WO2023184005A1 - Composição, método de controle de insetos e uso de pelgipeptinas - Google Patents
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Classifications
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- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
Definitions
- the invention concerns a composition, method of insect control and use of pelgipeptins. More specifically, the invention refers to the use of pelgipeptins for the development of biocidal compositions and for the control of vectors and agricultural pests.
- the present invention lies in the fields of Chemistry, Biochemistry and Biotechnology.
- the Aedes aegypti mosquito is an insect belonging to the order Diptera. In addition to being considered the urban transmitter of yellow fever, it is the main vector of dengue, Zika and Chikungunya viruses, with Brazil being the country that has presented the highest number of cases of these viruses in recent years (Kotsakiozi et al., 2017) .
- Yellow fever is an acute febrile illness, of clinical severity, that it can lead to hemorrhagic conditions, shock and multiple organ failure.
- Dengue, Zika and Chikungunya are diseases with similar symptoms, such as fever, headaches, muscle or joint pain (Cleton et al., 2012; Wilder-Smith et al., 2017).
- the Culex quinquefasciatus mosquito (order Diptera) is related to the transmission of filariasis, encephalitis and West Nile fever. It has a markedly anthropophilic habit, but it can also obtain its blood meal from dogs, cats, horses, wild and domestic birds, rodents, bats and other animals, favoring the transmission of pathogenic agents to humans (Boga et al., 2019; Wilder -Smith et al., 2017). It is also known that the C. quinquefasciatus mosquito can be infected by the Zika virus, releasing the virus in its saliva, being able to transmit it effectively (Guedes et al., 2017).
- Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus mosquitoes are associated with urban areas with poor sanitation. Therefore, the main way to prevent viruses transmitted by these mosquitoes is to combat the vector.
- the World Health Organization recommends the use of biological insecticide formulations using bacteria such as Bacillus thuringiensis to control mosquito vectors, as this bacteria, in addition to being efficient, is not toxic to other orders of insects, animals and plants (Whiteley and Schnepf, 2003).
- the Central-West region is the largest producer of corn, soybeans and cotton crops, combined. Of these crops, in the 2017/2018 harvest, it was estimated that 92% were genetically modified (transgenic), being resistant to insects, herbicide tolerant or both.
- Lepidoptera insects mainly the genus Spodoptera
- the Spodoptera frugiperda caterpillar is polyphagous and is considered one of the main pests of crops in Brazil and the Cerrado. Numerous data reveal that this pest shows resistance to most chemical insecticides and Bt plants (Netto et al., 2018).
- Document US9534019B2 describes a process for extracting lipopeptides from cultures of the bacterium Paenibacillus, more specifically Paenibacillus elgii (Henrique et al., 2015). The document also refers to the use of such peptides for the composition for prophylactic use and treatment of animals and plants.
- Document WO 2012/139179 A1 describes the use of pelgipeptins, the same family of lipopeptides as this invention, as antimicrobials and growth promoters, in the treatment and prophylaxis of animals and plants (Henrique et al., 2012).
- Document PI 0312448-7 A describes the insecticidal activity against lepidoptera of the Paenibacillus strain DAS1529. This activity is attributed to a Cry-like protein produced by this isolate. It is not a lipopeptide (Bintrim et al., 2005).
- Document BR 102017009855-9 A2 describes the use of fermented Bacillus thuringiensis to obtain a liquid formulation with larvicidal activity, having demonstrated its activity against Aedes aegypti (Kreutz, 2018).
- the document Manonmani et al. 201 1, entitled "Enhanced production of mosquitocidal cyclic lipopeptide from Bacillus subtilis subsp. subtilis” describes the larvicidal activity of surfactin against the Anopheles stephens mosquito, which transmits malaria.
- Surfactin is a lipopeptide produced by a strain of Bacillus subtilis, whose amino acid sequence is: Glu1 -Leu2-Leu3-Val4- Asp5-Leu6-Leu7 linked to a fatty acid chain that can vary from 11 to 15 carbons.
- Mukherjee et al. 2006 entitled “Assessment of mosquito larvicidal potency of cyclic lipopeptides produced by Bacillus subtilis strains” describes the larvicidal activity of an extract produced from the cultivation of another strain of Bacillus subtilis, which produces the lipopeptides surfactins, iturins and fengycins. Iturins are heptapeptides whose amino acid sequence is Asn1 -Tyr2- Asn3-Gln4-Pro5-Asn6-Ser7 linked to a fatty acid chain that can vary from 11 to 15 carbons.
- Fengycins are cyclic decapeptides whose sequence is: Glu1 -Orn2-Tyr3-Thr4-Glu5-Ala6-Pro7-Gln8-Tyr9-lle10 linked to a fatty acid that varies from 14 to 18 carbons.
- Ghribi et al. 2012 entitled “Evaluation of larvicidal potency of Bacillus subtilis SPB1 biosurfactant against Ephestia kuehniella (Lepidoptera: Pyralidae) larvae and influence of abiotic factors on its insecticidal activity” reports the larvicidal activity of metabolites produced by Bacillus subtilis against Lepidoptera larvae. However, the molecules responsible for this activity have not been described.
- the document NEUNG, Saophuong et al., 2014, entitled "Insecticidal potential of Paenibacillus elgii HOA73 and its combination with organic sulfur pesticide on diamondback moth, Plutella xylostella” refers to the insecticidal potential of extracts of the bacterium Paenibacillus elgii strain HOA73 using a medium containing chitin and gellan.
- the article reveals that the larvicidal activity is caused by hydrolytic enzymes, unlike the technology proposed here, in which the activity is proven to be attributed to lipopeptides from the family of pelgipeptins.
- the present invention solves the problems of the prior art through the development of a larvicidal composition, insect control method and use of pelgipeptins.
- the present invention discloses a larvicidal composition comprising from 0.7 pg/ml to 1000 pg/ml of pelgipeptins and at least one agriculturally acceptable vehicle.
- the present invention discloses a method of insect control comprising at least one step of applying a larvicidal composition comprising from 0.7 pg/ml to 1000 pg/ml of pelgipeptins to insect larvae.
- the present invention discloses the use of pelgipeptins in the control of pests and/or insects.
- Figure 1 shows the general structure of pelgipeptins, in which: Dab is 2,4-diaminobutyric acid; Phe: phenylalanine; Leu: leucine; Will: valine; Ser: serine. R and X vary depending on the isoform.
- Figure 2 refers to a test with pelgipeptin at a low concentration, 0.625 pM, which demonstrates that, even at a dose that causes little or no mortality, pelgipeptin visibly interferes with the development of the larvae.
- B Culex quinquefasciatus larvae 24 hours after treatment with pelgipeptin 0.625 pM (B) compared to the negative control (A), without addition of the lipopeptide.
- the treatment was carried out with 2 S instar larvae and caused visible damage to their development.
- Figure 3 shows Culex quinquefasciatus larvae 72 hours after treatment with pelgipeptin 0.625 pM (B) compared to the negative control (A), without addition of the lipopeptide.
- the treatment was carried out with 2 S instar larvae. Although pelgipeptin does not cause significant mortality in larvae at this concentration, treated larvae are visibly smaller.
- Figure 4 shows fourth instar larvae of C. quinquefasciatus after 24 hours of exposure to pelgipeptins at a concentration of 10 pM. Larvae at the bottom of the tube are dead.
- the present invention concerns a larvicidal composition, a method of controlling insects and using pelgipeptins. More specifically, the invention comprises the use of pelgipeptins, which can be obtained from a supernatant of a cell culture obtained after the growth of the bacterium Paenibacillus elgii in a chemically defined MMP medium, said medium being as defined in patent document BR102017018881 -7 , in bioinsecticide compositions or products, especially for the control of vectors and agricultural pests.
- the Pelgipeptins family is a class of lipopeptides produced by Paenibacillus elgii. This family comprises 4 lipopeptide isoforms that have a chain of nine amino acids cyclically linked to a fatty acid chain. Each of the 4 isoforms varies the fatty acid portion by the difference of 1 CH2, as well as the amino acids in position 2 of the peptide chain, which can be L-valine or L-isoleucine.
- the present invention in one embodiment, refers to the insecticidal activity of an extract produced from a chemically defined MMP medium, using the bacterium Paenibacillus elgii, strain AC13 0, which has a high concentration of pelgipeptins and low concentration of other molecules/impurities, as demonstrated with activity assays using purified molecules, pelgipeptins are the molecules responsible for the larvicidal activity of the extract, but the extract can also be used.
- a second embodiment of the invention refers to the use of pelgipeptins against mosquito vectors such as Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus.
- compositions comprising from 0.7 pg/ml to 1000 pg/ml of pelgipeptins have high biocidal potential in combating larvae, especially larvae of Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus and Spodoptera frugiperda, as can be seen in the experimental results present in the examples of the present invention.
- composition of the present invention does not present toxicity to humans, animals and does not cause damage to the environment, being an efficient, sustainable and safe alternative to the use of conventional pesticides and insecticides.
- the present invention discloses a process for obtaining pelgipeptins comprising the following steps: i) culturing Paenibacillus elgii in a culture medium; ii) recover the cultivation supernatant from step i) after approximately 72 hours have passed since the start of cultivation; iii) concentrate or purify the pelgipeptins present in the supernatant obtained at the end of step ii); wherein said culture medium comprises, by weight:
- the material obtained at the end of step iii) is free of Paeninacillus elgii cells.
- the culture medium comprises, by weight:
- the cultivation supernatant from step i) is recovered after between 54h and 72h have passed since the start of cultivation. In one embodiment, the supernatant from the cultivation of step i) is recovered after at least 60h have passed since the beginning of the cultivation. In one embodiment, the supernatant from the cultivation of step i) is recovered after at least 65h have passed since the beginning of the cultivation. Bacterial cells are removed by centrifugation and the supernatant is concentrated 5 times (SN 5X). In one embodiment, the SN 5X supernatant can be incorporated into the larvicidal composition. Alternatively, pelgipeptins can be purified for incorporation into the larvicidal composition.
- the present invention discloses a larvicidal composition comprising from 0.7 pg/ml to 1000 pg/ml of pelgipeptins and at least one agriculturally acceptable vehicle.
- the composition comprises from 7 pg/ml to 700 pg/ml of pelgipeptins. In one embodiment, the composition comprises from 7 pg/ml to 100 pg/ml pelgipeptins. In one embodiment, the composition comprises from 7 pg/ml to 70 pg/ml pelgipeptins. In one embodiment, the composition comprises from 7 pg/ml to 35 pg/ml pelgipeptins. In one embodiment, the composition comprises from 7 pg/ml to 50 pg/ml pelgipeptins.
- the pelgipeptins of the larvicidal composition are obtained by a process as defined above.
- the composition comprises from 30% to 95%, by volume, of a solvent. In one embodiment, the composition comprises from 40% to 95% by volume of a solvent. In one embodiment, the composition comprises from 50% to 95%, by volume, of a solvent. In one embodiment, the composition comprises from 70% to 95% by volume of a solvent.
- the composition comprises at least one additional component selected from the group consisting of:
- the composition comprises, in addition to pelgipeptins that can be purified or in the form of SN 5x supernatant, extracts of Bacillus thuringiensis and/or Lysinibacillus sphaericus.
- the composition comprises from 1% to 90%, by mass, of extracts of Bacillus thuringiensis and/or Lysinibacillus sphaericus. In one embodiment, the composition comprises from 5% to 80%, by mass, of extracts of Bacillus thuringiensis and/or Lysinibacillus sphaericus. In a embodiment, the composition comprises from 5% to 70%, by mass, of extracts of Bacillus thuringiensis and/or Lysinibacillus sphaericus. In one embodiment, the composition comprises from 5% to 60%, by mass, of extracts of Bacillus thuringiensis and/or Lysinibacillus sphaericus.
- the composition comprises from 1% to 50%, by mass, of extracts of Bacillus thuringiensis and/or Lysinibacillus sphaericus. In one embodiment, the composition comprises from 10% to 40%, by mass, of extracts of Bacillus thuringiensis and/or Lysinibacillus sphaericus. In one embodiment, the composition comprises 20% to 30%, by mass, of extracts of Bacillus thuringiensis and/or Lysinibacillus sphaericus.
- the present invention discloses a method of controlling insects comprising at least one step of applying a larvicidal composition comprising from 0.7 pg/ml to 1000 pg/ml of pelgipeptins to insect larvae.
- the composition comprises from 0.7 pg/ml to 1000 pg/ml of pelgipeptins and at least one other agriculturally acceptable carrier.
- the insects are of the orders Diptera or Lepidoptera.
- pelgipeptins are used to control Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus and/or Spodoptera frugiperda.
- the insect larvae are second and/or fourth instar.
- the application of pelgipeptins is by spraying, atomization, dusting or gel application.
- the present invention discloses the use of pelgipeptins in controlling pests and/or insects.
- pelgipeptins are used to control insect larvae.
- pelgipeptins are used to control insect populations.
- the insects are of the orders Diptera or Lepidoptera.
- pelgipeptins are used to control Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus and/or Spodoptera frugiperda.
- MMP chemically defined medium refers to a mineral culture medium that meets the nutritional requirements of the bacteria and that generates an extract low in impurities, being specifically developed for the production of antimicrobial lipopeptides by bacteria. Said means is as defined in patent document BR 102017018881 -7.
- LC50 refers to the lethal concentration necessary to cause 50% mortality in the tested population.
- First instar larva as used herein, the term “First instar larva” refers to the first stage of development of the larva after hatching from the egg.
- Second instar larva refers to the second stage of development of the larva, after the first molt or ecdysis. The larvae go through 4 stages of development, until they become pupae.
- Bioinsecticide refers to biological insecticides, developed from microorganisms such as viruses, bacteria and fungi or plant extracts. Preferably, they do not present toxicity to humans and animals and do not cause damage to the environment.
- Pesticides refers to products and agents of physical, chemical or biological processes, intended for use in the production sectors, in the storage and processing of agricultural products, in pastures, in the protection of forests, native or planted, and other ecosystems and urban, water and industrial environments, whose The purpose is to change the composition of flora or fauna, in order to preserve them from the harmful action of living beings considered harmful, as well as the substances and products used as defoliants, desiccants, growth stimulators and inhibitors.
- Active ingredients refers to compounds and/or substances that have a pest and/or insect controlling action.
- the active ingredient is an agrochemical selected from the group of pesticide, insecticide, fungicide, herbicide, acaricide, molluscicide, nematicide and/or plant growth modifying agent.
- Agriculturally acceptable vehicle refers to substances devoid of biocidal power, used to ensure the stability, effectiveness and physicochemical properties of one or more active ingredients in compositions, and may be of animal, vegetable or synthetic origin.
- a non-exhaustive list of agriculturally acceptable carriers includes excipients, surfactants, polymers, mineral oils, vegetable oils, wetting agents, drift controllers, thickening agents, adhesive agents, antioxidants, syrup conditioners, compatibility agents, pH regulators, humectants, defoamers and UV absorbers.
- Non-exhaustive examples of excipients include sodium citrate, calcium carbonate, calcium phosphate, lactose, polyethylene glycols of varying molecular weights, sweeteners, flavoring agents, coloring agents, emulsifying agents or suspension improvers.
- Non-exhaustive examples of disintegrating agents include starch or complex silicates.
- Non-exhaustive examples of binding agents include polyvinylpyrrolidone, sucrose, acacia, starches, gum arabic, gelatin, methylcellulose, carboxymethylcellulose.
- Non-exhaustive examples of lubricating agents include magnesium stearate, sodium laurel sulfate, acacia, silica, talc, stearic acid, calcium stearate and/or polyethylene glycols.
- Non-exhaustive examples of diluents include water, ethanol, propylene glycol, glycerin and combinations thereof. Additional examples include lactose, dextrose, sucrose, cellulose, corn starch or potato starch.
- Non-exhaustive examples of disintegrating agents that can be used in the compositions of the present invention are: starch, alginic acid, alginates or starch or sodium glycolate; effervescent mixtures; dyes; and sugary.
- Non-exhaustive examples of wetting/humectant agents are lectin, polysorbates and lauryl sulfates.
- Non-exhaustive examples of carrier agents include sucrose or sucrose with glycerin and/or mannit and/or sorbitol, natural gum, agar, sodium alginate, pectin, methylcellulose, carboxymethylcellulose or polyvinyl alcohol, sterile oils, propylene glycol and aqueous solutions sterile.
- compositions of the invention can be added to the compositions of the invention, such as additives to reduce foaming, caking, corrosion, unwanted microbial growth, and other similar agents.
- the lipopeptides of interest can be obtained after the growth of said bacteria in a chemically defined MMP medium (BR Patent 1020170188817), after a purification process or not yet purified, directly using the cell-free fermented product.
- the tests were carried out with second instar larvae of A.aegypti and C.quinquefasciatus. Twenty-five second instar larvae of each mosquito species were added to 200 ml plastic cups containing 100 ml of distilled water. The doses tested were 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625 and 0.312 pM. Each dose was tested in triplicate and three biological replicates were made. Readings for A. aegypti were performed after 24 hours and readings for C. quinquefasciatus were performed 48 hours after exposure to lipopeptides. The LC50 calculation was carried out using Probit analysis (FINNEY, 1971).
- LC50 values of purified Pelgipeptin and cell-free fermented are presented in tables 2 and 3. Table 2. LC50 values for Pelgipeptin against second instar larvae of Aedes aegypti and Culex quiinquefasciatus
- Lipopeptides when administered at LC50 against fourth instar larvae, were able to kill 100% of C. quinquefasciatus larvae and 84% of A. aegypti larvae.
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Abstract
A invenção se trata de uma composição, método de controle de insetos e uso de pelgipeptinas. Mais especificamente a invenção refere-se ao emprego de pelgipeptinas para o desenvolvimento de composições biocidas e para o controle de vetores e pragas agrícolas. A presente invenção se situa nos campos da Química, Bioquímica e Biotecnologia.
Description
Relatório Descritivo de Patente de Invenção
COMPOSIÇÃO, MÉTODO DE CONTROLE DE INSETOS E USO DE PELGIPEPTINAS
Campo da Invenção
[0001] A invenção se trata de uma composição, método de controle de insetos e uso de pelgipeptinas. Mais especificamente a invenção refere-se ao emprego de pelgipeptinas para o desenvolvimento de composições biocidas e para o controle de vetores e pragas agrícolas. A presente invenção se situa nos campos da Química, Bioquímica e Biotecnologia.
Antecedentes da Invenção
[0002] Diversos agentes causais de doenças infecciosas se disseminam por meio de transportador intermediário, conhecido biologicamente como vetor. A taxa de transmissão dessas doenças está intimamente ligada ao número de encontros entre hospedeiros e vetores, e da densidade desses últimos (Klempner et al., 2007; Musso and Gubler, 2016). No Brasil, os mosquitos Culex quinquefasciatus e Aedes aegypti têm distribuição geográfica generalizada (Marcondes et al., 2015).
[0003] O mosquito Aedes aegypti é um inseto pertencente à ordem Diptera. Além de ser considerado o transmissor urbano da febre amarela é o principal vetor dos vírus da dengue, Zika e Chikungunya, sendo o Brasil o país que tem apresentado o mais elevado número de casos dessas viroses nos últimos anos (Kotsakiozi et al., 2017).
[0004] Em 2018 o Brasil registrou 265.934 casos prováveis de dengue, sendo 321 confirmados na forma grave da doença, ocasionando 155 óbitos. A febre Chikungunya apresentou no mesmo ano, 87.687 prováveis casos, com 39 óbitos confirmados. Enquanto a doença pelo vírus Zika registrou 8.680 casos prováveis (Ministério da Saúde, 2018).
[0005] A febre amarela é uma doença febril aguda, de gravidade clínica, que
pode levar a quadros hemorrágicos, choque e insuficiência múltipla dos órgãos. Dengue, Zika e Chikungunya são doenças com sintomas parecidos, como febre, dores de cabeça, dores musculares ou nas articulações (Cleton et al., 2012; Wilder-Smith et al., 2017).
[0006] A infecção por Zika em gestantes pode levar à microcefalia nos bebês, principalmente no primeiro trimestre de gestação (Brady et al., 2019; Johansson et al., 2016).
[0007] O mosquito Culex quinquefasciatus (ordem Diptera) está relacionado à transmissão de filarioses, encefalites e a febre do Nilo Ocidental. Possui hábito acentuadamente antropofílico, mas também pode obter o repasto sanguíneo a partir de cães, gatos, equinos, aves silvestres e domésticas, roedores, morcegos e outros animais, favorecendo a transmissão de agentes patogênicos ao homem (Boga et al., 2019; Wilder-Smith et al., 2017). Sabe-se ainda que o mosquito C. quinquefasciatus pode ser infectado pelo vírus da Zika, podendo liberar o vírus em sua saliva, sendo capaz de transmiti-lo de forma eficaz (Guedes et al., 2017). [0008] Não há vacina para Chikungunya e Zika, e no caso da dengue a vacina Dengvaxia, produzida pela farmacêutica Sanofi, a única disponível no mundo contra essa doença, pode causar problemas a quem nunca foi infectado pelo vírus. Pesquisas iniciadas antes e após o início da distribuição desse produto sugerem que os pacientes sem histórico de infecção podem desenvolver quadros mais graves se tomarem a vacina e, depois, forem picados pelo mosquito (Kotsakiozi et al., 2017).
[0009] Os mosquitos Aedes aegypti e Culex quinquefasciatus estão associados às áreas urbanas com deficiências de saneamento. Desta forma, a principal forma de prevenção às viroses transmitidas por esses mosquitos é o combate ao vetor.
[0010] O controle desses vetores, por indicação do Programa Nacional de Controle de Dengue (PNCD) do Ministério da Saúde era feito através de químicos como organoclorados, organofosforados, carbamatos e piretroides, desde 1940. No entanto, o uso desses compostos por um longo período e sem
gerenciamento da resistência dos insetos, levou à seleção de populações resistentes e reaparecimento das doenças (Amorim et al., 2013; Martins et al., 2009).
[0011] A Organização Mundial de Saúde (OMS) recomenda a utilização de formulações de inseticidas biológicos utilizando bactérias como Bacillus thuringiensis para controle de mosquitos vetores, pois essa bactéria, além de eficiente, não é tóxica a outras ordens de insetos, animais e plantas (Whiteley and Schnepf, 2003).
[0012] Um estudo demonstrou que em 2016, os custos com as doenças: Dengue, Zika e Chikungunya chegaram a R$2,3 bilhões, dos quais R$ 1.470.990.760 foram referentes ao combate ao vetor Aedes aegypti, R$ 373.930.532 referentes aos custos médicos diretos com os indivíduos infectados e R$ 431.272.105 referentes aos custos indiretos, que se referem a perda de produtividade dos indivíduos doentes. Porém, esse estudo não contabilizou os gastos com vacinas e tratamentos da febre amarela, tampouco dos custos do tratamento de crianças nascidas com microcefalia decorrente da infecção por Zika (Teich et al., 2017). No mesmo ano, o PNUD desenvolveu um estudo que estimou que, em longo prazo, os custos do Brasil com a microcefalia associada à infecção por Zika chegará a U$ 10 bilhões (Ministério da saúde, 2017).
[0013] Na agricultura, existe ainda outro problema relacionado aos insetos conhecido como pragas agrícolas. O Brasil é o segundo maior produtor de grãos do mundo (dados da última safra). A produção brasileira de grãos do período 2018/2019, segundo o 5S levantamento realizado pela Companhia Nacional de Abastecimento (Conab), deve alcançar 234,1 milhões de toneladas. Assim, terá crescimento de 6,5 milhões de toneladas (2,8% superior), comparado à safra passada, quando milho e soja corresponderam a 88% do total da produção de grãos do país (CONAB, 2018).
[0014] A região Centro-Oeste é a maior produtora das culturas de milho, soja e algodão, somadas. Desses cultivos, na safra de 2017/2018, foi estimado que 92% eram geneticamente modificados (transgênicos), sendo resistentes a
insetos, tolerantes a herbicidas ou ambos. Os insetos lepidópteros, principalmente o gênero Spodoptera, vem atacando os cultivares, mesmo os transgênicos que expressam proteína inseticida, selecionando, assim, insetos resistentes a essas proteínas. A lagarta Spodoptera frugiperda é polifaga sendo considerada uma das principais pragas dos cultivos no Brasil e no Cerrado. Inúmeros dados revelam que essa praga mostra resistência à maioria dos inseticidas químicos e às plantas Bt (Netto et al., 2018).
[0015] A ESALQ realizou um estudo demonstrando que, em 2009, apenas na produção de milho o gasto com o controle de S. frugiperda superou R$ 1 ,2 bilhões (Ferreira Filho et al., 2010). Considerando esses gastos com inseticidas e a seleção de insetos resistentes, há uma demanda constante de novas tecnologias e novos inseticidas.
[0016] Na busca pelo estado da técnica em literaturas científica e patentária, foram encontrados os seguintes documentos que tratam sobre o tema:
[0017] O documento US9534019B2 descreve um processo de extração de lipopeptídeos de culturas da bactéria Paenibacillus, mais especificamente Paenibacillus elgii (Henrique et al., 2015). O documento refere-se ainda ao uso de tais peptídeos para a composição para uso profilático e para tratamento de animais e plantas.
[0018] O documento WO 2012/139179 A1 descreve a utilização das pelgipeptinas, mesma família de lipopeptídeos desta invenção, como antimicrobianos e promotores de crescimento, no tratamento e profilaxia de animais e plantas (Henrique et al., 2012).
[0019] O documento PI 0312448-7 A descreve a atividade inseticida contra lepidóptera da cepa DAS1529 de Paenibacillus. Esta atividade é atribuída a uma proteína do tipo Cry produzida por tal isolado. Não se tratando de um lipopeptídeo (Bintrim et al., 2005).
[0020] O documento BR 102017009855-9 A2 descreve a utilização do fermentado de Bacillus thuringiensis na obtenção de uma formulação líquida com atividade larvicida, tendo sido demonstrada sua atividade contra Aedes aegypti
(Kreutz, 2018).
[0021] O documento Manonmani et al. 201 1 , intitulado " Enhanced production of mosquitocidal cyclic lipopeptide from Bacillus subtilis subsp. subtilis" descreve a atividade larvicida da surfactina contra o mosquito Anopheles stephens, transmissor da malária. A surfactina é um lipopeptídeo produzido por uma cepa de Bacillus subtilis, cuja sequência de aminoácidos é: Glu1 -Leu2-Leu3-Val4- Asp5-Leu6-Leu7 ligado a uma cadeia de ácido graxo que pode variar de 11 a 15 carbonos.
[0022] Mukherjee et al. 2006, intitulado "Assessment of mosquito larvicidal potency of cyclic lipopeptides produced by Bacillus subtilis strains" descreve a atividade larvicida de um extrato produzido a partir do cultivo de outra cepa de Bacillus subtilis, a qual produz os lipopeptideos surfactinas, iturinas e fengicinas. As iturinas são heptapeptídeos cuja sequência de aminoácidos é Asn1 -Tyr2- Asn3-Gln4-Pro5-Asn6-Ser7 ligado a uma cadeia de ácido graxo que pode variar de 11 a 15 carbonos. Já as fengicinas são decapeptídeos cíclicos cuja sequência é: Glu1 -Orn2-Tyr3-Thr4-Glu5-Ala6-Pro7-Gln8-Tyr9-lle10 ligada a um ácido graxo que varia de 14 a 18 carbonos.
[0023] Ghribi et al. 2012, intitulado "Evaluation of larvicidal potency of Bacillus subtilis SPB1 biosurfactant against Ephestia kuehniella (Lepidoptera: Pyralidae) larvae and influence of abiotic factors on its insecticidal activity" relata a atividade larvicida de metabólitos produzidos por Bacillus subtilis contra larvas de Lepidoptera. No entanto não foram descritas as moléculas responsáveis por esta atividade.
[0024] O documento NEUNG, Saophuong et al., 2014, intitulado "Insecticidal potential of Paenibacillus elgii HOA73 and its combination with organic sulfur pesticide on diamondback moth, Plutella xylostella" refere-se ao potencial inseticida de extratos da bactéria Paenibacillus elgii cepa HOA73 utilizando urn meio contendo quitina e gelana. O artigo revela que a atividade larvicida é causada por enzimas hidrolíticas, diferentemente da tecnologia aqui proposta, na qual a atividade é comprovadamente atribuída aos lipopeptideos da família
das pelgipeptinas.
[0025] O documento ORTEGA, Daniel Barros., 2016, intitulado "Production of Polypeptin A analogues by Paenibacillus elgii strain AC 13 and quorum sensing dependent bacterial processes", trata da produção de pelgipeptinas por Paenibacillus elgii. Em nenhum momento este documento menciona a atividade larvicida de pelgipeptinas contra as larvas de insetos Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus e Spodoptera frugiperda.
[0026] Os documentos supracitados não descrevem a atividade larvicida ou inseticida de lipopeptídeos produzidos por Paenibacillus elgii, ou ainda a família de lipopeptídeos denominada pelgipeptinas contra Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus ou Spodoptera frugiperda. Além disso, nenhum dos documentos antecipa um processo de obtenção ou produção de um inseticida e/ou larvicida a partir do sobrenadante de uma cultura de Paenibacillus elgii AC13 em meio quimicamente definido.
[0027] Assim, do que depende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção, de forma que a formulação aqui proposta possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica.
[0028] Em suma, ainda há necessidade de se desenvolverem composições e métodos para o controle de larvas, sobretudo larvas de vetores de doenças e/ou de pragas.
Sumário da Invenção
[0029] Dessa forma, a presente invenção resolve os problemas do estado da técnica por meio do desenvolvimento de uma composição larvicida, método de controle de insetos e uso de pelgipeptinas.
[0030] Em um primeiro objeto, a presente invenção revela uma composição larvicida compreendendo de 0,7 pg/ml a 1000pg/ml de pelgipeptinas e pelo menos um veículo agricolamente aceitável.
[0031] Em um segundo objeto, a presente invenção revela um método de
controle de insetos compreendendo pelo menos uma etapa de aplicação de uma composição larvicida compreendendo de 0,7 pg/ml a 1000 pg/ml de pelgipeptinas em larvas de insetos.
[0032] Em um terceiro objeto, a presente invenção revela o uso de pelgipeptinas no controle de pragas e / ou insetos.
[0033] Estes e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e serão descritos detalhadamente a seguir.
Breve Descrição das Figuras
[0034] São apresentadas as seguintes figuras:
[0035] A Figura 1 apresenta a estrutura geral das pelgipeptinas, em que: Dab é o ácido 2,4-diaminobutírico; Phe: fenilalanina; Leu: leucina; Vai: valina; Ser: serina. R e X variam de acordo com a isoforma.
[0036] A Figura 2 refere-se a um ensaio com a pelgipeptina em baixa concentração, 0,625 pM, que demonstra que, mesmo em dose que causa pouca ou nenhuma mortalidade, a pelgipeptina interfere visivelmente no desenvolvimento das larvas. Na figura é possível observar larvas de Culex quinquefasciatus 24 horas após tratamento com pelgipeptina 0,625 pM (B) em comparação ao controle negativo (A), sem adição do lipopeptídeo. O tratamento foi realizado com larvas de 2S instar e provocou prejuízo visível em seu desenvolvimento.
[0037] A Figura 3 apresenta larvas de Culex quinquefasciatus 72 horas após tratamento com pelgipeptina 0,625 pM (B) em comparação ao controle negativo (A), sem adição do lipopeptídeo. O tratamento foi realizado com larvas de 2S instar. Apesar da pelgipeptina não causar mortalidade significativa nas larvas nesta concentração, as larvas tratadas estão visivelmente menores.
[0038] A Figura 4 exibe larvas de quarto instar de C. quinquefasciatus após 24 horas de exposição às pelgipeptinas na concentração de 10 pM. Larvas no fundo do tubo estão mortas.
Descrição Detalhada da Invenção
[0039] A presente invenção se trata de uma composição larvicida, método de controle de insetos e uso de pelgipeptinas. Mais especificamente a invenção compreende o emprego de pelgipeptinas, que podem ser obtidas a partir de um sobrenadante de uma cultura de células obtido após o crescimento da bactéria Paenibacillus elgii em meio quimicamente definido MMP, sendo o dito meio conforme definido no documento patentário BR102017018881 -7, em composições ou produtos bioinseticidas, sobretudo para o controle de vetores e pragas agrícolas.
[0040] A família das Pelgipeptinas é uma classe de lipopeptídeos produzidos por Paenibacillus elgii. Esta família compreende 4 isoformas de lipopeptídeos que possuem uma cadeia de nove aminoácidos ligada de forma cíclica a uma cadeia de ácido graxo. Cada uma das 4 isoformas variam a porção de ácido graxo pela diferença de 1 CH2, assim como os aminoácidos na posição 2 da cadeia peptídica, que pode ser uma L-valina ou L-isoleucina.
[0041] Enfatiza-se que a presente invenção, em uma concretização, refere-se à atividade inseticida de um extrato produzido a partir de um meio quimicamente definido MMP, utilizando a bactéria Paenibacillus elgii, cepa AC13 0 qual apresenta elevada concentração de pelgipeptinas e baixa concentração de outras moléculas/ impurezas, como demonstrado com os ensaios de atividade utilizando as moléculas purificadas, as pelgipeptinas são as moléculas responsáveis pela atividade larvicida do extrato, mas 0 extrato também pode ser utilizado.
[0042] Uma segunda concretização da invenção refere-se ao emprego de pelgipeptinas contra mosquitos vetores como Aedes aegypti e Culex quinquefasciatus.
[0043] A presente invenção, de forma surpreendente, ainda demonstra que composições compreendendo de 0,7 pg/ml a 1000 pg/ml de pelgipeptinas apresentam elevado potencial biocida no combate a larvas, sobretudo larvas de
Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus e Spodoptera frugiperda, assim como pode ser constatado nos resultados experimentais presentes nos exemplos da presente invenção.
[0044] Ainda, a composição da presente invenção não apresenta toxicidade aos seres humanos, animais e não provocam danos ao meio ambiente, sendo uma alternativa eficiente, sustentável e segura ao uso de agrotóxicos e inseticidas convencionais.
[0045] A presente invenção revela um processo de obtenção de pelgipeptinas compreendendo as seguintes etapas: i) realizar cultura de Paenibacillus elgii em um meio de cultura; ii) recuperar o sobrenadante do cultivo da etapa i) após terem se passado aproximadamente 72h do início do cultivo; iii) concentrar ou purificar as pelgipeptinas presentes no sobrenadante obtido ao final da etapa ii); em que o dito meio de cultura compreende, em peso:
- de 1 ,8% a 2,5% de Glicerol;
- de 0,7% a 1 % de (NH^SC ;
- de 0,10% a 0,2% de K2HPO4;
- de 0,03% a 0,06% Valina;
- de 0,015 a 0,025% de MgSO4.7 H2O;
- de 0,008% a 0,015% de CaCl2.2H2O;
- de 0,08% a 0,15% de NaCI;
- de 0,0008% a 0,0015% de FeSO4.7 H2O;
- de 0,0008% a 0,0015% de MnSO4; e
- de 0,0008% a 0,0015% de ZnSO4.
[0046] Em uma concretização, 0 material obtido ao final da etapa iii) é livre de células de Paeninacillus elgii.
[0047] Em uma concretização, 0 meio de cultura compreende, em peso:
- de 2,0 % de Glicerol;
- de 0,8% de (NH4)2SO4;
- de 0,17% de K2HPO4;
- de 0,05 % de Valina;
- de 0,02% de MgSO4.7.H2O;
- de 0,01 % de CaCl2.2H2O;
- de 0,01 % de NaCI;
- de 0,001 % de FeSO4.7.H2O;
- de 0,001 % de MnSC ; e
- de 0,001 % de ZnSO4.
[0048] Em uma concretização, 0 sobrenadante do cultivo da etapa i) é recuperado após terem se passado entre 54h e 72h do início do cultivo. Em uma concretização, 0 sobrenadante do cultivo da etapa i) é recuperado após terem se passado pelo menos 60h do início do cultivo. Em uma concretização, 0 sobrenadante do cultivo da etapa i) é recuperado após terem se passado pelo menos 65h do início do cultivo. As células bacterianas são removidas por centrifugação e 0 sobrenadante é concentrado 5 vezes (SN 5X). Em uma concretização, 0 sobrenadante SN 5X pode ser incorporado à composição larvicida. Alternativamente as pelgipeptinas podem ser purificadas para incorporação à composição larvicida.
[0049] Em um primeiro objeto, a presente invenção revela uma composição larvicida compreendendo de 0,7 pg/ml a 1000 pg/ml de pelgipeptinas e pelo menos um veículo agricolamente aceitável.
[0050] Em uma concretização, a composição compreende de 7 pg/ml a 700 pg/ml de pelgipeptinas. Em uma concretização, a composição compreende de 7 pg/ml a 100 pg/ml de pelgipeptinas. Em uma concretização, a composição compreende de 7 pg/ml a 70 pg/ml de pelgipeptinas. Em uma concretização, a composição compreende de 7 pg/ml a 35 pg/ml de pelgipeptinas. Em uma concretização, a composição compreende de 7 pg/ml a 50 pg/ml de pelgipeptinas.
[0051] Em uma concretização, as pelgipeptinas da composição larvicida são obtidas por um processo conforme definido acima.
[0052] Em uma concretização, a composição compreende de 30% a 95%, em volume, de um solvente. Em uma concretização, a composição compreende de 40% a 95%, em volume, de um solvente. Em uma concretização, a composição compreende de 50% a 95%, em volume, de um solvente. Em uma concretização, a composição compreende de 70% a 95%, em volume, de um solvente.
[0053] Em uma concretização, a composição compreende pelo menos um componente adicional selecionado do grupo que consiste em:
- surfactantes;
- polímeros;
- óleos minerais;
- óleos vegetais;
- agentes molhantes;
- controladores de deriva;
- agentes espessantes;
- agentes adesivos;
- antioxidantes;
- condicionadores de calda;
- agentes de compatibilidade;
- reguladores de pH;
- umectantes;
- antiespumantes;
- absorventes de UV; e
- ingredientes ativos adicionais.
[0054] Em uma concretização, a composição compreende, além das pelgipeptinas que podem ser purificadas ou na forma de sobrenadante SN 5x, extratos de Bacillus thuringiensis e/ou Lysinibacillus sphaericus.
[0055] Em uma concretização, a composição compreende de 1% a 90%, em massa, de extratos de Bacillus thuringiensis e/ou Lysinibacillus sphaericus. Em uma concretização, a composição compreende de 5% a 80%, em massa, de extratos de Bacillus thuringiensis e/ou Lysinibacillus sphaericus. Em uma
concretização, a composição compreende de 5% a 70%, em massa, de extratos de Bacillus thuringiensis e/ou Lysinibacillus sphaericus. Em uma concretização, a composição compreende de 5% a 60%, em massa, de extratos de Bacillus thuringiensis e/ou Lysinibacillus sphaericus. Em uma concretização, a composição compreende de 1% a 50%, em massa, de extratos de Bacillus thuringiensis e/ou Lysinibacillus sphaericus. Em uma concretização, a composição compreende de 10% a 40%, em massa, de extratos de Bacillus thuringiensis e/ou Lysinibacillus sphaericus. Em uma concretização, a composição compreende de 20% a 30%, em massa, de extratos de Bacillus thuringiensis e/ou Lysinibacillus sphaericus.
[0056] Em um segundo objeto, a presente invenção revela um método de controle de insetos compreendendo pelo menos uma etapa de aplicação de uma composição larvicida compreendendo de 0,7 pg/ml a 1000 pg/ml de pelgipeptinas em larvas de insetos.
[0057] Em uma concretização, a composição compreende de 0,7 pg/ml a 1000 pg/ml de pelgipeptinas e pelo menos um outro veículo agricolamente aceitável. [0058] Em uma concretização, os insetos são das ordens Diptera ou Lepidoptera.
[0059] Em uma concretização, as pelgipeptinas são usadas para controlar Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus e/ou Spodoptera frugiperda.
[0060] Em uma concretização, as larvas de inseto são de segundo e/ou quarto instar.
[0061] Em uma concretização, a aplicação de pelgipeptinas se dá por pulverização, atomização, polvilhamento ou aplicação de gel.
[0062] Em um terceiro objeto, a presente invenção revela o uso de pelgipeptinas no controle de pragas e / ou insetos.
[0063] Em uma concretização, as pelgipeptinas são utilizadas no controle de larvas de insetos.
[0064] Em uma concretização, o uso de pelgipeptinas é em conjunto a pelo menos um outro ativo inseticida.
[0065] Em uma concretização, as pelgipeptinas são usadas para controlar populações de insetos. Em uma concretização, os insetos são das ordens Diptera ou Lepidoptera. Em uma concretização, as pelgipeptinas são usadas para controlar Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus e/ou Spodoptera frugiperda.
[0066] Na presente invenção, entende-se por:
[0067] Meio quimicamente definido MMP: como aqui utilizado, o termo "Meio quimicamente definido MMP" refere-se a um meio de cultura mineral que atende os requisitos nutricionais da bactéria e que gera um extrato pobre em impurezas, sendo especificamente desenvolvido para a produção de lipopeptídeos antimicrobianos por bactérias. O dito meio é conforme definido no documento patentário BR 102017018881 -7.
[0068] CL50: como aqui utilizado, o termo "CL50" refere-se à concentração letal necessária para causar 50% de mortalidade da população testada.
[0069] Larva de primeiro instar: como aqui utilizado, o termo " Larva de primeiro instar " refere-se ao primeiro estágio de desenvolvimento da larva após eclosão do ovo.
[0070] Larva de segundo instar: como aqui utilizado, o termo "Larva de segundo instar" refere-se ao segundo estágio de desenvolvimento da larva, após primeira muda ou ecdise. As larvas passam por 4 estágios de desenvolvimento, até se tornarem pupas.
[0071] Bioinseticida: como aqui utilizado, o termo "bioinseticida" refere-se a inseticidas biológicos, desenvolvidos a partir de micro-organismos como vírus, bactérias e fungos ou extratos vegetais. Preferivelmente, não apresentam toxicidade ao homem e animais e não provocam danos ao meio ambiente.
[0072] Aqrotóxicos: como aqui utilizado, o termo "agrotóxicos" refere-se a produtos e agentes de processos físicos, químicos ou biológicos, destinados ao uso nos setores de produção, no armazenamento e beneficiamento de produtos agrícolas, nas pastagens, na proteção de florestas, nativas ou plantadas, e de outros ecossistemas e de ambientes urbanos, hídricos e industriais, cuja
finalidade seja alterar a composição da flora ou da fauna, a fim de preservá-las da ação danosa de seres vivos considerados nocivos, bem como as substâncias e produtos empregados como desfolhantes, dessecantes, estimuladores e inibidores de crescimento.
[0073] Ingredientes ativos: como aqui utilizado, o termo “ingredientes ativos” refere-se a compostos e/ou substâncias que possui uma ação controladora de pragas e/ou insetos. Em uma concretização, o ingrediente ativo é um agroquímico selecionado do grupo de pesticida, inseticida, fungicida, herbicida, acaricida, moluscicida, nematicida e/ou agente modificador do crescimento vegetal.
[0074] Veículo aqricolamente aceitável: como aqui utilizado, o termo "veículo agricolamente aceitável" refere-se a substâncias destituídas de poder biocida, usadas para assegurar a estabilidade, a eficácia e as propriedades físico- químicas de um ou mais ativos em composições, podendo ser de origem animal, vegetal ou sintética. Uma lista não exaustiva de veículos agricolamente aceitáveis compreende excipientes, surfactantes, polímeros, óleos minerais, óleos vegetais, agentes molhantes, controladores de deriva, agentes espessantes, agentes adesivos, antioxidantes, condicionadores de calda, agentes de compatibilidade, reguladores de pH, umectantes, antiespumantes e absorventes de UV.
[0075] Exemplos não exaustivos de excipientes compreendem citrato de sódio, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, lactose, polietileno glicóis de pesos moleculares variados, adoçantes, agentes flavorizantes, corantes, agentes emulsificantes ou aperfeiçoadores de suspensão.
[0076] Exemplos não exaustivos de agentes desintegrantes compreendem amido ou silicatos complexos.
[0077] Exemplos não exaustivos de agentes de ligação compreendem polivinilpirrolidona, sacarose, acácia, amidos, goma arábica, gelatina, metilcelulose, carboximetilcelulose.
[0078] Exemplos não exaustivos de agentes lubrificantes compreendem
estearato de magnésio, laurel sulfato de sódio, acácia, sílica, talco, ácido esteárico, estearato de cálcio e/ou glicóis de polietileno.
[0079] Exemplos não exaustivos de diluentes compreendem água, etanol, propileno glicol, glicerina e suas combinações. Exemplos adicionais compreendem lactose, dextrose, sacarose, celulose, amido de milho ou amido de batata.
[0080] Exemplos não exaustivos de agentes desagregantes que podem ser usados nas composições da presente invenção são: amido, ácido algínico, alginatos ou glicolato de amido ou sódio; misturas efervescentes; corantes; e açucarados.
[0081] Exemplos não exaustivos de agentes umidificantes/umectantes são lectina, polisorbatos e laurilsulfatos.
[0082] Exemplos não exaustivos de agentes carreadores compreendem sacarose ou sacarose com glicerina e/ou manita e/ou sorbitol, goma natural, agar, alginato de sódio, pectina, metilcelulose, carboximetilcelulose ou álcool polivinílico, óleos estéreis, propileno glicol e soluções aquosas estéreis.
[0083] Outros agentes de formulação, presentes em quantidades menores, podem ser adicionados às composições da invenção, tais como, aditivos para reduzir espumação, embolotamento, corrosão, crescimento microbiano indesejado, e outros agentes semelhantes.
Exemplos
[0084] Os exemplos aqui mostrados têm o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, sem limitar o seu escopo. Exemplo I - Obtenção do ativo
[0085] A cepa de Paenibacillus elgii (designada AC13) foi isolada do solo do Cerrado em um trabalho realizado na Universidade Católica de Brasília (UCB).
[0086] Os lipopeptídeos de interesse podem ser obtidos após o crescimento da dita bactéria em meio quimicamente definido MMP (Patente BR 1020170188817), após processo de purificação ou ainda não purificados,
empregando-se diretamente o fermentado livre de células.
[0087] A estrutura geral das pelgipeptinas pode ser verificada na figura 1 , em que Dab é o ácido 2,4-diaminobutírico; Phe: fenilalanina; Leu: leucina; Vai: valina Ser: serina. R e X variam de acordo com a isoforma.
Exemplo - Atividade larvicida
[0088] Para exemplificar a concretização do primeiro aspecto desta invenção foram realizados ensaios demonstrando a atividade larvicida das pelgipeptinas purificadas e do sobrenadante livre de células concentrado 5X.
[0089] Os ensaios foram realizados com larvas de segundo instar de A.aegypti e de C.quinquefasciatus. Adicionou-se 25 larvas de segundo instar de cada espécie de mosquito em copos plásticos de 200 ml contendo 100 ml de água destilada. As doses testadas foram 10, 5, 2,5, 1 ,25, 0,625 e 0,312 pM. Cada dose foi testada em triplicate e foram feitas três réplicas biológicas. As leituras para A. aegypti foram realizadas após 24 horas e as leituras para C. quinquefasciatus foram realizadas 48 horas após exposição aos lipopeptídeos. O cálculo da CL50 foi realizado utilizando análise de Probits (FINNEY, 1971 ).
[0090] Os valores de CL50 da Pelgipeptina purificada e do fermentado livre de células estão apresentados nas tabelas 2 e 3.
Tabela 2. Valores de CL50 para a Pelgipeptina contra larvas de segundo instar de Aedes aegypti e Culex quiinquefasciatus
Tabela 3. Comparação dos valores CL50 das Pelgipeptinas purificadas e do sobrenadante do cultivo, sem processo de purificação, concentrado cinco vezes (SNPE 5X) contra larvas de segundo instar de Aedes aegypti e Culex quiinquefasciatus.
[0091] Os lipopeptídeos quando administrados nas CL50 contra larvas de quarto instar foram capazes de matar 100% das larvas de C. quinquefasciatus e 84% das larvas de A. aegypti.
Tabela 4. Mortalidade em ensaio seletivo utilizando Pelgipeptina purificada contra larvas de 2S instar das espécies A. aegypti e C. quinquefasciatus nas concentrações de 100 pM e 10 pM.
[0092] Ensaios demonstraram a atividade larvicida das toxinas produzidas por Lysinibacillus sphaericus, bem como atividade sinérgica entre as Pelgipeptinas e as toxinas produzidas pela cepa S260 de Lysinibacillus sphaericus contra C. quinquefasciatus. O fator de sinergismo, segundo Tabashnikt (1992), consiste na divisão da CL50 esperada pela CL50 observada experimentalmente. Considera-se que há atividade sinérgica quando o fator de sinergismo calculado é acima de 1 (Tabashnikt, 1992).
Tabela 5. Valores de CL50 para as toxinas produzidas por Lysinibacillus sphaericus S260 contra Culex quiinquefasciatus
Tabela 6. Doses, proporções, CL50 e Fatores de Sinergismo da associação da cepa de Lysinibacillus sphaericus e Pelgipeptinas contra larvas Culex quinquefasciatus
[0093] Como pode ser observado na tabela 6, os valores observados foram muito inferiores quando comparados com os valores esperados. Assim, resultando em um valor de sinergismos de cerca de 2,42, comprovando a sinergia da associação da cepa de Lysinibacillus sphaericus e Pelgipeptinas
contra larvas Culex quinquefasciatus.
[0094] Ensaios adicionais demonstraram a atividade inseticida da composição do presente pedido de patente contra Spodoptera frugiperda na concentração avaliada de 10 pM.
[0095] REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
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[0125] Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outras variantes e alternativas, abrangidas pelo escopo das reivindicações a seguir.
Claims
1. Composição caracterizada por compreender de 0,7 pg/ml a 1000 pg/ml de pelgipeptinas e pelo menos um veículo agricolamente aceitável.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1 , caracterizada por compreender pelo menos um componente adicional selecionado do grupo que consiste em:
- surfactantes;
- polímeros;
- óleos minerais;
- óleos vegetais;
- agentes molhantes;
- controladores de deriva;
- agentes espessantes;
- agentes adesivos;
- antioxidantes;
- condicionadores de calda;
- agentes de compatibilidade;
- reguladores de pH;
- umectantes;
- antiespumantes;
- absorventes de UV;
- ingredientes ativos adicionais.
3. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por compreender, adicionalmente, extrato de Bacillus thuringiensis e/ou extrato de Lysinibacillus sphaericus.
4. Método de controle de insetos caracterizado por compreender pelo menos uma etapa de aplicação de uma composição compreendendo de 0,7 pg/ml a 1000 pg/ml de pelgipeptinas em larvas de insetos.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado em que a
composição é conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
6. Método, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado em que as larvas são de insetos da ordem Diptera ou Lepidoptera.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado em que os insetos são Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus e/ou Spodoptera frugiperda.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizado pelas larvas de inseto serem de segundo e/ou quarto instar.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 8, caracterizado em que a aplicação de pelgipeptinas é realizada por pulverização, atomização, polvilhamento, solução, pastilha ou aplicação de gel.
10. Uso de pelgipeptinas caracterizado por ser no controle de pragas e / ou insetos.
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