BR112019013559A2 - composições e métodos relacionados para contro-lar doenças transmitidas por vetores - Google Patents

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Abstract

são proporcionados aqui agentes, composições e métodos úteis para a saúde animal, por exemplo, para alterar o nível, atividade ou metabolismo de um ou mais microrganismos residentes em um inseto hospedeiro (por exemplo, artrópode, por exemplo, inseto, por exemplo, vetor de patógenos), a alteração resultando em um decréscimo da aptidão do hospedeiro. a invenção apresenta uma composição que inclui um agente (por exemplo, fago, peptídeo, molécula pequena, antibiótico ou suas combinações) que pode alterar a microbiota do hospedeiro de um modo que é prejudicial para o hospedeiro. por disrupção de níveis microbianos, atividade microbiana, metabolismo microbiano ou diversidade microbiana, os agentes descritos aqui podem ser usados para decrescer a aptidão de uma variedade de insetos que transportam patógenos transmitidos por vetores que causam doença em animais.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para COMPOSIÇÕES E MÉTODOS RELACIONADOS PARA CONTROLAR DOENÇAS TRANSMITIDAS POR VETORES.
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS [0001] Este pedido reivindica prioridade para o Pedido Provisório U.S. N° 62/450.032 depositado em 24 de janeiro, 2017, e Pedido Provisório U.S. N° 62/583.925 depositado em 9 de novembro, 2017, o conteúdo dos quais é incorporado aqui a título de referência na sua totalidade.
ANTECEDENTES [0002] Os insetos funcionam como vetores para patógenos causando doença grave em humanos e animais como dengue, tripanossomíases e malária. As doenças transmitidas por vetores que infetam animais, como gado, representam um grande encargo para a saúde pública global. Assim, são necessários na técnica métodos e composições para controlar insetos que transportam doenças transmitidas por vetores.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0003] São revelados aqui composições e métodos para modular a aptidão de insetos para controlar a disseminação de doenças transmitidas por vetores em animais. A composição inclui um agente que altera um nível, atividade ou metabolismo de um ou mais microorganismos residentes em um hospedeiro, a alteração resultando em uma modulação da aptidão do hospedeiro.
[0004] Em um aspecto, é proporcionado aqui um método para decrescer a aptidão de um vetor (por exemplo, vetor de inseto) para um patógeno de animais, o método incluindo administrar ao vetor um peptídeo antimicrobiano tendo pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 92%, 94%, 96%, 98% ou 100% de identidade de sequência) com uma ou mais das seguintes: cecropina
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2/321 (SEQ ID NO: 82), melitina, copsina, drosomicina (SEQ ID NO: 93), dermcidina (SEQ ID NO: 81), andropina (SEQ ID NO: 83), moricina (SEQ ID NO: 84), ceratotoxina (SEQ ID NO: 85), abaecina (SEQ ID NO: 86), apldaeclna (SEQ ID NO: 87), profenlna (SEQ ID NO: 88), indolicidina (SEQ ID NO: 89), protegrlna (SEQ ID NO: 90), taquiplesina (SEQ ID NO: 91), ou defensina (SEQ ID NO: 92).
[0005] Em algumas modalidades, a administração inclui administrar o peptídeo antimicrobiano a pelo menos um habitat onde o vetor cresce, vive, se reproduz, alimenta, ou infesta.
[0006] Em algumas modalidades, o peptídeo antimicrobiano pode ser administrado em uma composição comestível por insetos para ingestão pelo vetor.
[0007] Em algumas modalidades, o peptídeo antimicrobiano pode ser formulado como uma composição líquida, sólida, de aerossol, pastosa, de gel ou gasosa.
[0008] Em algumas modalidades, o inseto pode ser pelo menos um de um mosquito, cecidomídeo, piolho, mosquito-palha, carrapato, triatomíneo, mosca tsé-tsé, ou pulga.
[0009] Em outro aspecto, é proporcionada aqui uma composição incluindo um peptídeo antimicrobiano tendo pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 92%, 94%, 96%, 98% ou 100% de identidade de sequência) com uma ou mais das seguintes: cecropina (SEQ ID NO: 82), melitina, copsina, drosomicina (SEQ ID NO: 93), dermcidina (SEQ ID NO: 81), andropina (SEQ ID NO: 83), moricina (SEQ ID NO: 84), ceratotoxina (SEQ ID NO: 85), abaecina (SEQ ID NO: 86), apidaecina (SEQ ID NO: 87), profenlna (SEQ ID NO: 88), indolicidina (SEQ ID NO: 89), protegrina (SEQ ID NO: 90), taquiplesina (SEQ ID NO: 91), ou defensina (SEQ ID NO: 92) formulada para visar um micro-organismo em um vetor (por exemplo, um vetor de inseto) para um patógeno de animais.
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3/321 [0010] Em algumas modalidades do segundo aspecto, o peptídeo antimicrobiano pode estar presente a uma concentração de cerca de 0,1 ng/g até cerca de 100 mg/g (cerca de 0,1 ng/g até cerca de 1 ng/g, cerca de 1 ng/g até cerca de 10 ng/g, cerca de 10 ng/g até cerca de 100 ng/g, cerca de 100 ng/g até cerca de 1000 ng/g, cerca de 1 mg/g até cerca de 10 mg/g, cerca de 10 mg/g até cerca de 100 mg/g) ou cerca de 0,1 ng/mL até cerca de 100 mg/mL (cerca de 0,1 ng/mL até cerca de 1 ng/mL, cerca de 1 ng/mL até cerca de 10 ng/mL, cerca de 10 ng/mL até cerca de 100 ng/mL, cerca de 100 ng/mL até cerca de 1000 ng/mL, cerca de 1 mg/mL até cerca de 10 mg/mL, cerca de 10 mg/mL até cerca de 100 mg/mL) na composição.
[0011] Em algumas modalidades do segundo aspecto, o peptídeo antimicrobiano pode adicionalmente incluir um domínio de direcionamento.
[0012] Em algumas modalidades do segundo aspecto, o peptídeo antimicrobiano pode adicionaimente incluir um peptídeo penetrador de células.
[0013] Ainda em outro aspecto, a composição inclui um agente que altera um nível, atividade, ou metabolismo de um ou mais microorganismos residentes em um hospedeiro de inseto, a alteração resultando em um decréscimo da aptidão do hospedeiro de inseto.
[0014] Em algumas modalidades de quaisquer das composições acima, o um ou mais micro-organismos podem ser uma bactéria ou fungo residente no hospedeiro. Em algumas modalidades, a bactéria residente no hospedeiro é pelo menos uma selecionada do grupo consistindo em Candidatus spp, Buchenera spp. Blattabacterium spp, Baumania spp, Wigglesworthia spp, Woibachia spp, Rickettsia spp, Oríentia spp, Sodalis spp, Burkhoideria spp, Cupríavidus spp, Frankia spp, Snirhizobium spp, Streptococcus spp, Wolineila spp, Xyiella spp, Erwinia spp, Agrobacterium spp, Bacilius spp, Paenibacillus spp,
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4/321
Streptomyces spp, Micrococcus spp, Corynebacterium spp, Acetobacter spp, Cyanobacteria spp, Salmonella spp, Rhodococcus spp, Pseudomonas spp, Lactobacillus spp, Enterococcus spp, Alcaligenes spp, Klebsiella spp, Paenibacillus spp, Arthrobacter spp, Corynebacterium spp, Brevi bacterium spp, Thermus spp, Pseudomonas spp, Clostridium spp, e Escherichia spp. Em algumas modalidades, o fungo residente no hospedeiro é pelo menos um selecionado do grupo consistindo em Candida, Metschnikowia, Debaromyces, Starmerella, Pichia, Cryptococcus, Pseudozyma, Symbiotaphrína bucneri, Symbiotaphrina kochii, Scheffersomyces shehatae, Scheffersomyces stipites, Cryptococcus, Trichosporon, Amylostereum areolatum, Epichloe spp, Pichia pinus, Hansenula capsulate, Daldinia decipien, Ceratocytis spp, Ophiostoma spp, e Attamyces bromatificus. Em certas modalidades, a bactéria é uma Wolbachia spp. (por exemplo, em um hospedeiro de mosquito). Em certas modalidades, a bactéria é uma Rickettsia spp. (por exemplo, em um hospedeiro de carrapato).
[0015] Em quaisquer das composições acima, o agente, que daqui em diante também pode ser referido como agente modulador, pode alterar o crescimento, divisão, viabilidade, metabolismo, e/ou longevidade do micro-organismo residente no hospedeiro. Em quaisquer das modalidades acima, o agente modulador pode decrescer a viabilidade do um ou mais micro-organismos residentes no hospedeiro. Em algumas modalidades, o agente modulador aumenta o crescimento ou viabilidade do um ou mais micro-organismos residentes no hospedeiro.
[0016] Em quaisquer das modalidades acima, o agente modulador é um fago, um polipeptídeo, uma molécula pequena, um antibiótico, uma bactéria, ou qualquer combinação desses.
[0017] Em algumas modalidades, o fago se liga a uma proteína da superfície celular em uma bactéria residente no hospedeiro. Em algumas modalidades, o fago é virulento para uma bactéria residente no
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5/321 hospedeiro. Em algumas modalidades, o fago é peio menos um selecionado do grupo consistindo em Myoviridae, Siphoviridae, Podoviridae, Lipothrixviridae, Rudiviridae, Ampullavindae, Bicaudaviridae, Clavaviridae, Corticoviridae, Cystoviridae, Fuselloviridae, Gluboloviridae, Guttaviridae, Inoviridae, Leviviridae, Microvíridae, Plasmaviridae, e Tectiviridae.
[0018] Em algumas modalidades, o polipeptídeo é pelo menos um de uma bacteriocina, bacteriocina do tipo R, peptídeo rico em C específico para nóduios, peptídeo antimicrobiano, Usina, ou peptídeo regulador de bacteriócitos.
[0019] Em algumas modalidades, a molécula pequena é um metabolite.
[0020] Em algumas modalidades, o antibiótico é um antibiótico de largo espectro.
[0021] Em algumas modalidades, o agente modelador é uma bactéria de ocorrência natural. Em algumas modalidades, a bactéria é pelo menos uma selecionada do grupo consistindo em Bartonella apis, Parasaccharibacter apium, Frischella perrara, Snodgrassella alvi, Gilliamela apicola, Bifidobacterium spp, e Lactobacillus spp. Em algumas modalidades, a bactéria é pelo menos uma selecionada do grupo consistindo em Candidates spp, Buchenera spp, Blattabacterlum spp, Baumania spp, Wigglesworthla spp, Wolbachia spp, Rickettsia spp, Orientia spp, Sodalis spp, Burkholderia spp, Cupriavidus spp, Frankia spp, Snlrhizoblum spp, Streptococcus spp, Wolinella spp, Xylella spp, Erwinia spp, Agrobacterium spp, Bacillus spp, Paenibacillus spp, Streptomyces spp, Micrococcus spp, Corynebacterium spp, Acetobacter spp, Cyanobacteria spp, Salmonella spp, Rhodococcus spp, Pseudomonas spp, Lactobacillus spp, Enterococcus spp, Alcaligenes spp, Klebsiella spp, Paenibacillus spp, Arthrobacter spp, Corynebacterium spp, Brevlbacterium spp, Thermus spp, Pseudomonas spp, Clostridium
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6/321 spp, e Escherichia spp.
[0022] Em quaisquer das composições acima, a aptidão do hospedeiro pode ser medida pela sobrevivência, reprodução, ou metabolismo do hospedeiro. Em quaisquer das modalidades acima, o agente modulador pode modular a aptidão do hospedeiro por aumento da suscetibilidade a pesticidas do hospedeiro (por exemplo, suscetibilidade a um pesticida listado na Tabela 12). Em algumas modalidades, o agente modulador modula a aptidão do hospedeiro por aumento da suscetibilidade a pesticidas do hospedeiro. Em algumas modalidades, a suscetibilidade a pesticidas é suscetibilidade a bactericidas ou fungicidas. Em algumas modalidades, a suscetibilidade a pesticidas é suscetibilidade a inseticidas.
[0023] Em quaisquer das composições acima, a composição pode incluir uma pluralidade de diferentes agentes moduladores. Em algumas modalidades, a composição inclui um agente modulador e um agente pesticida (por exemplo, um pesticida listado na Tabela 12). Em algumas modalidades, o agente pesticida é um agente bactericida ou fungicida. Em algumas modalidades, o agente pesticida é um agente inseticida.
[0024] Em quaisquer das composições acima, o agente modulador pode ser ligado a uma segunda fração. Em algumas modalidades, a segunda fração é um agente modulador.
[0025] Em quaisquer das composições acima, o agente modulador pode ser ligado a um domínio de direcionamento. Em algumas modalidades, o domínio de direcionamento dirige o agente modulador para um sítio-alvo no hospedeiro. Em algumas modalidades, o domínio de direcionamento dirige o agente modulador para o um ou mais microorganismos residentes no hospedeiro.
[0026] Em quaisquer das composições acima, o agente modulador pode incluir uma pré- ou pró-sequência inativadora, desse modo for
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7/321 mando um agente modulador precursor. Em algumas modalidades, o agente modulador precursor é convertido em uma forma ativa no hospedeiro.
[0027] Em quaisquer das composições acima, o agente modulador pode incluir um Hgador. Em algumas modalidades, o ligador é um ligador clivável.
[0028] Em quaisquer das composições acima, a composição pode adicionalmente incluir um transportador. Em alguns casos, o transportador pode ser um transportador agricolamente aceitável.
[0029] Em quaisquer das composições acima, a composição pode adicionalmente incluir uma isca para o hospedeiro, um agente pegajoso, ou uma combinação desses. Em algumas modalidades, a isca para o hospedeiro é um agente comestível e/ou um quimioatrator.
[0030] Em quaisquer das composições acima, a composição pode estar a uma dose eficaz para modular a aptidão do hospedeiro.
[0031] Em quaisquer das composições acima, a composição pode ser formulada para administração a um micro-organismo habitando o intestino do hospedeiro. Em quaisquer das composições acima, a composição pode ser formulada para administração a um microorganismo habitando um bacteriócito do hospedeiro e/ou o intestino do hospedeiro. Em algumas modalidades, a composição pode ser formulada para administração a uma planta. Em algumas modalidades, a composição pode ser formulada para uso em uma estação de nutrição do hospedeiro.
[0032] Em quaisquer das composições acima, a composição pode ser formulada como um líquido, um pó, grânulos, ou nanopartículas. Em algumas modalidades, a composição é formulada como uma selecionada do grupo consistindo em um lipossomo, polímero, peptídeo de secreção bacteriana, e nanocápsula sintética. Em algumas modalidades, a nanocápsula sintética administra a composição em um sítio-alvo
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8/321 no hospedeiro. Em algumas modalidades, o sítio-alvo é o intestino do hospedeiro. Em algumas modalidades, o sítio-alvo é um bacteriócito no hospedeiro.
[0033] Em um aspecto adicional, também são proporcionados aqui hospedeiros que incluem quaisquer das composições acima. Em algumas modalidades, o hospedeiro é um inseto. Em algumas modalidades, o inseto é um mosquito, cecidomídeo, piolho, mosquito-palha, carrapato, triatomíneo, mosca tsé-tsé, ou pulga. Em certas modalidades, o inseto é um mosquito. Em certas modalidades, o inseto é um carrapato. Em certas modalidades, o inseto é um ácaro. Em certas modalidades, o inseto é um piolho.
[0034] Também é proporcionado aqui um sistema para modular a aptidão de um hospedeiro compreendendo um agente modulador que visa um micro-organismo que é requerido para a aptidão de um hospedeiro, em que o sistema é eficaz para modular a aptidão do hospedeiro, e em que o hospedeiro é um inseto. O agente modulador pode incluir quaisquer das composições descritas aqui. Em algumas modalidades, o agente modulador é formulado como um pó. Em algumas modalidades, o agente modulador é formulado como um solvente. Em algumas modalidades, o agente modulador é formulado como um concentrado. Em algumas modalidades, o agente modulador é formulado como um diluente. Em algumas modalidades, o agente modulador é preparado para administração por combinação de quaisquer das composições anteriores com um transportador.
[0035] Ainda em um aspecto adicional, também são proporcionados aqui métodos para modular a aptidão de um inseto usando quaisquer das composições descritas aqui. Em um caso, o método de modulação da aptidão de um hospedeiro de inseto inclui administrar a composição de qualquer uma das reivindicações anteriores ao hospedeiro, em que o agente modulador visa o um ou mais micro
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9/321 organismos residentes no hospedeiro, e desse modo modula a aptidão do hospedeiro. Em outro caso, o método de modulação da diversidade microbiana em um hospedeiro de inseto inclui administrar a composição de qualquer uma das reivindicações anteriores ao hospedeiro, em que o agente modulador visa o um ou mais micro-organismos residentes no hospedeiro, e desse modo modula a diversidade microbiana no hospedeiro.
[0036] Em algumas modalidades de quaisquer dos métodos acima, o agente modulador pode alterar os níveis do um ou mais microorganismos residentes no hospedeiro. Em algumas modalidades de quaisquer dos métodos acima, o agente modulador pode alterar a função do um ou mais micro-organismos residentes no hospedeiro. Em algumas modalidades, o um ou mais micro-organismos podem ser uma bactéria e/ou fungo. Em algumas modalidades, o um ou mais micro-organismos são requeridos para a aptidão do hospedeiro. Em algumas modalidades, o um ou mais micro-organismos são requeridos para a sobrevivência do hospedeiro.
[0037] Em algumas modalidades de quaisquer dos métodos acima, o passo de administração pode incluir proporcionar o agente modulador a uma dose e tempo suficientes para afetar o um ou mais micro-organismos, desse modo modulando a diversidade microbiana no hospedeiro. Em algumas modalidades, o passo de administração inclui aplicação tópica de quaisquer das composições anteriores em uma planta. Em algumas modalidades, o passo de administração inclui proporcionar o agente modulador através de uma planta geneticamente manipulada. Em algumas modalidades, o passo de administração inclui proporcionar o agente modulador ao hospedeiro na forma de um produto comestível. Em algumas modalidades, o passo de administração inclui proporcionar um hospedeiro contendo o agente modulador. Em algumas modalidades, o hospedeiro contendo o agente modulador
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10/321 pode transmitir o agente modulador a um ou mais hospedeiros adicionais.
[0038] Em algumas modalidades de quaisquer dos métodos acima, a composição pode ser eficaz para aumentar a sensibilidade do hospedeiro a um agente pesticida (por exemplo, um pesticida listado na Tabela 12). Em algumas modalidades, o hospedeiro é resistente ao agente pesticida antes da administração do agente modulador. Em algumas modalidades, o agente pesticida é um agente aleloquímico. Em algumas modalidades, o agente aleloquímico é cafeína, cistatina de sementes de soja N, monoterpenos, ácidos de diterpenos, ou compostos fenólicos. Em algumas modalidades, a composição é eficaz para matar seletivamente o hospedeiro. Em algumas modalidades, a composição é eficaz para decrescer a aptidão do hospedeiro. Em algumas modalidades, a composição é eficaz para decrescer a produção de aminoácidos essenciais e/ou vitaminas no hospedeiro.
[0039] Em algumas modalidades de quaisquer dos métodos acima, o hospedeiro é um inseto. Em algumas modalidades, o hospedeiro é um vetor para um patógeno de animais. Em algumas modalidades, o vetor é um mosquito, cecidomídeo, piolho, mosquito-palha, carrapato, triatomíneo, mosca tsé-tsé, ou pulga. Em certas modalidades, o vetor é um mosquito. Em certas modalidades, o vetor é um carrapato. Em certas modalidades, o vetor é um ácaro. Em certas modalidades, o vetor é um piolho. Em algumas modalidades, o patógeno de animais é um vírus, um protozoário, uma bactéria, um protista, ou um nematódeo. Em algumas modalidades, o vírus é um pertencente ao grupo Togaviridae, Flaviviridae, Bunyaviridae, Rhabdoviridae, ou Orbivirídae. Em algumas modalidades, a bactéria é uma pertencente ao gênero Yersinia, Franciselia, Rickettsia, Orientía, ou Borreiia. Em algumas modalidades, o protozoário é um pertencente ao gênero Plasmodium, Trypanosoma, Leishmania, ou Babesia. Em algumas modalidades, ο
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11/321 nematódeo é um pertencente ao gênero Brugia. Em algumas modalidades, a composição é eficaz para prevenir ou decrescer a transmissão do patógeno a animais. Em algumas modalidades, a composição é eficaz para prevenir ou decrescer a transmissão horizontal ou vertical do patógeno entre hospedeiros. Em algumas modalidades, a composição é eficaz para decrescer a aptidão do hospedeiro, desenvolvimento do hospedeiro, ou competência vetorial.
[0040] Em outro aspecto, também são proporcionados aqui ensaios de rastreio para identificar um agente modulador que modula a aptidão de um hospedeiro. Em um caso, o ensaio de rastreio para identificar um agente modulador que modula a aptidão de um hospedeiro Inclui os passos de (a) expor um micro-organismo que pode residir no hospedeiro a um ou mais agentes moduladores candidatos e (b) identificar um agente modulador que decresce a aptidão do hospedeiro.
[0041] Em algumas modalidades do ensaio de rastreio, o agente modulador é um micro-organismo residente no hospedeiro. Em algumas modalidades, o micro-organismo é uma bactéria. Em algumas modalidades, a bactéria, quando residente no hospedeiro, decresce a aptidão do hospedeiro. Em algumas modalidades do ensaio de rastreio, o agente modulador afeta um micro-organismo de degradação aleloquímica. Em algumas modalidades, o agente modulador é um fago, um antibiótico, ou um composto de teste. Em algumas modalidades, o antibiótico é timentina ou azitromicina.
[0042] Em algumas modalidades do ensaio de rastreio, o hospedeiro pode ser um invertebrado. Em algumas modalidades, o invertebrado é um inseto. Em algumas modalidades, o inseto é um mosquito. Em algumas modalidades, o inseto é um carrapato. Em certas modalidades, o inseto é um ácaro. Em certas modalidades, o inseto é um piolho.
[0043] Em quaisquer das modalidades acima do ensaio de ras
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12/321 treio, a aptidão do hospedeiro pode ser modulada por modulação da microbiota do hospedeiro.
Definições [0044] Como usado aqui, o termo animais se refere a gado ou animais de herdade e outros animais mamíferos de veterinária.
[0045] Como usado aqui, o termo bacteriocina se refere a um peptídeo ou polipeptídeo que possui propriedades antimicrobianas. Bacteriocinas de ocorrência natural são produzidas por certos procariotas e atuam contra organismos relacionados com a estirpe produtora, mas não contra a própria estirpe produtora. Bacteriocinas contempladas aqui incluem, mas não se limitam a, bacteriocinas de ocorrência natural, como bacteriocinas produzidas por bactérias, e seus derivados, como bacteriocinas manipuladas, bacteriocinas recombinantemente expressas, e bacteriocinas quimicamente sintetizadas. Em alguns casos, a bacteriocina é uma variante funcionalmente ativa das bacteriocinas descritas aqui. Em alguns casos, a variante da bacteriocina tem pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade, por exemplo, ao longo de uma região especificada ou ao longo de toda a sequência, com uma sequência de uma bacteriocina descrita aqui ou uma bacteriocina de ocorrência natural.
[0046] Como usado aqui, o termo bacteriócito se refere a uma célula especializada presente em certos insetos onde bactérias intracelulares residem com propriedades bacterianas simbióticas.
[0047] Como usado aqui, o termo quantidade eficaz se refere a uma quantidade de um agente modulador (por exemplo, um fago, lislna, bacteriocina, molécula pequena, ou antibiótico) ou composição incluindo o referido agente suficiente para efetivar o resultado indicado, por exemplo, para decrescer ou reduzir a aptidão de um organismo
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13/321 hospedeiro (por exemplo, inseto, por exemplo, mosquito, carrapato, ácaro, piolho); para alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) da concentração de um agente modulador dentro de um hospedeiro-alvo; para alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) da concentração de um agente modulador dentro do intestino de um hospedeiro-alvo; para alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) da concentração de um agente modulador dentro de um bacteriócito do hospedeiro-alvo; para modular o nível, ou uma atividade, de um ou mais micro-organismos (por exemplo, endossimbionte) no hospedeiroalvo.
[0048] Como usado aqui, o termo aptidão se refere à capacidade de um organismo hospedeiro para sobreviver, e/ou para produzir descendência sobrevivente. A aptidão de um organismo pode ser medida por um ou mais parâmetros, incluindo, mas não se limitando a, expectativa de vida, taxa reprodutiva, mobilidade, peso do corpo, e taxa metabólica. A aptidão pode adicionalmente ser medida com base em medidas de atividade (por exemplo, animais mordedores) ou transmissão de doença (por exemplo, transmissão vetor-vetor ou transmissão vetor-animal).
[0049] Como usado aqui, o termo intestino se refere a qualquer porção do intestino de um hospedeiro, incluindo o intestino anterior, intestino médio, ou intestino posterior do hospedeiro.
[0050] Como usado aqui, o termo hospedeiro se refere a um organismo (por exemplo, inseto, por exemplo, mosquito, piolho, ácaro, ou carrapato) contendo micro-organismos residentes (por exemplo, micro-organismos endógenos, micro-organismos endossimbióticos (por exemplo, endossimbiontes primários ou secundários), organismos comensais, e/ou micro-organismos patogênicos).
[0051] Como usado aqui, decrescer a aptidão do hospedeiro ou
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14/321 decrescer a aptidão do hospedeiro se refere a qualquer disrupção da fisiologia do hospedeiro, ou qualquer atividade realizada pelo referido hospedeiro, em consequência da administração de um agente modulador, incluindo, mas não se limitando a, qualquer um ou mais dos seguintes efeitos desejados: (1) decrescer a população de um hospedeiro em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% ou mais; (2) decrescer a taxa reprodutiva de um hospedeiro (por exemplo, inseto, por exemplo, mosquito, carrapato, ácaro, piolho) em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% ou mais; (3) decrescer a mobilidade de um hospedeiro (por exemplo, inseto, por exemplo, mosquito, carrapato, ácaro, piolho) em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% ou mais; (4) decrescer o peso do corpo de um hospedeiro (por exemplo, inseto, por exemplo, mosquito, carrapato, ácaro, piolho) em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% ou mais; (5) aumentar a taxa metabélica ou atividade de um hospedeiro (por exemplo, inseto, por exemplo, mosquito, carrapato, ácaro, piolho) em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% ou mais; (6) decrescer a transmissão de patógenos vetor-vetor (por exemplo, transmissão vertical ou horizontal de um patógeno de um inseto para outro) por um hospedeiro (por exemplo, inseto, por exemplo, mosquito, carrapato, ácaro, piolho) em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% ou mais; (7) decrescer a transmissão de patógenos vetor-animal (por exemplo, inseto, por exemplo, mosquito, carrapato, ácaro, piolho) em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% ou mais; (8) decrescer a expectativa de vida de um hospedeiro (por exemplo, inseto, por exemplo, mosquito, carrapato, ácaro, piolho) em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% ou mais; (9) au
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15/321 mentar a suscetibilidade a pesticidas (por exemplo, inseticidas) de um hospedeiro (por exemplo, inseto, por exemplo, mosquito, carrapato, ácaro, piolho) em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% ou mais; ou (10) decrescer a competência vetorial por um hospedeiro (por exemplo, inseto, por exemplo, mosquito, carrapato, ácaro, piolho) em cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 100% ou mais. Um decréscimo da aptidão do hospedeiro pode ser determinado em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado.
[0052] O termo “inseto inclui qualquer organismo pertencente ao filo Arthropods e à classe Insecta ou à classe Arachnída, em qualquer estágio de desenvolvimento, isto é, insetos imaturos e adultos.
[0053] Como usado aqui, “lisina, também conhecido como endolisina, autolisina, mureína hidrolase, peptídeoglicano hidrolase, ou hidrolase da parede celular, se refere a uma enzima hidrolítica que pode proceder à lise de uma bactéria por divagem de peptídeoglicano na parede celular da bactéria. Lisinas contempladas aqui incluem, mas não se limitam a, lisinas de ocorrência natural, como lisinas produzidas por fagos, lisinas produzidas por bactérias, e seus derivados, como lisinas manipuladas, lisinas recombinantemente expressas, e lisinas quimicamente sintetizadas. Uma variante funcionalmente ativa da bacteriocina pode ter pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade, por exemplo, ao longo de uma região especificada ou ao longo de toda a sequência, com uma sequência de uma bacteriocina sintética, recombinante ou naturalmente derivada, incluindo qualquer descrita aqui.
[0054] Como usado aqui, o termo micro-organismo se refere a
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16/321 bactérias ou fungos. Micro-organismos pode se referir microorganismos residentes em um organismo hospedeiro (por exemplo, micro-organismos endógenos, micro-organismos endossimbióticos (por exemplo, endossimbiontes primários ou secundários) ou microorganismos exógenos ao hospedeiro, incluindo os que podem atuar como agentes moduladores. Como usado aqui, o termo microorganismo-alvo se refere a um micro-organismo que reside no hospedeiro e sofre impacto por um agente modulador, direta ou indiretamente.
[0055] Como usado aqui, o termo agente ou agente modulador se refere a um agente que é capaz de alterar os níveis e/ou funcionamento de micro-organismos residentes em um organismo hospedeiro (por exemplo, inseto, por exemplo, mosquito, carrapato, ácaro, piolho), e desse modo modular (por exemplo, decrescer) a aptidão do organismo hospedeiro (por exemplo, inseto, por exemplo, mosquito, carrapato, ácaro, piolho).
[0056] Como usado aqui, o termo pesticida ou agente pesticida se refere a uma substância que pode ser usada no controle de pragas agrícolas, ambientais, ou domésticas/domiciliares, como insetos, fungos, bactérias, ou vírus. É entendido que o termo pesticida abrange inseticidas de ocorrência natural ou sintéticos (larvicidas ou adulticidas), reguladores do crescimento de insetos, acaricidas (miticidas), nematicidas, ectoparasiticidas, bactericidas, fungicidas, ou herbicidas (substância que pode ser usada em agricultura para controlar ou modificar o crescimento de plantas). Exemplos adicionais de pesticidas ou agentes pesticidas são listados na Tabela 12. Em alguns casos, o pesticida é um aleloquímico. Como usado aqui, aleloquímico ou agente aleloquímico é uma substância produzida por um organismo que pode efetivar uma função fisiológica (por exemplo, a germinação, crescimento, sobrevivência, ou reprodução) de outro organismo (por exem
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17/321 pio, um inseto hospedeiro).
[0057] Como usado aqui, o termo peptídeo, proteína, ou polipeptídeo abrange qualquer cadeia de aminoácidos de ocorrência natural ou não natural (D- ou L-aminoácidos), índependentemente do comprimento (por exemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 40, 50, 100, ou mais aminoácidos), da presença ou ausência de modificações pós-traduçâo (por exemplo, glicosilação ou fosforilação), ou da presença, por exemplo, de um ou mais grupos não aminoacila (por exemplo, açúcar, lipídeo, etc.) covalentemente ligados ao peptídeo, e inclui, por exemplo, proteínas naturais, polipeptídeos e peptídeos sintéticos, ou recombinantes, moléculas híbridas, peptoides, e peptídeomiméticos.
[0058] Como usado aqui, percentagem de identidade entre duas sequências é determinada pelo algoritmo BLAST 2.0, que é descrito em Altschul et aL, (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. Software para realizar análises de BLAST é publicamente disponibilizado pelo National Center for Biotechnology Information.
[0059] Como usado aqui, o termo bacteriófago ou fago se refere a um vírus que infeta e se replica em bactérias. Bacteriófagos se replicam dentro de bactérias após a injeção do seu genoma no citoplasma e o fazem usando um ciclo lítico, que resulta em lise de células bacterianas, ou um ciclo lisogênico (não lítico), que deixa a célula bacteriana intata. O fago pode ser um isolado de fago de ocorrência natural, ou um fago manipulado, incluindo vetores, ou ácidos nucleicos que codificam um genoma parcial do fago (por exemplo, incluindo pelo menos todos os genes essenciais necessários para conduzir o ciclo de vida do fago dentro de uma bactéria hospedeira) ou o genoma completo do fago.
[0060] Como usado aqui, o termo planta se refere a plantas completas, órgãos de plantas, tecidos de plantas, sementes, células
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18/321 de plantas, sementes, e progênie das mesmas. Células de plantas Incluem, sem limitação, células de sementes, culturas em suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calos, folhas, raizes, rebentos, gametófitos, esporófitos, pólen, e microesporos. Partes de plantas incluem tecidos diferenciados e indiferenciados incluindo, mas não se limitando aos seguintes: raízes, caules, rebentos, folhas, pólen, sementes, tecido tumorai, e várias formas de células e cultura (por exemplo, células isoladas, protoplastos, embriões, e tecido de calos). O tecido de planta pode estar em uma planta ou em um órgão, tecido, ou cultura de células de planta. Adicionalmente, uma planta pode ser geneticamente manipulada para produzir uma proteína ou RNA heterólogo, por exemplo, de qualquer um dos agentes moduladores nos métodos ou composições descritos aqui.
[0061] Como usado aqui, o termo vetor se refere a um inseto que pode transportar ou transmitir um patógeno de animais de um reservatório para um animal. Vetores exemplificativos incluem insetos, como aqueles com partes bucais perfuradoras-sugadoras, como as presentes em Hemiptera e alguns Hymenoptera e Diptera como mosquitos, abelhas, vespas, cecidomídeos, piolhos, mosca tsé-tsé, pulgas e formigas, bem como membros de Arachnidae como carrapatos e ácaros.
[0062] Outras características e vantagens da invenção serão claras a partir da seguinte Descrição Detalhada e das Reivindicações. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0063] É pretendido que as figuras sejam ilustrativas de uma ou mais características, aspectos, ou modalidades da invenção e não é pretendido que sejam limitadoras.
[0064] As Figuras 1A-1G mostram imagens de diferentes sistemas de administração de antibióticos. Afídeos LSR-1 de primeiro instar foram tratados com diferentes soluções terapêuticas por administração através de plantas (Figura 1A), revestimento foliar (Figura 1B), microin
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19/321 jeção (Figura 1C), e administração tópica (Figura 1D).
[0065] As Figuras 2A-2C mostram o retardamento no desenvolvimento de afídeos durante o tratamento com rifampicina em afídeos LSR-1 de primeiro instar tratados por administração através de plantas com três condições diferentes: dieta artificial sem aminoácidos essenciais (AD isoladamente), dieta artificial sem aminoácidos essenciais com 100 pg/mL de rifampicina (AD + Rif), e dieta artificial com 100 pg/mL de rifampicina e aminoácidos essenciais (AD + Rif + EAA). A Figura 2A é uma série de gráficos mostrando a percentagem de afídeos vivos em cada estágio de desenvolvimento (tamanho da amostra-33 afídeos/grupo). A Figura 2B mostra imagens representativas de cada tratamento tiradas aos 12 dias. Barras de escala 2,5 mm. A Figura 2C mostra medições da área de corpos de afídeos mostrando o efeito drástico do tratamento com rifampicina. Adicionar de novo aminoácidos essenciais resgata parcialmente deficiências do desenvolvimento.
[0066] A Figura 3 mostra que o tratamento com rifampicina resultou em morte de afídeos. A sobrevivência foi monitorada diariamente para afídeos LSR-1 tratados por administração através de plantas com dieta artificial sem aminoácidos essenciais (AD isoladamente), dieta artificial sem aminoácidos essenciais com 100 ug/mL de rifampicina (AD + Rif), e dieta artificial com 100 ug/mL de rifampicina e (AD + Rif + EAA). O número entre parênteses representa o número de afídeos em cada grupo. A significância estatística foi determinada pelo Teste LogRank e as seguintes diferenças estatisticamente significativas foram determinadas: AD isoladamente vs. AD + Rif, p<0,0001 e AD + Rif vs. AD + Rif + EAA, p=0,017.
[0067] A Figura 4 é um gráfico mostrando que o tratamento com rifampicina resultou em perda da reprodução em afídeos. Afídeos LSR-1 de primeiro instar foram tratados por administração através de
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20/321 plantas com dieta artificial sem aminoácldos essenciais (AD isoladamente), dieta artificial sem aminoácidos essenciais com 100 ug/mL de rifampicina (AD + Rjf), e dieta artificial com 100 ug/mL de rifampicina e (AD + Rif + EAA) e o número de progênie produzida em cada dia após os afídeos alcançarem a fase adulta foi medido. É mostrado o número médio de progênie produzida por dia após afídeos alcançarem a fase adulta ± D.P.
[0068] A Figura 5 é um gráfico mostrando que o tratamento com rifampicina eliminou Buchnera endossimbiótica. O título do simbionte foi determinado para as diferentes condições aos 7 dias póstratamento. DNA de afídeos foi extraído e qPCR foi realizado para determinar a razão de DNA de Buchnera para DNA de afídeo. É mostrada a razão média de DNA de Buchnera para DNA de afídeo ± DP de 3 afídeos por grupo. Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas usando um ANOVA de uma via seguido de Pós-Teste de Tukey; *, p<0,05.
[0069] As Figuras 6A e 6B mostram que o tratamento com rifampicina administrado através de revestimento foliar retardou o desenvolvimento de afídeos. Afídeos eNASCO de primeiro instar foram tratados por revestimento de folhas com 100 pL de duas soluções diferentes: controle de solvente (0,025% de Silwet L-77), e 50 pg/mL de rifampicina. A Figura 6A é uma série de gráficos mostrando o estágio do desenvolvimento ao longo do tempo para cada condição. É mostrada a percentagem de afídeos vivos em cada estágio de desenvolvimento (tamanho da amostra-20 afídeos/grupo). A Figura 6B é um gráfico mostrando medições da área de corpos de afídeos mostrando o efeito drástico de folhas revestidas com rifampicina no tamanho dos afídeos. Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas usando um ANOVA de uma via seguido de Pós-Teste de Tukey; *, p<0,05.
[0070] A Figura 7 mostra que o tratamento com rifampicina admiPetição 870190060758, de 28/06/2019, pág. 321/641
21/321 nistrado através de revestimento foliar resultou em morte de afídeos. A sobrevivência foi monitorada diariamente para afídeos eNASCO tratados por revestimento de folhas com 100 pL de duas soluções diferentes: controle de solvente (Silwet L-77), e 50 pg/mL de rifampicina. O tratamento afeta a taxa de sobrevivência de afídeos.
[0071] A Figura 8 mostra que o tratamento com rifampicina administrado através de revestimento foliar eliminou Buchnera endossimbíótica. O título do simbionte foi determinado para as duas condições aos 6 dias pós-tratamento. DNA de afídeos foi extraído e qPCR foi realizado para determinar a razão de DNA de Buchnera para DNA de afídeo. É mostrada a razão média de DNA de Buchnera para DNA de afídeo ± DP. Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas usando um ANOVA de uma via seguido de Pós-Teste de Tukey; *, p<0,05.
[0072] A Figura 9 é um gráfico mostrando que o tratamento com rifampicina por microinjeção eliminou Buchnera endossimbiótica. O título do simbionte foi determinado aos 4 dias pós-injeção com as condições indicadas. A amostra de controle é o solvente, 0,025% de Silwet L-77 descrito anteriormente. DNA de afídeos foi extraído e qPCR foi realizado para determinar a razão de DNA de Buchnera para DNA de afídeo. É mostrada a razão média de DNA de Buchnera para DNA de afídeo ± DP. Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas usando um ANOVA de uma via seguido de Pós-Teste de Tukey; *, p<0,05.
[0073] A Figura 10 é um gráfico mostrando que o tratamento com rifampicina administrado através de tratamento tópico eliminou Buchnera endossimbiótica. O título do simbionte foi determinado aos 3 dias pós-pulverização com: solvente (Silwet L-77) ou a solução de rifampicina diluída em solvente. DNA de afídeos foi extraído e qPCR foi realizado para determinar a razão de DNA de Buchnera para DNA de
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22/321 afídeo. É mostrada a razão média de DNA de Buchnera para DNA de afídeo ± DP. Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas usando um ANOVA de uma via seguido de Pós-Teste de Tukey; *, p<0,05.
[0074] A Figura 11 mostra um painel de gráficos demonstrando que afídeos LSR-1 de 1o e 2o instar foram colocados sobre folhas submetidas a perfusão com água mais corantes alimentares ou 50 pg/mL de rifampicina em água mais corantes alimentares. O estágio do desenvolvimento foi medido ao longo do tempo para cada condição. É mostrada a percentagem de afídeos vivos em cada estágio de desenvolvimento (tamanho da amostra-74-81 afídeos/grupo).
[0075] A Figura 12 mostra um gráfico demonstrando a sobrevivência de afídeos LSR-1 de 1o e 2o instar colocados sobre folhas submetidas a perfusão com água mais corantes alimentares ou 50 pg/mL de rifampicina em água mais corantes alimentares. O número entre parênteses representa o número de afídeos em cada grupo. A significância estatística foi determinada pelo Teste Log-Rank.
[0076] A Figura 13 mostra um gráfico demonstrando o título do simbíonte determinado aos 8 dias pós-tratamento com folhas submetidas a perfusão com água e corantes alimentares ou rifampicina mais água e corantes alimentares. DNA de afídeos foi extraído e qPCR foi realizado para determinar a razão de DNA de Buchnera para DNA de afídeo. É mostrada a razão média de DNA de Buchnera para DNA de afídeo ± DP. O número na caixa indica a mediana do grupo experimental.
[0077] A Figura 14 mostra um painel de gráficos demonstrando afídeos LSR-1 de 1o e 2o instar tratados via injeção foliar e através da planta com água mais corantes alimentares ou 100 pg/mL de rifampicina em água mais corantes alimentares. O estágio do desenvolvimento foi medido ao longo do tempo para cada condição. É mostrada a
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23/321 percentagem de afídeos vivos em cada estágio de desenvolvimento (tamanho da amostra=49-50 afídeos/grupo).
[0078] A Figura 15 é um gráfico demonstrando a sobrevivência de afídeos LSR-1 de 1o e 2o instar colocados sobre folhas submetidas a perfusão e tratadas com água mais corantes alimentares ou 100 pg/mL de rifampicina em água mais corantes alimentares. O número entre parênteses representa o número de afídeos em cada grupo. Um Teste Log-Rank foi realizado e foi determinado que não houve diferenças estatisticamente significativas entre grupos.
[0079] As Figuras 16A e 16B são gráficos mostrando o título do simbionte determinado aos 6 (16A) e 8 (16B) dias pós-tratamento em afídeos se alimentando em folhas submetidas a perfusão e tratadas com água e corantes alimentares ou rifampicina mais água e corantes alimentares. DNA foi extraído de afídeos e qPCR foi realizado para determinar a razão de DNA de Buchnera para DNA de afídeo. É mostrada a razão média de DNA de Buchnera para DNA de afídeo ± DP. O número na caixa indica a mediana do grupo experimental.
[0080] A Figura 17 é um painel de gráficos mostrando que afídeos LSR-1 de 1o e 2o instar foram tratados com soluções de controle (água e Silwet L-77) ou uma combinação de tratamentos com 100 pg/mL de rifampicina. O estágio do desenvolvimento foi medido ao longo do tempo para cada condição. É mostrada a percentagem de afídeos vivos em cada estágio de desenvolvimento (tamanho da amostra-76-80 afídeos/grupo).
[0081] A Figura 18 é um gráfico mostrando que afídeos LSR-1 de 1o e 2o instar foram tratados com soluções de controle de uma combinação de tratamentos contendo rifampicina. O número entre parênteses representa o número de afídeos em cada grupo. Um Teste LogRank foi realizado e foi determinado que não houve diferenças estatisticamente significativas entre grupos.
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24/321 [0082] A Figura 19 é um gráfico mostrando o título do simbionte determinado aos 7 dias pós-tratamento com soluções de controle ou rifampicina. DNA de afídeos foi extraído e qPCR foi realizado para determinar a razão de DNA de Buchnera para DNA de afídeo. É mostrada a razão média de DNA de Buchnera para DNA de afídeo ± DP. O número na caixa indica a mediana do grupo experimental. Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas pelo teste t.
[0083] A Figura 20 é uma imagem mostrando o sistema de administração de quitosana. Afídeos A pisum foram tratados com uma solução terapêutica por administração através de perfusão foliar e através das plantas, como mostrado.
[0084] A Figura 21 é um painel de gráficos mostrando que o tratamento com quitosana resultou em desenvolvimento de afídeos retardado. Afídeos A. pisum de primeiro e segundo instar foram tratados por administração através de plantas e perfusão foliar com a solução de controle (Água), e 300 ug/mL de quitosana em água. O estágio do desenvolvimento foi monitorado ao longo da experiência. São mostradas as percentagens de afídeos em cada estágio de desenvolvimento (1o instar, 2o instar, 3o instar, 4o instar, 5o instar, ou 5R que representa um 5o instar se reproduzindo) por grupo de tratamento.
[0085] A Figura 22 é um gráfico mostrando que ocorreu um decréscimo na sobrevivência de insetos por tratamento com quitosana. Afídeos A. pisum de primeiro e segundo instar foram tratados por administração através de plantas e perfusão foliar com apenas água ou solução de quitosana e a sobrevivência foi monitorada diariamente ao longo da experiência. O número entre parênteses representa o número total de afídeos no grupo de tratamento.
[0086] A Figura 23 é um gráfico mostrando que o tratamento com quitosana reduziu Buchnera endossimbiótica. Afídeos A. pisum de primeiro e segundo instar foram tratados por administração através de
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25/321 plantas e perfusão foliar com água ou 300 ug/mL de quitosana em água. Aos 8 dias pós-tratamento, DNA de afídeos foi extraído e qPCR foi realizado para determinar a razão de DNA de Buchnera para DNA de afídeo. É mostrada a razão média de DNA de Buchnera para DNA de afídeo ± DP de 6 afídeos/grupo. O valor da mediana para cada grupo é mostrado em uma caixa.
[0087] A Figura 24 é um painel de gráficos mostrando que o tratamento com nisina resultou em desenvolvimento de afídeos retardado. Afídeos A. pisum LSR-2 de primeiro e segundo instar foram tratados com água (controle) ou 1,6 ou 7 mg/mL de nisina via administração por injeção foliar e através da planta e o desenvolvimento foi medido ao longo do tempo. São mostradas as percentagens de afídeos em cada estágio de vida (1o, 2o, 3°, 4o, 5°, e 5R (5° se reproduzindo) instar) no momento indicado. N”56-59 afídeos/grupo.
[0088] A Figura 25 é um gráfico mostrando que ocorreu um decréscimo dependente da dose da sobrevivência de insetos por tratamento com nisina. Afídeos A. pisum LSR-1 de primeiro e segundo instar foram tratados com água (controle) ou 1,6 ou 7 mg/mL de nisina via administração por injeção foliar e através da planta e a sobrevivência foi monitorada ao longo do tempo. O número entre parênteses indica o número de afídeos/grupo. Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas pelo teste Log Rank (Mantel-Cox).
[0089] A Figura 26 é um gráfico mostrando que o tratamento com nisina reduziu Buchnera endossimbiótica. Afídeos A. pisum LSR-1 de primeiro e segundo instar foram tratados com água (controle) ou 1,6 mg/mL de nisina via administração por injeção foliar e através da planta e DNA foi extraído de afídeos selecionados aos oito dias póstratamento e usado para qPCR com o propósito de determinar números de cópias de Buchnera. São mostradas as razões médias de Bu~ chnera/afídeo para cada tratamento +/- EPM. O número na caixa aci
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26/321 ma de cada grupo experimental indica o valor da mediana para esse grupo. Cada ponto dos dados representa um único afídeo.
[0090] A Figura 27 é um painel de gráficos mostrando que o tratamento com ácido levulínico resultou em desenvolvimento de afídeos retardado. Afídeos A. pisum eNASCO de primeiro e segundo instar foram tratados com água (controle) ou ácido levulínico 0,03 ou 0,3% via administração por injeção foliar e através da planta e o desenvolvimento foi medido ao longo do tempo. São mostradas as percentagens de afídeos em cada estágio de vida (1o, 2o, 3o, 4o, e 5o instar) no momento indicado. N=57-59 afídeos/grupo.
[0091] A Figura 28 é um gráfico mostrando que ocorreu um decréscimo na sobrevivência de insetos por tratamento com ácido levuiínico. Afídeos A. pisum eNASCO de primeiro e segundo instar foram tratados com água (controle) ou ácido levulínico 0,03 ou 0,3% via administração por injeção foliar e através da planta e a sobrevivência foi monitorada ao longo do tempo. N=57~59 afídeos/grupo. Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas pelo teste Log Rank (Mantel-Cox): **, p<0,01.
[0092] A Figura 29 é um painel de gráficos mostrando que o tratamento com ácido levulínico reduziu Buchnera endossimbiótica. Afídeos A. pisum eNASCO de primeiro e segundo instar foram tratados com água (controle) ou ácido levulínico 0,03 ou 0,3% via administração por injeção foliar e através da planta e DNA foi extraído de afídeos selecionados aos sete e onze dias pós-tratamento e usado para qPCR com o propósito de determinar números de cópias de Buchnera. São mostradas as razões médias de fíuchnera/afídeo para cada tratamento +/EPM. Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas por ANOVA de Uma via e Teste de Comparações Múltiplas de Dunnett; *, p<0,05. Cada ponto dos dados representa um único afídeo.
[0093] As Figuras 30A e 30B mostram gráficos demonstrando que
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27/321 o tratamento com gossipol resultou em desenvolvimento de afídeos retardado. Afídeos A. pisum de primeiro e segundo instar foram tratados por administração através de plantas com dieta artificial sem aminoácidos essenciais (AD isoladamente), e dieta artificial sem aminoácidos essenciais com diferentes concentrações de gossipol (0,05%, 0,25% e 0,5%). O estágio do desenvolvimento foi monitorado ao longo da experiência. A Figura 30A é uma série de gráficos mostrando o número médio de afídeos em cada estágio de desenvolvimento (1o instar, 2o instar, 3o instar, 4o instar, 5o instar, ou 5R que representa um 5o instar se reproduzindo) por grupo de tratamento. No momento indicado, afídeos foram submetidos a imagiologia e o seu tamanho foi determinado usando Image J. A Figura 30B é um gráfico mostrando a área média de afídeos ± DP de afídeos tratados com dieta artificial (Controle) ou tratados com gossipol. A significância estatística foi determinada usando um ANOVA de Uma Via seguido de pós-teste de Tukey. *, p<0,05. **, p<0,01.
[0094] A Figura 31 é um gráfico mostrando um decréscimo dependente da dose da sobrevivência de afídeos por tratamento com o aleloquímico gossipol. Afídeos A. písum de primeiro e segundo instar foram tratados por administração através de plantas com dieta artificial sem aminoácidos essenciais (AD sem EAA), dieta artificial sem aminoácidos essenciais com 0,5% de ácido gossipol-acético (0,5% de gossipol), dieta artificial sem aminoácidos essenciais com 0,25% de ácido gossipol-acético (0,25% de gossipol), e dieta artificial sem aminoácidos essenciais e 0,05% de ácido gossipol-acético (0,05% de gossipol) e a sobrevivência foi monitorada diariamente ao longo da experiência. O número entre parênteses representa o número de aminoácidos essenciais de afídeos em cada grupo. Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas pelo teste Log-Rank e AD sem EAA e 0,5% de gossipol são significativamente diferentes, p-0,0002.
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28/321 [0095] As Figuras 32A e 32B são dois gráficos mostrando que o tratamento com 0,25% de gossipol resultou em fecundidade decrescida. Afídeos A. pisum de primeiro e segundo instar foram tratados por administração através de plantas com dieta artificial sem aminoácidos essenciais (AD5-2 sem EAA), ou dieta artificial sem aminoácidos essenciais com 0,25% de ácido gossipol-acético (AD5-2 sem EAA + 0,25% de gossipol), e a fecundidade foi determinada ao longo da experiência. A Figura 32A mostra o dia médio ± DP ao qual afídeos começaram a produzir progênie que foi medido e o tratamento com gossipol retardou a produção de progênie. A Figura 32B mostra o número médio de progênie produzida após o afídeo ter começado a ser um adulto se reproduzindo ± DP que foi medido e o tratamento com gossipol resulta em número decrescido de progênie produzida. Cada ponto dos dados representa um afídeo.
[0096] A Figura 33 é um gráfico mostrando que o tratamento com diferentes concentrações de gossipol reduziu Buchnera endossimbiótica. Afídeos A. pisum de primeiro e segundo instar foram tratados por administração através de plantas com dieta artificial sem aminoácidos essenciais (Controle) ou dieta artificial sem aminoácidos essenciais com 0,5%, 0,25% ou 0,05% de gossipol. Aos 5 ou 13 dias póstratamento, DNA de afídeos foi extraído e qPCR foi realizado para determinar a razão de DNA de Buchnera para DNA de afídeo. É mostrada a razão média de DNA de Buchnera para DNA de afídeo ± DP de 26 afídeos/grupo. Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas por teste T Não emparelhado; *, p<0,05.
[0097] A Figura 34 é um gráfico mostrando que a microinjeção de gossipol resultou em níveis decrescidos de Buchnera em afídeos. Afídeos LSR-1 A. pisum no estágio <3° instar (ninfas) foram injetados com 20 nL de dieta artificial sem aminoácidos essenciais (AD) ou dieta artificial sem aminoácidos essenciais com 0,05% de gossipol (gossipol
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29/321 (0,05%)). Três dias após a injeção, DNA foi extraído de afídeos e os níveis de Buchnera foram avaliados por qPCR. São mostradas as razões médias de DNA de Suchnera/afídeo ± DP. Cada ponto dos dados representa um afídeo.
[0098] A Figura 35 é um painel de gráficos mostrando que o tratamento com Trans-cinemaldeído resultou em desenvolvimento de afídeos retardado. Afídeos A. pisum de primeiro e segundo instar foram tratados por administração através de plantas com água e água com diferentes concentrações de trans-cinemaldeído (TC, 0,05%, 0,5%, e 5%). O estágio do desenvolvimento foi monitorado ao longo da experiência. É mostrado o número médio de afídeos em cada estágio de desenvolvimento (1o instar, 2o instar, 3o instar, 4o instar, 5o instar, ou 5R que representa um 5o instar se reproduzindo) por grupo de tratamento. N-40-49 afídeos/grupo experimental.
[0099] A Figura 36 é um gráfico mostrando que ocorreu um decréscimo dependente da dose da sobrevivência por tratamento com o antimicrobiano natural trans-cinemaldeído. Afídeos A. pisum de primeiro e segundo instar foram tratados por administração através de plantas com água e água com diferentes concentrações de transcinemaldeído (TC, 0,05%, 0,5%, e 5%). A sobrevivência foi monitorada ao longo do tratamento. Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas pelo teste Log-Rank. N=40-49 afídeos/grupo.
[00100] A Figura 37 é um gráfico mostrando que o tratamento com diferentes concentrações de trans-cinemaldeído reduziu Buchnera endossimbiótica. Afídeos A. pisum de primeiro e segundo instar foram tratados por administração através de plantas com água e água com diferentes concentrações de trans-cinemaldeído (0,05%, 0,5%, e 5%). Aos 3 dias pós-tratamento, DNA de afídeos foi extraído e qPCR foi realizado para determinar a razão de DNA de Buchnera para DNA de afídeo. É mostrada a razão média de DNA de Buchnera para DNA de
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30/321 afídeo ± DP de 2-11 afídeos/grupo. A mediana de cada grupo de tratamento é mostrada na caixa acima dos pontos de dados. Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas por teste T Não emparelhado; *, p<0,05. Houve uma diferença estatisticamente significativa entre o controle de água e o grupo de 0,5% de transcinemaldeido.
[00101] A Figura 38 é um painel de gráficos mostrando que o tratamento com o peptídeo de escorpião Uy192 resultou em desenvolvimento de afídeos retardado. Afídeos A. pisum de primeiro e segundo instar foram tratados por administração através de plantas e perfusão foliar com a solução de controle (água), e 100 ug/mL de Uy192 em água, a) o estágio de desenvolvimento foi monitorado ao iongo da experiência. Sâo mostradas as percentagens de afídeos em cada estágio de desenvolvimento (1o instar, 2o instar, 3o instar, 4o instar, 5o instar, ou 5R que representa um 5o instar se reproduzindo) por grupo de tratamento.
[00102] A Figura 39 é um gráfico mostrando que ocorreu um decréscimo na sobrevivência de insetos por tratamento com o AMP de escorpião Uy192. Afídeos A. pisum de primeiro e segundo instar foram tratados por administração através de plantas e perfusão foliar com somente água ou solução de Uy192 e a sobrevivência foi monitorada diariamente ao longo da experiência. O número entre parênteses representa o número total de afídeos no grupo de tratamento.
[00103] A Figura 40 é um gráfico mostrando que o tratamento com Uy192 reduziu Buchnera endossimbiótica. Afídeos A, pisum de primeiro e segundo instar foram tratados por administração através de plantas e perfusão foliar com água ou 100 ug/mL de Uy192 em água, aos 8 dias pós-tratamento, DNA de afídeos foi extraído e qPCR foi realizado para determinar a razão de DNA de Buchnera para DNA de afídeo. É mostrada a razão média de DNA de Buchnera para DNA de afídeo ±
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DP de 2-6 afídeos/grupo. O valor da mediana para cada grupo é mostrado em uma caixa.
[00104] A Figura 41 é um gráfico mostrando um decréscimo da sobrevivência em afídeos microinjetados com os peptídeos de escorpião D10 e D3. Afídeos A, pisum LSR-1 foram microinjetados com água (controle) ou com 100 ng de um dos peptídeos de escorpião D3 ou D10. Após a injeção, os afídeos foram liberados em folhas de fava e a sobrevivência foi monitorada ao longo de toda a experiência. O número entre parênteses indica o número de afídeos em cada grupo de tratamento experimental.
[00105] A Figura 42 é um gráfico mostrando um decréscimo nos títulos do endossimbionte por injeção com os peptídeos de escorpião D3 e D10. Afídeos A. pisum LSR-1 foram microinjetados com água (controle) ou com 100 ng de um dos peptídeos de escorpião D3 ou D10. Após a injeção, os afídeos foram liberados em folhas de fava e aos 5 dias pós-tratamento, DNA foi extraído dos afídeos vivos remanescentes e qPCR foi realizado para determinar a razão de DNA de fíüc/inera/afídeo. É mostrada a média ± DP de cada grupo de tratamento. N=2-9 afídeos/grupo. O número acima de cada grupo de tratamento na caixa representa a mediana do conjunto de dados.
[00106] A Figura 43 é um gráfico mostrando um decréscimo na sobrevivência de insetos por tratamento com um coquetel de AMP de escorpião. Afídeos eNASCO de primeiro e segundo instar foram tratados por administração através de perfusão foliar e através de plantas com um coquetel de peptídeos de escorpião (40 pg/mL de cada um de Uy17, D3, UyCt3, e D10) e a sobrevivência foi monitorada ao longo da experiência. O número entre parênteses representa o número de afídeos em cada grupo de tratamento.
[00107] A Figura 44 é um painel de gráficos mostrando que o tratamento com um peptídeo de escorpião fundido a um peptídeo penetra
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32/321 dor de células resultou em desenvolvimento de afídeos retardado. Afídeos A. pisum LSR-2 de primeiro instar foram tratados com água (controle) ou 100 pg/mL de Uy192+CPP+FAM via administração por injeção foliar e através da planta e o desenvolvimento foi medido ao longo do tempo. São mostradas as percentagens de afídeos em cada estágio de vida (1o, 2o, 3°, 4o, 5o, e 5R (5o se reproduzindo) instar) no momento indicado. N=90 afídeos/grupo.
[00108] A Figura 45 é um gráfico mostrando que o tratamento de afídeos com um peptídeo de escorpião fundido a um peptídeo penetrador de células aumentou a mortalidade. Afídeos A. pisum LSR-1 de primeiro instar foram tratados com água ou 100 pg/mL de UY192+CPP+FAM (peptídeo) em água administrado por injeção foliar e através da planta. A sobrevivência foi monitorada ao longo do tempo. O número entre parênteses indica o número de afídeos/grupo. Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas pelo teste Log Rank (Mantel-Cox) e há uma diferença significativa entre os dois grupos experimentais (p™0,0036).
[00109] A Figura 46 é um gráfico mostrando que o tratamento com Uy192+CPP+FAM reduziu Buchnera endossimbiótica. Afídeos A. pisum LSR-1 de primeiro instar foram tratados com água ou 100 pg/mL de Uy192+CPP+FAM (peptídeo) em água administrado por injeção foliar e através da planta. DNA foi extraído de afídeos selecionados aos cinco dias pós-tratamento e usado para qPCR com o propósito de determinar números de cópias de Buchnera. São mostradas as razões médias de Buchnera/aftâeo para cada tratamento +/- EPM. O número na caixa acima de cada grupo experimental indica o valor da mediana para esse grupo. Cada ponto dos dados representa um único afídeo. Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas pelo teste T de Student; ****, p<0,0001.
[00110] A Figura 47 é um painel de imagens mostrando que
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Uy192+CPP+FAM penetrou em membranas de bacteriócitos. Bacteriócitos foram dissecados dos afídeos e incubados com 250 ug/mL do peptídeo Uy192+CPP+FAM durante 30 min. Por lavagem e imagiologia, o Uy192+CPP+FAM pode ser observado a quantidades elevadas no interior dos bacteriócitos.
[00111] As Figura 48A e Figura 48B são um painel de gráficos mostrando que o tratamento com Pantotenol retardou o desenvolvimento de afídeos. Afídeos eNASCO de primeiro e segundo instar foram tratados por administração através de plantas com três condições diferentes: dieta artificial sem aminoácidos essenciais (AD sem EAA), dieta artificial sem aminoácidos essenciais com 10 uM de pantotenol (10 uM de pantotenol), e dieta artificial sem aminoácidos essenciais com 100 uM de pantotenol (100 uM de pantotenol), dieta artificial sem aminoácidos essenciais com 100 uM de pantotenol, e dieta artificial sem aminoácidos essenciais com 10 uM de pantotenol. A Figura 48A mostra o estágio de desenvolvimento monitorado ao longo do tempo para cada condição. A Figura 48B mostra medições da área relativa de corpos de afídeos mostrando o efeito drástico do tratamento com pantotenol.
[00112] A Figura 49 é um gráfico mostrando que o tratamento com pantotenol aumentou a mortalidade dos afídeos. A sobrevivência foi monitorada diariamente para afídeos eNASCO tratados por administração através de plantas com dieta artificial sem aminoácidos essenciais, ou dieta artificial sem aminoácidos essenciais contendo 10 ou 100 uM de pantotenol. O número entre parênteses representa o número de afídeos em cada grupo.
[00113] As Figuras 50A, 50B, e 50C são um painel de gráficos mostrando que o tratamento com Pantotenol resultou em perda da reprodução. Afídeos eNASCO de primeiro e segundo instar foram tratados por administração através de plantas com dieta artificial sem aminoá
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34/321 cidos essenciais ou com dieta artificial sem aminoácidos essenciais com 10 ou 100 uM de pantotenoi. A Figura 50A mostra a fração de afídeos sobrevivendo até à maturidade e se reproduzindo. A Figura 50B mostra o dia médio em que afídeos em cada grupo começaram a se reproduzir. É mostrado o dia médio que um afídeo começou a se reproduzir ± DP. A Figura 50C mostra o número médio de progênie produzida por dia após um afídeo ter começado a se reproduzir. É mostrado o número médio de progênie/dia ± DP.
[00114] A Figura 51 é um gráfico mostrando que o tratamento com Pantotenoi não afetou Buchnera endossimbiótica. O título do simbionte foi determinado para as diferentes condições aos 8 dias póstratamento. DNA de afídeos foi extraído e qPCR foi realizado para determinar a razão de DNA de Buchnera para DNA de afídeo. É mostrada a razão média de DNA de Buchnera para DNA de afídeo ± DP de 6 afídeos por grupo.
[00115] A Figura 52 é um painel de gráficos mostrando que o tratamento com Pantotenoi administrado através de plantas não afetou o desenvolvimento de afídeos. Afídeos eNASCO de primeiro instar foram tratados por revestimento de folhas com 100 pL de duas soluções diferentes: controle de solvente (0,025% de Silwet L-77), e 10 uM de pantotenoi e o estágio do desenvolvimento foi medido ao longo do tempo para cada condição. É mostrada a percentagem de afídeos vivos em cada estágio de desenvolvimento (tamanho da amostra-20 afídeos/grupo).
[00116] A Figura 53 é um gráfico mostrando que o tratamento com Pantotenoi administrado através de revestimento foliar resultou em morte de afídeos. A sobrevivência foi monitorada diariamente para afídeos eNASCO tratados por revestimento de folhas com 100 pL de duas soluções diferentes: controle de solvente (Silwet L-77), e 10 uM de pantotenoi. O tratamento afeta a taxa de sobrevivência de afídeos.
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Tamanho da amostra 20 afídeos/grupo. O teste Log-Rank de Mantel Cox foi usado para determinar se houve diferenças estatisticamente significativas entre grupos e identificou que os dois grupos são significativamente diferentes (p-0,0019).
[00117] As Figuras 54A e 54B são um painel de gráficos mostrando que o tratamento com um coquetel de análogos de aminoácidos retardou o desenvolvimento de afídeos. Afídeos LSR-1 de primeiro instar foram tratados por administração através de perfusão foliar e através de plantas com água ou um coquetel de análogos de aminoácidos em água (coquetel de AA). A Figura 54A mostra o estágio do desenvolvimento medido ao longo do tempo para cada condição. São mostradas as percentagens de afídeos vivos em cada estágio de desenvolvimento. A Figura 54B mostra as medições da área de corpos de afídeos mostrando o efeito drástico do tratamento com um coquetel de análogos de aminoácidos (coquetel de AA). Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas usando um teste T de Student; ****, p<0,0001.
[00118] A Figura 55 é um gráfico mostrando que o tratamento com um coquetel de análogos de aminoácidos eliminou Buchnera endossimbiótica. O título do simbionte foi determinado para as diferentes condições aos 6 dias pós-tratamento. DNA de afídeos foi extraído e qPCR foi realizado para determinar a razão de DNA de Buchnera para DNA de afídeo. São mostradas as razões médias de DNA de Buchnera para DNA de afídeo ± DP de 19-20 afídeos por grupo. Cada ponto dos dados representa um afídeo individual. Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas usando um teste T de Student; *, p<0,05.
[00119] As Figuras 56A e 56B são um painel de gráficos mostrando que o tratamento com uma combinação de três agentes retardou o desenvolvimento de afídeos. Afídeos LSR-1 de primeiro instar foram tra
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36/321 tados por administração através de perfusão foliar e através de plantas com água ou uma combinação de três agentes em água (Pep-RifQuitosana). A Figura 56A mostra o estágio do desenvolvimento medido ao longo do tempo para cada condição. São mostradas as percentagens de afídeos vivos em cada estágio de desenvolvimento. A Figura 56B mostra as medições da área de corpos de afídeos mostrando o efeito drástico do tratamento com uma combinação de três tratamentos (Pep-Rif-Quitosana). Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas usando um teste T de Student; p<0,0001.
[00120] A Figura 57 é um gráfico mostrando que o tratamento com uma combinação de um peptídeo, antibiótico, e agente antimicrobiano natural aumentou a mortalidade dos afídeos. Afídeos LSR-1 foram tratados com água ou uma combinação de três tratamentos (Pep-RifQuitosana) e a sobrevivência foi monitorada diariamente após o tratamento.
[00121] A Figura 58 é um gráfico mostrando que o tratamento com uma combinação de um peptídeo, antibiótico, e agente antimicrobiano natural eliminou Buchnera endossimbiótica. O título do simbionte foi determinado para as diferentes condições aos 6 dias pós-tratamento. DNA de afídeos foi extraído e qPCR foi realizado para determinar a razão de DNA de Buchnera para DNA de afídeo. São mostradas as razões médias de DNA de Buchnera para DNA de afídeo ± DP de 2021 afídeos por grupo. Cada ponto dos dados representa um afídeo individual.
[00122] As Figuras 59A e 59B são um painel de imagens mostrando que ciprofloxacina revestiu e penetrou em grãos de milho. Grãos de milho foram embebidos em água (sem antibiótico) ou na concentração indicada de ciprofloxacina em água e grão ou grãos completos foram testados para ver se conseguem inibir o crescimento de E. coli DH5o. A Figura 59A mostra o crescimento bacteriano na presença de um
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37/321 grão de milho embebido em água sem antibióticos e a Figura 59B mostra a inibição do crescimento bacteriano quando grãos de milho completos ou metades de grãos de milho que foram embebidos em antibióticos são colocados sobre uma placa espalhada com E. colL [00123] A Figura 60 é um gráfico mostrando que gorgulhos S. zea~ mais adultos foram tratados com ciprofloxacina (250 ug/mL ou 2,5 mg/mL) ou pseudotratados com água. Após 18 dias de tratamento, DNA genômico foi isolado dos gorgulhos e a quantidade de endossimbionte primário de Sitophilus foi determinada por qPCR. É mostrada a média ± EPM de cada grupo. Cada ponto dos dados representa um gorgulho. A mediana de cada grupo está listada acima do conjunto de dados.
[00124] As Figuras 61A e 61B são gráficos mostrando o desenvolvimento de gorgulhos após tratamento com ciprofloxacina. A Figura 61A mostra grãos de milho individuais cortados para ficarem abertos 25 dias após adultos terem sido removidos de uma repetição cada um dos grãos de milho iniciais embebidos/revestidos com água (controle) ou ciprofloxacina (250 ug/mL ou 2,5 mg/mL) e examinados quanto à presença de larvas, pupas, ou gorgulhos (adultos) quase totalmente desenvolvidos. É mostrada a percentagem de cada estágio de vida encontrado em grãos de cada grupo de tratamento. O número total de progênie encontrada nos grãos de cada grupo de tratamento está indicado acima de cada conjunto de dados. A Figura 61B mostra DNA genômico isolado de progênie dissecada de grãos de milho dos grupos de tratamento de controle (água) e 2,5 mg/mL de ciprofloxacina e qPCR foi realizado para medir a quantidade de endossimbionte primário de Sitophilus presente. É mostrada a média ± DP para cada grupo. Diferenças estatisticamente significativas foram determinadas pelo teste t não emparelhado; ***, p<0,001.
[00125] As Figuras 62A e 62B são gráficos mostrando as duas re~
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38/321 petições remanescentes de grãos de milho pseudotratados (água) ou tratados com 250 ug/mL ou 2,5 mg/mL de ciprofloxacina monitorados quanto à emergência de progênie após pares de acasalamento terem sido removidos (aos 7 dias pós-tratamento). A Figura 62A mostra o número médio de gorgulhos que emergiram de novo ao longo do tempo ± DP para cada grupo de tratamento. A Figura 62B mostra o número médio ± EPM de gorgulhos que emergiram para cada grupo de tratamento aos 43 dias após pares de acasalamento terem sido removidos.
[00126] A Figura 63 é um painel de gráficos mostrando que o tratamento com rifampicina e doxiciclina resultou em mortalidade de ácaros. A sobrevivência foi monitorada diariamente para ácaros-aranha de duas manchas não tratados e ácaros tratados com 250 pg/mL de rifampicina e 500 pg/mL de doxiciclina em 0,025% de Silwet L-77.
[00127] A Figura 64 é um painel de gráficos mostrando os resultados de um ensaio de fluxo Seahorse quanto à respiração bacteriana. Bactérias cresceram até à fase logarítmica e foram carregadas em placas Seahorse XFe96 para medições temporais da taxa de consumo de oxigênio (OCR) e taxa de acidificação extracelular (ECAR) como descrito em métodos. Os tratamentos foram injetados nos poços após aproximadamente 20 minutos e as bactérias foram monitoradas para detectar alterações no crescimento. Rifampicina = 100 pg/mL; Cloramfenicol ™ 25 pg/mL; Fagos (T7 para E. cgíí e 0SmVL-C1 para S. marcescens) Usados foram diluídos 1:2 ou 1:100 em Tampão SM. Os marcadores em cada linha são apenas proporcionados como indicadores da condição a que cada linha corresponde, e não são indicadores dos pontos de dados.
[00128] A Figura 65 é um gráfico mostrando que um fago contra S. marcescens reduziu a mortalidade das moscas. As moscas que foram picadas com S. marcescens morreram todas em um período de um
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39/321 dia, ao passo que uma porção considerável das moscas que foram picadas com ambos de S. marcescens e o fago sobreviveu durante cinco dias após o tratamento. Quase todas as moscas de controle que nâo foram tratadas de modo nenhum sobreviveram até ao fim da experiência. O teste Log-rank foi usado para comparar as curvas para significância estatística, asterisco designa p<0,0001.
DESCRIÇÃO DETALHADA [00129] São proporcionados aqui métodos e composições úteis para a saúde animal, por exemplo, para alterar um nível, atividade, ou metabolismo de um ou mais micro-organismos residentes em um inseto hospedeiro (por exemplo, artrópode, por exemplo, inseto, por exemplo, um vetor de patógenos de animais, por exemplo, mosquito, ácaro, piolho, ou carrapato), a alteração resultando em um decréscimo da aptidão do hospedeiro. A invenção apresenta uma composição que inclui um agente modulador (por exemplo, fago, peptídeo, molécula pequena, antibiótico, ou suas combinações) que pode alterar a microbiota do hospedeiro de um modo que é prejudicial para o hospedeiro. Por disrupção de níveis microbianos, atividade microbiana, metabolismo microbiano, ou diversidade microbiana, o agente modulador descrito aqui pode ser usado para decrescer a aptidão de uma variedade de insetos que transportam patógenos transmitidos por vetores que causam doença em animais.
[00130] Os métodos e composições descritos aqui são baseados, em parte, nos exemplos proporcionados aqui, que ilustram como agentes moduladores, por exemplo antibióticos (por exemplo, oxitetraciclina, doxiciclina, ou uma combinação desses) podem ser usados para visar micro-organismos simbióticos em um hospedeiro (por exemplo, endossimbiontes em vetores de inseto de patógenos de animais, por exemplo, Woibachia endossimbiótico em mosquitos ou Rickettsia em carrapatos) para decrescer a aptidão do hospedeiro por alteração do
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40/321 nível, atividade, ou metabolismo dos mícro-organismos dentro dos hospedeiros. Oxitetraciclina e doxiciclina são exemplos representativos de antibióticos úteis para este propósito. Nesta base, a presente revelação descreve uma variedade de diferentes abordagens para o uso de agentes que alteram um nível, atividade, ou metabolismo de um ou mais mícro-organismos residentes em um hospedeiro (por exemplo, um vetor de um patógeno de animais, por exemplo, um mosquito, ácaro, piolho ou um carrapato), a alteração resultando em um decréscimo da aptidão do hospedeiro.
L Hospedeiros
/. Hospedeiros [00131] Os métodos e composições proporcionados aqui podem ser usados com qualquer hospedeiro de inseto que seja considerado um vetor para um patógeno que é capaz de causar doença em animais.
[00132] Por exemplo, o hospedeiro de inseto pode incluir, mas não está limitado àqueles com partes bucais perfuradoras-sugadoras, como presentes em Hemiptera e alguns Hymenoptera e Diptera como mosquitos, abelhas, vespas, cecidomídeos, piolhos, mosca tsé-tsé, pulgas e formigas, bem como membros de Arachnidae como carrapatos e ácaros; ordem, classe ou família de Acarina (carrapatos e ácaros), por exemplo, representativos das famílias Argasidae, Dermanyssidae, Ixodidae, Psoroptidae ou Sarcoptidae e representativos das espécies Amblyomma spp., Anocenton spp., Argas spp., Boophiíus spp., Cheyletiella spp., Choríoptes spp., Demodex spp., Dermacentor spp., Denmanyssus spp., Haemophysalis spp., Hyalomma spp., Ixodes spp., Lynxacarus spp., Mesostigmata spp., Notoednes spp., Ornithodoros spp., Ornithonyssus spp., Otobius spp., Otodectes spp., Pneumonyssus spp., Psoroptes spp., Rhipicephalus spp., Sancoptes spp., ou Trombicula spp.; Anoplura (piolhos sugadores e mordedores), por exemplo, representativos das espécies Bovicola spp., Haematopinus
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41/321 spp., Linognathus spp., Menopon spp., Pediculus spp., Pemphigus spp., Phylloxera spp., ou Solenopotes spp.; Diptera (moscas), por exemplo, representativos das espécies Aedes spp., Anopheles spp., Calliphora spp., Chrysomyia spp., Chrysops spp., Cochllomyia spp., Cw/ex spp., Culicoides spp., Cuterebra spp., Denmatobia spp., Gastrophilus spp., Glossina spp., Haematobia spp., Haematopota spp., Hippobosca spp., Hypoderma spp., Lucilia spp., Lyperosia spp., Melophagus spp., Oestrus spp., Phaenicia spp., Phlebotomus spp., Phormia spp., Acari (sarna sarcóptica), por exemplo, Sarcoptidae spp., Sarcophaga spp., Simulium spp., Stomoxys spp., Tabanus spp., Tannia spp. ou Zzpu/alpha spp.; Mallophaga (piolhos mordedores), por exemplo, representativos das espécies Damalina spp., Felicola spp., Heterodoxos spp. ou Tríchodectes spp.; ou Siphonaptera (insetos sem asas), por exemplo, representativos das espécies Ceratophyllus spp., Xenopsylla spp; Cimicidae (percevejos), por exemplo representativos das espécies Cimex spp., Tritominae spp., Rhodinius spp., ou Tri atoma spp.
[00133] Em alguns casos, o inseto é um inseto sugador de sangue da ordem Diptera (por exemplo, subordem Nematocera, por exemplo, família Colicidae). Em alguns casos, o inseto é das subfamílias CulicF nae, Corethrinae, Ceratopogonidae, ou Simuliidae. Em alguns casos, o inseto é de uma Culex spp., Theobaldia spp., Aedes spp., Anopheles spp., Aedes spp., Forciponiyia spp., Culicoides spp., ou Helea spp.
[00134] Em certos casos, o inseto é um mosquito. Em certos casos, o inseto é um carrapato. Em certos casos, o inseto é um ácaro. Em certos casos, o inseto é um piolho mordedor.
ii. Aptidão de Hospedeiros [00135] Os métodos e composições proporcionados aqui podem ser usados para decrescer a aptidão de quaisquer dos hospedeiros descritos aqui. O decréscimo da aptidão pode surgir de quaisquer alterações
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42/321 em micro-organismos residentes no hospedeiro, em que as alterações são uma consequência da administração de um agente modulador e têm efeitos prejudiciais no hospedeiro.
[00136] Em alguns casos, o decréscimo da aptidão do hospedeiro pode se manifestar como uma deterioração ou declínio da fisiologia do hospedeiro (por exemplo, saúde ou sobrevivência reduzida) em consequência da administração de um agente modulador. Em alguns casos, a aptidão de um organismo pode ser medida por um ou mais parâmetros, incluindo, mas não se limitando a, taxa reprodutiva, expectativa de vida, mobilidade, fecundidade, peso do corpo, taxa metabólica ou atividade, ou sobrevivência em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado. Por exemplo, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para decrescer a saúde global do hospedeiro ou para decrescer a sobrevivência global do hospedeiro. Em alguns casos, a sobrevivência decresoida do hospedeiro é cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% maior relativamente a um nível de referência (por exemplo, um nível presente em um hospedeiro que não recebe um agente modulador). Em alguns casos, os métodos e composições são eficazes para decrescer a reprodução (por exemplo, taxa reprodutiva) do hospedeiro em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado. Em alguns casos, os métodos e composições são eficazes para decrescer outros parâmetros fisiológicos, como mobilidade, peso do corpo, expectativa de vida, fecundidade, ou taxa metabólica, em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% relativamente a um nível de referência (por exemplo, um nível presente em um hospedeiro que não recebe um agente modulador).
[00137] Em alguns casos, o decréscimo da aptidão do hospedeiro
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43/321 pode se manifestar como um decréscimo da produção de um ou mais nutrientes no hospedeiro (por exemplo, vitaminas, carboidratos, aminoácidos, ou polipeptideos). Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para decrescer a produção de nutrientes no hospedeiro (por exemplo, vitaminas, carboidratos, aminoácidos, ou polipeptideos) em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% relativamente a um nível de referência (por exemplo, um nível presente em um hospedeiro que não recebe um agente modulador). Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem decrescer nutrientes no hospedeiro por decréscimo da produção de nutrientes por um ou mais micro-organismos (por exemplo, endossimbionte) no hospedeiro em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado.
[00138] Em alguns casos, o decréscimo da aptidão do hospedeiro pode se manifestar como um aumento da sensibilidade do hospedeiro a um agente pesticida (por exemplo, um pesticida listado na Tabela 12) e/ou um decréscimo da resistência do hospedeiro a um agente pesticida (por exemplo, um pesticida listado na Tabela 12) em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado. Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para aumentar a sensibilidade do hospedeiro a um agente pesticida (por exemplo, um pesticida listado na Tabela 12) em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% relativamente a um nível de referência (por exemplo, um nível presente em um hospedeiro que não recebe um agente modulador). O agente pesticida pode ser qualquer agente pesticida conhecido na técnica, incluindo agentes inseticidas. Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem aumentar a sensibilidade do hospedeiro a um agente
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44/321 pesticida (por exemplo, um pesticida listado na Tabela 12) por decréscimo da capacidade do hospedeiro para metaboiizar ou degradar o agente pesticida em substratos usáveis em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado. [00139] Em alguns casos, o decréscimo da aptidão do hospedeiro pode se manifestar como um aumento da sensibilidade do hospedeiro a um agente aleloquímico e/ou um decréscimo da resistência do hospedeiro a um agente aleloquímico em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado. Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para decrescer a resistência do hospedeiro a um agente aleloquímico em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% relativamente a um nível de referência (por exemplo, um nível presente em um hospedeiro que não recebe um agente modulador). Em alguns casos, o agente aleloquímico é cafeína, cistatina de sementes de soja N, monoterpenos, ácidos de diterpenos, ou compostos fenólicos. Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem aumentar a sensibilidade do hospedeiro a um agente aleloquímico por decréscimo da capacidade do hospedeiro para metaboiizar ou degradar o agente aleloquímico em substratos usáveis em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado.
[00140] Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para matar a resistência do hospedeiro a parasitas ou patógenos (por exemplo, patógenos ou parasitas fúngicos, bacterianos, ou virais) em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado. Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para decrescer a resistência do hospedeiro a um patógeno ou parasita (por exemplo, patógenos fúngicos, bacterianos, ou virais; ou
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45/321 ácaros parasitários) em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais do que 100% relativamente a um nível de referência (por exemplo, um nível presente em um hospedeiro que não recebe um agente modulador).
[00141] Em alguns casos, o decréscimo da aptidão do hospedeiro pode se manifestar como outras desvantagens de aptidão, como tolerância decrescida a certos fatores ambientais (por exemplo, uma tolerância a temperatura elevada ou baixa), capacidade decrescida para sobreviver em certos habitats, ou uma capacidade decrescida para manter uma certa dieta em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado. Em alguns casos, os métodos ou composições proporcionados aqui podem ser eficazes para decrescer a aptidão do hospedeiro em qualquer pluralidade de modos descritos aqui. Além disso, o agente modulador pode decrescer a aptidão do hospedeiro em qualquer número de classes, ordens, famílias, gêneros, ou espécies de hospedeiros (por exemplo, 1 espécie de hospedeiro, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 200, 250, 500, ou mais espécies de hospedeiros). Em alguns casos, o agente modulador atua em uma única classe, ordem, família, gênero, ou espécie de hospedeiro.
[00142] A aptidão do hospedeiro pode ser avaliada usando quaisquer métodos padrão da técnica. Em alguns casos, a aptidão do hospedeiro pode ser avaliada por avaliação de um hospedeiro individual. Alternativamente, a aptidão do hospedeiro pode ser avaliada por avaliação de uma população de hospedeiros. Por exemplo, um decréscimo da aptidão do hospedeiro pode se manifestar como um decréscimo da competição bem-sucedida contra outros insetos, desse modo conduzindo a um decréscimo do tamanho da população do hospedeiro.
/77. Insetos hospedeiros em transmissão de doenças [00143] Ao decrescer a aptidão de insetos hospedeiros que trans
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46/321 portam patógenos de animais, os agentes moduladores proporcionados aqui são eficazes para reduzir a disseminação de doenças transmitidas por vetores. O agente modulador pode ser administrado aos insetos usando quaisquer das formulações e métodos de administração descritos aqui, em uma quantidade e durante um período de tempo eficaz para reduzir a transmissão da doença, por exemplo, reduzir a transmissão vertical ou horizontal entre vetores e/ou reduzir a transmissão para animais. Por exemplo, o agente modulador descrito aqui pode reduzir a transmissão vertical ou horizontal de um patógeno transmitido por vetores em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado. Como outro exemplo, o agente modulador descrito aqui pode reduzir a competência vetorial de um vetor de inseto em cerca de 2%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100% ou mais em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado.
[00144] Exemplos não limitadores de doenças que podem ser controladas pelas composições e métodos proporcionados aqui incluem doenças causadas por vírus Togavirídae (por exemplo, Chikungunya, febre de Ross River, Mayaro, febre de Onyon-nyong, febre de Sindbis, encefalomielite equina oriental, encefalomielite equina ocidental, encefalomielite equina venezuelana, ou floresta de Barmah); doenças causadas por vírus Fiavivirdae (por exemplo, Febre de Dengue, Febre amarela, doença da Floresta de Kyasanur, febre hemorrágica de Omsk, encefalite japonesa, encefalite de Murray Valley, Rocio, encefalite de St. Louis, encefalite do Nilo ocidental, ou Encefalite transmitida pelo carrapato); doenças causadas por vírus Bunyavindae (por exemplo, febre de Sandly, febre de Rift Valley, encefalite de La Crosse, encefalite da Califórnia, febre hemorrágica da Crimeia-Congo, ou febre
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47/321 de Oropouche); doença causada por vírus Rhabdoviridae (por exemplo, Estomatite vesicular); doença causada por Orbiviridae (por exemplo, Língua azul); doenças causadas por bactérias (por exemplo, Peste, Tularemia, febre Q, febre maculosa das Montanhas Rochosas, Tifo murino, febre de Boutonneuse, tifo do carrapato de Queensland, tifo do carrapato siberiano, Tifo dos arbustos, Febre recorrente, ou doença de Lyme); ou doenças causadas por protozoários (por exemplo, Malária, tripanossomíase africana, Nagana, doença de Chagas, Leishmaniose, Piroplasmose, Filariose bancroftiana, ou Filariose brugiana).
II. Micro-organismos-Alvo [00145] Os micro-organismos visados pelo agente modulador descrito aqui podem incluir qualquer micro-organismo residente em ou sobre o hospedeiro, incluindo, mas não se limitando a, quaisquer bactérias e/ou fungos descritos aqui. Micro-organismos residentes no hospedeiro podem incluir, por exemplo, micro-organismos simbióticos (por exemplo, micro-organismos endossimbióticos que proporcionam nutrientes ou enzimas benéficos para o hospedeiro), comensais, patogênicos, ou parasitários. Um micro-organismo endossimbiótico pode ser um endossimbionte primário ou um endossimbionte secundário. Um micro-organismo simbiótico (por exemplo, bactérias ou fungos) pode ser um simbionte obrigatório do hospedeiro ou a simbionte facultativo do hospedeiro. Micro-organismos residentes no hospedeiro podem ser adquiridos por qualquer modo de transmissão, incluindo transmissão vertical, horizontal, ou múltiplas origens de transmissão.
/, Bactérias [00146] Bactérias exemplificativas que podem ser visadas de acordo com os métodos e composições proporcionados aqui, incluem, mas não se limitam a, Xenorhabdus spp, Photorhabdus spp, Candidates spp, Buchnera spp, Biattabacterium spp, Baumanía spp, Wigglesworthia spp, Wolbachia spp, Rickettsia spp, Orientia spp, Sodaiis spp,
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Burkholderia spp, Cupriavidus spp, Frankia spp, Snirhlzobium spp, Streptococcus spp, Wolinella spp, Xylella spp, Erwinia spp, Agrobacterium spp, Bacillus spp, Paenibacillus spp, Streptomyces spp, Micrococcus spp, Corynebacterium spp, Acetobacter spp, Cyanobacteria spp, Salmonella spp, Rhodococcus spp, Pseudomonas spp, Lactobacillus spp, Enterococcus spp, Alcaligenes spp, Klebsiella spp, Paenibacillus spp, Arthrobacter spp, Corynebacterium spp, Brevlbacterium spp, Thermus spp, Pseudomonas spp, Clostridium spp, e Escherichia spp. Exemplos não limitadores de bactérias que podem ser visadas pelos métodos e composições proporcionados aqui são mostrados na Tabela 1. Em alguns casos, a sequência de rRNA 16S das bactérias visadas pelo agente modulador tem pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99%, 99,9% ou 100% de identidade com uma sequência listada na Tabela 1.
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Tabela 1: Exemplos de Bactérias-Alvo e Insetos Hospedeiros
Endossimbionte primário Hospedeiro Localização rRNA16S
Proteobactérlas gama
Carsoneiía ruddíi Psilídeos (Psylloídeá) bacteriócitos TATCCAGCCACAGGTTCCCCTACAGCTACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTT ACAAATCATACCGTTGTAATAGTAAAATTACTTATGATACAATTTACTTCCATG GTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCTCGAGAACGTATTCACCGTAACATTCT GATTTACGATTACTAGCGATTCCAACTTCATGAAATCGAGTTACAGATTTCAA TCCGAACTAAGAATATTTTTTAAGATTAGCATTATGTTGCCATATAGCATATAA CTTTTTGTAATACTCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACTTATAAGGGCCATG ATGACTTGACGTCGTCCTCACCTTCCTCCAATTTATCATTGGCAGTTTCTTATT AGTTCTAATATATTTTTAGTAAAATAAGATAAGGGTTGCGCTCGTTATAGGACT TAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTC AAAGCTAAAAAAGCTTTATTATTTCTAATAAATTCTTTGGATGTCAAAAGTAGG TAAGATTTTTCGTGTTGTATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGA GCCCCCGTCAATTCATTTGAG Η IIAACCTTGCGGTCGTAATCCCCAGGCGG TCAACTTAACGCGTTAGCTTTTTCACTAAAAATATATAACTTTTTTTCATAAAAC AAAATTACAATTATAATATTTAATAAATAGTTGACATCGTTTACTGCATGGACT ACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCATGCTTTCGTGTATTAGTGTCAGT ATTAAAATAGAAATACGCCTTCGCCACTAGTATTCTTTCAGATATCTAAGCATT TCACTGCTACTCCTGAAATTCTAATTTCTTCTTTTATACTCAAGTTTATAAGTAT TAATTTCAATATTAAATTACTTTAATAAATTTAAAAATTAATTTTTAAAAACAACC TGCACACCCTTTACGCCCAATAATTCCGATTAACGCTTGCACCCCTCGTATTA CCGCGGCTGCTGGCACGAAGTTAGCCGGTGCTTC II IIACAAATAACGTCAA AGATAATATTTTTTTATTATAAAATCTCTTCTTACTTTGTTGAAAGTGTTTTACA ACCCTAAGGCCTTCTTCACACACGCGATATAGCTGGATCAAGCTTTCGCTCA TTGTCCAATATCCCCCACTGCTGCCTTCCGTAAAAGTTTGGGCCGTGTCTCA GTCCCAATGTGGTTGTTCATCCTCTAAGATCAACTACGAATCATAGTCTTGTT
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AAGCTTTTACTTTAACAACTAACTAATTCGATATAAGCTCTTCTATTAGCGAAC GACATTCTCGTTCTTTATCCATTAGGATACATATTGAATTACTATACATTTCTA TATACTTTTCTAATACTAATAGGTAGATTCTTATATATTACTCACCCGTTCGCT GCTAATTATTTTTTTAATAATTCGCACAACTTGCATGTGTTAAGCTTATCGCTA GCGTTCAATCTGAGCTATGATCAAACTCA (SEQ ID NO: 1)
Portiera aleyrodidarum BT-B Moscas brancas (Aleyrodoidea) bacteriócitos AAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTAGCGGCAGACATAACACATGC AAGTCGAGCGGCATCATACAGGTTGGCAAGCGGCGCACGGGTGAGTAATAC ATGTAAATATACCTAAAAGTGGGGAATAACGTACGGAAACGTACGCTAATAC CGCATAATTATTACGAGATAAAGCAGGGGCTTGATAAAAAAAATCAACCTTGC GCTTTTAGAAAATTACATGCCGGATTAGCTAGTTGGTAGAGTAAAAGCCTACC AAGGTAACGATCCGTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACT GAGAAAAGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAA TGGGGGGAACCCTGATCCAGTCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTTGGG TTGTAAAGCACTTTCAGCGAAGAAGAAAAGTTAGAAAATAAAAAGTTATAACT ATGACGGTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCG GTAAGACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCAGAATTACTGGGCGTAAAGGGCAT GTAGGTGGTTTGTTAAGCTTTATGTGAAAGCCCTATGCTTAACATAGGAACG GAATAAAGAACTGACAAACTAGAGTGCAGAAGAGGAAGGTAGAATTCCCGGT GTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCTGGAGGAATACCAGTTGCGAAGGCGAC CTTCTGGGCTGACACTGACACTGAGATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGG ATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATATCAACTAGCCGTTGGATT CTTAAAGAA II IIGTGGCGTAGCTAACGCGATAAGTTGATCGCCTGGGGAGT ACGGTCGCAAGGCTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGG TGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGCAAAACCTTACCTACTCTTGA CATCCAAAGTACTTTCCAGAGATGGAAGGGTGCCTTAGGGAACTTTGAGACA GGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCC GTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCCAACGCATAAGGCGGGAACTTT AAGGAGACTGCTGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCA
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TCATGGCCCTTAAGAGTAGGGCAACACACGTGCTACAATGGCAAAAACAAAG GGTCGCAAAATGGTAACATGAAGCTAATCCCAAAAAAATTGTCTTAGTTCGGA TTGGAGTCTGAAACTCGACTCCATAAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAAT CAGAATGTCACGGTGAATACGTTCTCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACA CCATGGAAGTGAAATGCACCAGAAGTGGCAAGTTTAACCAAAAAACAGGAGA ACAGTCACTACGGTGTGGTTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCT GTAGGGGAACCTGTGGCTGGATCACCTCCTTAA (SEQ ID NO: 2)
Buchnera aphidicola estirpe APS (Acyrtho- siphon pisum) Afídeos (Aphídoídeá) bacteriócitos AGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAAGCCTAACACATGCA AGTCGAGCGGCAGCGAGAAGAGAGCTTGCTCTCTTTGTCGGCAAGCGGCAA ACGGGTGAGTAATATCTGGGGATCTACCCAAAAGAGGGGGATAACTACTAGA AATGGTAGCTAATACCGCATAATGTTGAAAAACCAAAGTGGGGGACCTTTTG GCCTCATGC Η II GGATGAACCCAGACGAGATTAGCTTGTTGGTAGAGTAAT AGCCTACCAAGGCAACGATCTCTAGCTGGTCTGAGAGGATAACCAGCCACA CTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATA TTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCTATGCCGCGTGTATGAAGAAGG CCTTAGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAAAAAATAAAACTAATAAT TTTATTTCGTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGC AGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCAGAATTACTGGGCGTAA AGAGCGCGTAGGTGGTTTTTTAAGTCAGGTGTGAAATCCCTAGGCTCAACCT AGGAACTGCATTTGAAACTGGAAAACTAGAGTTTCGTAGAGGGAGGTAGAAT TCTAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCTGGAGGAATACCCGTGGCGA AAGCGGCCTCCTAAACGAAAACTGACACT GAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGC AAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCGACTTGGA GGTTGTTTCCAAGAGAAGTGACTTCCGAAGCTAACGCATTAAGTCGACCGCC TGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGC ACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCT GGTCTTGACATCCACAGAATTCTTTAGAAATAAAGAAGTGCCTTCGGGAGCT GTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGG
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TTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCCCTGTTGCCAGCGGTTCGGC CGGGAACTCAGAGGAGACTGCCGGTTATAAACCGGAGGAAGGTGGGGACG ACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGG TTTATACAAAGAGAAGCAAATCTGCAAAGACAAGCAAACCTCATAAAGTAAAT CGTAGTCCGGACTGGAGTCTGCAACTCGACTCCACGAAGTCGGAATCGCTA GTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACA CCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGCAGGTATCCTAACC CTTTAAAAGGAAGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCG TAACAAGGTAACCGTAGGGGAACCTGCGGTTGGATCACCTCCTT (SEQ ID NO: 3)
Buchnera aphídícola estirpe Sg (Schizaphís graminum) Afídeos (Aphidoidea) bacteriócitos AAACTGAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAAGCCTAAC ACATGCAAGTCGAGCGGCAGCGAAAAGAAAGCTTGCTTTCTTGTCGGCGAG CGGCAAACGGGTGAGTAATATCTGGGGATCTGCCCAAAAGAGGGGGATAAC TACTAGAAATGGTAGCTAATACCGCATAAAGTTGAAAAACCAAAGTGGGGGA CC II II IIAAAGGCC I CA I GCI I I IGGATGAACCCAGACGAGATTAGCTTGTT GGTAAGGTAAAAGCTTACCAAGGCAACGATCTCTAGCTGGTCTGAGAGGATA ACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCA GTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCTATGCCGCGTGT ATGAAGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAAAAATTA AAACTAATAATTTTATTTTGTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACT CCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCAGAATTA CTGGGCGTAAAGAGCACGTAGGTGGTTTTTTAAGTCAGATGTGAAATCCCTA GGCTTAACCTAGGAACTGCATTTGAAACTGAAATGCTAGAGTATCGTAGAGG GAGGTAGAATTCTAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCTGGAGGAATAC CCGTGGCGAAAGCGGCCTCCTAAACGAATACTGACACTGAGGTGCGAAAGC GTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGT CGACTTGGAGGTTGTTTCCAAGAGAAGTGACTTCCGAAGCTAACGCGTTAAG TCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAATGAATTGACG GGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAA
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AACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAATTTTTTAGAAATAAAAAAGTGCCT TCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGA AATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCCCTGTTGCCAGC GGTTCGGCCGGGAACTCAGAGGAGACTGCCGGTTATAAACCGGAGGAAGGT GGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGC TACAATGGTTTATACAAAGAGAAGCAAATCTGTAAAGACAAGCAAACCTCATA AAGTAAATCGTAGTCCGGACTGGAGTCTGCAACTCGACTCCACGAAGTCGGA ATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTT GTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGCAGATTT CCTAACCACGAAAGTGGAAGGCGTCTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGT GAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAACCTGCGGTTGGATCACCTCCTTA (SEQ ID NO: 4)
Buchnera aphidicola estirpe Bp (Baizongia pistaciae) Afídeos (Aphidoidea) bacleriócitos ACTTAAAATTGAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAAGC TTAACACATGCAAGTCGAGCGGCATCGAAGAAAAGTTTACTTTTCTGGCGGC GAGCGGCAAACGGGTGAGTAACATCTGGGGATCTACCTAAAAGAGGGGGAC AACCATTGGAAACGATGGCTAATACCGCATAATGTTTTTAAATAAACCAAAGT AGGGGACTAAAATTTTTAGCCTTATGCTTTTAGATGAACCCAGACGAGATTAG CTTGATGGTAAGGTAATGGCTTACCAAGGCGACGATCTCTAGCTGGTCTGAG AGGATAACCAGCCACACTGGAACTGAGATACGGTCCAGACTCCTACGGGAG GCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCTAAAGCCTGATGCAGCTATGCC GCGTGTATGAAGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAA AGAATTATGTCTAATATACATATTTTGTGACGTTACCCGAAGAAGAAGCACCG GCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATC AGAATTACTGGGCGTAAAGAGCACGTAGGCGGTTTATTAAGTCAGATGTGAA ATCCCTAGGCTTAACTTAGGAACTGCATTTGAAACTAATAGACTAGAGTCTCA TAGAGGGAGGTAGAATTCTAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCTAGAG GAATACCCGTGGCGAAAGCGACCTCCTAAATGAAAACTGACGCTGAGGTGC GAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCTGTAAA CGATGTCGACTTGGAGGTTGTTTCCTAGAGAAGTGGCTTCCGAAGCTAACGC
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ATTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGGCTAAAACTCAAATGAAT TGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACG CGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCATAGAATTTTTTAGAGATAAAAGAG TGCCTTAGGGAACTATGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTT GTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTATCCTTTGTTGC CATCAGGTTATGCTGGGAACTCAGAGGAGACTGCCGGTTATAAACCGGAGG AAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACA CGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGATGCAACTCTGCGAAGATAAGCAAAC CTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGACTGGAGTCTGCAACTCGACTCCACGAA GTAGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCG GGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGC AGGTAGCTTAACCAGATTAI I I IATTGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCA TGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAACCTGCGGTTGGA TCACCTCCTTA (SEQ ID NO: 5)
Buchnera aphidicola BCc Afídeos (Aphídoídeá) bacteriócitos ATGAGATCATTAATATATAAAAATCATGTTCCAATTAAAAAATTAGGACAAAAT TTTTTACAGAATAAAGAAATTATTAATCAGATAATTAATTTAATAAATATTAATA AAAATGATAATATTATTGAAATAGGATCAGGATTAGGAGCGTTAACTTTTCCTA TTTGTAGAATCATTAAAAAAATGATAGTATTAGAAATTGATGAAGATCTTGTGT TTTTTTTAACTCAAAGTTTATTTATTAAAAAATTACAAATTATAATTGCTGATATT ATAAAATTTGATTTTTGTTGTTTTTTTTCTTTACAGAAATATAAAAAATATAGGT TTATTGGTAATTTACCATATAATATTGCTACTATATTTTTTTTAAAAACAATTAA ATTTCTTTATAATATAATTGATATGCATTTTATGTTTCAAAAAGAAGTAGCAAA GAGATTATTAGCTACTCCTGGTACTAAAGAATATGGTAGATTAAGTATTATTG CACAATATTTTTATAAGATAGAAACTGTTATTAATGTTAATAAATTTAATTTTTT TCCTACTCCTAAAGTAGATTCTACTTTTTTACGATTTACTCCTAAATATTTTAAT AGTAAATATAAAATAGATAAACAI I I I ICIÜI I I IAGAAII AA II AC I AGA II II CTTTTCAACATAGAAGAAAATTTTTAAATAATAATTTAATATCTTTATTTTCTAC AAAAGAATTAATTTCTTTAGATATTGATCCATATTCAAGAGCAGAAAATGTTTC TTTAATTCAATATTGTAAATTAATGAAATATTATTTGAAAAGAAAAA II IIATGT
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TTAGATTAA (SEQ ID NO: 6)
Buchners aphidicola (Cinara tujafílina) Afídeos (Aphidoidea) bacteriócitos TTATCTTATTTCACATATACGTAATATTGCGCTGCGTGCACGAGGATTTTTTTG AATTTCAGATATATTTGGTTTAATACGTTTAATAAAACGTATTTTTTTTTTTATTT TTCTTATTTGCAATTCAGTAATAGGAAGTTTTTTAGGTATATTTGGATAATTAC TGTAATTCTTAATAAAGTTTTTTACAATCCTATCTTCAATAGAATGAAAACTAAT AATAGCAATTTTTGATCCGGAATGTAATATGTTAATAATAATTTTTAATATTTTA TGTAATTCATTTATTTCTTGGTTAATATATATTCGAAAAGCTTGAAATGTTCTC GTAGCTGGATGTTTAAATTTGTCATATTTTGGGATTGATTTTTTTATGATTTGA ACTAACTCTAACGTGCTTGTTATGGTTTTTTTTTTTATTTGTAATATGATGGCT CGGGATAI I I Η I I IÜCG IAI I I I I CIICGCCAAAAI I II I IATTACCTGTTCTA TTGTTTTTTGGTTTGTTTTTTTTAACCATTGACTAACTGATATTCCAGATTTAGG GTTCATACGCATATCTAAAGGTCCATCATTCATAAATGAAAATCCTCGGATAC TAGAATTTAACTGTATTGAAGAAATACCTAAATCTAATAATATTCCATCTAI I I i ATCTCTATTTTTTTCTTTTTTTAATATTTTTTCAATATTAGAAAATTTACCTAAAA ATATTTTAAATCGCGAATCTTTTAI I I II I I I CCGAI I II IATAGATTGTGGGTC TTGATCAATACTATATAACTTTCCATTAACCCCTAATTCTTGAAGAATTGCTTT TGAATGACCACCACCTCCAAATGTACAATCAACATATGTACCGTCTTTTTTTAT I I I lAAGTATTGTATGATTTCTTTTGTTAAAACAGGTTTATGAATCAT (SEQ ID NO: 7)
Buchnera aphidicola estirpe G002 (Myzus persicae) Afídeos (Aphidoidea) bacteriócitos ATGAAAAGTATAAAAACTTTTAAAAAACACTTTCCTGTGAAAAAATATGGACAA AATTTTCTTATTAATAAAGAGATCATAAAAAATATTGTTAAAAAAATTAATCCAA ATATAGAACAAACATTAGTAGAAATCGGACCAGGATTAGCTGCATTAACTGAG CCCATATCTCAGTTATTAAAAGAGTTAATAGTTATTGAAATAGACTGTAATCTA TTATAI II I I IAAA.AAAACAACC.AI I I IAI ICAAAAI IAAI AG I I I I I I GTCAAG ATGCTTTAAACTTTAATTATACAAATTTAI II IATAAAAAAAATAAATTAATTCG TATTTTTGGTAATTTACCATATAATATCTCTACATCTTTAATTATTTTTTTATTTC AACACATTAGAGTAATTCAAGATATGAAI I I IATGCTTCAAAAAGAAGTTGCTG CAAGATTAATTGCATTACCTGGAAATAAATATTACGGTCGTTTGAGCATTATAT CTCAATATTATTGTGATATCAAAATTTTATTAAATGTTGCTCCTGAAGATTTTTG
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GCCTATTCCGAGAGTTCATTCTATATTTGTAAATTTAACACCTCATCATAATTC TCCTTATTTTGTTTATGATATTAATATTTTAAGCCTTATTACAAATAAGGCTTTC CAAAATAGAAGAAAAATATTACGTCATAGTTTAAAAAATTTATTTTCTGAAACA ACTTTATTAAATTTAGATATTAATCCCAGATTAAGAGCTGAAAATATTTCTGTTT TTCAGTATTGTCAATTAGCTAATTATTTGTATAAAAAAAATTATACTAAAAAAAA TTAA (SEQ ID NO: 8)
Buchnera aphidicola estirpe Ak (Acyríhosiphon kondoi) Afídeos (Aphidoidea) bacteriócitos ATTATAAAAAATTTTAAAAAACATTTTCCTTTAAAAAGGTATGGACAAAATTTTC TTGTCAATACAAAAACTATTCAAAAGATAATTAATATAATTAATCCAAACACCA AACAAACATTAGTGGAAATTGGACCTGGATTAGCTGCATTAACAAAACCAATT TGTCAATTATTAGAAGAATTAATTGTTATTGAAATAGATCCTAATTTATTG I I i i TATTAAAAAAACGTTCATTTTATTCAAAATTAACAGTTTTTTATCAAGACGCTTT AAATTTCAATTATACAGATTTGTTTTATAAGAAAAATCAATTAATTCGTGTTTTT GGAAACTTGCCATATAATATTTCTACATCTTTAATTATTTCTTTATTCAATCATA TTAAAGTTATTCAAGATATGAATTTTATGTTACAGAAAGAGGTTGCTGAAAGAT TAATTTCTATTCCTGGAAATAAATCTTATGGCCGTTTAAGCATTATTTCTCAGT ATTATTGTAAAATTAAAATATTATTAAATGTTGTACCTGAAGAI I I I CGACCTAT ACCGAAAGTGCATTCTGTTTTTATCAATTTAACTCCTCATACCAATTCTCCATA I I I í GI I IAIGA í ACAAAIAI CG I GAG I IC IAI CACAAGAAA i GG i I IICAAAA TAGAAGGAAAATTTTGCGTCATAGTTTAAAAAATTTATTTTCTGAAAAAGAACT AATTCAATTAGAAATTAATCCAAATTTACGAGCTGAAAATATTTCTATCTTTCA GTATTGTCAATTAGCTGATTATTTATATAAAAAATTAAATAATCTTGTAAAAATC AATTAA (SEQ ID NO: 9)
Buchnera aphidicola estirpe Ua (Uroleucon ambrosiae) Afídeos (Aphidoidea) bacteriócitos ATGATACTAAATAAATATAAAAAATTTATTCCTTTAAAAAGATACGGACAAAAT TTTCTTGTAAATAGAGAAATAATCAAAAATATTATCAAAATAATTAATCCTAAAA AAACGCAAACATTATTAGAAATTGGACCGGGTTTAGGTGCGTTAACAAAACCT ATTTGTGAATTTTTAAATGAACTTATCGTCATTGAAATAGATCCTAATATATTAT CTTTTTTAAAGAAATGTATATTTTTTGATAAATTAAAAATATATTGTCATAATGC TTTAGATTTTAATTATAAAAATATATTCTATAAAAAAAGTCAATTAATTCGTATT TTTGGAAATTTACCATATAATATTTCTACATCTTTAATAATATATTTATTTCGGA
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ATATTGATATTATTCAAGATATGAATTTTATGTTACAACAAGAAGTGGCTAAAA GATTAGTTGCTATTCCTGGTGAAAAACTTTATGGTCGTTTAAGTATTATATCTC AATATTATTGTAATATTAAAATATTATTACATATTCGACCTGAAAATTTTCAACC TATTCCTAAAGTTAATTCAATGTTTGTAAATTTAACTCCGCATATTCATTCTCCT TATTTTGTTTATGATATTAATTTATTAACTAGTATTACAAAACATGCTTTTCAAC ATAGAAGAAAAATATTGCGTCATAGTTTAAGAAAI Η II I IICTGAGCAAGATT TAATTCATTTAGAAATTAATCCAAATTTAAGAGCTGAAAATGTTTCTATTATTCA ATATTGTCAATTGGCTAATAATTTATATAAAAAACATAAACAGTTTATTAATAAT TAA (SEQ ID NO: 10)
Buchnera aphidicola (Aphis glycines) Afídeos (Aphídoídeá) bacteriócitos ATGAAAAAGCATATTCCTATAAAAAAATTTAGTCAAAATTTTCTTGTAGATTTG AGTGTGATTAAAAAAATAATTAAATTTATTAATCCGCAGTTAAATGAAATATTG GTTGAAATTGGACCGGGATTAGCTGCTATCACTCGACCTATTTGTGATTTGAT AGATCATTTAATTGTGATTGAAATTGATAAAAI I IIATTAGATAGATTAAAACA GTTCTCATTTTATTCAAAATTAACAGTATATCATCAAGATGCTTTAGCATTTGA TTACATAAAGTTATTTAATAAAAAAAATAAATTAGTTCGAATTTTTGGTAATTTA CCATATCATGTTTCTACGTCTTTAATATTGCATTTATTTAAAAGAATTAATATTA TTAAAGATATGAATTTTATGCTACAAAAAGAAGTTGCTGAACGTTTAATTGCAA CTCCAGGTAGTAAATTATATGGTCGTTTAAGTATTATTTCTCAATATTATTGTA ATATAAAAGTTTTATTGCATGTGTCTTCAAAATGTTTTAAACCAGTTCCTAAAG TAGAATCAATTTTTCTTAATTTGACACCTTATACTGATTATTTCCCTTATTTTAC TTATAATGTAAACGTTCTTAGTTATATTACAAATTTAGC INI CAAAAAAGAAG AAAAATATTACGTCATAGTTTAGGTAAAATATTTTCTGAAAAAGTTTTTATAAAA TTAAATATTAATCCCAAATTAAGACCTGAGAATATTTCTATATTACAATATTGTC AGTTATCTAATTATATGATAGAAAATAATATTCATCAGGAACATGTTTGTATTT AA (SEQ ID NO: 11)
Annandia pinicola (Phylloxeroidea) bacleriócltos AGATTGAACGCTGGCGGCATGCCTTACACATGCAAGTCGAACGGTAACAGG TCTTCGGACGCTGACGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTGC CCAGTCGTGGGGGATAACTACTCGAAAGAGTAGCTAATACCGCATACGATCT
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GAGGATGAAAGCGGGGGACCTTCGGGCCTCGCGCGATTGGAGCGGCCGAT GGCAGATTAGGTAGTTGGTGGGATAAAAGCTTACCAAGCCGACGATCTGTAG CTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGAACTGAGATACGGTCCAGACT CTTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATG CAGCTATGTCGCGTGTATGAAGAAGACCTTAGGGTTGTAAAGTACTTTCGAT AGCATAAGAAGATAATGAGACTAATAATTTTATTGTCTGACGTTAGCTATAGA AGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGGGGGTGC TAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGCATGTAGGTGGTTTATTAAG TCAGATGTGAAATCCCTGGACTTAATCTAGGAACTGCATTTGAAACTAATAGG CTAGAGTTTCGTAGAGGGAGGTAGAATTCTAGGTGTAGCGGTGAAATGCATA GATATCTAGAGGAATATCAGTGGCGAAGGCGACCTTCTGGACGATAACTGAC GCTAAAATGCGAAAGCATGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCC ATGCTGTAAACGATGTCGACTAAGAGGTTGGAGGTATAACTTTTAATCTCTGT AGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGGCTAAAAC TCAAATGAATTGACGGGGGCCTGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTC GATGCAACGCGTAAAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAATTTTACAGAA ATGTAGAAGTGCAATTTGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAG CTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCC TTTGTTACCATAAGATTTAAGGAACTCAAAGGAGACTGCCGGTGATAAACTG GAGGAAGGCGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTATGACCAGGGCTA CACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGATGCAATATTGCGAAATAAAGC CAATCTTATAAAATATGTCCTAGTTCGGACTGGAGTCTGCAACTCGACTCCAC GAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGCATGCCACGGTGAATATGTTT CCAGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGAAGTGGATTGCAAAAGA AGTAAGAAAATTAACCTTCTTAACAAGGAAATAACTTACCACTTTGTGACTCAT AACTGGGGTGA (SEQ ID NO: 12)
Moranella endobia (Coccoídea) bacíeriócitos TCTTTTTGGTAAGGAGGTGATCCAACCGCAGGTTCCCCTACGGTTACCTTGT TACGACTTCACCCCAGTCATGAATCACAAAGTGGTAAGCGCCCTCCTAAAAG
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GTTAGGCTACCTACTTCTTTTGCAACCCACTTCCATGGTGTGACGGGCGGTG TGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGGCATTCTGATCCACGATTACTA GCGATTCCTACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACG CACTTTATGAGGTCCGCTAACTCTCGCGAGCTTGCTTCTCTTTGTATGCGCC ATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTACTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCA TCCCCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGACCG AATCGCTGGCAAAAAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAA CATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCAGAGTTCC CGAAGGTACCAAAACATCTCTGCTAAGTTCTCTGGATGTCAAGAGTAGGTAA GGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGC CCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTC GATTTAACGCGTTAACTACGAAAGCCACAGTTCAAGACCACAGCTTTCAAATC GACATAGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCA CGCTTTCGTACCTGAGCGTCAGTATTCGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACT GGTATTCCTCCAGATATCTACACATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCCC CCTCTACGAGACTCTAGCCTATCAGTTTCAAATGCAGTTCCTAGGTTAAGCCC AGGGATTTCACATCTGACTTAATAAACCGCCTACGTACTCTTTACGCCCAGTA ATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGT TAGCCGGTGCTTCTTCTGTAGGTAACGTCAATCAATAACCGTATTAAGGATAT TGCCTTCCTCCCTACTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACA CGCGGCATGGCTGCATCAGGGTTTCCCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCT GCCTCCCGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGCTGGTCATC CTCTCAGACCAGCTAGGGATCGTCGCCTAGGTAAGCTATTACCTCACCTACT AGCTAATCCCATCTGGGTTCATCTGAAGGTGTGAGGCCAAAAGGTCCCCCAC TTTGGTCTTACGACATTATGCGGTATTAGCTACCGTTTCCAGCAGTTATCCCC CTCCATCAGGCAGATCCCCAGACTTTACTCACCCGTTCGCTGCTCGCCGGCA AAAAAGTAAACTTTTTTCCGTTGCCGCTCAACTTGCATGTGTTAGGCCTGCCG CCAGCGTTCAATCTGAGCCATGATCAAACTCTTCAATTAAA (SEQ ID NO: 13)
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Ishikawaella capsulata Mpkobe (Heteroptera) bacteriócitos AAATTGAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTAGCGGCAAGCTTAAC ACATGCAAGTCGAACGGTAACAGAAAAAAGCTTGCTTTTTTGCTGACGAGTG GCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGGATCTACCTAATGGCGGGGGATAACTA CTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAATGTTGTAAAACCAAAGTGGGGGACC TTATGGCCTCACACCATTAGATGAACCTAGATGGGATTAGCTTGTAGGTGGG GTAAAGGCTCACCTAGGCAACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAG CCACACTGGAACTGAGATACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGG GAATCTTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCTATGTCGCGTGTATGAAG AAGGCCTTAGGGTTGTAAAGTACTTTCATCGGGGAAGAAGGATATGAGCCTA ATATTCTCATATATTGACGTTACCTGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTG CCAGCAGCCGCGGTAACACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGG CGTAAAGAGCACGTAGGTGGTTTATTAAGTCATATGTGAAATCCCTGGGCTT AACCTAGGAACTGCATGTGAAACTGATAAACTAGAGTTTCGTAGAGGGAGGT GGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCTGGAGGAATATCAGAG GCGAAGGCGACCTTCTGGACGAAAACTGACACTCAGGTGCGAAAGCGTGGG GAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACAATGTCGACT AAAAAACTGTGAGCTTGACTTGTGGTTTTTGTAGCTAACGCATTAAGTCGACC GCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGTC CGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTA CCTGGTCTTGACATCCAGCGAATTATATAGAAATATATAAGTGCCTTTCGGGG AACTCTGAGACGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGT TAAGTCCCGCAACGAGCGCCCTTATCCTCTGTTGCCAGCGGCATGGCCGGG AACTCAGAGGAGACTGCCAGTATTAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTC AAGTCATCATGGCCCTTATGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTGTAT ACAAAGAGAAGCAATCTCGCAAGAGTAAGCAAAACTCAAAAAGTACATCGTA GTTCGGATTAGAGTCTGCAACTCGACTCTATGAAGTAGGAATCGCTAGTAAT CGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCTCTGGCCTTGTACACACCGCC CGTCACACCATGGGAGTAAGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTTATA GGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTTATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGG
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Petição 870190060758, de 28/06/2019, pág. 361/641
TAACTGTAGGGGAACCTGTGGTTGGATTACCTCCTTA (SEQ ID NO: 14)
Baumanonia cicadellinicola cigarrinhas (Cicadellinaé) bacteriócitos TTCAATTGAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGTAAGCTTA ACACATGCAAGTCGAGCGGCATCGGAAAGTAAATTAATTACTTTGCCGGCAA GCGGCGAACGGGTGAGTAATATCTGGGGATCTACCTTATGGAGAGGGATAA CTATTGGAAACGATAGCTAACACCGCATAATGTCGTCAGACCAAAATGGGGG ACCTAATTTAGGCCTCATGCCATAAGATGAACCCAGATGAGATTAGCTAGTA GGTGAGATAATAGCTCACCTAGGCAACGATCTCTAGTTGGTCTGAGAGGATG ACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCA GTGGGGAATCTTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCTATACCGCGTGT GTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGGGGAAGAAAATGAA GTTACTAATAATAATTGTCAATTGACGTTACCCGCAAAAGAAGCACCGGCTAA CTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAAGACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAAT TACTGGGCGTAAAGCGTATGTAGGCGGTTTATTTAGTCAGGTGTGAAAGCCC TAGGCTTAACCTAGGAATTGCATTTGAAACTGGTAAGCTAGAGTCTCGTAGA GGGGGGGAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAAGAA TACCAGTGGCGAAGGCGCCCCCCTGGACGAAAACTGACGCTCAAGTACGAA AGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACG ATGTCGATTTGAAGGTTGTAGCCTTGAGCTATAGCTTTCGAAGCTAACGCATT AAATCGACCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGA CGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATACAACGCGA AAAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGTATAAAGCAGAAAAGCTTTAGTGC CTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGT GAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCA ACGATTAAGTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAG GTGAGGATAACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTG CTACAATGGTGCATACAAAGAGAAGCAATCTCGTAAGAGTTAGCAAACCTCA TAAAGTGCATCGTAGTCCGGATTAGAGTCTGCAACTCGACTCTATGAAGTCG GAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGC
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Petição 870190060758, de 28/06/2019, pág. 362/641
CTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGTATTGCAAAAGAAGTTAGT AGCTTAACTCATAATACGAGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATAACTGG GGTGAAGTCGTAACAAGGTAACCGTAGGGGAACCTGCGGTTGGATCACCTC CTTACACTAAA (SEQ ID NO: 15)
Sodalis like Rhopalus sapporensis tropismo tecidual mais amplo ATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGCAGCGGGAA GAAGCTTGCTTCTTTGCCGGCGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGG ATCTGCCCGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATA ACGTCGCAAGACCAAAGTGGGGGACCTTCGGGCCTCACACCATCGGATGAA CCCAGGTGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGAT CCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTC CAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACC CTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCAC TTTCAGCGGGGAGGAAGGCGATGGCGTTAATAGCGCTATCGATTGACGTTA CCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGG AGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTACGCAGGCGGT CTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTGAA ACTGGCAGGCTAGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGT GAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGG ACGAAGACTGACGCTCAGGTACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGAT ACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGAAGGTTGTGGCCTTGA GCCGTGGCTTTCGGAGCTAACGTGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGC CGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAG CATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCA GAGAACTTGGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGC TGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAAC GAGCGCAACCCTTATCCTTTATTGCCAGCGATTCGGTCGGGAACTCAAAGGA GACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATG GCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAA
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Petição 870190060758, de 28/06/2019, pág. 363/641
GCGATCTCGCGAGAGTCAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATT GGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCA GAATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACAC CATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGC TTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGTG (SEQ ID NO: 16)
Hartigia pinicola O adelgídeo da casca do pinheiro bacteriócitos AGATTTAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGTACCAGA AGAAGCTTGCTTCTTGCTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTATGGGG ATCTGCCCGACAGAGGGGGATAACTATTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATA ATCTCTGAGGAGCAAAGCAGGGGAACTTCGGTCCTTGCGCTATCGGATGAA CCCATATGGGATTAGCTAGTAGGTGAGGTAATGGCTCCCCTAGGCAACGATC CCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCC AGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCC TGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCTTTAGGGTTGTAAAGTACTT TCAGTCGAGAGGAAAACATTGATGCTAATATCATCAATTATTGACGTTTCCGA CAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGG GTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTAA TTAAGTTAGATGTGAAAGCCCCGGGCTTAACCCAGGAATAGCATATAAAACT GGTCAACTAGAGTATTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAA T GCGTAGAGAT GT GGAGGAATACCAGTGGCGAAGGCGGCCCCCT GGACAAA AACTGACGCTCAAATGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT GGTAGTCCATGCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTTCCCTTGAGGAGT AGCTTCCGTAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGGAGTACGACTGCA AGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATG TGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGATA ATTTAGCAGAAATGCTTTAGTACCTTCGGGAAATCTGAGACAGGTGCTGCAT GGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGC GCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGATTAGGTCGGGAACTCAAAGGAGACT GCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCC
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Petição 870190060758, de 28/06/2019, pág. 364/641
TTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGGGAAGCAAC CTCGCGAGAGCAAGCGAAACTCATAAATTATGTCGTAGTTCAGATTGGAGTC TGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGC TACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGG AGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAACTTAACCTTATGGAAAGCGCTTACCAC TTTGTGATTCATAACTGGGGTG (SEQ ID NO: 17)
Wigglesworthía gtossinidia mosca tsé-tsé (Diptera: Gtossinidaé) bacteriócitos
Proteobactérias beta
Tremblaya phenacola Phenacoccus avenae (TPPAVE). bacteriomas AGGTAATCCAGCCACACCTTCCAGTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC AGTCACAACCCTTACCTTCGGAACTGCCCTCCTCACAACTCAAACCACCAAA CACTTTTAAATCAGGTTGAGAGAGGTTAGGCCTGTTACTTCTGGCAAGAATTA TTTCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGACCCGAGAACATATTCACCGT GGCATGCTGATCCACGATTACTAGCAATTCCAACTTCATGCACTCGAGTTTCA GAGTACAATCCGAACTGAGGCCGGCTTTGTGAGATTAGCTCCCTTTTGCAAG TTGGCAACTCTTTGGTCCGGCCATTGTATGATGTGTGAAGCCCCACCCATAA AGGCCATGAGGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCAACTTATCGCTGGCA GTCTCTTTAAGGTAACTGACTAATCCAGTAGCAATTAAAGACAGGGGTTGCG CTCGTTACAGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCAT GCAGCACCTGTGCACTAATTCTCTTTCAAGCACTCCCGCTTCTCAACAGGAT CTTAGCCATATCAAAGGTAGGTAAGGTTTTTCGCGTTGCATCGAATTAATCCA CATCATCCACTGCTTGTGCGGGTCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAACCTTG CGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGACTTGTGCGTTAGCTGCACCACTGAAAA GGAAAACTGCCCAATGGTTAGTCAACATCGTTTAGGGCATGGACTACCAGGG TATCTAATCCTGTTTGCTCCCCATGCTTTAGTGTCTGAGCGTCAGTAACGAAC CAGGAGGCTGCCTACGCTTTCGGTATTCCTCCACATCTCTACACATTTCACT
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Petição 870190060758, de 28/06/2019, pág. 365/641
GCTACATGCGGAATTCTACCTCCCCCTCTCGTACTCCAGCCTGCCAGTAACT GCCGCATTCTGAGGTTAAGCCTCAGCCTTTCACAGCAATCTTAACAGGCAGC CTGCACACCCTTTACGCCCAATAAATCTGATTAACGCTCGCACCCTACGTATT ACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTTGCCGGTGCTTATTCTTTCGGTACAGTCA CACCACCAAATTGTTAGTTGGGTGGCTTTCTTTCCGAACAAAAGTGCTTTACA ACCCAAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATTGCTGGATCAGGCTTCCGCCC ATTGTCCAAGATTCCTCACTGCTGCCTTCCTCAGAAGTCTGGGCCGTGTCTC AGTCCCAGTGTGGCTGGCCGTCCTCTCAGACCAGCTACCGATCATTGCCTTG GGAAGCCATTACCTTTCCAACAAGCTAATCAGACATCAGCCAATCTCAGAGC GCAAGGCAATTGGTCCCCTGCTTTCATTCTGCTTGGTAGAGAACTTTATGCG GTATTAATTAGGCTTTCACCTAGCTGTCCCCCACTCTGAGGCATGTTCTGATG CATTACTCACCCGTTTGCCACTTGCCACCAAGCCTAAGCCCGTGTTGCCGTT CGACTTGCATGTGTAAGGCATGCCGCTAGCGTTCAATCTGAGCCAGGATCAA ACTCT (SEQ ID NO: 18)
Tremblays princeps percevejo farinhento dos cifros Pianococcus cítri bacteriomas AGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTAGCGGCATGCATTACACATGCA AGTCGTACGGCAGCACGGGCTTAGGCCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTG AGTAACGCCTCGGAACGTGCCTTGTAGTGGGGGATAGCCTGGCGAAAGCCA GATTAATACCGCATGAAGCCGCACAGCATGCGCGGTGAAAGTGGGGGATTC TAGCCTCACGCTACTGGATCGGCCGGGGTCTGATTAGCTAGTTGGCGGGGT AATGGCCCACCAAGGCTTAGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGACGATCAGCC ACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGG AATCTTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAG AAGGCCTTCGGGTCGTAAAGCACTTTTGTTCGGGATGAAGGGGGGCGTGCA AACACCATGCCCTCTTGACGATACCGAAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGT GCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATCACTGG GCGTAAAGGGTGCGCGGGTGGTTTGCCAAGACCCCTGTAAAATCCTACGGC CCAACCGTAGTGCTGCGGAGGTTACTGGTAAGCTTGAGTATGGCAGAGGGG GGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATCTGGAGGAATACCG
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AAGGCGAAGGCAACCCCCTGGGCCATCACTGACACTGAGGCACGAAAGCGT GGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACCATGTC GACTAGTTGTCGGGGGGAGCCCTTTTTCCTCGGTGACGAAGCTAACGCATG AAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTAAAACTCAAAGGAATTG ACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCG AAAAACCTTACCTACCCTTGACATGGCGGAGATTCTGCCGAGAGGCGGAAGT GCTCGAAAGAGAATCCGTGCACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTG TCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCATAACGAGCGCAACCCCCGTCTTTAGTT GCTACCACTGGGGCACTCTATAGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGG TGGGGACGACGTCAAGTCATCATGGCCTTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCA TACAATGGCTGGAGCAAAGGGTCGCCAACTCGAGAGAGGGAGCTAATCCCA CAAACCCAGCCCCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTCG GAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGCATGCCACGGTGAATACGTTCTCGGGTC TTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTAAGCCGCATCAGAAGCAGCC TCCCTAACCCTATGCTGGGAAGGAGGCTGCGAAGGTGGGGTCTATGACTGG GGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTACCGGAAGGTGCGGCTGGATTACCT (SEQ ID NO: 19)
Vidania bacteriomas
Nasuía deltocephalinicola hospedeiro de inseto pestífero, Macrosteles quadripunctulatus (Hemiptera: Cicadellidae) bacteriomas AGTTTAATCCTGGCTCAGATTTAACGCTTGCGACATGCCTAACACATGCAAGT TGAACGTTGAAAATATTTCAAAGTAGCGTATAGGTGAGTATAACATTTAAACA TACCTTAAAGTTCGGAATACCCCGATGAAAATCGGTATAATACCGTATAAAAG TATTTAAGAATTAAAGCGGGGAAAACCTCGTGCTATAAGATTGTTAAATGCCT GATTAGTTTGTTGGTTTTTAAGGTAAAAGCTTACCAAGACTTTGATCAGTAGC TATTCTGTGAGGATGTATAGCCACATTGGGATTGAAATAATGCCCAAACCTCT ACGGAGGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGAGCGAAAGCTTGATCCAG CAATGTCGCGTGTGCGATTAAGGGAAACTGTAAAGCACTTTTTTTTAAGAATA AGAAATTTTAATTAATAATTAAAATTTTTGAATGTATTAAAAGAATAAGTACCGA CTAATCACGTGCCAGCAGTCGCGGTAATACGTGGGGTGCGAGCGTTAATCG
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GATTTATTGGGCGTAAAGTGTATTCAGGCTGCTTAAAAAGATTTATATTAAATA TTTAAATTAAATTTAAAAAATGTATAAATTACTATTAAGCTAGAGTTTAGTATAA GAAAAAAGAATTTTATGTGTAGCAGTGAAATGCGTTGATATATAAAGGAACGC CGAAAGCGAAAGCATTTTTCTGTAATAGAACTGACGCTTATATACGAAAGCGT GGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACTATGTCA ATTAACTATTAGAA í I II II IIAGTGGTGTAGCTAACGCGTTAAATTGACCGCC TGGGTATTACGATCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCAGCA CAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGATACGCGAAAAACCTTACCTG CCCTTGACATGGTTAGAA II I IATTGAAAAATAAAAGTGCTTGGAAAAGAGCT AACACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGG TTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTACTCTTAGTTGCTAATTAAAGAACTT TAAGAGAACAGCTAACAATAAGTTTAGAGGAAGGAGGGGATGACTTCAAGTC CTCATGGCCCTTATGGGCAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTTAATACAAA AAGTTGCAATATCGTAAGATTGAGCTAATCTTTAAAATTAATCTTAGTTCGGAT TGTACTCTGCAACTCGAGTACATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATC AGCATGCCGCGGTGAATAGTTTAACTGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACAC CATGGAAATAAATCTTG I II I AAA I GAAG I AA IA IAII IIATCAAAACAGGTTT TGTAACCGGGGTGAAGTCGTAACA (SEQ ID NO: 20)
Zinderia inseticola CAR! cigarrinha Clastoptera arízonana bacteriócitos ATATAAATAAGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTAGCGGTATGCTTTA CACATGCAAGTCGAACGACAATATTAAAGCTTGCTTTAATATAAAGTGGCGAA CGGGTGAGTAATATATCAAAACGTACCTTAAAGTGGGGGATAACTAATTGAAA AATTAGATAATACCGCATATTAATCTTAGGATGAAAATAGGAATAATATCTTAT GCTTTTAGATCGGTTGATATCTGATTAGCTAGTTGGTAGGGTAAATGCTTACC AAGGCAATGATCAGTAGCTGGTTTTAGCGAATGATCAGCCACACTGGAACTG AGACACGGTCCAGACTTCTACGGAAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAAT GGGAGAAATCCTGATCCAGCAATACCGCGTGAGTGATGAAGGCCTTAGGGT CGTAAAACTCTTTTGTTAGGAAAGAAATAATTTTAAATAATATTTAAAATTGAT GACGGTACCTAAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGT
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AATACGTAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGTGCGTA GGCTGTTATATAAGATAGATGTGAAATACTTAAGCTTAACTTAAGAACTGCAT TTATTACTGTTTAACTAGAGTTTATTAGAGAGAAGTGGAATTTTATGTGTAGCA GTGAAATGCGTAGATATATAAAGGAATATCGATGGCGAAGGCAGCTTCTTGG AATAATACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGAT ACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACTATGTCTACTAGTTATTAAATTAAAAATA AAATTTAGTAACGTAGCTAACGCATTAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGATC GCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATG ATGTGGATTAATTCGATGCAACACGAAAAACCTTACCTACTCTTGACATGTTT GGAATTTTAAAGAAATTTAAAAGTGCTTGAAAAAGAACCAAAACACAGGTGCT GCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAAC GAGCGCAACCCTTGTTATTATTTGCTAATAAAAAGAACTTTAATAAGACTGCC AATGACAAATTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTAT GAGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGATATATACAATGGGTAGCAAATTTGT GAAAATGAGCCAATCCTTAAAGTATATCTTAGTTCGGATTGTAGTCTGCAACT CGACTACATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGT GAATACGTTCTCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGAAGTGATT TTTACCAGAAATTATTTGTTTAACCTTTATTGGAAAAAAATAATTAAGGTAGAA TTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCAGTATCGGAAGGTGCGGC TGGATTACATTTTAAAT (SEQ ID NO: 21)
Proffiella armature Diaphorína citri, o psilídeo asiático dos cifras bacteriomas
Proteobactérias alfa
Hodgkinia Cigarra Diceroprocta semicinc- bacterioma AATGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGACAACGTTCAAAC GTTGTTAGCGGCGAACGGGTGAGTAATACGTGAGAATCTACCCATCCCAACG
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ta TGATAACATAGTCAACACCATGTCAATAACGTATGATTCCTGCAACAGGTAAA GATTTTATCGGGGATGGATGAGCTCACGCTAGATTAGCTAGTTGGTGAGATA AAAGCCCACCAAGGCCAAGATCTATAGCTGGTCTGGAAGGATGGACAGCCA CATTGGGACTGAGACAAGGCCCAACCCTCTAAGGAGGGCAGCAGTGAGGAA TATTGGACAATGGGCGTAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCATGAGTGATTGAA GGTCCAACGGACTGTAAAACTC Mil CTCCAGAGATCATAAATGATAGTATCT GGTGATATAAGCTCCGGCCAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAGG GGAGCGAGTATTGTTCGGTTTTATTGGGCGTAAAGGGTGTCCAGGTTGCTAA GTAAGTTAACAACAAAATCTTGAGATTCAACCTCATAACGTTCGGTTAATACT ACTAAGCTCGAGCTTGGATAGAGACAAACGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAA ATTCGTTGATACTTGGAGGAACACCAGAGGCGAAGGCGGTTTGTCATACCAA GCTGACACTGAAGACACGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT GGTAGTCCATGCCCTAAACGTTGAGTGCTAACAGTTCGATCAAGCCACATGC TATGATCCAGGATTGTACAGCTAACGCGTTAAGCACTCCGCCTGGGTATTAC GACCGCAAGGTTAAAACTCAAAGGAATTGACGGAGACCCGCACAAGCGGTG GAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACACGAAGAACCTTACCAGCCCTTGACA TACCATGGCCAACCATCCTGGAAACAGGATGTTGTTCAAGTTAAACCCTTGA AATGCCAGGAACAGGTGCTGCATGGCTGTTGTCAGTTCGTGTCGTGAGATGT ATGGTTAAGTCCCAAAACGAACACAACCCTCACCCATAGTTGCCATAAACAC AATTGGGTTCTCTATGGGTACTGCTAACGTAAGTTAGAGGAAGGTGAGGACC ACAACAAGTCATCATGGCCCTTATGGGCTGGGCCACACACATGCTACAATGG TGGTTACAAAGAGCCGCAACGTTGTGAGACCGAGCAAATCTCCAAAGACCAT CTCAGTCCGGATTGTACTCTGCAACCCGAGTACATGAAGTAGGAATCGCTAG TAATCGTGGATCAGCATGCCACGGTGAATACGTTCTCGGGTCTTGTACACGC CGCCCGTCACACCATGGGAGCTTCGCTCCGATCGAAGTCAAGTTACCCTTGA CCACATCTTGGCAAGTGACCGA (SEQ ID NO: 22)
Wolbachía sp. wPip Mosquito Culex quinquefascia- bacterioma AAATTTGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAATGAACGCTGGCGGCAGGCCTAAC ACATGCAAGTCGAACGGAGTTATATTGTAGCTTGCTATGGTATAACTTAGTGG
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Petição 870190060758, de 28/06/2019, pág. 370/641
tus CAGACGGGTGAGTAATGTATAGGAATCTACCTAGTAGTACGGAATAATTGTT GGAAACGACAACTAATACCGTATACGCCCTACGGGGGAAAAATTTATTGCTA TTAGATGAGCCTATATTAGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATAGCCTACCAAG GTAATGATCTATAGCTGATCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGAACTGAGA TACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGG CGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCATGAGTGAAGAAGGCCTTTGGGTTGT AAAGCTC MM AGTGAGGAAGATAATGACGGTACTCACAGAAGAAGTCCTGG CTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGAGGGCTAGCGTTATTCG GAATTATTGGGCGTAAAGGGCGCGTAGGCTGGTTAATAAGTTAAAAGTGAAA TCCCGAGGCTTAACCTTGGAATTGCTTTTAAAACTATTAATCTAGAGATTGAA AGAGGATAGAGGAATTCCTGATGTAGAGGTAAAATTCGTAAATATTAGGAGG AACACCAGTGGCGAAGGCGTCTATCTGGTTCAAATCTGACGCTGAAGCGCG AAGGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAA CGATGAATGTTAAATATGGGGAGTTTACTTTCTGTATTACAGCTAACGCGTTA AACATTCCGCCTGGGGACTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGAC GGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAA AAACCTTACCACTTCTTGACATGAAAATCATACCTATTCGAAGGGATAGGGTC GGTTCGGCCGGATTTTACACAAGTGTTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCG TGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCATCCTTAGTTGCC ATCAGGTAATGCTGAGTACTTTAAGGAAACTGCCAGTGATAAGCTGGAGGAA GGTGGGGATGATGTCAAGTCATCATGGCCTTTATGGAGTGGGCTACACACGT GCTACAATGGTGTCTACAATGGGCTGCAAGGTGCGCAAGCCTAAGCTAATCC CTAAAAGACATCTCAGTTCGGATTGTACTCTGCAACTCGAGTACATGAAGTTG GAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGCATGCCACGGTGAATACGTTCTCGGGTC TTGTACACACTGCCCGTCACGCCATGGGAATTGGTTTCACTCGAAGCTAATG GCCTAACCGCAAGGAAGGAGTTATTTAAAGTGGGATCAGTGACTGGGGTGA AGTCGTAACAAGGTAGCAGTAGGGGAATCTGCAGCTGGATTACCTCCTTA (SEQ ID NO: 23)
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Petição 870190060758, de 28/06/2019, pág. 371/641
Bacteroidetes
Uzinura diaspidicola cochonilhas-com- escudo bacleriócitos AAAGGAGATATTCCAACCACACCTTCCGGTACGGTTACCTTGTTACGACTTA GCCCTAGTCATCAAGTTTACCTTAGGCAGACCACTGAAGGATTACTGACTTC AGGTACCCCCGACTCCCATGGCTTGACGGGCGGTGTGTACAAGGTTCGAGA ACATATTCACCGCGCCATTGCTGATGCGCGATTACTAGCGATTCCTGCTTCA TAGAGTCGAATTGCAGACTCCAATCCGAACTGAGACTGGTTTTAGAGATTAG CTCCTGATCACCCAGTGGCTGCCCTTTGTAACCAGCCATTGTAGCACGTGTG TAGCCCAAGGCATAGAGGCCATGATGATTTGACATCATCCCCACCTTCCTCA CAGTTTACACCGGCAGTTTTGTTAGAGTCCCCGGCTTTACCCGATGGCAACT AACAATAGGGGTTGCGCTCGTTATAGGACTTAACCAAACACTTCACAGCACG AACTGAAGACAACCATGCAGCACCTTGTAATACGTCGTATAGACTAAGCTGTT TCCAGCTTATTCGTAATACATTTAAGCCTTGGTAAGGTTCCTCGCGTATCATC GAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGAACCCCCGTCAATTCCTTTGA GTTTCAATCTTGCGACTGTACTTCCCAGGTGGATCACTTATCGCTTTCGCTAA GCCACTGAATATCGTTTTTCCAATAGCTAGTGATCATCGTTTAGGGCGTGGA CTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGTGCACTGAGCGT CAGTAAAGATTTAGCAACCTGCCTTCGCTATCGGTGTTCTGTATGATATCTAT GCATTTCACCGCTACACCATACATTCCAGATGCTCCAATCTTACTCAAGTTTA CCAGTATCAATAGCAATTTTACAGTTAAGCTGTAAGCTTTCACTACTGACTTAA TAAACAGCCTACACACCCTTTAAACCCAATAAATCCGA ATAACGCTTGTGTCATCCGTATTGCCGCGGCTGCTGGCACGGAATTAGCCGA CACTTATTCGTATAGTACCTTCAATCTCCTATCACGTAAGATATTTTATTTCTA TACAAAAGCAGTTTACAACCTAAAAGACCTTCATCCTGCACGCGACGTAGCT GGTTCAGAGTTTCCTCCATTGACCAATATTCCTCACTGCTGCCTCCCGTAGG AGTCTGGTCCGTGTCTCAGTACCAGTGTGGAGGTACACCCTCTTAGGCCCC CTACTGATCATAGTCTTGGTAGAGCCATTACCTCACCAACTAACTAATCAAAC GCAGGCTCATCTTTTGCCACCTAAGTTTTAATAAAGGCTCCATGCAGAAACTT TATATTATGGGGGATTAATCAGAATTTCTTCTGGCTATACCCCAGCAAAAGGT AGATTGCATACGTGTTACTCACCCATTCGCCGGTCGCCGACAAATTAAAAATT
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TTTCGATGCCCCTCGACTTGCATGTGTTAAGCTCGCCGCTAGCGTTAATTCT GAGCCAGGATCAAACTCTTCGTTGTAG (SEQ ID NO: 24)
Sijicia muelleri Cicadelíneo azul-verde e várias espécies diferentes de cigarrinhas bacteriócitos CTCAGGATAAACGCTAGCGGAGGGCTTAACACATGCAAGTCGAGGGGCAGC AAAAATAATTATTTTTGGCGACCGGCAAACGGGTGAGTAATACATACGTAACT TTCCTTATGCTGAGGAATAGCCTGAGGAAACTTGGATTAATACCTCATAATAC AATTTTTTAGAAAGAAAAATTGTTAAAGTTTTATTATGGCATAAGATAGGCGTA TGTCCAATTAGTTAGTTGGTAAGGTAATGGCTTACCAAGACGATGATTGGTAG GGGGCCTGAGAGGGGCGTTCCCCCACATTGGTACTGAGACACGGACCAAAC TTCTACGGAAGGCTGCAGTGAGGAATATTGGTCAATGGAGGAAACTCTGAAC CAGCCACTCCGCGTGCAGGATGAAAGAAAGCCTTATTGGTTGTAAACTGCTT TTGTATATGAATAAAAAATTCTAATTATAGAAATAATTGAAGGTAATATACGAA TAAGTATCGACTAACTCTGTGCCAGCAGTCGCGGTAAGACAGAGGATACAAG CGTTATCCGGATTTATTGGGTTTAAAGGGTGCGTAGGCGGTTTTTAAAGTCA GTAGTGAAATCTTAAAGCTTAACTTTAAAAGTGCTATTGATACTGAAAAACTAG AGTAAGGTTGGAGTAACTGGAATGTGTGGTGTAGCGGTGAAATGCATAGATA TCACACAGAACACCGATAGCGAAAGCAAGTTACTAACCCTATACTGACGCTG AGTCACGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATG CCGTAAACGATGATCACTAACTATTGGGTTTTATACGTTGTAATTCAGTGGTG AAGCGAAAGTGTTAAGTGATCCACCTGAGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAAC TCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAATCGGTGGAGCATGTGGTTTAATT CGATGATACACGAGGAACCTTACCAAGACTTAAATGTACTACGAATAAATTGG AAACAATTTAGTCAAGCGACGGAGTACAAGGTGCTGCATGGTTGTCGTCAGC TCGTGCCGTGAGGTGTAAGGTTAAGTCCTTTAAACGAGCGCAACCCTTATTA TTAGTTGCCATCGAGTAATGTCAGGGGACTCTAATAAGACTGCCGGCGCAAG CCGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCACGGCCCTTACGTCTTGG GCCACACACGTGCTACAATGATCGGTACAAAAGGGAGCGACTGGGTGACCA GGAGCAAATCCAGAAAGCCGATCTAAGTTCGGATTGGAGTCTGAAACTCGAC TCCATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTGCATCAGCCATGGCACGGTGAAT
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ATGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAAGCCATGGAAGTTGGAAGT ACCTAAAGTTGGTTCGCTACCTAAGGTAAGTCTAATAACTGGGGCTAAGTCG TAACAAGGTA (SEQ ID NO: 25)
Tipo levedura
Symbiotaphrína buchneri voucher JCM9740 Besouros anobiídeos Stegobium paniceum micetoma entre o intestino anterior e intestino médio AGATTAAGCCATGCAAGTCTAAGTATAAGNAATCTATACNGTGAAACTGCGAA TGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTACCTTACTACATGGATAAC CGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAACCCCGACTTCGGAAGGGGT GTATTTATTAGATAAAAAACCAATGCCCTTCGGGGCTCCTTGGTGATTCATGA TAACTTAACGAATCGCATGGCCTTGCGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCT GCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGTGGCCTACCATGG I I IIAACGGGT AACGGGGAATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACC ACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGA GGTAGTGACAATAAATACTGATACAGGGCTCTTTTGGGTCTTGTAATTGGAAT GAGTACAATTTAAATCCCT TAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTC CAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAA CCTTGGGCCTGGCTGGCCGGTCCGCCTAACCGCGTGTACTGGTCCGGCCG GGCCTTTCCTTCTGGGGAGCCGCATGCCCTTCACTGGGTGTGTCGGGGAAC CAGGACTTTTACTTTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTATGCTCGAA TACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGCGGTTCTAI I H GTTGGTTTC TAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGATAGTCGGGGGCATCAGTATTCAATT GTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTT GCCA AGGATGTTTTCATTAATCAGTGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAG ATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGGCGATGT TATTAI I II GACTCGCTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCTG
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GGGGGAGTATGGTCGCAAGGCT GAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCAC CACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCAC CAGGTCCAGACACATTAAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTATGT GGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAAT TGCGATAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGCCCGGTCCGCTTTGGCG GGCCGCTGGCTTCTTAGAGGGACTATCGGCTCAAGCCGATGGAAGTTTGAG GCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTA CACTGACAGAGCCAACGAGTAAATCACCTTGGCCGGAAGGTCTGGGTAATCT TGTTAAACTCTGTCGTGCTGGGGATAGAGCATTGCAATTATTGCTCTTCAACG AGGAATTCCTAGTAAGCGCAAGTCATCAGCTTGCGCTGATTACGTCCCTGCC CTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTCAGTGAGGCCT TCGGACTGGCACAGGGACGTTGGCAACGACGACCCAGTGCCGG AAAGTTGGTCAAACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTC CGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTA (SEQ ID NO: 26)
Symbiotaphrina kochii voucher CBS 589.63 Besouros anobiideos Lasioderma serrioome micetoma TACCTGGTTGATTCTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATG CAAGTCTAAGTATAAGCAATCTATACGGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAAT CAGTTATCGTTTATTTGATAGTACCTTACTACATGGATAACCGTGGTAATTCTA GAGCTAATACATGCTAAAAACCTCGACTTCGGAAGGGGTGTATTTATTAGATA AAAAACCAATGCCCTTCGGGGCTCCTTGGTGATTCATGATAACTTAACGAATC GCATGGCCTTGCGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTT CGATGGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTTTCAACGGGTAACGGGGAATTAG GGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAAACGGCTACCACATCCAAGGAAG GCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATA AATACTGATACAGGGCTCTTTTGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTACAATTTAA ATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGG TAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTA GTTGAACCTTGGGCCTGGCTGGCCGGTCCGCCTAACCGCGTGTACTGGTCC GGCCGGGCCTTTCCTTCTGGGGAGCCGCATGCCCTTCACTGGGTGTGTCGG
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GGAACCAGGACTTTTACTTTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCCTATGC TCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGTGGTTCTATTTTGTTG GTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGATAGTCGGGGGCATCAGTATT CAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATTGAAGACTAACTACTGCGAAAG CATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGTGAACGAAAGTTAGGGGATCGAA GACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATC GGGCGATGTTATTAI I I IGACTCGCTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTCTT TGGGTTCTGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACG GAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGG GAAACTCACCAGGTCCAGACACATTAAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTC TTGATTATGTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTG TCTGCTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGCCCGGTC CGCTTTGGCGGGCCGCTGGCTTCTTAGAGGGACTATCGGCTCAAGCCGATG GAAGTTTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCA CGCGCGCTACACTGACAGAGCCAACGAGTACATCACCTTGGCCGGAAGGTC TGGGTAATCTTGTTAAACTCTGTCGTGCTGGGGATAGAGCATTGCAATTATTG CTCTTCAACGAGGAATTCCTAGTAAGCGCAAGTCATCAGCTTGCGCTGATTA CGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTC AGTGAGGCCTTCGGACTGGCACAGGGACGTTGGCAACGACGACCCAGTGC CGG AAAGTTCGTCAAACTTGGTCATTTAGAGG AAG N NNAAGTCGTAACAAG G TTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTA (SEQ ID NO: 27)
Simbionte extraceMar primário Hospedeiro Locaiização 16 rRNA
bactérias que degradam fenitrotiona
Burkholdería sp. SFA1 Riptortus pedestrís intestino AGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCATGCCTTACACATGCAAG
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TCGAACGGCAGCACGGGGGCAACCCT GGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAG TAATACATCGGAACGTGTCCTGTAGTGGGGGATAGCCCGGCGAAAGCCGGA TTAATACCGCATACGACCTAAGGGAGAAAGCGGGGGATCTTCGGACCTCGC GCTATAGGGGCGGCCGATGGCAGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTA CCAAGGCGACGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGA CTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGAC AATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCTTCGG GTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAAACTTCGTCCCTAATATGGATGGA GGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCG CGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGT GCGCAGGCGGTCTGTTAAGACCGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGA ACTGCATTGGTGACTGGCAGGCTTTGAGTGTGGCAGAGGGGGGTAGAATTC CACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAG GCAGCCCCCTGGGCCAACTACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCA AACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTG TTGGGGATTCATTTCCTTAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTG GGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCAC AAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTAC CCTTGACATGGTCGGAACCCTGCTGAAAGGTGGGGGTGCTCGAAAGAGAAC CGGCGCACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGG GTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCTACGCAAGAGCA CTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAA GTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGAAC AGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCCAATCCCAGAAAACCGATCGTAG TCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATC GCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCC CGTCACACCATGGGAGTGGGTTTCACCAGAAGTAGGTAGCCTAACCGCAAG GAGGGCGCTTACCACGGTGGGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGG TAGC
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(SEQ ID NO: 28)
Burkholderia sp. KM-A Riptortus pedestrís Intestino GCAACCCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTGTC CTGTAGTGGGGGATAGCCCGGCGAAAGCCGGATTAATACCGCATACGATCT ACGGAAGAAAGCGGGGGATCCTTCGGGACCTCGCGCTATAGGGGCGGCCG ATGGCAGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTG TAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAG ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGA ATTTTGGACAATGGGGGCAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGA AGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAAACGTCTTGGTTAA TACCTGAGGCGGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTG CCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGG CGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTCTGTTAAGACCGATGTGAAATCCCCGGGCT TAACCTGGGAACTGCATTGGTGACTGGCAGGCTTTGAGTGTGGCAGAGGGG GGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGA GGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGCCAACACTGACGCTCATGCA CGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTA AACGATGTCAACTAGTTGTTGGGGATTCATTTCCTTAGTAACGTAGCTAACGC GTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAAT TGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACG CGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGGTCGGAAGTCTGCTGAGAGGTGGAC GTGCTCGAAAGAGAACCGGCGCACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCG TGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAG TTGCTACGCAAGAGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAG GTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGT CATACAATGGTCGGAACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCCAATCC CAGAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAG CTGGAATCGCTAG TAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACAC
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CGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTCACCAGAAGTAGGTAGCCTAACCG CAAGGAGGGCGCTTACCACGGTGGGATTCATGACTGGGGTGAAGT (SEQ ID NO: 29)
Burkholdería sp. KM-G Riptoitus pedestris Intestino GCAACCCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTGTC CTGTAGTGGGGGATAGCCCGGCGAAAGCCGGATTAATACCGCATACGACCT AAGGGAGAAAGCGGGGGATCTTCGGACCTCGCGCTATAGGGGCGGCCGAT GGCAGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTA GCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGA CTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGCAACCCTGA TCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTG TCCGGAAAGAAAACTTCGAGGTTAATACCCTTGGAGGATGACGGTACCGGAA GAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTG CGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTCTGTTA AGACCGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTGGTGACTGG CAGGCTTTGAGTGTGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAA TGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGCCAA CACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT GGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGGGGATTCATTTCCTTA GTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGA TTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGG ATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGGTCGGAAG TCTGCTGAGAGGTGGACGTGCTCGAAAGAGAACCGGCGCACAGGTGCTGCA TGGCTGTC GTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCC TTGTCCTTAGTTGCTACGCAAGAGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAAC CGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGC TTCACACGTCATACAATGGTCGGAACAGAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGG AGCCAATCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACT GCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATA
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CGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTCA CCAGAAGTAGGTAGCCTAACCTGCAAAGGAGGGCGCTTACCACG (SEQ ID NO: 30)
Snodgrassella alví Abelha melífera (Apis mellifera) e Bombus spp. íleo GAGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCATGCCTTACACATGC AAGTCGAACGGCAGCACGGAGAGCTTGCTCTCTGGTGGCGAGTGGCGAAC GGGTGAGTAATGCATCGGAACGTACCGAGTAATGGGGGATAACTGTCCGAA AGGATGGCTAATACCGCATACGCCCTGAGGGGGAAAGCGGGGGATCGAAA GACCTCGCGTTATTTGAGCGGCCGATGTTGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAA AGGCCTACCAAGGCGACGATCCATAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCAC ATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAAT TTTGGACAATGGGGGGAACCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTCTGAAGAAG GCCTTCGGGTTGTAAAGGACTTTTGTTAGGGAAGAAAAGCCGGGTGTTAATA CCATCTGGTGCTGACGGTACCTAAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCA GCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGT AAAGCGAGCGCAGACGGTTAATTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGAGCTCAAC TTGGGACGTGCATTTGAAACTGGTTAACTAGAGTGTGTCAGAGGGAGGTAGA ATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGC GAAGGCAGCCTCCTGGGATAACACTGACGTTCATGCTCGAAAGCGTGGGTA GCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGACAATTAG CTGTTGGGACACTAGATGTCTTAGTAGCGAAGCTAACGCGTGAAATTGTCCG CCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCC GCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTAC CTGGTCTTGACATGTACGGAATCTCTTAGAGATAGGAGAGTGCCTTCGGGAA CCGTAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTG GGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCCATCATTAAGT TGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGA CGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGACCAGGGCTTCACACGTCATACAATGGT CGGTACAGAGGGTAGCGAAGCCGCGAGGTGAAGCCAATCTCAGAAAGCCGA
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TCGTAGTCCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGTCGGAATCGCTA GTAATCGCAGGTCAGCATACTGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACA CCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGGGATACCAGAATTGGGTAGACTAACC GCAAGGAGGTCGCTTAACACGGTATGCTTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAA CAAGGTAGCCGTAG (SEQ ID NO: 33)
Giliiarneila apicola abelha melífera (Apís mellifera) e Bombus spp. íleo TTAAATTGAAGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCTTA ACACATGCAAGTCGAACGGTAACATGAGTGCTTGCACTTGATGACGAGTGGC GGACGGGTGAGTAAAGTATGGGGATCTGCCGAATGGAGGGGGACAACAGTT GGAAACGACTGCTAATACCGCATAAAGTTGAGAGACCAAAGCATGGGACCTT CGGGCCATGCGCCATTTGATGAACCCATATGGGATTAGCTAGTTGGTAGGGT AATGGCTTACCAAGGCGACGATCTCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCC ACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGA ATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAA GGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCGGTGATGAGGAAGGTGGTGTATCTAAT AGGTGCATCAATTGACGTTAATTACAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCC AGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATGACTGGGC GTAAAGGGCATGTAGGCGGATAATTAAGTTAGGTGTGAAAGCCCTGGGCTCA ACCTAGGAATTGCACTTAAAACTGGTTAACTAGAGTATTGTAGAGGAAGGTA GAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGGTG GCGAAGGCGGCCTTCTGGACAGATACTGACGCTGAGATGCGAAAGCGTGGG GAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGATT TGGAGTTTGTTGCCTAGAGTGATGGGCTCCGAAGCTAACGCGATAAATCGAC CGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGC CCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTT ACCTGGTCTTGACATCCACAGAATCTTGCAGAGATGCGGGAGTGCCTTCGG GAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGT TGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCATCGGTTA GGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCGTTGATAAAGCGGAGGAAGGTGGGG
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ACGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAA TGGCGTATACAAAGGGAGGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAG TACGTCTAAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATC GCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTA CACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCACCAGAAGTAGATAGCTT AACCTTCGGGAGGGCGTTTACCACGGTGTGGTCCATGACTGGGGTGAAGTC GTAACAAGGTAACCGTAGGGGAACCTGCGGTTGGATCACCTCCTTAC (SEQ ID NO: 34)
Bartonella apis abelha melifera (Apis mellifera) Intestino AAGCCAAAATCAAATTTTCAACTTGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACG CTGGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAACGCACII I I CGGAGTGAGTG GCAGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAATCTACCTATTTCTACGGAATAACGCA GAGAAATTTGTGCTAATACCGTATACGTCCTTCGGGAGAAAGATTTATCGGA GATAGATGAGCCCGCGTTGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCCCACCA AGGCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACATTGGGACTG AGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAAT GGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGG TTGTAAAGCTCTTTCACCGGTGAAGATAATGACGGTAACCGGAGAAGAAGCC CCGGCTAACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTG TTCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATATTTAAGTCAGGGGT GAAATCCCGGGGCTCAACCCCGGAACTGCCTTTGATACTGGATATCTTGAGT ATGGAAGAGGTAAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTC GGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTACTGGTCCATTACTGACGCTGAG GTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCT GTAAACGATGAATGTTAGCCGTTGGACAGTTTACTGTTCGGTGGCGCAGCTA ACGCATTAAACATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAG GAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGC AACGCGCAGAACCTTACCAGCCCTTGACATCCCGATCGCGGATGGTGGAGA CACCGTCTTTCAGTTCGGCTGGATCGGTGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGT CAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTC
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GCCCTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGGGACTGCCGGTGATA AGCCGAGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGGGCT GGGCTACACACGTGCTACAATGGTGGTGACAGTGGGCAGCGAGACCGCGA GGTCGAGCTAATCTCCAAAAGCCATCTCAGTTCGGATTGCACTCTGCAACTC GAGTGCATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGTGGATCAGCATGCCACGGTGA ATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTT TACCCGAAGGTGCTGTGCTAACCGCAAGGAGGCAGGCAACCACGGTAGGGT CAGCGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGGGAACCTGCGGCT GGATCACCTCCTTTCTAAGGAAGATGAAGAATTGGAA (SEQ ID NO: 35)
Parasaccharibacter apium abelha melífera (Apis mellifera) Intestino CTACCATGCAAGTCGCACGAAACCTTTCGGGGTTAGTGGCGGACGGGTGAG TAACGCGTTAGGAACCTATCTGGAGGTGGGGGATAACATCGGGAAACTGGT GCTAATACCGCATGATGCCTGAGGGCCAAAGGAGAGATCCGCCATTGGAGG GGCCTGCGTTCGATTAGCTAGTTGGTTGGGTAAAGGCTGACCAAGGCGATG ATCG AT AGCT GGTTT G AGAGGAT GAT CAGCCACACTGGG ACT GAGACACGG CCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGCAA CCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCA CTTTCACTAGGGAAGATGATGACGGTACCTAGAGAAGAAGCCCCGGCTAACT TCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGGGCTAGCGTTGCTCGGAATGA CTGGGCGTAAAGGGCGCGTAGGCTGTTTGTACAGTCAGATGTGAAATCCCC GGGCTTAACCTGGGAACTGCATTTGATACGTGCAGACTAGAGTCCGAGAGA GGGTTGTGGAATTCCCAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTGGGAAGAAC ACCGGTTGCGAAGGCGGCAACCTGGCTNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGAGCTAACG CGTTAAGCACACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGA ATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAA CGCGCAGAACCTTACCAGGGCTTGCATGGGGAGGCTGTATTCAGAGATGGA TATTTCTTCGGACCTCCCGCACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGT
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CGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTTTAGTTG CCATCACGTCTGGGTGGGCACTCTAGAGAGACTGCCGGTGACAAGCCGGAG GAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGTCCTGGGCTACAC ACGTGCTACAATGGCGGTGACAGAGGGATGCTACATGGTGACATGGTGCTG ATCTCAAAAAACCGTCTCAGTTCGGATTGTACTCTGCAACTCGAGTGCATGAA GGTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCC GGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGTTTGACCTTAAG CCGGTGAGCGAACCGCAAGGAACGCAGCCGACCACCGGTTCGGGTTCAGC GACTGGGGGA (SEQ ID NO: 36)
Lactobacillus kunkeei abelha melifera (Apis mellifera) Intestino TTCCTTAGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCAGGTTCTCCTACGGCTACCTTGTT ACGACTTCACCCTAATCATCTGTCCCACCTTAGACGACTAGCTCCTAAAAGGT TACCCCATCGTCTTTGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTG TACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTGGCATGCTGATCCACGATTACTAGT GATTCCAACTTCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAATGG CTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTTTCGCGACTCGTTGTACCATCCATT GTAGCACGTGTGTAGCCCAGCTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCGTCC CCACCTTCCTCCGGTTTATCACCGGCAGTCTCACTAGAGTGCCCAACTAAAT GCTGGCAACTAATAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATC TCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCATTCTGTCCCCGAA GGGAACGCCCAATCTCTTGGGTTGGCAGAAGATGTCAAGAGCTGGTAAGGT TCTTCGCGTAGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCACTTGTGCGGGCCCC CGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAATAC TTAATGCGTTAGCTGCGGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGTAT TCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTACCCAT GCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTAACAGACCAGAAAGCCGCCTTCGCCACTG GTGTTCTTCCATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAGTTCCACTTTC CTCTTCTGTACTCAAGTTTTGTAGTTTCCACTGCACTTCCTCAGTTGAGCTGA GGGCTTTCACAGCAGACTTACAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATA
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AATCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAG TTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAAATACCGTCAAAGTGTTAACAGTTACTCTAAC ACTTGTTCTTCTTTAACAACAGAGTTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCAC GCGGCGTTGCTCCATCAGACTTTCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTG CCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAATGTGGCCGATTACCC TCTCAGGTCGGCTACGTATCATCGTCTTGGTGGGC I Η IATCTCACCAACTAA CTAATACGGCGCGGGTCCATCCCAAAGTGATAGCAAAGCCATCTTTCAAGTT GGAACCATGCGGTTCCAACTAATTATGCGGTATTAGCACTTGTTTCCAAATGT TATCCCCCGCTTCGGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCAGTTCGCCACT CGCTCCGAATCCAAAAATCATTTATGCAAGCATAAAATCAATTTGGGAGAACT CGTTCGACTTGCATGTATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCGTCCTGAGCCAGG ATCAAACTCTCATCTTAA (SEQ ID NO: 37)
Lactobacillus Firm-4 abelha melifera (Apis mellifera) Intestino ACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGCGGGAAGTCAG GGAAGCCTTCGGGT GGAACT GGTGGAACGAGCGGCGGAT GGGT GAGTAAC ACGTAGGTAACCTGCCCTAAAGCGGGGGATACCATCTGGAAACAGGTGCTA ATACCGCATAAACCCAGCAGTCACATGAGTGCTGGTTGAAAGACGGCTTCGG CTGTCACTTTAGGATGGACCTGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGGAGTAACGG TTCACCAAGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTG GG ACT G AG ACACGGCCCAAACTCCT ACGGG AGGCAGCAGT AGGGAAT CTT C CACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGGATGAAGAAGGTCT TCGGATCGTAAAATCCTGTTGTTGAAGAAGAACGGTTGTGAGAGTAACTGCT CATAACGTGACGGTAATCAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAG CCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAG GGAGCGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTGAATGTGAAAGCCCTCAGCTTAACTGA GGAAGAGCATCGGAAACTGAGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAAC TCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAA GGCGGCTCTCTGGTCTGTTACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCG AACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTG
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TTGGGAGGTTTCCGCCTCTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCC TGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGC ACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCA GGTCTTGACATCTCCTGCAAGCCTAAGAGATTAGGGGTTCCCTTCGGGGACA GGAAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGG TTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTG GGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGAC GTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGAT GGTACAATGAGAAGCGAACTCGCGAGGGGAAGCTGATCTCTGAAAACCATT CTCAGTTCGGATTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCATGAAGCTGGAATCGCTA GTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACAC ACCGCCC (SEQ ID NO: 38)
Bicho-da-seda
Enterococcus Bombyx mori Intestino AGGTGATCCAGCCGCACCTTCCGATACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC AATCATCTATCCCACCTTAGGCGGCTGGCTCCAAAAAGGTTACCTCACCGAC TTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCG GGAACGTATTCACCGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGGCT TCATGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAATCCGAACTGAGAGAAGCTTTAAGAGA TTTGCATGACCTCGCGGTCTAGCGACTCGTTGTACTTCCCATTGTAGCACGT GTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCC TCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCGCTAGAGTGCCCAACTAAATGATGGCAAC TAACAATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACAC GAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTTTGTCCCCGAAGGGAAAGC TCTATCTCTAGAGTGGTCAAAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGT TGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTC CTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGT TTGCTGCAGCACTGAAGGGCGGAAACCCTCCAACACTTAGCACTCATCGTTT
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ACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGAG CCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTC CATATATCTACGCATTTCACCGCTACACATGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGC ACTCAAGTCTCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTC ACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGA CAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGT GGCTTTCTGGTTAGATACCGTCAGGGGACGTTCAGTTACTAACGTCCTTGTT CTTCTCTAACAACAGAGTTTTACGATCCGAAAACCTTCTTCACTCACGCGGCG TTGCTCGGTCAGACTTTCGTCCATTGCCGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCC GTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAG GTCGGCTATGCATCGTGGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAAT GCACCGCGGGTCCATCCATCAGCGACACCCGAAAGCGCCTTTCACTCTTAT GCCATGCGGCATAAACTGTTATGCGGTATTAGCACCTGTTTCCAAGTGTTATC CCCCTCTGATGGGTAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCACTCCTC TTTCCAATTGAGTGCAAGCACTCGGGAGGAAAGAAGCGTTCGACTTGCATGT ATTAGGCACGCCGCCAGCGTTCGTCCTGAGCCAGGATCAAACTCT (SEQ ID NO: 39)
Delftia Bombyx morí Intestino CAGAAAGGAGGTGATCCAGCCGCACCTTCCGATACGGCTACCTTGTTACGA CTTCACCCCAGTCACGAACCCCGCCGTGGTAAGCGCCCTCCTTGCGGTTAG GCTACCTACTTCTGGCGAGACCCGCTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTA CAAGACCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCG ATTCCGACTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGGACTACGACTGGT TTTATGGGATTAGCTCCCCCTCGCGGGTTGGCAACCCTCTGTACCAGCCATT GTATGACGTGTGTAGCCCCACCTATAAGGGCCATGAGGACTTGACGTCATCC CCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCATTAGAGTGCTCAACTGAAT GTAGCAACTAATGACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCT CACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTGCAGGTTCTCTTT CGAGCACGAATCCATCTCTGGAAACTTCCTGCCATGTCAAAGGTGGGTAAGG TTTTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATCATCCACCGCTTGTGCGGGTCC
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CCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCAA CTTCACGCGTTAGCTTCGTTACTGAGAAAACTAATTCCCAACAACCAGTTGAC ATCGTTTAGGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGC TTTCGTGCATGAGCGTCAGTACAGGTCCAGGGGATTGCCTTCGCCATCGGT GTTCCTCCGCATATCTACGCATTTCACTGCTACACGCGGAATTCCATCCCCC TCTACCGTACTCTAGCCATGCAGTCACAAATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCG GGGATTTCACATCTGTCTTACATAACCGCCTGCGCACGCTTTACGCCCAGTA ATTCCGATTAACGCTCGCACCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGT TAGCCGGTGCTTATTCTTACGGTACCGTCATGGGCCCCCTGTATTAGAAGGA GCTTTTTCGTTCCGTACAAAAGCAGTTTACAACCCGAAGGCCTTCATCCTGCA CGCGGCATTGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAAAATTCCCCACTGCT GCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGGTCGTC CTCTCAGACCAGCTACAGATCGTCGGCTTGGTAAGCTTTTATCCCACCAACT ACCTAATCTGCCATCGGCCGCTCCAATCGCGCGAGGCCCGAAGGGCCCCC GCTTTCATCCTCAGATCGTATGCGGTATTAGCTACTCTTTCGAGTAGTTATCC CCCACGACTGGGCACGTTCCGATGTATTACTCACCCGTTCGCCACTCGTCAG CGTCCGAAGACCTGTTACCGTTCGACTTGCATGTGTAAGGCATGCCGCCAG CGTTCAATCTGAGCCAGGATCAAACTCTACAGTTCGATCT (SEQ ID NO: 40)
Petomonas Bombyx mori Intestino ATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCATGCCTTACACATGCAAGTCGAAC GGTAACAGGTTAAGCTGACGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATATATCGGAAC GTGCCCAGTCGTGGGGGATAACTGCTCGAAAGAGCAGCTAATACCGCATAC GACCTGAGGGTGAAAGCGGGGGATCGCAAGACCTCGCNNGATT GGAGCGG CCGATATCAGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCCACCAAGCCAACGAT CTGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCC CAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAAI Η IGGACAATGGGCGCAAGC CTGATCCAGCCATGCCGCGTGCGGGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAACCGC TTTTGTCAGGGAAGAAAAGGTTCTGGTTAATACCTGGGACTCATGACGGTAC CTGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTA
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GGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTT ATGCAAGACAGAGGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCCTTTGTG ACTGCATAGCTAGAGTACGGTAGAGGGGGATGGAATTCCGCGTGTAGCAGT GAAATGCGTAGATATGCGGAGGAACACCGATGGCGAAGGCAATCCCCTGGA CCTGTACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATA CCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTGGTTGTTGGGAGGGTTTCT TCTCAGTAACGTANNTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCG CAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGA TGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGCCA GGAATCCTGAAGAGATTTGGGAGTGCTCGAAAGAGAACCTGGACACAGGTG CTGCATGGCCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCA ACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCTACGAAAGGGCACTCTAATGAGACT GCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAGGTCATCATGGCC CTTATGGGTAGGGCTACACACGTCATACAATGGCCGGGACAGAGGGCTGCC AACCCGCGAGGGGGAGCTAATCCCAGAAACCCGGTCGTAGTCCGGATCGTA GTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCT TGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCAT GGGAGCGGGTTCTGCCAGAAGTAGTTAGCCTAACCGCAAGGAGGGCGATTA CCACGGCAGGGTTCGTGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTATCG GAAGGTGCGGCTGGATCAC (SEQ ID NO: 41)
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89/321 [00147] Por exemplo, um mosquito (por exemplo, Aedes spp. ou Anopheles spp.) alberga bactérias simbióticas que modulam a resposta imune do mosquito e influenciam a competência vetorial para patógenos. O agente modulador descrito aqui pode ser útil para visar bactérias residentes no mosquito, incluindo, mas não se limitando a, EspZ, Serratia spp (por exemplo, Serratia marcescens), Enterbacterloaceae spp., Enterobacter spp. (por exemplo, Enterobacter cloacae, Enterobacter amnigenus, Enterobacter ludwigií), Proteus spp., Acinetobacter spp., Wigglesworthia spp. (Wigglesworthia gloosinidia), Xanthomonas spp. (por exemplo, Xanthomonas maltophilia), Pseudomonas spp. (por exemplo, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas rhodesiae), Escherichia spp. (por exemplo, Escherchia coli), Cedecea spp. (por exemplo, Cedecea lapagei), Ewingella spp. (por exemplo, Ewingella americana), Bacillus spp. (por exemplo, Bacillus pumiius), Comamonas spp., ou Vagococcus spp. (por exemplo, Vagococcus salmoninarium), ou Wolbachia spp. (por exemplo, Wolbachia wMel, Wolbachia - wAIbB, Wolbachia - wMelPop, Wolbachia - wMelPop-CLA).
[00148] Qualquer número de espécies bacterianas pode ser visado pelas composições ou métodos descritos aqui. Por exemplo, em alguns casos, o agente modulador pode visar uma única espécie bacteriana. Em alguns casos, o agente modulador pode visar pelo menos cerca de quaisquer de 1,2, 3, 4, 5, 6,7,8,9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 500, ou mais espécies bacterianas distintas. Em alguns casos, o agente modulador pode visar qualquer uma de cerca de 1 até cerca de 5, cerca de 5 até cerca de 10, cerca de 10 até cerca de 20, cerca de 20 até cerca de 50, cerca de 50 até cerca de 100, cerca de 100 até cerca de 200, cerca de 200 até cerca de 500, cerca de 10 até cerca de 50, cerca de 5 até cerca de 20, ou cerca de 10 até cerca de 100 espécies bacterianas distintas. Em alguns casos,
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90/321 o agente modulador pode visar pelo menos cerca de quaisquer de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, ou mais fitos, classes, ordens, famílias, ou gêneros de bactérias.
[00149] Em alguns casos, o agente modulador pode aumentar uma população de uma ou mais bactérias (por exemplo, bactérias patogênicas, bactérias produtoras de toxinas) em peto menos cerca de quaisquer de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais no hospedeiro em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado. Em alguns casos, o agente modulador pode reduzir a população de uma ou mais bactérias (por exemplo, bactérias slmblóticas, bactérias que degradam pesticidas, por exemplo, uma bactéria que degrada qualquer um dos pesticidas listados na Tabela 12) em pelo menos cerca de quaisquer de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais no hospedeiro em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado. Em alguns casos, o agente modulador pode erradicar a população de uma bactéria (por exemplo, bactérias simbióticas, bactérias que degradam pesticidas, por exemplo, uma bactéria que degrada qualquer um dos pesticidas listados na Tabela 12) no hospedeiro. Em alguns casos, o agente modulador pode aumentar o nível de uma ou mais bactérias patogênicas em peto menos cerca de quaisquer de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais no hospedeiro e/ou decresce o nível de uma ou mais bactérias simbióticas em pelo menos cerca de quaisquer de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais no hospedeiro em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado.
[00150] Em alguns casos, o agente modulador pode alterar a diversidade bacteriana e/ou composição bacteriana do hospedeiro. Em alguns casos, o agente modulador pode aumentar a diversidade bacteri
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91/321 ana no hospedeiro relativamente a uma diversidade de partida em pelo menos cerca de quaisquer de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado. Em alguns casos, o agente modulador pode decrescer a diversidade bacteriana no hospedeiro relativamente a uma diversidade de partida em pelo menos cerca de quaisquer de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado.
[00151] Em alguns casos, o agente modulador pode alterar a função, atividade, crescimento, e/ou divisão de uma ou mais células bacterianas. Por exemplo, o agente modulador pode alterar a expressão de um ou genes nas bactérias. Em alguns casos, o agente modulador pode alterar a função de uma ou mais proteínas nas bactérias. Em alguns casos, o agente modulador pode alterar a função de uma ou mais estruturas celulares (por exemplo, a parede celular, a membrana externa ou interna) nas bactérias. Em alguns casos, o agente modulador pode matar (por exemplo, efetuar a lise) as bactérias.
[00152] A bactéria-alvo pode residir em uma ou mais partes do inseto. Além disso, as bactérias-alvo podem ser intracelulares ou extracelulares. Em alguns casos, as bactérias residem em ou sobre uma ou mais partes do intestino do hospedeiro, incluindo, por exemplo, o intestino anterior, intestino médio, e/ou intestino posterior. Em alguns casos, as bactérias residem como bactérias intracelulares dentro de uma célula do inseto hospedeiro. Em alguns casos, as bactérias residem em um bacteriócito do inseto hospedeiro.
[00153] Alterações nas populações de bactérias no hospedeiro podem ser determinadas por quaisquer métodos conhecidos na técnica, como microarranjo, reação em cadeia de polimerase (PCR), PCR em tempo real, citometria de fluxo, microscopia de fluorescência, micros
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92/321 copia eletrônica de transmissão, hibridação in situ por fluorescência (por exemplo, FISH), espectrofotometria, desorção/ionização com laser assistido por matriz-espectrometria de massa (MALDI-MS), e sequenciamento de DNA. Em alguns casos, uma amostra do hospedeiro tratado com um agente modulador é sequenciada (por exemplo, por sequenciamento metagenômico de rRNA ou rDNA 16S) para determinar o microbioma do hospedeiro após distribuição ou administração do agente modulador. Em alguns casos, uma amostra de um hospedeiro que não recebeu o agente modulador também é sequenciada para proporcionar uma referência.
//. Fungos [00154] Fungos exemplificativos que podem ser visados de acordo com os métodos e composições proporcionados aqui incluem, mas não se limitam a Amyicstereum areolatum, Epichice spp, Pichia pinus, Hansenuia capsulate, Daldinia decipien, Ceratocytis spp, Ophiostoma spp, e Attamyces bromatificus. Exemplos nâo limitadores de levedura e simbiontes do tipo levedura presentes em insetos incluem Candida, Metschnikowia, Debaromyces, Scheffersomyces shehatae e Scheffersomyces stipites, Starmerella, Pichia, Tríchosporon, Cryptococcus, Pseudozyma, e simbiontes do tipo levedura do subfilo Pezizornycotina (por exemplo, Symbiotaphrina bucneri e Symbiotaphrína kochii). Exemplos não limitadores de levedura que podem ser visados pelos métodos e composições aqui são listados na Tabela 2.
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Tabela 2
Espécie de Inseto Ordem: Família Localização da Levedura (Espécie)
Stegobium paniceum Coleoptera: Anobiidae Micetomas
(= Sitodrepa panicea) (Saccharomyces)
Cecos (Torulopsis buchneríi)
Micetoma entre intestino anterior e intestino médio
Micetomas (Symbiotaphrína buchneríi)
Micetomas e tubo digestivo (Torulopsis buchneríi)
Cecos do intestino (Symbiotaphrína buchneríi)
Lasioderma serrícorne Coleoptera: Anobiidae Micetoma entre intestino anterior e intestino médio
(Symbiotaphrína kochii)
Ernobius abietis Coleoptera: Anobiidae Micetomas (Torulopsis karawaiewii)
(Candida karawaiewii)
Ernobius mollis Coleoptera: Anobiidae Micetomas (Torulopsis ernobii)
(Candida ernobii)
Hemicoelus gibbicollis Coleoptera: Anobiidae Micetomas larvares
Xestobium piumbeum Coleoptera: Anobiidae Micetomas (Torulopsis xestobií)
(Candida xestobií)
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Criocephalus rusticus Coleoptera: Cerambycidae Micetomas
Phoracantha semipunctata Coleoptera: Cerambycidae Canal alimentar (Candida guilliermondii, C. tenuis')
Cecos em redor do intestino médio (Candida guilliermondii)
Harpium inquisitor Coleoptera: Cerambycidae Micetomas (Candida rhagii)
Harpium mordax H. sycophanta Coleoptera: Cerambycidae Cecos em redor do intestino médio (Candida tenuis)
Gaurotes virginea Coleoptera: Cerambycidae Cecos em redor do intestino médio (Candida rhagii)
Leptura rubra Coleoptera: Cerambycidae Cecos em redor do intestino médio (Candida tenuis)
Cecos em redor do intestino médio (Candida parapsilosis)
Leptura maculicornis Coleoptera: Cerambycidae Cecos em redor do intestino médio (Candida parapsilosis)
L cerambyciformis
Leptura sanguinolenta Coleoptera: Cerambycidae Cecos em redor do intestino médio (Candida sp.)
Rhagium bifasciatum Coleoptera: Cerambycidae Cecos em redor do intestino médio (Candida tenuis)
Rhagium inquisitor Coleoptera: Cerambycidae Cecos em redor do intestino médio (Candida guilliermondii)
Rhagium mordax Coleoptera: Cerambycidae Cecos em redor do intestino médio (Candida)
Carpophilus hemipterus Coleoptera: Nitidulidae Trato intestinal (10 espécies de levedura)
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Odontotaenius disjunctus Coieoptera: Passaiidae Intestino posterior (Enteroramus dimorphus)
Odontotaenius disjunctus Coieoptera: Passaiidae Intestino (Pichia stipitis, P. segobiensis, Candida shehatae)
Verres sternbergianus (C. ergatensis)
Scarabaeus semipunctatus Coieoptera: Scarabaeidae Trato digestivo (10 espécies de levedura)
Chironitis furcifer
Espécie desconhecida Coieoptera: Scarabaeidae intestinos (Trichosporon cutaneum)
Dendroctonus e Ips spp. Coieoptera: Scolytidae Canal alimentar (13 espécies de levedura)
Dendroctonus frontalis Coieoptera: Scolytidae Intestino médio (Candida sp.)
ips sexdentatus Coieoptera: Scolytidae Trato digestivo (Pichia bovis, P. rhodanensis)
Hanse nula holstii (Candida rhagii)
Trato digestivo
(Candida pulcherina)
ips typographus Coieoptera: Scolytidae Canal alimentar
Tratos alimentares (Hansenula capsulate, Candida parapsilosis)
Intestinos e homogenados de besouros (Hansenula holstii, H. capsulata, Candida diddensii, C. mohschtana, C. nitratophila, Cryptococcus aibidus, C. laurentii)
Trypodendron iineatum Coieoptera: Scolytidae Não especificado
Xyloterínus poiitus Coieoptera: Scolytidae Cabeça, tórax, abdômen (Candida, Pichia, Saccharomycopsis)
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Periplaneta americana Dictyoptera: Blattidae Hemocele (Candida sp. nov.)
Blatta orientalis Dictyoptera: Blattidae Trato intestinal (Kiuyveromyces blattae)
Blatella germanica Dictyoptera: Blattellidae Hemocele
Cryptocercus punctulatus Dictyoptera: Cryptocercidae Intestino posterior (1 espécie de levedura)
Philophylla heraclei Diptera: Tephritidae Hemocele
Aedes (4 espécies) Diptera: Culicidae Microflora interna (9 gêneros de levedura)
Drosophila pseudoobscura Diptera: Drosophilidae Canal alimentar (24 espécies de levedura)
Drosophila (5 spp.) Diptera: Drosophilidae Papo (42 espécies de levedura)
Drosophila meianogaster Diptera: Drosophilidae Papo (8 espécies de levedura)
Drosophila (4 spp.) Diptera: Drosophilidae Papo (7 espécies de levedura)
Drosophila (6 spp.) Diptera: Drosophilidae Intestino larvar (17 espécies de levedura)
Drosophila (20 spp.) Diptera: Drosophilidae Papo (20 espécies de levedura)
Drosophila (8 grupos de espécies) Diptera: Drosophilidae Papo (Kloeckera, Candida, Kiuyveromyces)
Drosophila serido Diptera: Drosophilidae Papo (18 espécies de levedura)
Drosophila (6 spp.) Diptera: Drosophilidae Epitélio intestinal (Coccidiascus legerí)
Protaxymia melanoptera Diptera Desconhecido (Candida, Cryptococcus, Sporoblomyces)
Astegopteryx styraci Homoptera: Aphididae Hemocele e corpo adiposo
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Tuberaphis sp. Homoptera: Aphididae Seções teciduais
Hamiltonaphis styraci
Glyphinaphis bambusae
Cerataphis sp.
Hamiltonaphis styraci Homoptera: Aphididae Hemocele abdominal
Cofana unimaculata Homoptera: Cicadellidae Corpo adiposo
Leofa unicolor Homoptera: Cicadellidae Corpo adiposo
Lecaniines, etc. Homoptera: Coccoidea d Hemolinfa, tecido graxo, etc.
Lecanium sp. Homoptera: Coccidae Hemolinfa, tecido adiposo
Ceroplastes (4 sp.) Homoptera: Coccidae Esfregaços de sangue
Laodelphax striate! 1 us Homoptera: Delphacidae Corpo adiposo
Ovos
Ovos (Candida)
Nilaparvata lugens Homoptera: Delphacidae Corpo adiposo
Ovos (2 espécies de levedura não identificadas)
Ovos, ninfas (Candida)
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Ovos (7 espécies de levedura não identificadas)
Ovos (Candida)
Nisia nervosa Homoptera: Delphacidae Corpo adiposo
Nisia grandiceps
Perkinsiella spp.
Sardia rostrata
Sogatella furcifera
Sogatodes orizicola Homoptera: Delphacidae Corpo adiposo
Amrasca devastans Homoptera: Jassidae Ovos, micetomas, hemolinfa
Tachardina lobata Homoptera: Kerriidae Esfregaços de sangue (Torulopsis)
Laccifer (~Lakshadia) sp. Homoptera: Kerriidae Esfregaços de sangue (Torula vanabilis)
Competia merceti Hymenoptera: Encyrtidae Hemolinfa, intestino, glândula de veneno
Solenopsis invicta Hymenoptera: Formicidae Hemolinfa (Myrmecomyces annellisae)
S. quinquecuspis
Solenopsis invicta Hymenoptera: Formicidae Larvas de quarto instar (Candida parapsilosis, Yarrowia lipoiitica)
Intestino e hemolinfa (Candida parapsilosis, C. iipolitica, C. guillermondii, C. rugosa, Debaryomyces hansenii)
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Apis mellifera Hymenoptera: Apidae Tratos digestivos (Torulopsis sp.)
Trato intestinal (Torulopsis apicola)
Tratos digestivos (8 espécies de levedura)
Conteúdo intestinal (12 espécies de levedura)
Conteúdo intestinal (7 espécies de levedura)
intestinos (14 espécies de levedura)
Trato intestinal (Pichia melissophila)
Tratos intestinais (7 espécies de levedura)
Canal alimentar (Hansenula silvicola)
Papo e intestino (13 espécies de levedura)
Apis mellifera Hymenoptera: Apidae intestinos médios (9 gêneros de levedura)
Anthophora occidentalis Hymenoptera: Anthophorídae
Nomia melanderi Hymenoptera: Halictidae
Halictus rubicundus Hymenoptera: Halictidae
Megachile rotundata Hymenoptera: Megachilidae
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100/321 [00155] Qualquer número de espécies fúngicas pode ser visado pelas composições ou métodos descritos aqui. Por exemplo, em alguns casos, o agente modulador pode visar uma única espécie fúngica. Em alguns casos, o agente modulador pode visar pelo menos cerca de quaisquer de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 500, ou mais espécies fúngicas distintas. Em alguns casos, o agente modulador pode visar qualquer uma de cerca de 1 até cerca de 5, cerca de 5 até cerca de 10, cerca de 10 até cerca de 20, cerca de 20 até cerca de 50, cerca de 50 até cerca de 100, cerca de 100 até cerca de 200, cerca de 200 até cerca de 500, cerca de 10 até cerca de 50, cerca de 5 até cerca de 20, ou cerca de 10 até cerca de 100 espécies fúngicas distintas. Em alguns casos, o agente modulador pode visar pelo menos cerca de quaisquer de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, ou mais filos, classes, ordens, famílias, ou gêneros de fungos.
[00156] Em alguns casos, o agente modulador pode aumentar uma população de um ou mais fungos (por exemplo, fungos patogênicos ou parasitários) em pelo menos cerca de quaisquer de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais no hospedeiro em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado. Em alguns casos, o agente modulador pode reduzir a população de um ou mais fungos (por exemplo, fungos simbióticos) em pelo menos cerca de quaisquer de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais no hospedeiro em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado. Em alguns casos, o agente modulador pode erradicar a população de um fungo (por exemplo, fungos simbióticos) no hospedeiro. Em alguns casos, o agente modulador pode aumentar o nível de um ou mais fungos simbióticos em pelo menos cerca de quaisquer de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais no hospedeiro e/ou
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101/321 pode decrescer o nível de um ou mais fungos simbióticos em pelo menos cerca de quaisquer de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais no hospedeiro em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado.
[00157] Em alguns casos, o agente modulador pode alterar a diversidade fúngica e/ou composição fúngica do hospedeiro. Em alguns casos, o agente modulador pode aumentar a diversidade fúngica no hospedeiro relativamente a uma diversidade de partida em pelo menos cerca de quaisquer de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado. Em alguns casos, o agente modulador pode decrescer a diversidade fúngica no hospedeiro relativamente a uma diversidade de partida em pelo menos cerca de quaisquer de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais em comparação com um organismo hospedeiro ao qual o agente modulador não foi administrado.
[00158] Em alguns casos, o agente modulador pode alterar a função, atividade, crescimento, e/ou divisão de um ou mais fungos. Por exemplo, o agente modulador pode alterar a expressão de um ou mais genes no fungo. Em alguns casos, o agente modulador pode alterar a função de uma ou mais proteínas no fungo. Em alguns casos, o agente modulador pode alterar a função de um ou mais componentes celulares no fungo. Em alguns casos, o agente modulador pode matar o fungo.
[00159] Além disso, o fungo-alvo pode residir em uma ou mais partes do inseto. Em alguns casos, o fungo reside em ou sobre uma ou mais partes do intestino do inseto, incluindo, por exemplo, o intestino anterior, intestino médio, e/ou intestino posterior. Em alguns casos, o fungo vive extracelularmente na hemolinfa, corpos adiposos ou em estruturas especializadas no hospedeiro.
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102/321 [00160] Alterações na população de fungos no hospedeiro podem ser determinadas por quaisquer métodos conhecidos na técnica, como microarranjo, reação em cadeia de polimerase (PCR), PCR em tempo real, citometria de fluxo, microscopia de fluorescência, microscopia eletrônica de transmissão, hibrídação in situ por fluorescência (por exemplo, FISH), espectrofotometria, desorção/ionização com laser assistido por matriz-espectrometria de massa (MALDI-MS), e sequenciamento de DNA. Em alguns casos, uma amostra do hospedeiro tratado com um agente modulador é sequenciada (por exemplo, por sequenciamento metagenômico) para determinar o microbioma do hospedeiro após distribuição ou administração do agente modulador. Em alguns casos, uma amostra de um hospedeiro que não recebeu o agente modulador também é sequenciada para proporcionar uma referência.
III. Agentes Moduladores [00161] O agente modulador dos métodos e composições proporcionados aqui pode incluir um fago, um polipeptídeo, uma molécula pequena, um antibiótico, um metabolite secundário, uma bactéria, um fungo, ou qualquer combinação desses.
/. Fago [00162] O agente modulador descrito aqui pode incluir um fago (por exemplo, um fago lítíco ou um fago não lítico). Em alguns casos, uma concentração eficaz de qualquer fago descrito aqui pode alterar um nível, atividade, ou metabolismo de um ou mais micro-organismos (como descrito aqui) residentes em um hospedeiro descrito aqui (por exemplo, um vetor de um patógeno de animais, por exemplo, um mosquito, um ácaro, um piolho mordedor, ou um carrapato), a modulação resultando em um decréscimo na aptidão do hospedeiro (por exemplo, como delineado aqui). Em alguns casos, o agente modulador inclui pelo menos um fago selecionado da ordem Tectiviridae, Myoviridae,
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Siphoviridae, Podoviridae, Caudoviraies, Lipothrixviridae, Rudiviridae, ou Ligamenvirales. Em alguns casos, a composição incluí pelo menos um fago selecionado da família Myoviridae, Siphoviridae, Podoviridae, Lipothrixviridae, Rudiviridae, Ampuilaviridae, Bicaudaviridae, Ciavaviridae, Corticoviridae, Cystoviridae, Fuseiloviridae, Giuboioviridae, Guttaviridae, inoviridae, Leviviridae, Microviridae, Plasmaviridae, e Tectiviridae. Outros exemplos não limitadores de fagos úteis nos métodos e composições são listados na Tabela 3.
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Tabela 3: Exemplos de Fagos e Bactérias Visadas
Fago e Acesso # Bactéria-alvo Hospedeiro-alvo
SA1(NC_027991), phiP68 (NC_004679) Staphylococcus sp. família Apidae
WO (AB036666.1) Wolbachia sp. Aedes aegypt; Drosophila melanogaster, Plasmodium sp; Teleogryilus taiwanemma; Bombyx mori
KL1 (NC.018278), BcepNazgul (NC...005091) PhiE125 (NC...003309) Burkholderia sp. Riptortus sp.; Pyrrhocoris apterus.
Fern (NC.028851), Xenia (NC.028837), HB10c2 (NC..028758) Paenibacillus larvae mamangabas: Bombus sp.; abelhas melíferas: A. meliifera
CP2 (NC.020205), XP10 (NC.004902), XP15 (NC...007024), phiL7 (NC.012742) Xanthomonas sp. Piebeina denoiti; família Apidae; Apis meliifera; família Drosphilidae; e família Chloropidae
PP1 (NC.019542), PM1 (NC.023865) Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum família Apidae
0RSA1 (NC..009382), 0RSB1 (NC.011201), 0RSL1 (NC_010811), RSM1 (NC...008574) Ralstonla solanacearum Bombyx mori
SF1(NC_.028807) Streptomyces scabies Philantus sp.; Trachypus sp
ECML-4 (NC.025446), ECML-117 (NC...025441), ECML-134 (NC...025449) Escherichia coli família Apidae; Varroa destructor
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Fago e Acesso # Bactéria-alvo Hospedeiro-alvo
SSP5(JX274646,1), SSP6 (NC.004831), SFP10 (NC_016073). F18SE (NC.028698) Salmonella sp. família Drosphilidae
γ (NC..001416), Bcp1 (NC... 024137) Bacillus sp. Lagarta peluda; Lymantria dispar, Varroa destructor
Phil (NC...009821) Enterococcus sp. Schistocerca gragaria
0KMV (NC...005045), 0EL(AJ697969,1), ΦΚΖ (NC..004S29) Pseudomonas sp. Lymantria díspar, família Apldae
A2 (NC..004112), phigle (NC.004305) Lactobacilli sp. família Apidae·, família Drosophila·, Varroa destructor
KLPN1 (NC_028760) Klebsiella sp C. capitata
vB__AbaM__Acíbel004 (NC_025462), vB_AbaP_Acibel007 (NC_025457) Acinetobacter sp. Schistocerca gragaria
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106/321 [00163] Em alguns casos, um agente modulador inclui um fago lítico. Assim, após a administração do fago lítico a uma célula bacteriana residente no hospedeiro, o fago causa lise na célula bacteriana-alvo. Em alguns casos, o fago lítico visa e mata uma bactéria residente em um inseto hospedeiro para decrescer a aptidão do hospedeiro. Alternativamente ou adicionalmente, o fago do agente modulador pode ser um fago nâo lítico (também referido como fago lisogênico ou temperado). Assim, após a administração do fago não lítico a uma célula bacteriana residente no hospedeiro, a célula bacteriana pode permanecer viável e conseguir manter estavelmente a expressão de genes codificados no genoma do fago. Em alguns casos, um fago não lítico é usado para alterar a expressão genética em uma bactéria residente em um inseto hospedeiro para decrescer a aptidão do hospedeiro. Em alguns casos, o agente modulador inclui uma mistura de fagos lítico e não lítico.
[00164] Em certos casos, o fago é um fago de ocorrência natural. Por exemplo, um fago de ocorrência natural pode ser isolado de uma amostra ambiental contendo uma mistura de diferentes fagos. O fago de ocorrência natural pode ser isolado usando métodos conhecidos na técnica para isolar, purificar, e identificar fagos que visam um microorganismo particular (por exemplo, um endossimbionte bacteriano em um hospedeiro de inseto). Alternativamente, em certos casos, o fago pode ser manipulado com base em um fago de ocorrência natural.
[00165] O agente modulador descrito aqui pode incluir um fago com uma gama de alvos bacterianos estreita ou larga. Em alguns casos, o fago tem uma gama de alvos bacterianos estreita. Em alguns casos, o fago é um fago promíscuo com uma gama de alvos bacterianos larga. Por exemplo, o fago promíscuo pode visar pelo menos cerca de quaisquer de 5, 10, 20, 30, 40, 50, ou mais bactérias residentes no hospedeiro. Um fago com uma gama de alvos bacterianos estreita pode vi
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107/321 sar uma estirpe bacteriana específica no hospedeiro sem afetar outras bactérias, por exemplo, não visadas, no hospedeiro. Por exemplo, o fago pode visar não mais do que cerca de quaisquer de 50, 40, 30, 20, 10, 8, 6, 4, 2, ou 1 bactéria residente no hospedeiro. Por exemplo, o fago descrito aqui pode ser útil para visar uma ou mais bactérias residentes no mosquito, incluindo, mas não se limitando a, EspZ, Serratia spp (por exemplo, Serratia marcescens), Enterbacterioaceae spp., Enterobacter spp. (por exemplo, Enterobacter cloacae, Enterobacter amnigenus, Enterobacter ludwigii), Proteus spp., Acinetobacter spp., Wigglesworthia spp. (Wigglesworthia gloosinidia), Xanthomonas spp. (por exemplo, Xanthomonas maltophilia), Pseudomonas spp. (por exemplo, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas rhodesiae), Escherichia spp. (por exemplo, Escherchia coli), Cedecea spp. (por exemplo, Cedecea lapagei), Ewingella spp. (por exemplo, Ewingella americana), Bacillus spp. (por exemplo, Bacillus pumilus), Comamonas spp., ou Vagococcus spp. (por exemplo, Vagococcus salmoninarium), ou Wolbachia spp. (por exemplo, Wolbachia wMel, Wolbachia - wAIbB, Wolbachia - wMelPop, Wolbachia - wMelPop-CLA).
[00166] As composições descritas aqui podem incluir qualquer número de fagos, como pelo menos cerca de qualquer um de 1, 2, 3, 4,
5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100, ou mais fagos. Em alguns casos, a composição inclui fagos de uma ou mais famílias (por exemplo, 2, 3, 4, 5,
6, 7, 8, 9, 10, ou mais famílias de fagos), uma ou mais ordens (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais fagos), ou uma ou mais espécies (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100, ou mais fagos). Composições incluindo um ou mais fagos também são referidas aqui como coquetéis de fagos. Coquetéis de fagos são úteis porque permitem visar uma gama mais larga de hospedeiros de bactérias. Além disso, permitem que cada estirpe bacteriana (isto é, subes
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108/321 pécie) seja visada por múltiplos fagos ortogonais, desse modo prevenindo ou retardando significativamente o surgimento de resistência. Em alguns casos, um coquetel inclui múltiplos fagos visando uma espécie bacteriana. Em alguns casos, um coquetel inclui múltiplos fagos visando múltiplas espécies bacterianas. Em alguns casos, um coquetel de um fago inclui um único fago promiscuo (isto é, um fago com uma gama larga de hospedeiros) visando muitas estirpes dentro de uma espécie.
[00167] Concentrações adequadas do fago no agente modulador descrito aqui dependem de fatores como a eficácia, taxa de sobrevivência, transmissibilidade do fago, número de fagos distintos, e/ou tipos de lisina nas composições, formulação, e métodos de aplicação da composição. Em alguns casos, o fago está em uma formulação líquida ou sólida. Em alguns casos, a concentração de cada fago em quaisquer das composições descritas aqui é pelo menos cerca de quaisquer de 102, 103, 104, 105, 10®, 107, 108, 109, 101°ou mais pfu/mL Em alguns casos, a concentração de cada fago em quaisquer das composições descritas aqui é não mais do que cerca de quaisquer de 102, 103, 104, 105, 10®, 107, 108, 109 pfu/mL Em alguns casos, a concentração de cada fago na composição é qualquer de cerca de 102 até cerca de 103, cerca de 103 até cerca de 104, cerca de 104 até cerca de 105, cerca de 105 até cerca de 10®, cerca de 107 até cerca de 108, cerca de 108 até cerca de 109, cerca de 102 até cerca de 104, cerca de 104 até cerca de 10®, cerca de 106 até cerca de 109, ou cerca de 103 até cerca de 108 pfu/mL. Em alguns casos, em que a composição inclui pelo menos dois tipos de fagos, a concentração de cada tipo dos fagos pode ser igual ou diferente. Por exemplo, em alguns casos, a concentração de um fago no coquetel é cerca de 108 pfu/mL e a concentração de um segundo fago no coquetel é cerca de 10s pfu/mL [00168] Um agente modulador incluindo um fago como descrito aqui
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109/321 pode ser contatado com o hospedeiro-alvo em uma quantidade e durante um tempo suficiente para: (a) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração do fago no interior de um hospedeiro-alvo; (b) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração do fago no interior do intestino de um hospedeiro-alvo; (c) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração do fago no interior de um bacteriócito de um hospedeiro-alvo; (d) modular o nível, ou uma atividade, de um ou mais micro-organismos (por exemplo, endossímbíonte) no hospedeiro-alvo; ou/e (e) modular a aptidão do hospedeiro-alvo.
[00169] Como ilustrado pelos Exemplos 5-7 e 28, fagos (por exemplo, um ou mais fagos de ocorrência natural) podem ser usados como agentes moduladores que visam uma bactéria endossimbiótica em um hospedeiro de inseto para decrescer a aptidão do hospedeiro (por exemplo, como delineado aqui).
//. Polipeptídeos [00170] Numerosos polipeptídeos (por exemplo, uma bacteriocina, bacteriocina do tipo R, peptídeo rico em C específico para nódulos, peptídeo antimicrobiano, lisina, ou peptídeo regulador de bacteriócitos) podem ser usados nas composições e métodos descritos aqui. Em alguns casos, uma concentração eficaz de qualquer peptídeo ou polípeptídeo descrito aqui pode alterar um nível, atividade, ou metabolismo de um ou mais micro-organismos (como descrito aqui, por exemplo, um Wolbachia spp. ou um Rickettsia spp.) residentes em um hospedeiro (por exemplo, um vetor de um patógeno de animais, por exemplo, um mosquito, ácaro, piolho mordedor, ou carrapato), a modulação resultando em um decréscimo na aptidão do hospedeiro (por exemplo, como delineado aqui). Polipeptídeos incluídos aqui podem incluir polipeptídeos de ocorrência natural ou variantes recombinante
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110/321 mente produzidas. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser uma variante funcionalmente ativa de quaisquer dos polipeptídeos descritos aqui com pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade, por exemplo, ao longo de uma região especificada ou ao longo de toda a sequência, com uma sequência de um polipeptídeo descrito aqui ou um polipeptídeo de ocorrência natural.
[00171] Um agente modulador compreendendo um polipeptídeo como descrito aqui pode ser contatado com o hospedeiro-alvo em uma quantidade e durante um tempo suficiente para: (a) alcançar um nívelalvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração no interior de um hospedeiro-alvo; (b) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração no interior do intestino de um hospedelro-alvo; (c) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração no interior de um bacteriócito de um hospedeiro-alvo; (d) modular o nível, ou uma atividade, de um ou mais micro-organismos (por exemplo, endossimbionte) no hospedeiro-alvo; ou/e (e) modular a aptidão do hospedeiro-alvo.
[00172] Os agentes moduladores polipeptídicos discutidos daqui em diante, nomeadamente bacteriocinas, Usinas, peptídeos antimicrobianos, peptídeos ricos em C específicos para nódulos, e peptídeos reguladores de bacteriócitos, podem ser usados para alterar o nível, atividade, ou metabolismo de micro-organismos-alvo (por exemplo, Rickettsia ou Wolbochía) como indicado na seção para decrescer a aptidão de insetos hospedeiros (por exemplo, um vetor de um patógeno de animais, por exemplo, um mosquito, um ácaro, um piolho mordedor, ou um carrapato).
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111/321 (a) Bacteriocinas [00173] O agente modulador descrito aqui pode incluir uma bacteriocina. Em alguns casos, a bacteriocina é naturalmente produzida por bactérias Gram-positivas, como Pseudomonas, Streptomyces, Bacillus, Staphylococcus, ou bactérias do ácido láctico (LAB, como Lactococcus lactis). Em alguns casos, a bacteriocina é naturalmente produzida por bactérias Gram-negativas, como Hafnla alvei, Citrobacter freundii, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumonia, Enterobacter cloacae, Serratia plymithicum, Xanthomonas campestris, Erwinia carotovora, Ralstonia solanacearum, ou Escherichia coll. Bacteriocinas exemplificativas incluem, mas não se limitam a, antibióticos LAB de Classe l-IV (como lantibióticos), colicinas, microcinas, e piocinas. Exemplos não limitadores de bacteriocinas são listados na Tabela 4.
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Tabela 4: Exemplos de Bacterioclnas
Classe Nome Produtor Alvos Sequência
Classe I Nisina Lactococcus lactis Ativo em bactérias Gram-positivas: Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Listeria, Clostridium ITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCHCSIHVSK (SEQ ID NO: 4242)
Epidermina Staphylococcus epidermis bactérias Gram-positivas IASKFICTPGCAKTGSFNSYCC (SEQ ID NO: 43)
Classe II
Classe II a Pediocina PA-1 Pediococcus acidilactici Pedíococci, Lactobacilli, Leuconostoc, Brochothrix thermosphacta, Propionibactería, Bacilli, Enterococci, Staphylococci, Listeria Clostridia, Listeria monocytogenes, Listeria innocua KYYGNGVTCGKHSCSVDWGKATTCIINNGAMAWATGG HQGNHKC (SEQ ID NO: 44)
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Classe II b Enterocina P Enterococcus faecium Lactobacillus sake!, Enterococcus faecium ATRSYGNGVYCNNSKCWVNWGEAKENIAGIVISGWAS GLAGMGH (SEQ ID NO: 45)
Classe II c Lactococcina G Streptococcus lactis bactérias Gram-positivas GTWDDIGQGIGRVAYWVGKAMGNMSDVNQASRINRKK KH (SEQ ID NO: 46)
Classe II d Lactacina-F Lactobacillus johnsonii Lactobacilli, Enterococcus faecalis N RWGDTVLSAASG AGTGIKAC KSFG PWGM Al CG VGG A AIGGYFGYTHN (SEQ ID NO: 47)
Classe III
Classe III a Enterocina AS-48 Enterococcus faecalis Espectro largo: bactérias Grampositivas e Gram-negativas. MAKEFGIPAAVAGTVLNWEAGGWVTTIVSILTAVGSGG LSLLAAAGRESIKAYLKKEIKKKGKRAVIAW (SEQ ID NO: 48)
Classe III b aureocina A70 Staphylococ- cus aureus Espectro largo: bactérias Grampositivas e Gram-negativas. MSWLNFLKYIAKYGKKAVSAAWKYKGKVLEWLNVGPTL EWVWQKLKKIAGL (SEQ ID NO: 49)
Classe IV Garvicina A Lactococcus garvieae Espectro largo: bactérias Grampositivas e Gram-negativas, IGGALGNALNGLGTWANMMNGGGFVNQWQVYANKGK INQYRPY (SEQ ID NO: 50)
Não classificado Colicina V Escherichia coll Ativo contra Escherichia coll (também bactérias proximamente relacionadas), Enterobacteriaceae MRTLTLNELDSVSGGASGRDIAMAIGTLSGQFVAGGIG AAAGGVAGGAIYDYASTHKPNPAMSPSGLGGTIKQKPE GiPSEAWNYAAGRLCNWSPNNLSDVCL (SEQ ID NO: 51)
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114/321 [00174] Em alguns casos, a bacteriocina é uma colicina, uma piocina, ou uma microcina produzida por bactérias Gram-negativas. Em alguns casos, a bacteriocina é uma colicina. A colicina pode ser uma colicina do grupo A (por exemplo, usa o sistema Tol para penetrar na membrana externa de uma bactéria-alvo) ou uma colicina do grupo B (por exemplo, usa o sistema Ton para penetrar na membrana externa de uma bactéria-aivo). Em alguns casos, a bacteriocina é uma microcina. A microcina pode ser uma microcina de classe I (por exemplo, < 5 kDa, tem modificações pós-tradução) ou uma microcina de classe II (por exemplo, 5-10 kDa, com ou sem modificações pós-tradução). Em alguns casos, a microcina de classe II é uma microcina de classe lia (por exemplo, requer mais do que um gene para sintetizar e montar peptídeos funcionais) ou uma microcina de classe llb (por exemplo, peptídeos lineares com ou sem modificações pós-tradução no terminal C). Em alguns casos, a bacteriocina é uma piocina. Em alguns casos, a piocina é uma R-piocina, F-piocina, ou S-piocina.
[00175] Em alguns casos, a bacteriocina é uma bacteriocina de classe I, classe II, classe III, ou classe IV produzida por bactérias Gram-positivas. Em alguns casos, o agente modulador inclui uma bacteriocina de Classe I (por exemplo, antibióticos contendo lantionina (lantibióticos) produzidos por uma bactéria Gram-positiva). As bacteriocinas de classe I ou lantibiótico podem ser um peptídeo de baixo peso molecular (por exemplo, menos do que cerca de 5 kDa) e podem possuir resíduos de aminoácidos modificados de modo pós-tradução (por exempio, lantionina, β-metil-lantionina, ou aminoácidos desidratados).
[00176] Em alguns casos, a bacteriocina é uma bacteriocina de Classe II (por exemplo, não lantibióticos produzidos por bactérias Gram-positivas). Muitas são peptídeos de carga positiva, não contendo lantionina, os quais, ao contrário dos lantibióticos, não sofrem modifi
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115/321 cação pós-tradução extensa. A bacteriocina de Classe II pode pertencer a uma das seguintes subclasses: bacterioclnas do tipo pedioclna (por exemplo, pediocina PA-1 e carnobacteriocina X (Classe lia)); bacteriocinas de dois peptídeos (por exemplo, lactacina F e ABP-118 (Classe llb)); bacterioclnas circulares (por exemplo, carnociclina A e enterocina AS-48 (Classe llc)); ou bacterioclnas não modificadas, lineares, não do tipo pediocina (por exemplo, epidermicina NI01 e lactococcina A (Classe lld)).
[00177] Em alguns casos, a bacteriocina é uma bacteriocina de Classe III (por exemplo, produzida por bactérias Gram-positivas). Bacteriocinas de Classe III podem ter um peso molecular maior do que 10 kDa e podem ser proteínas instáveis ao calor. As bacterioclnas de Classe III podem ser adicionalmente subdivididas em bacterioclnas do Grupo IIIA e Grupo IIIB. As bacterioclnas do Grupo ΠΙΑ incluem enzimas bacteriolíticas que matam estirpes sensíveis por lise da parede celular, como Enterolisina A. Bacterioclnas do Grupo IIIB incluem proteínas não líticas, como Caseicina 80, Helveticina J, e lactacina B.
[00178] Em alguns casos, a bacteriocina é uma bacteriocina de Classe IV (por exemplo, produzida por bactérias Gram-positivas). Bacteriocinas de Classe IV são um grupo de proteínas complexas, associadas a outras frações de lipídeos ou carboidratos, que aparentam ser requeridas para atividade. São relativamente hidrofóbicas e estáveis ao calor. Exemplos de bacterioclnas de Classe IV são leuconocina S, lactocina 27, e lactocina S.
[00179] Em alguns casos, a bacteriocina é uma bacteriocina do tipo R. Bacterioclnas do tipo R são complexos proteicos bacteriocidas contrateis. Algumas bacteriocinas do tipo R têm uma estrutura do tipo cauda de fago contrátil. A região C-terminal da proteína de fibra de cauda de fago determina a especificidade de ligação ao alvo. Podem se ligar a células-alvo através de uma proteína de ligação a recepto
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116/321 res, por exemplo, uma fibra de cauda. A ligação é seguida de contração da bainha e inserção do núcleo através do envelope da bactériaalvo. A penetração do núcleo origina uma despolarização rápida do potencial da membrana celular e morte celular imediata. O contato com uma única partícula de bacteriocina do tipo R pode resultar em morte celular. Uma bacteriocina do tipo R, por exemplo, pode ser termolábil, resistente a ácidos fracos, resistente a tripsina, sedimentável por centrifugação, resolúvel por microscopia eletrônica, ou uma combinação desses. Outras bacteriocinas do tipo R podem ser moléculas complexas incluindo múltiplas proteínas, polipeptídeos, ou subunidades, e podem se assemelhar a uma estrutura de cauda de bacteriófagos da família Myoviridae. Em bacteriocinas do tipo R de ocorrência natural, as estruturas de subunidade podem ser codificadas por um genoma bacteriano, como o de C. difficile ou P. aeruginosa e formam bacteriocinas do tipo R para atuarem como defesas naturais contra outras bactérias. Em alguns casos, a bacteriocina do tipo R é uma piocina. Em alguns casos, a piocina é uma R-piocina, F-piocina, ou S~ piocina.
[00180] Em alguns casos, a bacteriocina é uma variante funcionalmente ativa das bacteriocinas descritas aqui. Em alguns casos, a variante da bacteriocina tem pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade, por exemplo, ao longo de uma região especificada ou ao longo de toda a sequência, com uma sequência de uma bacteriocina descrita aqui ou uma bacteriocina de ocorrência natural.
[00181] Em alguns casos, a bacteriocina pode ser biomanipulada, de acordo com métodos padrão, para modular a sua bioatividade, por exemplo, aumentar ou decrescer ou regular, ou para especificar seus micro-organismos-alvo. Em outros casos, a bacteriocina é produzida
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117/321 pela maquinaria de tradução (por exemplo, um ribossomo, etc.) de uma célula microbiana. Em alguns casos, a bacteriocina é sintetizada quimicamente. Algumas bacteriocinas podem ser derivadas de um precursor polipeptídico. O precursor polipeptídico pode sofrer divagem (por exemplo, processamento por uma protease) para originar o polipeptídeo da própria bacteriocina. Como tal, em alguns casos, a bacteriocina é produzida a partir de um polipeptídeo precursor. Em alguns casos diferentes, a bacteriocina inclui um polipeptídeo que sofreu modificações pós-tradução, por exemplo, divagem, ou a adição de um ou mais grupos funcionais.
[00182] As bacteriocinas descritas aqui podem ser formuladas em uma composição para qualquer um dos usos descritos aqui. As composições reveladas aqui podem incluir qualquer número ou tipo (por exemplo, classes) de bacteriocinas, como pelo menos cerca de qualquer um de 1 bacteriocina, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100, ou mais bacteriocinas. Concentrações adequadas de cada bacteriocina nas composições descritas aqui dependem de fatores como eficácia, estabilidade da bacteriocina, número de tipos distintos de bacteriocinas nas composições, formulação, e métodos de aplicação da composição. Em alguns casos, cada bacteriocina em uma composição líquida vai desde cerca de 0,01 ng/mL até cerca de 100 mg/mL Em alguns casos, cada bacteriocina em uma composição sólida vai desde cerca de 0,01 ng/g até cerca de 100 mg/g. Em alguns casos, em que a composição inclui pelo menos dois tipos de bacteriocinas, a concentração de cada tipo das bacteriocinas pode ser igual ou diferente. Em alguns casos, a bacteriocina é proporcionada em uma composição incluindo uma célula bacteriana que secreta a bacteriocina. Em alguns casos, a bacteriocina é proporcionada em uma composição incluindo um polipeptídeo (por exemplo, um polipeptídeo isolado de uma célula bacteriana).
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118/321 [00183] As bacteriocinas podem neutralizar (por exemplo, matar) pelo menos um micro-organismo diferente da célula bacteriana individual na qual o polipeptídeo é produzido, incluindo células relacionadas de modo clonal com a célula bacteriana e outras células microbianas. Como tal, uma célula bacteriana pode exercer efeitos citotóxicos ou inibidores do crescimento em uma pluralidade de organismos microbianos por secreção de bacteriocinas. Em alguns casos, a bacteriocina visa e mata uma ou mais espécies de bactérias residentes no hospedeiro via formação de poros na membrana citoplasmática, interferência na parede celular (por exemplo, atividade de peptídeoglicanase), ou atividade de nuclease (por exemplo, atividade de DNase, atividade de rRNase 16S, ou atividade de tRNase).
[00184] Em alguns casos, a bacteriocina tem uma atividade neutralizadora. A atividade neutralizadora de bacteriocinas pode incluir, mas não se limita a, paragem da reprodução microbiana, ou citotoxicidade. Algumas bacteriocinas têm atividade citotóxica, e assim podem matar organismos microbianos, por exemplo, bactérias, levedura, algas, e similares. Algumas bacteriocinas podem inibir a reprodução de organismos microbianos, por exemplo, bactérias, levedura, algas, e similares, por exemplo, por paragem do ciclo celular.
[00185] Em alguns casos, a bacteriocina tem atividade exterminadora. O mecanismo de morte de bacteriocinas é específico de cada grupo de bacteriocinas. Em alguns casos, a bacteriocina tem bioatividade de pequeno espectro. As bacteriocinas são conhecidas pela sua potência muito elevada contra suas estirpes-alvo. Alguma atividade de bacteriocinas é limitada a estirpes que estão proximamente relacionadas com a estirpe produtora da bacteriocina (bioatividade de pequeno espectro). Em alguns casos, a bacteriocina tem bioatividade de largo espectro contra uma gama ampla de gêneros.
[00186] Em alguns casos, bacteriocinas interagem com uma molé
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119/321 cuia receptora ou uma molécula de ancoragem na membrana celular bacteriana-alvo. Por exemplo, nlsina é extremamente potente contra suas estirpes bacterianas-alvo, exibindo atividade antimicrobiana mesmo a uma concentração nanomolar de um único dígito. Foi mostrado que a molécula de nisina se liga ao lipídeo II, que é o principal transportador de subunidades de peptídeoglicano do citoplasma para a parede celular.
[00187] Em alguns casos, a bacteriocina tem atividade antifúngica. Foram identificadas algumas bacteriocinas com atividade antilevedura ou antifúngica. Por exemplo, foi mostrado que bacteriocinas de Bacillus têm atividade neutralizadora contra algumas estirpes de levedura (ver, por exemplo, Adetunji e Olaoye, Malaysian Journal of Microbiology 9:130-13, 2013). Em outro exemplo, foi mostrado que um peptídeo de Enterococcus faecalis tem atividade neutralizadora contra espécies de Candida (ver, por exemplo, Shekh e Roy, BMC Microbiology 12:132, 2012). Em outro exemplo, foi mostrado que bacteriocinas de Pseudomonas têm atividade neutralizadora contra fungos, como Cur~ vularia lunata, espécies de Fusarium, espécies de Helminthosporium, e espécies de Blopolaris (ver, por exemplo, Shalani e Srivastava, The Internet Journal of Microbiology Volume 5 Número 2, 2008). Em outro exemplo, foi mostrado que botricidina AJ1316 e alirina B1 de B. subtllls têm atividades antifúngicas.
[00188] Um agente modulador incluindo uma bacteriocina como descrito aqui pode ser contatado com o hospedeiro-alvo em uma quantidade e durante um período de tempo suficiente para: (a) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de bacteriocina no interior de um hospedeiro-alvo; (b) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de bacteriocina no interior do intestino de um hospedeiro-alvo; (c) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível prede
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120/321 terminado ou limite) de concentração de bacteriocina no interior de um bacteríócito de um hospedeiro-alvo; (d) modular o nível, ou uma atividade, de um ou mais micro-organismos (por exemplo, endossimbionte) no hospedeiro-alvo; ou/e (e) modular a aptidão do hospedeiro-alvo.
[00189] Como ilustrado pelos Exemplos 8, 9, ou 16, bacteriocinas (por exemplo, colA ou nisina) podem ser usadas como agentes moduladores que visam uma bactéria endossimbiótica em um hospedeiro de inseto para decrescer a aptidão do hospedeiro (por exemplo, como delineado aqui).
(b) Lisinas [00190] O agente modulador descrito aqui pode incluir uma lisina (por exemplo, também conhecida como uma mureína hidrolase ou autolisina para peptídeoglicano). Qualquer lisina adequada para inibir uma bactéria residente no hospedeiro pode ser usada. Em alguns casos, a lisina é tal que pode ser naturalmente produzida por uma célula bacteriana. Em alguns casos, a lisina é tai que pode ser naturalmente produzida por um bacteriófago. Em alguns casos, a lisina é obtida de um fago que inibe uma bactéria residente no hospedeiro. Em alguns casos, a lisina é manipulada com base em uma lisina de ocorrência natural. Em alguns casos, a lisina é manipulada de modo a ser secretada por uma bactéria hospedeira, por exemplo, por introdução de um peptídeo sinal na lisina. Em alguns casos, a lisina é usada em combinação com uma holina de fago. Em alguns casos, a lisina é expressa por um hospedeiro de bactéria recombinante que não é sensível à Usina. Em alguns casos, a lisina é usada para inibir uma bactéria Grampositiva ou Gram-negativa residente no hospedeiro.
[00191] A lisina pode consistir em qualquer classe de lisina e pode ter uma ou mais especificidades para substratos. Por exemplo, a lisina pode ser uma glicosidase, uma endopeptidase, uma carboxipeptidase, ou uma combinação desses. Em alguns casos, a lisina procede à cli
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121/321 vagem da ligação -1-4 glicosídica na fração de açúcar da parede celular, da ligação amida conectando as frações de açúcar e peptídica da parede da célula bacteriana, e/ou das ligações peptídicas entre as frações peptídicas da parede celular. A lisina pode pertencer a um ou mais grupos específicos de lisina, dependendo do sítio de divagem dentro do peptídeoglicano. Em alguns casos, a lisina é uma A/~acetil~ D-muramidase (por exemplo, lisozima), transglicosilase lítica, /V-acetil-D-glucosaminidase, AZ-acetílmuramil-L-alanina amidase, LDendopeptidase, D,D-endopeptidase, D,D-carboxipeptidase, L,Dcarboxipeptidase, ou L,D-transpeptidase. Exemplos não limitadores de lisinas e suas atividades são listados na Tabela 5.
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Tabela 5: Exemplos de Lisinas
Bactéria-alvo Produtor Lisinas Atividade Sequência
S. pneumoniae Cp1 Cpl-1 Muramidase MVKKNDLFVDVSSHNGYDITGILEQMGTTNTIIKISESTTYLNPCLSA QVEQSNPIGFYHFARFGGDVAEAEREAQFFLDNVPMQVKYLVLDYE DDPSGDAQANTNACLRFMQMIADAGYKPIYYSYKPFTHDNVDYQQI LAQFPNSLWIAGYGLNDGTANFEYFPSMDGIRWWQYSSNPFDKNIV LLDDEEDDKPKTAGTWKQDSKGWWFRRNNGSFPYNKWEKIGGVW YYFDSKGYCLTSEWLKDNEKWYYLKDNGAMATGWVLVGSEWYYM DDSGAMVTGWVKYKNNWYYMTNERGNMVSNEFIKSGKGWYFMNT NGELADNPSFTKEPDGLITVA (SEQ ID NO: 52)
S. pneumoniae Dp-1 Pal Amidase MGVDIEKGVAWMQARKGRVSYSMDFRDGPDSYDCSSSMYYALRS AGASSAGWAVNTEYMHAWLIENGYELISENAPWDAKRGDIFIWGRK GASAGAGGHTGMFIDSDNIIHCNYAYDGISVNDHDERWYYAGQPYY YVYRLTNANAQPAEKKLGWQKDATGFWYARANGTYPKDEFEYIEE NKSWFYFDDQGYMLAEKWLKHTDGNWYWFDRDGYMATSWKRIG ESWYYFNRDGSMVTGWIKYYDNWYYCDATNGDMKSNAFIRYNDG WYLLLPDGRLADKPQFTVEPDGLITAKV (SEQ ID NO: 53)
S. pyogenes C1 C1 Amidase N/A
B. anthracis □ PlyG Amidase MEIQKKLVDPSKYGTKCPYTMKPKYITVHNTYNDAPAENEVSYMISN
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NNEVSFHIAVDDKKAIQGIPLERNAWACGDGNGSGNRQSISVEICYS KSGGDRYYKAEDNAVDVVRQLMSMYNIPIENVRTHQSWSGKYCPH RMLAEGRWGAFIQKVKNGNVATTSPTKQNIIQSGAFSPYETPDVMG ALTSLKMTADFÍLQSDGLTYFISKPTSDAQLKAMKEYLDRKGWWYEV K (SEQ ID NO: 54)
β. anthracis pró-fago de Ames PlyPH Amidase N/A
E. faecaiis e E. faecium Phil PlyV12 Amidase N/A
S. aureus 0MR11 MV-L Endopeptidase e amidase MQAKLTKKEFIEWLKTSEGKQFNVDLWYGFQCFDYANAGWKVLFG LLLKGLGAKDIPFANNFDGLATVYQNTPDFLAQPGDMVVFGSNYGA GYGHVAWVIEATLDYIIVYEQNWLGGGWTDRIEQPGWGWEKVTRR QHAYDFPMWFIRPNFKSETAPRSIQSPTQASKKETAKPQPKAVELKII KDVVKGYDLPKRGGNPKGIVIHNDAGSKGATAEAYRNGLVNAPLSR LEAGIAHSYVSGNTVWQALDESQVGWHTANQLGNKYYYGIEVCQS MGADNATFLKNEQATFQECARLLKKWGLPANRNTIRLHNEFTSTSC PHRSSVLHTGFDPVTRGLLPEDKQLQLKDYFIKQIRVYMDGKIPVAT VSNESSASSNTVKPVASAWKRNKYGTYYMEENARFTNGNQPITVR KIGPFLSCPVAYQFQPGGYCDYTEVMLQDGHVWVGYTWEGQRYYL PI RTWNGSAPPNQILGDLWGEIS
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(SEQ ID NO: 55)
S. pyogenes C1 PlyC Amidase N/A
S. agalactiae B30 lisina de GBS Muramidase e endopeptidase MVINIEQAIAWMASRKGKVTYSMDYRNGPSSYDCSSSVYFALRSAG ASDNGWAVNTEYEHDWLIKNGYVLIAENTNWNAQRGDIFIWGKRGA SAGAFGHTGMFVDPDNIIHCNYGYNSITVNNHDEIWGYNGQPYVYA YRYSGKQSNAKVDNKSVVSKFEKELDVNTPLSNSNMPYYEATISED YYVESKPDVNSTDKELLVAGTRVRVYEKVKGWARIGAPQSNQWVE DAYLIDATDM (SEQ ID NO: 56)
S. aureus P68 Lys16 Endopeptidase N/A
S. aureus K LysK Amidase e endopeptidase MAKTQAEINKRLDAYAKGTVDSPYRVKKATSYDPSFGVMEAGAIDA DGYYHAQCQDLITDYVLWLTDNKVRTWGNAKDQIKQSYGTGFKIHE NKPSTVPKKGWIAVFTSGSYEQWGHIGIVYDGGNTSTFTILEQNWN GYANKKPTKRVDNYYGLTHFIEIPVKAGTTVKKETAKKSASKTPAPK KKATLKVSKNHINYTMDKRGKKPEGMVIHNDAGRSSGQQYENSLAN AGYARYANGIAHYYGSEGYVWEAIDAKNQIAWHTGDGTGANSGNF RFAGIEVCQSMSASDAQFLKNEQAVFQFTAEKFKEWGLTPNRKTVR LHMEFVPTACPHRSMVLHTGFNPVTQGRPSQAIMNKLKDYFIKQIKN YMDKGTSSSTVVKDGKTSSASTPATRPVTGSWKKNQYGTWYKPEN ATFVNGNQPIVTRIGSPFLNAPVGGNLPAGATIVYDEVCIQAGHIWIG YNAYNGNRVYCPVRTCQGVPPNQIPGVAWGVFK
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(SEQ ID NO: 57)
L. monocytogenes A118 Ply118 Amidase MTSYYYSRSLANVNKLADNTKAAARKLLDWSESNGIEVLIYETIRTKE QQAANVNSGASQTMRSYHLVGQALDFVMAKGKTVDWGAYRSDKG KKFVAKAKSLGFEWGGDWSGFVDNPHLQFNYKGYGTDTFGKGAST SNSSKPSADTNTNSLGLVDYMNLNKLDSSFANRKKLATSYGIKNYS GTATQNTTLLAKLKAGKPHTPASKNTYYTENPRKVKTLVQCDLYKSV DFTTKNQTGGTFPPGTVFTISGMGKTKGGTPRLKTKSGYYLTANTK FVKKI (SEQ ID NO: 58)
L. monocytogenes A511 Ply511 Amidase MVKYTVENKIIAGLPKGKLKGANFVIAHETANSKSTIDNEVSYMTRN WKNAFVTHFVGGGGRVVQVANVNYVSWGAGQYANSYSYAQVELC RTSNATTFKKDYEVYCQLLVDLAKKAGIPITLDSGSKTSDKGIKSHKW VADKLGGTTHQDPYAYLSSWGISKAQFASDLAKVSGGGNTGTAPAK PSTPAPKPSTPSTNLDKLGLVDYMNAKKMDSSYSNRDKLAKQYGIA NYSGTASQNTTLLSKIKGGAPKPSTPAPKPSTSTAKKIYFPPNKGNW SVYPTNKAPVKANAIGA!NPTKFGGLTYTIQKDRGNGVYE!QTDQFG RVQVYGAPSTGAVIKK (SEQ ID NO: 59)
L. monocytogenes A500 PlyõOO Endopeptidase MALTEAWLIEKANRKLNAGGMYKITSDKTRNVIKKMAKEGIYLCVAQ GYRSTAEQNALYAQGRTKPGAIVTNAKGGQSNHNYGVAVDLCLYT NDGKDVIWESTTSRWKKVVAAMKAEGFKWGGDWKSFKDYPHFEL
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CDAVSGEKIPAATQNTNTNSNRYEGKVIDSAPLLPKMDFKSSPFRM YKVGTEFLVYDHNQYWYKTYIDDKLYYMYKSFCDVVAKKDAKGRIK VRIKSAKDLRIPVWNNIKLNSGKIKWYAPNVKLAWYNYRRGYLELWY PNDGWYYTAEYFLK (SEQ ID NO: 60)
S. pneumoniae Φϋρ-1 Pal, S Endopeptidase e amidase N/A
S. agaiactiae pró-fago LambdaSal LambdaSal Glicosidase MVINIEQAIAWMASRKGKVTYSMDYRNGPSSYDCSSSVYFALRSAG ASDNGWAVNTEYEHDWLIKNGYVLIAENTNWNAQRGDIFIWGKRGA SAGAFGHTGMFVDPDNIIHCNYGYNSITVNNHDEIWGYNGQPYVYA YRYARKQSNAKVDNQSVVSKFEKELDVNTPLSNSNMPYYEATISED YYVESKPDVNSTDKELLVAGTRVRVYEKVKGWARIGAPQSNQWVE DAYLIDATDM (SEQ ID NO: 61)
S. agalactiae pró-fago LambdaSa2 LambdaSa2 Glicosidase e endopeptidase MEINTEIAIAWMSARQGKVSYSMDYRDGPNSYDCSSSVYYALRSAG ASSAGWAVNTEYMHDWLIKNGYELIAENVDWNAVRGDIAIWGMRG HSSGAGGHVVMFIDPENIIHCNWANNGITVNNYNQTAAASGWMYCY VYRLKSGASTQGKSLDTLVKETLAGNYGNGEARKAVLGNQYEAVM SVINGKTTTNQKTVDQLVQEVIAGKHGNGEARKKSLGSQYDAVQKR VTELLKKQPSEPFKAQEVNKPTETKTSQTELTGQATATKEEGDLSFN GTILKKAVLDKILGNCKKH Dl LPSYALTILHYEGLWGTSAVGKADNNW
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GGMTWTGQGNRPSGVTVTQGSARPSNEGGHYMHYASVDDFLTD WFYLLRAGGSYKVSGAKTFSEAIKGMFKVGGAVYDYAASGFDSYIV GASSRLKAIEAENGSLDKFDKATDIGDGSKDKIDITIEGIEVTINGITYE LTKKPV (SEQ ID NO: 62)
S. uberis pró-fago (ATCC7004 07) Ply700 Amidase MTDSIQEMRKLQSIPVRYDMGDRYGNDADRDGRIEMDCSSAVSKAL GISMTNNTETLQQALPAIGYGKIHDAVDGTFDMQAYDVIIWAPRDGS SSLGAFGHVLIATSPTTAIHCNYGSDGITENDYNYIWEINGRPREIVF RKGVTQTQATVTSQFERELDVNARLTVSDKPYYEATLSEDYYVEAG PRIDSQDKELIKAGTRVRVYEKLNGWSRINHPESAQWVEDSYLVDA TEM (SEQ ID NO: 63)
S. suis SMP LySMP Glicosidase e endopeptidase N/A
B. anthracis Bcp1 PlyB Muramidase N/A
S. aureus Phi11 e Phi12 lisina de Phi11 Amidase e endopeptidase MQAKLTKNEFIEWLKTSEGKQFNVDLWYGFQCFDYANAGWKVLFG LLLKGLGAKDIPFANNFDGLATVYQNTPDFLAQPGDMVVFGSNYGA GYGHVAWVIEATLDYIIVYEQNWLGGGWTDGIEQPGWGWEKVTRR QHAYDFPMWFIRPNFKSETAPRSVQSPTQAPKKETAKPQPKAVELK IIKDVVKGYDLPKRGSNPKGIVIHNDAGSKGATAEAYRNGLVNAPLS RLEAGIAHSYVSGNTVWQALDESQVGWHTANQIGNKYYYGIEVCQS
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MGADNATFLKNEQATFQECARLLKKWGLPANRNTIRLHNEFTSTSC PHRSSVLHTGFDPVTRGLLPEDKRLQLKDYFIKQIRAYMDGKIPVAT VSNESSASSNTVKPVASAWKRNKYGTYYMEESARFTNGNQPITVRK VGPFLSCPVGYQFQPGGYCDYTEVMLQDGHVWVGYTWEGQRYYL PIRTWNGSAPPNQILGDLWGEIS (SEQ ID NO: 64)
S. aureus ΦΗ5 LysH5 Amidase e endopeptidase MQAKLTKKEFIEWLKTSEGKQYNADGWYGFQCFDYANAGWKALFG LLLKGVGAKDIPFANNFDGLATVYQNTPDFLAQPGDMWFGSNYGA GYGHVAWVIEATLDYIIVYEQNWLGGGWTDGVQQPGSGWEKVTRR QHAYDFPMWFIRPNFKSETAPRSVQSPTQASKKETAKPQPKAVELK IIKDVVKGYDLPKRGSNPNFIVIHNDAGSKGATAEAYRNGLVNAPLSR LEAGIAHSYVSGNTVWQALDESQVGWHTANQIGNKYGYGIEVCQS MGADNATFLKNEQATFQECARLLKKWGLPANRNTIRLHNEFTSTSC PHRSSVLHTGFDPVTRGLLPEDKRLQLKDYFIKQIRAYMDGKIPVAT VSNDSSASSNTVKPVASAWKRNKYGTYYMEESARFTNGNQPITVR KVGPFLSCPVGYQFQPGGYCDYTEVMLQDGHVWVGYTWEGQRYY LPIRTWNGSAPPNQILGDLWGEIS (SEQ ID NO: 65)
S. warned 0WMY LysWMY Amidase e endopeptidase MKTKAQAKSWINSKIGKGIDWDGMYGYQCMDEAVDYIHHVTDGKV TMWGNAIDAPKNNFQGLCTVYTNTPEFRPAYGDVIVWSYGTFATYG HIAIWNPDPYGDLQYITVLEQNWNGNGIYKTEFATIRTHDYTGVSHF
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IRPKFADEVKETAKTVNKLSVQKKIVTPKNSVERIKNYVKTSGYINGE HYELYNRGHKPKGVVIHNTAGTASATQEGQRLTNMTFQQLANGVA HVYIDKNTÍYETLPEDRIAWHVAQQYGNTEFYGIEVCGSRNTDKEQF LANEQVAFQEAARRLKSWGMRANRNTVRLHHTFSSTECPDMSMLL HTGYSMKNGKPTQDITNKCADYFMKQINAYIDGKQPTSTVVGSSSS NKLKAKNKDKSTGWNTNEYGTLWKKEHATFTCGVRQGIVTRTTGPF TSCPQAGVLYYGQSVNYDTVCKQDGYVWISWTTSDGYDVWMPIRT WDRSTDKVSEIWGTIS (SEQ ID NO: 66)
Streptococci (GBS) ΦΝΟΤΟ 11261 PlyGBS Muramidase e endopeptidase MATYQEYKSRSNGNAYDIDGSFGAQCWDGYADYCKYLGLPYANCT NTGYARDIWEQRHENGILNYFDEVEVMQAGDVAIFMWDGVTPYSH VAIFDSDAGGGYGWFLGQNQGGANGAYNIVKIPYSATYPTAFRPKV FKNAVTVTGNIGLNKGDYFIDVSAYQQADLTTTCQQAGTTKTIIKVSE SIAWLSDRHQQQANTSDPIGYYHFGRFGGDSALAQREADLFLSNLP SKKVSYLVIDYEDSASADKQANTNAVIAFMDKIASAGYKPIYYSYKPF TLNNIDYQKIIAKYPNSIWIAGYPDYEVRTEPLWEFFPSMDGVRWWQ FTSVGVAGGLDKNIVLLADDSSKMDIPKVDKPQELTFYQKLATNTKL DNSNVPYYEATLSTDYYVESKPNASSADKEFIKAGTRVRVYEKVNG WSRIΝ H PESAQWVEDSYLVNATDM (SEQ ID NO: 67)
C. perfringens Φ3626 Ply3626 Amidase N/A
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C. difficile ΦΟΟ27 lisina de CD2r Amidase N/A
E. faecaiis Φ1 PlyV12 Amidase N/A
A. naeslundii ΦΑν-1- lisina de Av-1 Amidase/muramidase putativa N/A
L. gasseri Φθ3Υ LysgaY Muramidase N/A
S. aureus ΦδΑ4 LysSA4 Amidase e endopeptidase N/A
S. haemolyticus ΦδΗ2 SH2 Amidase e endopeptidase N/A
B. thuringiensis 0BtCS33 PlyBt33 Amidase N/A
L monocytogenes ΦΡ40 PlyP40 Amidase N/A
L. monocytogenes 0FWLLm3 LysZ5 Amidase MVKYTVENKIIAGLPKGKLKGANFVIAHETANSKSTIDNEVSYMTRN WQNAFVTHFVGGGGRVVQVANVNYVSWGAGQYANSYSYAQVELC RTSNATTFKKDYEVYCQLLVDLAKKAGIPITLDSGSKTSDKGIKSHKW VADKLGGTTHQDPYAYLSSWGiSKAQFASDLAKVSGGGNTGTAPAK PSTPSTNLDKLGLVDYMNAKKMDSSYSNRAKLAKQYGIANYSGTAS QNTTLLSKIKGGAPKPSTPAPKPSTSTAKKIYFPPNKGNWSVYPTNK APVKANAIGAINPTKFGGLTYTIQKDRGNGVYEIQTDQFGRVQVYGA PSTGAVIKK (SEQ ID NO: 68)
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B. cereus ΦΒΡ813 LysBPS13 Amidase MAKREKYIFDVEAEVGKAAKSIKSLEAELSKLQKLN KEIDATGGDRTE KEMLATLKAAKEVNAEYQKMQRILKDLSKYSGKVSRKEFNDSKVINN AKTSVQGGKVTDSFGQMLKNMERQINSVNKQFDNHRKAMVDRGQ QYTPHLKTNRKDSQGNSNPSMMGRNKSTTQDMEKAVDKFLNGQN EATTGLNQALYQLKEISKLNRRSESLSRRASASGYMSFQQYSNFTG DRRTVQQTYGGLKTANRERVLELSGQATGISKELDRLNSKKGLTAR EGEERKKLMRQLEGIDAELTARKKLNSSLDETTSNMEKFNQSLVDA QVSVKPERGTMRGMMYERAPAiALAIGGAITATIGKLYSEGGNHSKA MRPDEMYVGQQTGAVGANWRPNRTATMRSGLGNHLGFTGQEMM EFQSNYLSANGYHGAEDMKAATTGQATFARATGLGSDEVKDFFNT AYRSGGIDGNQTKQFQNAFLGAMKQSGAVGREKDQLKALNGILSS MSQNRTVSNQDMMRTVGLQSAISSSGVASLQGTKGGALMEQLDN GIREGFNDPQMRVLFGQGTKYQGMGGRAALRKQMEKGISDPDNLN TUDASKASAGQDPAEQAEVLATLASKMGVNMSSDQARGUDLQPS GKLTKENIDKVMKEGLKEGSIESAKRDKAYSESKASIDNSSEAATAK QATELNDMGSKLRQANAALGGLPAPLYTAIAAWAFTAAVAGSALMF KGASWLKGGMASKYGGKGGKGGKGGGTGGGGGAGGAAATGAGA AAGAGGVGAAAAGEVGAGVAAGGAAAGAAAGGSKLAGVGKGFMK GAGKLMLPLGILMGASEIMQAPEEAKGSAIGSAVGGIGGGIAGGAAT GAIAGSFLGPIGTAVGGÍAGGIAGGFAGSSLGETÍGGWFDSGPKEDA SAADKAKADASAAALAAAAGTSGAVGSSALQSQMAQGITGAPNMS
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QVGSMASALGISSGAMASALGISSGQENQIQTMTDKENTNTKKANE AKKGDNLSYERENISMYERVLTRAEQILAQARAQNGIMGVGGGGTA GAGGGiNGFTGGGKLQFL.AAGQKVVSSSNLQQHDLGFTDQNL.TAED LDKWIDSKAPQGSMMRGMGATFLKAGQEYGLDPRYLIAHAAEESG WGTSKIARDKGNFFGIGAFDDSPYSSAYEFKDGTGSAAERGIMGGA KWISEKYYGKGNTTLDKMKAAGYATNASWAPNIASIMAGAPTGSGS GNVTATINVNVKGDEKVSDKLKNSSDMKKAGKDIGSLLGFYSREMTi A (SEQ ID NO: 69)
S. aureus ΦΘΗ15 LysGH15 Amidase e endopeptidase MAKTQAEINKRLDAYAKGTVDSPYRIKKATSYDPSFGVMEAGAIDAD GYYHAQCQDLITDYVLWLTDNKVRTWGNAKDQIKQSYGTGFKIHEN KPSTVPKKGWIAVFTSGSYQQWGHIGIVYDGGNTSTFTILEQNWNG YANKKPTKRVDNYYGLTHFIEIPVKAGTTVKKETAKKSASKTPAPKKK ATLKVSKNHÍNYTMDKRGKKPEGMVIHNDAGRSSGQQYENSLANA GYARYANGIAHYYGSEGYVWEAIDAKNQIAWHTGDGTGANSGNFR FAGIEVCQSMSASDAQFLKNEQAVFQFTAEKFKEWGLTPNRKTVRL HMEFVPTACPHRSMVLHTGFNPVTQGRPSQAIMNKLKDYFIKQIKNY MDKGTSSSTVVKDGKTSSASTPATRPVTGSWKKNQYGTWYKPENA TFVNGNQPIVTRIGSPFLNAPVGGNLPAGATÍVYDEVCÍQAGHIWIGY NAYNGDRVYCPVRTCQGVPPNHIPGVAWGVFK (SEQ ID NO: 70)
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S. aureus 0vS LauS- PLA88 HydHõ Endopeptidase e glicosidase N/A
E. faecaiis ΦΓ168/08 Lys168 Endopeptidase N/A
E. faecaiis ΦΓ170/08 Lys170 Amidase N/A
S. aureus ΦΡ-27/ΗΡ P-27/HP Não especificado N/A
C. perfríngens Φ8Μ101 Psm Muramidase N/A
C. sporogenes Φ8074-Β1 CS74L Amidase MKIGIDMGHTLSGADYGVVGLRPESVLTREVGTKVIYKLQKLGHVVV NCTVDKASSVSESLYTRYYRANQANVDLFISIHFNATPGGTGTEVYT YAGRQLGEATRIRQEFKSLGLRDRGTKDGSGLAVIRNTKAKAMLVE CCFCDNPNDMKLYNSESFSNAIVKGITGKLPNGESGNNNQGGNKVK AWIYNEGADRRGAEYLADYLNCPTISNSRTFDYSCVEHVYAVGGK KEQYTKYLKTLLSGANRYDTMQQILNFINGGK (SEQ ID NO: 71)
S. typhimuríum Φ3ΡΝ13 SPN1S Glicosidase MDINQFRRASGINEQLAARWFPHITTAMNEFGITKPDDQAMFIAQVG HESGGFTRLQENFNYSVNGLSGFIRAGRITPDQANALGRKTYEKSLP LERQRAIANLVYSKRMGNNGPGDGWNYRGRGLIQITGLNNYRDCG NGLKVDLVAQPELLAQDEYAARSAAWFFSSKGCMKYTGDLVRVTQI INGGQNGIDDRRTRYAAARKVLAL (SEQ ID NO: 72)
C. michiganensis Φ0ΜΡ1 CMP1 Peptidase N/A
C. michiganensis ΦΟΝ77 CN77 Peptidase MGYWGYPNGQIPNDKMALYRGCLLRADAAAQAYALQDAYTRATGK
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PLVILEGYRDLTRQKYLRNLYLSGRGNIAAVPGLSNHGWGLACDFAA PLNSSGSEEHRWMRQNAPLFGFDWARGKADNEPWHWEYGNVPV SRWASLDVTPIDRNDMADITEGQMQRIAVILLDTEIQTPLGPRLVKHA LGDALLLGQANANSIAEVPDKTWDVLVDHPLAKNEDGTPLKVRLGD VAKYEPLEHQNTRDAIAKLGTLQFTDKQLATIGAGVKPIDEASLVKKI VDGVRALFGRAAA (SEQ ID NO: 73)
A. baumannii ΦΑΒ2 LysAB2 Glicosidase MILTKDGFSIIRNELFGGKLDQTQVDAINFIVAKATESGLTYPEAAYLL ATIYHETGLPSGYRTMQPIKEAGSDSYLRSKKYYPYIGYGYVQLTWK ENYERIGKLIGVDLIKNPEKALEPLIAIQIAIKGMLNGWFTGVGFRRKR PVSKYN KQQYVAARN1INGKDKAELIAKYAIIFERALRSL (SEQ ID NO: 74)
B. cereus ΦΒ4 LysB4 Endopeptidase MAMALQTLIDKANRKLNVSGMRKDVADRTRAVITQMHAQGIYICVAQ GFRSFAEQNALYAQGRTKPGSIVTNARGGQSNHNYGVAVDLCLYT QDGSDVIWTVEGNFRKVIAAMKAQGFKWGGDWVSFKDYPHFELYD VVGGQKPPADNGGAVDNGGGSGSTGGSGGGSTGGGSTGGGYDS SWFTKETGTFVTNTSIKLRTAPFTSADVIATLPAGSPVNYNGFGIEYD GYVWIRQPRSNGYGYLATGESKGGKRQNYWGTFK (SEQ ID NO: 75)
P. aeruginosa ΦΚΜν KMV45 Não especificado N/A
C. tyrobutyricum Φ0ΤΡ1 Ctpll Giicosidase MKKIADISNLNGNVDVKLLFNLGYIGIIAKASEGGTFVDKYYKQNYTN
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TKAQGKITGAYHFANFSTIAKAQQEANFFLNCIAGTTPDFVVLDLEQQ CTGDITDACLAFLNIVAKKFKCVVYCNSSFIKEHLNSKICAYPLWIANY GVATPAFTLWTKYAMWQFTEKGQVSGISGYIDFSYITDEFIKYIKGED EVENLWYNDGADQRAAEYLADRLACPTINNARKFDYSNVKNVYAV GGNKEQYTSYLTTLIAGSTRYTTMQAVLDYIKNLK (SEQ ID NO: 76)
P. aeruginosa 0EL EL188 Transglicosilase N/A
P. aeruginosa ΦΚΖ KZ144 Transglicosilase N/A
S. aureus Ply187 Hidrolase da Parede Celular MALPKTGKPTAKQWDWAINLIGSGVDVDGYYGRQCWDLPNYIFNR YWNFKTPGNARDMAWYRYPEGFKVFRNTSDFVPKPGDIAVWTGG NYNWNTWGHTGIWGPSTKSYFYSVDQNWNNSNSYVGSPAAKIKH SYFGVTHFVRPAYKAEPKPTPPAQNNPAPKDPEPSKKPESNKPIYK WTKILFTTAHIEHVKANRFVHYITKSDNHNNKPNKMKNTNTALSTID VYRYRDELDKDEIPHFFVDRLNVWACRPIEDSINGYHDSVVLSITETR TALSDNFKMNEIECLSLAESILKANNKKMSASNIIVDNKAWRTFKLHT GKDSLKSSSFTSKDYQKAVNELIKLFNDKDKLLNNKPKDWERIRIRTI VKENTKFVPSELKPRNNIRDKQDSKIDRVINNYTLKQALNIQYKLNPK PQTSNGVSWYNASVNQIKSAMDTTKIFNN N VQVYQFLKLNQYQGIP VDKLNKLLVGKGTLANQGHAFADGCKKYNINEIYUAHRFLESANGTS FFASGKTGVYNYFGIGAFDNNPNNAMAFARSHGWTSPTKAIIGGAE FVGKGYFNVGQNTLYRMRWNPQKPGTHQYATDISWAKVQAQMISA
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MYKEIGLTGDYFIYDQYKK (SEQ ID NO: 77)
P. uorescens Φ0ΒΡ OBPgp279 Glicosidase N/A
L. monocytogenes ΦΡ35 PlyP35 Amidase MARKFTKAELVAKAEKKVGGLKPDVKKAVLSAVKEAYDRYGIGIIVS QGYRSIAEQNGLYAQGRTKPGNIVTNAKGGQSNHNFGVAVDFAIDLI DDGKIDSWQPSATIVNMMKRRGFKWGGDWKSFTDLPHFEACDWY RGERKYKVDTSEWKKKENINMKDVGYFQDKPQFLNSKSVRQWKH GTKVKLTKHNSHWYTGWKDGNKSVRGYIYHSMAKVTSKNSDGSV NATINAHAFCWDNKKLNGGDFINLKRGFKGITHPASDGFYPLYFASR KKTFYIPRYMFDIKK (SEQ ID NO: 78)
L fermentum ΦΡΥΒ5 Lyb5 Muramidase N/A
S. pneumoniae Φ0Ρ-7 Cpl-7 Muramidase MVKKNDLFVDVASHQGYDISGILEEAGTTNTIIKVSESTSYLNPCLSA QVSQSNPIGFYHFAWFGGNEEEAEAEARYFLDNVPTQVKYLVLDYE DHASASVQRNTTACLRFMQIIAEAGYTPIYYSYKPFTLDN VDYQQI LA QFPNSLWIAGYGLNDGTANFEYFPSMDGIRWWQYSSNPFDKNIVLL DDEKEDNINNENTLKSLTTVANEVIQGLWGNGQERYDSLANAGYDP QAVQDKVNEILNAREIADLTTVANEVIQGLWGNGQERYDSLANAGY DPQAVQDKVNEILNAREIADLTTVANEVIQGLWGNGQERYDSLANA GYDPQAVQDKVNELLS (SEQ ID NO: 79)
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P. chlororaphis201 Φ2-1 201ü2-1gp229 Glicosidase N/A
S. enterica 0PVP-SE1) PVP-SE1gp146 Glicosidase N/A
Corynebacterium ΦΒΡΚ20 BKF20 Amidase N/A
E. faecaíia ΦΕΡΑΡ-1 EFAL-1 Amidase MKLKGILLSVVTTFGLLFGATNVQAYEVNNEFNLQPWEGSQQLAYP NKIILHETANPRATGRNEATYMKNNWFNAHTTAIVGDGGIVYKVAPE GNVSWGAGNANPYAPVQIELQHTNDPELFKANYKAYVDYTRDMGK KFGIPMTLDQGGSLWEKGVVSHQWVTDFVWGDHTDPYGYLAKMGI SKAQLAHDLANGVSGNTATPTPKPDKPKPTQPSKPSNKKRFNYRVD GLEYVNGMWQIYNEHLGKIDFNWTENGIPVEVVDKVNPATGQPTKD QVLKVGDYFNFQENSTGWQEQTPYMGYTLSHVQLPNEFIWLFTDS KQALMYQ (SEQ ID NO: 80)
Lactobacilli iamdaSA2 LysA, LysA2, e Lysga Y Não especificado N/A
S. aureus SAL-1 Não especificado N/A
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138/321 [00192] Em alguns casos, a Usina é uma variante funcionalmente ativa das lisinas descritas aqui. Em alguns casos, a variante da Usina tem pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade, por exemplo, ao longo de uma região especificada ou ao longo de toda a sequência, com uma sequência de uma lisina descrita aqui ou uma lisina de ocorrência natural.
[00193] Em alguns casos, a lisina pode ser biomanipulada para modular a sua bioatividade, por exemplo, aumentar ou decrescer ou regular, ou para especificar um micro-organismo-alvo. Em alguns casos, a lisina é produzida pela maquinaria de tradução (por exemplo, um ribossomo, etc.) de uma célula microbiana. Em alguns casos, a lisina é sintetizada quimicamente. Em alguns casos, a lisina é derivada de um precursor polipeptídico. O precursor polipeptídico pode sofrer divagem (por exemplo, processamento por uma protease) para originar o polipeptídeo da própria lisina. Como tal, em alguns casos, a Usina é produzida a partir de um polipeptídeo precursor. Em alguns casos, a lisina inclui um polipeptídeo que sofreu modificações póstradução, por exemplo, divagem, ou a adição de um ou mais grupos funcionais.
[00194] As lisinas descritas aqui podem ser formuladas em uma composição para qualquer um dos usos descritos aqui. As composições reveladas aqui podem incluir qualquer número ou tipo (por exemplo, classes) de lisinas, como pelo menos cerca de qualquer um de 1 lisina, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, ou mais lisinas. Uma concentração adequada de cada lisina na composição depende de fatores como eficácia, estabilidade da lisina, número de lisinas distintas, a formulação, e métodos de aplicação da composição. Em alguns casos, cada lisina em uma composição líquida vai desde cerca de 0,1 ng/mL até cerca
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139/321 de 100 mg/mL Em alguns casos, cada Usina em uma composição sólida vai desde cerca de 0,1 ng/g até cerca de 100 mg/g. Em alguns casos, em que a composição inclui pelo menos dois tipos de lisinas, a concentração de cada tipo de lisina pode ser igual ou diferente.
[00195] Um agente modulador incluindo uma lisina como descrito aqui pode ser contatado com o hospedeiro-alvo em uma quantidade e durante um período de tempo suficiente para: (a) alcançar um nívelalvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de lisina no interior de um hospedeiro-alvo; (b) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de lisina no interior do intestino de um hospedeiro-alvo; (c) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de lisina no interior de um bacteriócito de um hospedeiro-alvo;
(d) modular o nível, ou uma atividade, de um ou mais microorganismos (por exemplo, endossimbionte) no hospedeiro-alvo; ou/e (e) modular a aptidão do hospedeiro-alvo.
(c) Peptídeos Antimicrobianos [00196] O agente modulador descrito aqui pode incluir um peptídeo antimicrobiano (AMP). Qualquer AMP adequado para inibir um microorganismo residente no hospedeiro pode ser usado. AMP são um grupo diversificado de moléculas, que são divididas em subgrupos com base na sua composição de aminoácidos e estrutura. O AMP pode ser derivado ou produzido a partir de qualquer organismo que produza naturalmente AMP, incluindo AMP derivados de plantas (por exemplo, copsina), insetos (por exemplo, drosocina, peptídeo de escorpião (por exemplo, Uy192, UyCT3, D3, D10, Uy17, Uy192), mastoparano, poneratoxina, cecropina, moricina, melitina), rãs (por exemplo, magainina, dermaseptina, aureína), e mamíferos (por exemplo, catelicidinas, defensinas e protegrinas). Por exemplo, o AMP pode ser um peptídeo de escorpião, como Uy192 (5'- FLSTIWNGIKGLL-3'; SEQ ID NO: 227),
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UyCT3 (5'- LSAIWSGIKSLF-3; SEQ ID NO: 228), D3 (5'LWGKLWEGVKSLI-3'; SEQ ID NO: 229), e D10 (5!- FPFLKLSLKIPKSAIKSAIKRL-3'; SEQ ID NO: 230), Uy17 (S’- ILSAIWSGIKGLL3'; SEQ ID NO: 231), ou uma combinação desses. Em alguns casos, ο peptídeo antimicrobiano pode ser um tendo pelo menos 90% de identidade de sequência (por exemplo, pelo menos 90%, 92%, 94%, 96%, 98% ou 100% de identidade de sequência) com uma ou mais das seguintes: cecropina (SEQ ID NO: 82), melitina, copsina, drosomicina (SEQ ID NO: 93), dermcidina (SEQ ID NO: 81), andropina (SEQ ID NO: 83), moricina (SEQ ID NO: 84), ceratotoxina (SEQ ID NO: 85), abaecina (SEQ ID NO: 86), apidaecina (SEQ ID NO: 87), profenina (SEQ ID NO: 88), indolicidina (SEQ ID NO: 89), protegrlna (SEQ ID NO: 90), taquiplesina (SEQ ID NO: 91), ou defensina (SEQ ID NO: 92) com um vetor de um patógeno de animais. Exemplos não limitadores de AMP são listados na Tabela 6.
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Tabela 6: Exemplos de Peptídeos Antimlcrobianos
Tipo Característica Exemplo de AMP Sequência
Peptídeos aniônicos ricos em ácido giutâmico e aspártico dermcidina SSLLEKGLDGAKKAVGGLGKLGKDAVEDLESVGKGAVHDVKDVLDSVL (SEQ ID NO: 81)
peptídeos a-helicoidais catiônicos lineares sem cisteína cecropina A KWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAWGQATQIAK (SEQ ID NO: 82)
andropina MKYFSVLWLTLiLAIVDQSDAFINLLDKVEDALHTGAQAGFKLIRPVERGATPKKS EKPEK (SEQ ID NO: 83)
moricina MNILKFFFVFIVAMSLVSCSTAAPAKIPIKAIKTVGKAVGKGLRAINIASTANDVFNF LKPKKRKH (SEQ ID NO: 84)
ceratotoxina MANLKAVFLICIVAFIALQCVVAEPAAEDSVWKRSIGSALKKALPVAKKIGKIAL.pl AKAALPVAAGLVG (SEQ ID NO: 85)
Peptídeo catíôníco enriquecido quanto a um aminoácido específico rico em proiina, arginina, fenilalanina, glicina, triptofano abaecina MKWIFIFALLATICAAFAYVPLPNVPQPGRRPFPTFPGQGPFNPKIKWPQGY (SEQ ID NO: 86)
apidaecinas KNFALAiLWTFWAVFGNTNLDPPTRPTRLRREAKPEAEPGNNRPVYIPQPRPP HPRLRREAEPEAEPGNNRPVYIPQPRPPHPRLRREAELEAEPGNNRPVYISQPR PPHPRLRREAEPEAEPGNNRPVYIPQPRPPHPRLRREAELEAEPGNNRPVYISQ PRPPHPRLRREAEPEAEPGNNRPVYIPQPRPPHPRLRREAEPEAEPGNNRPVYI PQPRPPHPRLRREAEPEAEPGNNRPVYIPQPRPPHPRLRREAKPEAKPGNNRP VYIPQPRPPHPRI (SEQ ID NO: 87)
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profenina METQRASLCLGRWSLWLLLLALWPSASAQALSYREAVLRAVDRLNEQSSEANL YRLLELDQPPKADEDPGTPKPVSFTVKETVCPRPTRRPPELCDFKENGRVKQCV GTVTLDQIKDPLDITCNEGVRRFPWVWVPFLRRPRLRRQAFPPPNVPGPRFPPP NVPGPRFPPPNFPGPRFPPPNFPGPRFPPPNFPGPPFPPPIFPGPWFPPPPPFR PPPFGPPRFPGRR (SEQ ID NO: 88)
indolicidina MQTQRASLSLGRWSLWLLLLGLVVPSASAQALSYREAVLRAVDQLNELSSEANL YRLLELDPPPKDNEDLGTRKPVSFTVKETVCPRTIQQPAEQCDFKEKGRVKQCV GTVTLDPSNDQFDLNCNELQSVILPWKWPWWPWRRG (SEQ ID NO: 89)
Peptídeos aniônicos e catlônlcos que contêm cisteína e formam liga- ções dissulfeto contêm ligações 1-3 dissulfeto protegrina METQRASLCLGRWSLWLLLLALWPSASAQALSYREAVLRAVDRLNEQSSEANL YRLLELDQPPKADEDPGTPKPVSFTVKETVCPRPTRQPPELCDFKENGRVKQCV GTVTLDQIKDPLDITCNEVQGVRGGRLCYCRRRFCVCVGRG (SEQ ID NO: 90)
taquiplesinas KWCFRVC YRGICYRRC R (SEQ ID NO: 91)
defensina MKCATIVCTIAVVLAATLLNGSVQAAPQEEAALSGGANLNTLLDELPEETHHAALE NYRAKRATCDLASGFGVGSSLCAAHCIARRYRGGYCNSKAVCVCRN (SEQ ID NO: 92)
drosomicina MMQIKYLFALFAVLMLWLGANEADADCLSGRYKGPCAVWDNETCRRVCKEEG RSSGHCSPSLKCWCEGC (SEQ ID NO: 93)
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143/321 [00197] Ο AMP pode ser ativo contra qualquer número de microorganismos-alvo. Em alguns casos, o AMP pode ter atividades antibacterianas e/ou antifúngicas. Em alguns casos, o AMP pode ter uma bioatividade de pequeno espectro ou uma bioatividade de largo espectro. Por exemplo, alguns AMP visam e matam apenas algumas espécies de bactérias ou fungos, ao passo que outros são ativos contra bactérias gram-negativas e gram-positivas bem como fungos.
[00198] Além disso, o AMP pode atuar através de alguns mecanismos de ação conhecidos. Por exemplo, a membrana citoplasmática é um alvo frequente de AMP, mas AMP também podem interferir na síntese de DNA e proteínas, dobramento de proteínas, e síntese de paredes celulares. Em alguns casos, AMP com carga líquida catiônica e natureza anfipática procedem à disrupção de membranas bacterianas, conduzindo a lise celular. Em alguns casos, AMP podem entrar em células e interagir com um alvo intracelular para interferir na síntese de DNA, RNA, proteínas, ou paredes celulares. Para além de matarem micro-organismos, AMP demonstraram possuir algumas funções imunomoduladoras que estão envolvidas na eliminação de uma infecção, incluindo a capacidade de alterar a expressão genética do hospedeiro, atuar como quimiocinas e/ou induzir produção de quimiocinas, inibir a produção de citocinas pró-inflamatórias induzidas por lipopolissacarídeos, promover a cura de feridas, e modular as respostas de células dendríticas e células da resposta imune adaptativa.
[00199] Em alguns casos, o AMP é uma variante funcionalmente ativa dos AMP descritos aqui. Em alguns casos, a variante do AMP tem pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%,
79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%,
91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade, por exemplo, ao longo de uma região especificada ou ao longo de toda a sequência, com uma sequência de um AMP descrito aqui ou um
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AMP derivado naturalmente.
[00200] Em alguns casos, o AMP pode ser biomanipulado para modular a sua bioatividade, por exemplo, aumentar ou decrescer ou regular, ou para especificar um micro-organismo-alvo. Em alguns casos, o AMP é produzido pela maquinaria de tradução (por exemplo, um ribossomo, etc.) de uma célula. Em alguns casos, o AMP é sintetizado quimicamente. Em alguns casos, o AMP é derivado de um precursor polipeptídico. O precursor polipeptídico pode sofrer divagem (por exemplo, processamento por uma protease) para originar o polipeptídeo do próprio AMP. Como tal, em alguns casos, o AMP é produzido a partir de um polipeptídeo precursor. Em alguns casos, o AMP inclui um polipeptídeo que sofreu modificações pós-tradução, por exemplo, divagem, ou a adição de um ou mais grupos funcionais.
[00201] Os AMP descritos aqui podem ser formulados em uma composição para qualquer um dos usos descritos aqui. As composições reveladas aqui podem incluir qualquer número ou tipo (por exemplo, classes) de AMP, como pelo menos cerca de qualquer um de 1 AMP, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, ou mais AMP. Por exemplo, as composições podem incluir um coquetel de AMP (por exemplo, um coquetel de peptídeos de escorpião, por exemplo, UyCT3, D3, D10 e Uy17). Uma concentração adequada de cada AMP na composição depende de fatores como eficácia, estabilidade do AMP, número de AMP distintos na composição, a formulação e métodos de aplicação da composição. Em alguns casos, cada AMP em uma composição líquida vai desde cerca de 0,1 ng/mL até cerca de 100 mg/mL (cerca de 0,1 ng/mL até cerca de 1 ng/mL, cerca de 1 ng/mL até cerca de 10 ng/mL, cerca de 10 ng/mL até cerca de 100 ng/mL, cerca de 100 ng/mL até cerca de 1000 ng/mL, cerca de 1 mg/mL até cerca de 10 mg/mL, cerca de 10 mg/mL até cerca de 100 mg/mL). Em alguns casos, cada AMP em uma composição sólida vai desde cerca de 0,1 ng/g até cerca de 100 mg/g
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145/321 (cerca de 0,1 ng/g até cerca de 1 ng/g, cerca de 1 ng/g até cerca de 10 ng/g, cerca de 10 ng/g até cerca de 100 ng/g, cerca de 100 ng/g até cerca de 1000 ng/g, cerca de 1 mg/g até cerca de 10 mg/g, cerca de 10 mg/g até cerca de 100 mg/g). Em alguns casos, em que a composição inclui pelo menos dois tipos de AMP, a concentração de cada tipo de AMP pode ser igual ou diferente.
[00202] Um agente modulador incluindo um AMP como descrito aqui pode ser contatado com o hospedeiro-alvo em uma quantidade e durante um período de tempo suficiente para: (a) alcançar um nívelalvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de AMP no interior de um hospedeiro-alvo; (b) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de AMP no interior do intestino de um hospedeiro-alvo; (c) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de AMP no interior de um bacteriócito de um hospedeiro-alvo;
(d) modular o nível, ou uma atividade, de um ou mais microorganismos (por exemplo, endossimbionte) no hospedeiro-alvo; ou/e (e) modular a aptidão do hospedeiro-alvo.
[00203] Como ilustrado pelos Exemplos 16 e 20-22, AMP, como peptídeos de escorpião, podem ser usados como agentes moduladores que visam uma bactéria endossimbiótica em um hospedeiro de inseto para decrescer a aptidão do hospedeiro (por exemplo, como delineado aqui).
(d) Peptídeos ricos em C Específicos para Nódulos [00204] O agente modulador descrito aqui pode incluir um peptídeo rico em C específico para nódulos (peptídeo NCR). Peptídeos NCR são produzidos em certas plantas leguminosas e desempenham um papel importante na simbiose mutualista, fixadora de nitrogênio das plantas com bactérias da família Rhizobiaceae (rizóbios), resultando na formação de nódulos radiculares onde células de plantas contêm
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146/321 milhares de endossimbiontes intracelulares. Peptídeos NCR possuem propriedades antlmicrobianas que dirigem um processo de diferenciação Irreversível, terminal de bactérias, por exemplo, para permeabilizar a membrana bacteriana, proceder à disrupçâo da divisão celular, ou inibir a síntese de proteínas. Por exemplo, em células de nódulos de Medicago truncatula infectadas com Sinorhizobium meliloti, centenas de peptídeos NCR sâo produzidos que dirigem a diferenciação irreversível das bactérias para grandes bacteroides fixadores de nitrogênio poliploides. Exemplos não limitadores de peptídeos NCR são listados na Tabela 7.
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Tabela 7: Exemplos de Peptídeos NCR
NOME Sequência peptídica Produtor
>gi|152218086|gb|ABS314 77,11 NCR 340 MTKIWFIYWILLLTIFHVSAKKKRYIECETHEDCSQVFMPPFVMRCVIHECKIFNGEHLRY (SEQ ID NO: 94) Medícago truncatula
>gi|152218084|gb|ABS314 76,11 NCR 339 MAKIMKFVYNMIPFLSIFIITLQVNVWCEIDADCPQICMPPYEVRCVNHRCGWVNTDDSLFLTQEFTRS KQYIIS (SEQ ID NO: 95) Medícago truncatula
>gi|152218082|gb|ABS314 75,11 NCR 338 MYKVVESIFIRYMHRKPNMTKFFKFVYTMFILISLFLVVTNANAHNCTDISDCSSNHCSYEGVSLCMNG QCICIYE (SEQ ID NO: 96) Medícago truncatula
>gi 11522180S0|gb|ABS314 74,11 NCR 337 MVETLRLFYIMILFVSLCLVWDGESKLEQTCSEDFECYIKNPHVPFGHLRCFEGFCQQLNGPA (SEQ ID NO: 97) Medícago truncatula
>gi|152218078|gb|ABS314 73,11 NCR 336 MAKIVNFVYSMIVFLFLFLVATKAARGYLCVTDSHCPPHMCPPGMEPRCVRRMCKCLPIGWRKYFVP (SEQ ID NO: 98) Medícago truncatula
>gi|152218076|gb|ABS314 72,11 NCR 335 MQIGKNMVETPKLDYVIIFFFLYFFFRQMIILRLNTTFRPLNFKMLRFWGQNRNIMKHRGQKVHFSLILSD CKTNKDCPKLRRANVRCRKSYCVPI (SEQ ID NO: 99) Medícago truncatula
>gi|152218074|gb|ABS314 71,11 NCR 334 MLRLYLVSYFLLKRTLLVSYFSYFSTYIIECKTDNDCPISQLKIYAWKCVKNGCHLFDVIPMMYE (SEQ ID NO: 100) Medícago truncatula
>gi|152218072|gb|ABS314 70,11 NCR 333 MAEILKFVYIVILFVSLLLIVVASERECVTDDDCEKLYPTNEYRMMCDSGYCMNLLNGKIIYLLCLKKKKFL IIISVLL (SEQ ID NO: 101) Medícago truncatula
>gi 1152218070|gb|ABS314 69,11 NCR 332 MAEIIKFVYIMILCVSLLLIEVAGEECVTDADCDKLYPDIRKPLMCSIGECYSLYKGKFSLSIISKTSFSLMV YNVVTLVICLRLAYISLLLKFL (SEQ ID NO: 102) Medícago truncatula
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>gi|152218068|gb|ABS314 68,11 NCR 331 MAEILKDFYAMNLFIFLIILPAKIRGETLSLTHPKCHHIMLPSLFITEVFQRVTDDGCPKPVNHLRWKCIE HICEYGYNYRPDFASQIPESTKMPRKRE (SEQ ID NO: 103) Medicago truncatula
>gi|152218066|gb|ABS314 67,11 NCR 330 MVEILKNFYAMNLFIFLIILAVKIRGAHFPCVTDDDCPKPVNKLRVIKCIDHICQYARNLPDFASEISESTK MPCKGE (SEQ ID NO: 104) Medicago truncatula
>gi|152218064|gb|ABS314 66,11 NCR 329 MFHAQAENMAKVSNFVCIMILFLALFFITMNDAARFECREDSHCVTRIKCVLPRKPECRNYACGCYDSN KYR (SEQ ID NO: 105) Medicago truncatula
>gi|152218062|gb|ABS314 65,11 NCR 328 MQMRQNMATILNFVFVIILFISLLLWTKGYREPFSSFTEGPTCKEDIDCPSISCVNPQVPKCIMFECHCK YIPTTLK (SEQ ID NO: 106) Medicago truncatula
>gi|152218060|gb|ABS314 64,11 NCR 327 MATILMYVYITILFISILTVLTEGLYEPLYNFRRDPDCRRNIDCPSYLCVAPKVPRCIMFECHCKDIPSDH (SEQ ID NO: 107) Medicago truncatula
>gi|152218058|gb|ABS314 63,11 NCR 326 MTTSLKFVYVAILFLSLLLVVMGGIRRFECRQDSDCPSYFCEKLTVPKCFWSKCYCK (SEQ ID NO: 108) Medicago truncatula
>gi|152218056|gb|ABS314 62,11 NCR 325 MTTSLKFVYVAILFLSLLLVVMGGIRKKECRQDSDCPSYFCEKLTIAKCIHSTCLCK (SEQ ID NO: 109) Medicago truncatula
>gi|152218054|gb|ABS314 61,11 NCR 324 MQIGKNMVETPKLVYFIILFLSIFLCITVSNSSFSQIFNSACKTDKDCPKFGRVNVRCRKGNCVPI (SEQ ID NO: 110) Medicago truncatula
>gi|152218046|gb|ABS314 57,11 NCR 320 MTAILKKFINAVFLFIVLFLATTNVEDFVGGSNDECVYPDVFQCINNICKCVSHHRT (SEQ ID NO: 111) Medicago truncatula
>gi|152218044|gb|ABS314 56,11 NCR 319 MQKRKNMAQIIFYVYALIILFSPFLAARLVFVNPEKPCVTDADCDRYRHESAIYSDMFCKDGYCFIDYHH DPYP (SEQ ID NO: 112) Medicago truncatula
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>gi|152218042|gb|ABS314 55,11 NCR 318 MQMRKNMAQILFYVYALLILFTPFLVARIMWNPNNPCVTDADCQRYRHKLATRMICNQGFCLMDFTH DPYAPSLP (SEQ ID NO: 113) Medicago truncatula
>gi|152218040|gb|ABS314 54,11 NCR 317 MNHISKFVYALIIFLSIYLWLDGLPISCKDHFECRRKINILRCIYRQEKPMCINSICTCVKLL (SEQ ID NO: 114) Medicago truncatula
>gi|152218038|gb|ABS314 53,11 NCR 316 MQREKNMAKIFEFVYAMIIFILLFLVEKNVVAYLKFECKTDDDCQKSLLKTYVWKCVKNECYFFAKK (SEQ ID NO: 115) Medicago truncatula
>gi|152218036|gb|ABS314 52,11 NCR 315 MAGIIKFVHVLIIFLSLFHVVKNDDGSFCFKDSDCPDEMCPSPLKEMCYFLQCKCGVDTIA (SEQ ID NO: 116) Medicago truncatula
>gi|152218034|gb|ABS314 51,1| NCR 314 MANTHKLVSMILFIFLFLASNNVEGYVNCETDADCPPSTRVKRFKCVKGECRWTRMSYA (SEQ ID NO: 117) Medicago truncatula
>gi|152218032|gb|ABS314 50,11 NCR 313 MQRRKKKAQVVMFVHDLIICIYLFIVITTRKTDIRCRFYYDCPRLEYHFCECIEDFCAYIRLN (SEQ ID NO: 118) Medicago truncatula
>gi|152218030|gb|ABS314 49,11 NCR 312 MAKVYMFVYALIIFVSPFLLATFRTRLPCEKDDDCPEAFLPPVMKCVNRFCQYEILE (SEQ ID NO: 119) Medicago truncatula
>gi 1152218028|gb|ABS314 48,11 NCR 310 MIKQFSVCYIQMRRNMTTILKFPYIMVICLLLLHVAAYEDFEKEIFDCKKDGDCDHMCVTPGIPKCTGYV CFCFENL (SEQ ID NO: 120) Medicago truncatula
>gi|152218026|gb|ABS314 47,11 NCR 309 MQRSRNMTTIFKFAYIMIICVFLLNIAAQEIENGIHPCKKNEDCNHMCVMPGLPWCHENNLCFCYENAY GNTR (SEQ ID NO: 121) Medicago truncatula
>gi|152218024|gb|ABS314 46,11 NCR 304 MTIIIKFVNVLIIFLSLFHVAKNDDNKLLLSFIEEGFLCFKDSDCPYNMCPSPLKEMCYFIKCVCGVYGPIR ERRLYQSHNPMIQ (SEQ ID NO: 122) Medicago truncatula
>gi 1152218022|gb|ABS314 MRKNMTKILMIGYALMIFIFLSIAVSITGNLARASRKKPVDVIPCIYDHDCPRKLYFLERCVGRVCKYL Medicago truncatula
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45,11 NCR 303 (SEQ ID NO: 123)
>gi|152218020|gb|ABS314 44,11 NCR 301 MAHKLVYAITLFIFLFLIANNIEDDIFCITDNDCPPNTLVQRYRCINGKCNLSFVSYG (SEQ ID NO: 124) Medicago truncatula
>gi|152218018|gb|ABS314 43,11 NCR 300 MDETLKFVYILILFVSLCLWADGVKNINRECTQTSDCYKKYPFIPWGKVRCVKGRCRLDM (SEQ ID NO: 125) Medicago truncatula
>gi|152218016|gb|ABS314 42,11 NCR 290 MAKIIKFVYVLAIFFSLFLVAKNVNGWTCVEDSDCPANICQPPMQRIVICFYGECACVRSKFCT (SEQ ID NO: 126) Medicago truncatula
>gi|152218014|gb|ABS314 41,11 NCR 289 MVKIIKFVYFMTLFLSMLLVTTKEDGSVECIANIDCPQIFMLPFVMRCINFRCQIVNSEDT (SEQ ID NO: 127) Medicago truncatula
>gi|152218012|gb|ABS314 40,11 NCR 286 MDEILKFVYTLIIFFSLFFAANNVDANIMNCQSTFDCPRDMCSHIRDVICIFKKCKCAGGRYMPQVP (SEQ ID NO: 128) Medicago truncatula
>gi|152218008|gb|ABS314 38,11 NCR 278 MQRRKNMANNHMLIYAMIICLFPYLWTFKTAITCDCNEDCLNFFTPLDNLKCIDNVCEVFM (SEQ ID NO: 129) Medicago truncatula
>gi|152218006|gb|ABS314 37,11 NCR 266 MVNILKFIYVIIFFILMFFVLIDVDGHVLVECIENRDCEKGMCKFPFIVRCLMDQCKCVRIHNLI (SEQ ID NO: 130) Medicago truncatula
>gi|152218004|gb|ABS314 36,11 NCR 265 MliQFSIYYMQRRKLNMVEiLKFSHALliFLFLSALVTNANIFFCSTDEDCTWNLCRQPWVQKCRLHMCS CEKN (SEQ ID NO: 131) Medicago truncatula
>gi|152218002|gb|ABS314 35,11 NCR 263 MDEVFKFVYVMIIFPFLILDVATNAEKIRRCFNDAHCPPDMCTLGVIPKCSRFTICIC (SEQ ID NO: 132) Medicago truncatula
>gi|152218000|gb|ABS314 34,11 NCR 244 MHRKPNMTKFFKFVYTMFILISLFLVVTNANANNCTDTSDCSSNHCSYEGVSLCMNGQCICIYE (SEQ ID NO: 133) Medicago truncatula
>gi 1152217998|gb|ABS314 33,11 NCR 239 MQMKKMATILKFVYLIILLIYPLLVVTEESHYMKFSICKDDTDCPTLFCVLPNVPKCIGSKCHCKLMVN (SEQ ID NO: 134) Medicago truncatula
>gi|152217996|gb|ABS314 MVETLRLFYIMILFVSLYLVWDGVSKLAQSCSEDFECYIKNPHAPFGQLRCFEGYCQRLDKPT Medicago truncatula
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32,11 NCR 237 (SEQ ID NO: 135)
>gi|152217994|gb|ABS314 31,11 NCR 228 MTTFLKVAYIMIICVFVLHLAAQVDSQKRLHGCKEDRDCDNSCSVHAVTKCIGNMCRCLANVK (SEQ ID NO: 136) Medicago truncatula
>gi|152217992|gb|ABS314 30,11 NCR 224 MRINRTPAIFKFVYTIIIYLFLLRWAKDLPFNICEKDEDCLEFCAHDKVAKCMLNICFCF (SEQ ID NO: 137) Medicago truncatula
>gi|152217990|gb|ABS314 29,11 NCR 221 MAEILKILYVFIIFLSLILAVISQHPFTPCETNADCKCRNHKRPDCLWHKCYCY (SEQ ID NO: 138) Medicago truncatula
>gi|152217988|gb|ABS314 28,11 NCR 217 MRKSMATILKFVYVIMLFIYSLFVIESFGHRFLIYNNCKNDTECPNDCGPHEQAKCILYACYCVE (SEQ ID NO: 139) Medicago truncatula
>gi|152217986|gb|ABS314 27,11 NCR 209 MNTILKFIFVVFLFLSIFLSAGNSKSYGPCTTLQDCETHNWFEVCSCIDFECKCWSLL (SEQ ID NO: 140) Medicago truncatula
>gi|152217984|gb|ABS314 26,11 NCR 206 MAEIIKFVYIMILCVSLLLIAEASGKECVTDADCENLYPGNKKPMFCNNTGYCMSLYKEPSRYM (SEQ ID NO: 141) Medicago truncatula
>gi|152217982|gb|ABS314 25,11 NCR 201 MAKIIKFVYIMILCVSLLLIVEAGGKECVTDVDCEKIYPGNKKPLICSTGYCYSLYEEPPRYHK (SEQ ID NO: 142) Medicago truncatula
>gi|152217980|gb|ABS314 24,11 NCR 200 MAKVTKFGYIIIHFLSLFFLAMNVAGGRECHANSHCVGKITCVLPQKPECWNYACVCYDSNKYR (SEQ ID NO: 143) Medicago truncatula
>gi|152217978|gb|ABS314 23,11 NCR 192 MAKIFNYVYALIMFLSLFLMGTSGMKNGCKHTGHCPRKMCGAKTTKCRNNKCQCV (SEQ ID NO: 144) Medicago truncatula
>gi|152217976|gb|ABS314 22,11 NCR 189 MTEILKFVCVMIIFISSFIVSKSLNGGGKDKCFRDSDCPKHMCPSSLVAKCINRLCRCRRPELQVQLNP (SEQ ID NO: 145) Medicago truncatula
>gi|152217974|gb|ABS314 21,1| NCR 187 MAHIIMFVYAUYALIIFSSL.FVRDGIPCLSDDECPEMSHYSFKCNNKICEYDLGEMSDDDYYLEMSRE (SEQ ID NO: 146) Medicago truncatula
>gi j 152217972|gb|ABS314 20,11 NCR 181 MYREKNMAKTLKFVYVIVLFLSLFLAAKNIDGRVSYNSFIALPVCQTAADCPEGTRGRTYKCINNKCRYP KLLKPIQ Medicago truncatula
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(SEQ ID NO: 147)
>gi|152217970|gb|ABS314 19,11 NCR 176 MAHIFNYVYALLVFLSLFLMVTNGIHIGCDKDRDCPKQMCHLNQTPKCLKNICKCV (SEQ ID NO: 148) Medicago truncatula
>gi|152217968|gb|ABS314 18,11 NCR 175 MAEILKCFYTMNLFIFLIILPAKIREHIQCVIDDDCPKSLNKLLIIKCINHVCQYVGNLPDFASQIPKSTKMPY KGE (SEQ ID NO: 149) Medicago truncatula
>gi 1152217966|gb|ABS314 17,11 NCR 173 MAYiSRIFYVLlIFLSLFFWINGVKSLLLIKVRSFÍPCQRSDDCPRNLCVDQlIPTCVWAKCKCKNYND (SEQ ID NO: 150) Medicago truncatula
>gi|152217964|gb|ABS314 16,11 NCR 172 MANVTKFVYIAIYFLSLFFIAKNDATATFCHDDSHCVTKIKCVLPRTPQCRNEACGCYHSNKFR (SEQ ID NO: 151) Medicago truncatula
>gi|152217962|gb|ABS314 15,1 í NCR 171 MGEIMKFVYVMIIYLFMFNVATGSEFIFTKKLTSCDSSKDCRSFLCYSPKFPVCKRGICECI (SEQ ID NO: 152) Medicago truncatula
>gi|152217960|gb|ABS314 14,11 NCR 169 MGEMFKFIYTFILFVHLFLWIFEDIGHIKYCGIVDDCYKSKKPLFKIWKCVENVCVLWYK (SEQ ID NO: 153) Medicago truncatula
>gi|152217958|gb|ABS314 13,11 NCR 165 MARTLKFVYSMILFLSLFLVANGLKIFCIDVADCPKDLYPLLYKCIYNKCIVFTRIPFPFDWI (SEQ ID NO: 154) Medicago truncatula
>gi|152217956|gb|ABS314 12,11 NCR 159 MANITKFVYIAILFLSLFFIGMNDAAILECREDSHCVTKIKCVLPRKPECRNNACTCYKGGFSFHH (SEQ ID NO: 155) Medicago truncatula
>gi|152217954|gb|ABS314 11,1 j NCR 147 MQRVKKMSETLKFVYVLILFISIFHVVIVCDSIYFPVSRPCITDKDCPNMKHYKAKCRKGFCISSRVR (SEQ ID NO: 156) Medicago truncatula
>gi|152217952|gb|ABS314 10,11 NCR 146 MQIRKIMSGVLKFVYAIILFLFLFLVAREVGGLETIECETDGDCPRSMIKMWNKNYRHKCIDGKCEWIKK LP (SEQ ID NO: 157) Medicago truncatula
>gi|152217950|gb|ABS314 09,11 NCR 145 MFVYDLILFISLILWTGINAEADTSCHSFDDCPWVAHHYRECIEGLCAYRILY (SEQ ID NO: 158) Medicago truncatula
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>gi|152217948|gb|ABS314 08,11 NCR 144 MQRRKKSMAKMLKFFFAIILLLSLFLVATEVGGAYIECEVDDDCPKPMKNSHPDTYYKCVKHRCQWAW K (SEQ ID NO: 159) Medicago truncatula
>gi|152217946|gb|ABS314 07,11 NCR 140 MFVYTLIIFLFPSHVITNKIAIYCVSDDDCLKTFTPLDLKCVDNVCEFNLRCKGKCGERDEKFVFLKALKK MDQKLVLEEQGNAREVKIPKKLLFDRIQVPTPATKDQVEEDDYDDDDEEEEEEEDDVDMWFHLPDVV CH (SEQ ID NO: 160) Medicago truncatula
>gi|152217944|gb|ABS314 06,11 NCR 138 MAKFSMFVYALINFLSLFLVETAITNIRCVSDDDCPKVIKPLVMKCIGNYCYFFMIYEGP (SEQ ID NO: 161) Medicago truncatula
>gi|152217942|gb|ABS314 05,11 NCR 136 MAHKFVYAIILFIFLFLVAKNVKGYVVCRTVDDCPPDTRDLRYRCLNGKCKSYRLSYG (SEQ ID NO: 162) Medicago truncatula
>gi|152217940|gb|ABS314 04,11 NCR 129 MQRKKNMGQiLIFVFALiNFLSPILVEMTTTTIPCTFIDDCPKMPLVVKCIDNFCNYFEiK (SEQ ID NO: 163) Medicago truncatula
>gi 1152217938|gb|ABS314 03,11 NCR 128 MAQTLMLVYALIIFTSLFLVVISRQTDIPCKSDDACPRVSSHHIECVKGFCTYWKLD (SEQ ID NO: 164) Medicago truncatula
>gi|152217936|gb|ABS314 02,11 NCR 127 MLRRKNTVQILMFVSALLIYIFLFLVITSSANIPCNSDSDCPWKIYYTYRCNDGFCVYKSIDPSTIPQYMTD LIFPR (SEQ ID NO: 165) Medicago truncatula
>gi|152217934|gb|ABS314 01,11 NCR 122 MAVILKFVYIMIIFLFLLYWNGTRCNRDEDCPFICTGPQIPKCVSHICFCLSSGKEAY (SEQ ID NO: 166) Medicago truncatula
>gi|152217932|gb|ABS314 00,11 NCR 121 MDAILKFIYAMFLFLFLFVTTRNVEALFECNRDFVCGNDDECVYPYAVQCIHRYCKCLKSRN (SEQ ID NO: 167) Medicago truncatula
>gi|152217930|gb|ABS313 99,1| NCR 119 MQIGRKKMGETPKLVYVIILFLSIFLCTNSSFSQMINFRGCKRDKDCPQFRGVNIRCRSGFCTPIDS (SEQ ID NO: 168) Medicago truncatula
>gi 1152217928|gb|ABS313 MQMRKNMAQILFYVYALLILFSPFLVARIMVVNPNNPCVTDADCQRYRHKLATRMVCNIGFCLMDFTH Medicago truncatula
153/321
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98,1| NCR 118 DPYAPSLP (SEQ ID NO: 169)
>gi|152217926|gb|ABS313 97,11 NCR 111 MYVYYIQMGKNMAQRFMFIYALIIFLSQFFVVINTSDIPNNSNRNSPKEDVFCNSNDDCPTILYYVSKCV YNFCEYW (SEQ ID NO: 170) Medicago truncatula
>gi 1152217924|gb|ABS313 96,11 NCR 103 MAKIVNFVYSMIIFVSLFLVATKGGSKPFLTRPYPCNTGSDCPQNMCPPGYKPGCEDGYCNHCYKRW (SEQ ID NO: 171) Medicago truncatula
>gi|152217922|gb|ABS313 95,11 NCR 101 MVRTLKFVYVIILILSLFLVAKGGGKKIYCENAASCPRLMYPLVYKCLDNKCVKFMMKSRFV (SEQ ID NO: 172) Medicago truncatula
>gi|152217920|gb|ABS313 94,11 NCR 96 MARTLKFVYAVILFLSLFLVAKGDDVKIKCWAANCPDLMYPLVYKCLNGICVQFTLTFPFV (SEQ ID NO: 173) Medicago truncatula
>gi|152217918|gb|ABS313 93,11 NCR 94 MSNTLMFVITFIVLVTLFLGPKNVYAFQPCVTTADCMKTLKTDENIWYECINDFCIPFPIPKGRK (SEQ ID NO: 174) Medicago truncatula
>gi|152217916|gb|ABS313 92,11 NCR 93 MKRWNMAKIVKYVYVIIIFLSLFLVATKIEGYYYKCFKDSDCVKLLCRIPLRPKCMYRHICKCKWLTQN NYVLT (SEQ ID NO: 175) Medicago truncatula
>gi|152217914|gb|ABS313 91,11 NCR 90 MKRGKNMSKILKFIYATLVLYLFLVVTKASDDECKIDGDCPISWQKFHTYKCINQKCKWVLRFHEY (SEQ ID NO: 176) Medicago truncatula
>gi|152217912|gb|ABS313 90,11 NCR 88 MAKTLNFMFALILFISLFLVSKNVAIDIFVCQTDADCPKSELSMYTWKCIDNECNLFKVMQQMV (SEQ ID NO: 177) Medicago truncatula
>gi|152217910|gb|ABS313 89,11 NCR 86 MANTHKLVSMILFIFLFLVANNVEGYVNCETDADCPPSTRVKRFKCVKGECRWTRMSYA (SEQ ID NO: 178) Medicago truncatula
>gi|152217908|gb|ABS313 88,11 NCR 77 MAHFLMFVYALITCLSLFLVEMGHLSIHCVSVDDCPKVEKPITMKCINNYCKYFVDHKL (SEQ ID NO: 179) Medicago truncatula
>gi|152217906|gb|ABS313 MNQIPMFGYTLIIFFSLFPVITNGDRIPCVTNGDCPVMRLPLYMRCITYSCELFFDGPNLCAVERI Medicago truncatula
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87,11 NCR 76 (SEQ ID NO: 180)
>gi|152217904|gb|ABS313 86,11 NCR 74 MRKDMARISLFVYALIIFFSLFFVLTNGELEIRCVSDADCPLFPLPLHNRCIDDVCHLFTS (SEQ ID NO: 181) Medicago truncatula
>gi|152217902|gb|ABS313 85,11 NCR 68 MAQILMFVYFLIIFLSLFLVESIKIFTEHRCRTDADCPARELPEYLKCQGGMCRLLIKKD (SEQ ID NO: 182) Medicago truncatula
>gi|152217900|gb|ABS313 84,11 NCR 65 MARVISLFYALIIFLFLFLVATNGDLSPCLRSGDCSKDECPSHLVPKCIGLTCYCI (SEQ ID NO: 183) Medicago truncatula
>gi|152217898|gb|ABS313 83,11 NCR 62 MQRRKNMAQILLFAWFIISISLFLWTNGVKIPCVKDTDCPTLPCPLYSKCVDGFCKMLSI (SEQ ID NO: 184) Medicago truncatula
>gi 1152217896|gb|ABS313 82,11 NCR 57 MNHISKFVYALIIFLSVYLVVLDGRPVSCKDHYDCRRKVKIVGCIFPQEKPMCINSMCTCIREIVP (SEQ ID NO: 185) Medicago truncatula
>gi|152217894|gb|ABS313 81,11 NCR 56 MKSQNHAKFISFYKNDLFKIFQNNDSHFKVFFALIIFLYTYLHVTNGVFVSCNSHIHCRVNNHKIGCNIPE QYLLCVNLFCLWLDY (SEQ ID NO: 186) Medicago truncatula
>gi|152217892|gb|ABS313 80,11 NCR 54 MTYISKVVYALIIFLSIYVGVNDCMLVTCEDHFDCRQNVQQVGCSFREIPQCINSICKCMKG (SEQ ID NO: 187) Medicago truncatula
>gi|152217890|gb|ABS313 79,11 NCR 53 MTHISKFVFALIIFLSIYVGVNDCKRIPCKDNNDCNNNWQLLACRFEREVPRCINSICKCMPM (SEQ ID NO: 188) Medicago truncatula
>gi|152217888|gb|ABS313 78,11 NCR 43 MVQTPKLVYVIVLLLSIFLGMTICNSSFSHFFEGACKSDKDCPKLHRSNVRCRKGQCVQI (SEQ ID NO: 189) Medicago truncatula
>gi|152217886|gb|ABS313 77,11 NCR 28 MTKILMLFYAMIVFHSIFLVASYTDECSTDADCEYILCLFPIIKRCIHNHCKCVPMGSIEPMSTIPNGVHKF HIINN (SEQ ID NO: 190) Medicago truncatula
>gi|152217884|gb|ABS313 76,11 NCR 26 MAKTLNFVCAMILFISLFLVSKNVALYIIECKTDADCPISKLNMYNWRCIKSSCHLYKVIQFMV (SEQ ID NO: 191) Medicago truncatula
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>gi|152217882|gb|ABS313 75,11 NCR 24 MQKEKNMAKTFEFVYAMIIFILLFLVENNFAAYIIECQTDDDCPKSQLEMFAWKCVKNGCHLFGMYEDD DDP (SEQ ID NO: 192) Medicago truncatula
>gi|152217880|gb|ABS313 74,11 NCR 21 MAATRKFIYVLSHFLFLFLVTKITDARVCKSDKDCKDIIIYRYILKCRNGECVKIKI (SEQ ID NO: 193) Medicago truncatula
>gi|152217878|gb|ABS313 73,11 NCR 20 MQRLDNMAKNVKFIYVIILLLFIFLVIIVCDSAFVPNSGPCTTDKDCKQVKGYIARCRKGYCMQSVKRTW SSYSR (SEQ ID NO: 194) Medicago truncatula
>gi|152217876|gb|ABS313 72,11 NCR 19 MKFIYIMILFLSLFLVQFLTCKGLTVPCENPTTCPEDFCTPPMITRCINFICLCDGPEYAEPEYDGPEPEY DHKGDFLSVKPKIINENMMMRERHMMKEIEV (SEQ ID NO: 195) Medicago truncatula
>gi|152217874|gb|ABS313 71,11 NCR 12 MAQFLMFIYVLIIFLYLFYVEAAMFELTKSTIRCVTDADCPNVVKPLKPKCVDGFCEYT (SEQ ID NO: 196) Medicago truncatula
>gi 1152217872|gb|ABS313 70,11 NCR 10 MKMRIHMAQIIMFFYALIIFLSPFLVDRRSFPSSFVSPKSYTSEIPCKATRDCPYELYYETKCVDSLCTY (SEQ ID NO: 197) Medicago truncatula
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157/321 [00205] Qualquer peptídeo NCR conhecido na técnica é adequado para uso nos métodos ou composições descritas aqui. Plantas produtoras de peptídeos NCR incluem mas não se limitam a Pisum sativum (ervilha), Astragalus sinicus (legumes IRLC), Phaseolus vulgaris (feijão), Vigna unguiculata (feijão-frade), Medlcago truncatula (luzernacortada), e Lotus japonicus. Por exemplo, mais de 600 peptídeos NCR potenciais são previstos a partir da sequência do genoma de M. truncatula e quase 150 peptídeos NCR diferentes foram detectados em células isoladas de nódulos radiculares por espectrometria de massa. [00206] Os peptídeos NCR descritos aqui podem ser peptídeos NCR maduros ou imaturos. Os peptídeos NCR imaturos têm um peptídeo sinal C-terminal que é requerido para translocação para o interior do retículo endoplasmático e clivado após a translocação. O terminal N de um peptídeo NCR inclui um peptídeo sinal, que pode ser clivável, para direcionamento para uma via secretora. Os peptídeos NCR são geralmente peptídeos pequenos com pontes dissulfeto que estabilizam a sua estrutura. Os peptídeos NCR maduros têm um comprimento situado no intervalo de cerca de 20 até cerca de 60 aminoácidos, cerca de 25 até cerca de 55 aminoácidos, cerca de 30 até cerca de 50 aminoácidos, cerca de 35 até cerca de 45 aminoácidos, ou qualquer intervalo entre esses. Os peptídeos NCR podem incluir uma sequência conservada de resíduos cisteína com o restante da sequência peptídica sendo altamente variável. Os peptídeos NCR têm geralmente cerca de quatro ou oito cisteínas.
[00207] Os peptídeos NCR podem ser aniônicos, neutros, ou catiônicos. Em alguns casos, peptídeos NCR catiônicos sintéticos tendo um pl maior do que cerca de oito possuem atividades antimicrobianas. Por exemplo, NCR247 (pl = 10,15) (RNGCIVDPRCPYQQCRRPLYCRRR; SEQ ID NO: 198) e NCR335 (pl = 11,22) (MAQFLLFVYSLIIFLSLFFGEAAFERTETRMLTIPCTSDDNCPKVISPCHTKCFDGFCGWYIEPetição 870190060758, de 28/06/2019, pág. 458/641
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GSYEGP: SEQ ID NO: 199) são ambos eficazes contra bactérias gram-negativas e gram-positivas bem como fungos. Em alguns casos, peptideos NCR neutros e/ou aniônicos, como NCR001, não possuem atividades antimicrobianas a um pl maior do que cerca de 8.
[00208] Em alguns casos, o peptídeo NCR é eficaz para matar bactérias. Em alguns casos, o peptídeo NCR é eficaz para matar S. me///of/, Xenorhabdus spp, Photorhabdus spp, Candidates spp, Buchnera spp, Blattabacterium spp, Baumanla spp, Wigglesworthia spp, Wolbachia spp, Rickettsia spp, Orientia spp, Sodaiis spp, Burkhoidería spp, Cupríavidus spp, Frankia spp, Snirhizobium spp, Streptococcus spp, Wollnella spp, Xylella spp, Erwinia spp, Agrobacterium spp, Baciilus spp, Paenibacilius spp, Streptomyces spp, Micrococcus spp, Corynebacterium spp, Acetobacter spp, Cyanobacteria spp, Salmonella spp, Rhodococcus spp, Pseudomonas spp, Lactobacillus spp, Enterococcus spp, Alcaligenes spp, Klebsiella spp, Paenibacilius spp, Arthrobacter spp, Corynebacterium spp, Brevibacterium spp, Thermus spp, Pseudomonas spp, Clostridium spp, ou Escherichia spp.
[00209] Em alguns casos, o peptídeo NCR é uma variante funcionalmente ativa de um peptídeo NCR descrito aqui. Em alguns casos, a variante do peptídeo NCR tem pelo menos 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade, por exemplo, ao longo de uma região especificada ou ao longo de toda a sequência, com uma sequência de um peptídeo NCR descrito aqui ou peptídeo NCR derivado naturalmente.
[00210] Em alguns casos, o peptídeo NCR pode ser biomanipulado para modular a sua bioatividade, por exemplo, aumentar ou decrescer ou regular, ou para especificar um micro-organismo-alvo. Em alguns casos, o peptídeo NCR é produzido pela maquinaria de tradução (por
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159/321 exemplo, um ribossomo, etc.) de uma célula. Em alguns casos, o peptídeo NCR é sintetizado quimicamente. Em alguns casos, o peptídeo NCR é derivado de um precursor polipeptídico. O precursor polipeptídico pode sofrer divagem (por exemplo, processamento por uma protease) para originar o próprio peptídeo NCR. Como tal, em alguns casos, o peptídeo NCR é produzido a partir de um polipeptídeo precursor. Em alguns casos, o peptídeo NCR inclui um polipeptídeo que sofreu modificações pós-tradução, por exemplo, divagem, ou a adição de um ou mais grupos funcionais.
[00211] O peptídeo NCR descrito aqui pode ser formulado em uma composição para qualquer um dos usos descritos aqui. As composições reveladas aqui podem incluir qualquer número ou tipo de peptídeos NCR, como pelo menos cerca de qualquer um de 1 peptídeo NCR, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100, ou mais peptídeos NCR. Uma concentração adequada de cada peptídeo NCR na composição depende de fatores como eficácia, estabilidade do peptídeo NCR, número de peptídeos NCR distintos, a formulação e métodos de aplicação da composição. Em alguns casos, cada peptídeo NCR em uma composição líquida vai desde cerca de 0,1 ng/mL até cerca de 100 mg/mL. Em alguns casos, cada peptídeo NCR em uma composição sólida vai desde cerca de 0,1 ng/g até cerca de 100 mg/g. Em alguns casos, em que a composição inclui pelo menos dois tipos de peptídeos NCR, a concentração de cada tipo de peptídeo NCR pode ser igual ou diferente.
[00212] Um agente modulador incluindo um peptídeo NCR como descrito aqui pode ser contatado com o hospedeiro-alvo em uma quantidade e durante um período de tempo suficiente para: (a) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de peptídeo NCR no interior de um hospedeiro-alvo: (b) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limi
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160/321 te) de concentração de peptídeo NCR no interior do intestino de um hospedeiro-alvo; (c) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de peptídeo NCR no interior de um bacteriócito de um hospedeiro-alvo; (d) modular o nível, ou uma atividade, de um ou mass micro-organismos (por exemplo, endossimbionte) no hospedeiro-alvo; ou/e (e) modular a aptidão do hospedeiro-alvo.
(e) Peptídeos Reguladores de Bacteriócitos [00213] O agente modulador descrito aqui pode incluir um peptídeo regulador de bacteriócitos (BRP). BRP são peptídeos expressos nos bacteriócitos de insetos. Estes genes são expressos primeiramente em um momento do desenvolvimento coincidente com a incorporação de simbiontes e a sua expressão específica em bacteriócitos é mantida ao longo da vida do inseto. Em alguns casos, o BRP tem um domínio do terminal amino hidrofóbico, que se prevê ser um peptídeo sinal. Adicionalmente, alguns BRP têm um domínio rico em cisteína. Em alguns casos, o peptídeo regulador de bacteriócitos é uma proteína rica em cisteína específica de bacteriócitos (BCR). Os peptídeos reguladores de bacteriócitos têm um comprimento situado entre cerca de 40 e 150 aminoácidos. Em alguns casos, o peptídeo regulador de bacteriócitos tem um comprimento situado no Intervalo de cerca de 45 até cerca de 145, cerca de 50 até cerca de 140, cerca de 55 até cerca de 135, cerca de 60 até cerca de 130, cerca de 65 até cerca de 125, cerca de 70 até cerca de 120, cerca de 75 até cerca de 115, cerca de 80 até cerca de 110, cerca de 85 até cerca de 105, ou qualquer intervalo entre esses. Exemplos não limitadores de BRP e suas atividades são listados na Tabela 8.
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Tabela 8: Exemplos de Peptídeos Reguladores de Bacteriócitos
Nome Sequência Peptídica
Família BCR de proteínas ricas em cisteína específicas de bacteriócitos, peptídeo BCR1 MKLLHGFLIIMLTMHLSIQYAYGGPFLTKYLCDRVCHKLCGDEFVCSCIQYKSLKGLWFP HCPTGKASVVLHNFLTSP (SEQ ID NO: 200)
Família BCR de proteínas ricas em cisteína específicas de bacteriócitos, peptídeo BCR2 MKLLYGFLIIMLTIHLSVQYFESPFETKYNCDTHCNKLCGKIDHCSCIQYHSMEGLWFPH CRTGSAAQMLHDFLSNP (SEQ ID NO: 201)
Família BCR de proteínas ricas em cisteína específicas de bacteriócitos, peptídeo BCR3 MSVRKNVLPTMFVVLLIMSPVTPTSVFISAVCYSGCGSLALVCFVSNGITNGLDYFKSSA PLSTSETSCGEAFDTCTDHCLANFKF (SEQ ID NO: 202)
Família BCR de proteínas ricas em cisteína específicas de bacteriócitos, peptídeo BCR4 MRLLYGFLIIMLTIYLSVQDFDPTEFKGPFPTIEICSKYCAVVCNYTSRPCYCVEAAKERD QWFPYCYD (SEQ ID NO: 203)
Família BCR de proteínas ricas em cisteína específicas de bacteriócitos, peptídeo BCR5 MRLLYGFLIIMLTIHLSVQDIDPNTLRGPYPTKEICSKYCEYNVVCGASLPCICVQDARQL DHWFACCYDGGPEMLM (SEQ ID NO: 204)
Família SP de proteínas secretadas, peptídeo SP1 MKLFWWLVAVGIMFVFASDTAAAPTDYEDTNDMISLSSLVGDNSPYVRVSSADSGGS SKTSSKNPILGLLKSVIKLLTKIFGTYSDAAPAMPPIPPALRKNRGMLA (SEQ ID NO: 205)
Família SP de proteínas secretadas, peptídeo SP2 MVACKVILAVAWFVAAVQGRPGGEPEWAAPIFAELKSVSDNITNLVGLDNAGEYATAA KNNLNAFAESLKTEAAVFSKSFEGKASASDVFKESTKNFQAWDTYIKNLPKDLTLKDFT EKSEQALKYMVEHGTEITKKAQGNTETEKEIKEFFKKQIENLIGQGKALQAKIAEAKKA (SEQ ID NO: 206)
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Família SP de proteínas secretadas, peptídeo SP3 MKTSSSKVFASCVAIVCLASVANALPVQKSVAATTENPIVEKHGCRAHKNLVRQNWDL KTYDSMLITNEWQKQSNEVQSSEQSNEGQNSEQSNEGQNSEQSNEVQSSEHSNEG QNSKQSNEGQNSEQSNEVQSSEHSNEGQNSEQSNEVQSSEHSNEGQNSKQSNEGQ NSKQSNEVQSSEHWNEGQNSKQSNEDQNSEQSNEGQNSKQSNEGQNSKQSNEDQN SEQSNEGQNSKQSNEVQSSEQSNEGQNSKQSNEGQSSEQSNEGQNSKQSNEVQSP EEHYDLPDPESSYESEETKGSHESGDDSEHR (SEQ ID NO: 207)
Família SP de proteínas secretadas, peptídeo SP4 MKTULGLCLFGALFWSTQSMPVGEVAPAVPAVPSEAVPQKQVEAKPETNAASPVSDAK PESDSKPVDAEVKPTVSEVKAESEQKPSGEPKPESDAKPWASESKPESDPKPAAWE SKPENDAVAPETNNDAKPENAAAPVSENKPATDAKAETELIAQAKPESKPASDLKAEPE AAKPNSEVPVALPLNPTETKATQQSVETNQVEQAAPAAAQADPAAAPAADPAPAPAAA PVAAEEAKLSESAPSTENKAAEEPSKPAEQQSAKPVEDAVPAASEISETKVSPAVPAVP EVPASPSAPAVADPVSAPEAEKNAEPAKAANSAEPAVQSEAKPAEDIQKSGAWSAEN PKPVEEQKPAEVAKPAEQSKSEAPAEAPKPTEQSAAEEPKKPESANDEKKEQHSVNKR DATKEKKPTDSIMKKQKQKKAN (SEQ ID NO: 208)
Família SP de proteínas secretadas, peptídeo SP5a MNGKIVLCFAVVFIGQAMSAATGTTPEVEDIKKVAEQMSQTFMSVANHLVGITPNSADA QKSIEKIRTIMNKGFTDMETEANKMKDIVRKNADPKLVEKYDELEKELKKHLSTAKDMFE DKWKPIGEKVELKKITENVIKTTKDMEATMNKAIDGFKKQ (SEQ ID NO: 209)
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Família SP de proteínas secretadas, peptídeo SP6 MHLFLALGLFIVCGMVDATFYNPRSQTFNQLMERRQRSIPIPYSYGYHYNPIEPSINVLD SLSEGLDSRINTFKPIYQNVKMSTQDVNSVPRTQYQPKNSLYDSEYISAKDIPSLFPEED SYDYKYLGSPLNKYLTRPSTQESGIAINLVAIKETSVFDYGFPTYKSPYSSDSVWNFGSKI PNTVFEDPQSVESDPNTFKVSSPTiKIVKLLPETPEQESilTTTKNYELNYKTTQETPTEAE LYPITSEEFQTEDEWHPMVPKENTTKDESSFITTEEPLTEDKSNSÍTIEKTQTEDESNSIE FNSIRTEEKSNSITTEENQKEDDESMSTTSQETTTAFNLNDTFDTNRYSSSHESLMLRiR ELMKNIADQQNKSQFRTVDNIPAKSQSNLSSDESTNQQFEPQLVNGADTYK (SEQ ID NO: 210)
Colepotericina A, peptídeo ColA MTRTMLFLACVAALYVCISATAGKPEEFAKLSDEAPSNDQAMYESIQRYRRFVDGNRYN GGQQQQQQPKQWEVRPDLSRDQRGNTKAQVEINKKGDNHDINAGWGKNINGPDSHK DTWHVGGSVRW (SEQ ID NO: 211)
RIpA tipo I MKETTWWAKLFLILIILAKPLGLKAVNECKRLGNNSCRSHGECCSGFCFIEPGWALGVC KRLGTPKKSDDSNNGKNIEKNNGVHERIDDVFERGVCSYYKGPSITANGDVFDENEMT AAHRTLPFNTMVKVEGMGTSWVKINDRKTAADGKVMLLSRAAAESLNIDENTGPVQC QLKFVLDGSGCTPDYGDTCVLHHECCSQNCFREMFSDKGFCLPK (SEQ ID NO: 212)
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164/321 [00214] Em alguns casos, o BRP altera o crescimento e/ou atividade de uma ou mais bactérias residentes no bacteriócito do hospedeiro. Em alguns casos, o BRP pode ser biomanipulado para modular a sua bioatividade (por exemplo, aumentar, decrescer, ou regular) ou para especificar um micro-organismo-alvo. Em alguns casos, o BRP é produzido pela maquinaria de tradução (por exemplo, um ribossomo, etc.) de uma célula. Em alguns casos, o BRP é sintetizado quimicamente. Em alguns casos, o BRP é derivado de um precursor polipeptídico. O precursor polipeptídico pode sofrer divagem (por exemplo, processamento por uma protease) para originar o polipeptídeo do próprio BRP. Como tal, em alguns casos, o BRP é produzido a partir de um polipeptídeo precursor. Em alguns casos, o BRP inclui um polipeptídeo que sofreu modificações pós-tradução, por exemplo, divagem, ou a adição de um ou mais grupos funcionais.
[00215] Variantes funcionalmente ativas dos BRP como descrito aqui também são úteis nas composições e métodos descritos aqui. Em alguns casos, a variante do BRP tem pelo menos 70%, 71%, 72%,
73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%,
85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%,
97%, 98% ou 99% de identidade, por exemplo, ao longo de uma região especificada ou ao longo de toda a sequência, com uma sequência de um BRP descrito aqui ou BRP derivado naturalmente.
[00216] O BRP descrito aqui pode ser formulado em uma composição para qualquer um dos usos descritos aqui. As composições reveladas aqui podem incluir qualquer número ou tipo (por exemplo, classes) de BRP, como pelo menos cerca de qualquer um de 1 BRP, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, ou mais BRP. Uma concentração adequada de cada BRP na composição depende de fatores como eficácia, estabilidade do BRP, número de BRP distintos, a formulação e métodos de aplicação da composição. Em alguns casos, cada BRP em uma composição
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165/321 líquida vai desde cerca de 0,1 ng/mL até cerca de 100 mg/mL. Em alguns casos, cada BRP em uma composição sólida vai desde cerca de 0,1 ng/g até cerca de 100 mg/g. Em alguns casos, em que a composição inclui pelo menos dois tipos de BRP, a concentração de cada tipo de BRP pode ser igual ou diferente.
[00217] Um agente modulador incluindo um BRP como descrito aqui pode ser contatado com o hospedeiro-alvo em uma quantidade e durante um período de tempo suficiente para: (a) alcançar um nívelalvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de BRP no interior de um hospedeiro-alvo; (b) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de BRP no interior do intestino de um hospedeiro-alvo; (c) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de BRP no interior de um bacteriócito de um hospedeiro-alvo;
(d) modular o nível, ou uma atividade, de um ou mais microorganismos (por exemplo, endossimbionte) no hospedeiro-alvo; ou/e (e) modular a aptidão do hospedeiro-alvo.
///. Moléculas Pequenas [00218] Numerosas moléculas pequenas (por exemplo, um antibiótico ou um metabólito) podem ser usadas nas composições e métodos descritos aqui. Em alguns casos, uma concentração eficaz de qualquer molécula pequena descrita aqui pode alterar o nível, atividade, ou metabolismo de um ou mais micro-organismos (como descrito aqui) residentes em um hospedeiro, a alteração resultando em um decréscimo na aptidão do hospedeiro.
[00219] Um agente modulador compreendendo uma molécula pequena como descrito aqui pode ser contatado com o hospedeiro-alvo em uma quantidade e durante um período de tempo suficiente para: (a) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) da concentração de uma molécula pequena no interior de um
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166/321 hospedeiro-alvo; (b) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) da concentração de uma molécula pequena no interior do intestino de um hospedeiro~alvo; (c) alcançar um nívelalvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) da concentração de uma molécula pequena no interior de um bacteriócito de um hospedeiro-alvo; (d) modular o nível, ou uma atividade, de um ou mais micro-organ ismos (por exemplo, endossimbionte) no hospedeiro-alvo; ou/e (e) modular a aptidão do hospedeiro-alvo.
[00220] As moléculas pequenas discutidas daqui em diante, nomeadamente antibióticos e metabólitos secundários, podem ser usadas para alterar o nível, atividade, ou metabolismo de micro-organismosalvo como indicado nas seções para decrescer a aptidão de um inseto hospedeiro (por exemplo, vetor de um patógeno de animais), como um mosquito, um ácaro, um piolho, ou um carrapato.
(a) Antibióticos [00221] O agente modulador descrito aqui pode incluir um antibiótico. Qualquer antibiótico conhecido na técnica pode ser usado. Antibióticos são usualmente classificados com base no seu mecanismo de ação, estrutura química, ou espectro de atividade.
[00222] O antibiótico descrito aqui pode visar qualquer função ou processos de crescimento bacterianos e pode ser bacteriostático (por exemplo, abranda ou previne o crescimento bacteriano) ou bactericida (por exemplo, mata bactérias). Em alguns casos, o antibiótico é um antibiótico bactericida. Em alguns casos, o antibiótico bactericida é um que visa a parede da célula bacteriana (por exemplo, penicilinas e cefalosporinas); um que visa a membrana celular (por exemplo, polimixinas); ou um que inibe enzimas bacterianas essenciais (por exemplo, rifamicinas, lipiarmicinas, quinolonas e sulfonamidas). Em alguns casos, o antibiótico bactericida é um aminoglicosídeo. Em alguns casos, o antibiótico é um antibiótico bacteriostático. Em alguns casos, o anti
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167/321 biótico bacteriostático visa a síntese de proteínas (por exemplo, macrólidos, lincosamidas e tetraciclinas). Classes adicionais de antibióticos que podem ser usados aqui incluem lipopeptídeos cíclicos (como daptomicina), glicilciclinas (como tigeciclina), oxazolidinonas (como linezolida), ou lipiarmicinas (como fidaxomicina). Exemplos de antibióticos incluem oxitetraciclina, doxiciclina, rifampicina, ciprofloxacina, ampicilina e polimixina B. Outros exemplos não limitadores de antibióticos se encontram na Tabela 9.
Tabela 9: Exemplos de Antibióticos
Antibióticos Ação
Penicilinas, cefalosporinas, vancomicina Síntese da parede celular
Polimixina, gramicidina Agente ativo em membranas, disrupção da membrana celular
Tetraciclinas, macrólidos, cloranfenicol, clindamicina, espectinomicina Inibem a síntese de proteínas
Sulfonamidas Inibem vias dependentes de folato
Ciprofloxacina Inibem DNA-girase
Isoniazida, rifampicina, pirazinamida, etambutol, (mambutol)l, estreptomicina Agentes antimicobacterianos
[00223] O antibiótico descrito aqui pode ter qualquer nível de especificidade para alvos (por exemplo, espectro pequeno ou largo). Em alguns casos, o antibiótico é um antibiótico de pequeno espectro, e assim visa tipos específicos de bactérias, como bactérias gramnegativas ou gram-positivas. Alternativamente, o antibiótico pode ser um antibiótico de largo espectro que visa uma gama ampla de bactérias.
[00224] Os antibióticos descritos aqui podem ser formulados em
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168/321 uma composição para qualquer um dos usos descritos aqui. As composições reveladas aqui podem incluir qualquer número ou tipo (por exemplo, classes) de antibióticos, como pelo menos cerca de qualquer um de 1 antibiótico, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, ou mais antibióticos (por exemplo, uma combinação de rifampicina e doxiciclina, ou uma combinação de ampicilina e rifampicina). Uma concentração adequada de cada antibiótico na composição depende de fatores como eficácia, estabilidade do antibiótico, número de antibióticos distintos, a formulação e métodos de aplicação da composição. Em alguns casos, em que a composição inclui pelo menos dois tipos de antibióticos, a concentração de cada tipo de antibiótico pode ser igual ou diferente.
[00225] Um agente modulador incluindo um antibiótico como descrito aqui pode ser contatado com o hospedeiro-alvo em uma quantidade e durante um período de tempo suficiente para: (a) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de antibiótico no interior de um hospedeiro-alvo; (b) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de antibiótico no interior do intestino de um hospedeiroalvo; (c) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de antibiótico no interior de um bacteriócito de um hospedeiro-alvo; (d) modular o nível, ou uma atividade, de um ou mais micro-organismos (por exemplo, endossimbionte) no hospedeiro-alvo; ou/e (e) modular a aptidão do hospedeiro-alvo.
[00226] Como ilustrado pelos Exemplos 1-4, 14, 26 e 27, antibióticos (por exemplo, doxiciclina, oxitetraciclina, azitromicina, ciprofloxacina, ou rifampicina) podem ser usados como agentes modeladores que visam uma bactéria endossimbiótica, como uma Wolbachía spp., em um hospedeiro de inseto (por exemplo, um vetor de inseto de um patógeno de animais), como um mosquito ou ácaro ou carrapato ou piolho mordedor, para decrescer a aptidão do hospedeiro (por exemplo,
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169/321 como delineado aqui). Como ilustrado pelo Exemplo 3, antibióticos como oxitetraciclina podem ser usados como agentes moduladores que visam uma bactéria endossimbiótica, como uma Rickettsia spp., em um hospedeiro de inseto, como carrapatos, para decrescer a aptidão do hospedeiro (por exemplo, como delineado aqui).
(b) Metabolites Secundários [00227] Em alguns casos, o agente modulador das composições e métodos descritos aqui inclui um metabolite secundário. Metabolites secundários são derivados de moléculas orgânicas produzidas por um organismo. Metabolites secundários podem atuar (i) como agentes competitivos usados contra bactérias, fungos, amibas, plantas, insetos e animais grandes; (ii) como agentes transportadores de metais; (iii) como agentes de simbiose entre micróbios e plantas, insetos e animais superiores; (iv) como hormônios sexuais; e (v) como efetores de diferenciação. Exemplos não limitadores de metabolites secundários se encontram na Tabela 10.
Tabela 10: Exemplos de Metabolites Secundários
Fenilpropanoides Alcalóides Terpenoides Quinonas Esteroides Poiicetídeos
Antocianinas Acridinas Carotenes Antroquinonas Cardíacos Eritromicina
Cumarinas Betalaínas Monoter- penos Benzoquinonas Glicosídeos Lovastatina e outras estatinas
Flavonoides Quinolozidinas Sesquiterpenos Naftoquinonas Pregnenolona Discoder-molida
Hidroxicinamoíla Furonoquinonas Diterpenos Derivados Aflatoxina B1
Derivados Harringtoni- nas Triterpenos Avermectinas
Isoflavonoides Isoquinoinas Ni statin a
Lignanos Indóis Rifamicina
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170/321
Fenilpropanoides Alcalóides Terpenoides Quinonas Esteroídes Policetídeos
Fenolenonas Purinas
Proantocianidinas Piridinas
Estilbenos Tropano
Taninos Alcalóides
[00228] O metabólito secundário usado aqui pode incluir um metabolite de qualquer grupo conhecido de metabolites secundários. Por exemplo, metabolites secundários podem ser classificados nos seguintes grupos: alcalóides, terpenoides, flavonoides, glicosídeos, fenóis naturais (por exemplo, ácido gossipol-acético), enais (por exemplo, trans-cinamaldeído), fenazinas, bifenóis e dibenzofuranos, policetídeos, peptídeos de ácido graxo sintase, peptídeos não ribossômicos, peptídeos ribossomicamente sintetizados e modificados de modo póstradução, polifenóis, polissacarídeos (por exemplo, quitosana), e biopolímeros. Para uma revisão profunda de metabolites secundários ver, por exemplo, Vining, Annu. Rev. MicrobioL 44:395-427, 1990.
[00229] Metabolites secundários úteis para composições e métodos descritos aqui incluem os que alteram uma função natural de um endosslmbionte (por exemplo, endosslmbionte primário ou secundário), bacteriócito, ou simbionte extracelular. Em alguns casos, um ou mais metabolites secundários descritos aqui são isolados de um rastreio de alto rendimento (HTS) quanto a compostos antimicrobianos. Por exemplo, um rastreio HTS identificou 49 extratos antibacterianos que têm especificidade contra bactérias gram-positivas e gram-negativas de mais de 39 000 extratos brutos de organismos crescendo em diversos ecossistemas de uma região específica. Em alguns casos, o metabolite secundário é transportado no interior de um bacteriócito.
[00230] Em alguns casos, a molécula pequena é um inibidor da síntese de vitaminas. Em alguns casos, o inibidor da síntese de vitaminas
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171/321 é um análogo de um precursor de vitamina. Em certos casos, o análogo de um precursor de vitamina é pantotenol.
[00231] Em alguns casos, a molécula pequena é um análogo de aminoácido. Em certos casos, o análogo de aminoácido é L-canvanina, D-arginina, D-valina, D-metionina, D-fenilalanina, D-histidina, Dtriptofano, D~treonina, D-leucina, L-NG-nitroarginina, ou uma combinação desses.
[00232] Em alguns casos, a molécula pequena é um composto antimicrobiano natural, como ácido propiônico, ácido levuiínico, transcinemaldeído, nisina, ou quitosana de baixo peso molecular. O metabolite secundário descrito aqui pode ser formulado em uma composição para quaiquer um dos usos descritos aqui. As composições reveladas aqui podem incluir qualquer número ou tipo (por exemplo, classes) de metabolites secundários, como pelo menos cerca de qualquer um de 1 metabolite secundário, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, ou mais metabolites secundários. Uma concentração adequada de cada metabolite secundário na composição depende de fatores como eficácia, estabilidade do metabolite secundário, número de metabolites secundários distintos, a formulação e métodos de aplicação da composição. Em alguns casos, em que a composição inclui pelo menos dois tipos de metabolites secundários, a concentração de cada tipo de metabolite secundário pode ser igual ou diferente.
[00233] Um agente modulador incluindo um metabolite secundário como descrito aqui pode ser contatado com o hospedeiro-alvo em uma quantidade e durante um período de tempo suficiente para: (a) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de metabolite secundário no interior de um hospedeiroalvo; (b) alcançar um nível-alvo (por exemplo, um nível predeterminado ou limite) de concentração de metabolite secundário no interior do intestino de um hospedeiro-alvo; (c) alcançar um nível-alvo (por exem
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172/321 pio, um nível predeterminado ou limite) de concentração de metabolite secundário no interior de um bacteriócito de um hospedeiro-alvo; (d) modular o nível, ou uma atividade, de um ou mais micro-organismos (por exemplo, endossimbionte) no hospedeiro-alvo; ou/e (e) modular a aptidão do hospedeiro-alvo.
[00234] Como ilustrado pelo Exemplo 15, metabolites secundários (por exemplo, gossipol) podem ser usados como agentes moduladores que visam uma bactéria endossimbiótica em um hospedeiro de inseto para decrescer a aptidão do hospedeiro (por exemplo, como delineado aqui). Como adicionalmente ilustrado pelos Exemplos 11-13, 15-19, 23 e 24, molécula pequenas, como trans-cinemaldeído, ácido levulínico, quitosana, análogos de vitaminas, ou inibidores do transporte de aminoácidos, podem ser usados como agentes moduladores que visam uma bactéria endossimbiótica em um hospedeiro de inseto para decrescer a aptidão do hospedeiro (por exemplo, como delineado aqui). iv. Bactérias como agentes moduladores [00235] Em alguns casos, o agente modulador descrito aqui inclui uma ou mais bactérias. Numerosas bactérias são úteis nas composições e métodos descritos aqui. Em alguns casos, o agente é uma espécie bacteriana endogenamente presente no hospedeiro. Em alguns casos, o agente modulador bacteriano é uma espécie bacteriana endossimbiótica. Exemplos não limitadores de bactérias que podem ser usadas como agentes moduladores incluem todas as espécies bacterianas descritas aqui na Seção II da descrição detalhada e aquelas listadas na Tabela 1. Por exemplo, o agente modulador pode ser uma espécie bacteriana de quaisquer filos bacterianos presentes nos intestinos de insetos, incluindo Gammaproteobacteria, Alphaproteobactera, Betaproteobacterla, Bacteroidetes, Firmicutes (por exemplo, Lactobacillus e Bacillus spp.), Clostridia, Actinomycetes, Spirochetes, Verrucomicrobia e Actinobacteria.
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173/321 [00236] Em alguns casos, o agente modulador é uma bactéria que procede à disrupção da diversidade microbíana ou altera de qualquer outro modo a microbiota do hospedeiro de um modo prejudicial para o hospedeiro. Em um caso, bactérias podem ser proporcionadas para proceder à disrupção da microbiota de mosquitos. Por exemplo, o agente modulador bacteriano pode competir com, deslocar e/ou reduzir uma população de bactérias simbióticas em um mosquito.
[00237] Em outro caso, bactérias podem ser proporcionadas para proceder à disrupção da microbiota de ácaros. Por exemplo, o agente modulador bacteriano pode competir com, deslocar e/ou reduzir uma população de bactérias simbióticas em um ácaro.
[00238] Em outro caso, bactérias podem ser proporcionadas para proceder à disrupção da microbiota de piolhos mordedores. Por exemplo, o agente modulador bacteriano pode competir com, deslocar e/ou reduzir uma população de bactérias simbióticas em um piolho mordedor.
[00239] Em outro caso, bactérias podem ser proporcionadas para proceder à disrupção da microbiota de carrapatos. Por exemplo, o agente modulador bacteriano pode competir com, deslocar e/ou reduzir uma população de bactérias simbióticas em um carrapato.
[00240] Os agentes moduladores bacterianos discutidos aqui podem ser usados para alterar o nível, atividade, ou metabolismo de micro-organismos-alvo como indicado nas seções para decrescer a aptidão de um inseto hospedeiro (por exemplo, um vetor de um patógeno de animais), como um mosquito, um ácaro, um piolho mordedor, ou um carrapato.
v. Modificações em agentes moduladores (a) Fusões [00241] Quaisquer dos agentes moduladores descritos aqui podem ser fundidos ou ligados a uma fração adicional. Em alguns casos, o
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174/321 agente modulador inclui uma fusão de uma ou mais frações adicionais (por exemplo, 1 fração adicional, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais frações adicionais). Em alguns casos, a fração adicional é qualquer um dos agentes moduladores descritos aqui (por exemplo, um peptídeo, polipeptídeo, molécula pequena, ou antibiótico). Alternativamente, a própria fração adicional pode não atuar como agente modulador mas, ao invés, pode ter uma função secundária. Por exemplo, a fração adicional pode ajudar o agente modulador a acessar, se ligar, ou ficar ativado em um sítio-alvo no hospedeiro (por exemplo, no intestino de um hospedeiro ou bacteriócito de um hospedeiro) ou em um microorganismo-alvo residente no hospedeiro (por exemplo, um vetor de um patógeno de animais, por exemplo, um mosquito, um ácaro, um piolho mordedor, ou um carrapato).
[00242] Em alguns casos, a fração adicional pode ajudar o agente modulador a penetrar em uma célula hospedeira-aivo ou microorganismo-alvo residente no hospedeiro. Por exemplo, a fração adicional pode incluir um peptídeo penetrador de células. Peptídeos penetradores em células (CPP) podem ser sequências naturais derivadas de proteínas; peptídeos quiméricos que são formados pela fusão de duas sequências naturais; ou CPP sintéticos, que são sequências sinteticamente planejadas com base em estudos de estrutura-atividade. Em alguns casos, CPP têm a capacidade de atravessar ubiquamente membranas celulares (por exemplo, membranas celulares procarióticas e eucarióticas) com toxicidade limitada. Além disso, CPP podem ter a capacidade para atravessar membranas celulares via mecanismos dependentes e/ou independentes da energia, sem a necessidade de um reconhecimento quiral por receptores específicos. CPP podem ser ligados a quaisquer dos agentes moduladores descritos aqui. Por exemplo, um CPP pode ser ligado a um peptídeo antimicrobiano (AMP), por exemplo, um peptídeo de escorpião, por exemplo, UY192
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175/321 fundido a um peptídeo penetrador de células (por exemplo, YGRKKRRQRRRFLSTIWNGIKGLLFAM; SEQ ID NO: 232). Exemplos não limitadores de CPP são iistados na Tabela 11.
Tabela 11: Exemplos de Peptídeos Penetradores em Células (CPP)
Peptídeo Origem Sequência
Derivado de proteína
Penetratina Antennapedia RQlKiWFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 213)
Peptídeo Tat Tat GRKKRRQRRRPPQ (SEQ ID NO: 214)
pVEC Caderina LLIILRRRIRKQAHAHSK (SEQ ID NO: 215)
Quimérico
Transportano Galanina/Mastoparano GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL (SEQ ID NO: 216)
MPG gp41 do HlV/antígeno T do SV40 GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV (SEQ ID NO: 217)
Pep-1 transcriptase reversa do HlV/antígeno T do SV40 KETWWETWWTEWSQPKKKR KV (SEQ ID NO: 218)
Sintético
Poliargininas Baseado no peptídeo Tat (R)„:6<n< 12
MAP de novo KLALKLALKALKAALKLA (SEQ ID NO: 219)
r6w3 Baseado em penetratina RRWWRRWRR (SEQ ID NO: 220)
[00243] Em outros casos, a fração adicional ajuda o agente modulador a se ligar a um micro-organismo-alvo (por exemplo, um fungo ou bactéria) residente no hospedeiro. A fração adicional pode incluir um
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176/321 ou mais domínios de direcionamento. Em alguns casos, o domínio de direcionamento pode dirigir o agente modulador para um ou mais micro-organ ismos (por exemplo, bactéria ou fungo) residentes no intestino do hospedeiro. Em alguns casos, o domínio de direcionamento pode dirigir o agente modulador para uma região específica do hospedeiro (por exemplo, intestino ou bacteriócito do hospedeiro) para acessar micro-organismos que estão geralmente presentes na referida região do hospedeiro. Por exemplo, o domínio de direcionamento pode dirigir o agente modulador para o intestino anterior, intestino médio, ou intestino posterior do hospedeiro. Em outros casos, o domínio de direcionamento pode dirigir o agente modulador para um bacteriócito no hospedeiro e/ou uma ou mais bactérias específicas residentes em um bacteriócito do hospedeiro. Por exemplo, o domínio de direcionamento pode ser leotina ou aglutinina de Galanthus nivalis (GNA) ligada a um agente modulador descrito aqui, por exemplo, um AMP, por exemplo, um peptídeo de escorpião, por exemplo, Uy192.
(b) Pré- ou Pró-domínios [00244] Em alguns casos, o agente modulador pode incluir uma pré- ou pró-sequência de aminoácido. Por exemplo, o agente modulador pode ser uma proteína ou peptídeo inativo que pode ser ativado por divagem ou modificação pós-tradução de uma pré- ou prósequência. Em alguns casos, o agente modulador é manipulado com uma pré- ou pró-sequência inativadora. Por exemplo, a pré- ou prósequência pode obscurecer um sítio de ativação no agente modulador, por exemplo, um sítio de ligação a receptores, ou pode induzir uma alteração conformacional no agente modulador. Assim, por divagem da pré- ou pró-sequência, o agente modulador é ativado.
[00245] Alternativamente, o agente modulador pode incluir uma préou pró-molécula pequena, por exemplo, um antibiótico. O agente modulador pode ser uma molécula pequena inativa descrita aqui que po
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177/321 de ser ativada em um ambiente-alvo no interior do hospedeiro. Por exemplo, a molécula pequena pode ser ativada ao ser alcançado um certo pH no intestino do hospedeiro.
(c) Ligadores [00246] Em casos em que o agente modulador é conectado a uma fração adicional, o agente modulador pode adicionalmente incluir um ligador. Por exemplo, o ligador pode ser uma ligação química, por exemplo, uma ou mais ligações covalentes ou ligações não covalentes. Em alguns casos, o ligador pode ser um ligador peptídico (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 25, 30, 35, 40, ou mais aminoácidos de comprimento). O ligador pode incluir quaisquer ligadores flexíveis, rígidos, ou cliváveis descritos aqui.
[00247] Um ligador peptídico flexível pode incluir quaisquer dos habitualmente usados na técnica, incluindo ligadores tendo sequências que têm maioritarlamente resíduos Gly e Ser (ligador GS). Llgadores flexíveis podem ser úteis para unir domínios que requerem um certo grau de movimento ou interação e podem incluir aminoácidos pequenos, não polares (por exemplo, Gly) ou polares (por exemplo, Ser ou Thr).
[00248] Alternativamente, um ligador peptídico pode ser um ligador rígido. Llgadores rígidos são úteis para manter uma distância fixa entre frações e para manter suas funções independentes. Ligadores rígidos também podem ser úteis quando uma separação espacial dos domínios é crítica para conservar a estabilidade ou bioatividade de um ou mais componentes da fusão. Ligadores rígidos podem, por exemplo, ter uma estrutura em hélice alfa ou sequência rica em Pro, (XP)n, com X designando qualquer aminoácido, preferencialmente Ala, Lys ou Glu. [00249] Ainda em outros casos, um ligador peptídico pode ser um ligador clivável. Em alguns casos, ligadores podem ser clivados sob condições específicas, como a presença de reagentes redutores ou
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178/321 proteases. Ligadores cliváveis in vivo podem utilizar a natureza reversível de uma ligação dissuifeto. Um exemplo inclui uma sequência sensível a trombina (por exemplo, PRS) entre dois resíduos Cys. O tratamento com trombina in vitro de CPRSC resulta na divagem da sequência sensível a trombina, enquanto a ligação dissuifeto reversível permanece intata. Tais ligadores são conhecidos e descritos, por exemplo, em Chen et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 65(10):1357-1369, 2013. A divagem de ligadores em fusões também pode ser efetuada por proteases que são expressas in vivo sob condições em células ou tecidos específicos do hospedeiro ou micro-organismos residentes no hospedeiro. Em alguns casos, a divagem do ligador pode liberar um agente modulador livre funcional ao alcançar um sítio ou célula-alvo.
[00250] Fusões descritas aqui podem alternativamente ser ligadas por uma molécula ligadora, incluindo um ligador hidrofóbico, como um grupo sulfonato de carga negativa; lipídeos, como cadeias poli(--CH2-)hidrocarbonadas, como o grupo polietilenoglicol (PEG), suas variantes insaturadas, suas variantes hidroxiladas, suas variantes amidadas ou de outro modo contendo N, ligadores não carbonados; ligadores de carboidratos; ligadores fosfodiéster, ou outra molécula capaz de ligar covalentemente duas ou mais moléculas, por exemplo, dois agentes moduladores. Ligadores não covalentes podem ser usados, como glóbulos lipídicos hidrofóbicos aos quais o agente modulador é ligado, por exemplo, através de uma região hidrofóbica do agente modulador ou uma extensão hidrofóbica do agente modulador, como uma série de resíduos ricos em leucina, isoleucina, valina, ou talvez também alanina, fenilalanina, ou mesmo tirosina, metionina, glicina, ou outro resíduo hidrofóbico. O agente modulador pode ser ligado usando química à base da carga, de modo que uma fração com carga positiva do agente modulador é ligada a uma carga negativa de outro agente modulador ou uma fração adicional.
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IV. Formulações e Composições [00251] As composições descritas aqui podem ser formuladas em forma pura (por exemplo, a composição contém apenas o agente modulador) ou juntamente com um ou mais agentes adicionais (como excipiente, veículo de administração, transportador, diluente, estabilizador, etc.) para facilitar a aplicação ou administração das composições. Exemplos de excipientes e diluentes adequados incluem, mas não se limitam a, lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, amidos, goma acácia, fosfato de cálcio, alginatos, tragacanto, gelatina, silicato de cálcio, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, celulose, água, solução salina, xarope, metilcelulose, hidroxibenzoatos de metila e propiIa, talco, estearato de magnésio e óleo mineral.
[00252] Em alguns casos, a composição inclui um veículo de administração ou transportador. Em alguns casos, o veículo de administração inclui um excipiente. Excipientes exemplificativos incluem, mas não se limitam a, materiais transportadores sólidos ou líquidos, solventes, estabilizadores, excipientes de liberação lenta, corantes e substâncias com atividade de superfície (surfactantes). Em alguns casos, o veículo de administração é um veículo estabilizador. Em alguns casos, o veículo estabilizador inclui um excipiente estabilizador. Excipientes estabilizadores exemplificativos incluem, mas não se limitam a, óleos vegetais epoxidados, agentes antiespumantes, por exemplo, óleo de silicone, conservantes, reguladores da viscosidade, agentes de ligação e taquificantes. Em alguns casos, o veículo estabilizador é um tampão adequado para o agente modulador. Em alguns casos, a composição é microencapsulada em um veículo de administração de esférulas poliméricas. Em alguns casos, o veículo estabilizador protege o agente modulador contra UV e/ou condições acídicas. Em alguns casos, o veículo de administração contém um tampão do pH. Em alguns casos, a composição é formulada de modo a ter um pH situado no intervalo de
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180/321 cerca de 4,5 até cerca de 9,0, incluindo, por exemplo, intervalos de pH de cerca de qualquer um de 5,0 até cerca de 8,0, cerca de 6,5 até cerca de 7,5, ou cerca de 6,5 até cerca de 7,0.
[00253] Dependendo dos objetivos pretendidos e circunstâncias prevalecentes, a composição pode ser formulada em concentrados emulsificáveis, concentrados em suspensão, soluções diretamente pulverizáveis ou diluíveis, pastas revestíveis, emulsões diluídas, pós para pulverização, pós solúveis, pós dispersíveis, pós molháveis, poeiras, grânulos, encapsulações em substâncias poliméricas, microcápsulas, espumas, aerossóis, preparações com dióxido de carbono gasoso, comprimidos, preparações de resina, preparações de papel, preparações de artigos não tecidos, ou preparações de artigos tricotados ou tecidos. Em alguns casos, a composição é um líquido. Em alguns casos, a composição é um sólido. Em alguns casos, a composição é um aerossol, como em uma lata de aerossol pressurizado. Em alguns casos, a composição está presente nos resíduos (como fezes) da praga. Em alguns casos, a composição está presente em ou sobre uma praga viva.
[00254] Em alguns casos, o veículo de administração é o alimento ou água do hospedeiro. Em outros casos, o veículo de administração é uma fonte de alimento para o hospedeiro. Em alguns casos, o veículo de administração é uma isca alimentar para o hospedeiro. Em alguns casos, a composição é um agente comestível consumido pelo hospedeiro. Em alguns casos, a composição é administrada pelo hospedeiro a um segundo hospedeiro e é consumida pelo segundo hospedeiro. Em alguns casos, a composição é consumida pelo hospedeiro ou um segundo hospedeiro e a composição é liberada nas redondezas do hospedeiro ou do segundo hospedeiro via os resíduos (como fezes) do hospedeiro ou do segundo hospedeiro. Em alguns casos, o agente modulador é incluído em uma isca alimentar destinada a ser consumiPetição 870190060758, de 28/06/2019, pág. 481/641
181/321 da por um hospedeiro ou transportada de novo para a sua colônia.
[00255] Em alguns casos, o veículo de administração é um vetor bacteriano. O agente modulador pode ser incorporado em um vetor bacteriano usando quaisquer métodos de clonagem adequados e reagentes conhecidos na técnica, como descrito em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989. Vetor bacteriano, como usado aqui, se refere a qualquer elemento genético, como plasmídeos, vetores bacteriofágicos, transposons, cosmídeos e cromossomos, que é capaz de replicação no interior de células bacterianas e que é capaz de transferir genes entre células. Vetores bacterianos exemplificativos incluem, mas não se limitam a, sistema vetorial lambda gtl 1, gt WES.tB, Charon 4 e vetores plasmídicos como pBR322, pBR325, pACYC177, pACYC184, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pLG339, pR290, pKC37, pKCIOI, SV 40, pBluescript II SK +/- ou KS +/(ver Catálogo Stratagene Cloning Systems, Stratagene, La Jolla, Califórnia, 1993), pQE, plH821, pGEX, série pET (ver Studier et al., Use of T7 RNA Polymerase to Direct Expression of Cloned Genes, Gene Expression Technology Vol. 185, 1990), e quaisquer seus derivados.
[00256] Cada vetor bacteriano pode codificar um ou mais agentes moduladores. Em alguns casos, o vetor bacteriano inclui um genoma de fago a ser expresso e empacotado na bactéria simbiótica-alvo. Em alguns casos, o vetor bacteriano inclui uma molécula de ácido nucleico codificando uma lisina a ser expressa na bactéria simbiótica-alvo ou uma bactéria hospedeira. Em alguns casos, a lisina é coexpressa com uma holina, ou a lisina é manipulada para se obter um peptídeo sinal para secreção a partir da bactéria hospedeira. Em alguns casos, o vetor bacteriano inclui uma molécula de ácido nucleico codificando uma bacteriocina a ser expressa na bactéria simbiótica-alvo. Em alguns casos, o vetor bacteriano inclui adicionalmente um ou mais elementos
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182/321 reguladores, como promotores, sinais de terminação e elementos de transcrição e tradução. Em alguns casos, a sequência reguladora é operavelmente ligada a um ácido nucleico codificando um gene (como uma bacteriocina, lisina, ou outros polipeptídeos) a ser expresso na bactéria simbiótica-alvo.
[00257] Em alguns casos, o vetor bacteriano é introduzido em uma bactéria a ser consumida pelo hospedeiro ou um membro da colônia do hospedeiro. Em alguns casos, a bactéria é a bactéria simbióticaalvo. Em alguns casos, a bactéria é uma bactéria de ocorrência natural do intestino do hospedeiro, ou um seu derivado geneticamente modificado, que pode ser facilmente introduzida no hospedeiro através de ingestão. Bactérias exemplificativas para uso no transporte do vetor bacteriano incluem, mas não se limitam a, Proteobacter, incluindo o gênero Pseudomonas; Actinobacter, incluindo Priopionibactehum e Corynebacterium; Firmicutes, incluindo qualquer espécie dos gêneros Mycoplasma, Bacillus, Streptococcus, Staphylococcus; Fibrobacteres; Spirochaetes, incluindo Treponema e Borrelia; Bacteroides, incluindo os gêneros Bacteroides e Flavobacterium. Também são adequadas qualquer bactérias de Enterobacteriaceae, incluindo o gênero Serratia, incluindo, mas não se limitando a, S. marcescens, S. entomophila, S. proteamaculans, S. marcensces' qualquer espécie de Enterobacter, incluindo, mas não se limitando a, E. cloacae, E. amnigenus, E. aerogenes, E. dissolvens, E. agglomerans, E. hafiiiae', e qualquer espécie pertencente aos seguintes gêneros: Citrobacter, Escherichia, Klebsiella, Kiuyvera, Panotea, Proteus, Salmonella, Xenorhabdus e Yokenella.
[00258] Em alguns casos, o agente modulador pode perfazer cerca de 0,1% até cerca de 100% da composição, como qualquer um de cerca de 0,01% até cerca de 100%, cerca de 1% até cerca de 99,9%, cerca de 0,1% até cerca de 10%, cerca de 1% até cerca de 25%, cerca de 10% até cerca de 50%, cerca de 50% até cerca de 99% ou cer
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183/321 ca de 0,1% até cerca de 90% de ingredientes ativos (como fago, Iisina ou bacteriocina). Em aiguns casos, a composição inclui pelo menos quaisquer de 0,1%, 0,5%, 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais de ingredientes ativos (como fago, Iisina ou bacteriocina). Em alguns casos, os agentes concentrados são preferenciais como produtos comerciais, o usuário final normalmente usa agentes diluídos, que têm uma concentração substancialmente menor de ingrediente ativo.
[00259] Quaisquer das formulações descritas aqui podem ser usadas na forma de uma isca, uma espira, uma esteira elétrica, uma preparação fumígena, um fumigante, ou uma folha.
/. Formulações Líquidas [00260] As composições proporcionadas aqui podem estar em uma formulação líquida. Formulações líquidas são geralmente misturadas com água, mas em aiguns casos podem ser usadas com Crop Oil, combustível diesel, querosene ou outro óleo leve como transportador. A quantidade de ingrediente ativo muitas vezes varia desde cerca de 0,5 até cerca de 80 por cento em peso.
[00261] Uma formulação de concentrado emulsíficável pode conter um ingrediente ativo líquido, um ou mais solventes à base de petróleo e um agente que permite que a formulação seja misturada com água para formar uma emulsão. Tais concentrados podem ser usados em formulações para pragas agrícolas, ornamentais e de grama, silvicultura, estruturais, de processamento de alimentos, gado e saúde pública. Estes podem ser adaptáveis a equipamento de aplicação desde pequenos pulverizadores portáteis até pulverizadores hidráulicos, pulverizadores terrestres de baixo volume, sopradores de névoa e pulverizadores aéreos de baixo volume. Alguns ingredientes ativos são prontamente dissolvidos em um transportador líquido. Quando misturados com um transportador, formam uma solução que não sedimenta nem
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184/321 se separa, por exemplo, uma solução homogênea. Formulações destes tipos podem incluir um ingrediente ativo, um transportador e um ou mais ingredientes diferentes. Soluções podem ser usadas em qualquer tipo de pulverizador, dentro de portas e ao ar livre.
[00262] Em alguns casos, a composição pode ser formulada como uma emulsão inversa. Uma emulsão inversa é um ingrediente ativo solúvel em água disperso em um transportador oleoso. Emulsões inversas requerem um emulsificador que permite que o ingrediente ativo seja misturado com um grande volume de transportador à base de petróleo, usualmente óleo combustível. Emulsões inversas ajudam a reduzir a deriva. Com outras formulações ocorre alguma deriva de pulverização quando gotículas de água começam a evaporar antes de alcançarem superfícies-alvo; em resultado, as gotículas se tornam muito pequenas e leves. Uma vez que o óleo evapora mais lentamente do que a água, gotículas de emulsões inversas encolhem menos e mais ingrediente ativo alcança o alvo. O óleo ajuda adicionalmente a reduzir o escoamento e melhora a resistência à chuva. Também serve como fíxador-espalhador ao melhorar a cobertura e absorção da superfície. Uma vez que gotículas são relativamente grandes e pesadas, é difícil obter uma cobertura extensa nos lados inferiores da folhagem. Emulsões inversas são muito habitualmente usadas ao longo de vias onde derivas para áreas diferentes alvo suscetíveis podem ser um problema.
[00263] Uma formulação fluida ou líquida combina muitas das características de concentrados emulsificáveis e pós molháveis. Os fabricantes usam estas formulações quando o ingrediente ativo é um sólido que não se dissolve em água ou em óleo. O ingrediente ativo, impregnado em uma substância como argila, é triturado em um pó muito fino. O pó é então suspenso em uma pequena quantidade de líquido. O produto líquido resultante é bastante espesso. Fluidos e lí
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185/321 quidos partilham muitas das características de concentrados emulsificáveis e têm desvantagens similares. Requerem agitação moderada para ajudar a manter os mesmos em suspensão e deixam resíduos visíveis, similares aos de pós molháveis.
[00264] Fluidos/líquidos são fáceis de manejar e aplicar. Uma vez que são líquidos, estão sujeitos a derramamentos e salpicos. Contêm partículas sólidas, de modo que contribuem para o desgaste abrasivo de bocais e bombas. Suspensões fluidas e líquidas sedimentam em seus recipientes. Uma vez que formulações fluidas e líquidas tendem a sedimentar, o embalamento em recipientes de cinco galões ou menos facilita a remistura.
[00265] Formulações em aerossol contêm um ou mais ingredientes ativos e um solvente. A maior parte dos aerossóis contém uma baixa percentagem de ingredientes ativos. Há dois tipos de formulações em aerossol—o tipo pronto-a-usar habitualmente disponível em recipientes selados pressurizados e aqueles produtos usados em geradores de aerossóis elétricos ou alimentados a gasolina que liberam a formulação como um fumo ou nevoeiro.
[00266] Formulações em aerossol prontas a usar são usualmente unidades pequenas, autocontidas que liberam a formulação quando a válvula do bocal é acionada. A formulação é conduzida através de uma abertura fina por um gás inerte sob pressão, criando gotículas finas. Estes produtos são usados em estufas, em pequenas áreas no interior de edifícios, ou em áreas exteriores localizadas. Os modelos comerciais, que contêm cinco até 5 libras de ingrediente ativo, usualmente podem ser reabastecidos.
[00267] Formulações em aerossol de fumo ou nevoeiro não estão sob pressão. São usadas em máquinas que separam a formulação líquida em uma névoa ou nevoeiro fino (aerossol) usando um disco ou superfície aquecida rodopiando rapidamente.
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186/321 //. Formulações Secas ou Sólidas [00268] As formulações secas podem ser divididas em dois tipos: prontas-a-usar e concentrados que devem ser misturados com água para serem aplicados como uma pulverização. A maior parte das formulações em poeiras são prontas a usar e contêm uma baixa percentagem de ingredientes ativos (menos de cerca de 10 por cento em peso), mais um transportador inerte muito fino, seco feito de talco, giz, argila, cascas de nozes, ou cinza vulcânica. O tamanho das partículas de poeiras individuais varia. Algumas formulações em poeiras são concentrados e contêm uma elevada percentagem de ingredientes ativos. Misturar estas com transportadores inertes secos antes da aplicação. As poeiras são sempre usadas secas e podem facilmente sofrer deriva para sítios diferentes do alvo.
///. Formulações em Grânulos ou Péietes [00269] Em alguns casos, a composição é formulada como grânulos. Formulações granulares são similares a formulações em poeiras, com a exceção de as partículas granulares serem maiores e mais pesadas. As partículas grossas podem ser feitas de materiais como argila, sabugos de milho, ou cascas de nozes. O ingrediente ativo reveste o exterior dos grânulos ou é absorvido naqueles. A quantidade de ingrediente ativo pode ser relativamente baixa, usualmente variando desde cerca de 0,5 até cerca de 15 por cento em peso. Formulações granulares são muito frequentemente usadas para aplicação no solo, insetos vivendo no solo, ou absorção em plantas através das raízes. Formulações granulares são por vezes aplicadas por avião ou helicóptero para minimizar a deriva ou para penetrar em vegetação densa. Depois de aplicados, os grânulos podem liberar o ingrediente ativo lentamente. Alguns grânulos requerem umidade do solo para liberar o ingrediente ativo. Formulações granulares também são usadas para controlar mosquitos larvares e outras pragas aquáticas. Grânulos são
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187/321 usados em operações de controle de pragas agrícolas, estruturais, ornamentais, de gramados, aquáticas, vias e saúde pública (insetos mordedores).
[00270] Em alguns casos, a composição é formulada como péletes. A maior parte das formulações em péletes são muito similares a formulações granulares; os termos são usados alternadamente. No entanto, em uma formulação em péletes, todas as partículas têm o mesmo peso e formato. A uniformidade das partículas permite o uso com equipamento de aplicação de precisão.
iv. Pós [00271] Em alguns casos, a composição é formulada como um pó. Em alguns casos, a composição é formulada como um pó molhável. Pós molháveis são formulações secas, finamente trituradas que parecem poeiras. Usualmente devem ser misturadas com água para aplicação como uma pulverização. No entanto, alguns produtos podem ser aplicados como uma poeira ou como um pó molhável-—a escolha é deixada ao aplicador. Pós molháveis têm cerca de 1 até cerca de 95 por cento de ingrediente ativo em peso; em alguns casos mais do que cerca de 50 por cento. As partículas não se dissolvem em água. Sedimentam rapidamente a menos que sejam constantemente agitadas para as manter suspensas. Podem ser usadas para a maior parte dos problemas de pragas e na maior parte dos tipos de equipamento de pulverização onde a agitação é possível. Os pós molháveis têm excelente atividade residual. Devido às suas propriedades físicas, a maior parte da formulação permanece na superfície de materiais porosos tratados como concreto, reboco e madeira não tratada. Em tais casos, somente a água penetra no material.
[00272] Em alguns casos, a composição é formulada como um pó solúvel. Formulações em pó solúvel parecem ser pós molháveis. No entanto, quando misturadas com água, os pós solúveis se dissolvem
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188/321 prontamente e formam uma verdadeira solução. Depois de serem extensamente misturados, não é necessária nenhuma agitação adicional. A quantidade de ingrediente ativo em pós solúveis varia desde cerca de 15 até cerca de 95 por cento em peso; em alguns casos mais do que cerca de 50 por cento. Os pós solúveis têm todas as vantagens dos pós molháveis e nenhuma das desvantagens, excetuando o perigo de inalação durante o processo de mistura.
[00273] Em alguns casos, a composição é formulada como um grânulo dispersível em água. Grânulos dispersíveis em água, também conhecidos como fluidos secos, são como pós molháveis, com a exceção de, em vez de serem do tipo poeiras, serem formulados como pequenos grânulos facilmente medidos. Os grânulos dispersíveis em água devem ser misturados com água para serem aplicados. Uma vez em água, os grânulos se separam em partículas finas similares a pós molháveis. A formulação requer agitação constante para a manter suspensa em água. A percentagem de ingrediente ativo é elevada, multas vezes tanto quanto 90 por cento em peso. Os grânulos dispersíveis em água partilham muitas das mesmas vantagens e desvantagens dos pós molháveis, com a exceção de serem mais facilmente medidos e misturados. Devido ao fraco empoeiramento, têm menos perigo de inalação para o aplicador durante o manejo.
v. Isca [00274] Em alguns casos, a composição inclui uma isca. A isca pode estar em qualquer forma adequada, como um sólido, pasta, pélete ou forma em pó. A isca também pode ser transportada pelo hospedeiro de novo para uma população do referido hospedeiro (por exemplo, uma colônia ou colmeia). A isca pode então atuar como fonte de alimento para outros membros da colônia, desse modo proporcionando um agente modulador eficaz para um grande número de hospedeiros e potencialmente uma colônia completa de hospedeiros.
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189/321 [00275] As iscas podem ser proporcionadas em um compartimento ou armadilha adequado. Tais compartimentos e armadilhas estão disponíveis no mercado e as armadilhas existentes podem ser adaptadas para incluírem as composições descritas aqui. O compartimento ou armadilha pode ter o formato de uma caixa, por exemplo, e pode ser proporcionado em um estado pré-formado ou pode ser formado por cartão dobrável, por exemplo. Materiais adequados para um compartimento ou armadilha incluem plásticos e cartão, particularmente cartão corrugado. As superfícies internas das armadilhas podem ser revestidas com uma substância pegajosa para restringir o movimento do hospedeiro depois de estar dentro da armadilha. O compartimento ou armadilha pode conter uma depressão adequada cujo interior pode manter a isca no devido lugar. Uma armadilha é distinta de um compartimento pois o hospedeiro não pode abandonar facilmente uma armadilha depois de ter entrado, ao passo que um compartimento atua como uma estação de nutrição que dota o hospedeiro de um ambiente preferido onde pode se alimentar e sentir-se seguro de predadores.
vi. Atratores [00276] Em alguns casos, a composição inclui um atrator (por exemplo, um quimioatrator). O atrator pode atrair um hospedeiro adulto ou hospedeiro imaturo (por exemplo, larva) para a vizinhança da composição. Atratores incluem feromônios, um químico que é secretado por um animal, especialmente um inseto, que influencia o comportamento ou desenvolvimento de outros da mesma espécie. Outros atratores incluem açúcar e xaropes de hidrolisados de proteínas, leveduras e carne podre. Os atratores também podem ser combinados com um ingrediente ativo e pulverizados sobre folhagem ou outros itens na área de tratamento.
[00277] São conhecidos vários atratores que influenciam o comportamento do hospedeiro, como a busca de um hospedeiro por alimento,
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190/321 oviposição ou locais de acasalamento, ou parceiros de acasalamento. Atratores úteis nos métodos e composições descritas aqui incluem, por exemplo, eugenol, propionato de fenetila, dimetilisobutil-ciclopropanocarboxilato de etila, benzodioxancarboxilato de propila, cis-7,8-epoxi-2metiloctadecano, trans-8,trans-0-dodecadienol, cis-9-tetradecenal (com cis-11~hexadecenal), trans-11-tetradecenal, cis-11~hexadecenal, (Z)-11,12-hexadecadienal, acetato de cis-7-dodecenila, acetato de cis8-dodecenila, acetato de cis-9-dodecenila, acetato de cis-9-tetradecenila, acetato de cis-11-tetradecenila, acetato de trans-11-tetradecenila (com cis-11), acetato de cis-9,trans-11-tetradecadienila (com cis9,trans-12), acetato de cis~9,trans-12-tetradecadienila, acetato de cis7,cis-11-hexadecadienila (com cis-7,trans-11), acetato de cis-3,cis-13octadecadienila, acetato de trans-3,cis-13-octadecadienila, anetol e salicilato de isoamila.
[00278] Meios diferentes de quimioatratores também podem ser usados para atrair insetos, incluindo luzes de vários comprimentos de onda ou cores.
vii. Nanocápsulas/Microencapsulação/Lipossomos [00279] Em alguns casos, a composição é proporcionada em uma formulação microencapsulada. Formulações microencapsuladas são misturadas com água e pulverizadas do mesmo modo de outras formulações pulverizáveis. Após a pulverização, o revestimento de plástico se degrada e libera lentamente o ingrediente ativo.
viii. Transportadores [00280] Quaisquer das composições descritas aqui podem ser formuladas de modo a incluírem o agente modulador descrito aqui e um transportador inerte. Tal transportador pode ser um transportador sólido, um transportador líquido, um transportador em gel e/ou um transportador gasoso. Em certos casos, o transportador pode ser um revestimento de sementes. O revestimento de sementes é qualquer formu
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191/321 lação de ocorrência não natural que adere, na totalidade ou em parte, à superfície da semente. A formulação pode adicionalmente incluir um adjuvante ou surfactante. A formulação também pode incluir um ou mais agentes moduladores para alargar o espectro de ação.
[00281] Um transportador sólido usado para formulação inclui pó finamente dividido ou grânulos de argila (por exemplo, argila caulim, terra diatomácea, bentonita, argila Fubasami, argila ácida, etc.), óxido de silício hidratado sintético, talco, cerâmicas, outros minerais inorgânicos (por exemplo, sericita, quartzo, enxofre, carbono ativado, carbonato de cálcio, silica hidratada, etc.), uma substância que pode ser sublimada e está na forma sólida à temperatura ambiente (por exemplo, 2,4,6-tri-isopropil-1,3,5-trioxano, naftaleno, p-diclorobenzeno, cânfora, adamantano, etc.); lã; seda; algodão; cânhamo; polpa; resinas sintéticas (por exemplo, resinas de polietileno como polietileno de baixa densidade, polietileno linear de baixa densidade e polietileno de alta densidade; copolímeros de etileno-éster de vinila como copolímeros de etileno-acetato de vinila; copolímeros de etileno-éster do ácido metacrílico como copolímeros de etileno-metacrilato de metila e copolímeros de etileno-metacrilato de etila; copolímeros de etileno-éster do ácido acrílico como copolímeros de etileno-acrilato de metila e copolímeros de etileno-acrilato de etila; copolímeros de etileno-ácido vinilcarboxílico como copolímeros de etileno-ácido acrílico; copolímeros de etileno-tetraciclododeceno; resinas de polipropileno como homopolímeros de propileno e copolímeros de propileno-etileno; poli-4-metilpenteno-1, polibuteno-1, polibutadieno, poliestireno; resinas de acrilonitríla-estireno; elastômeros de estireno como resinas de acrilonitrila-butadienoestireno, copolímeros de bloco de dieno conjugado com estireno e hidretos de copolímeros de bloco de dieno conjugado com estireno; fluororresinas; resinas acrílicas como poli(metacrilato de metila); resinas de poliamida como náilon 6 e náilon 66; resinas de poliéster como te
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192/321 reftalato de polietileno, naftalato de polietileno, tereftalato de polibutileno e tereftalato de policiclo-hexilenodimetileno; policarbonatos, poliacetais, poliacrilsulfonas, poliarilatos, poliésteres do ácido hidroxibenzoico, poliéterimidas, carbonates de poliéster, resinas de éter de poll· fenileno, cloreto de polivinila, cloreto de polivinilideno, poliuretano, e resinas porosas (como espuma de poliuretano, espuma de polipropileno, ou espuma de etileno, etc.), vidros, metais, cerâmicas, fibras, panos, tecidos tricotados, folhas, papéis, fio, espuma, substâncias porosas e multifilamentos.
[00282] Um transportador líquido pode incluir, por exemplo, hidrocarbonatos aromáticos ou alifáticos (por exemplo, xileno, tolueno, alquilnaftaleno, fenilxililetano, querosene, gasóleo, hexano, ciclo-hexano, etc.), hidrocarbonatos halogenados (por exemplo, clorobenzeno, diclorometano, dicloroetano, tricloroetano, etc.), álcoois (por exemplo, metanol, etanol, álcool de isopropila, butanol, hexanol, álcool de benzila, etilenoglicol, etc.), éteres (por exemplo, éter de dietila, éter de dimetila de etilenoglicol, éter de monometila de dietilenoglicol, éter de monoetiIa de dietilenoglicol, éter de monometila de propilenoglicol, tetrahidrofurano, dioxano, etc.), ésteres (por exemplo, acetato de etila, acetato de butila, etc.), cetonas (por exemplo, acetona, metiletilcetona, metilisobutilcetona, ciclo-hexanona, etc.), nitrilas (por exemplo, acetonitrila, isobutironitrila, etc.), sulfóxidos (por exemplo, dimetilsulfóxido, etc.), amidas (por exemplo, Ν,Ν-dimetilformamida, N,N-dimetilaceta~ mida), imidas cíclicas (por exemplo, N-metilpirrolidona), carbonates de alquilideno (por exemplo, carbonato de propileno, etc.), óleo vegetal (por exemplo, óleo de soja, óleo de sementes de algodão, etc.), essências vegetais (por exemplo, essência de laranja, essência de hissopo, essência de limão, etc.), ou água.
[00283] Um transportador gasoso pode incluir, por exemplo, gás butano, gás Flon, gás de petróleo liquefeito (LPG), éter de dimetila e
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193/321 dióxido de carbono gasoso.
ix. Adjuvantes [00284] Em alguns casos, a composição proporcionada aqui pode incluir um adjuvante. Adjuvantes são químicos que não possuem atividade. Adjuvantes são pré-místurados na formulação ou adicionados ao tanque de pulverização para melhorar o processo de mistura ou aplicação ou para intensificar o desempenho. São extensamente usados em produtos planejados para aplicações foliares. Adjuvantes podem ser usados para customizar a formulação a necessidades específicas e compensar condições locais. Adjuvantes podem ser planejados para desempenhar funções específicas, incluindo umedecimento, espalhamento, aderência, redução da evaporação, redução da volatilização, tamponamento, emulsificação, dispersão, redução da deriva da pulverização e redução da formação de espuma. Nenhum adjuvante único pode desempenhar todas estas funções, mas adjuvantes compatíveis podem ser muitas vezes combinados para desempenhar simultaneamente múltiplas funções.
[00285] Entre exemplos não limitadores de adjuvantes incluídos na formulação se encontram Hgantes, dispersantes e estabilizadores, especificamente, por exemplo, caseína, gelatina, polissacarídeos (por exemplo, amido, goma arábica, derivados de celulose, ácido algínico, etc.), derivados de lignina, bentonita, açúcares, polímeros sintéticos solúveis em água (por exemplo, álcool de polivinila, polivinilpirrolidona, ácido poliacrílico, etc.), PAP (fosfato de isopropila acídico), BHT (2,6di-t-butil-4-metilfenol), BHA (uma mistura de 2-t-butn-4-metoxifenol e 3t-butil-4-metoxifenol), óleos vegetais, óleos minerais, ácidos graxos e ésteres de ácidos graxos.
x. Tensoativos [00286] Em alguns casos, a composição proporcionada aqui inclui um tensoativo. Tensoativos, também denominados agentes molhantes
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194/321 e agentes de espalhamento, alteram fisicamente a tensão superficial de uma gotícula de pulverização. Para que uma formulação desempenhe a sua função apropriadamente, uma gotícula de pulverização deve ser capaz de molhar a folhagem e se espalhar uniformemente sobre uma folha. Os tensoativos aumentam a área de cobertura da formulação, desse modo aumentando a exposição da praga ao químico. Os tensoativos são particularmente importantes quando se aplica uma formulação a folhas cerosas ou pilosas. Sem umedecimento e espalhamento apropriados, as gotículas de pulverização muitas vezes escorrem ou não conseguem cobrir adequadamente as superfícies foliares. No entanto, demasiado tensoativo pode causar escoamento excessivo e reduzir a eficácia.
[00287] Os tensoativos são classificados pelo modo como são ionizados ou se separam em átomos ou moléculas eletricamente carregados denominados íons. Um tensoativo com uma carga negativa é aniônico. Um com uma carga positiva é catiônico e um sem carga elétrica é não iônico. A atividade de uma formulação na presença de um tensoativo não iônico pode ser bastante diferente da atividade na presença de um tensoativo catiônico ou aniônico. A seleção do tensoativo errado pode reduzir a eficácia de um produto pesticida e danificar a planta-alvo. Os tensoativos aniônicos são muito eficazes quando usados com pesticidas de contato (pesticidas que controlam a praga por contato direto em vez de serem absorvidos sistemicamente). Tensoativos catiônicos nunca devem ser usados como tensoativos autônomos porque usualmente são fitotóxicos.
[00288] Os tensoativos não iônicos, muitas vezes usados com pesticidas sistêmicos, ajudam pulverizações pesticidas a penetrar em cutículas de plantas. Os tensoativos não iônicos são compatíveis com a maior parte dos pesticidas e a maior parte dos pesticidas registrados na EPA que requerem um tensoativo recomendam um tipo não iônico.
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Adjuvantes incluem, mas não se limitam a, adesivos, extensores, penetradores em plantas, agentes de compatibilidade, tampões ou modlficadores do pH, aditivos de controle da deriva, agentes antiespumantes e espessantes.
[00289] Entre exemplos não limitadores de tensoativos incluídos nas composições descritas aqui se contam sais de ésteres de alquiIsulfato, alquilsulfonatos, alquilarilsulfonatos, éteres de alquiiariia e seus produtos poiioxietilenados, éteres de polietilenoglicol, ésteres de álcoois polivalentes e derivados de álcoois de açúcares.
xi. Combinações [00290] Em formulações e nas formas de uso preparadas a partir destas formulações, o agente modulador pode estar em uma mistura com outros compostos ativos, como agentes pesticidas (por exemplo, inseticidas, esterilizantes, acaricidas, nematicidas, moluscicidas, ou fungicidas; ver, por exemplo, pesticidas listados na tabela 12), atratores, substâncias reguladoras do crescimento, ou herbicidas. Como usado aqui, o termo agente pesticida se refere a qualquer substância ou mistura de substâncias destinada a prevenir, destruir, repelir, ou mitigar qualquer praga. Um pesticida pode ser uma substância química ou agente biológico usado contra pragas incluindo insetos, patógenos, ervas daninhas e micróbios que competem com humanos por alimento, destroem propriedades, disseminam doenças, ou são um incômodo. O termo agente pesticida” pode abranger adicionalmente outras moléculas bioativas como antibióticos, pesticidas antivirals, antifúngicos, anti-helmínticos, nutrientes, pólen, sacarose e/ou agentes que atordoam ou abrandam o movimento dos insetos.
[00291] Em casos em que o agente modulador é aplicado em plantas, também é possível uma mistura com outros compostos conhecidos, como herbicidas, fertilizantes, reguladores do crescimento, fitoprotetores, semioquímicos, ou então com agentes para melhorar pro
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196/321 priedades das plantas.
V. Administração [00292] Um hospedeiro descrito aqui pode ser exposto a quaisquer das composições descritas aqui em qualquer modo adequado que permita distribuir ou administrar a composição ao inseto. O agente modulador pode ser administrado isoladamente ou em combinação com outras substâncias ativas ou inativas e pode ser aplicado, por exemplo, por pulverização, microinjeção, através de plantas, derramamento, imersão, na forma de líquidos concentrados, géis, soluções, suspensões, pulverizações, pós, péletes, briquetes, tijolos e similares, formulado para administrar uma concentração eficaz do agente modulador. Quantidades e localizações para aplicação das composições descritas aqui são geralmente determinadas pelos hábitos do hospedeiro, o estágio do ciclo de vida em que os micro-organismos do hospedeiro podem ser visados pelo agente modulador, o sítio onde a aplicação deverá ser efetuada e as características físicas e funcionais do agente modulador. Os agentes moduladores descritos aqui podem ser administrados ao inseto por ingestão oral, mas também podem ser administrados por meios que permitam a penetração através da cutícula ou penetração no sistema respiratório do inseto.
[00293] Em alguns casos, o inseto pode ser simplesmente embebido ou pulverizado com uma solução incluindo o agente modulador. Altemativamente, o agente modulador pode ser ligado a um componente alimentar (por exemplo, comestível) do inseto para facilidade de administração e/ou para aumentar a captação do agente modulador pelo inseto. Métodos para introdução oral incluem, por exemplo, mistura direta de um agente modulador com o alimento do inseto, pulverização do agente modulador no habitat ou campo do inseto, bem como abordagens manipuladas em que uma espécie que é usada como alimento é manipulada para expressar um agente modulador, então o
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197/321 inseto a ser afetado é alimentado com aquela. Em alguns casos, por exemplo, a composição do agente modulador pode ser incorporada em, ou sobreposta sobre, a dieta do inseto. Por exemplo, a composição do agente modulador pode ser pulverizada sobre um campo de culturas que um inseto habita.
[00294] Em alguns casos, a composição é pulverizada diretamente sobre uma planta, por exemplo, culturas, por exemplo, por pulverização dorsal, pulverização aérea, pulverização/empoeiramento de culturas, etc. Em casos em que o agente modulador é administrado a uma planta, a planta que recebe o agente modulador pode estar em qualquer estágio do crescimento da planta. Por exemplo, agentes moduladores formulados podem ser aplicados como um revestimento de sementes ou tratamento radicular em estágios precoces do crescimento da planta ou como um tratamento total da planta em estágios mais tardios do ciclo da cultura. Em alguns casos, o agente modulador pode ser aplicado como um agente tópico em uma planta, de modo que o inseto hospedeiro ingere ou contata de qualquer outro modo com a planta por interação com a planta.
[00295] Além disso, o agente modulador pode ser aplicado (por exemplo, no solo onde uma planta cresce, ou na água que é usada para regar a planta) como um agente sistêmico que é absorvido e distribuído através dos tecidos (por exemplo, caules ou folhas) de um hospedeiro vegetal ou animal, de modo que um inseto que se alimenta daqueles obterá uma dose eficaz do agente modulador. Em alguns casos, plantas ou organismos alimentares podem ser geneticamente transformados para expressar o agente modulador de modo que um hospedeiro que se alimenta da planta ou organismo alimentar irá ingerir o agente modulador.
[00296] Liberação retardada ou contínua também pode ser alcançada por revestimento do agente modulador ou de uma composição
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198/321 contendo o(s) agente(s) modulador(es) com uma camada de revestimento dissolúvel ou bioerodível, como gelatina, cujo revestimento se dissolve ou sofre erosão no ambiente do uso, para então disponibilizar o agente modulador, ou por dispersão do agente em uma matriz dissolúvel ou erodível. Tais dispositivos de liberação e/ou administração continua podem ser vantajosamente empregues para manter consistentemente uma concentração eficaz de um ou mais dos agentes moduladores descritos aqui em um habitat de um hospedeiro específico. [00297] O agente modulador também pode ser incorporado no meio onde o inseto cresce, vive, se reproduz, alimenta, ou infesta. Por exemplo, um agente modulador pode ser incorporado em um recipiente de alimentos, estação de nutrição, envoltório protetor, ou uma colmeia. Para algumas aplicações, o agente modulador pode ser ligado a um suporte sólido para aplicação em forma de pó ou em uma armadilha ou estação de nutrição. Como exemplo, para aplicações em que a composição se destina a ser usada em uma armadilha ou como isca para um inseto hospedeiro particular, as composições também podem ser ligadas a um suporte sólido ou encapsuladas em um material de liberação temporal. Por exemplo, as composições descritas aqui podem ser administradas por administração da composição a pelo menos um habitat onde um vetor (por exemplo, um vetor de um patógeno de animais, por exemplo, um mosquito, ácaro, piolho mordedor, ou carrapato) cresce, vive, se reproduz, alimenta, ou infesta. VL Rastreio [00298] São incluídos aqui métodos para rastreio quanto a agentes moduladores que são eficazes para alterar a microbiota de um hospedeiro (por exemplo, inseto) e desse modo decrescer a aptidão do hospedeiro. Os ensaios de rastreio proporcionados aqui podem ser eficazes para identificar um ou mais agentes moduladores (por exemplo, fago) que visam micro-organismos simbióticos residentes no hospedei
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199/321 ro e desse modo decrescer a aptidão do hospedeiro. Por exemplo, ο agente modulador identificado (por exemplo, fago) pode ser eficaz para decrescer a viabilidade de micro-organismos que degradam pesticidas ou aleloquímicos (por exemplo, bactérias, por exemplo, uma bactéria que degrada um pesticida listado na Tabela 12), desse modo aumentando a sensibilidade dos hospedeiros a um pesticida (por exemplo, sensibilidade a um pesticida listado na Tabela 12) ou agente aleloquímico.
[00299] Por exemplo, uma biblioteca de fagos pode ser rastreada para identificar um fago que visa um micro-organismo endossimbiótico específico residente em um hospedeiro. Em alguns casos, a biblioteca de fagos pode ser proporcionada na forma de uma ou mais amostras ambientais (por exemplo, solo, sedimentos de lagoas, ou água de esgotos). Alternativamente, a biblioteca de fagos pode ser gerada a partir de isolados laboratoriais. A biblioteca de fagos pode ser cocultivada com uma estirpe bacteriana-alvo. Após incubação com a estirpe bacteriana, os fagos que infetam e procedem a lise com êxito das bactériasalvo são enriquecidos no meio de cultura. A cultura enriquecida em fagos pode ser subcultivada com bactérias adicionais qualquer número de vezes para enriquecimento adicional quanto ao fago de interesse. O fago pode ser isolado para uso como agente modulador em quaisquer dos métodos ou composições descritas aqui, em que o fago altera a microbiota do hospedeiro de um modo que decresce a aptidão do hospedeiro.
Tabela 12. Pesticidas
Aclonifeno Fenclorazol-etila Pendimetalina
Acetamiprida Fenotiocarb Penflufeno
Alanicarb Fenitrotion Penflufeno
Amidossulfuron Fenpropidina Pentaclorbenzeno
Aminociclopíraclor Fluazolato Pentiopirad
Amisulbrom Flufenoxuron Pentiopirad
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Antraquinona Flumetralina Pírimifos-metila
Asulam, sal de sódio Fluxapiroxad Praletrina
Benfuracarb Fuberidazol Profenofos
Bensulida Glufosinato-amônio Proquinazida
beta-HCH; beta-BCH Glifosato Protiofos
Bioresmetrina Grupo: Bórax, sais borato (ver Piraclofos
Blasticidina-S Grupo: Óleos de parafina, Mineral Pirazaclor
Bórax; tetraborate dissódico H alien prox Pirazofos
Ácido bórico Imiprotrina Piridabeno
Heptanoato de bromoxinil Imidacloprida Piridalil
Octanoate de bromoxinil Ipconazol Piridifention
Carbossulfano Isopirazam Pirifenox
Clorantraniliprol Isopirazam Quinmerac
Ciordimeform Lenacil Rotenona
Clorfluazuron Fosfeto de magnésio Sedaxano
Clorfrofam Metaflumizona Sedaxano
Climbazol Metazaclor Silafluofeno
Clopiralida Metazaclor Sintofeno
Hidróxido de cobre (II) Metobromuron Espinetoram
Ciflufenamida Metoxuron Sulfoxaflor
Cialotrina Metsulfuron-metila Temefos
Cialotrina, gama Milbemectina tiocloprida
Deca-hidrato Naled Tiametoxam
Diafentiuron Napropamida Tolfenpirad
Dimefuron Nicossulfuron Tralometrina
Dimoxistrobina Nitenpiram Compostos de tributilestanho
Dinotefurano Nitrobenzene Tridifane
Dicloreto de diquat o-fenilfenol Triflumizol
Ditianon óleos Validamicina
E-Fosfamidon Oxadiargil Fosfeto de zinco
EPTC Oxicarboxina
Etaboxam Óleo de parafina
Etirimol Penconazol
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EXEMPLOS [00300] O seguinte é um exemplo dos métodos da invenção. É entendido que várias modalidades diferentes podem ser praticadas, dada a descrição geral proporcionada acima.
Exemplo 1: Tratamento do mosquito Aedes vexans com uma solução de antibiótico [00301] Este Exemplo demonstra a capacidade para matar ou decrescer a aptidão dos mosquitos Aedes vexans por tratamento com doxiciclina, um antibiótico de largo espectro que inibe a produção de proteínas. O efeito da doxiciclina em mosquitos é mediado através da modulação de populações bacterianas endógenas ao mosquito que são sensíveis à doxiciclina. Uma estirpe bacteriana visada é Wolbachia.
[00302] O controle e erradicação com êxito do vírus da síndrome reprodutiva e respiratória dos suínos (PRRSV) tem grande importância para a indústria suína global hoje em dia. Para reduzir o risco de entrada do PRRSV, os produtores de porcos utilizam medidas fortes para intensificar a biossegurança de suas quintas: no entanto, a infecção pelo PRRSV de varas de porcos ainda ocorre frequentemente. Um vetor de transmissão de PRRSV é o mosquito Aedes vexans. Aedes vexans é uma praga de mosquitos cosmopolita e comum. Para além do PRRSV, também é um vetor conhecido de Dirofilaría immitis (verme do coração canino); Myxomatosis (doença viral do coelho mortífera) e en~ cefalite equina oriental (doença viral equina mortífera nos EUA). Aedes vexans é o mosquito mais comum na Europa, muitas vezes compondo mais do que 80% da comunidade europeia de mosquitos. A sua abundância depende da disponibilidade de charcos de água de cheias. No verão, armadilhas para mosquitos podem recolher até 8 000 mosquitos por armadilha por noite.
[00303] Planejamento terapêutico:Rete'ições de sangue misturadas
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202/321 com soluções de doxiciclina são formuladas com concentrações finais do antibiótico de 0 (controle negativo), 1, 10, ou 50 pg/mL em 1 mL de sangue.
Planejamento experimental:
[00304] Para preparar para o tratamento, mosquitos crescem em um ambiente e meio laboratoriais. As experiências são realizadas com mosquitos fêmeas de um Aedes vexans, originalmente estabelecido a partir de mosquitos de campo recolhidos em um campo do campus da Universidade de Minnesota St. Paul, mantidos em sangue humano e alimentados como adultos com frutose 5%. Soluções de doxiciclina são preparadas dissolvendo doxiciclina (SIGMA-ALDRICH, D9891) em água esterilizada. Diferentes volumes de uma solução de doxiciclina são adicionados a sangue fresco para totalizar 1 mL na preparação para refeições de sangue. As concentrações finais de doxiciclina no sangue são aproximadamente 0 (solução de controle), 1, 10 ou 50 pg/mL.
[00305] Para cada repetição, a mosquitos de idades correspondentes com 2 até 3 dias de idade é oferecida uma refeição de controle ou de sangue experimental a partir de um dispositivo de alimentação de membrana (tubo Eppendorf de 2 mL) coberto com parafilme e mantido a 37 °C. Mosquitos não ingurgitados são descartados. As refeições são disponibilizadas a cada quatro dias para um total de três refeições de sangue. Entre as refeições de sangue, aos mosquitos é proporcionada uma almofada de algodão umedecida com água destilada para a oviposição. Os mosquitos que não se alimentaram não são removidos após a segunda e posterior refeições de sangue. As mortes são contadas diariamente e as carcaças são removidas e armazenadas para análise de Wolbachia como descrito aqui. Pelo menos 50 mosquitos por concentração de doxiciclina são usados para cada repetição. No final da última refeição de sangue, os mosquitos são mantidos durante
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203/321 horas antes da disseção.
Análise da Microbiota por Reação em Cadeia de Polimerase Quantitativa:
[00306] Antes da disseção, os mosquitos são imersos em etanol 70% durante 5 minutos, então são enxaguados 3 vezes em solução salina tamponada com fosfato (PBS) esterilizada para matar e remover bactérias da superfície, desse modo minimizando a contaminação das amostras com bactérias de cutículas durante a disseção. O intestino médio de cada mosquito (controle e tratamento com doxiciclina) é removido e congelado imediatamente em gelo seco e armazenado a 20°C até ao processamento. Os intestinos médios só são excluídos da análise se rebentarem e uma quantidade substancial do conteúdo do intestino se perder. As amostras são homogeneizadas em fenolclorofórmio em um homogeneizador Precellys 24 (Bertin) usando esférulas de vidro com 0,5 mm de tamanho (Bertin) durante 30 segundos a 6800 rpm e ácido desoxirribonucleico (DNA) é extraído com fenol· clorofórmio. O DNA ribossômico (rDNA) 16S é usado para quantificação de Woibachia e é mostrado como uma razão do gene doméstico 40S da proteína ribossômica S7 de Aedes (gene de Base Vetorial ID AAEL009496). Sequências de iniciadores para Woibachia são: iniciador direto 5'- TCAGCCACACTGGAACTGAG -3' (SEQ ID NO: 221) e iniciador reverso 5'- TAACGCTAGCCCTCTCCGTA -3' (SEQ ID NO: 222), e para S7: direto õ-AAGGTCGACACCTTCACGTC-S’ (SEQ ID NO: 223) e reverso 5-CCGTTTGGTGAGGGTCTTTA-3' (SEQ ID NO: 224). A reação em cadeia de polimerase quantitativa (qPCR) é realizada em um aplicador de ciclos térmicos 7500 Fast Real-Time (Applied Biosystems) usando o kit SYBR Premix Ex Taq (Takara), seguindo as instruções do fabricante. Mosquitos tratados com doxiciciina exibem uma redução de genes específicos de Woibachia.
[00307] As taxas de sobrevivência de mosquitos tratados com solu
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204/321 ção de doxicidina são comparadas com as dos mosquitos tratados com o controle negativo. A taxa de sobrevivência de mosquitos tratados com solução de doxicidina é decrescida em comparação com o controle.
Exemplo 2: Tratamento do mosquito Anopheles com soluções de azitromicina [00308] Este Exemplo demonstra a capacidade para matar ou decrescer a aptidão dos mosquitos Anopheles coluzzil e decrescer a taxa de transmissão de parasitas por tratamento com azitromicina, atividade antibacteriana relativamente larga mas superficial. Inibe algumas bactérias Gram-positivas, algumas bactérias Gram-negativas e muitas bactérias atípicas. O efeito da azitromicina em mosquitos é mediado através da modulação de populações bacterianas endógenas ao mosquito que são sensíveis à azitromicina. Uma estirpe bacteriana visada é Asaia.
[00309] O mosquito foi descrito como o animal mais perigoso do mundo e a malária é uma doença transmitida por mosquitos que tem um impacto prejudicial em humanos. Há cerca de 3 500 espécies de mosquitos e todas as que transmitem malária pertencem a um subconjunto denominado Anopheles. Aproximadamente 40 espécies de Anopheles são capazes de transmitir malária que tem um impacto significativo na saúde humana.
[00310] Planejamento terapêutico: Refeições de sangue misturadas com soluções de azitromicina são formuladas com concentrações finais do antibiótico de 0 (controle negativo), 0,1, 1, ou 5 pg/mL em 1 mL de sangue.
Planejamento experimental:
[00311] Para preparar para o tratamento, mosquitos crescem em um ambiente e meio laboratoriais. As experiências são realizadas com mosquitos fêmeas de uma colônia de Anopheles coluzzii Ngousso, ori
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205/321 ginalmente estabelecidos a partir de mosquitos de campo recolhidos em Cameroon, mantidos em sangue humano e alimentados como adultos com frutose 5%. As larvas são alimentadas com ração para peixes TetraMin. A temperatura é mantida a 28°C (±1°C), 70--80% de umidade em um ciclo de 12 hr de luz/escuridão.
[00312] Alimentação com Sangue Humano e Infecções com Plasmodium:
[00313] Gametócitos de Plasmodium falciparum NF54 são cultivados em meio RPMI (GIBCO) incluindo 300 mg.L·1 de L-glutamina suplementada com 50 mg/L de hipoxantina, HEPES 25 mM mais soro humano inativado pelo calor 10% sem antibióticos. Duas culturas de 25 mL são iniciadas 17 e 14 dias antes da infecção a 0,5% de parasitemia em eritrócitos (RBC) O+ lavados 6% v/v. O meio é mudado diariamente. Antes da infecção com mosquitos, RBC centrifugados são reunidos e suplementados com 20% de RBC lavados de fresco e soro humano (razão 2:3 v/v entre RBC e soro). Aos mosquitos é oferecida uma refeição de sangue a partir de um dispositivo de alimentação de membrana (tubo Eppendorf de 2 mL) coberto com Parafilme e mantido a 37°C.
[00314] Soluções de azitromicina são preparadas dissolvendo azitromicina (SIGMA-ALDRICH, PZ0007) em DMSO. Diferentes volumes de solução de azitromicina são adicionados a sangue fresco para totalizar 1 mL na preparação para refeições de sangue. As concentrações finais de azitromicina no sangue são 0 (apenas solvente como solução de controle), 0,1, 1, ou 5 pg/mL.
[00315] Para cada infecção com Plasmodium, a pelo menos 100 mosquitos de idades correspondentes com 2 até 3 dias de idade por condição é oferecida uma refeição de controle ou de sangue experimental a partir de um dispositivo de alimentação de membrana (tubo Eppendorf de 2 mL) coberto com parafilme e mantido a 37°C e mos
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206/321 quitos não ingurgítados são removidos. As refeições são disponibilizadas a cada quatro dias para um total de três refeições de sangue. Entre as refeições de sangue, aos mosquitos é proporcionada uma almofada de algodão umedecida com água destilada para a oviposição. Os mosquitos que não se alimentaram não são removidos após a segunda e posterior refeições de sangue. As mortes são contadas diariamente e as carcaças são removidas e armazenadas para análise de Asaia como descrito aqui. Pelo menos 50 mosquitos por concentração de azitromicina são usados para cada repetição. No final da última refeição de sangue, os mosquitos são mantidos durante 12 horas antes da disseção.
Análise da Microbiota por Reação em Cadeia de Poiimerase Quantitativa:
[00316] Antes da disseção, os mosquitos são imersos em etanol 70% durante 5 minutos, então são enxaguados 3 vezes em solução salina tamponada com fosfato (PBS) esterilizada para matar e remover bactérias da superfície, desse modo minimizando a contaminação das amostras com bactérias de cutículas durante a disseção. O intestino médio de cada mosquito (controle e tratamento com azitromicina) é removido e congelado imediatamente em gelo seco e armazenado a 20°C até ao processamento. Os intestinos médios só são excluídos da análise se rebentarem e uma quantidade substancial do conteúdo do intestino se perder. As amostras são homogeneizadas em fenolclorofórmio em um homogeneizador Precellys 24 (Bertin) usando esférulas de vidro com 0,5 mm de tamanho (Bertin) durante 30 segundos a 6800 rpm e ácido desoxirribonucleico (DNA) é extraído com fenolclorofórmío. O DNA ribossômico (rDNA) 16S é usado para quantificação de Asaia e é mostrado como uma razão do gene doméstico 40S da proteína ribossômica S7 de Anopheles (gene de Base Vetorial ID AGAP010592). Sequências de inicíadores para Asaia são: direto 5'
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GTGCCGATCTCTAAAAGCCGTCTCA-3' (SEQ ID NO:248) e reverso 5'TTCGCTCACCGGCTTCGGGT-3' (SEQ ID NO: 249), e para S7: direto 5'- GTGCGCGAGTTGGAGAAGA -3' (SEQ ID NO: 250) e reverso 5'- ATCGGTTTGGGCAGAATGC -3' (SEQ ID NO: 251). A reação em cadeia de polimerase quantitativa (qPCR) é realizada em um aplicador de ciclos térmicos 7500 Fast Real-Time (Applied Biosystems) usando o kit SYBR Premix Ex Taq (Takara), seguindo as instruções do fabricante. Mosquitos tratados com azitromicina exibem uma redução de genes específicos de Asaia.
[00317] As taxas de sobrevivência de mosquitos tratados com azitromicina são comparadas com as dos mosquitos tratados com o controle negativo. A taxa de sobrevivência de mosquitos tratados com solução de azitromicina é decrescida em comparação com o controle.
Exemplo 3: Tratamento do Dermacentor andersoni com uma solução de antibiótico [00318] Este Exemplo demonstra a capacidade para matar ou decrescer a aptidão do carrapato, Dermacentor andersoni, por tratamento com oxitetraciclina Liquamycin LA-200, um antibiótico de largo espectro habitualmente usado para tratar uma gama ampla de infecções bacterianas em gado. O efeito da oxitetraciclina Liquamycin LA-200 em carrapatos é mediado através da modulação de populações bacterianas endógenas ao carrapato que são sensíveis à oxitetraciclina Liquamycin LA-200. Uma estirpe bacteriana visada é Rickettsia.
[00319] Os carrapatos são artrópodes hematófagos obrigatórios que se alimentam de vertebrados e causam grandes perdas econômicas a gado devido à sua capacidade para transmitir doenças a humanos e animais. Em particular, carrapatos transmitem patógenos em todos os continentes e estão marcados como vetores principais de patógenos zoonóticos. De fato, 415 novos patógenos bacterianos transmitidos por carrapatos foram descobertos desde que a doença Lyme
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208/321 foi caracterizada em 1982. Dermacentor andersoni, o carrapato da madeira das Montanhas Rochosas, foi marcado como uma ‘verdadeira caixa de Pandora de agentes produtores de doenças' e transmite vários patógenos, incluindo Rickettsia rickettsii e Francisella tularensis. Também é um vetor de Anaplasma marginale, o agente de anaplasmose e o patógeno de gado transmitido por carrapatos mais disseminado em todo o mundo (Gall et ai, The ISME Journal 10:1846-1855, 2016). Perdas econômicas devido a anaplasmose em gado são estimadas em $300 milhões por ano nos Estados Unidos (Rochon et ai, J. Med. Entomol. 49:253-261, 2012).
[00320] Planejamento terapêutico: Uma dose terapêutica (11 mg/kg de peso do corpo) de injeção de oxitetraciclina Liquamycin LA-200 aos -4, -1, +3 e +5 dias pós-aplicaçâo de carrapatos.
[00321 ] Planejamento experimental:
[00322] D. andersoni adultos à espreita de hospedeiros são recolhidos por técnicas de arrastamento de bandeira de flanela em sítios em Burns, Oregon e Lake Como, Montana como descrito em (Scoles et ai, J. Med. Entomol. 42:153-162, 2005). Carrapatos recolhidos no campo são usados para estabelecer colônias laboratoriais Para análise de bactérias de carrapatos, um coorte de carrapatos machos F1 ou F2 adultos de cada colônia é alimentado em um vitelo Holstein e dissecado para recolher intestinos médios (MG) e glândulas salivares (SG) para isolamento de DNA genômico e quantificação de bactérias do modo seguinte:
[00323] Um coorte de carrapatos F1 é alimentado em vitelos tratados com antibiótico ou vitelos não tratados (controle). Os vitelos tratados com antibiótico receberam uma dose terapêutica (11 mg/kg de peso do corpo) de injeções de oxitetraciclina Liquamycin LA-200 aos - 4, -1,+3e+5 dias pós-aplicação de carrapatos, ao passo que vitelos não tratados não receberam nenhumas injeções (controle não tratado).
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Aos carrapatos fêmeas é permitida a continuação da oviposição durante uma segunda geração dos carrapatos não tratados e tratados (geração F2). A geração tratada F2 proveio de adultos F1 que são expostos a antibióticos. Os carrapatos F2 não são sujeitos a antibióticos.
[00324] Carrapatos machos adultos da geração F1 e F2 são alimentados durante 7 dias e então dissecados em um período de 24 h. As mortes são contadas diariamente e carrapatos são removidos e armazenados para análise de Rickettsia como descrito aqui. Antes da disseção, a superfície dos carrapatos é esterilizada e todas as ferramentas de disseção são esterilizadas entre cada disseção. MG e SG de carrapatos são dissecados e reunidos em grupos de 30 com três repetições biológicas. Os tecidos são armazenados em Solução Cell Lysis (Qiagen, Valencia, CA, EUA) e Proteinase K (1,25 mg/mL). DNA genômico é isolado usando o kit de Extração PureGene (Qiagen) de acordo com as especificações do fabricante.
[00325] Análise quantitativa de Rickettsia belli!:
[00326] Para quantificar Rickettsia, números de cópias do gene rickA são medidos usando PCR quantitativa com SYBR Green de carrapatos F1 e F2 não tratados e tratados com antibiótico. A quantidade de Rickettsia é determinada usando os iniciadores Direto (5TACGCCACTCCCTGTGT CA-3'; SEQ ID NO: 225) e Reverso (5'GATGTAACGGTATTAC ACCAACAG-3'; SEQ ID NO: 226). A quantidade bacteriana é medida em MG e SG de F1 e F2 das amostras reunidas. A reação em cadeia de polimerase quantitativa (qPCR) é realizada em um aplicador de ciclos térmicos 7500 Fast Real-Time (Applied Biosystems) usando o kit SYBR Premix Ex Taq (Takara), seguindo as instruções do fabricante. Carrapatos tratados com oxitetraciclina Liquamycin LA-200 exibem uma redução de genes específicos de Rickettsia.
[00327] As taxas de sobrevivência de carrapatos tratados com solu
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210/321 ção de antibiótico são comparadas com as dos carrapatos não tratados. A taxa de sobrevivência de carrapatos tratados com solução de oxitetraciclina Liquamycin LA-200 é decrescida em comparação com os nâo tratados.
Exemplo 4: Tratamento de ácaros que infectam gado com soluções de rifampicina [00328] Este Exemplo demonstra a capacidade para matar ou decrescer a aptidão de ácaros por tratamento dos mesmos com uma solução de antibiótico. Este Exemplo demonstra que o efeito de oxitetraciclina em ácaros é mediado através da modulação de populações bacterianas endógenas, como Bacillus, aos ácaros que são sensíveis à oxitetraciclina.
[00329] Sarna sarcóptica é causada por ácaros que infestam animais esburacando profundamente na pele e depositando ovos no interior dos buracos. Os ovos eclodem no estágio larvar. Os ácaros larvares abandonam então os buracos, se movem para a superfície da pele, e começam a formar novos buracos em tecido de pele saudável. O desenvolvimento desde o ovo até ao estado adulto é completado em cerca de 2 semanas. As lesões resultantes de infestações por estes ácaros são uma consequência da reação do sistema imune dos animais à presença dos ácaros. Devido à intensidade da resposta imunológica dos animais, é requerido apenas um pequeno número de ácaros para produzir lesões disseminadas e dermatite generalizada. Não obstante ácaros poderem ser mortos com acaricidas quimicamente sintetizados, estes tipos de agentes químicos devem ser pulverizados sobre cada animal da manada com equipamento de pulverização hidráulico de alta pressão para assegurar a penetração pela pulverização no interior da pele. Além disso, estes tipos de pesticidas químicos podem ter efeitos ecológicos e/ou agrícolas prejudiciais.
[00330] Planejamento terapêutico: Solução de oxitetraciclina é for
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211/321 mulada com 0 (controle negativo), 1, 10, ou 50 pg/mL em 10 mL de água esterilizada com sacarose 0,5% e aminoácidos essenciais.
[00331] Planejamento experimental:
[00332] Para determinar se ácaros adultos no estágio reprodutivo têm diferente suscetibilidade em comparação com ácaros foréticos ou sua descendência uma vez que a sua cutícula não é endurecida, ácaros vivendo em gado e ácaros associados a larvas e pupas são recolhidos. Este ensaio testa soluções de antibiótico em diferentes tipos de ácaros e determina como a sua aptidão é alterada visando micróbios endógenos, como Bacillus.
[00333] Os ácaros da progênie são recolhidos de porcos infestados com ácaros. Amostras de pele são recolhidas por raspagem suave e levantamento de áreas incrustadas da área do ouvido interno do porco com uma colher de chá afiada e são subsequentemente examinadas quanto a ácaros.
[00334] Os ácaros são agrupados por idade e avaliados separadamente. A idade é determinada com base na morfologia e pigmentação da larva ou da pupa do modo seguinte: ácaros recolhidos de larvas fiadoras que são suficientemente pequenas para rodopiarem são agrupados no Grupo 1; ácaros recolhidos de larvas estiradas, que são demasiado grandes para se depositarem na célula e começarem a estirar para a frente com a sua boca na direção da abertura celular, são agrupados no Grupo 2; e ácaros recolhidos de pupas são agrupados no Grupo 3. Os ácaros são armazenados na sua larva ou pupa hospedeira em placas de Petri de vidro até serem recolhidas 50 unidades. Isto assegura que a sua rotina de alimentação e estado fisiológico permanecem inalterados. Para evitar que ácaros sejam transviados das suas larvas ou pupas hospedeiras ou que trepem uns sobre os outros, apenas hospedeiros no mesmo estágio de desenvolvimento são mantidos na mesma placa.
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212/321 [00335] O equipamento - um anel de aço inoxidável (56 mm de diâmetro interno, 2-3 mm de altura) e 2 círculos de vidro (62 mm de diâmetro) - é limpo com acetona e hexano ou pentano para formar a arena de teste. As soluções de oxitetraciclina e solução de controle sâo aplicadas no equipamento por pulverização dos discos de vidro e anel da arena homogeneamente. Para este propósito, um reservatório é carregado com 1 mL das soluções; a distância entre a superfície pulverizada e a extremidade de baixo do tubo é fixada em 11 mm e um bocal de 0,0275 polegadas é usado. A pressão é ajustada (usualmente situada no intervalo 350-500 hPa) até a quantidade de solução depositada ser 1 ± 0,05 mg/cm2. As soluções de antibiótico são derramadas em suas placas respectivas, recobrindo toda a base das placas, e líquido residual é evaporado sob uma capela. O anel é colocado entre os círculos de vidro para construir uma gaiola. As gaiolas são usadas em um período de 60 hr da preparação, para não mais do que três ensaios, com o propósito de controlar a exposição dos ácaros a soluções de antibiótico. 10 até 15 ácaros são introduzidos nesta gaiola e as peças do equipamento são unidas com gotículas de cera fundida. São usados ácaros recolhidos de larvas fiadoras, larvas estiradas, pupas de olhos brancos e olhos escuros com corpo branco e pálido.
[00336] Passadas 4 horas, os ácaros são transferidos para uma placa de Petri de vidro limpa (60 mm de diâmetro) para se alimentarem com duas ou três pupas de olhos brancos (4-5 dias depois de tapados). Os ácaros são observados sob um microscópio de disseção às 4 hr, 24 hr e 48 hr depois de serem tratados com as soluções de antibiótico ou de controle, e são classificados de acordo com as seguintes categorias:
□ Móveis: se movimentam quando de pé, depois de serem ou não empurrados com uma agulha.
□ Paralisados: movem um ou mais apêndices, não esti-
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213/321 mulados ou após estimulação, mas não conseguem se movimentar.
□ Mortos: imóveis e não reagem a 3 estimulações subsequentes.
[00337] Um palito ou agulha esterilizado é usado para estimular os ácaros tocando em suas patas. Novos palitos ou agulhas esterilizadas são usados para estimular cada grupo para evitar contaminação entre grupos de ácaros.
[00338] Os ensaios são realizados a 32,5°C e 60-70% de umidade relativa. Se a mortalidade nos controles exceder 30%, a repetição é excluída. Cada experiência é repetida com quatro séries de gaiolas.
[00339] O estado de Bacillus em grupos de ácaros é avaliado por PCR. DNA total é isolado de indivíduos de controle (não tratados com oxitetraciclina) e tratados com oxitetraciclina (corpo completo) usando um Kit de DNA (OMEGA, Bio-tek) de acordo com o protocolo do fabricante. Os iniciadores para Bacillus, iniciador direto 5'- GAGGTAGACGAAGCGACCTG -3' (SEQ ID NO: 233) e iniciador reverso 5'TTCCCTCACGGTACTGGTTC -3' (SEQ ID NO: 234), são planejados com base em sequências de rRNA 23S-5S obtidas do genoma de Bacillus (Número de Acesso: AP007209.1) (Takeno et aí, J. Bacterid. 194(17):4767-4768, 2012) usando o software Primer 5.0 (Primer-E Ltd., Plymouth, RU). Os ciclos de amplificação por PCR incluíram um passo de desnaturação inicial a 95°C durante 5 min, 35 ciclos de 95°C durante 1 min, 59°C durante 1 min e 72°C durante 2 min, e um passo de extensão final de 5 min a 72°C. Os produtos de amplificação de amostras tratadas com oxitetraciclina e de controle são analisados em géis de agarose 1%, corados com SYBR Safe e visualizados usando um Sistema de imagiologia.
[00340] As taxas de sobrevivência de ácaros tratados com uma solução de oxitetraciclina são comparadas com os ácaros Varroa tratados com o controle negativo.
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214/321 [00341] É esperado que a taxa de sobrevivência e a mobilidade de ácaros tratados com solução de oxítetraciclina sejam decrescídas em comparação com o controle.
Exemplo 5: Produção de uma biblioteca de fagos [00342] Este Exemplo demonstra a aquisição de uma coleção de fagos de amostras ambientais.
[00343] Planejamento terapêutico: Coleção de biblioteca de fagos tendo as seguintes famílias de fagos: Myoviridae, Siphovlridae, Podoviridae, Lipothrixvíridae, Rudíviridae, Ampullavlridae, Bicaudaviridae, Clavavlridae, Cortlcovlridae, Cystoviridae, Fusellovlridae, Glubolovlridae, Guttavlridae, Inoviridae, Leviviridae, Microviridae, Plasmaviridae, Tectlvlridae.
[00344] Planejamento experimental:
[00345] Múltiplas amostras ambientais (solo, sedimentos de lagoas, água de esgoto) são recolhidas em balões esterilizados de 1 L ao longo de um período de 2 semanas e são imediatamente processadas como descrito abaixo após a recolha e seguidamente armazenadas a 4°C. Amostras sólidas são homogeneizadas em caldo Luria (LB) Difco de dupla potência esterilizado ou caldo de soja tríptica (TSB) suplementado com CaCh 2 mM para um volume final de 100 mL. O pH e níveis de fosfato são medidos usando tiras de teste de fosfato. Para a purificação, todas as amostras são centrifugadas a 3000-6000 g em um centrifugador Megafuge 1.0R, Heraeus, ou em Eppendorf 5702 R, durante 10-15 min a +4°C, e filtradas através de filtros com baixa ligação de proteína de 0,2 pm para remover todas as células bacterianas remanescentes. O sobrenadante é armazenado a 4°C na presença de clorofórmio em uma garrafa de vidro.
Exemplo 6: Identificação de fagos específicos para alvos [00346] Este Exemplo demonstra o isolamento, purificação e identificação de fagos específicos para um único alvo a partir de uma biblio
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215/321 teca heterogênea de fagos.
[00347] Planejamento experimental:
[00348] 20-30 mL da biblioteca de fagos descrita no Exemplo 5 são diluídos para um volume de 30-40 mL com caldo LB. A estirpe bacteriana-alvo, por exemplo, Buchnera, é adicionada (50-200 pL de cultura durante a noite cultivada em caldo LB) para enriquecer fagos que visam esta estirpe bacteriana específica na cultura. Esta cultura é incubada durante a noite a +37°C, agitada a 230 rpm. Bactérias desta cultura de enriquecimento são removidas por centrifugação (3000-6000 g em centrifugador Megafuge 1 .OR, Heraeus, ou em Eppendorf 5702 R, 15-20 min, +4°C) e filtradas (filtro de 0,2 ou 0,45 pm). 2,5 mL da cultura sem bactérias são adicionados a 2,5 mL de caldo LB e 50-100 pL das bactérias-alvo para enriquecer os fagos. A cultura de enriquecimento é cultivada durante a noite como acima. Uma amostra desta cultura de enriquecimento é centrifugada a 13 000 g durante 15 min à temperatura ambiente e 10 pL do sobrenadante são plaqueados em uma placa de Petri contendo LB~ágar juntamente com 100-300 pL das bactérias-alvo e 3 mL de ágar mole 0,7% fundido. As placas são incubadas durante a noite a +37°C. Cada uma das placas observadas no gramado bacteriano são selecionadas e transferidas para 500 pL de caldo LB. Uma amostra deste estoque de placas é adicionalmente plaqueada nas bactérias-alvo. A purificação de placas é efetuada três vezes para todos os fagos descobertos para isolar um único fago homogêneo da mistura heterogênea de fagos.
[00349] Lisados de placas com fagos em título elevado (>1x 10λ1° PFU/mL) são preparados por recolha de placas revestidas de uma estirpe de bactéria hospedeira exibindo lise confluente. Depois de ser inundado com 5 mL de tampão, o revestimento de ágar mole é macerado, clarificado por centrifugação e filtrado de modo esterilizado. Os lisados resultantes são armazenados a 4°C. Lisados de fagos em título
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216/321 elevado são adicionalmente purificados por centrifugação isopícnica com CsCI, como descrito em (Summer et aí, J. Bacteriol. 192:179-190, 2010).
[00350] DNA é isolado de suspensões de fagos purificadas com CsCI como descrito em (Summer, Methods Mol. Biol. 502:27-46, 2009). Um fago individual isolado é sequenciado como parte de duas reuniões de genomas de fagos usando um método de pirossequenciamento 454. DNA genômico de fagos é misturado em quantidades equimolares para uma concentração final de cerca de 100 ng/L. O DNA reunido é cisalhado, ligado com uma marca identificadora de multiplex (MID) específica para cada uma das reuniões, e sequenciado por pirossequenciamento usando uma reação de placa completa em um sequenciador de Titânio Roche FLX de acordo com os protocolos do fabricante. O DNA fágico reunido está presente em duas reações de sequenciamento. O resultado do fluxograma de Titânio FLX aparado correspondente a cada uma das reuniões é montado individualmente usando Newbler Assembler versão 2.5.3 (454 Life Sciences), por ajustamento dos parâmetros de modo a incluir somente leituras contendo uma única MID por montagem. A identidade de contigs individuais é determinada por PCR usando iniciadores gerados contra sequências de contigs e preparações DNA genômico de fagos individuais como modelo. Sequencher 4.8 (Gene Codes Corporation) é usado para a montagem e edição de sequências. Estruturas terminais cromossômicas de fagos são determinadas experimentalmente. Extremidades coesivas (cos) para fagos são determinadas por sequenciamento das extremidades do genoma do fago e sequenciamento dos produtos de PCR derivados por amplificação através da junção ligada de DNA genômico circularizado, como descrito em (Summer, Methods Moi Biol. 502:27-46, 2009). Regiões codificadores de proteínas são inicialmente previstas usando GeneMark.hmm (Lukashin et al. Nucleic Acids Res.
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26:1107-1115, 1998), refinadas através de análise manual em Artemis (Rutherford et aí, Bioinformatics 16:944-945, 2000), e analisadas usando BLAST (valor limite E de 0,005) (Camacho et aí, BMC Bioinformatics 10:421, 2009). Proteínas de interesse particular são adicionalmente analisadas por InterProScan (Hunter et ai., Nucleic Acids Res. 40O306-D312, 2012).
[00351] Microscopia eletrônica de fagos purificados com CsCI (>1 χ10λ11 PFU/mL) que procederam à lise das bactérias endossimbióticas, Buchnera, é realizada diluindo estoque com o tampão de caldo de soja tríptica. Os fagos são aplicados em grelhas Formvar finas revestidas com carbono de 400 de malha, corados com acetato de uranila 2% (peso/vol), e secos ao ar. Os espécimes são observados em um microscópio eletrônico de transmissão JEOL 1200EX operando a uma voltagem de aceleração de 100 kV. Cinco virions de cada fago são medidos para calcular valores médios e desvios padrão para as dimensões do capsídeo e cauda, quando apropriado.
Exemplo 7: Tratamento de afídeos com uma solução de fagos purificados [00352] Este Exemplo demonstra a capacidade para matar ou decrescer a aptidão de afídeos por tratamento dos mesmos com uma solução de fagos. Este Exemplo demonstra que o efeito de fagos em afídeos é mediado através da modulação de populações bacterianas endógenas ao afídeo que são sensíveis a fagos. Uma estirpe bacteriana visada é Buchnera com o fago identificado no Exemplo 6.
[00353] Afídeos são espécies representativas para testar agentes moduladores da microbiota e efeitos na aptidão dos afídeos.
[00354] Planejamento terapêutico:
[00355] Soluções de fagos são formuladas com 0 (controle negativo), 102, 105, ou 108 unidades formadoras de placas (pfu)/mL de fago do Exemplo 6 em 10 mL de água esterilizada com sacarose 0,5% e
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218/321 aminoácidos essenciais.
[00356] Planejamento experimental:
[00357] Para preparar para o tratamento, afídeos crescem em um ambiente e meio laboratoriais. Em uma sala de clima controlado (fotoperíodo de 16 h de luz; 60±5% de UR; 20±2°C), plantas de fava são cultivadas em uma mistura de vermiculita e perlita a 24°C com 16 h de luz e 8 h de escuridão. Para limitar efeitos maternos ou diferenças de saúde entre plantas, 5-10 adultos de diferentes plantas são distribuídos entre 10 plantas com duas semanas de idade, e deixados multiplicar para alta densidade durante 5-7 dias. Para as experiências, afídeos de segundo e terceiro instar são recolhidos de plantas saudáveis e divididos em tratamentos de modo que cada tratamento recebe aproximadamente o mesmo número de indivíduos de cada uma das plantas da coleção.
[00358] Soluções de fagos são preparadas como descrito aqui. Poços de uma placa de 96 poços são cheios com 200 pL de dieta artificial para afídeos (Febvay et al., Canadian Journal of Zoology 66(11):24492453, 1988) e a placa é coberta com parafilme para preparar um sachê de alimentação. A dieta artificial é misturada com água esterilizada e com sacarose 0,5% e aminoácidos essenciais como controle negativo ou com soluções de fagos com concentrações variáveis de fagos. Soluções de fagos são misturadas com dieta artificial para se obterem concentrações finais de fagos entre 102 e 108 (pfu)/mL.
[00359] Para cada tratamento repetido, 30-50 afídeos de segundo e terceiro instar são colocados Individualmente em poços de uma placa de 96 poços e uma placa de sachê de alimentação é invertida por cima daqueles, permitindo que os insetos se alimentem através do parafilme e mantendo os mesmos restringidos a poços Individuais. Os afídeos experimentais são mantidos sob as mesmas condições ambientais das colônias de afídeos. Depois de os afídeos se alimentarem
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219/321 durante 24 hr, o sachê de alimentação é substituído por um novo contendo dieta artificial esterilizada e um novo sachê esterilizado é proporcionado a cada 24 h durante 4 dias. No momento em que o sachê é substituído, os afídeos também são verificados quanto à mortalidade. Um afídeo é contado como morto se tiver ficado marrom ou estiver na base do poço e não se mover durante a observação. Se um afídeo estiver sobre o parafilme do sachê de alimentação mas não se mover, é presumido que está vivo e se alimentando.
[00360] O estado de Buchnera em amostras de afídeos é avaliado por PCR. Afídeos adultos do controle negativo (não tratados com fagos) e grupos tratados com fagos são primeiramente esterilizados na superfície com etanol 70% durante 1 min, lixívia 10% durante 1 min e três lavagens de água ultrapura durante 1 min. DNA total é extraído de cada indivíduo (corpo completo) usando um Kit Insect DNA (OMEGA, Bio-tek) de acordo com o protocolo do fabricante. Os iniciadores para Buchnera, iniciador direto 5'-GTCGGCTCATCACATCC-3f (SEQ ID NO: 235) e iniciador reverso 5-TTCCGTCTGTATTATCTCCT-3' (SEQ ID NO: 236), são planejados com base em sequências de rRNA 23S5S obtidas do genoma de Buchnera (Número de Acesso: GC.AJD00009605.1) (Shigenobu et a/., Nature 407:81-86, 2000) usando o software Primer 5.0 (Primer-E Ltd., Plymouth, RU). Os ciclos de amplificação por PCR incluíram um passo de desnaturação inicial a 95°C durante 5 min, 35 ciclos de 95°C durante 30 s, 55°C durante 30 s e 72°C durante 60 s, e um passo de extensão final de 10 min a 72°C. Os produtos de amplificação de amostras tratadas com rifampicina e de controle são analisados em géis de agarose 1%, corados com SYBR Safe e visualizados usando um Sistema de imagiologia. Afídeos tratados com fagos exibem uma redução de genes específicos de Buchnera.
[00361] As taxas de sobrevivência de afídeos tratados com fagos
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220/321 específicos para Buchnera são comparadas com as dos afídeos tratados com o controle negativo. A taxa de sobrevivência de afídeos tratados com fagos específicos para Buchnera é decrescida em comparação com a dos afídeos tratados com controle.
Exemplo 8: Produção de uma solução de bacteriocina colA [00362] Este Exemplo demonstra a produção e purificação de bacteriocina colA.
[00363] Sequência do construto:
catatg atg acccg caccatg ctgtttctg g cgtg cgtg g cg g cg ctgtatgtgtg cattag cg cg a ccg cg g g caaaccg g aag aatttg cg aaactg ag cg atg aag cg ccg ag caacg atcag g c g atgtatg aaag cattcag cg ctatcg ccg ctttgtg g atg g caaccg ctataacg g cg g ccag c ag cag cag cag cag ccg aaacag tg g g aagtg cg cccg g atctg ag ccg cg atcag cg cg g caacaccaaagcgcaggtggaaattaacaaaaaaggcgataaccatgatattaacgcgggct g g g g caaaaacattaacg g cccg g atag ccataaag atacctg g catgtg g g cg g cag cgtg cgctggctcgag (SEQ ID NO: 237)
Planejamento experimentai:
[00364] DNA é gerado por PCR com iniciadores específicos com sítios de restrição a montante (Ndel) e a jusante (Xhol). Iniciador direto GTATCTATTCCCGTCTACGAACATATGGAATTCC (SEQ ID NO: 238) e iniciador reverso CCGCTCGAGCCATCTGACACTTCCTCCAA (SEQ ID NO: 239). Fragmentos de PCR purificados (Extrato de NucleoSpin ll-Macherey Nagel) são digeridos com Ndel ou Xhol e então os fragmentos são ligados. Para a clonagem de colA, o fragmento de DNA ligado é clonado em vetor pcr2.1 (número de acesso da base de dados GenBank EY122872) (Anselme et al., BMC Biol. 6:43, 2008). A sequência de nucleotídeos é sistematicamente verificada (Cogenics).
[00365] O plasmídeo com a sequência colA é expresso em BL21 (DE3)/pLys. Bactérias são cultivadas em caldo LB a 30°C. A uma ODsoo de 0,9, isopropil-p-D-1-tiogalactopiranosídeo (IPTG) é adicionado para uma concentração final de 1 mM e células foram cultivadas
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221/321 durante 6 h. As bactérias são submetidas a lise por sonicação em NaCi 100 mM, Triton X-100 1%, base Tris 100 mM pH 9,5 e proteínas são carregadas em uma coluna HisTrap HP (GE Healthcare). A coluna é lavada sucessivamente com NaCI 100 mM, Tris-HCI 100 mM pH 6,8 e PBS. A eluição é efetuada com imidazol 0,3 M em PBS. Colunas PD10 de dessalinização (GE Healthcare) são usadas para eliminar imidazol e peptídeos solubilizados em PBS são concentrados em unidades de filtros de centrifugação (Millipore).
[00366] Sequência da Proteína ColA:
MTRTMLFLAC VAALYVCISA TAGKPEEFAK LSDEAPSNDQ AMYESIQRYR RFVDGNRYNG GQQQQQQPKQ WEVRPDLSRD QRGNTKAQVE INKKGDNHDI NAGWGKNING PDSHKDTWHV GGSVRW (SEQ ID NO: 211)
Exemplo 9: Tratamento de afídeos com uma solução de bacteriocina colA [00367] Este Exemplo demonstra a capacidade para matar ou decrescer a aptidão de afídeos por tratamento dos mesmos com uma solução de bacteriocina. Este Exemplo demonstra que o efeito de bacteriocinas em afídeos é mediado através da modulação de populações bacterianas endógenas ao afídeo que são sensíveis à bacteriocina ColA. Uma estirpe bacteriana visada é Buchnera com a bacteriocina produzida no Exemplo 8.
Planejamento terapêutico:
[00368] Soluções de ColA sâo formuladas com 0 (controle negativo), 0,6, 1, 50 ou 100 mg/mL de ColA do Exemplo 8 em 10 mL de água esterilizada com sacarose 0,5% e aminoácidos essenciais.
Planejamento experimental:
[00369] Para preparar para o tratamento, afídeos crescem em um ambiente e meio laboratoriais. Em uma sala de clima controlado (fotoperíodo de 16 h de luz; 60±5% de UR; 20±2°C), plantas são cultivadas
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222/321 em uma mistura de vermiculita e perlita e são infestadas com afídeos. Nas mesmas condições climáticas, larvas de E. balteatus são obtidas de uma produção em massa; as moscas-das-flores são criadas com açúcar, pólen e água; e a oviposição é induzida pela introdução de plantas hospedeiras infestadas na gaiola de criação durante 3 h. O ciclo de vida completo ocorre nas plantas hospedeiras que diariamente são reinfestadas com afídeos.
[00370] Poços de uma placa de 96 poços são cheios com 200 pL de dieta artificial para afídeos (Febvay et ai, Canadian Journal of Zoology 66(11):2449-2453, 1988) e a placa é coberta com parafilme para preparar um sachê de alimentação. A dieta artificial é misturada com a solução de água esterilizada com sacarose 0,5% e aminoácidos essenciais como controle negativo ou soluções de ColA com concentrações variáveis de ColA. Soluções de ColA são misturadas com dieta artificial para se obterem concentrações finais entre 0,6 e 100 mg/mL [00371] Para cada tratamento repetido, 30-50 afídeos de segundo e terceiro instar são colocados individualmente em poços de uma placa de 96 poços e uma placa de sachê de alimentação é invertida por cima daqueles, permitindo que os insetos se alimentem através do parafilme e mantendo os mesmos restringidos a poços individuais. Os afídeos experimentais são mantidos sob as mesmas condições ambientais das colônias de afídeos. Depois de os afídeos se alimentarem durante 24 hr, o sachê de alimentação é substituído por um novo contendo dieta artificial esterilizada e um novo sachê esterilizado é proporcionado a cada 24 h durante 4 dias. No momento em que o sachê é substituído, os afídeos também são verificados quanto à mortalidade. Um afídeo é contado como morto se tiver ficado marrom ou estiver na base do poço e não se mover durante a observação. Se um afídeo estiver sobre o parafilme do sachê de alimentação mas não se mover, é presumido que está vivo e se alimentando.
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223/321 [00372] O estado de Buchnera em amostras de afídeos é avaliado por PCR. Afídeos adultos do controle negativo e tratados com fagos são primeiramente esterilizados na superfície com etanol 70% durante 1 min, lixívia 10% durante 1 min e três lavagens de água ultrapura durante 1 min. DNA total é extraído de cada indivíduo (corpo completo) usando um Kit Insect DNA (OMEGA, Bio-tek) de acordo com o protocolo do fabricante. Os iniciadores para Buchnera, iniciador direto 5'GTCGGCTCATCACATCC-3' (SEQ ID NO: 235) e iniciador reverso 5'TTCCGTCTGTATTATCTCCT-3' (SEQ ID NO: 236), são planejados com base em sequências de rRNA 23S-5S obtidas do genoma de Buchnera (Número de Acesso: GCAJ300009605.1) (Shigenobu, et al., Nature 200.407, 81--86) usando o software Primer 5.0 (Primer-E Ltd., Plymouth, RU). Os ciclos de amplificação por PCR incluíram um passo de desnaturação inicial a 95°C durante 5 min, 35 ciclos de 95°C durante 30 s, 55°C durante 30 s, e 72°C durante 60 s, e um passo de extensão final de 10 min a 72°C. Os produtos de amplificação de amostras tratadas com rifampicina e de controle são analisados em géis de agarose 1%, corados com SYBR Safe e visualizados usando um Sistema de imagiologia. Afídeos tratados com ColA exibem uma redução de genes específicos de Buchnera.
[00373] As taxas de sobrevivência de afídeos tratados com bacteriocina ColA específica para Buchnera são comparadas com as dos afídeos tratados com o controle negativo. A taxa de sobrevivência de afídeos tratados com bacteriocina ColA específica para Buchnera é decrescida em comparação com a dos afídeos tratados com controle.
Exemplo 10: Tratamento de afídeos com soluções de rifampicina [00374] Este Exemplo demonstra a capacidade para matar ou decrescer a aptidão de afídeos por tratamento dos mesmos com rifampicina, um antibiótico de pequeno espectro que inibe a síntese de RNA dependente de DNA por inibição de uma RNA polimerase bacteriana.
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Este Exemplo demonstra que o efeito de rifampicina em afídeos é mediado através da modulação de populações bacterianas endógenas ao afídeo que são sensíveis à rifampicina. Uma estirpe bacteriana visada é Buchnera.
Planejamento terapêutico:
[00375] As soluções de antibiótico são formuladas com 0 (controle negativo), 1, 10, ou 50 pg/mL de rifampicina em 10 mL de água esterilizada com sacarose 0,5% e aminoácidos essenciais.
Planejamento experimental:
[00376] Para preparar para o tratamento, afídeos crescem em um ambiente e meio laboratoriais. Em uma sala de clima controlado (fotoperíodo de 16 h de luz: 60±5% de UR; 20±2°C), plantas de fava são cultivadas em uma mistura de vermiculita e perlita a 24°C com 16 h de luz e 8 h de escuridão. Para limitar efeitos maternos ou diferenças de saúde entre plantas, 5-10 adultos de diferentes plantas são distribuídos entre 10 plantas com duas semanas de idade e deixados multiplicar para alta densidade durante 5-7 dias. Para as experiências, afídeos de segundo e terceiro instar são recolhidos de plantas saudáveis e divididos em tratamentos de modo que cada tratamento recebe aproximadamente o mesmo número de indivíduos de cada uma das plantas da coleção.
[00377] Soluções de rifampicina são preparadas dissolvendo rifampicina (SIGMA-ALDRICH, 557303) em água esterilizada com sacarose 0,5% e aminoácidos essenciais. Poços de uma placa de 96 poços são cheios com 200 pL de dieta artificial para afídeos (Febvay et aL, Canadian Journal of Zoology 66(11):2449-2453, 1988) e a placa é coberta com parafilme para preparar um sachê de alimentação. A dieta artificial é misturada com água esterilizada e com sacarose 0,5% e aminoácidos essenciais como controle negativo ou com uma solução de rifampicina com uma das concentrações de rifampicina. Soluções de
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225/321 rifampicina são misturadas com dieta artificial para se obterem concentrações finais do antibiótico entre 1 e 50 pg/mL.
[00378] Para cada tratamento repetido, 30-50 afídeos de segundo e terceiro instar são colocados individualmente em poços de uma placa de 96 poços e uma placa de sachê de alimentação é invertida por cima daqueles, permitindo que os insetos se alimentem através do parafilme e mantendo os mesmos restringidos a poços individuais. Os afídeos experimentais são mantidos sob as mesmas condições ambientais das colônias de afídeos. Depois de os afídeos se alimentarem durante 24 hr, o sachê de alimentação é substituído por um novo contendo dieta artificial esterilizada e um novo sachê esterilizado é proporcionado a cada 24 h durante quatro dias. No momento em que o sachê é substituído, os afídeos também são verificados quanto à mortalidade. Um afídeo é contado como morto se tiver ficado marrom ou estiver na base do poço e não se mover durante a observação. Se um afídeo estiver sobre o parafilme do sachê de alimentação mas não se mover, é presumido que está vivo e se alimentando.
[00379] O estado de Buchnera em amostras de afídeos é avaliado por PCR. DNA total é isolado de indivíduos de controle (não tratados com rifampicina) e tratados com rifampicina usando um Kit Insect DNA (OMEGA, Bio-tek) de acordo com o protocolo do fabricante. Os iniciadores para Buchnera, iniciador direto 5'-GTCGGCTCATCACATCC-3' (SEQ ID NO: 235) e iniciador reverso 5-TTCCGTCTGTATTATCTCCT3' (SEQ ID NO: 236), são planejados com base em sequências de rRNA 23S-5S obtidas do genoma de Buchnera (Número de Acesso: GCAJJ00009605.1) (Shigenobu et a/„ Nature 407:81-86, 2000) usando o software Primer 5.0 (Primer-E Ltd., Plymouth, RU). Os ciclos de amplificação por PCR incluíram um passo de desnaturação inicial a 95°C durante 5 min, 35 ciclos de 95°C durante 30 s, 55°C durante 30 s e 72°C durante 60 s, e um passo de extensão final de 10 min a 72°C.
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Os produtos de amplificação de amostras tratadas com rifampicina e de controle são analisados em géis de agarose 1%, corados com SYBR Safe e visualizados usando um Sistema de imagiologia. Afídeos tratados com rifampicina exibem uma redução de genes específicos de Buchnera.
[00380] As taxas de sobrevivência de afídeos tratados com solução de rifampicina são comparadas com as dos afídeos tratados com o controle negativo. A taxa de sobrevivência de afídeos tratados com solução de rifampicina é decrescida em comparação com o controle.
Exemplo 11: Rastreio de alto rendimento (HTS) quanto a moléculas visando Buchnera [00381] Este Exemplo demonstra a identificação de moléculas que visam Buchnera.
[00382] Planejamento experimental: Um HTS para identificar inibidores de estirpes bacterianas visadas, Buchnera, usa fermentação de sacarose em meio pH-MMSuc (Ymele-Leki et al., PLoS ONE 7(2):e31307, 2012) para decrescer o pH do meio. Indicadores de pH no meio monitoram a acidificação do meio espectrofotometricamente através de uma alteração da absorvância a 615 nm (Aeis). Uma estirpe bacteriana visada, Buchnera, derivada de um estoque de glicerol, é plaqueada em uma placa de LB-ágar e incubada durante a noite a 37°C. Uma alça calibrada cheia de células é recolhida, lavada três vezes com PBS, e então ressuspensa em PBS a uma densidade óptica de 0,015.
[00383] Para o HTS, 10 pL desta suspensão de células bacterianas são transferidos em alíquotas para os poços de uma placa de 384 poços contendo 30 pL de meio pH-MMSuc e 100 nL de uma fração de composto de teste de uma biblioteca de produtos naturais de extratos pré-fracionados (39 314 extratos arranjados em placas de 384 poços) de fontes microbianas, como endófitos fúngicos, endófitos bacterianos,
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227/321 bactérias do solo e bactérias marinhas, descrito em (Ymele-Leki et aL, PLoS ONE 7(2):e31307, 2012). Para cada ensaio, a Aeis é medida após incubação à temperatura ambiente às 6 hr e 20 hr. Este passo é automatizado e validado no formato de placa de 384 poços usando um espectrofotômetro para múltiplos poços EnVisionTM para testar todas as frações da biblioteca. As frações que demonstram acidificação do meio retardada por fermentação de sacarose e crescimento celular inibido são selecionadas purificação adicional e identificação.
Exemplo 12: Isolamento e identificação de moléculas específicas para Buchnera [00384] Este Exemplo demonstra o isolamento e identificação de um isolado da fração descrita no Exemplo 11 que bloqueia a fermentação de sacarose e inibe o crescimento celular de Buchnera.
Planejamento experimental:
[00385] A fração descrita no Exemplo 11 é ressuspensa em 90% de água/metanol e passada ao longo de uma coluna C18 SPE para se obter a fração I. A coluna é então lavada com metanol para se obter a fração II. A fração II é separada em uma HPLC Agilent série 1100 com uma coluna preparativa de Fenil-hexila (Phenomenex, Luna, 25 cm 610 mm, 5 mm de tamanho das partículas) usando um tampão de eluição com 20% acetonitrila/água com ácido fórmico 0,1% a uma taxa de fluxo de 2 mL/min durante 50 minutos. Isto origina múltiplos compostos a diferentes tempos de eluição. Espectros para cada composto são obtidos em um espectrômetro de massa FT-IR Alpha (Broker), um Espectrofotômetro UV/Visível UltrospecTM 5300 pro (Amersham Biosciences), e um espectrofotômetro de ressonância magnética nuclear INOVA 600 MHz (Varian).
Exemplo 13: Tratamento de afídeos com uma solução de uma molécula específica para Buchnera [00386] Este Exemplo demonstra a capacidade para matar ou de
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228/321 crescer a aptidão de afídeos por tratamento dos mesmos com um dos compostos identificados no Exemplo 12 através da modulação de populações bacterianas endógenas ao afídeo que são sensíveis a este composto. Uma estirpe bacteriana visada é Buchnera.
Planejamento terapêutico:
[00387] Cada composto do Exemplo 12 é formulado a 0 (controle negativo), 0,6, 1, 20 ou 80 pg/mL em 10 mL de água esterilizada com sacarose 0,5% e aminoácidos essenciais.
Planejamento experimental:
[00388] Para preparar para o tratamento, afídeos crescem em um ambiente e meio laboratoriais. Em uma sala de clima controlado (fotoperíodo de 16 h de luz: 60±5% de UR; 20±2°C), plantas de fava são cultivadas em uma mistura de vermiculita e perlita a 24°C com 16 h de luz e 8 h de escuridão. Para limitar efeitos maternos ou diferenças de saúde entre plantas, 5-10 adultos de diferentes plantas são distribuídos entre 10 plantas com duas semanas de idade e deixados multiplicar para alta densidade durante 5-7 dias. Para as experiências, afídeos de segundo e terceiro instar são recolhidos de plantas saudáveis e divididos em tratamentos de modo que cada tratamento recebe aproximadamente o mesmo número de indivíduos de cada uma das plantas da coleção.
[00389] Poços de uma placa de 96 poços são cheios com 200 pL de dieta artificial para afídeos (Febvay et al., Canadian Journal of Zoology 66(11):2449-2453, 1988) e a placa é coberta com parafilme para preparar um sachê de alimentação. A dieta artificial é misturada com água esterilizada com sacarose 0,5% e aminoácidos essenciais como controle negativo ou com soluções com concentrações variáveis do composto.
[00390] Para cada tratamento repetido, 30-50 afídeos de segundo e terceiro instar sâo colocados individualmente em poços de uma pla
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229/321 ca de 96 poços e uma placa de sache de alimentação é invertida por cima daqueles, permitindo que os insetos se alimentem através do parafilme e mantendo os mesmos restringidos a poços individuais. Os afídeos experimentais sâo mantidos sob as mesmas condições ambientais das colônias de afídeos. Depois de os afídeos se alimentarem durante 24 h, o sachê de alimentação é substituído por um novo contendo dieta artificial esterilizada e um novo sachê esterilizado é proporcionado a cada 24 h durante 4 dias. No momento em que o sachê é substituído, os afídeos também são verificados quanto à mortalidade. Um afídeo é contado como morto se tiver ficado marrom ou estiver na base do poço e não se mover durante a observação. Se um afídeo estiver sobre o parafilme do sachê de alimentação, mas não se mover, é presumido que está vivo e se alimentando.
[00391] O estado de Buchnera em amostras de afídeos é avaliado por PCR. Afídeos do controle negativo e tratados com composto 1 são primeiramente esterilizados na superfície com etanol 70% durante 1 min, lixívia 10% durante 1 min e três lavagens de água ultrapura durante 1 min. DNA total é extraído de cada indivíduo (corpo completo) usando um Kit Insect DNA (OMEGA, Bio-tek) de acordo com o protocolo do fabricante. Os iniciadores para Buchnera, iniciador direto 5'GTCGGCTCATCACATCC-3' (SEQ ID NO: 235) e iniciador reverso 5'TTCCGTCTGTATTATCTCCT-3' (SEQ ID NO: 236), são planejados com base em sequências de rRNA 23S-5S obtidas do genoma de Buchnera (Número de Acesso: GCAJ300009605.1) (Shigenobu et al., Nature 407:81-86, 2000) usando o software Primer 5.0 (Primer-E Ltd., Plymouth, RU). Os ciclos de amplificação por PCR incluíram um passo de desnaturação inicial a 95°C durante 5 min, 35 ciclos de 95°C durante 30 s, 55°C durante 30 s e 72°C durante 60 s, e um passo de extensão final de 10 min a 72°C. Os produtos de amplificação de amostras tratadas com composto 1 e de controle são analisados em géis de
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230/321 agarose 1%, corados com SYBR Safe e visualizados usando um Sistema de imagíologia. Uma redução de genes específicos de Buchnera indica atividade antimicrobiana do composto 1.
[00392] A taxa de sobrevivência de afídeos tratados com o composto é comparada com a dos afídeos tratados com o controle negativo. É esperado que um decréscimo da taxa de sobrevivência de afídeos tratados com o composto indique atividade antimicrobiana do composto. Exemplo 14: Insetos tratados com uma solução de antibiótico [00393] Este Exemplo demonstra o tratamento de afídeos com rifampicina, um antibiótico de pequeno espectro que inibe a síntese de RNA dependente de DNA por inibição de uma RNA polimerase bacteriana. Este Exemplo demonstra que o efeito de rifampicina em uma espécie de insetos-modelo, afídeos, foi mediado através da modulação de populações bacterianas endógenas ao inseto que foram sensíveis à rifampicina. Uma estirpe bacteriana visada é Buchnera.
Planejamento Terapêutico [00394] A solução de antibiótico foi formulada, de acordo com o meio de administração, do modo seguinte (Fig. 1A-1G):
[00395] Através das plantas: com 0 (controle negativo) ou 100 pg/mL de rifampicina formulada em uma dieta artificial (com base em Akey e Beck, 1971; ver Planejamento Experimental) com e sem aminoácidos essenciais (2 mg/mL de histidina, 2 mg/mL de isoleucina, 2 mg/mL de leucina, 2 mg/mL de lisina, 1 mg/mL de metionina, 1,62 mg/mL de fenilalanina, 2 mg/mL de treonina, 1 mg/mL de triptofano e 2 mg/mL de valina).
[00396] Revestimento foiiar: 100 pL de 0,025% de solvente de tensoativo de organossilicone não iônico Silwet L-77 em água (controle negativo), ou 100 pL de 50 pg/mL de rifampicina formulada em solução de soivente foram aplicados diretamente na superfície foliar e deixados secar.
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231/321 [00397] Microinjeção: soluções de injeção consistiram em 0,025% de solvente de tensoativo de organossilicone não iônico Silwet L-77 em água (controle negativo), ou 50 pg/mL de rifampicina formulada em solução de solvente.
[00398] Administração tópica: 100 pL de 0,025% de solvente de tensoativo de organossilicone não iônico Siiwet L-77 (controle negativo), ou 50 pg/mL de rifampicina formulada em solução de solvente foram pulverizados usando uma garrafa de pulverização de 30 mL.
[00399] Método de injeção de foliar A - Perfusão e corte de folhas: folhas foram injetadas com aproximadamente 1 mL de 50 pg/mL de rifampicina em água com corantes alimentares ou aproximadamente 1 mL de controle negativo com água e corantes alimentares. As folhas foram cortadas em pedaços de 2x2 cm quadrados e afídeos foram colocados sobre os pedaços de folhas.
[00400] Perfusão foliar e administração através das plantas: Folhas foram injetadas com aproximadamente 1 mL de 100 pg/mL de rifampicina em água mais corantes alimentares ou aproximadamente 1 mL de controle negativo com água e corantes alimentares. O caule da folha injetada foi então colocado em um tubo Eppendorf com 1 mL de 100 pg/mL de rifampicina mais água e corantes alimentares ou 1 mL de controle negativo somente com água e corantes alimentares.
[00401] Método de administração de combinação: a) Administração tópica a afídeo e planta: via pulverização de afídeos e plantas com 0,025% de solvente de tensoativo de organossilicone não iônico Silwet L-77 em água (controle negativo) ou 100 pg/mL de rifampicina formulada em solução de solvente usando um 30 mL, b) Administração através da planta: somente água (controle negativo) ou 100 pg/mL de rifampicina formulada em água.
Planejamento Experimental da Administração em Plantas:
[00402] Afídeos (estirpe LSR-1, Acyrthosiphon pisum) cresceram
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232/321 em plantas de fava (fava Vroma vicia de Johnny's Selected Seeds) em um incubador de clima controlado (fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de escuridão; 60±5% de UR; 25±2°C). Antes de serem usadas para a criação de afídeos, plantas de fava foram cultivadas em solo envasado a 24°C com 16 h de luz e 8 h de escuridão. Para limitar efeitos maternos ou diferenças de saúde entre plantas, 5-10 adultos de diferentes plantas foram distribuídos entre 10 plantas com duas semanas de idade e deixados multiplicar para alta densidade durante 5-7 dias. Para as experiências, afídeos de primeiro instar foram recolhidos de plantas saudáveis e divididos em 3 grupos de tratamento diferentes: 1) dieta artificial isoladamente sem aminoácidos essenciais, 2) dieta artificial isoladamente sem aminoácidos essenciais e 100 pg/mL de rifampiclna, e 3) dieta artificial com aminoácidos essenciais e 100 pg/mL de rifampicina. Cada grupo de tratamento recebeu aproximadamente o mesmo número de indivíduos de cada uma das plantas da coleção.
[00403] A dieta artificial usada foi preparada como previamente publicado (Akey e Beck, 1971 Continuous Rearing of the Pea Aphid, Acyrthosiphon pisum, on a Holidic Diet”), com e sem os aminoácidos essenciais (2 mg/mL de histidina, 2 mg/mL de isoleucina, 2 mg/mL de leucina, 2 mg/mL de lisina, 1 mg/mL de metionina, 1,62 mg/mL de fenilalanina, 2 mg/mL de treonina, 1 mg/mL de triptofano e 2 mg/mL de valina), com a exceção de nenhuma dieta incluir homosserina ou betaalaniltirosina. O pH das dietas foi ajustado para 7,5 com KOH e as dietas foram filtradas de modo esterilizado através de um filtro de 0,22 pm e armazenadas a 4°C durante um curto período (<7 dias) ou a -80°C durante um período longo.
[00404] Soluções de estoque de rifampiclna (Tokyo Chemical Industry, LTD) foram preparadas a 25 mg/mL em metanol, esterilizadas por passagem através de um filtro de seringa de 0,22 pm, e armazenadas a -20°C. Para os tratamentos (ver Planejamento terapêutico), a quanti
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233/321 dade apropriada de solução de estoque foi adicionada à dieta artificial com ou sem aminoácidos essenciais para se obter uma concentração final de 100 pg/mL de rifampicina. A dieta foi então colocada em um tubo Eppendorf de 1,5 mL com um caule de fava com uma folha e a abertura do tubo foi fechada usando parafilme. Este sistema de alimentação com dieta artificiai foi então coiocado em uma placa de Petri profunda (Fisher Scientific, Cat# FB0875711) e afídeos foram aplicados nas folhas da planta.
[00405] Para cada tratamento, 33 afídeos foram colocados sobre cada folha. Os sistemas de alimentação com dieta artificial foram mudados a cada 2-3 dias ao longo da experiência. Os afídeos foram monitorados diariamente quanto à sobrevivência e afídeos mortos foram removidos da placa de Petri profunda alojando o sistema de alimentação artificial quando foram descobertos.
[00406] Adicionalmente, o estágio do desenvolvimento (1o, 2o, 3o, 4o, 5o instar) foi determinado diariamente ao longo da experiência. Assim que um afídeo alcançou o estágio de 4o instar, os afídeos receberam o seu próprio sistema de alimentação artificial em uma placa de Petri profunda de modo que a fecundidade pôde ser monitorada assim que alcançaram a fase adulta.
[00407] Para afídeos adultos, ninfas novas foram contadas diariamente e então descartadas. No final das experiências, a fecundidade foi determinada como o número médio de progênie produzida diariamente assim que o afídeo alcançou a fase adulta. Fotos de afídeos foram tiradas ao longo da experiência para avaliar diferenças de tamanho entre grupos de tratamento.
[00408] Após 7 dias de tratamento, DNA foi extraído de múltiplos afídeos de cada grupo de tratamento. Em resumo, a superfície corporal do afídeo foi esterilizada por imersão do afídeo em uma solução de lixívia 6% durante aproximadamente 5 segundos. Os afídeos foram
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234/321 então enxaguados em água esterilizada e DNA foi extraído de cada afídeo individual usando um kit de extração de DNA (Qiagen, kit DNeasy) de acordo com instruções do fabricante. A concentração de DNA foi medida usando uma quantificação de ácido nucleico por NanoDrop e os números de cópias de DNA de Buchnera e afídeo foram medidos por qPCR. Os iniciadores usados para Buchnera foram Buch_groES_18F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 240) e Buch__groES__98R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO:
241) (Chong e Moran, 2016 PNAS). Os iniciadores usados para afídeo foram ApEFIa 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG; SEQ ID NO:
242) e ApEFIa 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO:
243) (Chong e Moran, 2016 PNAS). qPCR foi realizado usando uma rampa de amplificação de qPCR de 1,6 grau C/s e as seguintes condições: 1) 95°C durante 10 minutos, 2) 95°C durante 15 segundos, 3) 55°C durante 30 segundos, 4) repetir os passos 2-3 40x, 5) 95°C durante 15 segundos, 6) 55°C durante 1 minuto, 7) alteração da rampa para 0,15 grau C/s, 8) 95°C durante 1 segundo. Os dados de qPCR foram analisados usando software analítico (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).
[00409] Tratamento com antibiótico retarda e trava a progressão do desenvolvimento de afídeos [00410] Afídeos LSR-1 de 1o instar foram divididos em três grupos de tratamento separados como definido em Planejamento Experimental (acima). Os afídeos foram monitorados diariamente e o número de afídeos em cada estágio de desenvolvimento foi determinado. Os afídeos tratados com dieta artificial isoladamente sem aminoácidos essenciais começaram a alcançar a maturidade (estágio de 5o instar) aproximadamente aos 6 dias (Fig. 2A). O desenvolvimento foi retardado em afídeos tratados com rifampicina, e pelos 6 dias de tratamento, a maior parte dos afídeos não maturou mais do que o estágio de 3o
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235/321 instar, mesmo após 12 dias, e o seu tamanho é drasticamente afetado (Figuras 2A-2C).
[00411] Em contraste, afídeos tratados com dieta artificial com rifampicina suplementada com aminoácidos essenciais se desenvolveram mais rapidamente e para estágios de instar mais elevado em comparação com afídeos tratados com rifampicina isoladamente, mas nâo tão rapidamente quanto afídeos tratados com dieta artificial sem aminoácidos essenciais (Figuras 2A-2C). Estes dados indicam que o tratamento com rifampicina enfraqueceu o desenvolvimento dos afídeos. Adicionar de novo aminoácidos essenciais resgatou parcialmente esta deficiência no desenvolvimento.
Tratamento com antibiótico aumentou a mortalidade dos afídeos [00412] A taxa de sobrevivência de afídeos também foi medida durante os tratamentos. A maior parte dos afídeos tratados com dieta artificial isoladamente sem aminoácidos essenciais estavam vivos aos 5 dias pós-tratamento (Fig. 3). Após 5 dias, os afídeos começaram gradualmente a morrer e alguns sobreviveram para além de 13 dias póstratamento.
[00413] Em contraste, afídeos tratados com rifampicina sem aminoácidos essenciais exibiram menores taxas de sobrevivência do que afídeos tratados com dieta artificial isoladamente (p<0,00001). Os afídeos tratados com rifampicina começaram a morrer após 1 dia de tratamento e todos os afídeos sucumbiram ao tratamento pelos 9 dias. Os afídeos tratados com rifampicina e aminoácidos essenciais sobreviveram durante mais tempo do que aqueles tratados com rifampicina isoladamente (p=0,017). Estes dados indicam que o tratamento com rifampicina afetou a sobrevivência dos afídeos.
Tratamento com antibiótico decresceu a reprodução dos afídeos [00414] A fecundidade também foi monitorada em afídeos durante os tratamentos. Pelos dias 7 e 8 pós-tratamento, a maior parte dos afí
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236/321 deos adultos tratados com dieta artificial sem aminoácidos essenciais começaram a se reproduzir. O número médio de progênie produzida diariamente após a maturidade por afídeos tratados com dieta artificial sem aminoácidos essenciais foi aproximadamente 4 (Fig. 4). Em contraste, afídeos tratados com rifampicina com ou sem aminoácidos essenciais foram incapazes de alcançar a fase adulta e produzir progênie. Estes dados indicam que o tratamento com rifampicina resultou em uma perda da reprodução dos afídeos.
Tratamento com antibiótico decresceu Buchnera em afídeos [00415] Para testar se rifampicina resultou especificamente em perda de Buchnera em afídeos, e se esta perda teve impacto na aptidão dos afídeos, DNA foi extraído de afídeos em cada grupo de tratamento após 7 dias de tratamento e qPCR foi realizado para determinar os números de cópias de Buchnera/afídeo. Os afídeos tratados com dieta artificial isoladamente sem aminoácidos essenciais exibiram razões elevadas de cópias de DNA de Buchnera/afídeo. Em contraste, afídeos tratados com rifampicina exibiram ~4 vezes menos cópias de DNA de Buchnera/afídeo (Fig. 5), indicando que o tratamento com rifampicina decresceu níveis de Buchnera.
Planejamento Experimental da Administração por Revestimento Foliar [00416] Solução de estoque de rifampicina foi adicionada a 0,025% de um solvente de tensoativo de organossilicone não tônico, Silwet L77, para se obter uma concentração final de 50 pg/mL de rifampicina. Afídeos (estirpe eNASCO, Acyrthosiphon pisum) cresceram em plantas de fava como descrito em um Exemplo anterior. Para as experiências, afídeos de primeiro instar foram recolhidos de plantas saudáveis e divididos em 2 grupos de tratamento diferentes: folhas foram pulverizadas com 1) controle negativo (solução de solvente isoladamente), 2) 50 pg/mL de rifampicina em solvente. As soluções foram absorvidas em um pedaço de 2x2 cm de folha de fava.
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237/321 [00417] Cada grupo de tratamento recebeu aproximadamente o mesmo número de indivíduos de cada uma das plantas da coleção. Para cada tratamento, 20 afídeos foram colocados sobre cada folha. Os afídeos foram monitorados diariamente quanto à sobrevivência e afídeos mortos foram removidos quando foram descobertos. Adícionalmente, o estágio do desenvolvimento (1o, 2o, 3°, 4o, 5° instar e 5R, representando um 5o instar se reproduzindo) foi determinado diariamente ao longo da experiência. Fotos de afídeos foram tiradas ao longo da experiência para avaliar diferenças de tamanho entre grupos de tratamento.
[00418] Após 6 dias de tratamento, DNA foi extraído de múltiplos afídeos de cada grupo de tratamento e qPCR para quantificar níveis de Buchnera foi realizado como descrito no Exemplo anterior.
Tratamento com antibiótico administrado através de revestimento foliar retarda e trava a progressão do desenvolvimento de afídeos [00419] Afídeos LSR-1 de 1o instar foram divididos em dois grupos de tratamento separados como definido no Planejamento Experimental descrito aqui. Os afídeos foram monitorados diariamente e o número de afídeos em cada estágio de desenvolvimento foi determinado. Os afídeos colocados sobre folhas revestidas tratadas com controle começaram a alcançar a maturidade (estágio de 5° instar se reproduzindo; 5R) aproximadamente aos 6 dias (Fig. 6A). O desenvolvimento foi retardado em afídeos colocados sobre folhas revestidas com rifampicina, e pelos 6 dias de tratamento, a maior parte dos afídeos não maturou mais do que o estágio de 3o instar, mesmo após 12 dias, e o seu tamanho é drasticamente afetado (Figuras 6A e 6B).
[00420] Estes dados indicam que o revestimento foliar com rifampicina enfraqueceu o desenvolvimento dos afídeos.
Tratamento com antibiótico administrado através de revestimento foliar aumentou a mortalidade dos afídeos
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238/321 [00421] A taxa de sobrevivência de afídeos também foi medida durante os tratamentos de revestimento foliar. Os afídeos colocados sobre folhas revestidas com rifampicina exibiram menores taxas de sobrevivência do que afídeos colocados sobre folhas revestidas com o controle (Fig. 7). Estes dados indicam que o tratamento com rifampicina administrado através de revestimento foliar afetou a sobrevivência dos afídeos.
Tratamento com antibiótico administrado através de revestimento foliar decresceu Buchnera em afídeos [00422] Para testar se rifampicina administrada através de revestimento foliar resultou especificamente em perda de Buchnera em afídeos, e se esta perda teve impacto na aptidão dos afídeos, DNA foi extraído de afídeos em cada grupo de tratamento após 6 dias de tratamento e qPCR foi realizado para determinar os números de cópias de Buchnera/afídeo.
[00423] Afídeos colocados sobre folhas tratadas com controle exibiram razões elevadas de cópias de DNA de Buchnera/afídeo. Em contraste, afídeos colocados sobre folhas tratadas com rifampicina exibiram uma redução drástica de cópias de DNA de Buchnera/afídeo (Fig. 8), indicando que o tratamento de revestimento foliar com rifampicina eliminou Buchnera endossimbiótica.
[00424] Planejamento Experimental da Administração por Mlcroinjeção:
[00425] Microinjeção foi realizada usando o Injetor NanoJet III AutoNanoliter com a agulha de borossilicato puxada Internamente (Drummond Scientific; Cat# 3-000-203-G/XL). Afídeos (estirpe eNASCO, Acyrthosiphon pisum) cresceram em plantas de fava como descrito em um Exemplo anterior. Os afídeos são transferidos usando um pincel para um sistema de tubagem conectado a vácuo (Fig. 1C). O sítio da injeção se situou no tórax ventral do afídeo. As soluções de injeção
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239/321 consistiram em 0,025% de solvente tensoativo de organossilicone Silwet L-77 (Lehle Seeds, Cat No VIS-01) em água (controle negativo), ou 50 pg/mL de rifampicina formulada em solução de solvente. O volume de injeção foi 10 nL para ninfas e 20 nL para adultos (ambos a uma taxa de 2 nL/s). Cada grupo de tratamento teve aproximadamente o mesmo número de indivíduos injetados de cada uma das plantas da coleção. Após a injeção, os afídeos foram liberados em uma placa de Petri com folhas de fava, cujos caules estão em ágar 2%.
Tratamento por microinjeção com antibiótico decresceu Buchnera em afídeos [00426] Para testar se rifampicina administrada por microinjeção resulta em perda de Buchnera em afídeos, e se esta perda tem impacto na aptidão dos afídeos como demonstrado em Exemplos anteriores, DNA foi extraído de afídeos em cada grupo de tratamento após 4 dias de tratamento e qPCR foi realizado como descrito em um Exemplo anterior para determinar os números de cópias de Buchnera/afídeo.
[00427] Afídeos microinjetados com controle negativo exibiram razões elevadas de cópias de DNA de Buchnera/afídeo. Em contraste, ninfas e adultos de afídeos microinjetados com rifampicina exibiram uma redução drástica de cópias de DNA de Buchnera/afídeo (Fig. 9), indicando que o tratamento de microinjeção com rifampicina decresceu a presença de Buchnera endossimbiótica.
[00428] Planejamento Experimental da Administração Tópica: [00429] Afídeos (estirpe LSR-1, Acyrthosiphon pisum) cresceram em plantas de fava como descrito em um Exemplo anterior. Garrafas de pulverização foram cheias com 2 mL de soluções de controle (0,025% de Silwet L-77) ou rifampicina (50 pg/mL de em solução de solvente). Afídeos (número = 10) foram transferidos para a base de uma placa de Petri limpa e reunidos no canto da placa de Petri usando um pincel. Subsequentemente, os afídeos foram separados em dois
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240/321 coortes e pulverizados com ~100 pL de soluções de controle ou rifampicina. Imediatamente após a pulverização, a placa de Petri foi coberta com uma tampa. Cinco minutos após a pulverização, os afídeos foram liberados em uma placa de Petri com folhas de fava com caules em ágar 2%.
Tratamento por administração tópica de antibiótico decresceu Buchnera em afídeos [00430] Para testar se rifampicina administrada por administração tópica resulta em perda de Buchnera em afídeos, e se esta perda tem impacto na aptidão dos afídeos como demonstrado em Exemplos anteriores, DNA foi extraído de afídeos em cada grupo de tratamento após 3 dias de tratamento e qPCR como descrito em um Exemplo anterior foi realizado para determinar os números de cópias de Buchnera/afídeo.
[00431] Os afídeos pulverizados com a solução de controle exibiram razões elevadas de cópias de DNA de Buchnera/afídeo. Em contraste, afídeos pulverizados com rifampicina exibiram uma redução drástica de cópias de DNA de Buchnera/afídeo (Fig. 10), indicando que o tratamento com rifampicina administrada através do tratamento tópico decresce a presença de Buchnera endossimbiótica.
[00432] Método de injeção de foliar A - Perfusão e corte de folhas [00433] Planejamento Experimental:
[00434] Afídeos LSR-1 (que albergam apenas Buchnera), Acyrthosiphon pisum cresceram em plantas de fava (fava Vroma vicia de Johnny’s Selected Seeds) em um incubador de clima controlado (fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de escuridão; 60±5% de UR; 25±2°C). Antes de serem usadas para a criação de afídeos, plantas de fava foram cultivadas em solo envasado a 24°C com 16 h de luz e 8 h de escuridão. Para limitar efeitos matemos ou diferenças de saúde entre plantas, 5-10 adultos de diferentes plantas foram distribuídos entre 10
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241/321 plantas com duas semanas de idade, e deixados multiplicar para alta densidade durante 5-7 dias. Para as experiências, afídeos de primeiro e segundo instar foram recolhidos de plantas saudáveis e divididos em 2 grupos de tratamento diferentes: 1) controle negativo (folha injetada com água mais corantes alimentares azuis) e 2) folha injetada com 50 pg/mL de rifampicina em água mais corantes alimentares azuis. Cada grupo de tratamento recebeu aproximadamente o mesmo número de indivíduos de cada uma das plantas da coleção. Para o tratamento, solução de estoque de rifampicina (25 mg/mL em metanol 100%) foi diluída para 50 pg/mL em água mais corantes alimentares azuis. A solução foi então colocada em um tubo Eppendorf de 1,5 mL com um caule de fava submetido a perfusão com as soluções e a abertura do tubo foi fechada usando parafilme. Este sistema de alimentação foi então colocado em uma placa de Petri profunda (Fisher Scientific, Cat# FB0875711) e afídeos foram aplicados nas folhas da planta. Para cada tratamento, 74-81 afídeos foram colocados sobre cada folha. Os sistemas de alimentação foram mudados a cada 2-3 dias ao longo da experiência. Os afídeos foram monitorados diariamente quanto à sobrevivência e afídeos mortos foram removidos da placa de Petri profunda quando foram descobertos. Adicionalmente, o estágio do desenvolvimento (1o, 2o, 3o, 4°, 5o e 5R (5° que se reproduziu) instar) foi determinado diariamente ao longo da experiência.
Tratamento com antibiótico administrado através do método de injeção foliar A retarda e trava a progressão do desenvolvimento de afídeos [00435] Afídeos LSR-1 do 1o e 2o instar foram divididos em dois grupos de tratamento separados como definido em Planejamento Experimental do Método de injeção de foliar A - Perfusão e corte de folhas (descrito aqui). Os afídeos foram monitorados diariamente e o número de afídeos em cada estágio de desenvolvimento foi determinado. Os afídeos tratados com água mais corantes alimentares come
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242/321 çaram a alcançar a maturidade (estágio de 5o instar) aproximadamente aos 6 dias (Fig. 11). O desenvolvimento foi retardado em afídeos se alimentando em folhas injetadas com rifampicina, e pelos 6 dias de tratamento, a maior parte dos afídeos não maturou mais do que o estágio de 4o instar. Mesmo após 8 dias, o desenvolvimento de afídeos se alimentando em folhas injetadas com rifampicina foi drasticamente retardado (Fig. 11). Estes dados indicam que o tratamento com rifampicina via perfusão foliar enfraqueceu o desenvolvimento dos afídeos. Tratamento com antibiótico administrado através do método de injeção foliar A aumentou a mortalidade dos afídeos [00436] A taxa de sobrevivência de afídeos também foi medida durante as experiências de perfusão foliar. Afídeos colocados sobre folhas injetadas com rifampicina exibiram menores taxas de sobrevivência do que afídeos colocados sobre folhas injetadas com a solução de controle (Fig. 12). Estes dados indicam que o tratamento com rifampicina administrada através de injeção foliar afetou a sobrevivência dos afídeos.
Tratamento com antibiótico administrado através do método de injeção foliar A resulta em níveis decrescidos de Buchnera [00437] Para testar se rifampicina administrada via perfusão foliar resuita em perda de Buchnera em afídeos, e se esta perda tem impacto na aptidão dos afídeos como demonstrado em Exemplos anteriores, DNA foi extraído de afídeos em cada grupo de tratamento após 8 dias de tratamento e qPCR como descrito em um Exemplo anterior foi realizado para determinar os números de cópias de Buchnera/afídeo.
[00438] Afídeos se alimentando em folhas injetadas com a solução de controle exibiram razões elevadas de cópias de DNA de Buchnera/afídeo. Em contraste, afídeos se alimentando em folhas injetadas com rifampicina exibiram uma redução de cópias de DNA de Buchnera/afídeo (Fig. 13), indicando que o tratamento com rifampicina admi
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243/321 nistrada via injeção foliar decresce a presença de Buchnera endossimbiótica, como mostrado em Exemplos anteriores, e originou um decréscimo da aptidão.
Perfusão foliar e administração através da planta [00439] Planejamento Experimental:
[00440] Afídeos LSR-1 (que albergam apenas Buchnera), Acyrthosiphon pisum cresceram em plantas de fava (fava Vroma vicia de Johnny's Selected Seeds) em um incubador de clima controlado (fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de escuridão; 60±5% de UR; 25±2°C). Antes de serem usadas para a criação de afídeos, plantas de fava foram cultivadas em solo envasado a 24°C com 16 h de luz e 8 h de escuridão.
[00441] Para limitar efeitos matemos ou diferenças de saúde entre plantas, 5-10 adultos de diferentes plantas foram distribuídos entre 10 plantas com duas semanas de idade, e deixados multiplicar para alta densidade durante 5--7 dias. Para as experiências, afídeos de primeiro e segundo instar foram recolhidos de plantas saudáveis e divididos em 2 grupos de tratamento diferentes: 1) afídeos colocados sobre folhas injetadas com a solução de controle negativo (água e corantes alimentares) e colocados em um tubo Eppendorf com a solução de controle negativo, ou 2) afídeos colocados sobre folhas que foram injetadas com 100 ug/mL de rifampícina em água mais corantes alimentares e colocados em um tubo Eppendorf com 100 ug/mL de rifampícina em água. Cada grupo de tratamento recebeu aproximadamente o mesmo número de indivíduos de cada uma das plantas da coleção.
[00442] Para o tratamento, solução de estoque de rifampicina (25 mg/mL em metanol 100%) foi diluída para 100 pg/mL em água mais corantes alimentares azuis. A solução foi então colocada em um tubo Eppendorf de 1,5 mL com um caule de fava com uma folha também submetido a perfusão com as soluções e a abertura do tubo foi fecha
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244/321 da usando parafilme. Este sistema de alimentação foi então colocado em uma placa de Petri profunda (Fisher Scientific, Cat# FB0875711) e afídeos foram aplicados nas folhas da planta.
[00443] Para cada tratamento, 49-50 afídeos foram colocados sobre cada folha. Os sistemas de alimentação foram mudados a cada 2-3 dias ao longo da experiência. Os afídeos foram monitorados diariamente quanto à sobrevivência e afídeos mortos foram removidos da placa de Petri profunda quando foram descobertos.
[00444] Adicionalmente, o estágio do desenvolvimento (1o, 2o, 3o, 4o, 5o e 5R (5o que se reproduziu) instar) foi determinado diariamente ao longo da experiência.
Tratamento com antibiótico administrado através de injeção foliar e administração através da planta retarda e trava a progressão do desenvolvimento de afídeos [00445] Afídeos LSR-1 de 1o e 2° instar foram divididos em dois grupos de tratamento separados como definido em Planejamento Experimental de Perfusão foliar e administração através da planta (descrito aqui). Os afídeos foram monitorados diariamente e o número de afídeos em cada estágio de desenvolvimento foi determinado. Os afídeos tratados com a solução de controle (água mais corantes alimentares isoladamente) começaram a alcançar a maturidade (estágio de 5o instar) aproximadamente aos 6 dias (Fig. 14).
[00446] O desenvolvimento foi retardado em afídeos tratados com rifampicína, e pelos 6 dias de tratamento, a maior parte dos afídeos não maturou mais do que o estágio de 3o Instar. Mesmo após 8 dias, o seu desenvolvimento foi drasticamente retardado (Fig. 14). Estes dados indicam que o tratamento com rifampicína via perfusão foliar enfraqueceu o desenvolvimento dos afídeos.
[00447] Tratamento com antibiótico administrado através de injeção foliar e administração através da planta aumentou a mortalidade dos
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245/321 afídeos [00448] A taxa de sobrevivência de afídeos também foi medida durante as experiências em que afídeos foram tratados com solução de controle ou com rifampicina administradas via perfusão foliar e através da planta. Afídeos se alimentando em folhas submetidas a perfusão e tratadas com rifampicina exibiram menores taxas de sobrevivência do que afídeos se alimentando em folhas submetidas a perfusão e tratadas com a solução de controle (Fig. 15). Estes dados indicam que o tratamento com rifampicina administrada através de perfusão foliar e através da planta teve um impacto negativo na sobrevivência dos afídeos.
Tratamento com antibiótico administrado via injeção foliar e através da planta resulta em níveis decrescidos de Buchnera [00449] Para testar se rifampicina administrada via perfusão foliar e através da planta resulta em perda de Buchnera em afídeos, e se esta perda tem impacto na aptidão dos afídeos como demonstrado em Exemplos anteriores, DNA foi extraído de afídeos em cada grupo de tratamento após 6 e 8 dias de tratamento e qPCR foi realizado para determinar os números de cópias de Buchnera/afídeo, como descrito em Exemplos anteriores.
[00450] Afídeos se alimentando em folhas injetadas e tratadas com a solução de controle exibiram razões elevadas de cópias de DNA de Buchnera/afídeo. Em contraste, afídeos se alimentando em folhas submetidas a perfusão e tratadas com rifampicina exibiram uma redução estatisticamente significativa de cópias de DNA de Buchnera/afídeo em ambos os momentos (p-0,0037 e p™0,0025 para os dias 6 e 8, respectivamente) (Figuras 16A e 16B), indicando que o tratamento com rifampicina administrada via perfusão foliar e através da planta decresceu a presença de Buchnera endossimbiótica, e como mostrado em Exemplos anteriores, e originou um decréscimo da apti
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246/321 dão.
Método de administração de combinação [00451] Planejamento Experimental:
[00452] Afídeos LSR-1 (que albergam apenas Buchnera), Acyrthosiphon pisum cresceram em plantas de fava (fava Vroma vicia de Johnny’s Selected Seeds) em um incubador de clima controlado (fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de escuridão; 60±5% de UR; 20±2°C). Antes de serem usadas para a criação de afídeos, plantas de fava foram cultivadas em soio envasado a 24°C com 16 h de luz e 8 h de escuridão. Para limitar efeitos matemos ou diferenças de saúde entre plantas, 5-10 adultos de diferentes plantas foram distribuídos entre 10 plantas com duas semanas de idade e deixados multiplicar para alta densidade durante 5-7 dias.
[00453] Para as experiências, afídeos de primeiro e segundo instar foram recolhidos de plantas saudáveis e divididos em 2 grupos de tratamento diferentes: 1) tratamento com soluções de controle de SilwetL77 ou água ou 2) tratamento com rifampicina diluída em Silwet L-77 ou água. Cada grupo de tratamento recebeu aproximadamente o mesmo número de indivíduos de cada uma das plantas da coleção. A combinação de métodos de administração foi a seguinte: a) Administração tópica a afídeo e planta por pulverização de 0,025% de solvente de tensoativo de organossilicone não iônico Silwet L-77 (controle negativo) ou 100 pg/mL de rifampicina formulada em solução de solvente usando uma garrafa de pulverização de 30 mL e b) Administração através da planta com água (controle negativo) ou com 100 pg/mL de rifampicina formulada em água. Para o tratamento, solução de estoque de rifampicina (25 mg/mL em metanol 100%) foi diluída para 100 pg/mL em Silwet L-77 (para tratamento tópico em afídeo e revestimento da folha) ou água (para administração através da planta). A solução foi então colocada em um tubo Eppendorf de 1,5 mL com um caule de
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247/321 fava com uma folha também submetido a perfusão com as soluções e a abertura do tubo foi fechada usando parafilme. Este sistema de alimentação foi então colocado em uma placa de Petri profunda (Fisher Scientific, Cat# FB0875711) e afídeos foram aplicados nas folhas da planta.
[00454] Para cada tratamento, 76-80 afídeos foram colocados sobre cada folha. Os sistemas de alimentação foram mudados a cada 2-3 dias ao longo da experiência. Os afídeos foram monitorados diariamente quanto à sobrevivência e afídeos mortos foram removidos da placa de Petri profunda quando foram descobertos.
[00455] Adicionalmente, o estágio do desenvolvimento (1o, 2o, 3o, 4°, 5o e 5R (5o que se reproduziu) instar) foi determinado diariamente ao longo da experiência.
Tratamento de combinação com antibiótico retarda o desenvolvimento de afídeos [00456] Afídeos LSR-1 de 1o e 2o instar foram divididos em dois grupos de tratamento separados como definido em Planejamento Experimental do Método de administração de combinação (descrito aqui). Os afídeos foram monitorados diariamente e o número de afídeos em cada estágio de desenvolvimento foi determinado. Afídeos tratados com controle começaram a alcançar a maturidade (estágio de 5o instar) aproximadamente aos 6 dias (Fig. 17). O desenvolvimento foi retardado em afídeos tratados com rifampicina, e pelos 6 dias de tratamento, a maior parte dos afídeos não maturou mais do que o estágio de 3o instar, mesmo após 7 dias o seu desenvolvimento foi drasticamente retardado (Fig. 17). Estes dados indicam que uma combinação de tratamentos com rifampicina enfraqueceu o desenvolvimento dos afídeos.
Tratamento de combinação com antibiótico resulta em mortalidade aumentada dos afídeos [00457] A taxa de sobrevivência de afídeos também foi medida du
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248/321 rante as experiências em que afídeos foram tratados com uma combinação de tratamentos com rifampicina. Afídeos tratados com rifampicina exibiram taxas de sobrevivência ligeiramente menores do que afídeos tratados com soluções de controle (Fig. 18). Estes dados indicam que o tratamento com rifampicina administrada através de uma combinação de tratamentos afetou a sobrevivência dos afídeos.
Tratamento de combinação com antibiótico resultou em níveis decrescidos de Buchnera [00458] Para testar se rifampicina administrada via uma combinação de métodos resulta em perda de Buchnera em afídeos, e se esta perda tem impacto na aptidão dos afídeos como demonstrado em Exemplos anteriores, DNA foi extraído de afídeos em cada grupo de tratamento após 7 dias de tratamento e qPCR como descrito em um Exemplo anterior foi realizado para determinar os números de cópias de Buchnera/afídeo.
[00459] Os afídeos tratados com as soluções de controle exibiram razões elevadas de cópias de DNA de Buchnera/afídeo. Em contraste, afídeos tratados com rifampicina exibiram uma redução drástica e estatisticamente significativa de cópias de DNA de Buchnera/afídeo (P”0,227; Fig. 19), indicando que o tratamento com rifampicina administrada via uma combinação de métodos decresce a presença de Buchnera endosslmbiótica, e como mostrado em Exemplos anteriores, isto originou um decréscimo da aptidão.
[00460] Em conjunto, estes dados descritos nos Exemplos anteriores demonstraram a capacidade para matar e decrescer o desenvolvimento, capacidade reprodutiva, longevidade, e populações bacterianas endógenas, por exemplo, aptidão, de afídeos por tratamento dos mesmos com um antibiótico através de múltiplos métodos de administração.
Exemplo 15: Insetos tratados com um polissacarídeo antimicrobiano natural
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249/321 [00461] Este Exemplo demonstra o tratamento de afídeos com Quitosana, um polissacarídeo linear catiônico natural de beta-1,4-Dglucosamina desacetilada derivado de quitina. Quitina é o elemento estrutural do exoesqueleto de insetos, crustáceos (maioritariamente camarões e caranguejos) e paredes celulares de fungos, e o segundo polissacarídeo natural mais abundante após celulose. Este Exemplo demonstra que o efeito de quitosana em insetos foi mediado através da modulação de populações bacterianas endógenas ao inseto que foram sensíveis à quitosana. Uma estirpe bacteriana visada é Buchnera aphidicola.
Planejamento Terapêutico [00462] A solução de quitosana foi formulada usando uma combinação de perfusão foliar e administração através das plantas (Fig. 20). A solução de controle foi injetada em folhas com água + corantes alimentares azuis e água no tubo. A solução de tratamento com 300 ug/mL de quitosana em água (baixo peso molecular) via injeção foliar (com corantes alimentares azuis) e através da planta (em tubo Eppendorf).
[00463] Planejamento Experimental de Perfusão foliar-Administração em Plantas:
[00464] Afídeos LSR-1 (que albergam apenas Buchnera), Acyrthosiphon pisum cresceram em plantas de fava (fava Vroma vicia de Johnny's Selected Seeds) em um incubador de clima controlado (fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de escuridão; 60±5% de UR; 25±2°C). Antes de serem usadas para a criação de afídeos, plantas de fava foram cultivadas em solo envasado a 24°C com 16 h de luz e 8 h de escuridão. Para limitar efeitos matemos ou diferenças de saúde entre plantas, 5-10 adultos de diferentes plantas foram distribuídos entre 10 plantas com duas semanas de idade e deixados multiplicar para alta densidade durante 5-7 dias. Para as experiências, afídeos de primeiro
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250/321 e segundo instar foram recolhidos de plantas saudáveis e divididos em 2 grupos de tratamento diferentes: 1) controle negativo (tratado com água), 2) A solução de tratamento incluiu 300 ug/mL de quitosana em água (baixo peso moiecular). Cada grupo de tratamento recebeu aproximadamente o mesmo número de indivíduos de cada uma das plantas da coleção.
[00465] Solução de estoque de quitosana (Sigma, número do catálogo 448869-50G) foi preparada a 1% em ácido acético, submetida a autoclavagem esterilizada, e armazenada a 4°C. Para o tratamento (ver Planejamento terapêutico), a quantidade apropriada de solução de estoque foi diluída com água para se obter a concentração de tratamento final de quitosana. A solução foi então colocada em um tubo Eppendorf de 1,5 mL com um caule de fava com uma folha também submetido a perfusão com as soluções e a abertura do tubo foi fechada usando parafilme. Este sistema de alimentação foi então colocado em uma placa de Petri profunda (Fisher Scientific, Cat# FB0875711) e afídeos foram aplicados nas folhas da planta.
[00466] Para cada tratamento, 50-51 afídeos foram colocados sobre cada folha. Os sistemas de alimentação foram mudados a cada 2-3 dias ao longo da experiência. Os afídeos foram monitorados diariamente quanto à sobrevivência e afídeos mortos foram removidos da placa de Petri profunda quando foram descobertos.
[00467] Adicionalmente, o estágio do desenvolvimento (1o, 2o, 3o, 4o, 5o e 5R (5o que se reproduziu) instar) foi determinado diariamente ao longo da experiência.
[00468] Após 8 dias de tratamento, DNA foi extraído de múltiplos afídeos de cada grupo de tratamento. Em resumo, a superfície corporal do afídeo foi esterilizada por imersão do afídeo em uma solução de lixívia 6% durante aproximadamente 5 segundos. Os afídeos foram então enxaguados em água esterilizada e DNA foi extraído de cada
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251/321 afídeo individual usando um kit de extração de DNA (Qiagen, kit DNeasy) de acordo com instruções do fabricante. A concentração de DNA foi medida usando uma quantificação de ácido nucleico por NanoDrop, e os números de cópias de DNA de Buchnera e afídeo foram medidos por qPCR. Os iniciadores usados para Buchnera foram BuchjgroES_J8F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 240) e Buch_groES__98R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO:
241) (Chong e Moran, 2016 PNAS). Os iniciadores usados para afídeo foram ApEFIa 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG: SEQ ID NO:
242) e ApEFIa 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO:
243) (Chong e Moran, 2016 PNAS). qPCR foi realizado usando uma rampa de amplificação de qPCR de 1,6 grau C/s e as seguintes condições: 1) 95°C durante 10 minutos, 2) 95°C durante 15 segundos, 3) 55°C durante 30 segundos, 4) repetir os passos 2-3 40x, 5) 95°C durante 15 segundos, 6) 55°C durante 1 minuto, 7) alteração da rampa para 0,15 grau C/s, 8) 95°C durante 1 segundo. Os dados de qPCR foram analisados usando software analítico (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).
[00469] Ocorreu uma resposta negativa na aptidão de insetos por tratamento com o polissacarídeo antimicrobiano natural [00470] Afídeos A. pisum LSR-1 de 1o e 2o instar foram divididos em dois grupos de tratamento separados como definido em Planejamento Experimental (acima). Os afídeos foram monitorados diariamente e o número de afídeos em cada estágio de desenvolvimento foi determinado. Os afídeos tratados com o controle negativo isoladamente começaram a alcançar a maturidade (estágio de 5o instar) aproximadamente aos 6 dias (Fig. 21). O desenvolvimento foi retardado em afídeos tratados com solução de quítosana, e pelos 6 dias de tratamento com quítosana, a maior parte dos afídeos não maturou mais do que o estágio de 4o instar. Estes dados indicam que o tratamento com quito
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252/321 sana retardou e travou a progressão do desenvolvimento de afídeos. Tratamento com quitosana aumentou a mortalidade dos afídeos [00471] A taxa de sobrevivência de afídeos também foi medida durante os tratamentos. A maior parte dos afídeos tratados com o controle isoladamente estavam vivos aos 3 dias pós-tratamento (Fig. 22). Após 4 dias, os afídeos começaram gradualmente a morrer, e alguns sobreviveram para além de 7 dias pós-tratamento.
[00472] Em contraste, afídeos tratados com solução de quitosana exibiram menores taxas de sobrevivência do que afídeos tratados com controle. Estes dados indicam que ocorreu um decréscimo da sobrevivência por tratamento com o polissacarídeo antimicrobiano natural. Tratamento com quitosana decresceu Buchnera em afídeos [00473] Para testar se o tratamento com solução de quitosana resultou especificamente em perda de Buchnera em afídeos, e se esta perda teve impacto na aptidão dos afídeos, DNA foi extraído de afídeos em cada grupo de tratamento após 8 dias de tratamento e qPCR foi realizado para determinar os números de cópias de Buchnera/afídeo. Os afídeos tratados com controle isoladamente exibiram razões elevadas de cópias de DNA de Buchnera/afídeo. Em contraste, afídeos tratados com 300 ug/mL de quitosana em água exibiram -2-5 vezes menos cópias de DNA de Buchnera/afídeo (Fig. 23), indicando que o tratamento com quitosana decresceu níveis de Buchnera.
[00474] Em conjunto, estes dados descritos previamente demonstraram a capacidade para matar e decrescer o desenvolvimento, longevidade, e populações bacterianas endógenas, por exemplo, aptidão, de afídeos por tratamento dos mesmos com um polissacarídeo antimicrobiano natural.
Exemplo 16: Insetos tratados com nisina, um peptídeo antimicrobiano natural [00475] Este Exemplo demonstra o tratamento de afídeos com o
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253/321 peptídeo antibacteriano policíclico, de largo espectro”, natural produzido pela bactéria Lactococcus lactis que é habitualmente usado como conservante alimentar. A atividade antibacteriana de nisina é mediada através da sua capacidade para gerar poros na membrana de células bacterianas e interromper a biossíntese de paredes de células bacterianas através de uma interação específica com lipídeo II. Este Exemplo demonstra que o efeito negativo de nisina na aptidão de insetos é mediado através da modulação de populações bacterianas endógenas ao inseto que foram sensíveis à nisina. Uma estirpe bacteriana visada é Buchnera aphídicola.
[00476] Planejamento Terapêutico:
[00477] Nisina foi formulada usando uma combinação de perfusão foliar e administração através de plantas. A solução de controle (água) ou solução de tratamento (nisina) foi injetada na folha e colocada no tubo Eppendorf. As soluções de tratamento consistiram em 1,6 ou 7 mg/mL de nisina em água.
[00478] Planejamento Experimental de Perfusão foliar-Administração em Plantas:
[00479] Afídeos LSR-1, Acyrthosiphon pisum cresceram em plantas de fava (fava Vroma vicia de Johnny's Selected Seeds) em um incubador de clima controlado (fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de escuridão; 60±5% de UR; 25±2°C). Antes de serem usadas para a criação de afídeos, plantas de fava foram cultivadas em solo envasado a 24°C com 16 h de luz e 8 h de escuridão. Para limitar efeitos maternos ou diferenças de saúde entre plantas, 5-10 adultos de diferentes plantas foram distribuídos entre 10 plantas com duas semanas de idade, e deixados multiplicar para alta densidade durante 5-7 dias. Para as experiências, afídeos de primeiro e segundo instar foram recolhidos de plantas saudáveis e divididos em 2 grupos de tratamento diferentes: 1) controle negativo (tratado com água), 2) tratado com nisina com 1,6
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254/321 ou 7 mg/mL de nisina em água. Cada grupo de tratamento recebeu aproximadamente o mesmo número de indivíduos de cada uma das plantas da coleção.
[00480] Para o tratamento (ver Planejamento terapêutico), solução de nisina (Sigma, número do produto: N5764) foi preparada a 1,6 ou 7 mg/mL (p/v) em água e filtrada de modo esterilizado usando um filtro de seringa de 0,22 um. A solução foi então injetada na folha da planta e o caule da planta foi colocado em um tubo Eppendorf de 1,5 mL. A abertura do tubo foi fechada usando parafilme. Este sistema de alimentação foi então colocado em uma placa de Petri profunda (Fisher Scientific, Cat# FB0875711) e afídeos foram aplicados nas folhas da planta.
[00481] Para cada tratamento, 56-59 afídeos foram colocados sobre cada folha. Os sistemas de alimentação foram mudados a cada 2-3 dias ao longo da experiência. Os afídeos foram monitorados diariamente quanto à sobrevivência e afídeos mortos foram removidos da placa de Petri profunda quando foram descobertos.
[00482] Adicionalmente, o estágio do desenvolvimento (1o, 2o, 3o, 4o, 5o e 5R (afídeos de 5o instar que estão se reproduzindo) instar) foi determinado diariamente ao longo da experiência.
[00483] Após 8 dias de tratamento, DNA foi extraído dos afídeos remanescentes em cada grupo de tratamento. Em resumo, a superfície corporal do afídeo foi esterilizada por imersão do afídeo em uma solução de lixívia 6% durante aproximadamente 5 segundos. Os afídeos foram então enxaguados em água esterilizada e DNA foi extraído de cada afídeo individual usando um kit de extração de DNA (Qiagen, kit DNeasy) de acordo com instruções do fabricante. A concentração de DNA foi medida usando uma quantificação de ácido nuclelco por NanoDrop, e os números de cópias de DNA de Buchnera e afídeo foram medidos por qPCR. Os íniciadores usados para Buchnera foram
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BuchjgroES_J8F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG: SEQ ID NO: 240) e Buch....groES„98R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO:
241) (Chong e Moran, 2016 PNAS). Os iniciadores usados para afídeo foram ApEFIa 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG; SEQ ID NO:
242) e ApEFIa 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO:
243) (Chong e Moran, 2016 PNAS). qPCR foi realizado usando uma rampa de amplificação de qPCR de 1,6 grau C/s e as seguintes condições: 1) 95°C durante 10 minutos, 2) 95°C durante 15 segundos, 3) 55°C durante 30 segundos, 4) repetir os passos 2-3 40x, 5) 95°C durante 15 segundos, 6) 55°C durante 1 minuto, 7) alteração da rampa para 0,15 grau C/s, 8) 95°C durante 1 segundo. Os dados de qPCR foram analisados usando software analítico (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).
Ocorreu uma resposta negativa dependente da dose na aptidão de insetos por tratamento com nisina [00484] Afídeos A. pisum LSR-1 de 1o e 2o instar foram divididos em três grupos de tratamento separados como definido em Planejamento Experimental (acima). Os afídeos foram monitorados diariamente e o número de afídeos em cada estágio de desenvolvimento foi determinado. Os afídeos tratados com a solução de controle negativo (água) começaram a alcançar a maturidade (estágio de 5o instar) aproximadamente aos 6 dias, e a se reproduzir (estágio 5R) pelos 7 dias (Fig. 24). O desenvolvimento foi seriamente retardado em afídeos tratados com 7 mg/mL de nisina. Os afídeos tratados com 7 mg/mL de nisina isoladamente se desenvolveram até ao estágio de 2o instar pelo dia 3, e pelo dia 6 todos os afídeos do grupo estavam mortos (Fig. 24). O desenvolvimento foi ligeiramente retardado em afídeos tratados com a menor concentração de nisina (1,6 mg/mL) e, em cada momento avaliado, havia mais afídeos menos desenvolvidos em comparação com controles tratados com água (Fig. 24). Estes dados indicam que o tra
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256/321 tamento com nisina retardou e travou a progressão do desenvolvimento de afídeos e este retardamento do desenvolvimento dependeu da dose de nisina administrada.
[00485] No entanto, é importante notar que o tratamento com 7 mg/mL de nisina também teve um impacto negativo na saúde das folhas usadas no ensaio. Pouco tempo após perfusão foliar de 7 mg/mL de nisina, começaram a ficar marrons. Após dois dias, as folhas submetidas à perfusão com 7 mg/mL ficaram negras. Não houve nenhuma diferença digna de nota na condição das folhas tratadas com 1,6 mg/mL de nisina.
Tratamento com nisina resultou em mortalidade dos afídeos aumentada [00486] A taxa de sobrevivência de afídeos também foi medida durante os tratamentos. Aproximadamente 50% de afídeos tratados com o controle Isoladamente sobreviveram à experiência de 8 dias (Fig. 25). Em contraste, a sobrevivência foi significativamente menor para afídeos tratados com 7 mg/mL de nisina (p<0,0001, pelo teste de LogRank de Mantel Cox), e todos os afídeos neste grupo sucumbiram ao tratamento pelos 6 dias (Fig. 25). Os afídeos tratados com a dose menor de nisina (1,6 mg/mL) exibiram mortalidade mais elevada em comparação com afídeos tratados com controle, apesar de a diferença não ter alcançado significância estatística (p™0,0501 pelo teste de LogRank de Mantel Cox). Estes dados indicam que ocorreu um decréscimo dependente da dose da sobrevivência por tratamento com nisina. Tratamento com nisina resultou em Buchnera decrescida em afídeos [00487] Para testar se o tratamento com nisina resultou especificamente em perda de Buchnera em afídeos, e se esta perda teve impacto na aptidão dos afídeos, DNA foi extraído de afídeos em cada grupo de tratamento após 8 dias de tratamento e qPCR foi realizado para determinar os números de cópias de Buchnera/afídeo. Os afídeos tratados com controle isoladamente exibiram razões elevadas de cópias
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257/321 de DNA de Buchnera/afídeo. Em contraste, afídeos tratados com 1,6 mg/mL de nísina exibiram --1,4 vezes menos cópias de DNA de Buchnera/afídeo após 8 dias de tratamento (Fig. 26). Nenhuns afídeos estavam vivos no grupo tratado com 7 mg/mL de nísina, e consequentemente, cópias de DNA de Buchnera/afídeo não foram avaliadas neste grupo. Estes dados indicam que o tratamento com nisina decresceu níveis de Buchnera.
[00488] Em conjunto, estes dados descritos previamente demonstram a capacidade para matar e decrescer o desenvolvimento, longevidade, e populações bacterianas endógenas, por exemplo, aptidão, de afídeos por tratamento dos mesmos com o peptídeo antimicrobiano nisina.
Exemplo 17: Insetos tratados com ácido levulínico decresce a aptidão dos insetos [00489] Este Exemplo demonstra que o tratamento de afídeos com ácido levulínico, um cetoácido produzido por aquecimento de um carboidrato com hexose (por exemplo, madeira, amido, trigo, palha, ou cana-de-açúcar) com a adição de um ácido mineral diluído, reduz a aptidão dos insetos. O ácido levulínico foi previamente testado como agente antimicrobiano contra Escherichia coli e Salmonella na produção de carne (Carpenter et al., 2010, Meat Science; Savannah G. Hawkins, 2014, tese de Licenciatura da Universidade do Tennessee). Este Exemplo demonstra que o efeito de ácido levulínico em insetos foi mediado através da modulação de populações bacterianas endógenas aos insetos que foram sensíveis ao ácido levulínico. Uma estirpe bacteriana visada é Buchnera aphidicola.
[00490] Planejamento Terapêutico:
[00491] O ácido levulínico foi formulado usando uma combinação de perfusão foliar e administração através das plantas. A solução de controle foi injetada em folhas com água e água foi colocada no tubo
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Eppendorf. As soluções de tratamento incluíram ácido levulínico 0,03 ou 0,3% em água via injeção foliar e através da planta (em tubo Eppendorf).
Perfusão foliar-Administração em Plantas [00492] Planejamento Experimental:
[00493] Afídeos eNASCO, Acyrthosiphon pisum cresceram em plantas de fava (fava Vroma vicia de Johnny's Selected Seeds) em um incubador de clima controlado (fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de escuridão; 60±5% de UR; 25±2°C). Antes de serem usadas para a criação de afídeos, plantas de fava foram cultivadas em solo envasado a 24°C com 16 h de luz e 8 h de escuridão. Para limitar efeitos maternos ou diferenças de saúde entre plantas, 5-10 adultos de diferentes plantas foram distribuídos entre 10 plantas com duas semanas de idade, e deixados multiplicar para alta densidade durante 5-7 dias. Para as experiências, afídeos de primeiro e segundo instar foram recolhidos de plantas saudáveis e divididos em 2 grupos de tratamento diferentes: 1) controle negativo (tratado com água), 2) A solução de tratamento incluiu ácido levulínico 0,03 ou 0,3% em água. Cada grupo de tratamento recebeu aproximadamente o mesmo número de indivíduos de cada uma das plantas da coleção.
[00494] Para o tratamento (ver Planejamento terapêutico), ácido levulínico (Sigma, número do produto: W262706) foi diluído para 0,03 ou 0,3% em água. A solução foi então colocada em um tubo Eppendorf de 1,5 mL com um caule de fava com uma folha também submetido a perfusão com as soluções e a abertura do tubo foi fechada usando parafilme. Este sistema de alimentação foi então colocado em uma placa de Petri profunda (Fisher Scientific, Cat# FB0875711) e afídeos foram aplicados nas folhas da planta.
[00495] Para cada tratamento, 57-59 afídeos foram colocados sobre cada folha. Os sistemas de alimentação foram mudados a cada 2-3
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259/321 dias ao longo da experiência. Os afídeos foram monitorados diariamente quanto à sobrevivência e afídeos mortos foram removidos da placa de Petrí profunda quando foram descobertos.
[00496] Adicionalmente, o estágio do desenvolvimento (1o, 2o, 3o, 4o e 5o instar) foi determinado diariamente ao longo da experiência.
[00497] Após 7 de tratamento, DNA foi extraído dos afídeos remanescentes em cada grupo de tratamento. Em resumo, a superfície corporal do afídeo foi esterilizada por imersão do afídeo em uma solução de lixívia 6% durante aproximadamente 5 segundos. Os afídeos foram então enxaguados em água esterilizada e DNA foi extraído de cada afídeo individual usando um kit de extração de DNA (Qiagen, kit DNeasy) de acordo com instruções do fabricante. A concentração de DNA foi medida usando uma quantificação de ácido nucleico por NanoDrop, e os números de cópias de DNA de Buchnera e afídeo foram medidos por qPCR. Os iniciadores usados para Buchnera foram Buch groES_18F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 240) e Buch groESJJSR (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO: 241) (Chong e Moran, 2016 PNAS). Os iniciadores usados para afídeo foram ApEFIa 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG; SEQ ID NO: 242) e ApEFIa 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO: 243) (Chong e Moran, 2016 PNAS). qPCR foi realizado usando uma rampa de amplificação de qPCR de 1,6 grau C/s e as seguintes condições: 1) 95°C durante 10 minutos, 2) 95°C durante 15 segundos, 3) 55°C durante 30 segundos, 4) repetir os passos 2-3 40x, 5) 95°C durante 15 segundos, 6) 55°C durante 1 minuto, 7) alteração da rampa para 0,15 grau C/s, 8) 95°C durante 1 segundo. Os dados de qPCR foram analisados usando software analítico (Thermo Fisher Scientific, QuantStudlo Design and Analysis).
[00498] Ocorreu uma resposta negativa dependente da dose na aptidão de insetos por tratamento com ácido levuiínico
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260/321 [00499] Afídeos eNASCO A. pisum de 1o e 2o instar foram divididos em três grupos de tratamento separados como definido em Planejamento Experimental (acima). Os afídeos foram monitorados diariamente e o número de afídeos em cada estágio de desenvolvimento foi determinado. Os afídeos tratados com o controle negativo isoladamente começaram a alcançar a maturidade (estágio de 5o instar) aproximadamente aos 7 dias (Fig. 27). O desenvolvimento foi retardado em afídeos tratados com ácido levulínico e, pelos 11 dias pós-tratamento, quase todos os afídeos tratados com controle alcançaram a maturidade ao passo que ~23 e 63% dos afídeos tratados com ácido levulínico 0,03 e 0,3%, respectivamente, não maturaram para além do estágio de 4o instar. Estes dados indicam que o tratamento com ácido levulínico retardou e travou a progressão do desenvolvimento de afídeos e este retardamento do desenvolvimento depende da dose de ácido levulínico administrada.
Tratamento com ácido levulínico resulta em mortalidade dos afídeos aumentada [00500] A taxa de sobrevivência de afídeos também foi medida durante os tratamentos. Aproximadamente 50% de afídeos tratados com o controle isoladamente sobreviveram à experiência de 11 dias (Fig. 28). Em contraste, a sobrevivência foi significativamente menor para afídeos tratados com ácido levulínico 0,3% (p<0,01). Os afídeos tratados com a dose baixa de ácido levulínico (0,03%) exibiram mortalidade mais elevada em comparação com afídeos tratados com controle, apesar de a diferença não ter alcançado significância estatística. Estes dados indicam que ocorreu um decréscimo dependente da dose da sobrevivência por tratamento com ácido levulínico.
Tratamento com ácido levulínico resulta em Buchnera decrescida em afídeos [00501] Para testar se o tratamento com ácido levulínico resultou
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261/321 especificamente em perda de Buchnera em afídeos, e se esta perda teve impacto na aptidão dos afídeos, DNA foi extraído de afídeos em cada grupo de tratamento após 7 dias de tratamento e qPCR foi realizado para determinar os números de cópias de Buchnera/afídeo. Os afídeos tratados com controle isoladamente exibiram razões elevadas de cópias de DNA de Buchnera/afídeo. Em contraste, afídeos tratados com ácido levulínico 0,03 ou 0,3% em água exibiram ~6 vezes menos cópias de DNA de Buchnera/afídeo após 7 dias de tratamento (Fig. 29, painel da esquerda). Estes dados indicam que o tratamento com ácido levulínico decresceu níveis de Buchnera.
[00502] Em conjunto, estes dados descritos previamente demonstraram a capacidade para matar e decrescer o desenvolvimento, longevidade, e populações bacterianas endógenas, por exemplo, aptidão, de afídeos por tratamento dos mesmos com ácido levulínico.
Exemplo 18: Insetos tratados com uma solução de metabólito secundário derivado de planta [00503] Este Exemplo demonstra o tratamento de afídeos com ácido gossipol-acético, um fenol natural derivado da planta do algodão (gênero Gossypium) que permeia células e atua como inibidor para várias enzimas desidrogenase. Este Exemplo demonstra que o efeito de gossipol em insetos foi mediado através da modulação de populações bacterianas endógenas ao inseto que foram sensíveis ao gossipol. Uma estirpe bacteriana visada é Buchnera aphidicola.
[00504] Planejamento Terapêutico: A solução de gossipol foi formulada dependendo do método de administração:
[00505] Através das plantas: com 0 (controle negativo) ou 0,5%, 0,25%, e 0,05% de gossipol formulado em uma dieta artificial (com base em Akey e Beck, 1971; ver Planejamento Experimental) sem aminoácidos essenciais (histidina, isoleucina, leucina, Usina, metionina, fenilalanina, treonina, triptofano e valina).
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262/321 [00506] Microinjeção: soluções de injeção consistiram em 0,5% de gossipol ou dieta artificial isoladamente (controle negativo).
[00507] Planejamento Experimental da Administração em Plantas: [00508] Afídeos (estirpes eNASCO (que albergam simbiontes primários e secundários de Buchnera e Serratia, respectivamente) ou LSR-1 (que albergam apenas Buchnera), Acyrthosiphon pisum) cresceram em plantas de fava (fava Vroma vicia de Johnny's Selected Seeds) em um incubador de clima controlado (fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de escuridão; 60±5% de UR; 25±2°C). Antes de serem usadas para a criação de afídeos, plantas de fava foram cultivadas em solo envasado a 24°C com 16 h de luz e 8 h de escuridão. Para limitar efeitos maternos ou diferenças de saúde entre plantas, 5-10 adultos de diferentes plantas foram distribuídos entre 10 plantas com duas semanas de idade, e deixados multiplicar para alta densidade durante 5-7 dias. Para as experiências, afídeos de primeiro e segundo instar foram recolhidos de plantas saudáveis e divididos em 4 grupos de tratamento diferentes: 1) dieta artificial isoladamente sem aminoácidos essenciais, 2) dieta artificial isoladamente sem aminoácidos essenciais e 0,05% de gossipol, 3) dieta artificial isoladamente sem aminoácidos essenciais e 0,25% de gossipol, e 4) dieta artificial isoladamente sem aminoácidos essenciais e 0,5% de gossipol. Cada grupo de tratamento recebeu aproximadamente o mesmo número de indivíduos de cada uma das plantas da coleção.
[00509] A dieta artificial usada foi preparada como previamente publicado (Akey e Beck, 1971 Continuous Rearing of the Pea Aphid, Acyrthosiphon pisum, on a Holidic Diet), com e sem os aminoácidos essenciais (2 mg/mL de histidina, 2 mg/mL de isoieucina, 2 mg/mL de leucina, 2 mg/mL de lisina, 1 mg/mL de metlonlna, 1,62 mg/mL de fenilalanina, 2 mg/mL de treonina, 1 mg/mL de triptofano e 2 mg/mL de valina), com a exceção de nenhuma dieta incluir homosserina ou beta
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263/321 alaniltirosina. 0 pH das dietas foi ajustado para 7,5 com KOH e as dietas foram filtradas de modo esterilizado através de um filtro de 0,22 pm e armazenadas a 4°C durante um curto período (<7 dias) ou a -80°C durante um período longo.
[00510] Solução de estoque de ácido gossipol-acético (Sigma, Cat#G4382~250MG) foi preparada a 5% em metanol e esterilizada por passagem através de um filtro de seringa de 0,22 pm, e armazenada a 4°C. Para os tratamentos (ver Planejamento terapêutico), a quantidade apropriada de solução de estoque foi adicionada à dieta artificial para se obterem as diferentes concentrações finais de gossipol. A dieta foi então colocada em um tubo Eppendorf de 1,5 mL com um caule de fava com uma folha e a abertura do tubo foi fechada usando parafilme. Este sistema de alimentação foi então colocado em uma placa de Petri profunda (Fisher Scientific, Cat# FB0875711) e afídeos foram aplicados nas folhas da planta.
[00511] Para cada tratamento, 15-87 afídeos foram colocados sobre cada folha. Os sistemas de alimentação com dieta artificial foram mudados a cada 2-3 dias ao longo da experiência. Os afídeos foram monitorados diariamente quanto à sobrevivência e afídeos mortos foram removidos da placa de Petri profunda alojando o sistema de alimentação artificial quando foram descobertos.
[00512] Adicionalmente, o estágio do desenvolvimento (1o, 2o, 3o, 4°, 5o e 5R (5° que se reproduziu) instar) foi determinado diariamente ao longo da experiência. Assim que um afídeo alcançou o estágio de 4o instar, os afídeos receberam o seu próprio sistema de alimentação artificial em uma placa de Petri profunda de modo que a fecundidade pôde ser monitorada assim que alcançaram a fase adulta.
[00513] Para afídeos adultos, ninfas novas foram contadas diariamente e então descartadas. No final das experiências, a fecundidade foi medida de dois modos: 1) o dia médio a que a primeira progênie
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264/321 para o grupo de tratamento foi determinada e 2) o número médio de progênie produzida diariamente assim que o afídeo alcançou a fase adulta. Fotos de afídeos foram tiradas ao longo da experiência para avaliar diferenças de tamanho entre grupos de tratamento.
[00514] Após 5 ou 13 dias de tratamento, DNA foi extraído de múltiplos afídeos de cada grupo de tratamento. Em resumo, a superfície corporal do afídeo foi esterilizada por imersão do afídeo em uma solução de lixívia 6% durante aproximadamente 5 segundos. Os afídeos foram então enxaguados em água esterilizada e DNA foi extraído de cada afídeo individual usando um kit de extração de DNA (Qiagen, kit DNeasy) de acordo com instruções do fabricante. A concentração de DNA foi medida usando uma quantificação de ácido nucleico por NanoDrop, e os números de cópias de DNA de Buchnera e afídeo foram medidos por qPCR. Os iniciadores usados para Buchnera foram BuchjgroES_J8F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 240) e Buch_groES__98R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO:
241) (Chong e Moran, 2016 PNAS). Os iniciadores usados para afídeo foram ApEFIa 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG: SEQ ID NO:
242) e ApEFIa 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO:
243) (Chong e Moran, 2016 PNAS). qPCR foi realizado usando uma rampa de amplificação de qPCR de 1,6 grau C/s e as seguintes condições: 1) 95°C durante 10 minutos, 2) 95°C durante 15 segundos, 3) 55°C durante 30 segundos, 4) repetir os passos 2-3 40x, 5) 95°C durante 15 segundos, 6) 55°C durante 1 minuto, 7) alteração da rampa para 0,15 grau C/s, 8) 95°C durante 1 segundo. Os dados de qPCR foram analisados usando software analítico (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).
[00515] Ocorreu uma resposta negativa dependente da dose na aptidão de insetos por tratamento com o aleloquímico gossipol [00516] Afídeos eNASCO e LSR-1 A. pisum de 1o e 2o instar foram
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265/321 divididos em quatro grupos de tratamento separados como definido em Planejamento Experimental (descrito aqui). Os afídeos foram monitorados diariamente e o número de afídeos em cada estágio de desenvolvimento foi determinado. Os afídeos tratados com dieta artificial isoladamente começaram a alcançar a maturidade (estágio de 5o instar) aproximadamente aos 3 dias (Fig. 30A). O desenvolvimento foi retardado em afídeos tratados com gossipol, e pelos 5 dias de tratamento com 0,5% de gossipol, a maior parte dos afídeos não maturou mais do que o estágio de 3o instar, e o seu tamanho também é afetado (Fig. 30A e 30B). Estes dados indicam que o tratamento com gossipol retardou e travou a progressão do desenvolvimento de afídeos, e que esta resposta dependeu da dose.
Tratamento com gossipol aumentou a mortalidade dos afídeos [00517] A taxa de sobrevivência de afídeos também foi medida durante os tratamentos. A maior parte dos afídeos tratados com dieta artificial isoladamente sem aminoácidos essenciais estavam vivos aos 2 dias pós-tratamento (Fig. 31). Após 4 dias, os afídeos começaram gradualmente a morrer, e alguns sobreviveram para além de 7 dias póstratamento.
[00518] Em contraste, afídeos tratados com 0,25 (não significativamente diferente do controle, p~0,2794) e 0,5% de gossipol exibiram menores taxas de sobrevivência do que afídeos tratados com dieta artificial isoladamente, com o tratamento com 0,5% de gossipol sendo significativamente diferente do controle de AD sem EAA (p-0,002). Afídeos tratados com 0,5% de gossipol começaram a morrer após 2 dias de tratamento e todos os afídeos sucumbiram ao tratamento pelos 4 dias. Os afídeos tratados com 0,25% sobreviveram um pouco mais do que os tratados com 0,5%, mas também foram drasticamente afetados. Estes dados indicam que ocorreu um decréscimo dependente da dose da sobrevivência por tratamento com o aleloquímico gossipol.
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Tratamento com gossipol decresceu a reprodução dos afídeos [00519] A fecundidade também foi monitorada em afídeos durante os tratamentos. Pelos dias 7 e 8 pós-tratamento, a maior parte dos afídeos adultos tratados com dieta artificial sem aminoácidos essenciais começaram a se reproduzir. O número médio de progênie produzida diariamente após a maturidade por afídeos tratados com dieta artificial sem aminoácidos essenciais foi aproximadamente 5 (Figuras 32A e 32B).
[00520] Em contraste, afídeos tratados com 0,25% de gossipol exibem uma redução para alcançar a fase adulta e produzir progênie. Estes dados indicam que o tratamento com gossipol resultou em um decréscimo da reprodução dos afídeos.
Tratamento com gossipol decresceu Buchnera em afídeos [00521] Para testar se diferentes concentrações de gossipol resultaram especificamente em perda de Buchnera em afídeos, e se esta perda teve impacto na aptidão dos afídeos, DNA foi extraído de afídeos em cada grupo de tratamento após 5 ou 13 dias de tratamento e qPCR foi realizado para determinar os números de cópias de Buchnera/afídeo. Os afídeos tratados com dieta artificiai isoladamente sem aminoácidos essenciais (controle) exibiram razões elevadas de cópias de DNA de Buchnera/afídeo. Em contraste, afídeos tratados com 0,25 e 0,5% de gossipol exibiram -4 vezes menos cópias de DNA de Buchnera/afídeo (Fig. 33), indicando que o tratamento com gossipol decresceu níveis de Buchnera, e que este decréscimo dependeu da concentração.
[00522] Planejamento experimental da administração por microinjeção:
[00523] Microinjeção foi realizada usando o Injetor NanoJet HI AutoNanoliter com a agulha de borossilicato puxada intemamente (Drummond Scientific; Cat# 3-000-203-G/XL). Afídeos (estirpe LSR-1, A. pi
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267/321 sum) cresceram em plantas de fava como descrito em um Exemplo anterior. Cada grupo de tratamento teve aproximadamente o mesmo número de indivíduos injetados de cada uma das plantas da coleção. Afídeos ninfas (<estágio de 3o instar) foram transferidos, usando um pincel, para um sistema de tubagem conectado a vácuo e microinjetados no tórax ventral com 20 nL de dieta artificial sem aminoácidos essenciais (controle negativo) ou com solução de 0,05% de gossipol em dieta artificial sem aminoácidos essenciais. Após a injeção, os afídeos foram colocados em uma placa de Petri profunda com uma folha de fava com caule em ágar 2%.
Tratamento por microinjeção com antibiótico decresceu Buchnera em afídeos [00524] Para testar se gossipol administrado por microinjeção resulta em perda de Buchnera em afídeos, e se esta perda tem impacto na aptidão dos afídeos como demonstrado em Exemplos anteriores, DNA foi extraído de afídeos em cada grupo de tratamento após 4 dias de tratamento e qPCR foi realizado como descrito em um Exemplo anterior para determinar os números de cópias de Buchnera/afídeo.
[00525] Afídeos microinjetados com controle negativo exibiram razões elevadas de cópias de DNA de Buchnera/afídeo. Em contraste, ninfas e adultos de afídeos microinjetados com gossipol exibiram uma redução drástica de cópias de DNA de Buchnera/afídeo (Fig. 34), indicando que tratamento por microinjeção de gossipol decresce a presença de Buchnera endossimbiótica e, como mostrado em Exemplos anteriores, isto originou um decréscimo da aptidão.
[00526] Em conjunto, estes dados descritos nos Exemplos anteriores demonstraram a capacidade para matar e decrescer o desenvolvimento, capacidade reprodutiva, longevidade, e populações bacterianas endógenas, por exemplo, aptidão, de afídeos por tratamento dos mesmos com solução de metabólito secundário de planta através de
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268/321 múltiplos métodos de administração.
Exemplo 19: Insetos tratados com composto antimicrobiano natural derivado de planta, transcinemaldeído [00527] Este Exemplo demonstra que o tratamento de afídeos com transcinemaldeído, um aldeído aromático natural que é o componente principal de extrato da casca da árvore da canela (Cinnamomum zeylandicum) resulta em aptidão decrescida. Foi mostrado que transcinemaldeído tem atividade antimicrobiana contra organismos Gramnegativos e Gram-positivos, apesar de o mecanismo de ação exato da sua atividade antimicrobiana permanecer por esclarecer. O transcinemaldeído pode danificar membranas de células bacterianas e inibir processos celulares ou enzimas específicos (Gill e Holley, 2004 Applied Environmental Microbiology). Este Exemplo demonstra que o efeito de transcinemaldeído em insetos foi mediado através da modulação de populações bacterianas endógenas ao inseto que foram sensíveis ao transcinemaldeído. Uma estirpe bacteriana visada é Buchnera aphidicola.
[00528] Planejamento Terapêutico:
[00529] Transcinemaldeído foi diluído para 0,05%, 0,5% ou 5% em água e foi administrado através de perfusão foliar (~1 mL foi injetado em folhas) e através de plantas.
[00530] Planejamento Experimental:
[00531] Afídeos (estirpes LSR-1 (que albergam apenas Buchnera), Acyrthosiphon pisum) cresceram em plantas de fava (fava Vroma vicia de Johnny’s Selected Seeds) em um incubador de clima controlado (fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de escuridão; 60±5% de UR; 25±2°C). Antes de serem usadas para a criação de afídeos, plantas de fava foram cultivadas em solo envasado a 24°C com 16 h de luz e 8 h de escuridão. Para limitar efeitos maternos ou diferenças de saúde entre plantas, 5-10 adultos de diferentes plantas foram distribuídos entre 10
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269/321 plantas com duas semanas de idade, e deixados multiplicar para alta densidade durante 5-7 dias. Para as experiências, afídeos de primeiro e segundo instar foram recolhidos de plantas saudáveis e divididos em quatro grupos de tratamento diferentes: 1) controles tratados com água, 2) 0,05% de transcinemaldeído em água, 3) 0,5% de transcinemaldeído em água, e 4) 5% de transcinemaldeído em água. Cada grupo de tratamento recebeu aproximadamente o mesmo número de indivíduos de cada uma das plantas da coleção.
[00532] Transcinemaldeído (Sigma, Cat#C80687) foi diluído para a concentração apropriada em água (ver Planejamento terapêutico), esterilizado por passagem através de um filtro de seringa de 0,22 pm, e armazenado a 4°C. Folhas de fava foram injetadas com aproximadamente 1 mL do tratamento e então a folha foi colocada em um tubo Eppendorf de 1,5 mL contendo a mesma solução de tratamento. A abertura do tubo onde o caule de fava foi colocado foi fechada usando parafilme. Este sistema de alimentação de tratamento foi então colocado em uma placa de Petri profunda (Fisher Scientific, Cat# FB0875711) e afídeos foram aplicados nas folhas da planta.
[00533] Para cada tratamento, 40-49 afídeos foram colocados sobre cada folha. Os sistemas de alimentação de tratamento foram mudados a cada 2-3 dias ao longo da experiência. Os afídeos foram monitorados diariamente quanto à sobrevivência e afídeos mortos foram removidos da placa de Petri profunda alojando o sistema de alimentação de tratamento quando foram descobertos.
[00534] Adicionalmente, o estágio do desenvolvimento (1o, 2o, 3o, 4o, 5o e 5R (5o que se reproduziu) instar) foi determinado diariamente ao longo da experiência.
[00535] Após 3 dias de tratamento, DNA foi extraído dos afídeos vivos remanescentes de cada grupo de tratamento. Em resumo, a superfície corporal do afídeo foi esterilizada por imersão do afídeo em
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270/321 uma solução de lixívia 6% durante aproximadamente 5 segundos. Os afídeos foram então enxaguados em água esterilizada e DNA foi extraído de cada afídeo individual usando um kit de extração de DNA (Qiagen, kit DNeasy) de acordo com instruções do fabricante. A concentração de DNA foi medida usando uma quantificação de ácido nucleico por NanoDrop, e os números de cópias de DNA de Buchnera e afídeo foram medidos por qPCR. Os iniciadores usados para Buchnera foram BuctL.groES.J8F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 240) e BuchjgroESJ38R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO:
241) (Chong e Moran, 2016 PNAS). Os iniciadores usados para afídeo foram ApEFIa 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG; SEQ ID NO:
242) e ApEFIa 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO:
243) (Chong e Moran, 2016 PNAS). qPCR foi realizado usando uma rampa de amplificação de qPCR de 1,6 grau C/s e as seguintes condições: 1) 95°C durante 10 minutos, 2) 95°C durante 15 segundos, 3) 55°C durante 30 segundos, 4) repetir os passos 2-3 40x, 5) 95°C durante 15 segundos, 6) 55°C durante 1 minuto, 7) alteração da rampa para 0,15 grau C/s, 8) 95°C durante 1 segundo. Os dados de qPCR foram analisados usando software analítico (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).
[00536] Ocorreu uma resposta negativa dependente da dose na aptidão de insetos por tratamento com o antimicrobiano natural transcinemaldeído [00537] Afídeos LSR-1 A. pisum de 1o e 2o instar foram divididos em quatro grupos de tratamento separados como definido em Planejamento Experimental (descrito aqui). Os afídeos foram monitorados diariamente e o número de afídeos em cada estágio de desenvolvimento foi determinado. Os afídeos tratados com água isoladamente começaram a alcançar o estágio de 3o instar aos 3 dias póstratamento (Fig. 35). O desenvolvimento foi retardado em afídeos tra
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271/321 tados com transcinemaldeído, e pelos 3 dias de tratamento com cada uma das três concentrações de transcinemaldeído, nenhum dos afídeos maturou para além do estágio de segundo instar (Fig. 35). Além disso, todos os afídeos tratados com a concentração mais elevada de transcinemaldeído (5%) permaneceram no estágio de 1o instar ao longo de toda a experiência. Estes dados indicam que o tratamento com transcinemaldeído retarda e trava a progressão do desenvolvimento de afídeos, e que esta resposta depende da dose.
Tratamento com transcinemaldeído aumentou a mortalidade dos afídeos [00538] A taxa de sobrevivência de afídeos também foi medida durante os tratamentos. Aproximadamente 75 por cento dos afídeos tratados com água isoladamente estavam vivos aos 3 dias póstratamento (Fig. 36). Em contraste, afídeos tratados com 0,05%, 0,5%, e 5% de transcinemaldeído exibiram taxas de sobrevivência significativamente menores (p<0,0001 para cada grupo de tratamento em comparação com controle tratado com água) do que afídeos tratados com água isoladamente. Estes dados indicam que ocorreu um decréscimo dependente da dose da sobrevivência por tratamento com o antimicrobiano natural transcinemaldeído.
Tratamento com transcinemaldeído decresceu Buchnera em afídeos [00539] Para testar se diferentes concentrações de transcinemaldeído resultaram especificamente em perda de Buchnera em afídeos, e se esta perda teve impacto na aptidão dos afídeos, DNA foi extraído de afídeos em cada grupo de tratamento após 3 dias de tratamento e qPCR foi realizado para determinar os números de cópias de Buchnera/afídeo. Os afídeos tratados com água isoladamente (controle) exibiram razões elevadas de cópias de DNA de Buchnera/afídeo. Similarmente, afídeos tratados com a concentração mais baixa de transcinemaldeído (0,5%) exibiram razões elevadas de cópias de DNA de Buchnera/afídeo.
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272/321 [00540] Em contraste, afídeos tratados com 0,5 e 5% de transcinemaldeído exibiram -870 vezes menos cópias de DNA de Buchnera/afídeo (Fig. 37), indicando que o tratamento com transcinemaldeído decresceu níveis de Buchnera, e que este decréscimo dependeu da concentração.
[00541] Em conjunto, estes dados descritos nos Exemplos anteriores demonstram a capacidade para matar e decrescer o desenvolvimento, capacidade reprodutiva, longevidade e populações bacterianas endógenas, por exemplo, aptidão, de afídeos por tratamento dos mesmos com solução de metabólito secundário de planta através de múltiplos métodos de administração.
Exemplo 20: Insetos tratados com peptídeos antimicrobianos de escorpião [00542] Este Exemplo demonstra o tratamento de afídeos com múltiplos peptídeos antimicrobianos (AMP) de escorpião, dos quais vários são AMP identificados no transcriptoma da glândula de veneno do escorpião Urodacus yaschenkoi (Luna-Ramirez et al., 2017, Toxins). Os AMP têm tipicamente uma carga líquida positiva e, assim, uma afinidade elevada para membranas bacterianas. Este Exemplo demonstra que o efeito do AMP em insetos foi mediado através da modulação de populações bacterianas endógenas ao inseto que foram sensíveis a peptídeos AMP. Uma estirpe bacteriana visada é Buchnera aphidicola, um simbionte obrigatório de afídeos.
[00543] Planejamento Terapêutico:
[00544] A solução de Uy192 foi formulada usando uma combinação de perfusão foliar e administração através de plantas. A solução de controle foi injetada em folhas com água + corantes alimentares azuis e água no tubo. A solução de tratamento consistiu em 100 ug/mL de Uy192 em água via injeção foliar (com corantes alimentares azuis) e através da planta (em tubo Eppendorf).
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273/321 [00545] Planejamento Experimental de Perfusão foliar-Administração em Plantas:
[00546] Afídeos LSR-1 (que albergam apenas Buchnera), Acyrthosiphon pisum cresceram em plantas de fava (fava Vroma vicia de Johnny's Selected Seeds) em um incubador de clima controlado (fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de escuridão; 60±5% de UR; 20±2°C). Antes de serem usadas para a criação de afídeos, plantas de fava foram cultivadas em solo envasado a 24°C com 16 h de luz e 8 h de escuridão. Para limitar efeitos matemos ou diferenças de saúde entre plantas, 5-10 adultos de diferentes plantas foram distribuídos entre 10 plantas com duas semanas de idade, e deixados multiplicar para alta densidade durante 5-7 dias. Para as experiências, afídeos de primeiro e segundo instar foram recolhidos de plantas saudáveis e divididos em 2 grupos de tratamento diferentes: 1) controle negativo (tratado com água), 2) A solução de tratamento de 100 ug/mL de AMP em água. Cada grupo de tratamento recebeu aproximadamente o mesmo número de indivíduos de cada uma das plantas da coleção.
[00547] Uy192 foi sintetizado por Bio-Synthesis a >75% de pureza.
mg de peptídeo liofilizado foi reconstituído em 500 uL de 80% de acetonitrila, 20% de água, e TFA 0,1%, 100 uL (100 ug) foram transferidos em alíquotas para 10 tubos Eppendorf individuais, e deixados secar. Para o tratamento (ver Planejamento terapêutico), 1 mL de água foi adicionado a uma alíquota de 100 ug de peptídeo para se obter a concentração final de Uy192 (100 ug/mL). A solução foi então colocada em um tubo Eppendorf de 1,5 mL com um caule de fava com uma folha também submetido a perfusão com as soluções e a abertura do tubo foi fechada usando parafilme. Este sistema de alimentação foi então colocado em uma placa de Petri profunda (Fisher Scientific, Cat# FB0875711) e afídeos foram aplicados nas folhas da planta.
[00548] Para cada tratamento, 50 afídeos foram colocados sobre
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274/321 cada folha. Os sistemas de alimentação foram mudados a cada 2-3 dias ao longo da experiência. Os afídeos foram monitorados diariamente quanto à sobrevivência e afídeos mortos foram removidos da placa de Petri profunda quando foram descobertos.
[00549] Adicionalmente, o estágio do desenvolvimento (1o, 2o, 3o, 4°, 5o e 5R (5o que se reproduziu) instar) foi determinado diariamente ao longo da experiência.
[00550] Após 8 dias de tratamento, DNA foi extraído dos afídeos remanescentes em cada grupo de tratamento. Em resumo, a superfície corporal do afídeo foi esterilizada por imersão do afídeo em uma solução de lixívia 6% durante aproximadamente 5 segundos. Os afídeos foram então enxaguados em água esterilizada e DNA foi extraído de cada afídeo individual usando um kit de extração de DNA (Qiagen, kit DNeasy) de acordo com instruções do fabricante. A concentração de DNA foi medida usando uma quantificação de ácido nucleico por NanoDrop, e os números de cópias de DNA de Buchnera e afídeo foram medidos por qPCR. Os iniciadores usados para Buchnera foram BuchjgroES_J8F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 240) e Buch_groES_98R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO:
241) (Chong e Moran, 2016 PNAS). Os iniciadores usados para afídeo foram ApEFIa 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG: SEQ ID NO:
242) e ApEFIa 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO:
243) (Chong e Moran, 2016 PNAS). qPCR foi realizado usando uma rampa de amplificação de qPCR de 1,6 grau C/s e as seguintes condições: 1) 95°C durante 10 minutos, 2) 95°C durante 15 segundos, 3) 55°C durante 30 segundos, 4) repetir os passos 2-3 40x, 5) 95°C durante 15 segundos, 6) 55°C durante 1 minuto, 7) alteração da rampa para 0,15 grau C/s, 8) 95°C durante 1 segundo. Os dados de qPCR foram analisados usando software analítico (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).
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275/321 [00551] Ocorreu uma resposta negativa na aptidão de insetos por tratamento com os AMP de escorpião [00552] Afídeos A. pisum LSR-1 de 1o e 2o instar foram divididos em dois grupos de tratamento separados como definido em Planejamento Experimental (acima). Os afídeos foram monitorados diariamente e o número de afídeos em cada estágio de desenvolvimento foi determinado. Os afídeos tratados com o controle negativo isoladamente começaram a alcançar a maturidade (estágio de 5o instar) aproximadamente aos 6 dias (Fig. 38). O desenvolvimento foi retardado em afídeos tratados com Uy192, e após 8 dias de tratamento, afídeos não maturaram para além do estágio de 4o instar. Estes dados indicam que o tratamento com Uy192 retardou e travou a progressão do desenvolvimento de afídeos.
Tratamento com AMP de escorpião resulta em mortalidade dos afídeos aumentada [00553] A taxa de sobrevivência de afídeos também foi medida durante os tratamentos. A maior parte dos afídeos tratados com o controle isoladamente estavam vivos aos 3 dias pós-tratamento (Fig. 39). Após 4 dias, os afídeos começaram gradualmente a morrer, e alguns sobreviveram para além de 7 dias pós-tratamento.
[00554] Em contraste, afídeos tratados com Uy192 exibiram menores taxas de sobrevivência do que afídeos tratados com controle. Estes dados indicam que ocorreu um decréscimo da sobrevivência por tratamento com o AMP de escorpião Uy192.
Tratamento com o AMP de escorpião Uy192 resulta em Buchnera decrescida em afídeos [00555] Para testar se o tratamento com Uy192 resultou especificamente em perda de Buchnera em afídeos, e se esta perda teve Impacto na aptidão dos afídeos, DNA foi extraído de afídeos em cada grupo de tratamento após 8 dias de tratamento e qPCR foi realizado
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276/321 para determinar os números de cópias de Buchnera/afídeo. Os afídeos tratados com controle isoladamente exibiram razões elevadas de cópias de DNA de Buchnera/afídeo. Em contraste, afídeos tratados com 100 ug/mL de Uy192 em água exibiram ~7 vezes menos cópias de DNA de Buchnera/afídeo (Fig. 40), indicando que o tratamento com Uy192 decresceu níveis de Buchnera.
[00556] Em conjunto, estes dados descritos previamente demonstraram a capacidade para matar e decrescer o desenvolvimento, longevidade e populações bacterianas endógenas, por exemplo, aptidão, de afídeos por tratamento dos mesmos com um peptídeo antimicrobiano natural de escorpião.
Exemplo 21: insetos tratados com peptídeos antimicrobianos de escorpião [00557] Este Exemplo demonstra o tratamento de afídeos com vários peptídeos antimicrobianos (AMP) de escorpião D10, D3, Uyct3, e LJy17, que sâo AMP que foram recentemente identificados no transcriptoma da glândula de veneno do escorpião Urodacus yaschenkoi (Luna-Ramirez et al., 2017, Toxins). Os AMP têm tipicamente uma carga líquida positiva e, assim, uma afinidade elevada para membranas bacterianas. Este Exemplo demonstra que o efeito dos AMP em insetos foi mediado através da modulação de populações bacterianas endógenas ao inseto que foram sensíveis aos peptídeos AMP. Uma estirpe bacteriana visada é Buchnera aphidicola, um simbionte obrigatório de afídeos.
[00558] Afídeos são pragas de insetos agrícolas causando lesões de alimentação diretas na planta e servindo como vetores de vírus de plantas. Adicionalmente, o néctar (honeydew) de afídeos promove o crescimento de bolor fuliginoso e atrai formigas incômodas. O uso de tratamentos químicos, infelizmente ainda disseminado, conduz à seleção de indivíduos resistentes cuja erradicação se torna cada vez mais
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277/321 difícil· [00559] Planejamento Terapêutico:
[00560] O peptídeo ou coquetel de peptídeos indicado (ver as seções Planejamento Experimental de Microinjeção de Afídeos e Planejamento Experimental de Perfusão foliar-Plantas quanto a detalhes abaixo) foi diretamente microinjetado em afídeos ou administrado usando uma combinação de perfusão foliar e administração através de plantas. Como controle negativo, afídeos foram microinjetados com água (para experiências de microinjeção) ou colocados sobre folhas injetadas com água e água no tubo (para experiências de perfusão foliar e administração em plantas). As soluções de tratamento consistiram em 20 nL de 5 pg/pL de D3 ou D10 dissolvido em água (para microinjeções de afídeos) ou 40 pg/mL de um coquetel de D10, Uy17, D3 e UyCt3 em água via injeção foliar e através da planta (em tubo Ep~ pendorf).
Planejamento Experimental da Microinjeção de Afídeos [00561] Microinjeção foi realizada usando o Injetor NanoJet III AutoNanoliter com a agulha de borossilicato puxada internamente (Drummond Scientific; Cat# 3-000-203-G/XL). Afídeos (estirpe LSR-1, Acyrthosiphon pisum) cresceram em plantas de fava (fava Vroma vicia de Johnny's Selected Seeds) em um incubador de clima controlado (fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de escuridão; 60±5% de UR; 25±2°C). Antes de serem usadas para a criação de afídeos, plantas de fava foram cultivadas em solo envasado a 24°C com 16 h de luz e 8 h de escuridão. Para limitar efeitos matemos ou diferenças de saúde entre plantas, 5-10 adultos de diferentes plantas foram distribuídos entre 10 plantas com duas semanas de idade, e deixados multiplicar para alta densidade durante 5-7 dias. Cada grupo de tratamento teve aproximadamente o mesmo número de indivíduos injetados de cada uma das plantas da coleção. Afídeos adultos foram microinjetados no tórax
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278/321 ventral com 20 nL de água ou com 100 ng (20 uL de uma solução 5 ug/mL de peptídeo D3 ou D10). A taxa de microinjeção foi 5 nL/s. Após a injeção, os afídeos foram colocados em uma placa de Petri profunda contendo uma folha de fava com caule em ágar 2%.
[00562] Os peptídeos foram sintetizados por Bio-Synthesis a >75% de pureza. 1 mg de peptídeo líofilizado foi reconstituído em 500 pL de 80% de acetonitrila, 20% de água e TFA 0,1%, 100 pL (100 pg) foram transferidos em alíquotas para 10 tubos Eppendorf individuais, e deixados secar.
[00563] Após 5 dias de tratamento, DNA foi extraído dos afídeos remanescentes em cada grupo de tratamento. Em resumo, a superfície corporal do afídeo foi esterilizada por imersão do afídeo em uma solução de lixívia 6% durante aproximadamente 5 segundos. Os afídeos foram então enxaguados em água esterilizada e DNA foi extraído de cada afídeo individual usando um kit de extração de DNA (Qiagen, kit DNeasy) de acordo com instruções do fabricante. A concentração de DNA foi medida usando uma quantificação de ácido nucleíco por NanoDrop, e os números de cópias de DNA de Buchnera e afídeo foram medidos por qPCR. Os iniciadores usados para Buchnera foram BuchjgroESJSF (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 240) e BuchjgroES_98R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO:
241) (Chong e Moran, 2016 PNAS). Os iniciadores usados para afídeo foram ApEFIa 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG; SEQ ID NO:
242) e ApEFIa 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO:
243) (Chong e Moran, 2016 PNAS). qPCR foi realizado usando uma rampa de amplificação de qPCR de 1,6 grau C/s e as seguintes condições: 1) 95°C durante 10 minutos, 2) 95°C durante 15 segundos, 3) 55°C durante 30 segundos, 4) repetir os passos 2-3 40x, 5) 95°C durante 15 segundos, 6) 55°C durante 1 minuto, 7) alteração da rampa para 0,15 grau C/s, 8) 95°C durante 1 segundo. Os dados de qPCR
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279/321 foram analisados usando software analítico (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).
Microinjeção de afídeos com os peptídeos de escorpião D3 e D10 resulta em sobrevivência de insetos decrescida [00564] Afídeos LSR-1 A. pisum de 1o e 2o instar foram divididos em três grupos de tratamento separados como definido em Planejamento Experimental (descrito aqui). Os afídeos foram monitorados diariamente e a taxa de sobrevivência foi determinada. Após 5 dias de tratamento, os afídeos injetados com os peptídeos de escorpião exibiram taxas de sobrevivência menores em comparação com controles injetados com água (9, 35 e 45% de sobrevivência para injeção com D3, D10 e água, respectivamente) (Fig. 41). Estes dados indicam que ocorreu um decréscimo da sobrevivência por tratamento com os AMP de escorpião D3 e D10.
Microinjeção de afídeos com os peptídeos de escorpião D3 e D10 resulta em uma redução de endossimbiontes Buchnera [00565] Para testar se a injeção com os AMP de escorpião D3 e D10 resultou especificamente em perda de Buchnera em afídeos, e se esta perda teve impacto na aptidão dos afídeos, DNA foi extraído de afídeos em cada grupo de tratamento 5 dias após a injeção e qPCR foi realizado para determinar os números de cópias de Buchnera/afídeo. Afídeos injetados com água isoladamente exibiram razões elevadas de DNA de Buchnera/afídeo (47,4) ao passo que afídeos injetados com D3 e D10 exibiram razões menores de DNA de Buchnera/afídeo (25,3 e 30,9, respectivamente) (Fig. 42). Estes dados indicam que o tratamento com os peptídeos de escorpião D3 e D10 resultou em níveis decrescidos do simbionte bacteriano Buchnera.
[00566] Planejamento Experimental de Perfusâo foliar-Administração em Plantas:
[00567] Afídeos eNASCO (que albergam Buchnera e Serratia),
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280/321
Acyrthosiphon pisum cresceram em plantas de fava (fava Vroma vicia de Johnny's Selected Seeds) como descrito acima. Para as experiências, afídeos de primeiro e segundo instar foram recolhidos de plantas saudáveis e divididos em 2 grupos de tratamento diferentes: 1) controle negativo (tratado com água), 2) A solução de tratamento consistiu em 40 pg/mL de cada D10, Uy17, D3 e UyCt3 em água. Cada grupo de tratamento recebeu aproximadamente o mesmo número de indivíduos de cada uma das plantas da coleção.
[00568] Peptídeos foram sintetizados, dissolvidos, e transferidos em alíquotas, como descrito acima. Para o tratamento (ver Planejamento terapêutico), água foi adicionada a uma alíquota de 100 pg de peptídeo para se obter a concentração final desejada (40 pg/mL). Os quatro peptídeos foram combinados para preparar a solução de coquetel de peptídeos. Esta solução foi usada para efetuar perfusão em folhas via injeção. Após a injeção, os caules das folhas injetadas foram colocados em um tubo Eppendorf de 1,5 mL que então foi selado com parafilme. Este sistema de alimentação foi então colocado em uma placa de Petri profunda (Fisher Scientific, Cat# FB0875711) e afídeos foram aplicados nas folhas da planta.
[00569] Para cada tratamento, 41-49 afídeos foram colocados sobre cada folha. Os sistemas de alimentação foram mudados a cada 2-3 dias ao longo da experiência. Os afídeos foram monitorados diariamente quanto à sobrevivência e afídeos mortos foram removidos da placa de Petri profunda quando foram descobertos.
Tratamento com coquetel de peptídeos de escorpião resulta em mortalidade dos afídeos aumentada [00570] A taxa de sobrevivência de afídeos também foi medida durante os tratamentos. Após 6 dias de tratamento, afídeos tratados com o coquetel de peptídeos exibiram menores taxas de sobrevivência em comparação com os tratados com água, e após 9 dias o efeito é mais
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281/321 evidente (16 e 29% de sobrevivência para tratados com coquetel de peptídeos e água, respectivamente) (Fig. 43). Estes dados indicam que ocorreu um decréscimo da sobrevivência por tratamento com o coquetel de AMP de escorpião e, como mostrado em Exemplos anteriores, estes AMP decresceram os níveis de endossimbionte nos afídeos.
[00571] Em conjunto, estes dados descritos previamente demonstraram a capacidade para matar e decrescer a longevidade e populações bacterianas endógenas, por exempio, aptidão, de afídeos por tratamento dos mesmos com peptídeos antimicrobianos naturais de escorpião isolados ou um coquetel de peptídeos antimicrobianos naturais de escorpião.
Exemplo 22: Insetos tratados com um peptídeo antimicrobiano fundido a um peptídeo penetrador de células [00572] Este Exemplo demonstra o tratamento de afídeos com um peptídeo antimicrobiano (AMP) de escorpião (Uy192) fundido a um peptídeo penetrador de células derivado de um vírus. O AMP Uy192 é um dos vários AMP recentemente identificados no transcriptoma da glândula de veneno do escorpião Urodacus yaschenkoi (Luna-Ramirez et al., 2017, Toxins). Os AMP têm tipicamente uma carga líquida positiva e, assim, uma afinidade elevada para membranas bacterianas. Para intensificar a administração do peptídeo de escorpião Uy192 em células de afídeos, o peptídeo foi sintetizado fundido a uma porção da proteína do transativador da transcrição (TAT) do vírus da imunodeficiência humana I (HIV-1). Estudos prévios mostraram que a conjugação deste peptídeo penetrador de células (CPP) a outras moléculas aumentou a sua captação em células via transduçâo (Zhou et al., 2015 Journal of Insect Science e Cermenati et al., 2011 Journal of Insect Physiology). Este Exemplo demonstra que o efeito do peptídeo fundido em insetos foi mediado através da modulação de populações bacteria
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282/321 nas endógenas ao inseto que foram sensíveis ao peptídeo antimicrobíano. Uma estirpe bacteriana visada é Buchnera.
Planejamento Terapêutico [00573] O peptídeo de escorpião conjugado ao peptídeo penetrador de células e marcado de modo fluorescente com 6FAM (Uy192*CPP+FAM) foi formulado usando uma combinação de perfusão foliar e administração através de plantas. A solução de controle (água) ou solução de tratamento (Uy192+CPP+FAM) foi injetada na folha e colocada no tubo Eppendorf. A solução de tratamento incluiu 100 pg/mL de Uy192+CPP+FAM em água.
[00574] Planejamento Experimental de Perfusão foliar-Administração em Plantas [00575] Afídeos LSR-1, Acyrthosiphon pisum cresceram em plantas de fava (fava Vroma vicia de Johnny's Selected Seeds) em um incubador de clima controlado (fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de escuridão; 60±5% de UR; 25±2°C). Antes de serem usadas para a criação de afídeos, plantas de fava foram cultivadas em solo envasado a 24°C com 16 h de luz e 8 h de escuridão. Para limitar efeitos maternos ou diferenças de saúde entre plantas, 5-10 adultos de diferentes plantas foram distribuídos entre 10 plantas com duas semanas de idade, e deixados multiplicar para alta densidade durante 5-7 dias. Para as experiências, afídeos de primeiro instar foram recolhidos de plantas saudáveis e divididos em 2 grupos de tratamento diferentes: 1) controle negativo (tratado com água), 2) Uy192+CPP+FAM tratado com 100 pg/mL de Uy192+CPP+FAM em água. Cada grupo de tratamento recebeu aproximadamente o mesmo número de indivíduos de cada uma das plantas da coleção.
[00576] Para o tratamento (ver Planejamento terapêutico), Uy192+CPP+FAM (sequência de aminoácidos: YGRKKRRQRRRFLSTIWNGIKGLL-FAM) foi sintetizado por Bio-Synthesis a >75% de pure
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283/321 za. 5 mg de peptídeo liofilizado foram reconstituídos em 1 mL de 80% de acetonitrile, 20% de água e TFA 0,1%, 50 pL (100 pg) foram transferidos em alíquotas para tubos Eppendorf individuais, e deixados secar. Para o tratamento (ver Planejamento terapêutico), 1 mL de água esterilizada foi adicionado a uma alíquota de 100 pg de peptídeo para se obter a concentração final de Uy192+CPP+FAM (100 pg/mL). A solução foi então injetada na folha da planta e o caule da planta foi colocado em um tubo Eppendorf de 1,5 mL. A abertura do tubo foi fechada usando parafilme. Este sistema de alimentação foi então colocado em uma placa de Petri profunda (Fisher Scientific, Cat# FB0875711) e afídeos foram aplicados nas folhas da planta. Imagiologia por epifluorescência da folha confirmou que as folhas continham o peptídeo com marcação fluorescente verde em seu sistema vascular.
[00577] Para cada tratamento, 30 afídeos foram colocados sobre cada folha em triplicado. Os sistemas de alimentação foram mudados a cada 2-3 dias ao longo da experiência. Os afídeos foram monitorados diariamente quanto à sobrevivência e afídeos mortos foram removidos da placa de Petri profunda quando foram descobertos. Adicionalmente, o estágio do desenvolvimento (1o, 2°, 3°, 4°, 5° e 5R (afídeos de 5o instar que estão se reproduzindo) instar) foi determinado diariamente ao longo da experiência.
[00578] Aos 5 dias pós-tratamento, DNA foi extraído de vários afídeos em cada grupo de tratamento. Em resumo, a superfície corporal do afídeo foi esterilizada por imersão do afídeo em uma solução de lixívia 6% durante aproximadamente 5 segundos. Os afídeos foram então enxaguados em água esterilizada e DNA foi extraído de cada afídeo individual usando um kit de extração de DNA (Qiagen, kit DNeasy) de acordo com instruções do fabricante. A concentração de DNA foi medida usando uma quantificação de ácido nucleico por NanoDrop, e os números de cópias de DNA de Buchnera e afídeo foram
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284/321 medidos por qPCR. Os iniciadores usados para Buchnera foram BuctL.groES.J8F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 240) e Buch_groES__98R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO:
241) (Chong e Moran, 2016 PNAS). Os iniciadores usados para afídeo foram ApEFIa 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG; SEQ ID NO:
242) e ApEFIa 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO:
243) (Chong e Moran, 2016 PNAS). qPCR foi realizado usando uma rampa de amplificação de qPCR de 1,6 grau C/s e as seguintes condições: 1) 95°C durante 10 minutos, 2) 95°C durante 15 segundos, 3) 55°C durante 30 segundos, 4) repetir os passos 2-3 40x, 5) 95°C durante 15 segundos, 6) 55°C durante 1 minuto, 7) alteração da rampa para 0,15 grau C/s, 8) 95°C durante 1 segundo. Os dados de qPCR foram analisados usando software analítico (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).
[00579] Tratamento com o peptídeo de escorpião Uy192 fundido a um peptídeo penetrador de células retardou e travou a progressão do desenvolvimento de afídeos [00580] Afídeos LSR-1 A. pisum de 1° instar foram divididos em três grupos de tratamento separados como definido em Planejamento Experimental (acima). Os afídeos foram monitorados diariamente e o número de afídeos em cada estágio de desenvolvimento foi determinado. O desenvolvimento dos afídeos tratados com água e dos tratados com o peptídeo de escorpião fundido ao peptídeo penetrador de células foi similar para os dias 0 e 1 (Fig. 44). No entanto, pelo dia 2, os afídeos tratados com controle se desenvolveram até ao estágio de segundo ou terceiro instar, ao passo que alguns afídeos tratados com o peptídeo de escorpião fundido ao peptídeo penetrador de células permaneceram no estágio de primeiro instar (Fig. 44). Mesmo aos 3 dias pós-tratamento, alguns afídeos tratados com o peptídeo de escorpião fundido ao peptídeo penetrador de células permaneceram no
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285/321 estágio de primeiro instar (Fig. 44). Pelos 7 dias pós-tratamento, a maior parte dos afídeos tratados com água se desenvolveram até ao estágio de 5o instar ou 5o instar se reproduzindo. Em contraste, somente 50 por cento dos afídeos tratados com o peptídeo de escorpião fundido ao peptídeo penetrador de células se desenvolveram até ao estágio de 5o instar, ao passo que -42 e -~8 por cento dos afídeos permaneceram no estágio de 3o ou 4o instar, respectivamente (Fig.
44) . Estes dados indicam que o tratamento com o peptídeo de escorpião Uy192 fundido ao peptídeo penetrador de células retardou e travou a progressão do desenvolvimento de afídeos.
[00581] Tratamento com o peptídeo de escorpião Uy192 fundido a um peptídeo penetrador de células resultou em mortalidade aumentada dos afídeos [00582] A taxa de sobrevivência de afídeos também foi medida durante os tratamentos. Aproximadamente 40% de afídeos tratados com o controle isoladamente sobreviveram à experiência de 7 dias (Fig.
45) . Em contraste, a sobrevivência foi significativamente menor para afídeos tratados com 100 pg/mL de Uy192+CPP+FAM (p-0,0036, pelo teste Log-Rank de Mantel Cox), com somente 16% dos afídeos sobrevivendo até ao dia 7 (Fig. 45). Estes dados indicam que ocorreu um decréscimo da sobrevivência por tratamento com o peptídeo de escorpião Uy192 fundido a um peptídeo penetrador de células.
[00583] Tratamento com um peptídeo de escorpião fundido a um peptídeo penetrador de células resultou em razões decrescídas de DNA de Buchnera/afídeo [00584] Para testar se o tratamento com Uy192+CPP+FAM resultou especificamente em perda de Buchnera em afídeos, e se esta perda teve impacto na aptidão dos afídeos, DNA foi extraído de afídeos em cada grupo após 5 dias de tratamento, e qPCR foi realizado para determinar os números de cópias de Buchnera/afídeo. Os afídeos trata
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286/321 dos com água exibiram razões elevadas (~134) de DNA de Buchnera/afídeo. Em contraste, afídeos tratados com o peptídeo de escorpião fundido ao peptídeo penetrador de células exibiram -1,8 vezes menos cópias de DNA de Buchnera/afídeo após 5 dias de tratamento (Fig.
46). Estes dados indicam que o tratamento com o peptídeo de escorpião fundido a um peptídeo penetrador de células decresceu os níveis de endossimbionte.
[00585] O peptídeo de escorpião fundido a um peptídeo penetrador de células entrou livremente nos bacteriócitos para atuar contra Buchnera [00586] Para testar se o peptídeo penetrador de células auxilia a administração do peptídeo de escorpião nos bacteriócitos diretamente, bacteriócitos isolados foram diretamente expostos à proteína de fusão e submetidos a imagiologia. Os bacteriócitos foram dissecados dos afídeos em meio de Schneider suplementado com 1% p/v de BSA (meio Schneider-BSA), e colocados em um poço de imagiologia contendo 20 uL de meio de Schneider. Uma alíquota liofilizada de 100 ug do peptídeo de escorpião foi resuspensa em 100 uL do meio de Schneider para produzir solução a 1 mg/mL, e 5 uL desta solução foram misturados no poço contendo bacteriócitos. Após 30 min de incubação à temperatura ambiente, os bacteriócitos foram extensamente lavados para eliminar qualquer excesso de peptídeo livre na solução. Imagens dos bacteriócitos foram capturadas antes e após a incubação (Fig. 47). O peptídeo de fusão penetrou nas membranas dos bacteriócitos e ficou diretamente disponível para Buchnera.
[00587] Em conjunto, estes dados demonstram a capacidade para matar e decrescer o desenvolvimento, longevidade, e populações bacterianas endógenas, por exemplo, aptidão, de afídeos por tratamento dos mesmos com o peptídeo antimicrobiano de escorpião Uy192 fundido a um peptídeo penetrador de células.
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Exemplo 23: Insetos tratados com análogos de vitaminas [00588] Este Exemplo demonstra o tratamento de afídeos com a pró-vitamina pantotenol que é o análogo álcool do ácido pantotênico (Vitamina B5). Afídeos têm bactérias endossimbiontes obrigatórias, Buchnera, que os ajudam a produzir aminoácidos essenciais e vitaminas, incluindo Vitamina B5. Um estudo prévio mostrou que o pantotenol inibe o crescimento de Plasmodium falciparium por inibição das cinases específicas de parasitas (Saliba et al., 2005). Foi posta a hipótese de o tratamento de insetos com pantotenol ser prejudicial para a simbiose bactérias-insetos, consequentemente afetando a aptidão dos insetos. Este Exemplo demonstra que o tratamento com pantotenol decresceu a aptidão de insetos.
[00589] Planejamento Terapêutico:
[00590] Soluções de pantotenol foram formuladas dependendo do método de administração:
[00591] Em dieta artificial através de plantas: com 0 (controle negativo) ou 10 ou 100 uM de pantotenol formulado em uma dieta artificial (com base em Akey e Beck, 1971; ver Planejamento Experimental) sem aminoácidos essenciais (2 mg/mL de histidina, 2 mg/mL de isoleucina, 2 mg/mL de leucina, 2 mg/mL de Iisina, 1 mg/mL de metionina, 1,62 mg/mL de fenilalanina, 2 mg/mL de treonina, 1 mg/mL de triptofano e 2 mg/mL de valina).
[00592] Revestimento foliar: 100 pL de 0,025% de solvente de tensoativo de organossilicone não iônico Silwet L-77 em água (controle negativo) ou 100 pL de 50 pg/mL de rifampicina formulada em solução de solvente foram aplicados diretamente na superfície foliar e deixados secar.
Planejamento Experimental da Administração em Plantas [00593] Afídeos (eNASCO, Acyrthosiphon pisum) cresceram em plantas de fava (fava Vroma vicia de Johnny's Selected Seeds) em um
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288/321 incubador de dima controlado (fotoperiodo de 16 h de luz/8 h de escuridão; 60±5% de UR; 25±2°C). Antes de serem usadas para a criação de afídeos, plantas de fava foram cultivadas em solo envasado a 24°C com 16 h de luz e 8 h de escuridão. Para limitar efeitos maternos ou diferenças de saúde entre plantas, 5-10 adultos de diferentes plantas foram distribuídos entre 10 plantas com duas semanas de idade, e deixados multiplicar para alta densidade durante 5-7 dias. Para as experiências, afídeos de primeiro e segundo instar foram recolhidos de plantas saudáveis e divididos em 3 grupos de tratamento diferentes: 1) dieta artificial isoladamente sem aminoácidos essenciais, 2) dieta artificial isoladamente sem aminoácidos essenciais e 10 uM de pantotenol, e 3) dieta artificiai isoladamente sem aminoácidos essenciais e 100 uM de pantotenol. Cada grupo de tratamento recebeu aproximadamente o mesmo número de indivíduos de cada uma das plantas da coleção.
[00594] A dieta artificial usada foi preparada como previamente publicado (Akey e Beck, 1971 Continuous Rearing of the Pea Aphid, Acyrthosiphon pisum, on a Holidic Diet”), com e sem os aminoácidos essenciais (2 mg/mL de histidina, 2 mg/mL de isoleucina, 2 mg/mL de leucina, 2 mg/mL de lisina, 1 mg/mL de metionina, 1,62 mg/mL de feniialanina, 2 mg/mL de treonina, 1 mg/mL de triptofano e 2 mg/mL de valina), com a exceção de nenhuma dieta incluir homosserina ou betaalaniltirosina. O pH das dietas foi ajustado para 7,5 com KOH e as dietas foram filtradas de modo esterilizado através de um filtro de 0,22 pm e armazenadas a 4°C durante um curto período (<7 dias) ou a -80°C durante um período longo.
[00595] Soluções de pantotenol (Sigma Cat# 295787) foram preparadas a 10 uM e 100 uM em dieta artificial sem aminoácidos essenciais, esterilizadas por passagem através de um filtro de seringa de 0,22 pm, e armazenadas a -20°C. Para os tratamentos (ver Planejamento
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289/321 terapêutico), a quantidade apropriada de solução de estoque foi adicionada à dieta artificial sem aminoácidos essenciais para se obter uma concentração final de 10 ou 100 uM de pantotenol. A dieta foi então colocada em um tubo Eppendorf de 1,5 mL com um caule de fava com uma folha e a abertura do tubo foi fechada usando parafilme. Este sistema de alimentação com dieta artificial foi então colocado em uma placa de Petri profunda (Fisher Scientific, Cat# FB0875711) e afídeos foram aplicados nas folhas da planta.
[00596] Para cada tratamento, 16-20 afídeos foram colocados sobre cada folha. Os sistemas de alimentação com dieta artificial foram mudados a cada 2-3 dias ao longo da experiência. Os afídeos foram monitorados diariamente quanto à sobrevivência e afídeos mortos foram removidos da placa de Petri profunda alojando o sistema de alimentação artificial quando foram descobertos.
[00597] Adicionalmente, o estágio do desenvolvimento (1o, 2o, 3o, 4o, 5o instar) foi determinado diariamente ao longo da experiência. Depois de um afídeo ter alcançado o estágio de 4o instar, os afídeos receberam o seu próprio sistema de alimentação artificial em uma placa de Petri profunda de modo que a fecundidade pôde ser monitorada assim que alcançaram a fase adulta.
[00598] Para afídeos adultos, ninfas novas foram contadas diariamente e então descartadas. No final das experiências, a fecundidade foi determinada como o número médio de progênie produzida diariamente assim que o afídeo alcançou a fase adulta. Fotos de afídeos foram tiradas ao longo da experiência para avaliar diferenças de tamanho entre grupos de tratamento.
[00599] Após 8 dias de tratamento, DNA foi extraído de múltiplos afídeos de cada grupo de tratamento. Em resumo, a superfície corporal do afídeo foi esterilizada por imersão do afídeo em uma solução de lixívia 6% durante aproximadamente 5 segundos. Os afídeos foram
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290/321 então enxaguados em água esterilizada e DNA foi extraído de cada afídeo individual usando um kit de extração de DNA (Qiagen, kit DNeasy) de acordo com instruções do fabricante. A concentração de DNA foi medida usando uma quantificação de ácido nucleico por NanoDrop, e os números de cópias de DNA de Buchnera e afídeo foram medidos por qPCR. Os iniciadores usados para Buchnera foram BuchjgroES__18F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 240) e Buch__groES_98R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO:
241) (Chong e Moran, 2016 PNAS). Os iniciadores usados para afídeo foram ApEFIa 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG; SEQ ID NO:
242) e ApEFIa 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO:
243) (Chong e Moran, 2016 PNAS). qPCR foi realizado usando uma rampa de amplificação de qPCR de 1,6 grau C/s e as seguintes condições: 1) 95°C durante 10 minutos, 2) 95°C durante 15 segundos, 3) 55°C durante 30 segundos, 4) repetir os passos 2-3 40x, 5) 95°C durante 15 segundos, 6) 55°C durante 1 minuto, 7) alteração da rampa para 0,15 grau C/s, 8) 95°C durante 1 segundo. Os dados de qPCR foram analisados usando software analítico (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).
Tratamento com análogos de vitaminas retarda o desenvolvimento de afídeos [00600] Afídeos eNASCO de 1o e 2o instar foram divididos em três grupos de tratamento separados como definido em Planejamento Experimental da Administração em Plantas (descrito aqui). Os afídeos foram monitorados diariamente e o número de afídeos em cada estágio de desenvolvimento foi determinado. Os afídeos tratados com dieta artificial isoladamente sem aminoácidos essenciais começaram a alcançar a maturidade (estágio de 5o instar) aproximadamente aos 5 dias (Fig. 48A). O desenvolvimento foi retardado em afídeos tratados com pantotenol, especialmente nos dias dois e três pós-tratamento
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291/321 (Fig. 48A), indicando que o tratamento com pantotenol enfraquece o desenvolvimento de afídeos. Por fim, a maior parte dos afídeos de cada grupo de tratamento alcançaram a maturidade e começaram a se reproduzir. Para além de monitorar o estágio de desenvolvimento de afídeos ao longo do tempo, afídeos também foram submetidos a imagiologia e a área dos afídeos foi determinada. Todos os afídeos tinham o mesmo tamanho após 1 dia de tratamento, no entanto, pelos 3 dias pós-tratamento, a área de afídeos tratados com pantotenol era menor do que a de controles não tratados. Além disso, afídeos tratados com pantotenol exibiram um aumento do tamanho do corpo (determinado pela área) muito menor ao longo da experiência em comparação com afídeos tratados com dieta artificial isoladamente sem aminoácidos essenciais (Fig. 48B).
Tratamento com análogos de vitaminas aumentou a mortalidade dos afídeos [00601] A taxa de sobrevivência de afídeos também foi medida durante os tratamentos. Afídeos criados a dieta artificial isoladamente sem aminoácidos essenciais exibiram taxas de sobrevivência mais elevadas em comparação com afídeos tratados com 10 ou 100 uM de pantotenol (Fig. 49), indicando que o tratamento com pantotenol afetou negativamente a aptidão dos afídeos.
Tratamento com pantotenol decresce a fecundidade de afídeos [00602] A fecundidade também foi monitorada em afídeos durante os tratamentos. A fração de afídeos sobrevivendo até à maturidade e se reproduzindo foi determinada. Aproximadamente um quarto dos afídeos tratados com dieta artificial sem aminoácidos essenciais sobreviveram para alcançar a maturidade pelos 8 dias pós-tratamento (Fig. 50A). Em contraste, apenas um pouco mais de 1/10° dos afídeos tratados com 10 ou 100 uM de pantotenol sobreviveram para alcançar a maturidade e se reproduziram pelos 8 dias pós-tratamento. O dia
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292/321 médio em que afídeos em cada grupo de tratamento começaram a se reproduzir também foi medido e, para todos os grupos de tratamento, o dia médio em que afídeos começaram a se reproduzir foi 7 dias (Fig. 50B). Adicionalmente, o número médio de progênie por dia produzida por afídeos maduros, se reproduzindo também foi monitorado. Os afídeos tratados com dieta artificial isoladamente sem aminoácidos essenciais produziram aproximadamente 7 descendentes/dia. Em contraste, afídeos tratados com 10 e 100 uM de pantotenol só produziram aproximadamente 4 e 5 descendentes/dia, respectivamente, mostrado na Fig. 50C. Considerados em conjunto, estes dados indicam que o tratamento com pantotenol resultou em uma perda da reprodução dos afídeos.
Tratamento com pantotenol não afeta Buchnera em afídeos [00603] Para testar se o tratamento com pantotenol resultou especificamente em perda de Buchnera em afídeos, e se esta perda teve impacto na aptidão dos afídeos, DNA foi extraído de afídeos em cada grupo de tratamento após 8 dias de tratamento e qPCR foi realizado para determinar os números de cópias de Buchnera/afídeo. Os afídeos tratados com dieta artificial isoladamente sem aminoácidos essenciais exibiram razões elevadas de cópias de DNA de Buchnera/afídeo tal como afídeos tratados com cada uma das duas concentrações de pantotenol (Fig. 51). Estes dados indicam que o tratamento com pantotenol não afeta diretamente o número de cópias de DNA de Buchnera/afídeo.
[00604] Planejamento Experimental da Administração por Revestimento Foliar:
[00605] Pantotenol em pó foi adicionado a 0,025% de um solvente de tensoativo de organossilicone não iônico, Silwet L-77, para se obter uma concentração final de 10 uM de pantotenol. O tratamento foi filtrado de modo esterilizado usando um filtro de 0,22 um e armazenado a 4 graus C. Afídeos (estirpe eNASCO, Acyrthosiphon pisum) cresceram
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293/321 em plantas de fava como descrito em um Exemplo anterior. Para as experiências, afídeos de primeiro instar foram recolhidos de plantas saudáveis e divididos em 2 grupos de tratamento diferentes: 1) controle negativo (solução de solvente isoladamente) e 2) 10 uM de pantotenol em solvente. 100 uL da solução foram absorvidos em um pedaço de 2x2 cm de folha de fava.
[00606] Cada grupo de tratamento recebeu aproximadamente o mesmo número de indivíduos de cada uma das plantas da coleção. Para cada tratamento, 20 afídeos foram colocados sobre cada folha. Os afídeos foram monitorados diariamente quanto à sobrevivência e afídeos mortos foram removidos quando foram descobertos. Adicionalmente, o estágio do desenvolvimento (1o, 2o, 3°, 4o, 5° instar e 5R, representando um 5o instar se reproduzindo) foi determinado diariamente ao longo da experiência.
Tratamento com pantotenol administrado através de revestimento foliar não afeta o desenvolvimento de afídeos [00607] Afídeos eNASCO de 1o instar foram divididos em dois grupos de tratamento separados como definido no Planejamento Experimental descrito aqui. Os afídeos foram monitorados diariamente e o número de afídeos em cada estágio de desenvolvimento foi determinado. Os afídeos colocados sobre folhas revestidas tratadas com o controle ou solução de pantotenol maturaram a velocidades similares até dois dias pós-tratamento (Fig. 52). Estes dados indicam que o revestimento foliar com pantotenol não afetou o desenvolvimento de afídeos.
Tratamento com pantotenol administrado através de revestimento foliar aumentou a mortalidade dos afídeos [00608] A taxa de sobrevivência de afídeos também foi medida durante os tratamentos de revestimento foliar. Os afídeos colocados sobre folhas revestidas com pantotenol exibiram menores taxas de sobrevivência do que afídeos colocados sobre folhas revestidas com a
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294/321 solução de controle (Fig. 53). Estes dados indicam que tratamento com pantotenol administrado através de revestimento foliar afetou significativamente (p-0,0019) a sobrevivência dos afídeos. Todos os afídeos morreram nesta experiência e não restaram afídeos para extrair DNA dos mesmos e determinar razões de DNA de Buchnera/afídeo.
[00609] Em conjunto, estes dados descritos nos Exemplos anteriores demonstram a capacidade para matar e decrescer o desenvolvimento, capacidade reprodutiva, longevidade, e populações bacterianas endógenas, por exemplo, aptidão, de afídeos por tratamento dos mesmos com pantotenol através de múltiplos métodos de administração.
Exemplo 24: Insetos tratados com um coquetel de inibidores de transportadores de aminoácidos [00610] Este Exemplo demonstra o tratamento de afídeos com um coquetel de análogos de aminoácidos. O objetivo deste tratamento foi inibir captações de glutamina nos bacteriócitos através do transportador de glutamina ApGLNTI. Foi previamente mostrado que a arginina inibe a captação de glutamina pelo transportador de glutamina (Price et al., 2014 PNAS), e a hipótese de o tratamento com análogos de arginina, ou análogos de outros aminoácidos, também pode inibir a captação de aminoácidos essenciais nos bacteriócitos de afídeos. Este Exemplo demonstra que o decréscimo da aptidão por tratamento foi mediado através da modulação de populações bacterianas endógenas ao inseto que foram sensíveis aos análogos de aminoácidos. Uma estirpe bacteriana visada é Buchnera.
[00611 ] Planejamento T erapêutico:
[00612] O coquetel de aminoácidos foi formulado para administração através de perfusão foliar e através da planta. Este método de administração consistiu em injetar folhas com aproximadamente 1 mL do coquetel de aminoácidos em água (ver abaixo a lista de componentes do coquetel) ou 1 mL da solução de controle negativo contendo
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295/321 água isoladamente.
[00613] Planejamento experimental da perfusão foliar e administração através de plantas:
[00614] Afídeos LSR-1 (que albergam apenas Buchnera), Acyrthosiphon pisum cresceram em plantas de fava (fava Vroma vicia de Johnny's Selected Seeds) em um incubador de clima controlado (fotoperíodo de 16 h de luz/8 h de escuridão; 60±5% de UR; 25±2°C). Antes de serem usadas para a criação de afídeos, plantas de fava foram cultivadas em solo envasado a 24°C com 16 h de luz e 8 h de escuridão. Para limitar efeitos maternos ou diferenças de saúde entre plantas, 5-10 adultos de diferentes plantas foram distribuídos entre 10 plantas com duas semanas de idade, e deixados multiplicar para alta densidade durante 5-7 dias. Para as experiências, afídeos de primeiro instar foram recolhidos de plantas saudáveis e divididos em 2 grupos de tratamento diferentes: 1) controle negativo (tratamento com água) e 2) tratamento com coquetel de aminoácidos. O coquetel de aminoácidos continha cada um dos seguintes agentes às concentrações finais indicadas: 330 μΜ de L-NNA (N-nitro-L-Arginina; Sigma), 0,1 mg/mL de L-canavanina (Sigma), 0,5 mg/mL de D-arginina (Sigma), 0,5 mg/mL de D~fenilalanina (Sigma), 0,5 mg/mL de D-histidina (Sigma), 0,5 mg/mL de D-triptofano (Sigma), 0,5 mg/mL de D-treonina (Sigma), 0,5 mg/mL de D-valina (Sigma), 0,5 mg/mL de D-metionina (Sigma), 0,5 mg/mL de D-leucina e 6 μΜ de L-NMMA (citrato) (Cayman Chemical). ~ 1 mL da solução de tratamento foi submetido a perfusão na folha de fava via injeção e o caule da planta foi colocado em um tubo Eppendorf de 1,5 mL contendo a solução de tratamento. A abertura do tubo foi fechada usando parafilme. Este sistema de alimentação foi então colocado em uma placa de Petri profunda (Fisher Scientific, Cat# FB0875711) e afídeos foram aplicados nas folhas da planta. Para cada tratamento, um total de 56-58 afídeos foram colocados sobre ca
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296/321 da folha (cada tratamento consistiu em duas repetições de 28-31 afídeos). Cada grupo de tratamento recebeu aproximadamente o mesmo número de indivíduos de cada uma das plantas da coleção. Os sistemas de alimentação foram mudados a cada 2-3 dias ao longo da experiência. Os afídeos foram monitorados diariamente quanto à sobrevivência e afídeos mortos foram removidos da placa de Petri profunda quando foram descobertos. O estágio de desenvolvimento dos afídeos (1o, 2o, 3o, 4o e 5o instar) foi determinado diariamente ao longo da experiência e imagens microscópicas foram tiradas dos afídeos no dia 5 para determinar medições da área dos afídeos.
[00615] Soluções de estoque de L-NNA foram preparadas a 5 mM em água, esterilizadas por passagem através de um filtro de seringa de 0,22 pm, e armazenadas a -20°C. Soluções de estoque de Lcanavanina foram preparadas a 100 mg/mL em água, esterilizadas por passagem através de um filtro de seringa de 0,22 pm, e armazenadas a 4°C. Soluções de estoque de D-arginina e D-treonina foram preparadas a 50 mg/mL em água, esterilizadas por passagem através de um filtro de seringa de 0,22 pm, e armazenadas a 4°C. Soluções de estoque de D-valina e D-metionina foram preparadas a 25 mg/mL em água, esterilizadas por passagem através de um filtro de seringa de 0,22 pm, e armazenadas a 4°C. Soluções de estoque de D-leucina foram preparadas a 12 mg/mL em água, esterilizadas por passagem através de um filtro de seringa de 0,22 pm, e armazenadas a 4°C. Soluções de estoque de D-fenilalanina e D-histidina foram preparadas a 50 mg/mL em HC11 M, esterilizadas por passagem através de um filtro de seringa de 0,22 pm, e armazenadas a 4°C. Soluções de estoque de D-triptofano foram preparadas a 50 mg/mL em HCI 0,5 M, esterilizadas por passagem através de um filtro de seringa de 0,22 pm, e armazenadas a 4°C. Soluções de estoque de L-NMMA foram preparadas a 6 mg/mL em PBS esterilizado, esterilizadas por passagem através de
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297/321 um filtro de seringa de 0,22 pm, e armazenadas a -20°C. Para os tratamentos (ver Planejamento terapêutico), a quantidade apropriada de solução de estoque foi adicionada a água para se obter a concentração final do agente no coquetel como indicado acima.
[00616] Após 6 dias de tratamento, DNA foi extraído de múltiplos afídeos de cada grupo de tratamento. Em resumo, a superfície corporal do afídeo foi esterilizada por imersão do afídeo em uma solução de lixívia 6% durante aproximadamente 5 segundos. Os afídeos foram então enxaguados em água esterilizada e DNA foi extraído de cada afídeo individual usando um kit de extração de DNA (Qiagen, kit DNeasy) de acordo com instruções do fabricante. A concentração de DNA foi medida usando uma quantificação de ácido nucleico por NanoDrop, e os números de cópias de DNA de Buchnera e afídeo foram medidos por qPCR. Os iniciadores usados para Buchnera foram BuchjgroES_J8F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 240) e Buch_groES__98R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO:
241) (Chong e Moran, 2016 PNAS). Os iniciadores usados para afídeo foram ApEFIa 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG: SEQ ID NO:
242) e ApEFIa 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO:
243) (Chong e Moran, 2016 PNAS). qPCR foi realizado usando uma rampa de amplificação de qPCR de 1,6 grau C/s e as seguintes condições: 1) 95°C durante 10 minutos, 2) 95°C durante 15 segundos, 3) 55°C durante 30 segundos, 4) repetir os passos 2-3 40x, 5) 95°C durante 15 segundos, 6) 55°C durante 1 minuto, 7) alteração da rampa para 0,15 grau C/s, 8) 95°C durante 1 segundo. Os dados de qPCR foram analisados usando software analítico (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).
Tratamento com um coquetel de análogos de aminoácidos retardou e travou a progressão do desenvolvimento de afídeos [00617] Afídeos LSR-1 de 1° instar foram divididos em dois grupos
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298/321 de tratamento separados como definido em Planejamento experimental de perfusão foliar e administração através de plantas (descrito aqui). Os afídeos foram monitorados diariamente e o número de afídeos em cada estágio de desenvolvimento foi determinado. Os afídeos tratados com água começaram a alcançar a maturidade (estágio de 5o instar) ao dia 5 pós-tratamento (Fig. 54A). Pelos 6 dias pós-tratamento, ~20 por cento dos afídeos tratados com água alcançaram o estágio de 5o instar. Em contraste, menos de 3 por cento dos afídeos tratados com o coquetel de aminoácidos alcançaram o estágio de 5o instar, mesmo após 6 dias (Fig. 54A). Este retardamento do desenvolvimento por tratamento com o coquetel de aminoácidos foi adicionalmente exemplificado pelas medições do tamanho dos afídeos registradas aos 5 dias pós-tratamento. Os afídeos tratados com água isoladamente tinham aproximadamente 0,45 mm2, ao passo que os afídeos tratados com o coquetel de aminoácidos tinham aproximadamente 0,33 mm2 (Fig. 54B). Estes dados indicam que o tratamento com o coquetel de aminoácidos retardou o desenvolvimento de afídeos, tendo um impacto negativo na aptidão dos afídeos.
Tratamento com um coquetel de análogos de aminoácidos resultou em Buchnera decrescida em afídeos [00618] Para testar se o tratamento com o coquetel de análogos de aminoácidos resultou especiflcamente em perda de Buchnera em afídeos, e se esta perda teve impacto na aptidão dos afídeos, DNA foi extraído de afídeos em cada grupo de tratamento após 6 dias de tratamento e qPCR foi realizado para determinar os números de cópias deBuchnera/afídeo. Afídeos colocados em solução de controle exibiram razões elevadas de cópias de DNA de Buchnera/afídeo. Em contraste, afídeos colocados em tratamento com coquetel de AA exibiram uma redução drástica de cópias de DNA de Buchnera/afídeo (Fig. 55), indicando que o tratamento com coquetel de análogos de AA eliminou
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Buchnera endossimbiótica.
[00619] Em conjunto, estes dados demonstram a capacidade para decrescer o desenvolvimento e populações bacterianas endógenas, por exemplo, aptidão, de afídeos por tratamento dos mesmos com um coquetel de análogos de aminoácidos.
Exemplo 25: Insetos tratados com uma combinação de agentes (antibiótico, peptídeo e antimicrobiano natural) [00620] Este Exemplo demonstra o tratamento de insetos com uma combinação de três agentes antimicrobianos - um antibiótico (rifampicina), um peptídeo (o peptídeo de escorpião Uy192), e um antimicrobiano natural (quitosana de baixo peso molecular). Em outros Exemplos, cada um destes agentes administrado individualmente resultou em aptidão decrescida dos afídeos e reduziu níveis de endossimbionte. Este Exemplo demonstra que através da administração de uma combinação de tratamentos, a aptidão de insetos e níveis de endossimbionte foram reduzidos tanto quanto, ou melhor do que, o tratamento com cada agente individual isoladamente.
Planejamento Terapêutico [00621] O tratamento de combinação foi formulado para administração através de perfusão foliar e através da planta. Este método de administração consistiu em injetar folhas com aproximadamente 1 mL do tratamento de combinação em água (com concentrações finais de 100 pg/mL de rifampicina, 100 pg/mL de Uy192 e 300 pg/mL de quitosana) ou 1 mL da solução de controle negativo contendo água isoladamente.
Planejamento experimental de perfusão foliar e administração através de plantas [00622] Afídeos LSR-1 (que albergam apenas Buchnera), Acyrthosiphon pisum cresceram em plantas de fava (fava Vroma vicia de Johnny's Selected Seeds) em um incubador de clima controlado (foto
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300/321 período de 16 h de luz/8 h de escuridão; 60±5% de UR; 25±2°C). Antes de serem usadas para a criação de afídeos, plantas de fava foram cultivadas em solo envasado a 24°C com 16 h de luz e 8 h de escuridão. Para limitar efeitos maternos ou diferenças de saúde entre plantas, 5-10 adultos de diferentes plantas foram distribuídos entre 10 plantas com duas semanas de idade, e deixados multiplicar para alta densidade durante 5-7 dias. Para as experiências, afídeos de primeiro instar foram recolhidos de plantas saudáveis e divididos em 2 grupos de tratamento diferentes: 1) controle negativo (tratamento com água) e 2) uma combinação de tratamento com 100 pg/mL de rifampicina, 100 pg/mL de Uy192 e 300 pg/mL de quitosana. -1 mL da solução de tratamento foi submetido a perfusão na folha de fava via injeção e o caule da planta foi colocado em um tubo Eppendorf de 1,5 mL contendo a solução de tratamento. A abertura do tubo foi fechada usando pa~ rafilme. Este sistema de tratamento foi então colocado em uma placa de Petri profunda (Fisher Scientific, Cat# FB0875711) e afídeos foram aplicados nas folhas da planta. Para cada tratamento, um total de 56 afídeos foi colocado sobre cada folha (cada tratamento consistiu em duas repetições de 28 afídeos). Cada grupo de tratamento recebeu aproximadamente o mesmo número de indivíduos de cada uma das plantas da coleção. Os sistemas de alimentação foram mudados a cada 2-3 dias ao longo da experiência. Os afídeos foram monitorados diariamente quanto à sobrevivência e afídeos mortos foram removidos da placa de Petri profunda quando foram descobertos. O estágio de desenvolvimento dos afídeos (1o, 2o, 3o, 4o e 5o instar) foi determinado diariamente ao longo da experiência e imagens microscópicas foram tiradas dos afídeos no dia 5 para determinar medições da área dos afídeos.
[00623] Solução de estoque de rifampicina (Tokyo Chemical Industry, LTD) foi preparada a 25 mg/mL em metanol, esterilizada por pas
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301/321 sagem através de um filtro de seringa de 0,22 pm, e armazenada a 20°C. Para o tratamento, a quantidade apropriada de solução de estoque foi adicionada a água para se obter uma concentração final de 100 pg/mL de rifampícina. Uy192 foi sintetizado por Bio-Synthesis a >75% de pureza. 1 mg de peptídeo liofilizado foi reconstituído em 500 pL de 80% de acetonitrila, 20% de água e TFA 0,1%. 100 pL (100 pg) foram transferidos em alíquotas para 10 tubos Eppendorf individuais e deixados secar. Para o tratamento, 1 mL de água foi adicionada a uma alíquota de 100 pg de peptídeo para se obter a concentração final de 100 pg/mL de Uy192. Solução de estoque de quitosana (Sigma, número do catálogo 448869-50G) foi preparada a 1% em ácido acético, submetida à autoclavagem esterilizada, e armazenada a 4°C. Para os tratamentos, a quantidade apropriada de solução de estoque foi adicionada a água para se obter a concentração final de 300 pg/mL de quitosana. [00624] Após 6 dias de tratamento, DNA foi extraído de múltiplos afídeos de cada grupo de tratamento. Em resumo, a superfície corporal do afídeo foi esterilizada por imersão do afídeo em uma solução de lixívia 6% durante aproximadamente 5 segundos. Os afídeos foram então enxaguados em água esterilizada e DNA foi extraído de cada afídeo individual usando um kit de extração de DNA (Qiagen, kit DNeasy) de acordo com instruções do fabricante. A concentração de DNA foi medida usando uma quantificação de ácido nucleico por NanoDrop, e os números de cópias de DNA de Buchnera e afídeo foram medidos por qPCR. Os iniciadores usados para Buchnera foram Buch___groES„„18F (CATGATCGTGTGCTTGTTAAG; SEQ ID NO: 228) e BuchjgroESJ98R (CTGTTCCTCGAGTCGATTTCC; SEQ ID NO:
229) (Chong e Moran, 2016 PNAS). Os iniciadores usados para afídeo foram ApEFIa 107F (CTGATTGTGCCGTGCTTATTG; SEQ ID NO:
230) e ApEFIa 246R (TATGGTGGTTCAGTAGAGTCC; SEQ ID NO:
231) (Chong e Moran, 2016 PNAS). qPCR foi realizado usando uma
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302/321 rampa de amplificação de qPCR de 1,6 grau C/s e as seguintes condições: 1) 95°C durante 10 minutos, 2) 95°C durante 15 segundos, 3) 55°C durante 30 segundos, 4) repetir os passos 2~3 40x, 5) 95°C durante 15 segundos, 6) 55°C durante 1 minuto, 7) alteração da rampa para 0,15 grau C/s, 8) 95°C durante 1 segundo. Os dados de qPCR foram analisados usando software analítico (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).
[00625] Tratamento com uma combinação de três agentes antlmicrobianos retardou e travou a progressão do desenvolvimento de afídeos [00626] Afídeos LSR-1 de 1o instar foram divididos em dois grupos de tratamento separados como definido em Planejamento experimental de perfusão foliar e administração através de plantas (descrito aqui). Os afídeos foram monitorados diariamente e o número de afídeos em cada estágio de desenvolvimento foi determinado. Os afídeos tratados com água começaram a alcançar a maturidade (estágio de 5o instar) ao dia 5 pós-tratamento (Fig. 56A). Pelos 6 dias pós-tratamento, -20 por cento dos afídeos tratados com água alcançaram o estágio de 5o instar. Em contraste, nenhum afídeo tratado com a combinação de três agentes alcançou o estágio de 5o instar, mesmo após 6 dias (Fig. 56A). Este retardamento do desenvolvimento por tratamento de combinação foi adicionalmente exemplificado por medições do tamanho dos afídeos efetuadas aos 5 dias pós-tratamento. Os afídeos tratados com água isoladamente tinham aproximadamente 0,45 mm2, ao passo que os afídeos tratados com a combinação de 3 agentes tinham aproximadamente 0,26 mm2 (Fig. 56B). Estes dados indicam que o tratamento com uma combinação de agentes retardou o desenvolvimento de afídeos, tendo impacto negativo na aptidão dos afídeos.
[00627] Tratamento com uma combinação de três agentes antimicrobianos aumentou a mortalidade dos afídeos
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303/321 [00628] A sobrevivência também foi monitorada diariamente após o tratamento. Aos 2 dias pós-tratamento, aproximadamente 75 por cento dos afídeos tratados com água estavam vivos, ao passo que somente 62 por cento dos afídeos tratados com a combinação de agentes estavam vivos. Esta tendência de mais afídeos sobrevivendo ao tratamento no grupo de controle (tratado com água) continuou durante toda a experiência. Aos 6 dias pós-tratamento, 64 por cento dos afídeos de controle (tratados com água) sobreviveram, ao passo que 58 por cento dos afídeos tratados com uma combinação de rifampicina, Uy192 e quitosana sobreviveram (Fig. 57). Estes dados indicam que a combinação de tratamentos afetou negativamente a sobrevivência dos afídeos.
[00629] Tratamento com uma combinação de três agentes resultou em Buchnera decrescida em afídeos [00630] Para testar se o tratamento com uma combinação de um peptídeo, antibiótico, e antimicrobiano natural resultou especificamente em perda de Buchnera em afídeos, e se esta perda teve impacto na aptidão dos afídeos, DNA foi extraído de afídeos em cada grupo de tratamento após 6 dias de tratamento e qPCR foi realizado para determinar os números de cópias de Buchnera/afídeo. Os afídeos tratados com água isoladamente exibiram razões de DNA de aproximadamente 2,3 Buchnera/afídeo (Fig. 58). Em contraste, afídeos tratados com a combinação de um peptídeo, antibiótico, e antimicrobiano natural exibiram razões aproximadamente 2 vezes menores de DNA de Buchnera/afídeo (Fig. 58). Estes dados indicam que o tratamento de combinação reduziu níveis do endossimbionte, que resultou em aptidão decrescida dos afídeos.
[00631] Em conjunto, estes dados demonstram a capacidade para decrescer o desenvolvimento e populações bacterianas endógenas, por exemplo, aptidão, de afídeos por tratamento dos mesmos com
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304/321 uma combinação de um peptídeo, antibiótico e antimicrobiano natural. Exemplo 26: Insetos tratados com uma solução de antibiótico [00632] Este Exemplo demonstra os efeitos de tratamento de gorgulhos com ciprofloxacina, um antibiótico bactericida que inibe a atividade de DNA girase e topoisomerase, duas enzimas essenciais para a replicação de DNA. Este Exemplo demonstra que o efeito fenotípico da ciprofloxacina em outro inseto-modelo, gorgulhos, foi mediado através da modulação de populações bacterianas endógenas aos insetos que foram sensíveis à ciprofloxacina. Uma estirpe bacteriana visada é o endossimbionte primário de Sitophilus (SPE, Candidatus Sodalis pierantonius).
[00633] Planejamento Experimental:
[00634] Gorgulhos de milho Sitophilus (Sitophilus zeamais) foram criados em milho orgânico a 27,5°C e 70% de umidade relativa. Antes de ser usado para a criação de gorgulho, milho foi congelado durante 7 dias e então temperado para 10% de umidade com água esterilizada. Para as experiências, pares de acasalamento macho/fêmea adultos foram divididos em 3 grupos de tratamento diferentes que foram realizados em triplicado: 1) controle de água, 2) 250 pg/mL de ciprofloxacina, e 3) 2,5 mg/mL de ciprofloxacina. Soluções de estoque de ciprofloxacina (Sigma) foram preparadas a 25 mg/mL em HCI 0,1 N, esterilizadas por passagem através de um filtro de seringa de 0,22 pm, e armazenadas a -20°C. Para os tratamentos, a quantidade apropriada de solução de estoque foi diluída em água esterilizada.
[00635] Os gorgulhos foram sujeitos a três tratamentos sucessivos: [00636] O primeiro tratamento incluiu embebição de 25 g de milho com cada dos três grupos de tratamento listados acima: 1) controle de água, 2) 250 pg/mL de ciprofloxacina, e 3) 2,5 mg/mL de ciprofloxacina. Em resumo, 25 g de milho foram colocados em um tubo cônico de 50 mL e cada um dos tratamentos foi adicionado para encher o tubo
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305/321 completamente. O tubo foi colocado em um agitador durante 1,5 horas após o que o milho foi removido e colocado em uma placa de Petri profunda e seco ao ar. Pares de acasalamento Macho/Fêmea foram então adicionados a cada grupo de tratamento e deixados se alimentar durante 4 dias.
[00637] Após 4 dias, os pares de acasalamento foram removidos e sujeitos a um segundo tratamento colocando os mesmos em 25 g de milho novo tratado com 1) controle de água, 2) 250 pg/mL de ciprofloxacina, e 3) 2,5 mg/mL de ciprofloxacina. Os pares de acasalamento se alimentaram e puseram ovos neste milho durante 7 dias. O milho do segundo tratamento foi avaliado quanto à emergência de progênie (ver avaliação de progênie, abaixo) [00638] Os pares de acasalamento foram sujeitos a um tratamento final que incluiu uma combinação de submergir os mesmos no tratamento (1) controle de água, 2) 250 pg/mL de ciprofloxacina, e 3) 2,5 mg/mL de ciprofloxacina durante 5 segundos e então colocar os mesmos em um frasco com 10 grãos de milho que haviam sido revestidos com 1 mL de 1) controle de água, 2) 250 pg/mL de ciprofloxacina, e 3) 2,5 mg/mL de ciprofloxacina.
[00639] A sobrevivência dos gorgulhos foi monitorada diariamente durante 18 dias, após o que DNA foi extraído dos gorgulhos remanescentes em cada grupo. Em resumo, a superfície do corpo do gorgulho foi esterilizada por imersão do gorgulho em uma solução de 6% de al~ vejante durante aproximadamente 5 segundos. Os gorgulhos foram então enxaguados em água esterilizada e DNA foi extraído de cada afídeo individual usando um kit de extração de DNA (Qiagen, kit DNeasy) de acordo com instruções do fabricante. A concentração de DNA foi medida usando uma quantificação de ácido nucleico por NanoDrop, e números de cópias de DNA de SPE e gorgulho foram medidos por qPCR. Os iniciadores usados para SPE foram qPCR__Sod_F
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306/321 (ATAGCTGTCCAGACGCTTCG; SEQ ID NO: 244) e qPCR^Sod^R (ATGTCGTCGAGGCGATTACC; SEQ ID NO: 245). Os iniciadores usados para gorgulho (β-actina) foram SA.CT144J:OR (GGTGTTGGCGTACAAGTCCT; SEQ ID NO: 246) e SACT314JREV (GAATTGCCTGATGGACAGGT; SEQ ID NO: 247) (Login et al., 2011). qPCR fol realizado usando uma rampa de amplificação de qPCR de 1,6 grau C/s e as seguintes condições: 1) 95°C durante 10 minutos, 2) 95°C durante 15 segundos, 3) 57°C durante 30 segundos, 4) repetir os passos 2-3 40x, 5) 95°C durante 15 segundos, 6) 55°C durante 1 minuto, 7) alteração da rampa para 0,15 grau C/s, 8) 95°C durante 1 segundo. Os dados de qPCR foram analisados usando software analítico (Thermo Fisher Scientific, QuantStudio Design and Analysis).
[00640] Avaliação de progênie:
[00641] Após 25 dias, uma repetição dos grãos de milho do segundo tratamento dos pares de acasalamento adultos foi dissecada (ver Planejamento Experimental, acima) para verificar quanto à presença de quaisquer larvas e pupas em desenvolvimento, ou gorgulhos adultos. A maior parte do desenvolvimento de gorgulhos Sitophilus ocorre dentro do grão/arroz/mllho e adultos emergem dos grãos assim que o seu desenvolvimento está completado. Grãos de milho foram suavemente abertos por disseção com um bisturi e quaisquer gorgulhos em desenvolvimento foram recolhidos e as percentagens de adultos, pupas e larvas foram determinadas. A superfície dos gorgulhos da disseção foi então esterilizada e os níveis de SPE foram determinados por qPCR. Grãos de milho das duas repetições restantes de cada um dos grupos do segundo tratamento não foram dissecados, mas foram verificados diariamente quanto à emergência de gorgulhos adultos.
Avaliação da penetração de antibiótico em milho [00642] 25 mg de grãos de milho foram colocados em um tubo cônico de 50 mL e água ou 2,5 mg/mL ou 0,25 mg/mL de ciprofloxacina
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307/321 em água foi adicionada para encher o tubo. Os grãos foram embebidos durante 1,5 horas como descrito aqui. Após a embebição, os grãos foram secos ao ar e avaliados para determinar se o antibiótico foi capaz de revestir e penetrar no grão. Para testá-lo, uma amostra concentrada de Escherichia coll DH5a em água foi espalhada sobre 5 placas de Caldo Luria (LB). Em cada placa foi efetuado o seguinte, 1) um grão de milho embebido em água foi adicionado, 2) um grão de milho inteiro que havia sido embebido com 2,5 ou 0,25 mg/mL de ciprofloxacina foi adicionado, e 3) meio grão de milho que havia sido embebido com 2,5 ou 0,25 mg/mL de ciprofloxacina foi adicionado e colocado virado para baixo na placa. As placas foram incubadas durante a noite a 37 graus Ceo crescimento bacteriano e/ou zona(s) de inibição foram avaliados no dia seguinte.
[00643] Embebição de grãos de milho em antibióticos permitiu que antibióticos revestissem a superfície e penetrassem nos grãos de milho.
[00644] Para testar se ciprofloxacina conseguia revestir a superfície de um grão de milho após um grão, grãos de milho foram embebidos em água sem antibióticos ou água com 2,5 ou 0,25 mg/mL de ciprofloxacina (como descrito acima). Uma cultura concentrada de E. coll foi então espalhada sobre placas LB e um dos grãos revestidos foi então colocado no centro da placa. As placas foram incubadas durante a noite, e o crescimento bacteriano foi avaliado no dia seguinte.
[00645] Um gramado de bactérias cresceu em toda a placa com o grão de milho que havia sido revestido em água sem quaisquer antibióticos (Fig. 56A). Em contraste, nenhumas bactérias cresceram em placas com grãos de milho inteiros que haviam sido embebidos em uma das duas concentrações de ciprofloxacina (Fig. 56B, painéis da esquerda). Estes dados mostram que o método de revestimento empregue nestas experiências permitiu que ciprofloxacina revestisse com
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308/321 êxito a superfície de grãos de milho e inibisse o crescimento bacteriano.
[00646] Para testar se ciprofloxacina conseguia penetrar no grão de milho, grãos de milho embebidos em 2,5 ou 0,25 mg/mL de ciprofloxacina foram cortados ao meio e colocados com o lado cortado para baixo em uma placa LB com uma cultura concentrada de E. coli. As placas foram incubadas durante a noite e no dia seguinte o crescimento bacteriano foi avaliado. Nenhum crescimento bacteriano estava presente nas placas com os grãos embebidos em qualquer uma das concentrações de antibiótico, indicando que ciprofloxacina penetrou no grão de milho (Fig. 56B, painéis da direita). Em conjunto, estes dados indicam que o método de embebição de grãos de milho usado para estas experiências fez com que o antibiótico revestisse e penetrasse com êxito nos grãos.
[00647] Tratamento com antibiótico decresce níveis de SPE na geração F0.
[00648] Pares de acasalamento de S. zeamais foram divididos em três grupos de tratamento separados como definido em Planejamento Experimental (acima). Os gorgulhos foram monitorados diariamente e todos os gorgulhos permaneceram vivos durante a experiência. Após 18 dias de tratamento, a superfície dos gorgulhos foi esterilizada, DNA genômico foi extraído, e níveis de SPE foram medidos por qPCR. Os gorgulhos tratados com água isoladamente exibiram quantidades aproximadamente 4 e 8 vezes mais elevadas de SPE em comparação com gorgulhos tratados com 250 ug/mL e 2,5 mg/mL de ciprofloxacina, respectivamente (Fig. 57). Estes dados indicam que o tratamento de gorgulhos com ciprofloxacina resultou em níveis decrescidos de SPE. [00649] Tratamento com antibiótico retarda o desenvolvimento e decresce os níveis de SPE da geração F1 de gorgulhos.
[00650] O desenvolvimento da geração F1 de gorgulhos foi avaliado
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309/321 por disseção de grãos de milho resultantes da oviposição de pares de acasalamento F0 durante 7 dias e foram subsequentemente removidos. Após 25 dias, 12 descendentes foram encontrados em milho tratado com água/controle, com a maioria (-67%) da progênie estando na forma de pupas (Fig. 58A). 13 e 20 descendentes foram encontrados em gorgulhos tratados com 250 ug/mL e 2,5 mg/mL de ciprofloxacina, respectivamente. É interessante notar que gorgulhos tratados com antibiótico exibiram um retardamento do desenvolvimento em comparação com gorgulhos tratados com controle, com a maioria (38 e 65% para 250 ug/mL e 2,5 mg/mL de ciprofloxacina, respectivamente) da progênie estando na forma larvar (Fig. 58A).
[00651] DNA genômico foi extraído de gorgulhos dissecados dos grãos de milho e qPCR foi realizado para medir os níveis de SPE. Gorgulhos F1 tratados com água tinham níveis de SPE aproximadamente 4 vezes mais elevados em comparação com gorgulhos tratados com 2,5 mg/mL de ciprofloxacina (Fig. 58B). Estes dados indicam que o tratamento com ciprofloxacina reduziu os níveis de SPE em gorgulhos que conduziu a um retardamento do desenvolvimento.
Tratamento com antibiótico decresceu a reprodução de gorgulhos [00652] O número de gorgulhos que emergiram ao longo de 43 dias depois de os pares de acasalamento iniciais terem sido removidos do segundo tratamento foi usado como uma medida da fecundidade (Fig. 59A e 59B). O primeiro gorgulho emergiu no dia 29, e o número total de gorgulhos que emergiram até ao dia 43 foi contado. Enquanto gorgulhos tratados com água e 250 ug/mL exibiram uma quantidade similar de progênie F1, houve muito menos progênie que emergiu do grupo de tratamento de 2,5 mg/mL, indicando que o tratamento com antibiótico decresceu a fecundidade de gorgulhos afetada pelos níveis de SPE.
[00653] Em conjunto com os Exemplos anteriores, estes dados de
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310/321 monstram a capacidade para matar e decrescer o desenvolvimento, capacidade reprodutiva, longevidade e populações bacteríanas endógenas, por exemplo, aptidão, de gorgulhos por tratamento dos mesmos com um antibiótico através de múltiplos métodos de administração.
Exemplo 27: Ácaros tratados com uma solução de antibióticos [00654] Este Exemplo demonstra a capacidade para matar, decrescer a aptidão de ácaros-aranha de duas manchas por tratamento dos mesmos com rifampicina, um antibiótico de pequeno espectro que inibe a síntese de RNA dependente de DNA por inibição de uma RNA polimerase bacteriana, e doxiciclina, um antibiótico de largo espectro que previne a reprodução bacteriana por inibição da síntese de proteínas. O efeito de rifampicina e doxiciclina em ácaros foi mediado através da modulação de populações bacteríanas endógenas aos ácaros que foram sensíveis aos antibióticos.
[00655] Insetos, como mosquitos e aracnídeos, como carrapatos, podem funcionar como vetores para patógenos causando doenças graves em humanos e animais como doença de Lyme, dengue, tripanossomíases e malária. Doenças transmitidas por vetores causam milhões de mortes humanas a cada ano. Além disso, doenças transmitidas por vetores que infectam animais, como gado, representam um grande fardo global para a saúde pública. Assim, são necessários métodos e composições para controlar insetos e aracnídeos que transportem doenças transmitidas por vetores. Ácaros-aranha de duas manchas são aracnídeos da mesma subclasse dos carrapatos. Em consequência, este Exemplo demonstra métodos e composições usados para decrescer a aptidão de ácaros-aranha de duas manchas e proporcionar discernimento para decrescer a aptidão de carrapatos.
Planejamento terapêutico [00656] Dois tratamentos foram usados para estas experiências 1)
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0,025% de Silwet L-77 (controle negativo) ou 2) um coquetel de antibióticos contendo 250 pg/mL de rifampicina e 500 pg/mL de doxicicll·· na. Soluções de estoque de rifampicina (Tokyo Chemical Industry, LTD) foram preparadas a 25 mg/mL em metanol, esterilizadas por passagem através de um filtro de seringa de 0,22 pm, e armazenadas a ~20°C. Soluções de estoque de doxiciclina (fabricante) foram preparadas a 50 mg/mL em água, esterilizadas por passagem através de um filtro de seringa de 0,22 pm, e armazenadas a -20°C.
[00657] Planejamento Experimental:
[00658] Este ensaio testou uma solução de antibiótico em ácarosaranha de duas manchas e determinou como a sua aptidão foi alterada ao visar micróbios endógenos.
[00659] Plantas de feijão encarnado foram cultivadas em solo envasado a 24°C com 16 h de luz e 8 h de escuridão. Ácaros foram criados em plantas de feijão encarnado a 26°C e 15-20% de umidade relativa. Para os tratamentos, discos foliares com uma polegada de diâmetro foram cortados de folhas de feijão encarnado e pulverizados com 0,025% de Silwet L-77 (controle negativo) ou com o coquetel de antibióticos (250 pg/mL de rifampicina e 500 pg/mL de doxiciclina em 0,025% de Silwet L-77) usando um Compressor Master Airbrush Brand Modelo Compressor de Ar C-16-B Black Mini Airbrush. O compressor foi limpo com etanol antes, após, e entre tratamentos. O líquido foi alimentado através do compressor usando um tubo de um quarto de polegada. Um tubo novo foi usado para cada tratamento.
[00660] Depois de os discos foliares terem secado, quatro de cada tratamento foram colocados em uma taça sobre uma bola de algodão molhado coberta com um pedaço de limpador Kimwipe. Cada montagem de tratamento foi realizada em duplicado. 25 ácaros fêmeas adultos foram então colocados na taça. No dia 4, as fêmeas foram removidas da taça e os ovos e larvas foram deixados sobre os discos folía
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312/321 res.
[00661] No dia 11, ácaros no estágio de protoninfa e no estágio de deutoninfa foram retirados das taças e colocados no seu próprio tubo para que a sobrevivência pudesse ser medida. Cada tubo continha uma bola de algodão úmido coberta com um pedaço de Kimwipe com um disco foliar de meia polegada tratado com o controle negativo ou o coquetel.
[00662] Os ácaros foram observados sob um microscópio de disseção diariamente após se alimentarem em uma folha tratada com as soluções de antibiótico ou controle, e classificados de acordo com as seguintes categorias:
[00663] Vivos: se movimentaram quando de pé ou se moveram depois de serem empurrados com um pincel.
[00664] Mortos: imóveis e não reagiram a estimulação com um pincel [00665] Um pincel esterilizado foi usado para estimular os ácaros tocando em suas patas. Os ácaros classificados como mortos foram mantidos ao longo do ensaio e novamente verificados quanto ao movimento diariamente. Os ensaios foram realizados a 26°C e 15-20% de umidade relativa.
Tratamento com antibiótico aumentou a mortalidade dos ácaros [00666] As taxas de sobrevivência dos ácaros-aranha de duas manchas tratados com o coquetel de antibióticos foram comparadas com as dos ácaros tratados com o controle negativo. As taxas de sobrevivência dos ácaros tratados com o coquetel decresceram em comparação com o controle (Fig. 60).
[00667] Estes dados demonstram a capacidade para decrescer a aptidão de ácaros por tratamento dos mesmos com uma solução de antibióticos.
Exemplo 28: Insetos tratados com uma solução de fago purificado
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313/321 [00668] Este Exemplo demonstra o isolamento e purificação de fagos de amostras ambientais que visaram bactérias de insetos específicas. Este Exemplo também demonstra a eficácia de fagos isolados contra as bactérias-alvo in vitro por ensaios em placas, por medição da sua taxa de consumo de oxigênio, e da taxa de acidificação extracelular. Por fim, este Exemplo demonstra a eficácia dos fagos in vivo, por medição da capacidade do fago para as bactérias-alvo de moscas por tratamento das mesmas com um fago isolado contra as bactérias. Este Exemplo demonstra que uma bactéria patogênica que decresceu a aptidão de um inseto pode ser eliminada usando um fago para visar as bactérias. Especificamente, Serratia marcescens, que é uma bactéria patogênica em moscas, pode ser eliminada com o uso de um fago que foi isolado de adubo de jardim.
Planejamento experimental [00669] Isolamento de bacteriófagos específicos a partir de amostras naturais:
[00670] Bacteriófagos contra bactérias-alvo foram isolados de material de uma fonte ambiental. Em resumo, uma cultura saturada de Serratia marcescens foi diluída em caldo de soja tríptica (TSB) de dupla potência fresco e cultivada durante -120 minutos para a fase log inicial a 24-26°C, ou em caldo Luria-Bertani (LB) de dupla potência e cultivada durante -90 min a 37°C. Adubo de jardim foi preparado por homogeneização em PBS e esterilizado por filtração a 0,2 pm. Detritos brutos foram esterilizados por filtração a 0,2 pm. Um volume de material de fonte filtrado foi adicionado a culturas bacterianas em fase log e a incubação foi continuada durante 24 h. Material de fonte enriquecido foi preparado por peletização de culturas e filtração do fluido do sobrenadante através de membranas de 0,45 pm.
[00671] Os fagos foram isolados plaqueando amostras sobre gramados bacterianos em ágar duplo. Culturas bacterianas estacionárias
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314/321 foram combinadas com LB ou TSB ágar 0,6% fundido e derramadas sobre placas de LB ou TSB ágar 1,5%. Após a solidificação, 2,5 pL de diluições de amostras de fagos foram dispostos em manchas sobre placas de duplo ágar e deixados absorver. As placas foram então embrulhadas e incubadas durante a noite a 25°C (TSA) ou 37°C (LB), então foram avaliadas quanto à formação de placas visíveis. Placas isoladas de novo foram purificadas por passagem em série de placas individuais na estirpe-alvo por triagem de placas para Tampão SM (TrisHCI 50 mM [pH 7,4], MgSO4 10 mM, NaCI 100 mM) e incubação durante 15 min a 55°C, então repetindo o método de disposição em manchas em duplo ágar de acima usando a suspensão de placas.
[00672] Bacteriófagos foram isolados com êxito de detritos e adubo, como detalhado acima. A formação de placas foi claramente evidente após disposição em manchas de amostras sobre gramados das bactérias S. marcescens usados para os enriquecimentos.
[00673] Passagem, quantificação, e propagação de bacteriófagos: [00674] A propagação e geração de lisados de fagos para uso em experiências subsequentes foram realizadas usando bacteriófagos isolados e purificados como acima. Em resumo, culturas bacterianas saturadas foram diluídas 100 vezes em meio fresco e cultivadas durante 60-120 minutos para alcançar um estado de crescimento logarítmico inicial para infecção eficaz com fagos. Suspensões ou lisados de fagos foram adicionados a culturas em fase log inicial e a incubação foi continuada até eliminação da turvação do caldo, indicadora de propagação dos fagos e lise bacteriana, ter sido observada, ou até às 24 h pós-infecção. Os lisados foram recolhidos por peletização de células a 7 197 x g durante 20 min, então filtração do fluido do sobrenadante através de membranas de 0,45 ou 0,2 pm. Os lisados filtrados foram armazenados a 4°C.
[00675] A enumeração de partículas de fagos infecciosas foi reali
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315/321 zada usando o método de disposição em manchas em duplo ágar. Em resumo, uma série de diluições 1:10 de amostras foi realizada em PBS e as diluições foram dispostas em manchas sobre placas de duplo ágar solidificado preparadas com as bactérias hospedeiras como acima. Unidades formadoras de placas (PFU) foram contadas após incubação durante a noite para determinar o titulo aproximado das amostras.
[00676] Análise In vitro de fagos isolados medindo a respiração bacteriana:
[00677] Um Analisador Seahorse XFe96 (Agilent) foi usado para medir os efeitos de fagos em bactérias por monitoração da taxa de consumo de oxigênio (OCR) e taxa de acidificação extracelular (ECAR) durante a infecção. Placas XFe96 foram revestidas no dia antes das experiências por 15 pL de um estoque de 1 mg/mL de poli-Llisina por poço e foram secas durante a noite a 28°C, e sondas XFe96 foram equilibradas por colocação em poços contendo 200 pL de Calibrador XF e incubação no escuro à temperatura ambiente. No dia seguinte, placas revestidas com poli-L-lisina foram lavadas duas vezes com ddH2O. Culturas durante a noite saturadas de E. coli BL21 (LB, 37°C) ou S. marcescens (TSB, 25°C) foram subcultivadas a 1:100 no mesmo meio e cresceram com arejamento durante --2,5 h a 30°C. As culturas foram então diluídas para O.D. 600 nm ~ 0,02 usando o mesmo meio. Os tratamentos foram preparados por diluição de estoques em Tampão SM a 10x concentração final e carga de 20 pL das soluções 10x nos portos de injeção apropriados da placa de sonda. Enquanto as sondas estavam equilibrando no Analisador de Fluxo XFe96, placas bacterianas foram preparadas por adição de 90 pL de suspensões bacterianas ou controles de meio e rotação a 3 000 rpm durante 10 min. Após centrifugação, mais 90 pL do meio apropriado foram adicionados suavemente aos poços de modo a não perturbar a
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316/321 aderência bacteriana, perfazendo o volume total para 180 pL por poço. [00678] O Analisador de Fluxo XFe96 foi operado a ~30°C, após uma aplicação de ciclos de Mistura, Espera, Leitura de 1:00, 0:30, 3:00. Quatro ciclos foram completados para permitir a equilibraçâo/normalização de bactérias, então os tratamentos de 20 pL foram injetados e a aplicação de ciclos continuou como acima, durante um período de tempo total de aproximadamente 6 h. Os dados foram analisados usando o pacote de software Seahorse XFe96 Wave.
[00679] Os efeitos de bacteriófagos isolados foram avaliados medindo a taxa de consumo de oxigênio (OCR) e a taxa de acidificação extracelular (ECAR) de bactérias com um Analisador Seahorse XFe96. Quando E. coli foi infectada com fago T7 e S. marcescens infectada com o isolado de novo éSmVL-CI, decréscimos dramáticos da OCR foram observados após breves jatos desta taxa (Fig. 64). Para ambos os fagos com os dois organismos hospedeiros, o ensaio Seahorse permitiu a detecção de infecção com fagos bem-sucedida sem a necessidade de ensaios de placas. Assim, este método é aplicável para detectar a infecção com fagos de um organismo hospedeiro não propício a métodos de detecção com fagos tradicionais.
[00680] Ensaio de transdução com SYBR Gold para identificação de infecção:
[00681] Preparações de bacteriófago foram produzidas para coloração por pré-tratamento com nucleases com o propósito de remover ácidos nucleicos extravírais que podem interferir na interpretação de sinais fluorescentes. Em resumo, MgCI2 foi adicionado a 10 mL de lisado de fagos à concentração final de 10 mM, e RNase A (Qiagen) e DNase I (Sigma) foram ambas adicionadas para concentrações finais de 10 pg/mL. As amostras foram incubadas durante 1 h à temperatura ambiente. Após tratamento com nucleases, 5 mL de Usados foram combinados com 1 pL de SYBR Gold (Thermo, 10 OOOx) e incubados à
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317/321 temperatura ambiente durante ~1,5 h. O corante em excesso foi subsequentemente removido de amostras usando colunas de ultrafiltração Amicon. Em resumo, colunas Amicon (15 mL, limite de peso molecular 10 k) foram lavadas por adição de 10 mL de Tampão SM e rotação a 5 000 x g, 4°C durante 5 min. Amostras de fagos etiquetadas foram então submetidas a rotação através das colunas a 5 000 x g, 4°C até o volume ter decrescido em aproximadamente 10 vezes (15-30 min). Para lavar amostras, 5 mL de Tampão SM foram adicionados a cada reservatório e a rotação foi repetida, seguida de mais duas lavagens. Após a terceira lavagem, as amostras retidas foram pipetadas dos reservatórios Amicon e perfeitas para aproximadamente 1 mL usando Tampão SM. Para remover contaminantes maiores, amostras de fagos lavados e etiquetados foram submetidas a rotação a 10 000 x g durante 2 min, e os sobrenadantes foram subsequentemente filtrados através de membranas de 0,2 pm para microtubos negros e armazenados a4°C.
[00682] Culturas bacterianas saturadas (E. coll MG1655 cultivada em LB a 37°C, S. marcescens e S. symbiotica cultivadas em TSB a 26°C) foram preparadas por rotação de alíquotas de 1 mL e lavagem uma vez com 1 mL de PBS antes de uma ressuspensão final usando 1 mL de PBS. Bactérias etiquetadas de controle positivo foram coradas por combinação de 500 pL de bactérias lavadas com 1 pL de SYBR Gold e incubação durante 1 h no escuro à temperatura ambiente. As bactérias foram peletizadas por rotação a 8 000 x g durante 5 min e lavadas duas vezes com um volume igual de PBS, seguido de ressuspensão em um volume final de 500 pL de PBS. Um volume de 25 pL de bactérias coradas foi combinado com 25 pL de Tampão SM em um microtubo negro, ao qual 50 pL de formalina 10% (volume final de 5%, formaldeído ~2%) foram adicionados e misturados com um movimento súbito. As amostras foram fixadas à temperatura ambiente durante ~3
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318/321 h e então lavadas usando colunas de ultrafiltração Amicon. Em resumo, 500 pL de água picopura foram adicionados a colunas Amicon (0,5 mL, limite de peso molecular de 100 k) e submetidos à rotação a 14 000 x g durante 5 min para lavar membranas. As amostras fixadas foram diluídas por adição de 400 pL de PBS e então transferidas para colunas de rotação pré-lavadas e submetidas a rotação a 14 000 x g durante 10 min. As colunas foram transferidas para tubos de recolha frescos, e 500 pL de PBS foram adicionados para diluir fixador remanescente no retentado. Subsequentemente, duas diluições adicionais com PBS foram realizadas, para um total de três lavagens. Os retentados finais foram diluídos para aproximadamente 100 pL, então as colunas foram invertidas para tubos de recolha frescos e o sistema foi submetido à rotação a 1 000 x g durante 2 min para recolher amostras. As amostras lavadas foram transferidas para microtubos negros e armazenadas a 4°C.
[00683] Para as experiências de transdução e controles, 25 pL de bactérias (ou PBS) e 25 pL de fagos etiquetados com SYBR Gold (ou Tampão SM) foram combinados em microtubos negros e incubados de modo estático durante 15-20 min à temperatura ambiente para permitir a adsorção dos fagos e injeção em bactérias recebedoras. Imediatamente após a incubação, 50 pL de formalina 10% foram adicionados a amostras e a fixação foi realizada à temperatura ambiente durante -4 h. As amostras foram lavadas com PBS usando colunas Amicon, como acima.
[00684] Foi requerida Injeção de ácido nucleico de bacteriófago para que um fago infectasse com êxito uma célula bacteriana hospedeira. Collfago P1kc etiquetado com SYBR Gold e coincubado com S. marcescens revelou a presença de bactérias fluorescentes por microscopia, validando o uso deste ensaio em uma arquitetura encadeada de isolamento de fagos. Tal como com o ensaio Seahorse, esta aborda
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319/321 gem proporcionou uma alternativa a métodos tradicionais com fagos para permitir a expansão para organismos não propícios a um ensaio de placas. Adicionalmente, o ensaio de transdução com SYBR Gold nâo requereu crescimento bacteriano, logo é aplicável à análise de fagos visando organismos de cultura difícil ou mesmo não cultiváveis, incluindo endossimbiontes como Buchnera.
Teste in vivo da eficácia dos fagos contra S. marcescens em moscas Drosophila melanoqaster [00685] Culturas de S. marcescens cresceram em Caldo de Soja Tríptica (TSB) a 30°C com agitação constante a 200 rpm.
[00686] O meio usado para criar estoques de moscas foi meio de farelo de milho, melaço e levedura (11 g/L de levedura, 54 g/L de farelo de milho amarelo, 5 g/L de ágar, 66 ml/L de melaço e 4,8 ml/L de ácido propiônico). Todos os componentes da dieta excetuando o ácido propiônico foram aquecidos em conjunto para 80°C em água desionizada com mistura constante durante 30 minutos e deixados esfriar para 60°C. O ácido propiônico foi então misturado no sistema e 50 mL da dieta foram transferidos em alíquotas para garrafas individuais e deixados esfriar e solidificar. As moscas foram criadas a 26°C, ciclo de 16:8 horas de luz:escuridão, a cerca de 60% de umidade.
[00687] Para infectar as moscas com S. marcescens, uma agulha fina (Ponta com cerca de 10 um de largo) foi imersa em uma cultura de fase estacionária densa durante a noite e o tórax das moscas foi pun~ cionado. Para esta experiência, quatro repetições de 10 machos e 10 fêmeas cada foram infectados com S. marcescens usando o método de punção com agulha como controle positivo para a mortalidade das moscas. Para o grupo de tratamento, quatro repetições de 10 machos e 10 fêmeas cada foram picados com S. marcescens e uma solução de fagos contendo cerca de 108 partículas de fagos/mL. Por fim, duas repetições de 10 machos e 10 fêmeas cada que não foram picados
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320/321 nem tratados de modo nenhum foram usadas como controle negativo para a mortalidade.
[00688] Moscas em todas as condições foram colocadas em garrafas de alimento e incubadas a 26°C, ciclo de 16:8 luz:escuridão, a 60% de umidade. Os números de moscas vivas e mortas foram contados em cada dia durante quatro dias após as picadas. Todas as moscas picadas com S. marcescens isoladamente estavam mortas em um período de 24 horas do tratamento. Em comparação, mais de 60% das moscas no grupo de tratamento com fagos, e todas as moscas no grupo de controle não tratado estavam vivas nesse momento (Fig. 65). Além disso, a maior parte das moscas no grupo de tratamento com fagos e no grupo de controle negativo sobreviveram durante mais quatro dias quando a experiência foi terminada.
[00689] Para averiguar o motivo da morte das moscas, moscas mortas de ambas as moscas picadas com S. marcescens e S. marcescens + fago foram homogeneizadas e plaqueadas. Quatro moscas mortas de cada uma das quatro repetições de ambos os tratamentos com S. marcescens e S. marcescens + fago foram homogeneizadas em 100 uL de TSB. Uma diluição 1:100 também foi produzida por diluição do homogenado em TSB. 10 uL do homogenado concentrado bem como a diiuição 1:100 foram plaqueados em piacas TSA, e incubados durante a noite a 30°C. Por inspeção das placas quanto ao crescimento de bactérias, todas as placas das moscas mortas picadas com S. marcescens exibiram um gramado de bactérias crescendo sobre as mesmas, ao passo que as placas das moscas mortas picadas com S. marcescens + fago não exibiram bactérias sobre as mesmas. Isto mostra que, na ausência do fago, S. marcescens provavelmente induziu choque séptico nas moscas, conduzindo à sua fatalidade. No entanto, na presença do fago, a mortalidade pode ter sido devida a lesão causada pela picada com a agulha.
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OUTRAS MODALIDADES [00690] Apesar de a invenção anterior ter sido descrita em algum detalhe a título de ilustração e exemplo para propósitos de clareza da compreensão, as descrições e exemplos não devem ser considerados limitadores do escopo da invenção. As revelações de todas as patentes e literatura científica citadas aqui são expressamente incorporadas na sua totalidade a título de referência.

Claims (9)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método para decrescer a aptidão de um vetor para um patógeno de animais, caracterizado pelo fato de que compreende:
    administrar um peptídeo antimicrobiano tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma ou mais das seguintes: cecropina (SEQ ID NO: 82), melitina, copsina, drosomicina (SEQ ID NO: 93), dermcidina (SEQ ID NO: 81), andropina (SEQ ID NO: 83), moricina (SEQ ID NO: 84), ceratotoxina (SEQ ID NO: 85), abaecina (SEQ ID NO: 86), apidaecina (SEQ ID NO: 87), profenina (SEQ ID NO: 88), indolicidina (SEQ ID NO: 89), protegrina (SEQ ID NO: 90), taquiplesina (SEQ ID NO: 91), ou defensina (SEQ ID NO: 92) ao vetor.
  2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a administração compreende administrar o peptídeo antimicrobiano em pelo menos um habitat onde o vetor cresce, vive, se reproduz, alimenta, ou infesta.
  3. 3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o peptídeo antimicrobiano é administrado em uma composição comestível por insetos para ingestão pelo vetor.
  4. 4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o peptídeo antimicrobiano é formulado como uma composição líquida, sólida, de aerossol, pastosa, de gel ou gasosa.
  5. 5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o inseto é pelo menos um de um mosquito, cecidomídeo, piolho, mosquito-palha, carrapato, triatomíneo, mosca tsé-tsé, ou pulga.
  6. 6. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um peptídeo antimicrobiano tendo pelo menos 90% de identidade de sequência com uma ou mais das seguintes: cecropina, melitina, copsi
    Petição 870190060758, de 28/06/2019, pág. 623/641
    2/2 na, drosomicina, dermcidina, andropina, moricina, ceratotoxina, abaecina, apidaecina, profenina, indolicidina, protegrina, taquiplesina ou defensina formuladas para visar um microrganismo em um vetor para um patógeno de animais.
  7. 7. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o peptídeo antimicrobiano está a uma concentração de cerca de 0,1 ng/g até cerca de 100 mg/g na composição.
  8. 8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 ou 7, caracterizada pelo fato de que o peptídeo antimicrobiano compreende adicionalmente um domínio de direcionamento.
  9. 9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6, 7 ou 8, caracterizada pelo fato de que o peptídeo antimicrobiano compreende adicionalmente um peptídeo penetrador de células.
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