HU221806B1 - Vázon módosított oligonukleotid analógok - Google Patents

Vázon módosított oligonukleotid analógok Download PDF

Info

Publication number
HU221806B1
HU221806B1 HU9303289A HU9303289A HU221806B1 HU 221806 B1 HU221806 B1 HU 221806B1 HU 9303289 A HU9303289 A HU 9303289A HU 9303289 A HU9303289 A HU 9303289A HU 221806 B1 HU221806 B1 HU 221806B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
compound
mol
oligonucleotide
formula
added
Prior art date
Application number
HU9303289A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT66378A (en
HU9303289D0 (en
Inventor
Philip Dan Cook
Alain De Mesmaeker
Jacques Lebreton
Adrian Waldner
Original Assignee
Novartis Ag.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=24826111&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU221806(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Novartis Ag. filed Critical Novartis Ag.
Publication of HU9303289D0 publication Critical patent/HU9303289D0/hu
Publication of HUT66378A publication Critical patent/HUT66378A/hu
Publication of HU221806B1 publication Critical patent/HU221806B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/04—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/14—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F7/00—Compounds containing elements of Groups 4 or 14 of the Periodic Table
    • C07F7/02—Silicon compounds
    • C07F7/08—Compounds having one or more C—Si linkages
    • C07F7/18—Compounds having one or more C—Si linkages as well as one or more C—O—Si linkages
    • C07F7/1804—Compounds having Si-O-C linkages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H11/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by inorganic acids; Metal salts thereof

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Electric Double-Layer Capacitors Or The Like (AREA)
  • Organic Insulating Materials (AREA)
  • Other Resins Obtained By Reactions Not Involving Carbon-To-Carbon Unsaturated Bonds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

A találmány nukleázokkal szemben ellenálló oligonukleotidanalógokra ésazok előállításánál felhasználásra kerülő di- mer vegyületekrevonatkozik. A találmány szerinti oligonukleotidanalógokra jellemző,hogy legalább néhány alegységük az (I) általános képletnek megfelelőszerkezetű – a képletben Bx jelentése természetben előforduló purin-vagy pirimidinbázis, L1–L2–L3–L4 jelentése NH–C(O)–CH2–CH2,NH–C(S)–CH2–CH2, CH2–CH2–NH–C(O), CH2–CH2–NH–C(S), CH2–C(O)–NH– CH2vagy CH2–C(S)–NR–CH2-csoport, és a megmaradó alegységek természetesvagy szintetikus eredetűek. ŕ

Description

A találmány oligonukleotidanalógokra vonatkozik.
A találmány közelebbről nukleázoknak ellenálló oligonukleotidanalógokra gvonatkozik, amelyek felhasználhatók gyógyszerként, diagnosztikumként és kutatási reagensként. A találmány szerinti oligonukleotidanalógok módosított kötéseket tartalmaznak, amelyek helyettesítik a foszfor-diészter-kötéseket, amelyek normálesetben a természetes nukleinsavaknál cukrok közötti kötésként szolgálnak. Az ilyen analógok ellenállók a nukleázok általi degradációnak és képesek a DNS és RNS aktivitásának módosítására. A találmány oltalmi körébe tartozik ezen nukleotidanalógok előállítása, a proteinek termelésének módosítása, valamint a találmány szerinti oligonukleotidanalógok intermedierként való alkalmazása.
Ismert, hogy az emlősök legtöbb szervezeti állapotát, beleértve a legtöbb betegségi állapotot is, a proteinek nagymértékben befolyásolják. Az ilyen proteinek vagy közvetlenül hatnak vagy enzimatikus funkciójukon keresztül, és nagymértékben hozzájárulnak számos betegség kialakulásához állatoknál és embereknél egyaránt.
A klasszikus gyógyszerhatóanyagok általában az ilyen proteinek közötti egymásra hatásokra hatnak annak érdekében, hogy csökkentsék a betegséget kiváltó vagy a betegségeket fokozó szerepüket. Az utóbbi időben azonban kísérleteket végeztek annak érdekében is, hogy csökkentsék az ilyen proteinek tényleges termelődését a molekulákkal, így például intracelluláris RNSsel való kölcsönhatás révén, amely közvetlenül irányítja ezek szintézisét. Ezek a kölcsönhatások részt vesznek a komplementer „antiszenz” oligonukleotidok vagy ezek bizonyos analógjainak RNS-hez való hibridizációjában. A hibridizáció az oligonukleotidok vagy oligonukleotidanalógok szekvenciaspecifíkus hidrogénkötése az RNS-hez vagy az egyszálú DNS-hez. Ezen proteinek termelődési folyamatába való beavatkozásától terápiás eredményt lehet várni maximális hatással és minimális mellékhatásokkal. Hasonlóképpen az oligonukleotidanalógok befolyásolhatják ezen proteinek termelődését valamely szervnél.
Az antiszenz oligonukleotidok és oligonukleotidanalógok gyógyászati aktivitása hasonlóan más gyógyszerekhez, számos faktortól függ, amelyek befolyásolják ezen szerek hatásos koncentrációját egy specifikus intracelluláris célhelynél. Az egyik igen fontos faktor az oligonukleotidok esetében ezek stabilitása nukleázok jelenlétében. Nem valószínű, hogy a nem módosított oligonukleotidok hatásos terápiás szerek, mivel ezeket a nukleázok igen gyorsan degradálják. Az oligonukleotidok módosításaival ezeket ellenállóvá tesszük a nukleázokkal szemben, így ezen módosított vegyületek igen szükségesek.
A nukleázokkal szembeni ellenállás érdekében végzett oligonukleotidmódosítások általában a foszforatomnál vagy a cukor-foszfát vázon történnek. Különböző foszforo-tioátokat, metil-foszfonátokat, foszfor-amidátokat és foszfo-triésztereket ismertettek már, amelyek bizonyos nukleázrezisztenciát biztosítanak, azonban a foszfátmódosított oligonukleotidok általában nem kielégítő hibridizációs tulajdonságokkal rendelkeznek (Cohen J. S., kiadó, Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of gene Expression; CRC Press, Inc., Boca Raton FL, 1989).
Egy másik kulcsfaktor az antiszenz vegyületek azon képessége, hogy gátolják a specifikus sejtek plazmamembránját, amely részt vesz a betegségi folyamatban. A celluláris membránok lipid-protein kettős rétegeket tartalmaznak, amelyek szabadon átjárhatók a kicsi, nemionos, lipofil vegyületeknek, és nem átjárható a legtöbb természetes metabolitnak és terápiás szemek [Wilson, D. B. Ann. Rév. Biochem. 47:933-965 (1978)]. A természetes és módosított oligonukleotidok biológiai és antivirális hatását a tenyésztett emlőssejtekben igen jól dokumentálták, így úgy tűnik, hogy ezek a szerek képesek behatolni a membránokba, hogy elérjék az intracelluláris céljukat. Vizsgálták ezen antiszenz vegyületek felvételét a különböző emlőssejtek, így például HL-60 szíriai aranyhörcsög (Syrian Hamster)-fibroblaszt, U937, L929, CV-1 és ATH8 sejtek esetén természetes oligonukleotidok és bizonyos nukleázoknak rezisztens analógok, így például alkil-triészterek esetén [Miller, P. S. Braiterman, L.T. és Ts’O, P. Ο. P., Biochemistry 16:1988-1996 (1977)], metil-foszfonátok esetén [Marcus-Sekura, C. H., Woerner A. M., Shinozuka K., Zon G., és Quinman G. V., Nuc. Acids Rés. 15:5749-5763 (1987) és Miller P. S., McParland K. B., Hayerman K. és Ts’O, P. Ο. P., Biochemistry 16:1988-1996 (1977) és Loke S. K., Stein C. Zhang X. H. Avigan M., Cohen J. és Neckers L. M., Top Microbiol. Immunoi. 141:282:289 (1988)].
A módosított oligonukleotidok és oligonukleotidanalógok gyakran kevésbé könnyen intemalizáltak, mint a természetes megfelelőjük. Ennek eredményeképpen sok korábban ismert antiszenz oligonukleotid nem rendelkezik elegendő aktivitással a gyakorlati gyógyítás, kutatás vagy diagnosztika céljára. Két másik, igen komoly hátránya az ismert oligonukleotidoknak, amelyeket antiszenz hatóanyagként való felhasználásra terveztek az intracelluláris RNS-hez való csekély hibiridizáció és meghatározott kémiai vagy enzimközvetített folyamat, ami a lényeges RNS-fiinkciókat lezárja.
Az antiszenz oligonukleotidok hatásosságának növelésére irányuló módosítások, valamint ezen problémák leküzdésére irányuló kísérletek igen különböző formájúak. Ezek a módosítások magukban foglalják az alapgyűrű módosításait a cukorrész módosításait, valamint a cukor-foszfát váz módosításait. A korábbi cukor-foszfát vázmódosítások, különösen a foszforatomon végzett módosítások különböző szintű nukleázokkal szembeni rezisztenciát eredményeztek. Azonban, bár az antiszenz oligonukleotidok azon képessége, hogy specifikus DNS-hez vagy RNS-hez rendszeresen kötődnek, alapvető az antiszenzmetodika szempontjából, a módosított foszfor-oligonukleotidokra jellemző általában a csökkent képességű hibridizációs tulajdonság.
A foszforatom helyettesítése volt egy alternatív lehetőség a prokirális foszfát-molekularész módosításával kapcsolatos problémák elkerülésére. Néhány módosítást, amelyeknél a foszforatom helyettesítését érték
HU 221 806 Β1 el, ismertet például Matteucci, M. [Matteucci M. Tetrahedron Letters 31:2385-2388 (1990)], ahol a foszforatom helyettesítése a metiléncsoporttal az ismert technikákra korlátozódott és nem biztosította a formacetálkötés egyenletes inszertációját az egész vázon, továbbá az instabilitás ezt a módszert alkalmatlanná tette a felhasználásra; Cormier és mtársai [Cormier és mtársai, Nucleic Acids Research 16:4583-4594 (1988)] módszere szerint a foszfo-diészter-csoport helyettesítését diizopropil-szilil-csoporttal végezték, és a módszer korlátozott a metodológia, a homopolimerek oldhatósága, valamint a hibridizációs tulajdonságok miatt; Stirchak és mtársai szerint [Stirchak és mtársai, Journal of Organic Chemistry 52:4202-4206 (1987)] a foszforkötést rövid, karbamát- vagy morfolinocsoportot tartalmazó homopolimerrel végzik, ez is korlátozott a módszertan, a kapott molekula oldhatósága, valamint a hibridizációs tulajdonságok miatt; Mazur és mtársai [Mazur és mtársai, Tetrahedron 40:3949-3956 (1984)] a foszfordiészter-kötés helyettesítését foszfonkötéssel végezték, és ez nem jelentett fejlődést a homotrimermolekulák szintéziséhez képest, Goodchild, J. [Goodchild J., Bioconjugate Chemistry 1:165-187 (1990)] az észterkötést enzimatikusan bontotta észterázzal, és ezért a módszer nem volt alkalmas a foszfátkötés helyettesítésére antiszenz felhasználás esetén.
Az ismert módszerek - amelyek a foszfor-diészterváz módosítását célozták - korlátái egy folyamatos és régóta fennálló szükségletre mutatták rá, hogy más módosítási módszerek szükségesek, amelyek biztosítani képesek a nukleázokkal szembeni rezisztenciát, és kielégítő hibridizációs tulajdonságokat biztosítanak a diagnosztikai, terápiás és kutatási célokra szánt antiszenz oligonukleotidoknak.
A fentiek alapján találmányunk a következőkre vonatkozik:
- oligonukleotidanalógok antiszenz oligonukleotidként való felhasználásra a diagnosztikában, kutatási reagensként, valamint gyógyszerként,
- oligonukleotidanalógok, amelyek fokozott celluláris felvétellel rendelkeznek,
- oligonukleotidanalógok, amelyek nagyobb hatásosságúak, mint a nem módosított antiszenz oligonukleotidanalógok,
- eljárás az említett oligonukleotidanalógok előállítására.
A fentieket részletesen a következő, szakember számára érthető leírásban és az igénypontokban ismertetjük.
A találmány szerinti készítmények, amelyek felhasználhatók az RNS- vagy DNS-molekulák aktivitásának módosítására, általában oligonukleotidanalógokat tartalmaznak, amelyeknek a vázkötései legalább részben módosítottak. Ezen módosításoknál a természetes nukleinsavak cukor-foszfát vázában lévő foszfor-diészterkötések különböző négyatomos kapcsolócsoporttal vannak helyettesítve. Ezek a négyatomos kötőcsoportok megtartják a kívánt négyatomos távolságot az egyik cukor vagy cukoranalóg 3’-szénatomja és a szomszédos cukor vagy cukoranalóg 4’-szénatomja között. A találmány szerinti oligonukleotidanalógok egy megválasztott szekvenciával épülnek fel, amelyek specifikusan hibridizálhatók egy egyszálú vagy kétszálú DNS vagy RNS előre meghatározott nukleotidszekvenciájával. Ezek az oligonukleotidok alkalmas módon szintetizálhatok, ismert szilárd fázisú szintetikus eljárással úgy, hogy komplementerek legyenek vagy legalább specifikusan hibridizálhatók legyenek egy RNS vagy DNS előre megválasztott nukleotidszekvenciájával. A nukleinsavszintetizátorok kereskedelmi forgalomban beszerezhetők, és alkalmazásuk szakember számára nyilvánvaló, mint amelyeket hatásosan lehet alkalmazni ésszerű, kívánt hosszúságú közel bármely oligonukleotid vagy oligonukleotidanalóg előállításához.
A találmány értelmében a „nukleozid” kifejezés egy heterociklikus bázisból és cukor komponenséből álló egységre utal. A „nukleotid” kifejezés olyan nukleozidra utal, amely 3’ vagy 5’cukor-hidroxil-csoporton foszfát-diészter-csoportot tartalmaz. így a nukleozidok, nem úgy mint a nukleotidok, ilyen csoportot nem tartalmaznak. Az „oligonukleotid” kifejezés több összekapcsolt nukleotidegységre utal, amelyekben specifikus szekvenciában vannak a természetben előforduló bázisok és pentofuranozilcsoportok, és ezeket cukorcsoportok, natív foszfo-diészter-kötésekkel kapcsolják össze. Ezek a nukleotidegységek lehetnek nukleinsavbázisok, így például guanin, adenin, citozin, timin vagy uracil. A cukorcsoport lehet dezoxiribóz vagy ribóz. A kifejezés mind természetben előforduló, mind szintetikus egységekre utal, amelyek természetben előforduló alegységekből képződnek.
Az „oligonukleotidanalóg” kifejezés a találmány értelmében olyan csoportokra, olyan részekre utal, amelyek az oligonukleotidokhoz hasonlóan viselkednek, de amelyek tartalmaznak nem természetben előforduló részeket is. Az oligonukleotidanalógok tartalmazhatnak módosított cukorrészeket, módosított bázisrészeket vagy módosított intercukorkötéseket is. Ebből a szempontból egy találmány szerinti oligonukleotidanalóg, amely nem foszfo-diészter-kötéseket, azaz egy módosított intercukorkötést tartalmaz, tekinthető „oligonukleozidnak” is. Az ilyen oligonukleozidok ily módon olyan termékre utalnak, amelyek több nukleozidegységet tartalmaznak a natív foszfo-diészter-kötőcsoporttól eltérő csoporttal összekötve. Továbbá, a találmány értelmében az „oligomerek” megnevezést úgy is tekinthetjük, mint ami magában foglal oligonukleotidokat, oligonukleotidanalógokat vagy oligonukleozidokat. így az „oligomerek” kifejezés utal különböző nukleotidokra vagy nukleozidanalógokra, amelyek egymással vagy természetes foszfo-diészter-kötésekkel vagy más kötéssel, beleértve a találmány szerinti négyatomos kötéseket is, vannak összekapcsolva. Általában, bár a kötés az egyik nukleozid 3’ szénatomja a másik nukleozid 5’ szénatomja között van, az „oligomer” kifejezés magában foglalhat más kötéseket is, így például a 2’-5’ kötést is.
Az oligonukleotidanalógok tartalmazhatnak más egyéb módosításokat is, amelyek a találmány lényegével összhangban vannak, és különösen olyan módosításokat, amelyek növelhetik az oligonukleotidkészítmé3
HU 221 806 Β1 nyék nukleázokkal szembeni rezisztenciáját, hogy biztosítsák az adott oligonukleotidok antiszenz terápiás, diagnosztikai vagy kutatási célú alkalmazását. így például, ha a nukleozid nukleotid cukorrészét egy karbociklusos vagy egy más résszel helyettesítjük, az többé nem cukor. Továbbá, ha más szubsztitúciót, így például az intercukor-foszfor-diészter-kötés szubsztitúcióját végezzük el, a kapott anyag többé nem igazi nukleinsav. Mindezeket azonban analógoknak nevezzük. A leírásban végig, a nukleinsavfajták cukorrészére való utalást úgy kell érteni, mint ami vagy egy igazi cukorra, vagy egy olyan fajtára utal, amely a cukor szokott helyét foglalja el a természetes nukleinsavakban. Továbbá az intercukorkötésekre való utalást úgy kell érteni, hogy az magában foglal olyan részeket, amelyek a cukor vagy cukoranalógrészek összekötésére szolgál a természetes nukleinsavaknál meglévő módon.
A találmány tehát új típusú antiszenz oligonukleotidanalógokra és oligonukleozidokra vonatkozik, amelyek úgy vannak módosítva, hogy növekszik a celluláris felvétel, a nukleázokkal szembeni ellenálló képesség, valamint javulnak a hibridizációs tulajdonságok, valamint meghatározott kémiai vagy enzimatikus úton közvetített folyamatok mennek végbe, amelyek befejeznek lényeges RNS-fúnkciókat.
Azt találtuk, hogy bizonyos oligonukleotidanalógvegyületek előnyösen alkalmazhatók terápiás anyagként és más, a találmány szerinti célkitűzés teljesítésére. Ezeket az oligonukleotidanalógokat alegységek alkotják, amelyek közül legalább néhány az (I) általános képletnek megfelelő szerkezetű - a képletben
Bx jelentése természetben előforduló purin- vagy pirimidinbázis,
-L1-L2-L3-L4- jelentése -NH-C(O)-CH2-CH2-,
-NH-C(S)-CH2-CH2-,
-CH2-CH2-NH-C(O)-,
-CH2-CH2-NH-C(S)-, -CH2-C(O)-NH-CH2 vagy -CH2-C(S)-NH-CH2- csoport, és a többi alegység lehet természetes vagy szintetikus.
A találmány szerinti oligonukleotidanalógok előnyösen 4-50 alegységet, még előnyösebben 5-20 alegységet tartalmaznak a amelyeknek szerkezete fentiekben megadott. Bár lényegében mindegyik alegység az oligonukleotidanalógban a fenti szerkezetű lehet, előnyösek azok is, amelyek a fentitől lényegében eltérő alegységet is tartalmaznak.
Néhány előnyös találmány szerinti oligonukleotidanalógot az (1/1)-(1/5) általános képlettel írunk le.
A találmány szerinti oligonukleotidanalógokat előnyösen gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyaggal elkeverve alkalmazzuk terápiás adagolásnál, ezeket a készítményeket ismert módon állítjuk elő. A találmány szerinti analógok megnövekedett nukleázokkal szembeni rezisztenciával rendelkeznek összehasonlítva a természetben előforduló megfelelő oligonukleotidoknak. A találmány szerinti analógok alkalmazásával egy szervben egy proteintermelődést vagy annak aktivitását módosíthatjuk, ennél az alkalmazásnál a szervet egy találmány szerinti oligonukleotidanalóggal érintkeztetjük, amely specifikusan hibridizálódik az említett proteint kódoló nukleinsavszekvencia legalább egy részéhez, és amely oligonukleotidban legalább néhány alegység a fentiekben megadott szerkezetű.
A találmány szerinti analógok alkalmasak valamely szerv betegségének kezelésére, amely betegség egy protein nemkívánatos termelődésével jellemezhető, ekkor a szervet egy találmány szerinti oligonukleotidanalóggal érintkeztetjük, amely az említett proteint kódoló nukleinsavszekvencia legalább egy részével hibridizálódik, az említett oligonukleotidot önmagában vagy gyógyászatilag elfogadható hordozóanyaggal együtt alkalmazzuk, és amely oligonukleotidban legalább néhány alegység a fentiekben megadott szerkezetű.
A találmány vonatkozik továbbá a fentiekben ismertetett oligonukleotidanalógok előállításánál használható vegyületekre és ezek előállítására is. Ezen vegyületeket az (Γ) általános képlettel újuk le, amely képletben RHP1 és RHP2 jelentése egymástól függetlenül H vagy hidroxil védőcsoport, és Bx és -L1-L2-L3-L4jelentése az előzőekben megadott.
Ezeket a vegyületeket úgy állítjuk elő, hogy egy első synthon-vegyületet, amelyet az (1) általános képlettel írunk le, egy második synthon-vegyülettel kapcsolunk, amelyet a (2) általános képlettel írunk le - a képletekben (a) RT jelentése NH2 és RB jelentése RA-CH2-CH2 (b) RT jelentése CH2-CH2-NH2 és RB jelentése RA (c) RT jelentése CH2-RA és RB jelentése NH2-CH2, ahol Ra jelentése C(O)OH, C(S)OH vagy ezek aktivált származéka - kapcsolunk úgy, hogy az RT és RB csoportokon keresztül amid- vagy tioamidkötést alakítunk ki.
A találmány szerinti oligonukleotidanalógokat, amely oligonukleotidok a terápiás eljárásban alkalmazhatók, például úgy állítjuk elő, hogy egy (1/1) általános képletű vegyületet egy (2/1) általános képletű vegyülettel - a képletekben Bx jelentése a fenti és Et és E2 jelentése azonos vagy különböző és mindegyik jelentése elektrofil reakcióképes csoport - kapcsolunk egy kötőcsoport segítségével az említett elektrofil reakcióképes csoportokon keresztül.
Egy előnyös kiviteli módnál az elektrofil reakcióképes csoport jelentése az (1/1) általános képletű vegyület esetében például halogén-metil-, trifluor-metil-, szulfonil-metil-, p-metil-benzolszulfonil-metil- vagy 3’-Cformil-csoport, míg a második, (2/1) általános képletű vegyület esetében például halogénatom, szulfonil-metil-, p-metil-benzolszulfonil-metil- vagy aldehidcsoport. Előnyös, ha a kötőcsoport hidrazin- vagy hidroxilamin.
Előnyösen olyan gyógyszerkészítményeket készítünk, amelyeknél a fenti oligonukleotidanalóg legalább egy része egy további oligonukleotidvegyületbe van beépítve, és így a további oligonukleotidanalógban a természetes típusú foszfor-diészter-kötések lényegében váltakoznak a kapcsolt területekkel. A beépítést előnyösen a dinukleotid kívánt szekvenciájának foszfo-diészter-kötésével végezzük, amely dinukleotidokat előzőleg kapcsoltunk.
HU 221 806 Β1
A találmány szerinti eljárásnál kiindulási anyagként alkalmazható nukleozidok prekurzorait például a (3) általános képlettel újuk le - amelyek képletében Bx jelentése a fenti,
X jelentése H, OH, 1-10 szénatomos rövid szénláncú alkil-, szubsztituált rövid szénláncú alkil-, alkarilvagy aralkilcsoport, F, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, OCN, 0-, S- vagy N-alkil-, 0-, S- vagy N-alkenil-, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, Nj, NH2, heterociklusos alkil-, heterociklusos alkaril-, amino-alkil-amino-, polialkil-amino-, szubsztituált szililcsoport, egy RNS-t hasító csoport vagy egy, az oligonukleotid farmakokinetikai vagy farmakodinamikai tulajdonságait javító csoport,
Y jelentése hidroxil-, amino-metil-, hidrazino-metil-, hidroxi-metil-, C-formil-, ftálimido-hidroxi-metil-, aril-szubsztituált imidazolidino-, amino-hidroxilmetil-, orto-metil-amino-benzol-tio-, metil-foszfonát vagy metil-alkil-foszfonát-csoport,
Z jelentése H, hidroxil-, amino-metil-, hidrazino-metil-, hidroxi-metil-, C-formil-, ftálimido-hidroxi-metil-, aril-szubsztituált imidazolidino-, amino-hidroxil-metil-, orto-metil-amino-benzol-tio-, metilfoszfonát vagy metil-alkil-foszfonát-csoport.
Azt tapasztaltuk, hogy a módosított cukorkötéseket tartalmazó oligonukleotidanalógok hatásosak a fenti célok teljesítésében. Az oligonukleotidanalógok előnyösen 4-50 nukleinsavbázis-alegységet tartalmaznak, még előnyösebben 5-20 alegységet tartalmaznak. A találmány szerinti oligonukleotidanalógok hibridizálónak egy egy szálú vagy kétszálú DNS vagy RNS előre megválasztott nukleotidszekvenciájával. A nukleinsavbázisok lehetnek pirimidinek, így például timin, uracil vagy citozin vagy lehetnek purinok, így például guanin vagy adinin vagy ezek módosításai, így például 5-metil-citozin, megfelelő szekvencia szerint elrendezve. A cukorrész lehet ribóz vagy dezoxiribóz típusú vagy egy cukorutánzó csoport, így például egy karbociklusos gyűrű. A találmány egy előnyös kiviteli módjánál az oligonukleotidanalógok vagy oligonukleozidok hibridizálódnak a tat-proteint kódoló HIV-mRNS-hez vagy a HIV-mRNS TAR-szakaszához. Az oligonukleotidanalógok vagy oligonukleozidok utánozhatják a HIVmRNS TAR-szakaszának szekunder szerkezetét, hogy a tat-proteinhez kötődjenek. Egy másik előnyös antiszenz oligonukleotidanalóg vagy oligonukleozidszekvencia egy komplementer szekvenciát tartalmaz a herpesz, papilloma vagy más vírusokkal szemben.
A találmány szerinti módosított kötések előnyösen atomos kötőcsoportok, amelyek a természetben előforduló foszfo-diészter-5’-metilén-kötést helyettesítik. A természetben előforduló kötéseknek a találmány szerinti 4 atomos csoportokkal való helyettesítése az így kapott oligonukleotidanalógoknak nukleázokkal szembeni rezisztenciát és megnövekedett celluláris felvételt biztosít. A 4 atomos kötőcsoport magában foglalja előnyösen a valamely kötött cukor 3’-dezoxicsoportját. A 4 atomos kötőcsoport az -L!-L2-L3-L4szerkezetnek felel meg. Előnyös, ha a módosított kötés lényegében mindegyik kötéshelynél előfordul. Lehetséges azonban az is, hogy a módosítás nem fordul elő minden helyen, így például csak váltakozó kötéshelyeken vagy lényegében rendezetlenül. A kötés lehet semleges, vagy lehet pozitív vagy negatív töltésű.
A találmány oltalmi körébe tartozik további a fenti oligonukleozidok előállítási eljárása is. A találmány szerinti eljárásnál egy 3’-dezoxi-3’-szubsztituált, különösen metilszubsztituált nukleozidot egy 5’-dezoxi-5’szubsztituált nukleoziddal kapcsolunk egy kétatomos vagy egy szubsztituált kétatomos fragmensen keresztül. Az addíciós reakciót végezhetjük lépésenként, amelyeknél a megfelelő nukleozidok 3’ és 5’ helyeit aktiváljuk a megfelelő, különböző elektrofil csoportok vonatkozásában, majd ezután végezzük a megfelelő kötéseket az elektrofilekkel való reakcióval. Egy más módszernél egy lépésben is eljárhatunk. Az ilyen módszereknél DNS-szintetizátorhoz szilárd hordozókat, manuális manipulációt vagy más egyéb eljárást alkalmazunk.
A találmány szerinti analógok, illetve ezeket tartalmazó készítmények alkalmasak proteinek termelődésének módosítására valamely szervnél, amelynél a szervet egy előzőekben ismertetett meggondolások alapján kialakított készítménnyel érintkeztetjük. Előnyös, ha az RNS- vagy DNS-részt, amelyet módosítani kívánunk, úgy választjuk meg, hogy tartalmazza azon DNS- vagy RNS-szakaszt, amely kódolja azt a proteint, amelynek képződését vagy aktivitását módosítani kívánjuk. A felhasználandó készítmény kiválasztott szakasza így úgy van megválasztva, hogy komplementer a DNS vagy RNS előre megválasztott szakaszával, azaz arra ez egy antiszenz oligonukleotid.
A találmány szerinti analógok alkalmasak továbbá egy szerv betegségének kezelésére, amely betegség egy protein nemkívánatos termelődésével kapcsolatos. Ennél a kezelésnél a szervet az előző megfontolások szerint kialakított készítménnyel érintkeztetjük. A készítmény előnyösen olyan, hogy specifikusan kötődik egy messenger RNS-hez, amely kódolja azt a proteint, amelynek termelődését vagy aktivitását módosítani kívánjuk. A találmány szerinti analógok alkalmazhatók továbbá egy diagnosztikai eljárásnál is, amely alkalmas egy abnormális RNS-molekula jelenlétét vagy hiányát kimutatni, vagy kimutatja a szervben vagy a sejtekben egy normál RNS-molekula abnormális vagy nem megfelelő expresszióját. A találmány szerinti analógok alkalmasak továbbá RNS szelektív megkötésére, amely kutatási és diagnosztikai célokra alkalmazható. Az ilyen szelektív, erős kötés RNS vagy DNS, és a találmány szerinti készítmények egymásra hatásával jön létre, amely készítmények ellenállóak nukleázok degradációs hatásának, és amelyek erőteljesebben és nagyobb pontossággal hibridizálódnak, mint az ismert oligonukleotidok vagy oligonukleotidanalógok.
Az 1. ábrán bemutatjuk a találmány szerinti egyik kiviteli mód szerinti előállítási eljárást sematikusan, a 2. ábrán egy másik, találmány szerinti előállítási eljárást mutatunk be sematikusan.
A korábban ismert antiszenz oligonukleotidok biológiai aktivitása általában nem volt elegendő a gyakorlatban a gyógyszerek kutatásához vagy diagnosztikai fel5
HU 221 806 Β1 használáshoz. A találmány maga módosított oligonukleotidokra, azaz oligonukleotidanalógokra vagy oligonukleozidokra, valamint ezen módosítások megvalósítására szolgáló eljárásokra vonatkozik. Ezek a módosított oligonukleotidok és oligonukleotidanalógok megnövelt stabilitással rendelkeznek a természetben előforduló megfelelőjükhöz viszonyítva. Az extracelluláris és intracelluláris nukleázok általában nem ismerik fel őket, és ily módon nem kötődnek a találmány szerinti vázon módosított oligonukleotidanalógokhoz vagy oligonukleozidokhoz. Bármilyen kötődése a nukleázoknak a vázhoz nem eredményezi a nukleozidkötések hasítását a megfelelő érzékeny foszfor-oxigén-kötések hiánya révén. Továbbá, a kapott új, természetes vagy pozitív töltésű vázak bejutnak a sejtekbe egyszerű passzív transzport útján, és nem igényelnek komplikált, proteinek által közvetített folyamatokat. A találmány egy másik előnye, hogy a negatív töltésű váz hiánya megkönnyíti az oligonukleotidanalógok vagy oligonukleozidok szekvenciaspecifikus kötődését a kiválasztott RNS-hez, amelynek negatív töltése van, és amely ennek megfelelően visszautasítja a hasonló töltésű oligonukleotidok bejutását. Egy további előnye a találmány szerinti megoldásnak, hogy ezen szerkezeti típusokban helyek vannak azon funkcionális csoportok kötődésére, amelyek a célzott RNS katalitikus hasítását iniciálják.
A találmány egy előnyös kiviteli módjában vonatkozik az intercukor-foszfát-kötések helyettesítésére, amikor is olyan oligonukleotidokat nyerünk, amelyek a fenti (I) általános képlettel leírt szerkezetű egységeket tartalmazzák.
A találmány vonatkozik továbbá a módosított intercukorkötéseket tartalmazó oligonukleozidok előállítására is. Ezek a módosítások kivitelezhetők például szilárd hordozóanyagok alkalmazásával, amelyek manuálisan manipulálhatók vagy amelyek a DNS-szintetizátorokkal kapcsolatban felhasználhatók, az előállításnál a DNS-szintéziseknél általánosan alkalmazott módszerekkel. Általában ennél az eljárásnál két nukleozid cukorrészét funkcionalizáljuk, amelyek egy megválasztott szekvenciában egymással szomszédosak. Az 5’—>3’ módnál az „upsteram” nukleozidot általában a 3’ cukorhelynél módosítjuk, és a továbbiakban „synthon 1”ként említjük. A találmány szerinti egyik eljárásnál az adenin, guanin, citozin, uracil, timin, valamint ezek analógjainak ribo- és 2’-dezoxi-ribonukleozidjait módosítjuk, és így nyerjük a 3’-dezoxi-3-hidroxi-metil-analógokat. Ezeket a 3’-hidroxi-metil-csoportokat alakítjuk át ezután különböző típusú elektrofil centrumokká. Ezt számos különböző módon végezhetjük, így például a következő előnyös módon.
A kiindulási anyagok egyik csoportját a 3’-dezoxi3’-hidroxi-metil-ribonukleozidokat például Townsend és mtársai [Townsend és mtársai, Tetrahedron Letters, 31:3101-3104 (1990), Samano, V. és M. J. Morris, Journal of Organic Chemistry, 55:5186-5188 (1990), és Bergstrom D. E. (Bergstorm D. E., Nucleosides and Nucleotides 8(8):1529-1535) (1989)] módszere szerint állítjuk elő. Ezen nukleozidoknál megfelelő módon szelektíve védjük a cukor hidroxilcsoportjait, majd a standard 2’-dezoxidáló eljárást végezzük, és így nyerjük a 2 ’ ,3 ’-didezoxi-3 ’-hidroxi-metil-ribonukleozidokat. Az ilyen típusú nukleozidokat szelektíve védhetjük és a 3’hidroxi-metil-csoportot különböző alkalmas elektrofil csoportokkal funkcionálhatjuk. A találmány előnyös kiviteli módjának megfelelően az ilyen elektrofil csoportok közé tartoznak például a következők: halogén-metil-, trifluor-metil-, szulfonil-metil-, p-metil-benzolszulfonilmetil-, hidrazino-metil- vagy 3’-C-formil-csoport.
A „downstream” nukleozidokat általában az 5’ cukorhelynél módosítjuk, és ezeket a továbbiakban „synthon 2” névvel jelöljük. Az adenin, guanin, citozin, uracil, timin, valamint analógjainak ribo- és 2’-dezoxiribonukleozidjainak előállításához a módosítást amelynél az 5’-hidroxi-metilén-csoportot különböző típusú elektrofil centrumokká alakítjuk - különböző, kereskedelmi forgalomban beszerezhető nukelozidok felhasználásával végezhetjük. így például az 5’-dezoxi5’-halogén-nukleozidot, az 5’-dezoxi-5’-tozil-nukleozidokat és az 5’-aldehid-nukleozidokat Jones G. H. és J. G. Moffatt eljárása szerint állíthatjuk elő [Jpnes G. H. és J. G. Moffatt, Journal of the American Chemical Society 90:5337-5338 (1968)].
A synthon 1 vegyületet az (1/1), míg a synthon 2 vegyületet a (2/1) általános képlettel is leírhatjuk, amely képletekben Bx jelentése a fenti és Ej és E2 jelentése azonos vagy különböző elektrofil reakcióképes csoport.
A fentiek szerinti két synthon-vegyületet egy kötőcsoporttal kapcsoljuk, amely reakcióba képes lépni az elektrofil csoporttal. A synthon 1 és synthon 2 közötti kapcsolást vagy lépésenként végezzük, vagy egyszerre visszük végbe a reakciót, és ennek eredményeképpen dinukleozidokat nyerünk, amelyek egy találmány szerinti módosított kötéssel kapcsolódnak egymáshoz vagy pedig egy nukleozidokból álló láncot nyerünk, amelyek mindegyike a találmány szerinti említett, módosított kötőcsoporttal kapcsolódik a következő nukleozidhoz.
Az egyszerre véghezvitt kapcsolási reakciót a synthon 1 és synthon 2 vegyületek elektrofil centrumai között például ammónia vagy ammóniaszármazék jelenlétében végezzük, így nyerjük a dinukleozidot. A találmány egy előnyös kiviteli módjánál az ismert bróm-metil típusú synthonokat kapcsoljuk hidrazinaddícióval, amikor is olyan kötést nyerünk, amelyben az -L1-L2-L3-L4-csoport a -CH2NHNHCH2-csoportnak felel meg. Egy másik előnyös kiviteli módnál a bróm-metil típusú synthonok kapcsolását hidroxil-amin addíciójával végezzük, amikor is az -Li-L2-L3-L4kötésnek a -CH2NHOCH2- vagy -CH2ONHCH2-csoport felel meg.
Egy másik eljárásnál, amelynél az intercukorkötések módosításával a fentiekben leírt szerkezetű dinukleozidokat nyerjük, Witting-reakciót végzünk. Előnyösen az ilyen reakcióknál a kiindulási vegyület egy 3’ketonukleozid [Townsend és mtársai, Tetrahedron Letters 31:3101-3104 (1990); Samano V. és M. J. Morris, Journal of Organic Chemistry 55:5186-5188 (1990); Bergstrom D. E. és mtársai, Nucleosides and Nucleotides 8(8):1529-1535 (1989)] vagy egy 5’-aldehid6
HU 221 806 Β1 nukleozid [Jones G. H. és J. G. Moffatt, Journal of the American Chemical Society 90:5337-5338 (1968)]. A kiindulási anyagot előnyösen egy foszforilidvegyülettel reagáltatjuk, amely benzil- vagy más védőcsoportot tartalmaz. Az egyik előnyös ilidvegyület, amelyet alkalmazhatunk a trifenil-foszforán-benzil-oxi-metilidin. Egy másik alkalmas ilidvegyület a trifenil-foszforánbenzil-oxi-etilidin. A vinilcsoport redukciójával és a benzil védőcsoport hidrogenolízisével nyerjük a hidroxi-metil-, illetve hidroxi-etil-csoportokat a guanin, adenin, citozin, timin, uracil kívánt nukleozidjainak, vagy ezen nukleozidok analógjainak 5’- vagy 3'-helyzetében. Továbbá a Witting-reakciót alkalmazhatjuk az 5’ és 3’-hidroxi-alkil-csoportok kialakításához a karbociklusos nukleozidoknál.
A hidroxilcsoportok konverziójával nyerjük az elektrofil centrumokat, majd a 3’ elektrofil centrumot kapcsoljuk az 5’ elektrofil centrummal, és így nyerjük a találmány szerinti dinukleozidokat. A találmány egyik kiviteli módjánál a hidroxilcsoportokat például bromid, triflát és tozilát elektrofil centrumokká alakítjuk. A kapcsolás révén olyan dinukleozidokat nyerünk, amelyeknél a szénlánc egy vagy több heteroatommal kapcsolódik. Az ilyen heteroatomok előnyös jelentése például Ο, NH, NR3, S, SO, P(O)R4 vagy SiR^R^, mint amelyeket az előzőekben az általános képlet leírásánál megadtunk.
További hasznos dinukleozidok, amelyeket valószínűleg Witting-reakcióval lehet előállítani a 3’ vagy 5’karbonilnukleozidok és trifenil-foszforin-metilidin-difenil-foszfonát alkalmazásával, a foszfonát-dinukleozidok. Ennél a reakciónál metil- vagy etil-foszfonátokat nyerünk, amelyek kondenzálhatok a megfelelő 5’vagy 3’-hidroxicsoporttal, így nyerjük a 3’- vagy 5’foszfonátkapcsolású oligonukleozidokat. Az ilyen típusú vegyületek kémiájában ismertetik a dinukleozidok foszfonátjainak előállítását, amelyet biokémiai folyamatok tanulmányozásához alkalmaznak [Moffatt J. G. és mtársai, Journal of American Chemical Society 92:5510-5513 (1970)]. Az ilyen típusú kapcsolás alkalmazása egy előnyös módszer, amelynél egy 3’-ketonukleozidot kapcsolunk egy 5’-nukleozidhoz szimmetrikus bisz(metil-trifenil-foszfán)-fenil-foszfonát alkalmazásával és így 3’, 5’-dimetil-foszfonát-kapcsolású oligonukleotidokat nyerünk.
A Witting-reakción kívül a 3’-hidroxi-metil-nukleozidokat előállíthatjuk az α-karbociklusos nukleozidok inverziójával is. Ennél a kívánt 3’-hidroxi-metil-csoportot a „down” vagy α-helyen nyerjük. Ezt a csoportot védeni lehet és a 3”-hidroxilcsoportot (azonosítja az exociklusos metilcsoportot, amely a cukor 3’ helyzetében kapcsolódik mint 3”-metil) hidroxi-metil-csoporttá vagy egy hosszabb alkilcsoporttá alakíthatjuk. Az egyik módszer a 3’ csoport átalakítására a ketocsoporttá való oxidáció, amelyet egy Witting-reakció követ trifenil-foszforin-metilidin-difenil-foszfonáttal, majd egy redukciós lépés. Hosszabb hidroxi-alkil-csoportokat a 3”-helyzetbe hasonlóképpen tudunk bevinni. Ennél a kiviteli módnál 4’-dezmetil-3’-hidroxi-metilnukleozid synthont is előállíthatunk. A 4’-dezmetil és a normál 3’-hidroxi-nukleozid közötti kapcsolás egy kétatomos kapcsolócsoporttal dinukleozid synthonokat eredményez, amelyet az előző, függő bejelentésünkben ismertettünk (alapszám 566836, benyújtva 1990. augusztus 13.). A 4’-dezmetil-hidroxil-csoport kapcsolása a megfelelő 3’-synthonokkal, mint azt a fentiekben már említettük, számos más típusú dinukleozid synthont eredményez.
Egy további lehetőség a 3’-dezoxi-3’-metil-nukleozidok metilcsoportjának funkcionalizálására elvégezhető a 3’-dezoxi-3’-ciano-nukleozidok alkalmazásával. K. E. B. Parkes és K. Taylor [Parkes K. E. B. és K. Taylor, Tetrahedron Letters 29:2995-2996 (1988)] egy általános eljárást ismertetnek a 3’-ciano-nukleozidok előállításához. Ennél az eljárásnál 5’-tritilvédett 2’-dezoxi-nukleozidokat 3’-jódoznak metil-trifenilfoszfónium-jodid alkalmazásával. Ezeket az anyagokat ezután hexametil-dionnal, terc-butil-izonitrillel és 2,2’azo-bisz(izobutrilo-nitrillel) (AIBN) kezelnek, amikor is a cianocsoport gyökös addícióját hozzák létre a 3’helyzetben. Ezen cianocsoport aldehicsoporttá való átalakítását magas kihozatallal lehet elvégezni. Ezután a kapott intermedier anyagot hidroxi-metil-csoporttá alakítják, amely egy igen értékes prekurzor az elektrofil synthon 1 előállításához.
Egy további módszer, amellyel az intercukorkötések módosíthatók a dinukleozidok előállításához, amelynél 3’-C-formil-derivatizált nukleozidokat alkalmaznak synthon 1-ként és 1’-amino-hidroxi-derivatizált nukleozidokat synthon 2 vegyidéiként. A synthon 1 és 2 vegyületek közvetlen kapcsolásával nyerjük a dinukleozidokat, amelyek oximkötéssel kapcsolódnak. Ebben az esetben az oxim mint E/Z izomer van jelen. Az izomervegyületeket ezután HPLC-vel elválasztjuk. Továbbá ennél a módszernél az oxim nitrogénatomja szomszédos az „upstream” nukleozid 3’-végén lévő szénatommal. Az olyan dinukleozidokat, amelyek oxim-nitrogén-atomja szomszédos a „downstream” nukleozid 5’szénatomjával úgy állítjuk elő, hogy 5’-C-formilderivatizált nukleozidot mint synthon 2-t reagáltatunk egy -3’-dezoxi-3’-amino-hidroxi-metil-derivatizált nukleoziddal mint synthon 1 vegyülettel. Ebben az esetben szintén oxim E/Z izomereket is nyerünk. Mindkét esetben az oximkapcsolású dimerek alkalmasak az oligomerekbe való közvetlen beépítésre vagy redukáhatók a megfelelő hidroxi-amino-kapcsolású dinukleozidokká. Az oximkapcsolású dinukleozidok reakcióját dinukleozid formában vagy mint egy oligomer dinukleozid részeként nátrium-ciano-bór-hidriddel végezzük, és így nyerjük a megfelelő amino-hidroxil-kapcsolású vegyületeket. A hidroxi-amino-kapcsolású dinukleozidok vagy a nagy oligomer alkilezhető az amino-hidroxil-kötés aminocsoportjánál, és így nyeljük a megfelelő N-alkil-amino-kötőcsoportot.
A 3’-C-formil-helyettesített synthon-vegyületet számos szintetikus úton előállíthatjuk. Az egyik előnyös módszernél a megfelelő 3’-dezoxi-3’-jód-nukleozid gyökös karbonilezését alkalmazzuk. A jódvegyületet COdal, AIBN-nel, azaz 2,2’-azo-bisz(izobutril-nitrillel) és TTMS-sel, azaz trisz(trimetil-szilil)-szilánnal kezeljük.
HU 221 806 Β1
Eljárhatunk úgy is, hogy 3’-dezoxi-3’-ciano-cukrot vagy nukleozidot alkalmazunk. Mind az 5’-C-formil-csoport (5’-aldehidocsoportként is említjük), mind a 3’-C-formil-csoportot alkalmas módon blokkolhatjuk O-metilamino-benzoil-tiol-védőcsoport alkalmazásával. Mind az 5’, mind a 3’-C-formil-csoportok deblokkolását ezüst-nitrátos oxidációval lehet elvégezni.
Egy másik módszernél a 3’-C-formil-nukleozidok előállításához 1 -O-metil-3 ’ -dezoxi-3 ’ -O-metil-aminobenzol-tiol-5 ’-O-tritil-p-D-eritro-pentofuranozidot alkalmazunk. Ez a vegyület szolgál bármely 3’-dezoxi3’-C-formil-nukleozid prekurzoqaként. Az 1-O-metil3 ’-dezoxi-3 ’-O-metil-amino-benzol-tiol-5 ’-O-triti 1-βD-eritro-pentofuranozidot reagáltatjuk egy megfelelő bázissal standard glükozilálási körülmények alkalmazásával, majd a kapott vegyületet deblokkolva nyerjük a kívánt nukleozidot. Még egy további másik módszernél a 3’-dezoxi-3’-ciano-nukleozidot vagy a megfelelő 3’dezoxi-3’-jód-nukleozidból nyeljük, vagy egy glükozilálási reakció segítségével 1-O-metil-3’-dezoxi-3’-Ociano-5’-O-tritil-p-D-eritro-pentofuranoziddal.
A 3”-0-amino-3”-hidroxi-metil-nukleozidot és a megfelelő 5’-O-amino-nukleozidot alkalmas módon állíthatjuk elő védett ftálimido intermedieren keresztül a Mitsunobu alkalmazási körülmények között N-hidroxiftálimid, trifenil-foszfin és diizopropil-azo-dikarboxilát alkalmazásával. Ezt viszont a Mitsunobu-reakcióval állítjuk elő a nukleozid nem védett hidroxilcsoportján. A 3”-O-amino-3”-hidroxi-metil-nukleozid előállításánál tritilt alkalmazunk védőcsoportként nukleozid 5’hidroxilcsoportjához. Mind a purin-, mind a pirimidinnukleozidokat a reakció előtt N-hidroxi-ftálimiddel védjük, a 3’-hidroxicsoportot pedig TBDPS-sel. A pirimidinbázisok esetén 5’-O-amino-nukleozidok kialakításánál a 3’-hidroxilcsoportot TBDPS védőcsoporttal védhetjük a ftálimidocsoportnak az 5’-helyzetbe való bevitele után.
Egy másik eljárás, amelynél az intercukorkötéseket módosíthatjuk hogy foszfonátkötésű dinukleotidokat nyerjünk, a Michaelis-Arbuzov-eljárás [Mazur és mtársai, Tetrahedron, 20:3949 (1984)], amelynél 3’-Cfoszfonát-dimereket nyerünk. Ez az eljárás alkalmazná a 3’-hidroxi-metil-nukleozidokat mint synthon 1 vegyületet. Ezt kezeljük N-bróm-szukcinimiddel, ekkor nyerjük a megfelelő 3”-bróm-metil-származékot. A synthon 2 vegyületként 5’-foszfitot alkalmazunk. A synthon 1 és 2 vegyületek kapcsolásakor nyeljük a dinukleozidot, amely 3’-C-foszfonát-kötést tartalmaz. A megfelelő 5’-C-foszfonát-dimereket úgy állíthatjuk elő, hogy először a megfelelően blokkolt foszfitot reagáltatjuk a synthon 1 vegyülettel, majd ezután végezzük a deblokkolást, és így nyeljük a 3’-CH2-foszfit-intermediert. A synthon 2 vegyületként 5’-bróm-nukleozidot választunk. A 3’-CH2-foszfít-intermediert ezután reagáltatjuk a synthon 2 vegyülettel, és így nyerjük az 5’-C-foszfátdimert. Ha blokkolt foszfitként tribenzil-foszfitot választunk, a synthon 1 vegyülettel való kapcsolás után a benzilcsoportot hidrogenolízissel távolíthatjuk el. Eljárhatunk úgy is, hogy az 5’-dezoxi-5’-bróm-nukleozidot reagáltatjuk a foszfit-észterrel, és így 5’-foszfonátot nyerünk. Ezt azután a 3’-hidroxi-metil-nukleoziddal reagáltatva nyerjük az 5’-C-foszfonát-kötésű dimert.
A fentiek szerinti bármelyik dinukleozidot, amelyek hidrazinokkal, hidroxil-aminokkal vagy más találmány szerinti kötőcsoporttal kapcsolódnak, dimetoxitritil-csoporttal védhetjük az 5’-hidroxilcsoportnál és aktiválhatjuk a 3’-hidroxilcsoportnál történő ciano-etildiizopropil-foszfrt-csoporttal való kapcsoláshoz. Ezeket a dimereket bármelyik kívánt szekvenciába beépíthetjük standard, szilárd fázisú automatizált DNSszintézises eljárással, amelynél foszfor-amidát-kapcsolóreagenseket alkalmazunk. Ekkor a védett dinuklezidok egy specifikált DNS-szekvencia egységeivel kapcsolódnak normál foszfo-diészter-kötések alkalmazásával. A kapott oligonukleotidanalóg vagy oligomer kevert vázú, részben normál foszfo-diészter-kötéseket és részben új négyatomos, találmány szerinti kötéseket tartalmaz. Ennél a módszernél egy 15 tagú szekvenciaspecifikus oligonukleotidot könnyen előállíthatunk, amely 7 hidroxil-amin, hidrazin vagy más típusú kötéssel kötött dinukleozidot tartalmaz. Az ilyen szerkezet megnövekedett vízoldhatóságú, összehasonlítva a natív foszfo-diészter-kapcsolású oligonukleotidokkal.
Az egyforma vázkötésű oligonukleotidokat például a CPG-szilárd hordozós eljárás, valamint standard nukleinsavszintetizáló berendezések alkalmazásával lehet előállítani (lásd például Applied Biosystems Inc. 380B és 394 és Milligen/Biosearch 7500 és 8800s). A kezdőnukleozidot (No. 1 a 3’-terminusznál) a szilárd hordozóhoz (így például szabályozott pórusméretű üveghez) kapcsoljuk, majd a szekvenciaspecifikus sorrendben mindegyik további új nukleozidot hozzákapcsoljuk vagy manuális manipulációval vagy automatizált szintetizáló rendszenei. A metilén-hidrazin-kötés esetében az ismétlődő nukleozidegység lehet két általános típusú, így egy nukleozid 5’-védett aldehidfúnkcióval és egy 3’-dezoxi-3’-C-hidrazino-metil-csoporttal vagy egy nukleozid, amely 5’-dezoxi-5’-hidrazino-csoport, amelyet egy savra labilis csoporttal, így például egy 3’-dezoxi-3’-C-formil-csoporttal védünk. Mindegyik esetben a körülmények, amelyeket mindegyik ciklusban a szekvencia által megkövetelt egység beépítését végezzük, a következő: savas mosás az 5’aldehid-védőcsoport eltávolítására; a következő, a 3’metilén-hidrazino-csoportot tartalmazó nukleozid adagolása a megfelelő hidrazonkapcsolat kialakítására; redukció bármely változtatható szerrel a kívánt metilénhidrazin-kötésű CPG-kötött oligonukleozidok kialakítására. Egy ilyen alkalmas redukálószer például a nátrium-ciano-bór-hidrid.
Egy előnyös módszert mutatunk be az 1. ábrán. Ennél a módszernél szilárd hordozót alkalmazunk, amelyre rávisszük a synthon 2 vegyületet 5’-védett formában. Előnyösen az 5’-hely védését DMT-vel végezzük. Ezután a synthon 2 vegyület 5’ helyét felszabadítjuk, enyhe savval mossuk, majd oxidáljuk, és így nyerjük az intermedier terméket. Egy előnyös módszernél az aldehidszármazékot Ν,Ν-difenil-etilén-diaminnal reagáltatjuk, így egy intermedier terméket nyerünk, ez az 5’-difenil-imidazolidino-védett synthon 2. Egy még elő8
HU 221 806 Β1 nyösebb kiviteli formánál az 5’-difenil-imidazolidinovédett synthon 2 vegyületet közvetlenül visszük a hordozóra. Egy másik módszernél az intermedier terméket ezt követően deblokkolhatjuk, így nyeljük a synthon 2t, amely nukleofil csoportot tartalmaz az 5’-helyzetben. A következő lépésben a synthon 2 vegyületet adagoljuk 5’-aldehidcsoporton védett formában, így például 5’difenil-imidazolidino-védett 3 ’ -dezoxi-3 ’-C-hidrazinbázist adagolunk, ezt ezután például nátrium-cianobór-hidrid adagolásával reagáltatjuk a már felvitt synthon 2-vel. Ezután mosás következik, a kialakult dinukleozid-hidrazino-csoporton keresztül kapcsolódik. Ezután a ciklust megismételhetjük, kívánt esetben egy synthon 1 vegyület adagolásával, majd egy sav/bázis védőcsoport-eltávolítás következik, így képződik a polysynthon-vegyület, ez a kívánt oligomer a kívánt szekvenciában, amely módosított intercukorkötéseken keresztül kapcsolódik. Néhány előnyös kiviteli formánál a synthon 1 vegyület lehet egy 5’-DMT-védett 3’C-hidrazin-bázis.
Ezen lépésenkénti eljárás egyik előnyös kiviteli formájánál difenil-etil-diamin-adduktumot (1,3-diszubsztituált imidazolidino) alkalmazunk a synthon 2 vegyület elektrofil centrumának védésére a szilárd hordozóhoz való kötés során [Moffatt J. G. és mtársai, Journal of American Chemical Society 90:5337-5338 (1968)]. A synthon 2 vegyület kapcsolását előnyösen a szilárd hordozóhoz, így például a szabályozott pórusméretű üvegszemcséhez vagy más alkalmas hordozóhoz a szakember számára ismert módon standard eljárással végezhetjük [Gait M. J., kiadó, Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach (IRL Press 1984)]. Eljárhatunk úgy is, hogy az előállítást a védett, felvitt nukleozid közvetlen oxidálásával végezzük, amelyhez különböző standard oxidációs eljárásokat alkalmazunk. A synthon 2 felvitt vegyületet előnyösen egy hidrazinnal reagáltatjuk, így egy Schiff-bázist nyerünk, amelyet ezt követően redukálunk. Ennél az eljárásnál a hidroxi-amin szintén egy előnyös reagens.
A 2. ábrán egy további módszert mutatunk be az egyforma vázkötésű oligonukleotidok előállítására. Ennél a módszernél szintén szilárd hordozót alkalmazunk, amelyhez kötjük az 5’-helyen védett synthon 2 vegyületet. Ebben az esetben a synthon 5’-helyét ftalimidocsoporttal védjük. Ezután a synthon 2 5’-helyét felszabadítjuk DCM-ben oldott metil-hidrazinnal, majd DCM/metanol eleggyel mossuk. A synthon 1 vegyület 5’-helyén lévő amino-hidroxin-csoportot szintén védjük ftalimidocsoporttal. Ilyen synthon 1 vegyület például az 5 ’-ftalimidovédett 3’-dezoxi-3’-C-formil-nukleozid. A synthon 1 vegyületet a synthon 2 vegyülettel reagáltatjuk ezután, majd eltávolítjuk az 5’ helyen a védőcsoportot és a terméket mossuk, hogy felszabadítsuk a következő 5’-amino-hidroxi reakcióhelyet. A ciklust ismételjük további synthon 1 vegyület adagolásával addig, amíg a kívánt szekvenciát kialakítjuk. Ebben a szekvenciában mindegyik nukleozid oximkötéssel kapcsolódik egymáshoz. A kívánt oligonukleozid terminális nukleozidját a szekvenciához 5’-DMT-blokkolt 3’-dezoxi-3’-Cformil-nukleozidként adagoljuk. Az oximkötésű oligonukleozidokat eltávolíthatjuk a hordozóról. Ha amino-hidroxil-kötésű oligonukleozidot akarunk előállítani, az oximkötéseket nátrium-ciano-bór-hidriddel redukáljuk. A redukciót váltakozva is végezhetjük, mivel az oximkötésű oligonukleozid még a hordozóhoz van kapcsolva.
A találmány szerinti oligonukleotidanalógok felhasználhatók diagnosztikumként, terápiás szerként, kutatási reagensként és készletként. Terápiás alkalmazásnál az oligonukleotidanalógokat olyan élőlényeknek adagoljuk, amelyek bizonyos proteinek által kiváltott betegségben szenvednek. A betegeknek, amelyekről feltételezzük, hogy ilyen betegségben szenvednek, az oligonukleotidanalógokat olyan mennyiségben adagoljuk, amely képes a betegség szimptómáit hatásosan csökkenteni. A szakterületen jártas szakember meg tudja határozni az optimális dózist és a kezelések sorrendjét.
A találmány szerinti terápiás szereket előnyösen orálisan, intravénásán vagy intramuszkulárisan adagoljuk, de más egyéb adagolási módszerek, így például a transzdermális, topikális, vagy intralezionális adagolás szintén hatásos lehet. Az adagolást végezhetjük kúpok formájában is. Bizonyos kiviteli formánál a gyógyászatilag elfogadható hordozóanyagok is felhasználhatók.
A következő nem korlátozó példákkal a találmány szerinti megoldást mutatjuk be közelebbről.
Egyforma metilén-hidrazin (3 ’- CH2-NH-NH- CH2-5 j-kötésü oligonukleotidok előállítása
1. példa
CPG-kötött nukleozidok előállítása; difenil-imidazolidino-védett 5 ’-aldehid-timidin és 5 ’-dezoxi-5 'h idrazino-tim idin
CPG-kötött timidint (3 pmol timidin 1 g CPG hordozón, ABI, Foster City Ca) kezelünk környezeti hőmérsékleten DMSO, benzol, DCC, piridin és trifluor-ecetsav (15 ml/15 ml/2,48 g/0,4 ml/0,2 ml) keverékével K. E. Pfítzer és J. G. Moffatt oxidációs módszeréhez hasonló eljárással [Pfítzer K. E. és J. G. Moffatt, Journal of American Chemical Society 85:3027 (1963)], így nyerjük az 5’-aldehidnukleozidokat. A keveréket ezután 1 éjszakán át tároljuk, majd szűrjük, a hordozót oxálsawal kimossuk (1,3 g, 5 ml benzol/DMSO=l/l elegyben), majd 3 g 1,2-dianilino-etilénnel kezeljük 1 órán át, majd szűrjük és acetonitrillel mossuk, így nyeljük az 5’-difenil-imidazolidino-védett 5’-aldehid-timidint. A hordozóhoz kötött 5’-aldehido-timidint hidrazin-hidrát/nátriumciano-bór-hidrát acetonitriles oldatával kezelve nyerjük a CPG-3’-kötött 5’-dezoxi-5’-hidrazino-timidint, amelyet hidrokloridsója formájában tárolunk.
2. példa ’-Difenil-imidazolidino-védett-3 ’-dezoxi-3 ’-Chidrazino-metil-timidin előállítása A kereskedelmi forgalomban beszerezhető 3’-O-acetil-timidint oxidálunk, majd védjük N,N-difenil-etiléndiamin-származékaként (1,3-difenil-imidazolidino). Ily módon nyerjük az ismert 5’-dezoxi-5’-difenil-imida9
HU 221 806 Β1 zolidino-3’-acetil-timidint [Pfítzer K. E. és J. G. Moffatt, Journal of American Chemical Society 85:3027 (1963)]. Ezt az anyagot metanolos ammóniával való kezeléssel hidrolizáljuk szobahőmérsékleten 15 órán át. 4,5 g 5’-dezoxi-5’-difenil-imidazolidino-timidint feloldunk 100 ml DMF-ban és trifenil-metil-foszfónium-jodiddal kezeljük szobahőmérsékleten 15 órán át. Az oldószert ezután csökkentett nyomáson eltávolítjuk, és a visszamaradó anyagot metanolból átkristályosítva nyeqük a 3’-dezoxi-3’-jód-származékot.
A 3 ’-dezoxi-3 ’-jód-5 ’-difenil-imidazolino-timidint feloldjuk toluolban, majd hexametil-dionnal, terc-butilizonitrillel és AIBN-nel kezeljük. E gyökös reakcióval nyerjük a 3’-dezoxi-3’-ciano-származékot, amelyet ezután diizobutil-alumínium-hidriddel (DIBAL-H) redukálunk toluol/THF elegyben 0°-on, így nyerjük a 3’-dezoxi-3’-C-formil-5’-difenil-imidazolidino-timidint. Ezt az anyagot ezután hidrazin-hidráttal és nátrium-bór-hidriddel kezeljük acetonitrilben, így nyerjük a 5’-difenilimidazolidino-védett-3 ’-dezoxi-3 ’-C-hidrazinometil-timint. Ezt az anyagot előnyösen acetátsója formájában tároljuk.
3. példa
Egyforma metilén-hidrazin-kötésű oligonukleotidanalögok előállítása Applied Biosystems Inc. 380B DNS-szintetizátorral
A CPG-kötött timidint a difenil-imidazolidinovédett 5’-aldehidcsoporttal, amely a 3’-terminális nukleozid lesz, az Applied Biosystem Inc. (ABI) oszlopra visszük (250 mg, 5 pmol kötött nukleozid) és egy ABI 380B automata DNS-szintetizátorhoz kapcsoljuk. Az automatizált (komputerszabályozott) lépések, amelyek szükségesek a dezmetil-nukleotid-egységeknek a növekvő lánchoz való kapcsolásához, a következők:
1 Lépések Reagens vagy oldószerkeverék Idő (perc: mp)
1. 3% DCA diklór-etánban 3:00
2. Diklór-etános mosás 1:30
3. 5 ’ -dezoxi-5 ’ -(1,3 -difenil-imidazolidino)-3 ’-dezoxi-3 ’-C-metilén-hidrazin-nukleozid (ez a második nukleozid); 2 pmol 30 ml acetonitrilben 2:50
4. Nátrium-bór-hidrid (50 pmol 50 ml 1/1 =THF/EtOH elegyben) 3:00
5. Diklór-etános mosás 2:00
6. Visszavezetés az 1. lépéshez (savas mosás) 3:00
A fenti eljárással nyerjük a nukleozidokat, amelyek 5’-dimetoxi-tritil-szubsztituált nukleozidegységet tartalmaznak.
A szintézis befejezésével a bázisok védőcsoportjait eltávolítjuk, majd az oligomert eltávolítjuk a hordozóról ismert eljárások szerint. A tritil-on HPLC-tisztítását egy savas védőcsoport-eltávolítás, majd egy kicsapás követi, így nyerjük az oligonukleozidokat acetátsójuk formájában.
Váltakozó metilén-hidrazin (3 ’-CH2-NH-NH-CH2-5 ')-kötésű oligonukleozidok előállítása
4. példa ’-Dezoxi-5 ’-hidrazino-timidin-hidroklorid előállítása
Az 5’-benzil-karbazil-5’-dezoxi-timidin előállításához 1,98 g (5 mmol) 5’-O-tozil-timidint [Nucleosides & Nucleotides 9:89 (1990)] elkeverünk 4,15 g (25 mmol) benzil-karbaziddal, 2 g aktivált molekulaszitával (3 Á) és 100 ml vízmentes dimetil-acetamiddal és nedvesség kizárása mellett 110 °C fürdőhőmérsékleten 16 órán át keverjük. A terméket ezután lehűtjük, csökkentett nyomáson betöményítjük (fürdőhőmérséklet kisebb mint 50 °C), a maradékot szilikagélen tisztítjuk (5 x45 cm) (CH2Cl2/MeOH=9/l tf/tf). A homogén frakciókat egyesítjük, szárazra pároljuk és a kapott habszerű anyagot EtOH-ból kikristályosítjuk, így 0,7, g 36% 5’-benzil-karbazil-5’-dezoxi-timidint nyerünk, olvadáspont 201 °C.
•H-NMR (Me2SO-d6) 8 1,79 (s, 3, CH3), 2,00-2,18 (m, 2, C2CH2), 2,95 (t, 2, C5CH2), 3,75 (m, 1,
C4.H), 4,18 (m, 1, C3.H), 4,7 (brs, 1, O2NH), 5,03 (s, 2, PhCH2), 5,2 (d, 1, C3.H), 6,16 (t, 1, CrH),
7,2-7,4 (m, 5, C6H5), 7,6 (s, 1, C6H), 8,7 (brs, 1,
CH2NH), 11,2 (brs, 1, C3NH).
A hidrokloridsó előállításához 0,78 g (2 mmol) fenti karbazátot elkeverünk 150 mg 10%-os szénhordozós palládiummal, 30 ml vízmentes MeOH/HCl elegyben (2 tömeg% HC1) és hidrogénatmoszférában szobahőmérsékleten 1,5 órán át keverjük. A metanolos oldatot ezután celiten leszűijük a katalizátor eltávolítására, a szűrőlepényt kétszer 25-25 ml EtOH-dal mossuk, a szűrletet vákuumban betöményítjük és a visszamaradó anyagot 1 éjszakán át szárítjuk a HCl-nyomok eltávolítására. A sárga anyagot ezután 3 ml metanolban oldjuk és cseppenként gyors keverés közben 100 ml etil-acetáthoz adagoljuk. A kiváló csapadékot szüljük, ezt háromszor 100-100 ml etil-acetáttal mossuk és a halványsárga, szilárd anyagot vákuumban szárítjuk. Ily módon 0,51 g 5’-dezoxi-5’-hidrazino-timidin-hidrokloridot nyerünk higroszkópos por formájában.
iH-NMR (Me2SO-d6) 8 1,81 (s, 3, CH3), 2,02-2,22 (m, 2, C2.CH2), 3,2 (m, 2, C5, CH2), 3,8 (m, 1,
C4,H), 4,2 (m, 1, C3,H), 6,17 (t, 1, C„H), 7,54 (s, 1,
C6H), 11,18 (brs, 1, C3NH), a hidrazino- és 3’-OH nem volt látható, mivel a minta nedves volt.
5. példa
5’-Tritil-l-[2,3-didezoxi-3-C-(formil)-$-D-eritropentofuranozil]-uracil és -timin előállítása
0,96 g (2 mmol) 3’-ciano-2’,3’-didezoxi-5’-O-tritiluridint (lásdTetrahedron Letters 29:2995 (1988) a timidinanalóg előállítására) feloldunk 20 ml vízmentes THF-ban és argonatmoszférában hozzáadunk 4 ml 1 mólos toluolos DIBAL-H-t (ALdrich) -10 °C hő10
HU 221 806 Β1 mérsékleten 10 perc alatt. 30 perc elteltével a keverékhez 5 ml MeOH-ot adunk -10°-on, majd a keveréket környezeti hőmérsékleten még 30 percig keverjük, 25 ml CH2Cl2-ral hígítjuk, majd vákuumban betöményítjük. Ezt az eljárást háromszor 25-25 ml CH2Cl2-ral megismételjük a maradék THF eltávolítására. A visszamaradó anyagot flash-kromatográfiával 25 g szilikagélen tisztítjuk (CH2C12 9/1 tf/tf), majd a kapott anyagot CH2Cl2/MeOH elegyből átkristályosítjuk. így nyerjük a 5’-O-tritil-3’-C-formil-2’,3’-didezoxi-uridint, mennyisége 0,53 g, 53%, olvadáspont 100 °C.
1H-NMR (CDClj) δ 2,25-2,8 (m, 2, CH2), 3,4 (m, 1, C3,H), 3,45-3,6 (m, 2, C5,CH2), 4,37 (m, 1, C4,H), 5,4 (d, 1, C5H), 6,1 (m, 1, C„H), 7,2-7,4 (m, 15, C6H5), 7,81 (d, 1, C6H), 7,95 (brs, 1, NH), 9,61 (s, 1, HC=O)
6. példa l-Metil-5-(terc-butil-difenil-szilil)-2,3-didezoxi-3C-(formil)-D-eritro-pentofiiranozil előállítása A 3’-C-formil cukorprekurzort olaj formájában
90%-os kihozatallal nyerjük a 3’-C-ciano-cukor DIBAL-H-nel végzett redukciójával (Tetrahedron Lettem 44:625 (1988).
7. példa
Metilén-hidrazin-kapcsolású (3 ’-CH2-NH-NH-CH2-5 ) 5 -dimetoxi-tritil-S ’$-ciano-etoxi-diizopropil-foszforamiditdinukleozidok előállítása mmol 5’-O-tritil-l-[2,3-didezoxi-3-C-(formil)-pD-eritro-pentofuranozil]-timidint elkeverünk 1 mmol 5’-dezoxi-5’-hidrazino-timidin-hidrokloriddal és 25 ml vízmentes THF-fel argonatmoszférában és hozzáadunk 1 g száraz molekulaszitát. A reakciót hagyjuk 1 éjszakán át végbemenni, majd 5 mg bromocresol green-t adagolunk hozzá, majd 4 mmol nátrium-ciano-bór-hidridet, majd cseppenként fecskendőn keresztül 4 mmol p-toluolszulfonsavat adagolunk 4 ml THF-ban oly módon, hogy a reakciókeverék drappos színét megtartsuk. A keverést 2 órán át folytatjuk még az adagolás befejeztével. A keveréket ezután szüljük, a szilárd anyagot háromszor 10-10 ml vízmentes metanollal átmossuk, a szűrleteket egyesítjük és betöményítjük. A visszamaradó anyagot oszlopkromatográfiával tisztítjuk, így nyeljük a metilén-hidrazin kötött (3’-CH2-NH-NH-CH2-5’) timidin-dimereket. Ezen anyag hidrazinokötését monobenzoilezzük M. J. Gait módszere szerint [Gait M. J., szerk., Oligonucleotide Synthesis, A practical Approach (IRL Press 1984)]. Az 5-hidroxil- és 3-hidroxilcsoportokat standardeljárással 5’-O-dimetoxi-tritil-3’-Pciano-etoxi-diizopropil-foszfor-amidittá alakítjuk.
8. példa
Váltakozó metilén-hidrazin (3 ’-CH2-NH-NH-CH2-5 )-kötésű oligonukleozidok előállítása A CPG-kötött timidint (vagy bármely más nukleozidot, amely a 3’-terminális részre kerül) az Applied Biosystems Inc. ABI oszlopára visszük (250 mg, pmol kötött nukleozid) és az oszlopot egy ABI 380B automata DNS-szintetizátorhoz kapcsoljuk. Standard automatizált (komputerszabályzott) lépéseket alkalmazunk foszfor-amidit-reagensekkel a metilénhidrazin-timidin-dimemek a kívánt helyen és a kívánt szekvencia szerinti elhelyezésére.
9. példa
Más módszer az 5 ’-O-tritil-l-[2,3-didezoxi-3-C(formil)-$-D-eritro-pentofuranozil]-uracil- és timidin előállítására
0,59 g (4 mmol) 3’-dezoxi-3’-jód-5’-O-tritiltimidint (Tét. Letters, 29:2995 (1988)] elkeverünk 2,87 g (1,2 mmol) trisz(trimetil-szilil)-szilánnal 12 mg (0,072 mmol) AIBN-nel és 20 ml toluollal egy üvegedényben és argonnal telítjük úgy, hogy szobahőmérsékleten argongázt buborékoltatunk keresztül. Az üvegedényt ezután egy rozsdamentes autoklávba helyezzük, szén-monoxiddal nyomás alá helyezzük (80 psi) lezárjuk, 90°-ra hűtjük (fürdőhőmérséklet) és ezen a hőmérsékleten tartjuk 26 órán át. A keveréket ezután 0°-ra lehűtjük, a CO-gázt kiengedjük óvatosan (védősisakban), a terméket flash-kromatográfiával 20 g szilikagélen tisztítjuk (EtOAc/hexán=2/l), majd a megfelelő frakciókat egyesítjük, így nyerjük a cím szerinti vegyületet hab formájában, mennyisége 0,3 g, 61%.
A 2’,3’-didezoxi-3’-jód-5’-O-tritil-uridin gyökös karbonilezését hasonlóképpen elvégezve nyerjük a 3’C-formil-uri din-származékot.
10. példa ’-O-Ftálimido-timidin és 2 ’-dezoxi-O-ftálimidouridin előállítása
1,21 g (5 mmol) timidint elkeverünk 1,09 g (6,6 mmol) N-hidroxi-ftálimiddel és 1,75 g (6,6 mmol) trifenil-foszfinnal 25 ml vízmentes DMF-ban, majd hozzáadunk 1,5 ml (2,5 mmol) diizopropil-azo-dikarboxilátot 30 perc alatt 0°-on. A keverést még 12 órán át szobahőmérsékleten folytatjuk, majd az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk és a visszamaradó anyagot kétszer 50-50 ml dietil-éterrel mossuk. A maradékot 50 ml fonó etanollal szuszpendáljuk, lehűtjük, szűrjük, amikor is 1,54 g, 80% cím szerinti vegyületet nyerünk fehér por formájában.
Hasonló reakcióval a 2’-dezoxi-uridinből nyerjük a megfelelő 2’-dezoxi-5’-ftálimido-uridint, olvadáspont 241-242 °C.
11. példa ’-O-Ftálimido-3 '-O-terc-butil-(difenil)-szilil-timidin és 2 ’-dezoxi-ő ’-O-ftálimido-3 ’-Oterc-butil-(difenil)-szilil-uridin előállítása 5’-O-Ftálimidio-timidint vagy 2’-dezoxi-5’-O-ftálimido-uridint piridinben és imidazolban terc-butil-(difenil)-klór-szilánnal kezelünk ismert módon, így nyerjük kristályos termék formájában a 5’-O-ftálimido-3’-Oterc-butil-(difenil)-szilil-timidin és 2’-dezoxi-5’-O-ftálimido-3’-O-terc-butil-(difenil)-szilil-uridint.
Ή-NMR a timidinszármazékra CDCl3-ban: δ 1,10 (s,
9, C(CH3)3), 1,95 (s, 3, CH3), 2,2 (m, 2, C2, CH2),
HU 221 806 Β1
3,63-4,15 (m, 3, C3, H és C5-, CH2), 4,80 (m, 1, C4,
H), 6,45 (t, 1, Cb H), 7,4 (m, 15, ArH, C6H), 8,2 (br s, 1,NH).
12. példa '-O-Amino-3 ’-O-terc-butil-(difenil)-szilil-timidin előállítása ml vízmentes CH2Cl2-ral elkeverünk 5’-O-ftálimido-3’-O-terc-butil-(difenil)-szilil-timidint és hozzáadunk 3 mmol metil-hidrazint vízmentes körülmények között szobahőmérsékleten. A kapott oldatot 12 órán át keverjük, majd lehűtjük 0°-ra, szűrjük, a kiváló csapadékot kétszer 10-10 ml CH2Cl2-ral mossuk, a szűrleteket egyesítjük és betöményítjük. A visszamaradó anyagot flash-kromatográfiával tisztítjuk (20 g szilikagél, CH2Cl2/MeOH=9/l), amikor is a kívánt cím szerinti vegyületet nyeqük kristályos por formájában (65%). Ή-NMR (CDC13) 8 1,0 (s, 9, C(CH3)3), 1,80 (s, 3,
CH3), 1,81 és 2,24 (2, m, 2, C2, CH2), 3,25 és 3,60 (2, m, 2, C5, CH2), 4,0 (m, 1, C3, H), 4,25 (m, 1, C4,
H), 5,4 (v, br s, NH2), 6,25 (t, 1, C„ H), 7,2 (s, 1,
C6H), 7,25-7,60 (m, 10, ArH), 8,4 (br s, 1, NH).
13. példa (3 ’-CH=N-O-CH2-5 ')- és (3 '-CH2-NH-O-CH2-5 )-kötésű oligonukleotidok előállítása
0,99 g (2 mmol) 3’-dezoxi-3’-C-formil-5’-O-tritil-timidint és 0,99 g (2 mmol) 5’-O-amino-3’-terc-butil-(difenil)-szilil-timidint elkeverünk 25 ml vízmentes CH2Cl2-ban és 1 órán át szobahőmérsékleten keveijük. Az oldószert ezután vákuumban eltávolítjuk, a visszamaradó anyagot 20 ml vízmentes THF-ban oldjuk, majd keverés közben hozzáadunk 5 ml 1 mólos tetrabutil-ammónium-fluorid THF-os oldatot. A keverést 1 órán át szobahőmérsékleten folytatjuk, majd az oldószert elpárologtatjuk, a visszamaradó gumiszerű anyagot oszlopkromatografáljuk (20 g szilikagél, CH2Cl2/MeOH=99/4 tf7tf), amikor is a kívánt dimert nyerjük hab formájában. A kapott terméket 50 ml vízmentes MeOH-ban feloldjuk és hozzáadunk 2,5 ml telített metanolos sósavoldatot. A keveréket szobahőmérsékleten 15 órán át keveijük, majd 10 ml vízmentes piridint adunk hozzá és az oldószert elpárologtatjuk. így nyeljük a nyers oximkötésű dinukleozidot. Ezt az anyagot szilikagélen kromatografáljuk (20 g, CH2Cl2/MeOH=92/8 tf/tf), amikor is 0,69, 70% oximkötésű dimert nyerünk E/Z izomerek keverékének formájában.
Ή-NMR (DMSO-de) δ 1,78 és 1,80 (2 s, 6H, 2, CH3),
2,02-2,40 (m, 4, 2C2, CH2), 3,15 (m, 1, C3, H),
3,45 és 3,65 (2 m, 2, C5, CH2), 3,95 (m, 2, 2 C4, H),
4,15-4,25 (m, 3, C3, H és C5, CH2), 5,20 (t, 1, 5,OH), 5,40 (d, 1, 3,OH), 6,05 (t, 1, Cb H), 6,18 (t,
I, C1; H), 6,85 (d, 1, Cr,H), 7,4 és 7,44 (2, s, 1,
C6H), 7,46 (d, 1, C3 H), 7,78 és 7,80 (2 s, 1, C6H) és
II, 25 (2 brs, 2, NH).
A két geometriai izomert (E/Z) fordított fázisú HPLC-vel választjuk el és különböző analitikai módszerekkel jellemezzük. Az izomer dimereket ezután 5’-Odimetoxi-tritil-származékává alakítjuk az 5’-hidroxilcsoporton és 3’-O-P-ciano-etoxi-diizopropilfoszfor-amidit-származékká a 3’-hidroxilcsoportnál, ismert eljárással. Az így derivatizált dimert 31P-NMR jellemzői DMSO-d6-ban: δ 150,4,150,7 és 150,8 ppm. A védett dimert megfelelően tárolhatjuk és alkalmazhatjuk automata DNS-szintetizátorban (ABI 380B) való kapcsoláshoz akkor és amikor szükséges egy terápiás értékű oligomerbe való beépítéséhez. Mint látható, az oximkötésű nukleoziddimereket tartalmazó oligomerek olyan oligomerré redukáhatók, amelyek hidroxil-aminkötésű nukleoziddimert tartalmaznak.
14. példa
Váltakozó (3’-CH=N-O-CH2-5)- vagy (3 ’-CH2-NH-O-CH2-5 )-kötésű oligonukleozidok előállítása A megfelelő 2’-dezoxi-nukleozidot, amely a 3’terminális nukleozid lesz, CPG-oszlophoz kötünk ABI 380B automata DNS-szintetizátorban való alkalmazáshoz. Az ismert foszfor-amidit-reakciólépéseket alkalmazzuk a (3’-CH=N-O-CH2-5’)- vagy (3’-CH2-NH-O-CH2-5’)-kötéseket tartalmazó dimerek megfelelő helybe és megfelelő szekvenciába való elhelyezéséhez.
15. példa
Egyforma (3’-CH~N-O-CH2~5’)- vagy (3 ’-CH2-NH-O-CH2-5 ’) kötéseket tartalmazó oligonukleozidok előállítása ABI 380B DNSszintetizátor alkalmazásával 3 nukleozid alegység felhasználásához alegység: CPG-kötött5’-O-ftálimido-timidin(előállítása: Nucleic Acids Research, 18:3813 (1990), ezt az oligonukleozidszintézisnél 3’-terminális egységként alkalmazzuk.
alegység: bifunkcionális 3’-C-formil és 5’-0-ftálimido-dezoxiribonukleozid, amelyet standard glükozilálással nyerünk metil-3-dezoxi-3-C-ciano-5-0-(ftalimido)-p-D-eritro-pentofuranozidból, egy megfelelő bázisból, majd a nukleozid termék DIBAL-H redukciójával.
alegység: 5’-O-DMT-3’-C-formil-timidin, amelyet az utolsó nukleozid beépítéséhez alkalmazunk, az oligonukleozid 5’-vége.
Az egyforma kötések kialakításához szükséges ciklus automata lépései (10 pmólos méretben: az 1. egység bevitele a CPG-re) a következő:
Lépés Reagens/oldószer Idő/perc
1. 5%-os metil-hidrazin DCM-ben 10
2. DCM:MeOH 9:1 tf/tf 5
3. DCM mosás 2
4. 3’-C-formil-5’-O-ftalimido-dezoxi-ribonukleozid (2 egység, 20 μτηοΐ 20 ml DCM-ben) 3
5. DCM: Aceton 9:1 tf/tf: zárás 2
6. DCM mosás 3
HU 221 806 Β1
A fenti 1-6. lépéseket ismételjük minden nukleozidegység beadagolásakor függően a kívánt szekvenciától és hosszúságtól. Ezután adagoljuk az utolsó egységet:
NaCNBH3 redukciós lépés a (3'-CH=N-O-CH2-5) (3 ’-CH2-NH-O-CH2-5 j-kötéssé való átalakításához dimer kötésben vagy egy oligonukleozidkötésben
16. példa
Dimer redukciója
0,49 g (1 mmol) dimert feloldunk 5 ml jégecetben, majd hozzáadunk 1 ml ecetsavban oldott 0,19 g (3 mmol) nátrium-ciano-bór-hidridet. A szuszpenziót 1 órán át keverjük, majd további 1 ml ecetsavas NaBH3CN-t adagolunk és a keverést még 1 órán át folytatjuk. A feleslegben lévő AcOH-ot eltávolítjuk csökkentett nyomáson és szobahőmérsékleten, a visszamaradó anyagot toluollal (2 χ 50 ml) együttesen bepároljuk, majd 25 g szilikagélen tisztítjuk (CH2C12: MeOH=9:1 tfrtf), a megfelelő frakciókat egyesítjük, majd ismételten bepároljuk, így 0,36 g (75%) szilárd dimert nyerünk.
17. példa
Oligonukleozid redukciója pmol mennyiségű CPG-kötött oligonukleozidot veszünk le a szintetizátorról az előállítási ciklusok befejezése után, amely egy vagy több vázon módosított kötést tartalmaz. 1 mól NaBHjCN-oldatot (THF/AcOH = l/l, 10 ml) a CPG-kötött anyagon keresztül szivattyúzunk ismert módon injekcióstűs technika alkalmazásával 30 percen át. Az oszlopot 50 ml THF-nal átmossuk, majd a redukált oligonukleozidot felszabadítjuk az oszlopról ismert módon.
18. példa
Egy oligonukleozid redukciója más módon
A fentitől eltérő módon a redukciót a CPG-hordozóról való eltávolítás után is elvégezhetjük. Ha az előállítást befejeztük, az oligonukleozidot eltávolítjuk a CPGhordozóról ismert eljárással. Az 5’-O-tritil-on-oligonukleozidot HPLC-vel tisztítjuk, majd a fentiekben leírtak szerint NaBH3CN/AcOH/THF eljárással redukáljuk.
19. példa (3 ’-CH2-O-N-CH-5 j- és (3 '-CH2-O-NH-CH2-5 j-kötésű oligonukleozidok előállítása 3’-C-Formil-5’-O-tritil-timidint redukálunk feleslegben alkalmazott NaBH4-gyel, amikor is 3’-hidroximetil-timint nyerünk, amelyet ezután trifenil-foszfmnal N-hidroxi-ftálimiddel és diizopropil-azo-dikarboxiláttal THF-ban kezelve nyerjük a 3’-ftálimido-metilanalógot, amelyeket metil-hidrazinnal kezelve nyerjük A 3’-hidroxi-metil-(O-amino)-5’-O-tritil-timidint összesen 64%-os kihozatallal.
l-(4-C-Formil-3-O-terc-butil-(difenil)-szilil-2-dezoxi-P-D-eritro-pentofuranozil)-timidint állítunk elő ismert módon (Nucleosides and Nucleotides, 9:533). Ezt a nukleozidot ezután 3’-hidroxi-metil-(O-amino)-5’-Otritil-timidinnel kapcsoljuk DCM-ben a fentiekben leírtak szerint, amikor is az oximot nyeljük, amit azután NaCNBH3-mal redukálunk. Az így kapott dimert megfelelően védjük, majd aktiváljuk mint az 5’-O-DMT és 3’-O-foszfor-amid-származékokat és alkalmazzuk standard DNS-szintetizátorhoz az oligonukleozidok kívánt helyre való beépítéséhez.
20. példa (3 ’-CH2-P(O)2-O-CH2-5 j- és (3 ’-CH2-O-P(O)2-CH2-5 j-kötésű oligonukleozidok előállítása
A. 3 ’-C-Foszfonát-dimer előállítása
A 3 ’-hidroxi-metil-5 ’-(O-terc-butil-(difenil)-szililtimidint bromidjává alakítjuk NBS-sel való kezelés után, majd a bromidot Arbuzov-reakciónak vetjük alá, így nyeljük a foszfonát-diésztert. Ezt trimetil-bróm-szilánnal hasítjuk, amikor is a szabad savat nyeljük, amelyet 3’-(O-terc-butil-(difenil)-szilil)-timidinnel és DCCvel kezelve piridinben nyeljük a cím szerinti dimert.
B. 3 ’-C-Foszfonát-kötésű oligonukleozidok előállítása
A fentiek szerint nyert dimert egy oligonukleozidba építhetjük be megfelelően védve és aktiválva a dimert mint 5’-O-DMT és 3’-O-foszfor-amid-származékot, amelyet standard DNS-eljárással az oligonukelozid kívánt helyére építünk be.
C. 5 ’-C-Foszfonát-kötésű oligonukleozidok előállítása
A megfelelő 5’-C-foszfonát-dimereket úgy állítjuk elő, hogy az 5’-dezoxi-5’-bróm-nukleozidot egy foszfit-észterrel reagáltatjuk, így nyeljük az 5-foszfonátot, ezt ezután a 3’-hidroxi-metil-nukleoziddal reagáltatva nyeljük az 5’-C-foszfonát-kötésű dimert.
21. példa
A (III) általános képletnek megfelelő szerkezetű (13) vegyidet előállítása - a képletben REI jelentése 0-(dímetoxi-tritil)-csoport, RE2 jelentése O-(2ciano-etil-N,N,N',N’-tetraizopropil-foszfordiamidilj-csoport és RE3jelentése H
A. A (IV) általános képletnek megfelelő szerkezetű (2) vegyület előállítása, amely képletben RE1 jelentése O-(terc-butil-difenil-szilil)-csoport, RE2 jelentése 0-(p-toluol-tio-formil)-csoport és RE3 jelentései!
11,45 g (23,82 χ 103 mól) (1) vegyületet (IV képletnek megfelelő szerkezet, ahol RE1=O-terc-butil-difenil-szilil, RE2=OH-csoport, RE3=H) argonatmoszférában feloldunk CH2Cl2-ban, majd hozzáadunk 2,41 (23,82xl0-3 mól) g NEt3-at, 2,911 g (23,82x10-3 mól) DMAP-t (4-N,N-dimetil-amino-piridin) és 4,446 g (23,82 χ ΙΟ-3 mól) p-toluol-tio-klór-hangyasavésztert. A keveréket szobahőmérsékleten 20 órán át keverjük, majd 50 ml CH2Cl2-ral hígítjuk, kétszer 5050 ml vizes NaH2PO4-oldattal, majd kétszer 50-50 ml
HU 221 806 Β1 sóoldattal mossuk, majd Na2SO4 felett szárítjuk. Ezután az oldószert elpárologtatjuk, a visszamaradó anyagot szilikagélen kromatografáljuk (hexán/AcOEt=4/l). A kapott (2) vegyületet halványságra, szilárd anyag formájában nyeljük (13,074 g, 20,72 χ 10~3 mól, 87%). ’H-NMR (CDC13, 500 MHz, 5 (ppm), J(Hz)): 2,41 (H2., ddd, 2J=13,5, 3J2’_3>=5,9, 3J2-_r=9,3), 2,73 (H2>, dd, 3J2._r=5,0), 4,36 (H4., ddd, 3J3>_4.=0,9),
5,94 (H3., dd), 6,51 (Hr, dd), 7,58 (H6, q, *J=1,0) MS(FD: m/e): 631 (M)+
B. (3) vegyület, (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol Rei jelentése O-(terc-butil-difenil-szilil), RE2 jelentése allilcsoport és RE3jelentése H g (7,926 xl0~3 mól) (2) vegyületet feloldunk 79 ml (0,1 mól) gázmentesített benzolban (a gáztalanítást argongázzal végezzük 30 percig), majd hozzáadunk 13,12 g (39,63 x 10 3 mól) allil-tri-n-butil-ont és 0,65 g (3,963 χ 10-3 mól) AIBN-t (azo-bisz(izobutironitril)) és a kapott keveréket visszafolyatás közben melegítjük. 4 óra elteltével további 0,26 g (1,58 xl0~3 mól) AIBN-t adagolunk. 20 óra elteltével analitikai vékonyréteg-kromatográfiával (szilikagélen, hexán/AcOEt= 1/1) kiindulási anyag már nem mutatható ki. Az oldószert ezután csökkentett nyomáson eltávolítjuk, a visszamaradó anyagot szilikagélen kromatografáljuk (hexán/AcOEt gradiens 6/1 -> 2/1). így nyerjük a (3) vegyületet fehér, szilárd anyag formájában, mennyisége 3,12 g (6,18 χ 10-3 mól, 78%).
’H-NMR (CDClj, 500 MHz, δ (ppm), J(Hz)):
2,15-2,19 (2H2., m), 2,46 (H3·, m), 5,70 (CH=CH2, m), 6,11 (Hr, dd 3Jr_2-=5,l és 6,1),
7,51 (H6, q, 4J= 1,1)
MS(FD, m/e): 505 (M)+
C. (4) vegyület, (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol RE1 jelentése O-(terc-butil-difenil-szilil), RE2 jelentése CH2C(O)H és RE3jelentése H
3,11 g (6,162 χ 103 mól) (3) olefinszármazékot feloldunk 60 ml dioxán/H2=2/l elegyben, hozzáadunk 0,157 g (0,616 χ 10 3 mól) OsO4-et, majd 25 ml vízben oldott 2,89 g (13,55 xl0~3 mól) NaIO4-et. A kapott szuszpenziót szobahőmérsékleten 4 órán át keverjük, majd 100 ml CH2Cl2-t adagolunk hozzá. A szerves fázist kétszer 50-50 ml sóoldattal mossuk és Na2SO4 felett szárítjuk, majd az oldószert elpárologtatjuk, a visszamaradó anyagot szilikagélen kromatografáljuk (hexán/AcOEt=l/l). így nyerjük a (4) vegyületet halványsárga szilárd anyag formájában, mennyisége 1,561 g (3,08xl0-3 mól, 50%).
’H-NMR (CDCI3, 500 MHz, δ (ppm), J(Hz)): 2,07 (H2., ddd, 2j=i4,9, 3J2._r=7,9), 2,39 (H2·, ddd, 3J2._r=4,9, 3J2._3-=8,3), 2,84 (Hr, m), 3,72 (H4., ddd 3J3,_4.=7,5), 6,14 (Hr, dd), 9,72 (CHO, dd)
D. (5) vegyület (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol RE1 jelentése O-(terc-butil-difenil-szilil), RE2 jelentése CH2C(O)OCH3 és RE3 jelentése H
2,23 g (4,401 χ IO-3 mól (4) aldehidvegyületet feloldunk 20 ml DMF-ban, majd hozzáadunk 0,846 g (26,4xl0-3 mól) MeOH-ot és 10,137 g (26,4xl0~3 mól) PDC-t (piridinium-dikromát), majd a kapott sötétbarna színű oldatot szobahőmérsékleten 20 órán át keverjük, majd 60 ml CH2Cl2-ral hígítjuk, kétszer 5050 ml NaH2PO4-oldattal, majd kétszer 50-50 ml sóoldattal mossuk. Na2SO4 felett szárítjuk, az oldószert elpárologtatjuk és a visszamaradó anyagot szilikagélen kromatografáljuk (hexán/AcOEt=2/l). így 1,531 g (2,869x10-3 mól, 65%) (5) vegyületet nyerünk fehér szilárd anyag formájában.
’H-NMR (CDCI3, 500 MHz, δ (ppm), J(Hz)): 2,17 (H2., ddd, 2J=14,3, 3J2._r=7,0, 3J2'_3’=7,2), 2,33 (H2·, ddd, 3J2._r=5,0, 3J2-_3.=8,3), 2,82 (Hy, m),
3,68 (COOMe, s), 61,5 (Hr, dd)
E. (6) vegyület (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol Rei jelentése O-(terc-butil-difenil-szilil), RE2 jelentése CH2C(O)OH és RE3jelentése H
7,197 g (13,4 χ IO-3 mól) (5) észterszármazékot feloldunk 50 ml THF/H2O=1/1 keverékben, majd hozzáadunk 26,8 ml (26,81 χ 10-3 mól) 0,1 n NaOH-ot. A keveréket ezután 18 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd további 13,4 ml 13,4 xlO'3 0,1 n NaOH-ot adagolunk és a keverést 2 órán át még folytatjuk. A keveréket ezután 1 n sósavval semlegesítjük, kétszer 5050 ml CH2Cl2-ral extraháljuk, a szerves fázist kétszer 50-50 ml sóoldattal mossuk és Na2SO4 felett szárítjuk. Ezután az oldószert eltávolítjuk, így nyeljük a (6) vegyületet fehér szilárd anyag formájában, mennyisége 6,38 g 916,03 χ 10~3 mól, 91%).
’H-NMR (CDClj, 500 MHz, δ (ppm), J(Hz)): 6,14 (Hr, dd).
F. 5’-Azido-2’,5’-didezoxi-timidin (7) (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol REI jelentése azido, RE2 jelentése hidroxil és RE3 jelentése H
A cím szerinti vegyület előállítását T. Lin és W. Prusoff szerint végezzük [T. Lin, W. Prusoff, J. Med. Chem., 21,109 (1978)] a kereskedelmi forgalomban beszerezhető pirimidin-timidin (Aldrich Chemical Co. Milwaukee, WI) alkalmazásával.
G. (8) vegyület (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol Rej jelentése azido, RE2 jelentése O-(terc-butil-fenil-szilil) és RE3 jelentése H g (11,22x10-3 mól) (7) vegyületet feloldunk 20 ml DMF-ban, argonatmoszférában hozzáadunk 1,3 g (19,08xl0-3 mól) imidazolt és 4,627 g (16,83xl0-3 mól) terc-butil-difenil-klór-szilánt. A keveréket 48 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd a DMF-t csökkentett nyomáson elpárologtatjuk, a visszamaradó anyagot 60 ml CH2Cl2-ban és 60 ml vizes NaH2PO4-oldatban oldjuk. A szerves fázist 50 ml vizes NaH2PO4-oldattal és 50 ml sóoldattal mossuk, Na2SO4 felett szárítjuk. Ezután az oldószert elpárologtatjuk, a visszamaradó anyagot szilikagélen kromatografáljuk (CHCl3/MeOH=20/l), amikor is 5,39 g (10,66x10-3 moi, 95%) cím szerinti vegyületet nyerünk halványsárga olaj formájában.
’H-NMR (CDC13, 500 MHz, δ (ppm), J(Hz)): 1,95 (H2., ddd), 2,36 (H2., ddd), 6,38 (HP, dd).
H. (9) vegyület (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol Rei jelentése amino, RE2 jelentése O-(terc-butil-fenil-szilil) és RE3 jelentése H
7,3 g (14,43x10-3 mól) (8) vegyületet feloldunk 144 ml (0,1 mól) gáztalanított benzolban (a
HU 221 806 Β1 gáztalanítást 30 percig argongázzal való öblítéssel végeztük), hozzáadunk 0,237 g (1,44 χ 10-3 mól) AIBN-t és 9,244 g (31,76 x 10~3 mól) N-tributil-ón-hidridet és a kapott oldatot 80°-on 15 órán át melegítjük. Ezután további 0,237 g (1,44 x 10-3 mól) AIBN-t adagolunk és a melegítést még 5 órán át folytatjuk. Ezután az oldószert elpárologtatjuk, a visszamaradó anyagot szilikagélen kromatografáljuk (hexán/AcOEt= 1/2), így 406 g (9,6 χΙΟ 3, 85%) (9) vegyületet nyerünk halványsárga, szilárd anyag formájában.
iH-NMR (CDC13, 500 MHz, δ (ppm), J(Hz)): 1,93 (H2>, ddd, 2J=13,5, 3J2._r=6,8, 3J2._r=6,8), 2,35 (H2>, ddd, 3J2._r=6,2, 3J2._3.=4,2), 3,87 (H4>, ddd, 3J3-_4-=3,7), 4,25 (Hr, ddd), 6,31 (Hr, dd)
I. (10) vegyület (III) képletnek megfelelő szerkezet, ahol RE1 jelentése O-(terc-butil-fenil-szilil),
RE2 jelentése O-(terc-butil-fenil-szilil) és RE3 jelentései!
0,468 g (0,869 x lO 3 mól) (6) vegyületet feloldunk ml MeCN-ben, majd a kapott színtelen oldathoz 0,099 g (0,906x10-3 mól) N-metil-morfolint, 0,06 g (0,448xlO 3 mól) N-hidroxi-benztriazolt, 0,317 g (0,986 xlO-3 mól) O-(lH-N-hidroxi-benztriazol-l-il)Ν,Ν,Ν’,Ν’-tetrametil-uronium-tetrafluor-borátot adagolunk és a kapott keveréket 30 percen át szobahőmérsékleten keveijük. Ezután 0,43 g (0,896 χ 10 3 mól) (9) vegyületet feloldunk 5 ml MeCN-ben és 0,136 g (1,344xlO 3 mól) N-metil-morfolinnal együtt hozzáadagoljuk. A keveréket szobahőmérsékleten 20 órán át hagyjuk, majd az acetonitrilt csökkentett nyomáson elpárologtatjuk, a visszamaradó anyagot 60 ml CH2C12ban és 30 ml NaH2PO4-oldatban oldjuk, a szerves fázist kétszer 30-30 ml NaH2PO4-oldattal és kétszer 30-30 ml sóoldattal mossuk, majd Na2SO4 felett szárítjuk és az oldószert elpárologtatjuk. A visszamaradó anyagot szilikagélen kromatografáljuk (hexán/AcOAt=l/l), így 0,692 g (0,703 x IO-3 mól, 79%) (10) vegyületet nyerünk halványsárga szilárd anyag formájában. iH-NMR (CDC13, 500 MHz, δ (ppm), J(Hz)): 5,79 (Hr, dd, 3Jr^=7,0), 6,20 (Hr, dd, 3J,>_2’=6,4), 6,95 (He, q, 4J=l,0), 7,27 (H6, q, 4J=l,0)
MS (El, m/e): 984 (M)+
J. (11) vegyület, (111) képletnek megfelelő szerkezet, ahol RE1 jelentése hidroxil, RE2 hidroxil és RE3jelentése H
0,68 g (0,69xlO 3 mól) (10) vegyületet feloldunk ml THF-ban argonatmoszférában, majd hozzáadunk 0,124 g (2,07 x IO-3 mól) ecetsavat és 1,88 ml 1,1 mólos tetrahidrofurános tetra-N-butil-alumínium-fluoridot (2,07 x 10~3 mól), majd a keveréket szobahőmérsékleten 20 órán át tartjuk. A keveréket ezután háromszor toluollal együtt elpárologtatjuk csökkentett nyomáson, a visszamaradó anyagot szilikagélen kromatografáljuk (AcOEt/MeOH=20/l), így 0,295 g (0,58 xl0~3 mól, 84%) (11) vegyületet nyerünk fehér, szilárd anyag formájában.
’H-NMR (CDClj, 500 MHz, δ (ppm), J(Hz)): 5,95 (Hr, dd, 3Jr_2.=6,2, 3Ji’_2’=4,0), 6,22 (Hr, dd, 3Jr_2.=6,2,3Jr-2.=7,9), 7,47 (H5, q, H=0,8), 7,85 (H6>, q, 4J=0,8)
K. (12) vegyület, (III) képletnek megfelelő szerkezet, ahol RE1 jelentése O-(dimetoxi-tritil), RE2 hidroxil és RE3 jelentése H
0,29 g (0,57 xl0~3 mól) (11) vegyületet feloldunk 10 ml piridinben argonatmoszférában, majd hozzáadunk 0,194 g (0,571 x 10-3 mól) DMTCl-vegyületet (4,4’-dimetoxi-trifenil-metil-klorid), majd a kapott keveréket 18 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd további 0,097 g (0,285 χ 10 3 mól) DMTCl-vegyületet adagolunk. A keverékhez ezután 1 ml MeOH-ot adagolunk, majd 40 óra elteltével 50 ml CH2Cl2-ral és 50 ml vizes Na2CO3-oldattal hígítjuk. A szerves fázist kétszer 30-30 ml sóoldattal mossuk és Na2SO4 felett szárítjuk. Az oldószert háromszor toluollal együtt elpárologtatjuk csökkentett nyomáson, majd a visszamaradó anyagot szilikagélen kromatografáljuk (AcOEt/MeOH gradiens 50/1 -> 10/1, +1% N-metil-morfolin). Ily módon 0,426 g (0,526xl0-3 mól, 92%) (12) vegyületet nyerünk halványsárga szilárd anyag formájában. iH-NMR (CDC13, 500 MHz, δ (ppm), J(Hz)): 1,44 (Me, d), 1,88 (Me, d), 3,80 (2xOMe, s), 7,66 (H6,q)
L. (13) vegyület, (III) képletnek megfelelő szerkezet, ahol Rei jelentése O-(dimetoxi-tritil), RE2 O-(2ciano-etil-N,N,N’,N'-tetraizopropil-foszfordiamidil) és RE3 jelentése H
0,413 g (0,52xl0-3 mól) (12) vegyületet argonatmoszférában 20 ml CH2Cl2-ban oldott 0,172 g (0,572xl0-3 mól) 2-ciano-etil-N,N,N’,N’-tetraizopropil-foszfor-diamidithoz és 0,107 g (0,624xl0“3 mól) Ν,Ν’-diizopropil-ammónium-tetrazolidhoz adagolunk. A keveréket 16 órán át szobahőmérsékleten hagyjuk, majd további 0,172 g (0,572xlO-3 mól) 2-ciano-etilΝ,Ν,Ν’,Ν’-tetraizopropil-foszfor-diamiditot adagolunk. A keveréket szobahőmérsékleten 24 órán át hagyjuk állni, majd hozzáadunk 20 ml vizes NaHCO3-oldatot, a szerves fázist kétszer 20-20 ml sóoldattal mossuk és Na2SO4 felett szárítjuk. Ezután az oldószert elpárologtatjuk, a visszamaradó anyagot szilikagélen kromatografáljuk (toluol/AcOEt= 1/1 + 1% N-metil-morfolin), így 0,299 g (0,296xl0-3 mól, 57%) (13) vegyületet nyerünk fehér szilárd anyag formájában.
31P-NMR (CDC13, 101 MHz, δ (ppm)): 148,89 és
149,31.
22. példa (17) vegyület, (IV) általános képletnek megfelelő szerkezet, ahol RE1 jelentése O-(terc-butil-difenilszilil), RE2jelentése C(O)OH és RE3jelentése H
A. (14) vegyület, (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol RE1 jelentése O-(terc-butil-difenil-szilil), RE2jelentése sztiril és RE3 jelentése H 3,558 g (5,569 χ ΙΟ3 mól) (2) vegyületet (lásd 21A.
példa) feloldunk 19 ml (0,3 mól) gáztalanított benzolban (a gáztalanítást 30 percig argonatmoszférában végeztük), majd hozzáadunk 0,183 g (1,113 χ 10-3 mól) AIBN-t és 21,9 g (55,69 xl0~3 mól) l-fenil-2-n-tributil-ón-etilént és a kapott oldatot 80°-ra melegítjük. Ezután 10 óránként 0,183 g (1,113x10-3 mól) AIBN-t adagolunk részletekben annyiszor, amíg az összmennyi15
HU 221 806 Β1 ség 0,915 g (5,566x10-3 mól) lesz. Ha már kiindulási anyag vékonyréteg-kromatográfiával (szilikagél/hexán=l/l) nem mutatható ki, az oldószert elpárologtatjuk és a maradékot szilikagélen kromatografáljuk (gradiens hexán/EcOAt, 10/1 -» 4/1). Ily módon 2,367 g (4,177xl0-3 mól, 75%) (14) vegyületet nyerünk fehér szilárd anyag formájában.
’H-NMR (CDC13, 500 MHz, δ (ppm), J(Hz)): 2,34 (Hr, ddd, 2J=14,0, 3J2._r=3,0, 312Ή.=8,2), 2,46 (H2., ddd, 3J2._r=7,l, 3J2,_3,=10,2), 3,28 (Hr, m),
3,88 (H4., ddd, 3J3,_4-=9,l), 6,21 (Hr, dd), 7,58 (H6, q, 4J=l,0)
B. (15) vegyület, (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol RE1jelentése O-(terc-butil-difenil-szilil), RE2jelentése formil és RE3jelentése H
2,193 g (3,869x10-3 mól) (14) vegyületet feloldunk 30 ml dioxán/H2O=21/l elegyben, majd hozzáadunk 0,098 g (0,386 x 10“3 mol) OsO4-et, majd 8 ml vízben oldott 1,82 g (8,512 χ 10~3 mol) NaIO4-et. A kapott szuszpenziót 3 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd háromszor 50-50 ml CH2Cl2-ral extraháljuk. A szerves fázist kétszer 30-30 ml sóoldattal mossuk, majd Na2SO4 felett szárítjuk. Ezután az oldószert elpárologtatjuk, a visszamaradó anyagot szilikagélen kromatografáljuk (hexán/AcOEt=l/l). így 1,334 g (2,708 χ 10-3 moi) (15) aldehidet nyerünk fehér szilárd anyag formájában.
Ή-NMR (CDC13, 250 MHz, δ (ppm), J(Hz)): 2,26 (H2., ddd, 2j=i5,3, 3J2._,.=6,1, 3J2,_3,=9,4), 2,77 (H2>, ddd, 3J2_,.=3j2,_3,=6,2), 3,36 (H3’,m), 6x10 (Hp, dd).
C. (16) vegyület, (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol REl jelentése O-(terc-butil-difenil-szilil), RE2 jelentése C(O)OCH} és RE3jelentése H
1,091 g (2,214 χ 10-3 mol) (15) aldehidet feloldunk 10 ml DMF-ban, hozzáadunk 0,425 g (13,287x10-3 mol) MeOH-ot és 4,998 g (13,287x10-3 mol) PDC-t (piridinium-dikromát). A kapott sötétbarna színű oldatot 20 órán át szobahőmérsékleten keveqük, majd 50 ml CH2Cl2-ral hígítjuk és kétszer 50-50 ml NaH2PO4-oldattal és kétszer 50-50 ml sóoldattal mossuk, majd Na2SO4 felett szárítjuk és az oldószert elpárologtatjuk. A visszamaradt anyagot szilikagélen kromatografáljuk (hexán/AcOEt=l/l), így 0,661 g (1,264x10-3 mol, 57o/o) (16) vegyületet nyerünk fehér szilárd anyag formájában.
•H-NMR (CDC13, 500 MHz, δ (ppm), J(Hz)): 2,28 (H2., ddd, 2J=14,5, 3J2._r=5,6, 3J2,_3.=9,1), 2,76 (H2., ddd, 3j2, ,,=3^,^,=6,9), 3,42 (H3., ddd), 4,28 (H4., ddd, 3J3,_4,=7,0), 6,21 (Hr, dd)
D. (17) vegyület, (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol REI jelentése O-(terc-butil-difenil-szilil), RE2 jelentése C(0)0H és RE3 jelentése H
2,2 g (4,209 χ 10-3 mol) (16) észterszármazékot feloldunk 50 ml THF/H2O=1/1 keverékben, majd hozzáadunk 126,3 ml (12,627x10-3 moi) oj n NaOH-ot. A keveréket szobahőmérsékleten 16 órán át kevexjük, majd 1 n sósavval semlegesítjük és kétszer 50-50 ml CH2Cl2-ral extraháljuk. A szerves fázist kétszer 5050 ml sóoldattal mossuk és Na2SO4 felett szárítjuk. Ezután az oldószert eltávolítjuk, így 2,015 g (3,985 χ 10~3 mol, 94%) (17) vegyületet nyerünk fehér, szilárd anyag formájában.
•H-NMR (CDC13, 250 MHz, δ (ppm), J(Hz)) 6,22 (Hr, dd)
23. példa (26) vegyület, (V) általános képletnek megfelelő szerkezet, ahol REI jelentése O-(dimetoxi-tritil), RE2 jelentése O-(2-ciano-etil-N,N,N’,N’-tetraizopropilfoszfor-diamidil) és RE3 jelentése H
A. (18) vegyület, (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol RE1 jelentése O-(terc-butil-difenil-szilil), RE2 jelentése hidroxi-etil és RE3 jelentése H
5,23 g (10,5 χ 10-3 moi) (4) vegyületet (lásd 21C. példa) feloldunk 60 ml MeOH-ban, hozzáadunk 0°-on kis részletekben 1,192 g (31,51 χ 10~3 mol) NaBH4-ot, majd amikor a hidrogénképződés megszűnik, a keveréket szobahőmérsékleten 2 órán át keveijük. Ezután 20 ml vizes NaH2PO4-ot adagolunk óvatosan, majd az MeOH-ot eltávolítjuk és a visszamaradó anyagot kétszer 50-50 ml CH2Cl2-ral extraháljuk. A szerves fázist 50 ml sóoldattal mossuk, Na2SO4 felett szárítjuk, az oldószert elpárologtatjuk és a maradékot szilikagélen kromatografáljuk (hexán/AcOAt=l/l). így 5,01 g (9,84χ ΙΟ-3 mol) (18) vegyületet nyerünk fehér szilárd anyag formájában.
•H-NMR (CDClj, 500 MHz, δ (ppm), J(Hz)): 2,15 (H2., ddd 2J=13,5, 3J2._r=7,0, 3j2,_3,=9,0), 2,27 (H2., ddd, 3J2,_r=4,0, 3J2,_3.=8,0), 2,49 (Hr, m),
3,77 (H4., ddd), 6,11 (Hr, dd).
B. (19) vegyület, (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol REI jelentése O-(terc-butil-difenil-szilil), RE2 jelentése etoxi-p-toluilszulfonil és RE3 jelentése H
0,334 g (0,656x10-3 mol) (18) vegyületet feloldunk 15 ml CDCl3-ban argonatmoszférában, majd hozzáadunk 0,241 g (1,969x10-3 moi) DMAP-t, 0,208 g (2,626x10-3 mol) piridint és 0,375 g (1,969x10-3 mol) tozil-kloridot egymást követően. A keveréket 24 órán át szobahőmérsékleten keverjük, majd hozzáadunk további 0,12 g (0,984x10-3 mol) DMAP-t, 0,102 g (1,313x10-3 mol) piridint és 0,187 g (0,984x10-3 mol) tozil-kloridot. A keveréket 60 ml CH2Cl2-ral hígítjuk, majd 40 óra elteltével kétszer 5050 ml vizes NaH2PO4-oldattal és kétszer 50-50 ml sóoldattal mossuk. A szerves fázist Na2SO4 felett szárítjuk, majd az oldószert elpárologtatjuk, a maradékot szilikagélen kromatografáljuk (hexán/AcOEt=2/l). így 0,369 g (0,556x10-3 mol, 84%) (19) vegyületet nyerünk halványsárga szilárd anyag formájában.
•H-NMR (CDC13, 250 MHz, δ (ppm), J(Hz)): 2,44 (pMe-pH-SO3-, s).
C. (20) vegyület, (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol RE1 jelentése O-(terc-butil-difenil-szilil), RE2 jelentése azido-etil és RE3 jelentése H
0,365 g (0,55 χ ΙΟ-3 mol) (19) vegyületet feloldunk 10 ml DMF-ban vízmentes argonatmoszférában, majd hozzáadunk 0,135 g (2,75x10-3 mol) LiN3-at és 0,165 g (1,1 χ ΙΟ-3 mol) NaI-t. A kapott keveréket
HU 221 806 Β1
100°-on 17 órán át melegítjük, majd szobahőmérsékletre lehűtjük, 100 ml étert, majd 50 ml sóoldatot adagolunk, a szerves fázist kétszer 50-50 ml sóoldattal mossuk, majd Na2SO4 felett szárítjuk. Ezután az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk, a maradékot szilikagélen kromatografáljuk (hexán/AcOEt=3/l). így 0,259 g (0,485 x 10~3 mól, 88%) (20) vegyületet nyerünk halványsárga olaj formájában.
Ή-NMR (CDC13, 500 MHz, δ (ppm), J(Hz)): 2,13 (H2., ddd, 2J=13,5, 3j =8,7, 3J2, ,,=7,0), 2,26 (H2,, ddd, 3J2._3.=7,9, 3J2,_r=4,0), 2,47 (Hr, m),
3,73 (H4,, ddd, 3J4,_3,=8,0), 6,11 (H,., dd).
D. (21) vegyület, (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol REI jelentése O-(terc-butil-difenil-szilil), RE2 jelentése amino-etil és RE3jelentése H
0,255 g (0,477 x 10-3 mól) (20) azidszármazékot feloldunk 0,1 mól, 5 ml gáztalanított benzolban (a gáztalanítást argonárammal 30 percig végezzük), majd hozzáadunk 0,008 g (0,047 xlO 3 mól) AIBN-t és 0,347 g (1,19 x 10~3 mól) n-tributil-ón-hidridet szobahőmérsékleten. A keveréket ezután 80°-on 5 órán át keverjük, majd az oldószert csökkentett nyomáson elpárologtatjuk, a visszamaradó anyagot szilikagélen kromatografáljuk (gradiens CHCl3/MeOH, 50/1 -> 10/1). így 0,23 g (0,452 x 10-3 mól, 95%) (21) vegyületet nyerünk halványsárga olaj formájában.
Ή-NMR (CDC13, 500 MHz, δ (ppm), J(Hz)): 2,12 (H2,, ddd, 3J2’_r=6,9), 2,24 (H2., ddd, 3J2-_r=4,0),
2,38 (H3>, m), 3,74 (H4,, ddd, 3J3._4,=8,0), 6,09 (Hr, dd)
MS(FD, m/e): 508 (M)+.
E. (22) vegyület, (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol RE] jelentése C(O)OH, RE2jelentése O(terc-butil-difenil-szilil) és RE3 jelentése H
A (22) vegyületet a következő irodalmi helyen ismertetett módon állítjuk elő: Tetrahedron Letters, 30(37): 4969-4972 (1989).
F. (23) vegyület, (V) képletnek megfelelő szerkezet, ahol REI jelentése O-(terc-butil-difenil-szilil), RE2 jelentése O-(terc-butil-difenil-szilil) és RE3 jelentése H
2,205 g (4,459 χ 103 mól) (22) vegyületet feloldunk 80 ml MeCN-ben és 10 ml THF-ban. A kapott oldathoz 0,496 g (4,905 χ 10~3 mól) N-metil-morfolint, 0,301 g (2,229xl0-3 mól) N-hidroxi-benztriazolt és 1,575 g (4,9xl0-3 mól) O-(lH-N-hidroxi-benzotirazol-l-il)N, N,Ν’, N’-tetrametil-uronium-tetra-fluor-borátot adagolunk. A keveréket ezután 30 percen át szobahőmérsékleten keverjük. 2,264 g (4,45 χ 10 3 mól) (21) vegyületet feloldunk 20 ml MeCN-ben és 0,676 g (6,688 xlO-3 mól) N-metil-morfolinnal együtt hozzáadagoljuk. Szobahőmérsékleten 20 órán tartjuk, majd az oldószert csökkentett nyomáson elpárologtatjuk, a maradékot feloldjuk 100 ml CH2Cl2-ban és 50 ml NaH2PO4-oldatban. A szerves fázist kétszer 50-50 ml NaH2PO4-oldattal és kétszer 50-50 ml sóoldattal mossuk, majd Na2SO4 felett szárítjuk. Az oldószert ezután eltávolítjuk, a visszamaradó anyagot szilikagélen kromatografáljuk (hexán/AcOEt=l/2), így 4,11 g (4,175x10-3 mól, 93%) (23) vegyületet nyerünk fehér szilárd anyag formájában.
Ή-NMR (CDClj, 500 MHz, δ (ppm), J(Hz)): 2,34 (H2., ddd, 2J=14,3, 3J2._3-=4,3, 3J2._,.=9,9), 4,01 (H5., m), 4,28 (H4., s), 4,55 (H3>, d), 6,07 (Hr, dd, 3Jr_2.=6,5,3Jr_2.=3,8), 6,17 (Hr, dd, 3J,,_2,=5,0) MS(CI, m/e): 984 M+.
G. (24) vegyület, (V) képletnek megfelelő szerkezet, ahol RE1 jelentése hidroxil, RE2 jelentése hidroxil és RE3 jelentése H
1,292 g (1,312χ10-3 mól) (23) vegyületet feloldunk 30 ml THF-ban argonatmoszférában, majd hozzáadunk 0,236 g (3,937 χ 10 3 mól) ecetsavat és 3,58 ml 1,1 mólos (3,937xl0-3 mól) tetrahidrofurános tetra-n-butil-ammónium-fluoridot. A keveréket szobahőmérsékleten 24 óráig állni hagyjuk, majd háromszor toluollal elpárologtatjuk csökkentett nyomáson és a visszamaradó anyagot szilikagélen kromatografáljuk (AcOEt/MeOH=20/l). így 0,647 g (1,27χ10-3 mól, 97%) (24) vegyületet nyerünk fehér szilárd anyag formájában.
Ή-NMR (CD3OD, 500 MHz, δ (ppm), J(Hz)): 4,25 (H4., d, 3J4._3.=1,9), 6,05 (Hr, dd, 3Jr_2.=2,l, 3Jr-2’=7,8), 6,21 (Hr, dd, 3Jr_2.=5,9,3J,,_2,=8,4),
7,88 (H6, q), 8,03 (H6,q).
H. (25) (V) képletnek megfelelő szerkezet, ahol REI jelentése O-(dimetoxi-tritil), RE2 jelentése hidroxil és RE3 jelentése H
0,64 g (1,261 χ 10-3 mól) (24) vegyületet argonatmoszférában feloldunk 10 ml piridinben, majd hozzáadunk 0,428 g (1,263 χ 10“3 mól) DMTCl-et (4,4’-dimetoxi-trifenil-metil-klorid), majd a reakciókeveréket 17 órán át szobahőmérsékleten keverjük és további 0,424 g (1,263 x 10~3 mól) DMTCl-t adagolunk. 40 óra után a keverékhez 1 ml MeOH-ot adagolunk, 60 ml CH2Cl2-ral és 50 ml vizes Na2CO3-mal hígítjuk. A szerves fázist kétszer 30-30 ml sóoldattal mossuk, majd Na2SO4-on szárítjuk, az oldószert háromszor toluollal együtt csökkentett nyomáson elpárologtatjuk és a maradékot szilikagélen kromatografáljuk (AcOEt/MeOH, gradiens 50/1 10/1 + 1% N-metil-morfolin). így
0,902 g (1,11 χ 10-3 mól, 88%) (25) vegyületet nyerünk fehér szilárd por formájában.
Ή-NMR (CD3OD, 500 MHz, δ (ppm), J(Hz)): 4,23 (H4., d, 3J4._3.=1,8), 6,06 (Hr, dd, 3J,._2.=2,4, 3Ji’-2’=7,5), 6,19 (Hr, dd, 3J,._2.=5,9,3Jr_2.=9,0) MS(CI: m/e): 809(M+).
I. (26) vegyület, (V) képletnek megfelelő szerkezet, ahol RE1 jelentése O-(dimetoxi-tritil), RE2 jelentése O-(2-ciano-etil-N,N,N ’,N ’-tetraizopropil-foszfordiamidil) és RE3 jelentése H
0,89 g (1,121x10-3 mól) (25) vegyületet elkeverünk 30 ml CH2Cl2-ban oldott 0,371 g (1,233xlO 3 mól) 2-ciano-etil-N,N,N ’ ,N ’-tetraizopropil-foszfordiamidittal és 0,23 g (1,345 χ 10~3 mól) N,N’-diizopropil-ammónium-tetrazoliddal. A kapott keveréket szobahőmérsékleten 18 órán át reagáltatjuk, majd további 0,371 g (1,233x10-3 mol) 2-ciano-etil-N,N,N’,N’-tetraizopropil-foszfor-diamiditot adagolunk. 24 órán át szobahőmérsékleten hagyjuk a keveréket állni, majd hozzáadunk 20 ml vizes NaHCO3-oldatot, a szerves fázist kétszer 30-30 ml sóoldattal mossuk és Na2SO4 felett szárítjuk. Az oldószert elpárologtatjuk, a visszama17
HU 221 806 Β1 radó anyagot szilikagélen kromatografáljuk (hexán/AcOEt=1/2+1% N-metil-morfolin). Ily módon 0,624 g (0,614 xlO-3 mól, 55%) (26) vegyületet nyerünk halványsárga szilárd anyag formájában.
3’P-NMR (CDC13, 101 MHz, δ (ppm)): 148,17 és
150,57.
24. példa (3) vegyület, (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol REI jelentése O-(terc-butil-difenil-szilil), RE2 jelentése amino-metil és RE3 jelentése H
A. (27) vegyület, (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol RE1 jelentése O-(terc-butil-difenil-szilil), RE2jelentése hidroxi-metil és RE3jelentése H 0,759 g (1,541 x 103 mól) 22A-B. példa szerint előállított aldehidet feloldunk 6 ml MeOH-ban argonatmoszférában, majd lehűtjük 0°-ra és 0,291 g (7,708 x 10~3 mól) NaBH4-ot adagolunk hozzá. A keveréket 30 percig ezen a hőmérsékleten, majd 25°-on 20 órán át keverjük, majd hozzáadunk 30 ml vizes NaH2PO4-oldatot, az MeOH-ot csökkentett nyomáson elpárologtatjuk és a vizes fázist háromszor 30-30 ml CH2Cl2-ral extraháljuk. A szerves fázist kétszer 2020 ml sóoldattal mossuk Na2SO4 felett szárítjuk, majd az oldószert elpárologtatjuk és a visszamaradó anyagot szilikagélen kromatografáljuk (hexán/AcOEt= 1/2). Ily módon nyerjük a (27) vegyületet fehér szilárd anyag formájában, mennyisége 0,381 g (0,77 x 10~3 mól, 50%). Ή-NMR (CDClj, 500 MHz, δ (ppm), J(Hz)): 2,14 (H2., ddd, 2J=14,0, 3J2._r=5,2, 3J2._3>=8,8), 2,29 (H2., ddd, 3J2._r=6,8, 3J2-_3-=5,9), 2,60 (H3·, m), 3,94 (H4., ddd), 6,13 (Hr, dd)
MS(FD, m/e): 495 (M+)
B. (28) vegyület, (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol RE1 jelentése O-(terc-butil-difenil-szilil), RE2 jelentése metoxi-p-toluolszulfonil és RE3jelentése H 0,397 g (0,802xlO3 mól) (27) vegyületet feloldunk 15 ml CHCl3-ban argonatmoszférában, majd a kapott oldatot lehűtjük 0°-ra és hozzáadunk 0,254 g (3,21 xlO 3 mól) piridint, 0,294 g (2,407xl0~3 mól) DMAP-t és 0,459 g (2,407x10 3 mól) tozil-kloridot. 10 percig 0 °C-on, majd szobahőmérsékleten keverjük a kapott keveréket, majd vékonyréteg-kromatográfiával (hexán/AcOEt=l/l) kimutatjuk, hogy kiindulási anyag már nincs jelen. Ekkor további 0,306 g (1,6xlO-3 mól) tozil-kloridot, 0,127 g (1,605 xl0~3 mól) piridint és 0,196 g (91,6 χ 10~3 mól) DMAP-t adagolunk. A keveréket 40 órán át reagáltatjuk, majd 50 ml CHCl3-mal hígítjuk, kétszer 40-40 ml vizes NaH2PO4-oldattal, majd kétszer 40-40 ml NaHCO3-oldattal, végül kétszer 40-40 ml sóoldattal mossuk és Na2SO4 felett szárítjuk. Ezután az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk, a visszamaradó anyagot szilikagélen kromatografáljuk (hexán/AcOEt=2/l), így 0,429 g (0,661 χ 10 3 mól, 82%) (28) vegyületet nyerünk színtelen szilárd anyag formájában.
Ή-NMR (CDClj, 500 MHz, δ (ppm), J(Hz)): 2,14 (H2., ddd, 2J=14,8, 3J2-_!’=5,6, 3J2._3.=9,0), 2,22 (H2., ddd, 3J2-_r=6,8, 3J2-_3-=6,8), 2,84 (Hr, m), 3,85 (H4., ddd, 3J3>_4,=7,0), 6,05 (H,·, dd)
MS (FD, m/e): 649 (M+)
C. (29) vegyület, (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol RE1 jelentése O-(terc-butil-difenil-szilil), RE2 jelentése azido-metil és RE3 jelentése H 0,425 g (0,655 xl0~3 mól) (28) tozilszármazékot feloldunk 15 ml DMF-ban argonatmoszférában, majd hozzáadunk 0,16 g (3,275 xl0~3 mól) LiN3-at és 0,196 g (1,35 χ10~3 mól) NaI-t szobahőmérsékleten. A kapott keveréket 20 órán át 100 °C hőmérsékleten keverjük, majd vékonyréteg-kromatográfiát végzünk (hexán/AcOEt=l/3) és amikor a reakció befejeződik 100 ml étert adagolunk a keverékhez. Az oldatot ezután háromszor 50-50 ml sóoldattal mossuk és Na2SO4 felett szárítjuk. Szűrés után a visszamaradó anyagot szilikagélen kromatografáljuk (hexán/AcOEt=2/1), így 0,262 g (0,504xl0-3 mól, 77%) (29) azidszármazékot nyerünk színtelen, üvegszerű anyag formájában.
Ή-NMR (CDC13, 500 MHz, δ (ppm), J(Hz)): 2,18 (H2·, ddd, 2J=14,3, 3J2._y=8,9, 3J2,_1.=5,5), 2,28 (H2·, ddd, 3J2._3.=3j2, ,,=6,5), 2,67 (Hr, m), 3,37 (CH2-NH3, d, 3J=6,3), 7,46 (H6, q, J=1,0)
MS(FD, m/e): 520 (M+)
D. (30) vegyület, (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol RE1 jelentése O-(terc-butil-difenil-szilil), RE2 jelentése amino-metil és RE3 jelentése H 0,245 g (0,471 x 10“3 mól) (29) azidszámazékot feloldunk gáztalanított benzolban (0,1 mól, a gáztalanítást 30 percig argonatmoszférában végezzük), majd hozzáadunk 0,008 g (0,047xl0-3 mól) AIBN-t és 0,343 g (1,78χ10-3 mól) nBu3SnH-t (n-tributil-ón-hidrid) szobahőmérsékleten, majd a kapott keveréket 80°-on 7 órán át melegítjük. Ezután vékonyréteg-kromatográfiát végzünk (hexán/AcOEt=l/l), ami kimutatja, hogy kiindulási anyag már nincs jelen a keverékben. Ekkor 0,08 g (0,0471 χ ΙΟ-3 mól) AIBN-t adagolunk és a keveréket további 17 órán át 80°-on melegítjük. Ezután az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk, a visszamaradó halványsárga színű olajos anyagot szilikagélen kromatografáljuk (flash-kromatográfia, gradiens AcOEt/MeOH=50/l -+ 20/1 -+ 10/1 + 1% NEt3). Ily módon 0,196 g (0,397xlO-3 mól, 87%) (30) aminvegyületet nyerünk.
Ή-NMR (CDC13, 500 MHz, δ (ppm), J(Hz)): 2,28 (2H2., m), 2,58 (H3·, m), 2,70 (C3-CH2-NH2, dd, 2J=12,2, 3J = 8,0), 2,82 (C3.-CH2-NH2, dd, 3J=5,4), 6,11 (Hr, dd, 3J=5,9), 7,54 (H6, q, H=l,l)
NS (FD, m/e): 494 (M+)
25. példa (42) vegyület, (VI) képletnek megfelelő szerkezet, ahol Rei jelentése O-(dimetoxi-tritil), RE2 jelentése O-(2-ciano-etil-N,N,N’,N’-tetraizopropil-foszfordiamidil) és RE3 jelentése H
A. (31) vegyület, (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol RE1 jelentése hidroxil, RE2 jelentése O(terc-butil-difenil-szilil) és RE3 jelentése H A cím szerinti (31) vegyületet a következő irodalmi helyen leírtak szerint állítjuk elő: Tetrahedron Letters, 23(26): 2641-2644(1982).
HU 221 806 Β1
B. (32) vegyület, (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol RE1 jelentése hidroxil, RE2 jelentése O(terc-butil-difenil-szilil) és RE3jelentése CH2OCH2Ph
3,53 g (7,4 mmol) (31) vegyületet feloldunk 15 ml vízmentes acetonitrilben és szobahőmérsékleten argonatmoszférában hozzáadunk 2,2 ml (14,8 mmol) DBU-t, majd 2 g (12,8 mmol) benzil-klór-metil-étert. A reakciót 4 órán át szobahőmérsékleten hagyjuk végbemenni, majd hozzáadunk 150 ml CH2Cl2-t és a szerves fázist két részletben kétszer 25-25 ml 2%-os KHSO4-oldattal, 70 ml vízzel és 50 ml sóoldattal mossuk. A szerves fázist Na2SO4 felett szárítjuk, csökkentett nyomáson betöményítjük, a visszamaradó anyagot szilikagélen kromatografáljuk (gradiens hexán/AcOEt), amikor is 3,21 g (53%) cím szerinti (32) timidinvegyületet nyerünk fehér hab formájában.
Ή-NMR (CDCI3, 300 MHz) δ: 1,01 (9H, s,
3’-O’-SitBu), 1,79 (3H, s, Me-5), 4,61 (2H, s,
O-CH2-Ph), 5,40 (2H, s, -N-CH2-O).
C. (33) vegyület, (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol RE1 jelentése CH = CHC(O)OCH3, RE2 jelentése O-(terc-butil-difenil-szilil) és RE3 jelentése CH2OCH2Ph
0,65 ml (7,3 mmol) oxalil-kloridot elkeverünk 25 ml vízmentes CH2Cl2-ral és -78° argonatmoszférában hozzáadagolunk 1,05 ml (14,6 mmol) vízmentes DMSO-t 5 ml CH2Cl2-ban. Az adagolást 5 percen át végezzük, majd a kapott keveréket 1 órán át -78°-on keveijük és hozzáadunk 25 ml CH2Cl2-ban oldott 2,91 g (4,84 mmol) (32) vegyületet 10 perc alatt. A reakciót órán át -78°-on végezzük, majd 4,1 ml (29,2 mmol) vízmentes trietil-amint adagolunk és hagyjuk a keveréket 0°-ra felmelegedni. Ekkor 2,45 g (7,2 mmol) metoxi-karbonil-metilén-trifenil-foszforánt adagolunk szilárd formában és a keveréket szobahőmérsékleten órán át keverjük. Ezután 200 ml CH2Cl2-t, majd 50 ml vizet adagolunk és a kapott keveréket 10 percig kevetjük, majd a rétegeket elválasztjuk. A szerves fázist kétszer 50-50 ml vízzel és 50 ml sóoldattal mossuk, a szerves fázist Na2SO4 felett szárítjuk és csökkentett nyomáson betöményítjük. A visszamaradó anyagot szilikagélen kromatografáljuk (hexán/etil-acetát=4/l), amikor is (33) α,β-telítetlen metil-észtert nyerünk, mennyisége 2,95 g, 93%.
Ή-NMR (CDC13, 300 MHz) δ: 0,875 (9H, s, 3’OSitBu), 5,66 (1H, dd, J= 16 Hz, J= 1,5 Hz, H-6’),
6,45 (1H, dd, J = 7 Hz, H-l’), 6,41 (1H, dd,
J=16Hz ésJ=6Hz).
D. (34) vegyület, (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol REI jelentése CH2CH2C(O)OCH3, RE2 jelentése O-(terc-butil-difenil-szilil) és RE3 jelentései!
2,7 g (4,1 mmol) (33) vegyületet feloldunk 85 ml MeOH-ban és erőteljes keverés közben atmoszferikus nyomású hidrogénnel szobahőmérsékleten 960 mg porított 10%-os szénhordozós palládiumkatalizátor jelenlétében 3 napon át hidrogénezzük. A keveréket ezután SiO2-ágyon átszűrjük, a szűrőlepényt kb. 100 ml MeOH-dal átmossuk, a szűrletet csökkentett nyomáson betöményítjük, amikor is 2,1 g nyers (34) vegyületet nyerünk színtelen hab formájában. Az anyagot a következő lépéshez további tisztítás nélkül alkalmazzuk. Ή-NMR (CDClj, 300 MHz) δ: 1,82 (3H, s, Me-5),
3,56 (3H, s, OMe), 6,25 (1H, dd, J=6 Hz, H-l’),
6,92 (1H, s, H-6), 8,6 (1H, széles s, N-H).
E. (35) vegyület, (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol REI jelentése CH2C(O)OH, RE2 jelentése O-(terc-butil-difenil-szilil) és RE3 jelentése H
2,1 g (3,9 mmol) nyers (34) vegyületet feloldunk 10 ml MeOH-ban szobahőmérsékleten, majd hozzáadunk 40 ml 2 mólos MeOH/H2O=7/3 eleggyel készült KOH-oldatot. 2 óra elteltével szobahőmérsékleten a keveréket Dowex 50 Wx4 (Fluka) adagolásával pH=4 értékig megsavanyítjuk, majd a szuszpenziót szűrjük, a szilárd anyagot 150 ml CH2Cl2-ral és 50 ml H2O-dal átmossuk, a rétegeket elválasztjuk, a vizes fázist CH2C12ral extraháljuk, a szerves fázisokat egyesítjük és 50 ml H2O-dal és 50 ml sóoldattal mossuk. A szerves fázist Na2SO4 felett szárítjuk és csökkentett nyomáson betöményítjük, így 1,27 g (87%) (34) savvegyületet nyerünk fehér por formájában.
Ή-NMR (CDClj, 300 MHz) δ: 1,82 (3H, s, Me-5),
3,9 (1H, m, H-4’), 6,25 (1H, s, H-l’), 6,95 (1H, s,
H-6).
F. (36) vegyület, (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol REI jelentése (O-tritil), RE2 jelentése azido és R E3 jelentése H
A (36) vegyületet a következő irodalmi helyen leírtak szerint állítjuk elő: Lin. T. és W. Prusoff, J. Med. Chem. 21, 109 (1978).
G. (37) vegyület, (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol RE1 jelentése O-(tritil), RE2 jelentése amino és RE3 jelentése H
10,5 g (0,02 mól) (36) azidvegyületet feloldunk 100 ml dioxánban, majd hozzáadunk 0,5 g 10%-os szénhordozós palládiumkatalizátort és a keveréket atmoszferikus nyomáson hidrogénezzük. Az anyagot 16 óra után szüljük, a szűrletet csökkentett nyomáson betöményítjük, így nyeljük a nyersamint, amelyet CH2Cl2/Et2O elegyből átkristályosítjuk. így 7 g (37) aminoszármazékot nyerünk.
Ή-NMR (DMSO-d6): 1,50 (s, 3H, CH3), 6,15 (m,
1H, H(l’)), 7,50 (s, 1H, H(6)).
H. (38) vegyület, (VI) képletnek megfelelő szerkezet, ahol RE1 jelentése O-(tritil), RE2 jelentése O(terc-butil-difenil-szilil) és RE3 jelentése H
313 mg (0,6 mmol) (35) vegyületet elkeverünk 289 mg (0,6 mmol) (37) aminvegyülettel 5 ml vízmentes CH2Cl2-ban argonatmoszférában szobahőmérsékleten és hozzáadunk 144 mg, 0,7 mmol, N,N’-diciklohexil-karbodiimidet és 30 mg, 0,25 mmol DMAP-t. A reakciót 12 órán át szobahőmérsékleten végezzük, majd hozzáadunk 100 ml CH2Cl2-t és átmossuk 20 ml 0,1 n sósavval háromszor 20-20 ml vízzel és kétszer 20-20 ml sóoldattal. A szerves fázist Na2SO4 felett szárítjuk, majd csökkentett nyomáson betöményítjük, így 0,95 g olajos anyagot nyerünk, amelyet szilikagélen kromatografálunk (kloroform/metanol=98/2), így nyerjük a (38) dimert, mennyisége 0,46 g (78%), fehér por.
HU 221 806 Β1 iH-NMR (CDClj, 300 MHz) δ: 1,32 és 1,80 (3H, s,
Me-5), 5,96 és 6,25 (1H, dd, J=6 Hz, H-l’), 6,52 (1H, d, J=6 Hz, N-H (lánc)), 6,9 és 7,5 (1H, s,
H-6), 9,18 és 9,37 (1H, s széles, N3-H).
I. (39) vegyület, (VI) képletnek megfelelő szerkezet, ahol Rej jelentése hidroxil, RE2jelentése O-(tercbutil-difenil-szilil) és RE3jelentése H
I. 01 g (1,02 mmol) (38) vegyületet feloldunk 1,6 ml ecetsav és 0,4 ml víz elegyében és 80°-on 1 óra 30 percen át melegítjük, majd az oldószert csökkentett nyomáson elpárologtatjuk, a visszamaradó anyagot szilikagélen kromatografáljuk (CH2Cl2/MeOH/Et3N=95/4/l), amikor is 591 mg, 78% (39) vegyületet nyerünk fehér hab formájában.
iH-NMR (CDClj, 300 MHz) δ: 1,76 és 1,82 (3H, s,
Me-5), 6,02 és 6,10 (1H, dd, J=6 Hz, H-l’), 6,9 és 7,6 (1H, Is, H-6), 7,05 (1H, d széles, NH (lánc)), 9,82 és 9,92 (1H, s széles, N3-H).
J. (40) vegyület, (VI) képletnek megfelelő szerkezet, ahol RE1 jelentése O-(dimetoxi-tritil), RE2 jelentése O-(terc-butil-difenil-szilil) és RE3 jelentése H
860 mg (1,15 mmol) (39) vegyületet feloldunk 20 ml CH2Cl2-ban szobahőmérsékleten és argonatmoszférában hozzáadunk 210 mg (1,7 mmol) DMAP-t és 0,5 ml (3,5 mmol) Et3N-t, majd 575 mg (1,7 mmol) dimetoxi-tritil-kloridot, a keveréket szobahőmérsékleten 12 órán át keverjük, majd 300 mg (8,8 mmol) dimetoxi-tritil-kloridot adagolunk még. A reakciót szobahőmérsékleten 24 órán át végezzük, majd hozzáadunk kb. 100 ml CH2Cl2-t és sóoldattal átmossuk. A szerves fázist Na2SO4 felett szárítjuk, csökkentett nyomáson betöményítjük, a visszamaradó olajos anyagot szilikagélen kromatografáljuk (CH2Cl2/MeOH/Et3N=94/5/l), amikor is 575 mg, 48% (40) vegyületet nyerünk.
•H-NMR (CDClj, 300 MHz) δ: 1,46 és 1,92 (3H, s,
Me-5), 3,88 (6H, s, OMe), 6,13 és 6,4 (1H, s,
H-l’), 7,07 (1H, s, H6), 9,5 és 9,6 (1H, s széles 1
N3-H).
K. (41) vegyület, (VI) képletnek megfelelő szerkezet, ahol RE1jelentése O-(dimetoxi-tritil), RE2 jelentése hidroxil és RE3jelentése H
405 mg (0,39 mmol) (40) vegyületet feloldunk 3 ml THF-ban szobahőmérsékleten és hozzáadunk 141 mg (0,5 mmol) tetra-n-butil-ammónium-fluoridot egy adagban szilárd anyag formájában. A reakciót szobahőmérsékleten 3 órán át végezzük, az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk és a visszamaradó anyagot kromatográfiásan szilikagélen tisztítjuk (CH2Cl2/Et3N/metanol=93/l/6), amikor is 310 mg, 100% (41) vegyületet nyerünk fehér hab formájában.
iH-NMR (CDClj, 300 MHz) δ: 1,21 és 1,73 (3H, s,
Me-5), 3,64 (6H, s, OMe), 6,00 és 6,22 (3H, dd,
J=6 Hz, H-l’), 7,25 és 7,55 (1H, s, H-6).
L. (42) vegyület, (VI) képletnek megfelelő szerkezet, ahol REj jelentése O-(dimetoxi-tritil), RE2jelentése O-(2-ciano-etil-N,N,N ’,N ’-tetraizopropil-foszforamidil) és RE3 jelentése H
310 mg (0,39 mmol) (41) vegyületet feloldunk 5 ml vízmentes CH2Cl2-ban, amely 55 mg (0,32 mmol) diizopropil-ammónium-tetrazolidot tartalmaz és keverés közben argonatmoszférában és szobahőmérsékleten hozzáadunk 0,180 ml (0,6 mmol) 2-ciano-etil-N,N,N’,N’tetraizopropil-foszfor-diamiditet. A reakciót 13 órán át szobahőmérsékleten végezzük, majd a keveréket 100 ml CH2Cl2-ral hígítjuk, 5%-os vizes NaHCO3-oldattal vízzel és sóoldattal mossuk, Na2SO4 felett szárítjuk és az oldószert csökkentett nyomáson elpárologtatjuk. A visszamaradó nyersolajat szilikagélen kromatografáljuk (CH2Cl2/n-metil-morfolin/metanol=98/l/l), amikor is 285 mg (74%) (42) vegyületet nyerünk, amelyet háromszor 150 ml vízmentes benzollal együtt elpárologtatunk, így fehér habot nyerünk.
31P-NMR (CDCI3, 100 MHz) δ: 148,658 és
148,070 ppm.
26. példa (48) vegyület, (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol RE1 jelentése C(O)OH, RE2 jelentése O-(tercbutil-difenil-szilil) és RE3 jelentése H
A. (43) vegyület, (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol RE1 jelentése amino-metil, RE2jelentése hidroxil és RE3jelentése H
A (43) vegyületet a következő irodalmi helyen leírtak szerint állítjuk elő: Chem. Comm. 422 (1968).
B. (44) vegyület, (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol RE1 jelentése amino-metil, RE2jelentése O-(terc-butil-dimetil-szilil) és RE3 jelentése H l, 4 g (5,5 mmol) nyers (43) amino-alkoholt elkeverünk 10 ml vízmentes DMF-dal és 5 ml vízmentes CH2Cl2-ral és szobahőmérsékleten argonatmoszférában hozzáadunk 520 mg (7,6 mmol) imidazolt és 1,08 g (7,2 mmol) terc-butil-dimetil-klór-szilánt. A kapott keveréket 8 órán át szobahőmérsékleten keveijük, majd még 210 mg (3,1 mmol) imidazolt és 420 mg (2,8 mmol) terc-butil-dimetil-klór-szilánt adagolunk hozzá. 22 óra elteltével az oldószert nagyvákuumban (kb. 10,2 Hgmm, 45 °C) eltávolítjuk, majd a visszamaradó szilárd anyagot szilikagélen kromatografáljuk (CH2Cl2/MeOH/Et3N), amikor is 1,7 g (83%) 44 vegyületet nyerünk halványsárga hab formájában. iH-NMR (CDCI3, 300 MHz), δ: 0,00 (6H, s, 3’OSiMe2), 0,81 (9H, s, 3’-O’SitButil), 1,75 (2H, m,
H-5’), 1,97 (3H, s, Me-T), 2,15 (2H, m, H-2’),
3,40 (2H, m, H-6’), 3,74 (1H, m, H-4’), 4,05 (1H, m, H-3’), 6,07 (1H, t, J=6,5 Hz, H-l’), 7,06 (1H, s, H-6), 8,10 (1H, s, N-H).
C. (45) vegyület, (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol REi jelentése CH=CH2, RE2 jelentése O(terc-butil-difenil-szilil) és RE3 jelentése CH2OCH2Ph
2,2 ml (25 mmol) oxalil-kloridot feloldunk 45 ml vízmentes CH2Cl2-ban -78°-on argonatmoszférában és hozzáadunk 3,6 ml (50 mmol) vízmentes DMSO-ot 15 ml CH2Cl2-ban 5 perc alatt. A keveréket 1 órán át -78°-on keverjük, majd 10 g (10,64 mmol) 25A-B. példa szerint előállított (32) vegyületet adunk hozzá 50 ml CH2Cl2-ban. A reakciót -78°-on 45 percig végezzük, majd hozzáadunk 14,8 ml, (0,1 mól) vízmentes trietil-amint 5 perc alatt, majd a keveréket hagyjuk -30°ra melegedni 1 óra alatt. Az így kapott oldathoz ezután
HU 221 806 Β1
-78°-on metilén-trifenil-foszforánt adagolunk, amelyet úgy állítunk elő, hogy 1,6 n n-butil-lítiumot hexános oldatban (62,5 ml, 0,1 mól) 150 ml vízmentes tetrahidrofüránban -78°-on elkevert, 35,7 g (0,1 mól) metil-trifenil-foszfónium-bromidhoz adagolunk, majd szobahőmérsékleten 2 órán át keverjük. Az így nyert keveréket ezután hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni, itt 2 órán át keverjük, majd 100 ml vizet adunk hozzá és a keveréket csökkentett nyomáson kb. 150 ml-re betöményítjük, majd 350 ml éterrel hígítjuk. A szerves fázist vízzel és sóoldattal mossuk, majd nátrium-szulfáton szárítjuk, az oldószert elpárologtatjuk, a visszamardó olajos anyagot szilikagélen kromatografáljuk (hexán/etil-acetát=4/l), így 3,55 g (35%) (45) vegyületet nyerünk.
'H-NMR (CDC13, 300 MHz), δ: 1,02 (9H, s, 3’OSitBu), 1,80 (3H, s, Me-5), 4,62 (2H, s,
Ph-Ch2-O), 5,5 (1H, m, H-5’), 6,32 (1H, dd,
J=6,0 Hz, H-l’), 6,95 (1H, s, H-8).
D. (46) vegyület, (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol REI jelentése hidroxi-metil, RE2jelentése O-(terc-butil-dÍfenil-szilil) és RE3 jelentése CH2OCH2Ph
252 mg (0,42 mmol) (45) vegyületet feloldunk 5 ml vízmentes THF-ban és keverés közben lehűtjük 0°-ra argonatmoszférában és hozzáadunk 0,25 ml (2,5 mmol) 10 mólos borán-dimetil-szulfid-komplexet THF-ban. 2 óra elteltével 0°-on a keverékhez lassan, folyamatosan, egyidejűleg 4 ml 2 n vizes NaOH-oldatot és 1 ml 30%-os vizes H2O2-oldatot adagolunk. A keveréket hagyjuk szobahőmérsékletre melegedni 10 perc alatt, majd 50 ml CH2Cl2-ral hígítjuk, vízzel és sóoldattal mossuk, majd MgSO4-on szárítjuk, a szerves fázist csökkentett nyomáson betöményítjük, és a visszamaradó anyagot szilikagélen kromatografáljuk (hexán/etilacetát=2/l -> 1/1), így 186 mg (72%) (46) vegyületet nyerünk színtelen olaj formájában.
‘H-NMR (CDC13, 300 MHz), δ: 1,01 (9H, s, 3OSitBu), 1,80 (3H, s, Me-5), 3,51 (2H, m,
CH2-6’), 5,41 (2H, s, O-CH2-N), 627 (1H, dd,
J=6 Hz, H-l ’), 6,87 (1H, s, H-6).
E. (47) vegyület, (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol RE1 jelentése hidroxi-metil, RE2 jelentése O-(terc-butil-difenil-szilil) és RE3 jelentése H
1,03 g (1,67 mmol) (46) vegyületet feloldunk 37 ml MeOH-ban és erőteljes keverés közben atmoszferikus nyomáson szobahőmérsékleten 520 mg porított, 10%os szénhordozós palládiumkatalizátor jelenlétében 3 napon át hidrogénezzük. A keveréket ezután szilikagélen átszűrjük, a szilárd anyagot 100 ml MeOH-dal mossuk, a szűrlethez kb. 200 mg, 3,5 mmol KOH-ot adagolunk és az oldatot szobahőmérsékleten 1 órán át keverjük. Az oldatot ezután csökkentett nyomáson betöményítjük kb. 20 ml-re, majd felhígítjuk 100 ml CH2Cl2-ral és a szerves fázist H2O-dal és sóoldattal mossuk, MgSO4 felett szárítjuk, az oldószert csökkentett nyomáson eltávolítjuk és így 742 mg (90%) (47) vegyületet nyerünk. A kapott anyagot további tisztítás nélkül alkalmazzuk. ‘H-NMR (CDClj, 300 MHz), δ: 0,94 (9H, s, 3’OSitBu), 1,73 (s, 3H, Me-5), 3,45 (2H, m,
CH2-6’), 6,17 (1H, dd, J=6,5 Hz, H-l’), 6,85 (1H, s, H-6).
F. (48) vegyület, (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol REj jelentése C(O)OH, RE2jelentése O(terc-butil-difenil-szilil) és RE3 jelentése H 710 mg (1,5 mmol) (47) vegyületet feloldunk 50 ml vízmentes DMF-ban és szobahőmérsékleten erőteljes keverés közben argonatmoszférában hozzáadunk 1,5 g (4 mmol) piridinium-dikromátot (PDC). 14 óra elteltével barna színű oldatot kapunk, ehhez 35 ml EtOAc-t adagolunk, 5 percig keverjük, majd a szuszpenziót szilikagélen szűrjük és a szilárd anyagot 75 ml EtOAc-vel átmossuk. Az oldószert eltávolítjuk és a visszamaradó anyagot szilikagélen kromatografáljuk (etil-acetát/metanol=95/5), így nyerjük a cím szerinti sawegyületet. ‘H-NMR (CDCI3, 300 MHz), δ: 1,09 (9H, s, 3’-OSitBu), 1,83 (3H, s, Me-5), 2,38 (2H, m, CH2-5’),
6,32 (1H, dd, J=6,5 Hz, H-l’), 7,23 (1H, s, H-6).
27. példa (50) vegyület, (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol REj jelentése CH2C(O)CH3, RE2jelentése O(terc-butil-difenil-szilil) és RE3 jelentése CH2OCH2Ph
A. (49) vegyület, (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol REI jelentése CH=(l,3-ditián-2-il) RE2 jelentése O-(terc-butil-difenil-szilil) és RE3jelentése CH2OCH2Ph
2.2 ml (25 mmol) oxalil-kloridot feloldunk 45 ml vízmentes CH2Cl2-ban és -78°-on argonatmoszférában hozzáadunk 3,6 ml (50 mmol) vízmentes DMSO-t 15 ml CH2Cl2-ban 5 perc leforgása alatt. A keveréket ezután 1 órán át -78°-on keverjük, majd 10 g (10,64 mmol) (32) vegyületet adagolunk hozzá 50 ml CH2Cl2-ban oldva 20 perc alatt. A reakciót 45 percig -78°-on végezzük, majd 14,8 ml (0,1 mmol) vízmentes trietil-amint adagolunk 5 perc alatt, a keveréket hagyjuk -30°-ra melegedni 1 óra alatt. Ez utóbbi oldathoz -78°on foszfónium-ilidet adagolunk, amelyet úgy állítunk elő, hogy 0,5 n kálium-bisz(trimetil-szilil)-amidot tokióiban (85 ml, 42,2 mmol) elkeverünk 135 ml vízmentes THF-ban -78°-on szuszpendált 16 g, 38,4 ml 1,3ditián-2-il-trifenil-foszfónium-kloriddal, majd a kapott anyagot szobahőmérsékleten 3 órán át keverjük. Az előzőek szerint kapott keveréket hagyjuk ezután szobahőmérsékletre melegedni, majd 2 órán át keverjük, ekkor hozzáadunk 300 ml CH2Cl2-t és 100 ml vizet, majd a keveréket 10 percig keverjük és a rétegeket elválasztjuk. A vizes fázist 200 ml CH2Cl2-ral extraháljuk, a szerves fázisokat egyesítjük, sóoldattal mossuk, MgSO4-on szárítjuk, majd csökkentett nyomáson betöményítjük. A maradékot szilikagélen kromatografáljuk (hexán/EtOAc), amikor is 10,1 g (87%) (49) vegyületet nyerünk.
MS (FD, m/e): 701 (M+).
B. (50) vegyület, (IV) képletnek megfelelő szerkezet, ahol Reí jelentése CH2C(O)CH3 RE2jelentése O-(terc-butil-difenil-szilil) és RE3jelentése CH2OCH2Ph
1.3 g (1,8 mmol) (49) vegyületet feloldunk 50 ml MeOH/H2O=9/l elegyben és visszafolyatás közben ar21
HU 221 806 Β1 gonatmoszférában hozzáadunk 2,9 g (10,7 mmol) higany-kloridot 40 perc elteltével a keveréket szobahőmérsékletre hűtjük, a sót leszűijük, az anyagot csökkentett nyomáson betöményítjük és a visszamaradó anyagot 100 ml CH2Cl2-ral hígítjuk. A szerves fázist kétszer 30-30 ml vízzel, majd sóoldattal mossuk, MgSO4 felett szárítjuk, az oldószert elpárologtatjuk és a visszamaradó anyagot szilikagélen kromatografáljuk (hexán/etilacetát=7/3), így nyeljük a cím szerinti (5) vegyületet. »H-NMR (CDC13, 300 MHz), δ: 1,02 (9H, s, 3’OSitBu), 1,80 (3H, s, Me-5), 2,28 (2H, m, CH2-5’), 3,52 (3H, s, MeO), 5,41 (2H, s, O-CH2-N), 6,29 (1H, dd, J=6,5 Hz, H-l’), 7,03 (1H, H-6).
Kiértékelés
1. eljárás - Hibridizációs analízis
Egy találmány szerinti oligonukleotid, egy oligonukleotidanalóg vagy egy oligonukleozid relatív képességét, hogy egy komplementer nukleinsavhoz kötődni képes jellemezhetjük az adott hibridizációs komplex olvadási értékének meghatározásához. Az olvadási hőmérsékleten (Tm) egy jellemző fizikai tulajdonsága a komplementer nukleinsavaknak, jelzi °C-ban azt a hőmérsékletet, amelynél 50% kettős hélix per lánc forma (nem hibridizált) van jelen. A Tm értékét UV-spektrum segítségével határozzuk meg, amelynél megállapítható a hibridizáció kialakulása és összeomlása (olvadás). Az alap felhalmozódást, amely a hibridizáció alatt bekövetkezik, az UV-abszorpció csökkenése kíséri (hipokromicitás). Következésképpen az UV-abszorpcióban bekövetkező csökkenés nagyobb Tm-értéket jelez. Minél nagyobb a Tm-érték, annál nagyobb az alak kötődési szilárdsága. A nem Watson-Crick-bázispárok erős destabilizáló hatásúak a Tm-re. Következésképpen a bázispárosodás abszolút pontossága szükséges egy antiszenz oligonukleotid vagy oligonukleozid optimális kötődéséhez a cél-RNS-éhez.
A. Az oligonukleotidanalógok hibridizációs termodinamikájának kiértékelése A találmány szerinti kiválasztott oligonukleotidanalógok azon képességét, hogy a komplementer RNSvagy DMS-szekvenciákhoz hibridizálódni képesek, termikus olvadási analízissel határoztuk meg. Az RNSkomplementert T7 RNS-polimerázból és a DNS templátpromoterből nyertük, amelyet Applied Biosystems Inc. 38OB nukleinsavszintetizátorral szintetizáltunk. Az RNS-t ioncserével tisztítottuk FPLC (LKB Pharmacia Inc.) alkalmazásával. Az antiszenz oligonukleotidanalógokat vagy az RNS-hez vagy a DNS-komplementhez adagoltuk sztöchiometrikus koncentrációban és vizsgáltuk az abszorpciós hiperkromicitást (260 nm) a duplexnek rendezetlen láncba való átalakulás hatására Gilford Response II spektrofotométer alkalamzásával. Ezeket a méréseket 10 mmólos Nafoszfátban végeztük pH=7,4, 0,4 mmol EDTA és NaCl jelenlétében úgy, hogy az ionerősség vagy 0,1 mól vagy 1 mól volt. A kapott adatokat grafikusan ábrázoltuk 1/Tm vs ln[Ct] összefüggés szerint, ahol a [Ct] jelentése az össz-oligonukleotidkoncentráció.
A termodinamikai jellemzőket ezen analízis alapján határozzuk meg. A kapott információk alapján, ami a kialakult duplex heteroduplexének stabilitására vonatkozik, becsülhető, hogy a módosított kötések bevitele az oligonukleotidba hogyan befolyásolja a helix stabilitását. A módosítások, amelyek drasztikusan megváltoztatják a hibrid stabilitását csökkentik a szabad energia (delta-G) értékét és ez alapján dönteni lehet az antiszenz oligonukleotidok hasznosságát illetően.
B. Az oligonukleotidanalógok hibridizációjának pontossága
A találmány szerinti antiszenz oligonukleotidanalógok azon képességét, hogy abszolút specificitással képesek a cél-mRNS-hez hibridizálódni, a tisztított célmRNS Northem-blot-analízisével mutatjuk ki a totális celluláris RNS jelenlétében. A cél-mRNS-t a célmRNS-hez szükséges cDNS-t tartalmazó vektorból szintetizáljuk, amely a T7 RNS polimerázpromotortól downstream helyezkedik el. A szintetizált mRNS-t elektroforetizáljuk agarózgélen és egy alkalmas hordozómembránra (nitrocellulóz) átvisszük. A hordozómembránt blokkoljuk és (32P)-jelzett oligonukleotidanalógokkal vizsgáljuk. A pontosságot ismételt foltokkal határozzuk meg, és vagy emelt hőmérsékleten, vagy csökkent ionerősségű mosópuffer alkalmazásával mossuk. Autoradiográfiát végzünk a heteroduplex formációk jelenlétének megállapítására és az autoradiogramokat lézerdenzitométerrel (LKB Phramacia Inc.) értékeljük. A hibridképződés specificitását a totális celluláris RNS ismert technikával való izolálásával és analízisével végezzük, amelyhez agarózelektroforézist, membrántranszfert és jelzett oligonukleotidanalógokkal való vizsgálatot alkalmazunk. A pontosságot előre meghatározzuk egy nem módosított antiszenz oligonukleotidra és olyan körülményeket alkalmazunk, amelyeknél csak a specifikusan kiválasztott cél-mRNS képes az oligonukleotidanalóggal heteroduplex képzésére.
2. Eljárás - Nukleázrezisztencia
A. Az oligonukleotidanalógok szérummal és citoplazmikus nukleázokkal szembeni rezisztenciájának vizsgálata
A találmány szerinti oligonukleotidanalógokat a szérumnukleázokkal szembeni rezisztenciájuk megállapítására úgy vizsgálhatjuk, hogy az oligonukleotidanalógokat különböző koncentrációban magzati boqúszérumot tartalmazó közegben inkubáljuk. A jelzett oligonukleotidanalógokat különböző ideig inkubáljuk, proteáz K-val kezeljük, majd gélelektroforézissel analizáljuk (20% poliakrilamin-karbamid denaturálógél), majd ezt követően autoradiográfiát végzünk. Az autoraiogramokat lézerdenzitometriával értékeljük ki. A módosított kötések elhelyezkedése, az oligonukleotid ismert hosszúsága alapján meghatározható az adott kodifikáció hatása a nukleázdegradációra. Citoplazmikus nukleázokhoz HL 60 sejtvonalat lehet alkalmazni. Egy posztmitokondriális felülúszót készítünk differenciális centrifugálással és a jelzett oligonukleotidanalógokat ezen felülúszóban inkubáljuk különböző ideig. Az inkubálást követően vizsgáljuk az oligonukleotidanalógokat
HU 221 806 Β1 a degradáció mértékére, hasonlóan mint ahogy azt a fentiekben a szérumnukleotikus degradációknál ismertettük. Az autoradiográfíás eredményeket kiértékeltük nem módosított és a találmány szerinti oligonukleotidanalógok összehasonlítására.
B. Az oligonukleotidanalógok rezisztenciája specifikus endo- és exonukleázokkal szemben A természetes oligonukleotidok és a találmány szerinti oligonukleotidanalógok rezisztenciáját specifikus nukleázokkal szemben (azaz endonukleázok, 3’,5’exo-, és 5’,3’-exonukleázok) vizsgáltuk annak érdekében, hogy meghatározzuk a módosított kötések hatását a degradációra. Az oligonukleotidanalógokat meghatározott pufferekben, amelyek a különböző nukleázokra specifikusak, inkubáljuk, majd a termékeket proteáz Kval kezeljük, majd ezután karbamidot adagolunk és elvégezzük az analízist 20% poliakrilamidgélen, amely karbamidot tartalmaz. A géltermékeket láthatóvá tesszük Stains All reagent (Sigma Chemical Co.) anyaggal való festéssel. A degradáció mértékének meghatározásához lézerdenzitometriát alkalmazunk. Meghatároztuk a módosított kötések hatását specifikus nukleázokkal szemben és összehasonlítottuk azokat a szérummal és citoplazmás rendszerekkel kapott eredményekkel.
3. eljárás - 5 ’-lipoxigenázanalízis, gyógyszerek és vizsgálatok
A. gyógyszerek
Terápiás felhasználásra állatokat kezeltünk - amelyek feltehetően 5-lipoxigenáz abnormális feleslegben való felhalmozódásával jellemezhető betegségben szenvednek - kezeltünk a találmány szerinti oligonukleotidanalógok adagolásával. A szakterületen jártas szakember könnyen meghatározhatja az optimális dózist, az adagolás módszerét és az ismétlődés gyakoriságát. A kezelést általában vagy addig végezzük, amíg a kívánt kúrát befejezzük, vagy addig, amíg a betegség tünetei csökkennek. Bizonyos betegségeknél valószínűleg hosszú kezelés szükséges.
B. Kutatási reagensek
A találmány szerinti oligonukleotidanalógok hasznosak lehetnek mint kutatási reagensek, amelyek használhatók az 5-lipoxigenáz mRNS hasítására, vagy más módosítására nyers sejtlizátumokban vagy pedig részlegesen vagy teljesen tisztított RNS-készítményekben. Ezt a találmány szerinti alkalmazást például úgy végezzük, hogy standard módszerekkel sejteket lizálunk, optimálisan extraháljuk az RNS-t, majd kezeljük egy olyan kompozícióval, amelynek a kompozíciója például 100-500 ng/10 Mg össz-RNS, pufferban, amely például 50 mmol foszfát, a pH-értéke 4-10 közötti érték és a hőmérséklete 30-50 °C közötti érték. A hasított 5lipoxigenáz RNS-t agarózgélen elektroforézissel lehet analizálni és a hibridizációját pedig radiojelzett DNSmintával vagy más ismert módszerrel.
C. Diagnosztikumok
A találmány szerinti oligonukleotidanalógok alkalmazhatók diagnosztikai célra is, különösen egy specifikus mRNS expressziójának meghatározásához különböző szövetekben vagy abnormális vagy mutáns RNSfajták expressziójának meghatározásához. E példában az oligonukleotidanalóg egy hipotetikus abnormális mRNS-t céloz meg, amely úgy van megtervezve, hogy komplementer az abnormális szekvenciával, de nem hibridizálódna vagy nem hasítaná a normál-mRNS-t.
A szövetmintákat homogenizáljuk és az RNS-t ismert módon extraháljuk. A nyershomogenizátumot vagy -extraktumot például úgy kezeljük, hogy a célRNS-t hasítjuk. A terméket ezután szilárd hordozóhoz hibridizáljuk, amely a megkötött oligonukleotidot tartalmazza, amely komplementer a hasítási hely 5’-végén lévő szakasszal. Az mRNS-nek mind a normál-, mind az abnormál 5’ szakasza kötődne a szilárd hordozóhoz. Az abnomrál RNS 3’ szakasza, amelyet a találmány szerinti vegyület hasít, nem kötődne a hordozóhoz és ily módon a normál-mRNS-től elválasztódna.
A kiválasztott mRNS-fajták az 5-lipoxigenázra vonatkoznak, azonban a szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a találmány nem korlátozódik erre és az általánosságban is alkalmazható. Az 5 ’-lipoxigenázenzim termelődésének gátlása vagy módosítása várhatóan jelentős terápiás hatású a betegségek kezelésénél. A készítmények hatásosságának megállapítására további vizsgálatokat végeztünk.
D. In vitro vizsgálatok
Az 5-lipoxigenáz celluláris vizsgálataihoz előnyösen humán promyelocitikus leukémia HL-60 sejtvonalat alkalmazunk. Ezek a sejtek képesek akár monocitaszerű, akár neutrofilszerű sejtekké differenciálódni különböző szerek hatására. A sejteket 1,3% dimetil-szulfoxiddal DMSO-ban kezelve ismert, hogy a sejtek neutrofilekké való differenciálódását segítjük elő. Most azt találtuk, hogy az alap HL-60 sejtek nem szintetizálnak mérhető mértékben 5-lipoxigenázproteint vagy szekréciós leukotriéneket (ez az 5-lipoxigenáz downstream terméke). A sejtek DMSO-ban való differenciálódása az 5-lipoxigenázprotein és a leukotrién bioszintézisének megjelenését okozza 48 órával a DMSO adagolása után. így az 5lipoxigenázprotein szintézisének akiváltása felhasználható vizsgálórendszerként az antiszenz oligonukleotidanalógok analíziséhez, amelyek az 5-lipoxigenázszintézist gátolják ezen sejtekben.
Antiszenz oligonukleotidokhoz alkalmas egy másik vizsgálórendszernél azt a tényt hasznosítjuk, hogy az 5lipoxigenáz egy „suicide” enzim annyiban, hogy inaktiválja magát a szubsztrátummal való reagáláskor. A differenciált HL-60 vagy más 5-lipoxigenázt expresszáló sejteket 10 pmol A23187-tel, egy kalciumionoforral, kezelve elősegítjük az 5-lipoxigenáz transzlokációját a citozoltól a membránhoz, és az enzim aktivációja is bekövetkezik. Az aktivációt és több menet katalízist követően az enzim katalitikusán inaktívvá válik, így a sejtet kalciumionoforral kezelve az endogén 5-lipoxigenáz inaktiválódik. A sejteknek kb. 24 órába telik, hogy az A23187-kezelésből regenerálódjanak, mint azt a leukotrién B4 szintetizálására való képesség alapján meghatároztuk. Az 5-lipoxigenáz elleni oligonukleotidanalógok vizsgálhatók két HL-60 modellrendszerben aktivitásra a következő kvantitatív vizsgálat szerint. A vizsgálatokat az intakt sejtekben való 5-lipo23
HU 221 806 Β1 xigenázgátlás legközvetlenebb mérésétől az intakt sejtekben végbemenő több downstream eseményig, így az 5-lipoxigenázaktivitás méréséig írjuk le.
A legközvetlenebb hatás, amit az oligonukleotidanalógok az intakt sejtekre kifejthetnek és amely könnyen meghatározható, az 5-lipoxigenázproteinszintézis specifikus gátlása. Ennek kivitelezéséhez a sejteket 35S-metioninnal (50 pCi/mL) jelezzük 2 órán át 37 °C hőmérsékleten az újonnan szintetizált proteinek jelzésére. A sejteket extraháljuk, az összes celluláris protein szolubilizálására és az 5-lipoxigenázt immunoprecipitáljuk 5-lipoxigenáz-antitesttel, majd eluáljuk a protein A Sepharose gyöngyöktől. Az immunoprecipitált proteineket ezután SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel újra feloldjuk és autoradiográfiát végzünk. Az immunoprecipitált 5-lipoxigenáz mennyiségét scanning-denzitometriával határozzuk meg.
Ezen kísérletek alapján a várható eredmények a következők. A kontrollsejtekből immunoprecipitált 5-lipoxigenázprotein mennyiségét 100%-ra normalizáljuk. A sejteket 48 órán át 1 pmol, 10 pmol és 30 pmol hatásos oligonukleotidanalóggal kezelve az immunoprecipitált 5-lipoxigenáz mennyisége a kontrolihoz viszonyítva 5,25, illetve 75%-kal csökken.
Az 5-lipoxigenázenzim aktivitásának mérése a celluláris homogenizátumban szintén alkalmazható a jelen lévő enzim mennyiségének meghatározására, amely leukotriének szintetizálására képes. Kifejlesztettünk egy radiometrikus vizsgálatot az 5-lipoxigenázenzim aktivitásának mérésére a sejthomogenizátumban fordított fázisú HPLC felhasználásával. A sejteket ultrahangosán összetörjük egy pufferben, amely proteázinhibitorokat és EDTA-t tartalmaz. A sejthomogenizátumot 10 000 G mellett 30 percen át centrifugáljuk, majd a felülúszót analizáljuk 5-lipoxigenázaktivitásra. A cytosolicus proteineket 10 pmol 14C-arachidonsav, 2 mmol ATP, 50 pmol szabad kalcium, 100 pg/ml foszfatidilkolin és 50 mmol bisz-trisz puffer jelenlétében (pH=7) 5 percen át 37°-on inkubáljuk. A reakciót azonos térfogatú aceton adagolásával lezárjuk, a zsírsavakat etil-acetáttal extraháljuk. A szubsztrátumot és a reakcióterméket egymástól fordított fázisú HPLC-vel Novopak C18 oszlop (Waters Inc., Millford MA) alkalmazásával elválasztjuk. A radioaktív csúcsot Beckman típusú 171 radiokromatográfiás detektorral detektáljuk. A di-HETE és mono-HETE formába átalakult arachidonsav mennyiségét használjuk az 5-lipoxigenázaktivitás mértékének megállapítására.
A várt eredmény a DMSO-dal differenciált HL-60 sejteknél, amelyeket 72 órán át 1 pmol, 10 pmol és 30 pmol hatásos oligonukleotidanalóggal kezelünk, a következők. A kontrollsejtek 200 pmol arachidonsav/5 perc/106 sejtet oxidálnak. Az 1 pmol, 10 pmol és 30 pmol hatásos oligonukleozidanalóggal kezelt sejtek 195 pmol, 140 pmol és 60 pmol arachidonsav/5 perc/106 sejtmennyiséget oxidálnak.
Kifejlesztettünk egy kvantitatív, kompetitív enzimkapcsolásos immunoszorbens vizsgálatot (ELISA) az 5lipoxigenázprotein-mennyiség sejtekben való meghatározásához. E. coli-ban expresszált és extrakcióval tisztított humán 5-lipoxigenázt, Q-Sepharose-t, hidroxi-apatitot és fordított fázisú HPLC-t alkalmaztunk standardként és primer antigénként a mikrotiterlemezek borításához. 25 ng tisztított 5-lipoxigenázt kötöttünk a mikrotiterlemezekhez 1 éjszakán át 4 °C hőmérsékleten. A lyukakat 90 percen át 5%-os kecskeszérummal blokkoltuk, amelyet 20 mmol trisz.HCL-pufferral, pH=7,4, blokkoltunk 150 mmol NaCL (TBS) jelenlétében. A sejtextraktumokat (0,2% Triton X-100,12 000 G, 30 perc) vagy a tisztított 5-lipoxigenázt 1:4000 hígítású 5-lipoxigenáz poliklón antitesttel inkubáltuk, 90 percig az össztérfogat a mikrotiterlyukakban 100 pl volt. Az antitesteket immunizált nyulakból tisztított humán rekombináns 5-lipoxigenázzal nyertük. A lyukakat TBS-sel mostuk, amely 0,05% Tween 20 (TBST)-tartalmú volt, majd az inkubálást 100 pl 1:1000 hígítású peroxidázzal konjugált kecske-antinyúl IgG-vel (Cappel Laboratories, Melvem, PA) végeztük 60 percen át 25 °C hőmérsékleten. A lyukakat TBST-vel mostuk és a peroxidázzal jelzett második antitestmennyiséget meghatároztuk tetrametil-benzidinnel végzett kifejlesztéssel.
A vizsgálatból várható eredmény 30 mer oligonukleotidanalóg 1 pmol, 10 pmol és 30 pmol mennyiségével végzett kezelés után 30 ng, 18 ng, illetve 5 ng 5-lipoxigenáz/106 sejt, míg a kezeletlen sejtek esetében az 5lipoxigenáztartalom 34 ng.
Az 5-lipoxigenáz bioszintézisének gátlása azzal a hatással jár, hogy csökken a stimulált sejtekből felszabaduló leukotriének mennyisége. A DMSO-differenciált HL-60 sejtekből leukotrién B4 szabadul fel kalciumionofor A23187-tel végzett stimulálás hatására. A sejtközegbe felszabaduló leukotrién B4 mennyiségét radio-immunovizsgálattal lehet meghatározni kereskedelmi forgalomban beszerezhető diagnosztikai kitek (New England Nuclear, Boston, MA) felhasználásával. A leukotrién B4 termelődése kimutatható a HL-60 sejtekben 48 órával a DMSO adagolását követően, amely a sejteket neutrofilszerű sejtté differenciálja. A sejteket (2xl05 sejt/ml) növekvő koncentrációjú oligonukleotidanalógokkal kezeljük 48-72 órán át 1,3% DMSO jelenlétében. A sejteket mossuk és 2χ 106 sejt/ml koncentrációban reszuszpendáljuk Dulbecco-féle foszfáttal pufferolt sóoldatban, amely 1% dezlipidezett szarvasmarha-szérumalbumint tartalmaz. A sejteket 10 pmol kalciumionofor A23187-tel stimuláljuk 15 percig, majd meghatározzuk az LTB4 mennyiségét az 5xl05 sejtmennyiségben radio-immunovizsgálattal a gyártó előírásai szerint eljárva.
A vizsgálat alkalmazásával várhatóan a következő eredményt kapjuk a 15-mer módosított kötésű, 5-LO mRNS-re irányított antiszenz oligonukleotid (GCAAGGTCACTGAAG) alkalmazásával. A sejteket 72 órán át 1 pmol, 10 pmol vagy 30 pmol oligonukleotidanalóggal kezeljük 1,3% DMSO jelenlétében. Az 5 x 105 sejtben termelődött LTB4 mennyisége várhatóan 75 pg, 50 pg, illetve 35 pg, míg a kezeletlen differenciálódott sejtek esetében ez a mennyiség 75 pg LTB4.
E. In vivő vizsgálat
Egerek esetében az 5-lipoxigenáz termelődésének gátlását a következőképpen mutatjuk ki. Az arachidon24
HU 221 806 Β1 sav topikális alkalmazása a bőrben a leukotrién B4, leukotrién C4 és prosztaglandin E2 gyors termelődését eredményezi, amelyet ödéma és celluláris infiltráció követ. Bizonyos 5-lipoxigenázinhibitorokról ismert, hogy aktivitással rendelkeznek ezen vizsgálatnál. A vizsgálathoz 2 mg arachidonsavat alkalmazunk az egerek fülére, kontrollként a másik fül szolgál. A polimorfonukleáris sejtinfiltrátumot vizsgáljuk myeloperoxidáz-aktivitás mérésével a homogenizátumban, amelyet biopszissal veszünk 1 órával az arachidonsav adagolása után. Az ödémás választ a fül vastagságának mérésével és a biopszis tömegének mérésével határozzuk meg. A biopszismintában termelődött leukotrién B4 mennyiségének mérését a szövetben az 5-lipoxiogenázaktivitás közvetlen mérésével végezzük. Az oligonukleotidanalógokat topikálisan alkalmazzuk mindkét fülre 12-24 órával az arachidonsav adagolása előtt a vegyületek optimális aktivitásának kifejtése érdekében. Mindkét fület 24 órán át előkezeljük 0,1 pmol, 0,3 pmol vagy 1 pmol oligonukleotidanalóggal az arachidonsavval végzett kezelés után. Az értékeket átlagojuk koncentrációnként három állatra vonatkozóan. A polimorfonukleáris sejtinfiltráció gátlásának értéke 0,1 pmol, 0,3 pmol és 1 pmol esetében várhatóan 10%, 75% és 82% a kontroliaktivitásra vonatkozóan. Az ödéma gátlása várhatóan 3%, 50% és 90%, míg a leukotrién B4 termelődésének gátlása várhatóan 15%, 79%, illetve 99%.

Claims (12)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Egy oligonukleotidanalóg, amelynek legalább néhány alegysége az (I) általános képletnek megfelelő szerkezetű - a képletben
    Bx jelentése természetben előforduló purin- vagy pirimidinbázis,
    Lj-L2-L3-L4 jelentése NH-C(O)-CH2-CH2,
    NH-C(S)-CH2-CH2, CH2-CH2-NH-C(O),
    CH2-CH2-NH-C(S), CH2-C(O)-NH-CH2 vagy
    CH2-C(S)-NH-CH2-csoport, és a megmaradó alegységek természetes vagy szintetikus eredetűek.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotidanalóg, amelynek képletében Bx jelentése adenin, guanin, uracil, timin, citozin, 2-amino-adenozin vagy 5-metil-citozin.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotidanalóg, amely 4-50 említett szerkezetű alegységet tartalmaz.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotidanalóg, amelyben lényegében az összes alegység a megadott szerkezetű.
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotidanalóg, amely lényegében váltakozóan tartalmazza az adott szerkezetű alegységeket.
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotidanalóg, amely lényegében rendezetlen eloszlásban tartalmazza az adott szerkezetű alegységeket.
  7. 7. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotidanalóg, amely még gyógyászatiig elfogadható hordozóanyagot is tartalmaz.
  8. 8. Az 1. igénypont szerinti oligonukleotidanalóg, amely fokozott nukleázokkal szembeni rezisztenciával rendelkezik összehasonlítva a természetes eredetű oligonukleotidokkal.
  9. 9. Az (F) általános képletnek megfelelő vegyület amely képletben
    Bx jelentése természetben előforduló purin- vagy pirimidinbázis,
    Lj-L2-L3-L4 jelentése NH-C(O)-CH2-CH2,
    NH-C(S)-CH2-CH2, CH2-CH2-NH-C(O),
    CH2-CH2-NH-C(S), CH2-C(O)-NH-CH2 vagy
    CH2-C(S)-NH-CH2-csoport,
    RHPi és RHP2 jelentése egymástól függetlenül H vagy hidroxil-védőcsoport.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti vegyület, amelynek képletében Bx jelentése adenin, guanin, uracil, timin, citozin, 2-amino-adenozin vagy 5-metil-citozin.
  11. 11. Eljárás az (Γ) általános képletnek megfelelő vegyületek előállítására - a képletben
    Bx jelentése természetben előforduló purin- vagy pirimidinbázis,
    L!-L2-L3-L4 jelentése NH-C(O)-CH2-CH2,
    NH-C(S)-CH2-CH2, CH2-CH2-NH-C(O),
    CH2-CH2-NH-C(S), CH2-C(O)-NH-CH2 vagy
    CH2-C(S)-NH-CH2-csoport,
    RHP1 és RHP2 jelentése egymástól függetlenül H vagy hidroxil-védőcsoport -, azzal jellemezve, hogy egy (I) általános képletnek megfelelő synthon 1 vegyületet egy (2) általános képletű synthon 2 vegyülettel - a képletekben (a) RT jelentése NH2 és RB jelentése RA-CH2-CH2 (b) RT jelentése CH2-CH2-NH2 és RB jelentése RA (c) RT jelentése CH2-RA és RB jelentése NH2-CH2 ahol RA jelentése C(O)OH, C(S)OH vagy ezek aktivált származéka kapcsolunk úgy, hogy a synthon 1 és a synthon 2 vegyület egy amid- vagy tioamidkötést alkosson az RT és RB csoportokon keresztül.
  12. 12. Gyógyszerkészítmény egy protein nemkívánatos termelődésével kapcsolatos betegség kezelésére, amely valamely, 1. igénypont szerinti oligonukleotidot tartalmaz gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyaggal együtt.
HU9303289A 1991-05-21 1992-05-21 Vázon módosított oligonukleotid analógok HU221806B1 (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/703,619 US5378825A (en) 1990-07-27 1991-05-21 Backbone modified oligonucleotide analogs
PCT/US1992/004305 WO1992020823A1 (en) 1991-05-21 1992-05-21 Backbone modified oligonucleotide analogs

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9303289D0 HU9303289D0 (en) 1994-03-28
HUT66378A HUT66378A (en) 1994-11-28
HU221806B1 true HU221806B1 (hu) 2003-01-28

Family

ID=24826111

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9303290A HUT65941A (en) 1991-05-21 1992-05-21 Backbone modified oligonucleotide analogues and pharmaceutical preparations containing them
HU9303289A HU221806B1 (hu) 1991-05-21 1992-05-21 Vázon módosított oligonukleotid analógok

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9303290A HUT65941A (en) 1991-05-21 1992-05-21 Backbone modified oligonucleotide analogues and pharmaceutical preparations containing them

Country Status (14)

Country Link
US (1) US5378825A (hu)
EP (3) EP1004593A3 (hu)
JP (2) JP2625257B2 (hu)
KR (2) KR0156945B1 (hu)
AT (2) ATE191933T1 (hu)
AU (2) AU666121B2 (hu)
BR (2) BR9206027A (hu)
CA (2) CA2103464A1 (hu)
DE (2) DE69231441T2 (hu)
FI (2) FI113870B (hu)
HU (2) HUT65941A (hu)
IE (2) IE921850A1 (hu)
NO (2) NO308703B1 (hu)
WO (2) WO1992020822A1 (hu)

Families Citing this family (593)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6444798B1 (en) * 1988-06-06 2002-09-03 Steven Albert Benner Chimeras of sulfur-linked oligonucleotide analogs and DNA and RNA
US5872232A (en) * 1990-01-11 1999-02-16 Isis Pharmaceuticals Inc. 2'-O-modified oligonucleotides
US6783931B1 (en) 1990-01-11 2004-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US6399754B1 (en) * 1991-12-24 2002-06-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides
US6753423B1 (en) 1990-01-11 2004-06-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhanced biostability and altered biodistribution of oligonucleotides in mammals
US5681941A (en) * 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US6339066B1 (en) 1990-01-11 2002-01-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotides which have phosphorothioate linkages of high chiral purity and which modulate βI, βII, γ, δ, Ε, ζ and η isoforms of human protein kinase C
US7037646B1 (en) 1990-01-11 2006-05-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US6005087A (en) * 1995-06-06 1999-12-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modified oligonucleotides
US20040142899A1 (en) * 1990-01-11 2004-07-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhanced biostability and altered biodistribution of oligonucleotides in mammals
US6358931B1 (en) 1990-01-11 2002-03-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating RNA
US5859221A (en) * 1990-01-11 1999-01-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modified oligonucleotides
US5541307A (en) * 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5618704A (en) * 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5386023A (en) * 1990-07-27 1995-01-31 Isis Pharmaceuticals Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling
US5610289A (en) * 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US6121433A (en) * 1990-07-27 2000-09-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds having nitrogen-containing linkages
US5998603A (en) * 1994-09-29 1999-12-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4'-desmethyl nucleoside analogs, and oligomers thereof
US5602240A (en) * 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5623070A (en) * 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5378825A (en) * 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
PT98562B (pt) * 1990-08-03 1999-01-29 Sanofi Sa Processo para a preparacao de composicoes que compreendem sequencias de nucleo-sidos com cerca de 6 a cerca de 200 bases resistentes a nucleases
US5789573A (en) * 1990-08-14 1998-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of ICAM-1, E-selectin, and CMV IE1/IE2
EP0549686A4 (en) * 1990-09-20 1995-01-18 Gilead Sciences Inc Modified internucleoside linkages
US5965722A (en) 1991-05-21 1999-10-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of ras gene with chimeric and alternating oligonucleotides
US7015315B1 (en) 1991-12-24 2006-03-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligonucleotides
US6335434B1 (en) 1998-06-16 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc., Nucleosidic and non-nucleosidic folate conjugates
US8153602B1 (en) 1991-11-19 2012-04-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Composition and methods for the pulmonary delivery of nucleic acids
US5359044A (en) * 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
EP0635023B1 (en) * 1992-03-05 2002-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Covalently cross-linked oligonucleotides
US5543507A (en) * 1992-03-05 1996-08-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Covalently cross-linked oligonucleotides
US6537973B1 (en) 1992-03-16 2003-03-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide inhibition of protein kinase C
US6117847A (en) * 1992-03-16 2000-09-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides for enhanced modulation of protein kinase C expression
GB9207380D0 (en) * 1992-04-03 1992-05-13 Ici Plc Compounds
US5817781A (en) * 1992-06-01 1998-10-06 Gilead Sciences, Inc. Modified internucleoside linkages (II)
US5434257A (en) * 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
WO1994000467A1 (en) * 1992-06-24 1994-01-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5872242A (en) * 1992-10-05 1999-02-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide inhibition of ras
US20030013670A1 (en) * 1992-10-05 2003-01-16 Monia Brett P. Antisense oligonucleotide inhibition of ras
EP0670897A4 (en) * 1992-10-05 1997-08-06 Isis Pharmaceuticals Inc INHIBITION OF THE RAS GENE WITH COUNTERFLOWING OLIGONUCLEOTIDS.
US6784290B1 (en) 1992-10-05 2004-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide inhibition of ras
US5985558A (en) 1997-04-14 1999-11-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense oligonucleotide compositions and methods for the inibition of c-Jun and c-Fos
CA2159629A1 (en) * 1993-03-31 1994-10-13 Sanofi Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
HU9501978D0 (en) * 1993-03-31 1995-09-28 Sterling Winthorp Inc Bifunctional nucleosides, oligomers thereof, and methods of making and using the same
GB9311682D0 (en) * 1993-06-05 1993-07-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
US6605708B1 (en) * 1993-07-28 2003-08-12 Hybridon, Inc. Building blocks with carbamate internucleoside linkages and oligonucleotides derived therefrom
US6653458B1 (en) 1993-09-03 2003-11-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modified oligonucleotides
CA2170869C (en) 1993-09-03 1999-09-14 Phillip Dan Cook Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
JPH09508134A (ja) * 1994-01-26 1997-08-19 チバ−ガイギー アクチェンゲゼルシャフト 変型オリゴヌクレオチド
US5625050A (en) * 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5981731A (en) * 1994-05-31 1999-11-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of B-raf gene expression
US6391636B1 (en) 1994-05-31 2002-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of raf gene expression
JPH10503934A (ja) * 1994-08-09 1998-04-14 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト 抗腫瘍性アンチセンスオリゴヌクレオチド
GB9417746D0 (en) * 1994-09-03 1994-10-19 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
GB9417938D0 (en) * 1994-09-06 1994-10-26 Ciba Geigy Ag Compounds
US5681940A (en) * 1994-11-02 1997-10-28 Icn Pharmaceuticals Sugar modified nucleosides and oligonucleotides
EP0714907A1 (en) * 1994-11-30 1996-06-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Oligoribonucleotides with amide backbone
US5807718A (en) 1994-12-02 1998-09-15 The Scripps Research Institute Enzymatic DNA molecules
US6207826B1 (en) 1995-03-27 2001-03-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Macrocyclic compounds having nitrogen-containing linkages
EP0817787A4 (en) 1995-03-27 2000-09-13 Isis Pharmaceuticals Inc NITROGEN MACROCYCLIC COMPOUNDS
US6420549B1 (en) * 1995-06-06 2002-07-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide analogs having modified dimers
US6251939B1 (en) 1995-06-07 2001-06-26 Promega Biosciences, Inc. Carbamate-based cationic lipids
US5665721A (en) * 1995-06-07 1997-09-09 Abbott Laboratories Heterocyclic substituted cyclopentane compounds
US6143749A (en) * 1995-06-07 2000-11-07 Abbott Laboratories Heterocyclic substituted cyclopentane compounds
US5855911A (en) * 1995-08-29 1999-01-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Liposomal phosphodiester, phosphorothioate, and P-ethoxy oligonucleotides
GB9604669D0 (en) 1996-03-05 1996-05-01 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
US5856099A (en) * 1996-05-21 1999-01-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense compositions and methods for modulating type I interleukin-1 receptor expression
US20040203024A1 (en) * 1996-06-06 2004-10-14 Baker Brenda F. Modified oligonucleotides for use in RNA interference
US5898031A (en) * 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
US20040161777A1 (en) * 1996-06-06 2004-08-19 Baker Brenda F. Modified oligonucleotides for use in RNA interference
US20070275921A1 (en) * 1996-06-06 2007-11-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric Compounds That Facilitate Risc Loading
US9096636B2 (en) * 1996-06-06 2015-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
US20050119470A1 (en) * 1996-06-06 2005-06-02 Muthiah Manoharan Conjugated oligomeric compounds and their use in gene modulation
US7812149B2 (en) * 1996-06-06 2010-10-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2′-Fluoro substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
US20040266706A1 (en) * 2002-11-05 2004-12-30 Muthiah Manoharan Cross-linked oligomeric compounds and their use in gene modulation
US20040147022A1 (en) * 1996-06-06 2004-07-29 Baker Brenda F. 2'-methoxy substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
US20050053976A1 (en) * 1996-06-06 2005-03-10 Baker Brenda F. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
US20050042647A1 (en) * 1996-06-06 2005-02-24 Baker Brenda F. Phosphorous-linked oligomeric compounds and their use in gene modulation
GB9612600D0 (en) 1996-06-13 1996-08-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
WO1998000434A1 (en) * 1996-06-28 1998-01-08 Novartis Ag Modified oligonucleotides
US7309692B1 (en) 1996-07-08 2007-12-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of chronic myelogenous leukemic cell growth by liposomal-antisense oligodeoxy-nucleotides targeting to GRB2 or CRK1
US6077954A (en) 1996-08-01 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted heterocyclic compounds
WO1998005766A1 (fr) * 1996-08-02 1998-02-12 Bio Merieux Procede d'amplification d'une sequence d'un acide nucleique cible
US6111085A (en) * 1996-09-13 2000-08-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbamate-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US6977244B2 (en) 1996-10-04 2005-12-20 Board Of Regents, The University Of Texas Systems Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides
US5780241A (en) 1996-11-05 1998-07-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Complex chemical libraries
US6077833A (en) * 1996-12-31 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
US6319906B1 (en) 1996-12-31 2001-11-20 Isis Pharmaceuticals Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
US7235653B2 (en) 1996-12-31 2007-06-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
US6172209B1 (en) * 1997-02-14 2001-01-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Aminooxy-modified oligonucleotides and methods for making same
US6639062B2 (en) * 1997-02-14 2003-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy-modified nucleosidic compounds and oligomeric compounds prepared therefrom
US6127533A (en) 1997-02-14 2000-10-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-aminooxy-modified oligonucleotides
US6576752B1 (en) * 1997-02-14 2003-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy functionalized oligomers
AU735522C (en) 1997-04-29 2005-04-07 Scripps Research Institute, The Enzymatic dna molecules
ATE321882T1 (de) 1997-07-01 2006-04-15 Isis Pharmaceuticals Inc Zusammensetzungen und verfahren zur verabreichung von oligonukleotiden über die speiseröhre
US5877309A (en) 1997-08-13 1999-03-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotides against JNK
US20070149472A1 (en) * 1997-08-13 2007-06-28 Mckay Robert Antisense oligonucleotide compositions and methods for the modulation of jnk proteins
US6809193B2 (en) 1997-08-13 2004-10-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide compositions and methods for the modulation of JNK proteins
US6133246A (en) * 1997-08-13 2000-10-17 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense oligonucleotide compositions and methods for the modulation of JNK proteins
US20030165888A1 (en) * 2001-07-18 2003-09-04 Brown Bob D. Oligonucleotide probes and primers comprising universal bases for diagnostic purposes
US6518017B1 (en) * 1997-10-02 2003-02-11 Oasis Biosciences Incorporated Combinatorial antisense library
US7704962B1 (en) 1997-10-03 2010-04-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Small oligonucleotides with anti-tumor activity
US7285288B1 (en) 1997-10-03 2007-10-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides
US6232463B1 (en) 1997-10-09 2001-05-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5948902A (en) 1997-11-20 1999-09-07 South Alabama Medical Science Foundation Antisense oligonucleotides to human serine/threonine protein phosphatase genes
US5968748A (en) * 1998-03-26 1999-10-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of human HER-2 expression
US20040186071A1 (en) * 1998-04-13 2004-09-23 Bennett C. Frank Antisense modulation of CD40 expression
US7321828B2 (en) * 1998-04-13 2008-01-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. System of components for preparing oligonucleotides
JP2002515514A (ja) 1998-05-21 2002-05-28 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド オリゴヌクレオチドの局所送逹のための組成物及び方法
CA2329130A1 (en) * 1998-05-21 1999-11-25 Isis Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for non-parenteral delivery of oligonucleotides
US6300319B1 (en) 1998-06-16 2001-10-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeted oligonucleotide conjugates
US6867294B1 (en) 1998-07-14 2005-03-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages
US6673912B1 (en) 1998-08-07 2004-01-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2′-O-aminoethyloxyethyl-modified oligonucleotides
US20040009938A1 (en) * 1998-08-07 2004-01-15 Muthiah Manoharan Methods of enhancing renal uptake of oligonucleotides
US6043352A (en) 1998-08-07 2000-03-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-Dimethylaminoethyloxyethyl-modified oligonucleotides
US6175004B1 (en) 1998-09-01 2001-01-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for the synthesis of oligonucleotides incorporating 2-aminoadenosine
US6077709A (en) 1998-09-29 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of Survivin expression
US6069243A (en) * 1998-10-06 2000-05-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for oligonucleotide synthesis
US6667176B1 (en) 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
US6492111B1 (en) 1998-11-25 2002-12-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. In situ binary synthesis of biologically effective molecules
US6087112A (en) * 1998-12-30 2000-07-11 Oligos Etc. Inc. Arrays with modified oligonucleotide and polynucleotide compositions
US20030180789A1 (en) * 1998-12-30 2003-09-25 Dale Roderic M.K. Arrays with modified oligonucleotide and polynucleotide compositions
US6403779B1 (en) 1999-01-08 2002-06-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Regioselective synthesis of 2′-O-modified nucleosides
US6399765B1 (en) 1999-03-17 2002-06-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for removing dimethoxytrityl groups from oligonucleotides
AU3934000A (en) 1999-03-18 2000-10-04 United Therapeutics Corporation Inhibitors of endothelin-1 synthesis
US6235891B1 (en) 1999-03-31 2001-05-22 South Alabama Medical Science Foundation Glucocorticoid receptor agonist and decreased PP5
CA2365984A1 (en) * 1999-04-08 2000-10-19 Oasis Biosciences, Inc. Antisense oligonucleotides comprising universal and/or degenerate bases
US7098192B2 (en) 1999-04-08 2006-08-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of STAT3 expression
US6656730B1 (en) 1999-06-15 2003-12-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides conjugated to protein-binding drugs
US6147200A (en) * 1999-08-19 2000-11-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers
US6277982B1 (en) 1999-08-20 2001-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Alkylation of alcohols, amines, thiols and their derivatives by cyclic sulfate intermediates
US6261840B1 (en) 2000-01-18 2001-07-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of PTP1B expression
US20020055479A1 (en) 2000-01-18 2002-05-09 Cowsert Lex M. Antisense modulation of PTP1B expression
AU2001276691A1 (en) * 2000-08-03 2002-02-18 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Brushless motor and method of manufacturing the brushless motor
US7767802B2 (en) 2001-01-09 2010-08-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
EP1404698A4 (en) 2001-06-21 2004-12-22 Isis Pharmaceuticals Inc ANTI-SENSE MODULATION OF SOLUBLE SUPEROXIDE DISMUTASE 1 EXPRESSION
US7425545B2 (en) 2001-07-25 2008-09-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of C-reactive protein expression
US6964950B2 (en) 2001-07-25 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of C-reactive protein expression
US20030096772A1 (en) 2001-07-30 2003-05-22 Crooke Rosanne M. Antisense modulation of acyl CoA cholesterol acyltransferase-2 expression
US7407943B2 (en) 2001-08-01 2008-08-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein B expression
US7227014B2 (en) 2001-08-07 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein (a) expression
AU2002334895B2 (en) 2001-10-09 2006-10-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of insulin-like growth factor binding protein 5 expression
US6750019B2 (en) 2001-10-09 2004-06-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of insulin-like growth factor binding protein 5 expression
EP1488233A4 (en) 2001-10-09 2006-06-21 Genentech Inc NEW ACID MUDE PROTEINS AND THESE CODING POLYNUCLEOTIDES
DE10159904A1 (de) * 2001-12-06 2003-07-03 Adnagen Ag Oligonukleotidanordnung, Verfahren zum Nukleotidnachweis sowie Vorrichtung hierfür
US6965025B2 (en) 2001-12-10 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of connective tissue growth factor expression
WO2003061386A1 (en) * 2002-01-03 2003-07-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Wt1 antisense oligos for the inhibition of breast cancer
US20030166282A1 (en) * 2002-02-01 2003-09-04 David Brown High potency siRNAS for reducing the expression of target genes
ATE529512T1 (de) * 2002-02-01 2011-11-15 Life Technologies Corp Doppelsträngige oligonukleotide
US20060009409A1 (en) 2002-02-01 2006-01-12 Woolf Tod M Double-stranded oligonucleotides
US20030191075A1 (en) * 2002-02-22 2003-10-09 Cook Phillip Dan Method of using modified oligonucleotides for hepatic delivery
US7169916B2 (en) * 2002-04-01 2007-01-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chloral-free DCA in oligonucleotide synthesis
US7199107B2 (en) 2002-05-23 2007-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of kinesin-like 1 expression
US20100075423A1 (en) * 2002-06-12 2010-03-25 Life Technologies Corporation Methods and compositions relating to polypeptides with rnase iii domains that mediate rna interference
US20040248094A1 (en) * 2002-06-12 2004-12-09 Ford Lance P. Methods and compositions relating to labeled RNA molecules that reduce gene expression
WO2004011479A1 (en) * 2002-07-25 2004-02-05 Micrologix Biotech Inc. Inhibitors of rna dependent rna polymerase and uses thereof
SI3222724T1 (sl) 2002-08-05 2019-03-29 Silence Therapeutics Gmbh Nadaljnje nove oblike molekul interferenčne RNA
US20040029275A1 (en) * 2002-08-10 2004-02-12 David Brown Methods and compositions for reducing target gene expression using cocktails of siRNAs or constructs expressing siRNAs
US20050196382A1 (en) * 2002-09-13 2005-09-08 Replicor, Inc. Antiviral oligonucleotides targeting viral families
EA008940B1 (ru) * 2002-09-13 2007-10-26 Репликор, Инк. Антивирусные олигонуклеотиды, не связанные с комплементарностью последовательностей
EP1546344A4 (en) * 2002-09-18 2007-10-03 Isis Pharmaceuticals Inc EFFICIENT REDUCTION OF TARGET RNA USING OLIGOMERIC COMPOUNDS WITH SINGLE AND DOUBLE STRAPS
WO2004031350A2 (en) 2002-09-26 2004-04-15 Amgen, Inc. Modulation of forkhead box o1a expression
WO2004044138A2 (en) 2002-11-05 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
WO2004044132A2 (en) * 2002-11-05 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modified oligonucleotides for use in rna interference
ES2420914T3 (es) 2002-11-13 2013-08-27 Genzyme Corporation Modulación antisentido de la expresión de la apolipoproteína B
AU2003294281B2 (en) 2002-11-13 2010-05-20 Kastle Therapeutics, Llc Antisense modulation of apolipoprotein B expression
US7144999B2 (en) 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
WO2004072284A1 (en) 2003-02-11 2004-08-26 Antisense Therapeutics Ltd Modulation of insulin like growth factor i receptor expression
US7002006B2 (en) * 2003-02-12 2006-02-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Protection of nucleosides
US7803781B2 (en) 2003-02-28 2010-09-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of growth hormone receptor expression and insulin-like growth factor expression
EP3450559A1 (en) 2003-03-07 2019-03-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic compositions
US20040185559A1 (en) 2003-03-21 2004-09-23 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 1 expression
US7598227B2 (en) 2003-04-16 2009-10-06 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of apolipoprotein C-III expression
ES2702942T3 (es) 2003-04-17 2019-03-06 Alnylam Pharmaceuticals Inc Agentes de ARNi modificados
US7399853B2 (en) 2003-04-28 2008-07-15 Isis Pharmaceuticals Modulation of glucagon receptor expression
US20040219533A1 (en) * 2003-04-29 2004-11-04 Jim Davis Biological bar code
WO2004098386A2 (en) * 2003-05-01 2004-11-18 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotides comprising a molecular switch
US7897582B2 (en) 2003-05-23 2011-03-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
US7960355B2 (en) 2003-05-23 2011-06-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
WO2004108081A2 (en) * 2003-06-02 2004-12-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide synthesis with alternative solvents
CA2524495A1 (en) 2003-06-03 2005-01-13 Eli Lilly And Company Modulation of survivin expression
WO2005014782A2 (en) 2003-06-13 2005-02-17 Alnylam Europe Ag., Double-stranded ribonucleic acid with increased effectiveness in an organism
EP1636342A4 (en) * 2003-06-20 2008-10-08 Isis Pharmaceuticals Inc OLIGOMERIC COMPOUNDS FOR GENE MODULATION
US7525013B2 (en) * 2003-06-30 2009-04-28 United Soybean Board Soybean selection system based on AEC-resistance
WO2005013901A2 (en) 2003-07-31 2005-02-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding rnas
US7825235B2 (en) 2003-08-18 2010-11-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 2 expression
US20070123480A1 (en) * 2003-09-11 2007-05-31 Replicor Inc. Oligonucleotides targeting prion diseases
NZ576775A (en) 2003-09-18 2010-12-24 Isis Pharmaceuticals Inc Modulation of eIF4E expression
WO2005027962A1 (en) * 2003-09-18 2005-03-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4’-thionucleosides and oligomeric compounds
US7125945B2 (en) * 2003-09-19 2006-10-24 Varian, Inc. Functionalized polymer for oligonucleotide purification
US20050191653A1 (en) 2003-11-03 2005-09-01 Freier Susan M. Modulation of SGLT2 expression
EP2363480A3 (en) 2004-01-20 2015-10-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of glucocorticoid receptor expression
US8569474B2 (en) * 2004-03-09 2013-10-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand
US20050244869A1 (en) * 2004-04-05 2005-11-03 Brown-Driver Vickie L Modulation of transthyretin expression
US7674778B2 (en) 2004-04-30 2010-03-09 Alnylam Pharmaceuticals Oligonucleotides comprising a conjugate group linked through a C5-modified pyrimidine
CA2567720A1 (en) 2004-05-24 2005-12-08 Genvault Corporation Stable protein storage and stable nucleic acid storage in recoverable form
EP1771563A2 (en) 2004-05-28 2007-04-11 Ambion, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS INVOLVING MicroRNA
US8394947B2 (en) * 2004-06-03 2013-03-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Positionally modified siRNA constructs
CA2569036A1 (en) * 2004-06-03 2005-12-22 Balkrishen Bhat Chimeric gapped oligomeric compositions
US20090048192A1 (en) * 2004-06-03 2009-02-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double Strand Compositions Comprising Differentially Modified Strands for Use in Gene Modulation
JP2008501693A (ja) * 2004-06-03 2008-01-24 アイシス ファーマシューティカルズ、インク． 遺伝子調節で使用するための個別に調節された鎖を有する二本鎖組成物
US7968762B2 (en) * 2004-07-13 2011-06-28 Van Andel Research Institute Immune-compromised transgenic mice expressing human hepatocyte growth factor (hHGF)
JP5192234B2 (ja) 2004-08-10 2013-05-08 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 化学修飾オリゴヌクレオチド
JP4468989B2 (ja) 2004-08-16 2010-05-26 クアーク・ファーマスーティカルス、インコーポレイテッド Ｒｔｐ８０１阻害剤の治療への使用
CA2583375C (en) 2004-09-02 2013-01-15 Yale University Regulation of oncogenes by micrornas
US7884086B2 (en) * 2004-09-08 2011-02-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays
EP1799859B1 (en) 2004-09-17 2014-07-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Enhanced antisense oligonucleotides
ES2534304T3 (es) 2004-11-12 2015-04-21 Asuragen, Inc. Procedimientos y composiciones que implican miARN y moléculas inhibidoras de miARN
CN101193905B (zh) 2005-02-11 2014-06-25 纪念斯隆-凯特林癌症中心 用于检测抗药egfr突变体的方法和组合物
US20090264635A1 (en) * 2005-03-25 2009-10-22 Applera Corporation Methods and compositions for depleting abundant rna transcripts
CA2605015C (en) 2005-05-06 2013-09-10 Gen-Probe Incorporated Compositions and assays to detect influenza virus a and b nucleic acids
US8354384B2 (en) * 2005-06-23 2013-01-15 Yale University Anti-aging micrornas
US8067571B2 (en) 2005-07-13 2011-11-29 Avi Biopharma, Inc. Antibacterial antisense oligonucleotide and method
AU2006304721B2 (en) 2005-10-17 2012-01-19 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect Legionella pneumophila nucleic acid
EP2325315B1 (en) 2005-10-28 2014-05-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of huntingtin gene
AU2006311730B2 (en) 2005-11-09 2010-12-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of Factor V Leiden mutant gene
DOP2007000015A (es) 2006-01-20 2007-08-31 Quark Biotech Inc Usos terapéuticos de inhibidores de rtp801
PL2314594T3 (pl) 2006-01-27 2014-12-31 Isis Pharmaceuticals Inc Zmodyfikowane w pozycji 6 analogi bicykliczne kwasów nukleinowych
EP1987166A4 (en) 2006-02-03 2010-06-02 Univ Columbia DEOXYRIBOZYME BINARY PROBES FOR ANALYSIS OF NUCLEIC ACID
EP2511383B1 (en) 2006-03-31 2013-12-25 Columbia University Binary probes for fluorescent analysis of nucleic acids
JP2009536222A (ja) 2006-05-05 2009-10-08 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド Ｐｃｓｋ９の発現を調節するための化合物および方法
JP5570806B2 (ja) 2006-05-11 2014-08-13 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｐｃｓｋ９遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法
CA2651453C (en) * 2006-05-11 2014-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-modified bicyclic nucleic acid analogs
US7666854B2 (en) * 2006-05-11 2010-02-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs
AU2007249286B2 (en) * 2006-05-12 2013-06-13 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect enterococci nucleic acid
EP2023938A4 (en) * 2006-05-23 2010-11-10 Isis Pharmaceuticals Inc MODULATION OF THE EXPRESSION OF ChREBP
US8198253B2 (en) 2006-07-19 2012-06-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and their uses directed to HBXIP
CN102321626B (zh) 2006-07-21 2014-12-10 赛伦斯治疗有限公司 用于抑制蛋白激酶3表达的方法
US9051601B2 (en) 2006-08-01 2015-06-09 Gen-Probe Incorporated Methods of nonspecific target capture of nucleic acids
EP2487240B1 (en) 2006-09-19 2016-11-16 Interpace Diagnostics, LLC Micrornas differentially expressed in pancreatic diseases and uses thereof
CA2663962A1 (en) 2006-09-19 2008-03-27 Asuragen, Inc. Mir-15, mir-26, mir-31,mir-145, mir-147, mir-188, mir-215, mir-216, mir-331, mmu-mir-292-3p regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
CA2663581C (en) 2006-09-21 2016-03-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the hamp gene
AU2007303205A1 (en) 2006-10-03 2008-04-10 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Lipid containing formulations
JP2010507387A (ja) 2006-10-25 2010-03-11 クアーク・ファーマスーティカルス、インコーポレイテッド 新規のｓｉＲＮＡおよびその使用方法
EP2407558A1 (en) 2006-10-31 2012-01-18 Noxxon Pharma AG Methods for the detection of a single- or double-stranded nucleic acid molecule
CA2671299A1 (en) 2006-12-08 2008-06-19 Asuragen, Inc. Functions and targets of let-7 micro rnas
CA2673017C (en) 2006-12-21 2015-08-04 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for nucleic acid amplification
EP2114981B1 (en) 2007-01-29 2013-05-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating protein expression
PE20090064A1 (es) 2007-03-26 2009-03-02 Novartis Ag Acido ribonucleico de doble cadena para inhibir la expresion del gen e6ap humano y composicion farmaceutica que lo comprende
EP2977452A3 (en) 2007-05-11 2016-05-25 Thomas Jefferson University Methods of treatment and prevention of neurodegenerative diseases and disorders
MX2009012197A (es) 2007-05-11 2010-01-15 Univ Pennsylvania Metodos para tratamiento de ulceras en la piel.
CA2688321A1 (en) 2007-05-30 2008-12-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
EP2173760B2 (en) 2007-06-08 2015-11-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic bicyclic nucleic acid analogs
JP5745842B2 (ja) 2007-06-19 2015-07-08 ストラトス ゲノミクス インコーポレイテッド 拡張によるハイスループット核酸配列決定
CN103215269B (zh) 2007-07-05 2015-01-21 诺瓦提斯公司 用于治疗病毒感染的dsRNA
ES2376507T5 (es) * 2007-07-05 2015-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos 6-disustituidos
WO2009023855A2 (en) * 2007-08-15 2009-02-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Tetrahydropyran nucleic acid analogs
EP2205741A2 (en) 2007-10-02 2010-07-14 Amgen Inc. Increasing erythropoietin using nucleic acids hybridizable to micro-rna and precursors thereof
JP5646997B2 (ja) 2007-10-03 2014-12-24 クォーク ファーマシューティカルズ インコーポレーティッドＱｕａｒｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． 新規ｓｉＲＮＡ構造
EP2222851B1 (en) 2007-11-20 2017-06-28 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of cd40 expression
CA3043911A1 (en) 2007-12-04 2009-07-02 Arbutus Biopharma Corporation Targeting lipids
US7595164B2 (en) * 2007-12-26 2009-09-29 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect Candida albicans nucleic acid
KR101588736B1 (ko) 2008-01-10 2016-01-26 리서치 디벨롭먼트 파운데이션 얼리키아 샤피엔시스에 대한 백신 및 진단제
WO2009100320A2 (en) * 2008-02-07 2009-08-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexitol nucleic acid analogs
WO2009111375A2 (en) * 2008-03-01 2009-09-11 Abraxis Bioscience, Llc Treatment, diagnostic, and method for discovering antagonist using sparc specific mirnas
WO2009117589A1 (en) 2008-03-21 2009-09-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising tricyclic nucleosides and methods for their use
WO2009124295A2 (en) * 2008-04-04 2009-10-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleosides and having reduced toxicity
WO2009124238A1 (en) * 2008-04-04 2009-10-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising neutrally linked terminal bicyclic nucleosides
AU2009234266B2 (en) 2008-04-11 2015-08-06 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components
WO2009137660A2 (en) * 2008-05-07 2009-11-12 Abraxis Bioscience, Llc Enhancement of drug therapy by mirna
EP2990487A1 (en) 2008-05-08 2016-03-02 Asuragen, INC. Compositions and methods related to mirna modulation of neovascularization or angiogenesis
US20100209957A1 (en) * 2008-06-20 2010-08-19 Genvault Corporation Biosample storage devices and methods of use thereof
EP2323667A4 (en) * 2008-08-07 2012-07-25 Isis Pharmaceuticals Inc MODULATION OF TRANSTHYRETIN EXPRESSION BY TREATMENT OF CNS DISEASES
US8283165B2 (en) 2008-09-12 2012-10-09 Genvault Corporation Matrices and media for storage and stabilization of biomolecules
CA2737661C (en) 2008-09-23 2019-08-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Chemical modifications of monomers and oligonucleotides with cycloaddition
DK2356129T3 (da) * 2008-09-24 2013-05-13 Isis Pharmaceuticals Inc Substituerede alpha-L-bicykliske nukleosider
DK2361256T3 (da) 2008-09-24 2013-07-01 Isis Pharmaceuticals Inc Cyclohexenyl-nukleinsyreanaloger
EP3335715A3 (en) 2008-10-15 2018-08-08 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of factor 11 expression
WO2010048549A2 (en) 2008-10-24 2010-04-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5' and 2' bis-substituted nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
EP2447274B1 (en) 2008-10-24 2017-10-04 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and methods
CN102272157B (zh) 2008-11-07 2015-11-25 研究发展基金会 用于抑制cripto/grp78复合物形成和信号的组合物和方法
NO2355851T3 (hu) 2008-11-10 2018-09-01
WO2010059944A1 (en) 2008-11-21 2010-05-27 Columbia University A split dna enzyme for visual single nucleotide polymorphism typing
CA2744987C (en) 2008-12-02 2018-01-16 Chiralgen, Ltd. Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids
US20110288155A1 (en) 2008-12-18 2011-11-24 Elena Feinstein Sirna compounds and methods of use thereof
US8853134B2 (en) 2009-01-28 2014-10-07 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Microarrays of binary nucleic acid probes for detecting nucleic acid analytes
WO2010091308A2 (en) 2009-02-06 2010-08-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and methods
WO2010090969A1 (en) 2009-02-06 2010-08-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Tetrahydropyran nucleic acid analogs
WO2010091878A2 (en) 2009-02-13 2010-08-19 Silence Therapeutics Ag Means for inhibiting the expression of opa1
EP2398903A1 (en) 2009-02-18 2011-12-28 Silence Therapeutics Aktiengesellschaft Means for inhibiting the expression of ang2
AU2010221419B2 (en) 2009-03-02 2015-10-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid chemical modifications
EA201190178A1 (ru) * 2009-03-20 2012-06-29 Алиос Биофарма, Инк. Замещённые нуклеозидные и нуклеотидные аналоги
US20110045080A1 (en) * 2009-03-24 2011-02-24 William Marsh Rice University Single-Walled Carbon Nanotube/Bioactive Substance Complexes and Methods Related Thereto
EP2258858A1 (en) 2009-06-05 2010-12-08 Universitätsklinikum Freiburg Transgenic LSD1 animal model for cancer
KR20230098713A (ko) 2009-06-10 2023-07-04 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 향상된 지질 조성물
WO2011003020A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for nucleic acid amplification
AU2010270714B2 (en) 2009-07-06 2015-08-13 Wave Life Sciences Ltd. Novel nucleic acid prodrugs and methods use thereof
US8927513B2 (en) 2009-07-07 2015-01-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 5′ phosphate mimics
US9512164B2 (en) 2009-07-07 2016-12-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide end caps
EP2462153B1 (en) 2009-08-06 2015-07-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs
AP3574A (en) 2009-08-14 2016-02-08 Alnylam Pharmaceuticals Inc Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of a gene from the ebola virus
CN102597239A (zh) 2009-11-26 2012-07-18 夸克医药公司 包含末端取代的sirna化合物
EP3296398A1 (en) 2009-12-07 2018-03-21 Arbutus Biopharma Corporation Compositions for nucleic acid delivery
US8778904B2 (en) 2009-12-09 2014-07-15 Quark Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating diseases, disorders or injury of the CNS
AU2010328104B2 (en) 2009-12-09 2014-10-30 Nitto Denko Corporation Modulation of hsp47 expression
US20130017223A1 (en) 2009-12-18 2013-01-17 The University Of British Columbia Methods and compositions for delivery of nucleic acids
WO2011084193A1 (en) 2010-01-07 2011-07-14 Quark Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compounds comprising non-nucleotide overhangs
US8779118B2 (en) 2010-01-11 2014-07-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Base modified bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
WO2011094580A2 (en) 2010-01-28 2011-08-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Chelated copper for use in the preparation of conjugated oligonucleotides
US9198972B2 (en) 2010-01-28 2015-12-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Monomers and oligonucleotides comprising cycloaddition adduct(s)
WO2011103274A1 (en) 2010-02-17 2011-08-25 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect atopobium vaginae nucleic acid
EP2542678B1 (en) 2010-03-04 2017-04-12 InteRNA Technologies B.V. A MiRNA MOLECULE DEFINED BY ITS SOURCE AND ITS THERAPEUTIC USES IN CANCER ASSOCIATED WITH EMT
WO2011115818A1 (en) 2010-03-17 2011-09-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-substituted bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
WO2011123621A2 (en) 2010-04-01 2011-10-06 Alnylam Pharmaceuticals Inc. 2' and 5' modified monomers and oligonucleotides
CA3074551C (en) 2010-04-21 2021-05-04 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits to detect herpes simplex virus nucleic acids
WO2011133876A2 (en) 2010-04-22 2011-10-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising acyclic and abasic nucleosides and analogs
WO2011133868A2 (en) 2010-04-22 2011-10-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Conformationally restricted dinucleotide monomers and oligonucleotides
US9725479B2 (en) 2010-04-22 2017-08-08 Ionis Pharmaceuticals, Inc. 5′-end derivatives
CN103154014B (zh) 2010-04-28 2015-03-25 Isis制药公司 修饰核苷、其类似物以及由它们制备的寡聚化合物
US9127033B2 (en) 2010-04-28 2015-09-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5′ modified nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
WO2011139695A2 (en) 2010-04-28 2011-11-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modified 5' diphosphate nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
WO2011139911A2 (en) 2010-04-29 2011-11-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated single stranded rna
WO2011139917A1 (en) 2010-04-29 2011-11-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of transthyretin expression
TWI620756B (zh) 2010-05-28 2018-04-11 薩羅塔治療公司 具有經修飾之單元間連結及／或末端基團之寡核苷酸類似物
WO2011156278A1 (en) 2010-06-07 2011-12-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
US8846637B2 (en) 2010-06-08 2014-09-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted 2′-amino and 2′-thio-bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
WO2011163436A1 (en) 2010-06-24 2011-12-29 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double stranded rna compounds to rhoa and use thereof
AU2011272868B2 (en) 2010-06-30 2015-09-17 Gen-Probe Incorporated Method and apparatus for identifying analyte-containing samples using single-read determination of analyte and process control signals
CA2804599C (en) 2010-07-06 2023-01-31 Interna Technologies Bv Mirna and its diagnostic and therapeutic uses in diseases or conditions associated with melanoma, or in diseases or conditions associated with activated braf pathway
EP2593569B1 (en) 2010-07-12 2018-01-03 Gen-Probe Incorporated Compositions and assays to detect seasonal h1 influenza a virus nucleic acids
WO2012016188A2 (en) 2010-07-30 2012-02-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for delivery of active agents
WO2012016184A2 (en) 2010-07-30 2012-02-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for delivery of active agents
JP5952815B2 (ja) 2010-08-04 2016-07-13 シズル バイオテクノロジー リミテッド ガンの診断および処置のための方法および化合物
EP2611932A2 (en) 2010-08-30 2013-07-10 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and reaction mixtures for the detection of xenotropic murine leukemia virus-related virus
WO2012031243A2 (en) 2010-09-03 2012-03-08 Avi Biopharma, Inc. dsRNA MOLECULES COMPRISING OLIGONUCLEOTIDE ANALOGS HAVING MODIFIED INTERSUBUNIT LINKAGES AND/OR TERMINAL GROUPS
EP2616555B1 (en) 2010-09-16 2017-11-08 Gen-Probe Incorporated Capture probes immobilizable via l-nucleotide tail
CN103209987B (zh) 2010-09-22 2017-06-06 艾丽奥斯生物制药有限公司 取代的核苷酸类似物
EP2620428B1 (en) 2010-09-24 2019-05-22 Wave Life Sciences Ltd. Asymmetric auxiliary group
EP3438289A1 (en) 2010-10-04 2019-02-06 Gen-Probe Prodesse, Inc. Compositions, methods and kits to detect adenovirus nucleic acids
US20140134231A1 (en) 2010-10-11 2014-05-15 Sanford-Burnham Medical Research Institute Mir-211 expression and related pathways in human melanoma
EP3388532B1 (en) 2010-11-01 2021-03-10 Gen-Probe Incorporated Integrated capture and amplification of target nucleic acid for sequencing
US8569220B2 (en) 2010-11-12 2013-10-29 Jelmar, Llc Hard surface cleaning composition
JP6126009B2 (ja) 2010-11-17 2017-05-10 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッドＩｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． α−シヌクレイン発現の調節
SG190412A1 (en) 2010-12-06 2013-06-28 Quark Pharmaceuticals Inc Double stranded oligonucleotide compounds comprising threose modifications
EP2474617A1 (en) 2011-01-11 2012-07-11 InteRNA Technologies BV Mir for treating neo-angiogenesis
DK3202760T3 (da) 2011-01-11 2019-11-25 Alnylam Pharmaceuticals Inc Pegylerede lipider og deres anvendelse til lægemiddelfremføring
CA2828002A1 (en) 2011-03-03 2012-09-07 Quark Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating lung disease and injury
SG193280A1 (en) 2011-03-03 2013-10-30 Quark Pharmaceuticals Inc Oligonucleotide modulators of the toll-like receptor pathway
EP2683833B1 (en) 2011-03-10 2018-09-26 Gen-Probe Incorporated Methods for the selection and optimization of oligonucleotide tag sequences
EP2702166B1 (en) 2011-04-25 2018-06-06 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting bv-associated bacterial nucleic acid
TWI658830B (zh) 2011-06-08 2019-05-11 日東電工股份有限公司 Ｈｓｐ47表現調控強化用類視色素脂質體
US10196637B2 (en) 2011-06-08 2019-02-05 Nitto Denko Corporation Retinoid-lipid drug carrier
WO2012170347A1 (en) 2011-06-09 2012-12-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
US20140227293A1 (en) 2011-06-30 2014-08-14 Trustees Of Boston University Method for controlling tumor growth, angiogenesis and metastasis using immunoglobulin containing and proline rich receptor-1 (igpr-1)
CA3113828A1 (en) 2011-07-15 2013-01-24 Gen-Probe Incorporated Compositions and method for detecting human parvovirus nucleic acid and for detecting hepatitis a virus nucleic acids in single-plex or multiplex assays
SG10201700554VA (en) 2011-07-19 2017-03-30 Wave Life Sciences Pte Ltd Methods for the synthesis of functionalized nucleic acids
EP2742056B2 (en) 2011-08-11 2020-06-10 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Selective antisense compounds and uses thereof
US10023861B2 (en) 2011-08-29 2018-07-17 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomer-conjugate complexes and their use
EP2753714B1 (en) 2011-09-06 2017-04-12 Gen-Probe Incorporated Circularized templates for sequencing
EP3620533B1 (en) 2011-09-06 2023-01-18 Gen-Probe Incorporated Closed nucleic acid structures
EP2753713B1 (en) 2011-09-08 2017-07-19 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting bv-associated bacterial nucleic acid
WO2013040251A2 (en) 2011-09-13 2013-03-21 Asurgen, Inc. Methods and compositions involving mir-135b for distinguishing pancreatic cancer from benign pancreatic disease
EP2760477B1 (en) 2011-09-27 2018-08-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Di-aliphatic substituted pegylated lipids
US20130157884A1 (en) 2011-10-26 2013-06-20 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving mirna expression levels for distinguishing pancreatic cysts
WO2013067076A2 (en) 2011-11-03 2013-05-10 Quark Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for neuroprotection
EP3492604B1 (en) 2011-11-04 2021-01-06 Gen-Probe Incorporated Molecular assay reagents and methods
WO2013070821A1 (en) 2011-11-08 2013-05-16 Quark Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating diseases, disorders or injury of the nervous system
CA2854907C (en) 2011-11-18 2020-03-10 Sarepta Therapeutics, Inc. Functionally-modified oligonucleotides and subunits thereof
DE102011120550B4 (de) 2011-12-05 2013-11-07 Gen-Probe Prodesse, Inc. Zusammensetzungen, Verfahren und Kits zur Detektion von Adenovirusnukleinsäuren
AU2012358804B2 (en) 2011-12-22 2018-04-19 Alios Biopharma, Inc. Substituted phosphorothioate nucleotide analogs
ES2886147T3 (es) 2011-12-22 2021-12-16 Interna Tech B V MiARN para el tratamiento del cáncer de cabeza y de cuello
SG11201402826YA (en) 2011-12-22 2014-12-30 Alios Biopharma Inc Substituted nucleosides, nucleotides and analogs thereof
SG11201403756PA (en) 2012-01-01 2014-11-27 Qbi Entpr Ltd Endo180-targeted particles for selective delivery of therapeutic and diagnostic agents
CN104080912A (zh) 2012-01-12 2014-10-01 夸克制药公司 用于治疗听力和平衡障碍的组合疗法
EP3511426B1 (en) 2012-02-01 2022-08-17 Gen-Probe Incorporated Asymmetric hairpin target capture oligomers
WO2013123996A1 (en) 2012-02-24 2013-08-29 Astrazeneca Uk Limited Novel sirna inhibitors of human icam-1
WO2013134734A2 (en) 2012-03-09 2013-09-12 Vestaron Corporation Toxic peptide production, peptide expression in plants and combinations of cysteine rich peptides
EP2639238A1 (en) 2012-03-15 2013-09-18 Universität Bern Tricyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
USRE48171E1 (en) 2012-03-21 2020-08-25 Janssen Biopharma, Inc. Substituted nucleosides, nucleotides and analogs thereof
US9441007B2 (en) 2012-03-21 2016-09-13 Alios Biopharma, Inc. Substituted nucleosides, nucleotides and analogs thereof
WO2013142124A1 (en) 2012-03-21 2013-09-26 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Solid forms of a thiophosphoramidate nucleotide prodrug
US9012427B2 (en) 2012-03-22 2015-04-21 Alios Biopharma, Inc. Pharmaceutical combinations comprising a thionucleotide analog
WO2013154799A1 (en) 2012-04-09 2013-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Tricyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
EP2850092B1 (en) 2012-04-09 2017-03-01 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Tricyclic nucleic acid analogs
AU2013205110B2 (en) 2012-04-24 2016-10-13 Gen-Probe Incorporated Compositions, Methods and Kits to Detect Herpes Simplex Virus Nucleic Acids
WO2013179289A1 (en) 2012-05-31 2013-12-05 Bio-Lab Ltd. Pyrazolotriazolyl nucleoside analogues and oligonucleotides comprising them
AU2013205064B2 (en) 2012-06-04 2015-07-30 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Amplifying and Characterizing HCV Nucleic Acid
AU2013205087B2 (en) 2012-07-13 2016-03-03 Gen-Probe Incorporated Method for detecting a minority genotype
SG11201500239VA (en) 2012-07-13 2015-03-30 Wave Life Sciences Japan Asymmetric auxiliary group
AU2013202793B2 (en) 2012-07-31 2014-09-18 Gen-Probe Incorporated System, method and apparatus for automated incubation
AU2013308647B2 (en) 2012-08-30 2018-10-18 Gen-Probe Incorporated Multiphase nucleic acid amplification
WO2014043291A1 (en) 2012-09-12 2014-03-20 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded nucleic acid compounds
US9932578B2 (en) 2012-09-12 2018-04-03 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded oligonucleotide molecules to P53 and methods of use thereof
EP2895608B1 (en) 2012-09-12 2018-12-05 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded oligonucleotide molecules to p53 and methods of use thereof
WO2014045126A2 (en) 2012-09-18 2014-03-27 Uti Limited Partnership Treatment of pain by inhibition of usp5 de-ubiquitinase
US20140100124A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Asuragen, Inc. Diagnostic mirnas for differential diagnosis of incidental pancreatic cystic lesions
AU2013205122B2 (en) 2012-10-11 2016-11-10 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Detecting Human Papillomavirus Nucleic Acid
US9029335B2 (en) 2012-10-16 2015-05-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted 2′-thio-bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
US10201556B2 (en) 2012-11-06 2019-02-12 Interna Technologies B.V. Combination for use in treating diseases or conditions associated with melanoma, or treating diseases or conditions associated with activated B-raf pathway
AU2013205090B2 (en) 2012-12-07 2016-07-28 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Detecting Gastrointestinal Pathogen Nucleic Acid
EP2961853B1 (en) 2013-02-28 2018-09-19 The Board of Regents of The University of Texas System Methods for classifying a cancer as susceptible to tmepai-directed therapies and treating such cancers
CA2905144C (en) 2013-03-14 2023-08-22 Lyle J. Arnold Methods for amplification of nucleic acids on solid support
US10202629B2 (en) 2013-03-15 2019-02-12 Aegea Biotechnologies, Inc. Methods for amplification of nucleic acids utilizing clamp oligonucleotides
EP3404116B1 (en) 2013-03-15 2022-10-19 The University of Chicago Methods and compositions related to t-cell activity
CN105247076B (zh) 2013-03-15 2021-06-18 莱尔·J·阿诺德 使用拼装序列扩增片段化的目标核酸的方法
EP2978446B1 (en) 2013-03-27 2020-03-04 The General Hospital Corporation Anti-cd33 antibody for use in treating alzheimer's disease
RU2686080C2 (ru) 2013-05-01 2019-04-24 Ионис Фармасьютикалз, Инк. Композиции и способы
US20160208247A1 (en) 2013-07-31 2016-07-21 Qbi Enterprises Ltd. Methods of use of sphingolipid polyalkylamine oligonucleotide compounds
CN105452465B (zh) 2013-07-31 2019-06-21 奇比艾企业有限公司 鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物
EP4299767A3 (en) 2013-08-14 2024-03-27 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting hev nucleic acid
EP2853595A1 (en) 2013-09-30 2015-04-01 Soluventis GmbH NOTCH 1 specific siRNA molecules
US11162096B2 (en) 2013-10-14 2021-11-02 Ionis Pharmaceuticals, Inc Methods for modulating expression of C9ORF72 antisense transcript
WO2015070050A1 (en) 2013-11-08 2015-05-14 Baylor Research Institute Nuclear loclization of glp-1 stimulates myocardial regeneration and reverses heart failure
DK3077510T3 (da) 2013-12-02 2020-06-08 Ionis Pharmaceuticals Inc Antisense-forbindelser og anvendelser deraf
MX2016009290A (es) 2014-01-16 2017-02-28 Wave Life Sciences Ltd Diseño quiral.
US10087444B2 (en) 2014-02-13 2018-10-02 The Board Of Regents Of The University Of Texas System MicroRNA composition for the treatment of neuroblastoma
WO2015142910A1 (en) 2014-03-17 2015-09-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic carbocyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
US10006027B2 (en) 2014-03-19 2018-06-26 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods for modulating Ataxin 2 expression
EP3119888B1 (en) 2014-03-19 2021-07-28 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for modulating ataxin 2 expression
HUE050704T2 (hu) 2014-04-01 2020-12-28 Biogen Ma Inc Összetételek a SOD-1 expressziójának modulálására
WO2015164693A1 (en) 2014-04-24 2015-10-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising alpha-beta-constrained nucleic acid
EP3137476B1 (en) 2014-04-28 2019-10-09 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Linkage modified oligomeric compounds
KR102356388B1 (ko) 2014-05-01 2022-01-26 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 안지오포이에틴-유사 3 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법
RS59182B1 (sr) 2014-05-01 2019-10-31 Ionis Pharmaceuticals Inc Kompozicije i postupci za modulaciju ekspresije faktora b komplementa
WO2015190922A1 (en) 2014-06-10 2015-12-17 Erasmus University Medical Center Rotterdam Antisense oligonucleotides useful in treatment of pompe disease
WO2016033424A1 (en) 2014-08-29 2016-03-03 Genzyme Corporation Methods for the prevention and treatment of major adverse cardiovascular events using compounds that modulate apolipoprotein b
WO2016040748A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for detection of smn protein in a subject and treatment of a subject
KR102473092B1 (ko) 2014-09-15 2022-12-01 칠드런'즈 메디컬 센터 코포레이션 히스톤 h3-리신 트리메틸화를 제거함으로써 체세포 핵 이식(scnt) 효율을 증가시키는 방법 및 조성물
US20170304459A1 (en) 2014-10-10 2017-10-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for inhalation delivery of conjugated oligonucleotide
EP3209799B1 (en) 2014-10-20 2020-07-08 Gen-Probe Incorporated Red blood cell lysis solution
WO2016083624A1 (en) 2014-11-28 2016-06-02 Silence Therapeutics Gmbh Means for inhibiting the expression of edn1
EP3230445B1 (en) 2014-12-12 2024-01-24 Tod M. Woolf Compositions and methods for editing nucleic acids in cells utilizing oligonucleotides
EP3234141A4 (en) 2014-12-18 2018-06-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Reversir tm compounds
US9688707B2 (en) 2014-12-30 2017-06-27 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic morpholino compounds and oligomeric compounds prepared therefrom
WO2016112132A1 (en) 2015-01-06 2016-07-14 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for modulating expression of c9orf72 antisense transcript
EP3242956B1 (en) 2015-01-09 2020-06-17 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for diagnosing bacterial vaginosis
US10538763B2 (en) 2015-01-16 2020-01-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulation of DUX4
WO2016134293A1 (en) 2015-02-20 2016-08-25 Baylor College Of Medicine p63 INACTIVATION FOR THE TREATMENT OF HEART FAILURE
US11129844B2 (en) 2015-03-03 2021-09-28 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating MECP2 expression
JP6796593B2 (ja) 2015-03-16 2020-12-09 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド 細菌核酸を検出し細菌性膣炎を診断するための方法および組成物
US10407678B2 (en) 2015-04-16 2019-09-10 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for modulating expression of C9ORF72 antisense transcript
WO2016196897A1 (en) 2015-06-04 2016-12-08 Sarepta Therapeutics, Inc. Methods and compounds for treatment of lymphocyte-related diseases and conditions
AU2016295168B2 (en) 2015-07-17 2021-08-19 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Multi-targeted single entity conjugates
US10533175B2 (en) 2015-09-25 2020-01-14 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating Ataxin 3 expression
WO2017066643A1 (en) 2015-10-14 2017-04-20 Bio-Path Holding, Inc. P-ethoxy nucleic acids for liposomal formulation
CA2999341A1 (en) 2015-11-06 2017-05-11 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulating apolipoprotein (a) expression
WO2017096395A1 (en) 2015-12-04 2017-06-08 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating breast cancer
CA3007152A1 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Erasmus University Medical Center Rotterdam Enzymatic replacement therapy and antisense therapy for pompe disease
AU2017205399C1 (en) 2016-01-04 2023-06-15 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for detecting Candida species
CA3006599A1 (en) 2016-01-05 2017-07-13 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing lrrk2 expression
WO2017161168A1 (en) 2016-03-16 2017-09-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of dyrk1b expression
CA3013799A1 (en) 2016-03-16 2017-09-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods of modulating keap1
CA3019635A1 (en) 2016-03-31 2017-10-05 Baylor Research Institute Angiopoietin-like protein 8 (angptl8)
EP3228326A1 (en) 2016-04-05 2017-10-11 Silence Therapeutics GmbH Nucleic acid linked to a trivalent glycoconjugate
EP3443090A4 (en) 2016-04-14 2019-12-11 University of Florida Research Foundation, Incorporated USE OF MIR-223-3P AS CANCER THERAPEUTIC AND METHOD FOR THE TREATMENT OF CANCER THEREWITH
WO2017219017A1 (en) 2016-06-17 2017-12-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of gys1 expression
NL2017294B1 (en) 2016-08-05 2018-02-14 Univ Erasmus Med Ct Rotterdam Natural cryptic exon removal by pairs of antisense oligonucleotides.
NL2017295B1 (en) 2016-08-05 2018-02-14 Univ Erasmus Med Ct Rotterdam Antisense oligomeric compound for Pompe disease
MX2019003070A (es) 2016-09-16 2019-10-14 Bio Path Holdings Inc Terapia de combinacion con oligonucleotidos antisentido liposomales.
KR20190065341A (ko) 2016-10-06 2019-06-11 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 올리고머 화합물들의 접합 방법
WO2018075633A2 (en) 2016-10-19 2018-04-26 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting or quantifying hepatitis c virus
JOP20190104A1 (ar) 2016-11-10 2019-05-07 Ionis Pharmaceuticals Inc مركبات وطرق لتقليل التعبير عن atxn3
WO2018094171A1 (en) 2016-11-21 2018-05-24 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting or quantifying hepatitis b virus
WO2018102745A1 (en) 2016-12-02 2018-06-07 Cold Spring Harbor Laboratory Modulation of lnc05 expression
CN117737062A (zh) 2016-12-22 2024-03-22 因特利亚治疗公司 用于治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏症的组合物及方法
US11197928B2 (en) 2017-01-13 2021-12-14 Board Of Regents, The University Of Texas System Sustained production of high affinity antigen specific antibody by high dose BAFF receptor-targeting mAb-siRNA conjugate
WO2018165564A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Morpholino modified oligomeric compounds
CA3057154A1 (en) 2017-03-24 2018-09-27 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting or quantifying parainfluenza virus
CA3056135C (en) 2017-03-25 2024-02-20 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits to detect adenovirus nucleic acids
WO2018185252A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Silence Therapeutics Gmbh Nucleic acid conjugates
WO2018185253A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Silence Therapeutics Gmbh Ligand modified double-stranded nucleic acids
EP3385272A1 (en) 2017-04-05 2018-10-10 Silence Therapeutics GmbH Further novel oligonucleotide-ligand conjugates
CN110612354A (zh) 2017-05-11 2019-12-24 简·探针公司 用于分离靶核酸的组合物和方法
EP4276201A3 (en) 2017-06-07 2024-01-17 Gen-Probe Incorporated Detecting babesia species nucleic acid in a sample
CA3068994C (en) 2017-07-10 2023-06-27 Gen-Probe Incorporated Analytical systems and methods for nucleic acid amplification using sample assigning parameters
US11859257B2 (en) 2017-08-11 2024-01-02 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting Staphylococcus aureus
CA3071033A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of the notch signaling pathway for treatment of respiratory disorders
US10517889B2 (en) 2017-09-08 2019-12-31 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulators of SMAD7 expression
CN118530993A (zh) 2017-09-29 2024-08-23 因特利亚治疗公司 用于ttr基因编辑及治疗attr淀粉样变性的组合物及方法
TWI839337B (zh) 2017-09-29 2024-04-21 美商英特利亞醫療公司 用於基因組編輯之多核苷酸、組合物及方法
CA3079157A1 (en) 2017-11-02 2019-05-09 Janssen Biopharma, Inc. Oligonucleotide constructs and uses thereof
AU2018358016A1 (en) 2017-11-03 2020-05-07 Interna Technologies B.V. MiRNA molecule, equivalent, antagomir, or source thereof for treating and/or diagnosing a condition and/or a disease associated with neuronal deficiency or for neuronal (re)generation
TWI809004B (zh) 2017-11-09 2023-07-21 美商Ionis製藥公司 用於降低snca表現之化合物及方法
EP3710595A1 (en) 2017-11-17 2020-09-23 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting c1orf43 nucleic acid
US11662281B2 (en) 2017-12-13 2023-05-30 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for biological sample processing
EP3724354A1 (en) 2017-12-15 2020-10-21 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting toxigenic clostridium difficile
WO2019126641A2 (en) 2017-12-21 2019-06-27 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of frataxin expression
MX2020007369A (es) 2018-01-15 2020-10-28 Ionis Pharmaceuticals Inc Moduladores de la expresion de dnm2.
WO2019147743A1 (en) 2018-01-26 2019-08-01 Massachusetts Institute Of Technology Structure-guided chemical modification of guide rna and its applications
JP2021512303A (ja) 2018-01-29 2021-05-13 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド 分析システムおよび方法
EP3752164A1 (en) 2018-02-12 2020-12-23 InteRNA Technologies B.V. Anticancer microrna and lipid formulations thereof
TWI840345B (zh) 2018-03-02 2024-05-01 美商Ionis製藥公司 Irf4表現之調節劑
US11732260B2 (en) 2018-03-02 2023-08-22 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for the modulation of amyloid-β precursor protein
US11661601B2 (en) 2018-03-22 2023-05-30 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods for modulating FMR1 expression
EP3549610A1 (en) 2018-04-05 2019-10-09 Silence Therapeutics GmbH Nucleic acid conjugates
CA3094020A1 (en) 2018-04-11 2019-10-17 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulators of ezh2 expression
JOP20200280A1 (ar) 2018-05-09 2020-11-05 Ionis Pharmaceuticals Inc مركبات وطرق لتقليل التعبير الوراثي عن fxi
KR20210008497A (ko) 2018-05-09 2021-01-22 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 Atxn3 발현 감소용 화합물 및 방법
GB2590210B (en) 2018-06-13 2023-01-25 Gen Probe Inc Compositions and methods for detecting group B Streptococcus nucleic acid
AU2019287635A1 (en) 2018-06-14 2020-12-17 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for increasing STMN2 expression
TWI833770B (zh) 2018-06-27 2024-03-01 美商Ionis製藥公司 用於減少 lrrk2 表現之化合物及方法
US20210317515A1 (en) 2018-07-10 2021-10-14 Gen-Probe Incorporated Methods and systems for detecting and quantifying nucleic acids
AU2019310097A1 (en) 2018-07-25 2021-02-04 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for reducing ATXN2 expression
EP3830267A1 (en) 2018-07-31 2021-06-09 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for hydroxyacid oxidase 1 (hao1) gene editing for treating primary hyperoxaluria type 1 (ph1)
CA3106975A1 (en) 2018-08-01 2020-02-06 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting nucleic acids of epstein-barr virus
US20210310059A1 (en) 2018-08-08 2021-10-07 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for detecting mycoplasma genitalium
EP3833762A4 (en) 2018-08-09 2022-09-28 Verseau Therapeutics, Inc. OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS FOR TARGETING CCR2 AND CSF1R AND THEIR USES
WO2020041414A1 (en) 2018-08-21 2020-02-27 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for amplifying, detecting or quantifying human cytomegalovirus
JP7389111B2 (ja) 2018-08-24 2023-11-29 ジェン－プローブ・インコーポレーテッド 細菌の核酸を検出し、細菌性膣炎を診断するための組成物および方法
WO2020069085A2 (en) 2018-09-27 2020-04-02 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting bordetella pertussis and bordetella parapertussis nucleic acid
AU2019347517A1 (en) 2018-09-28 2021-05-06 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for lactate dehydrogenase (LDHA) gene editing
BR112021007025A2 (pt) 2018-10-16 2021-08-03 Intellia Therapeutics, Inc. composições e métodos para imunoterapia
MA53919A (fr) 2018-10-18 2021-08-25 Intellia Therapeutics Inc Constructions d'acides nucléiques et procédés d'utilisation
TW202027798A (zh) 2018-10-18 2020-08-01 美商英特利亞醫療公司 用於從白蛋白基因座表現轉殖基因的組成物及方法
BR112021007301A2 (pt) 2018-10-18 2021-07-27 Intellia Therapeutics, Inc. composições e métodos para expressar fator ix
MX2021004276A (es) 2018-10-18 2021-09-08 Intellia Therapeutics Inc Composiciones y metodos para tratar deficiencia de alfa-1 antitripsina.
CN113195743A (zh) 2018-10-22 2021-07-30 简·探针公司 扩增，检测或定量人类多瘤病毒bk病毒的组合物和方法
TW202028222A (zh) 2018-11-14 2020-08-01 美商Ionis製藥公司 Foxp3表現之調節劑
CN113646430A (zh) 2018-11-15 2021-11-12 Ionis制药公司 Irf5表达的调节剂
TW202030333A (zh) 2018-12-20 2020-08-16 美商簡 探針公司 用於檢測瘧原蟲物種核酸之組成物及方法
JP2022519532A (ja) 2019-01-31 2022-03-24 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド Ｙａｐ１発現のモジュレーター
MX2021010152A (es) 2019-02-27 2021-09-14 Ionis Pharmaceuticals Inc Moduladores de la expresion de malat1.
US20220098647A1 (en) 2019-03-22 2022-03-31 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Detecting Group A Streptococcus
CN113874076A (zh) 2019-03-28 2021-12-31 因特利亚治疗公司 包括ttr向导rna和对rna引导的dna结合剂进行编码的多核苷酸的组合物和方法
AU2020248337A1 (en) 2019-03-28 2021-11-04 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for ttr gene editing and treating ATTR amyloidosis comprising a corticosteroid or use thereof
SG11202110135YA (en) 2019-03-28 2021-10-28 Intellia Therapeutics Inc Polynucleotides, compositions, and methods for polypeptide expression
MX2021011916A (es) 2019-03-29 2021-10-26 Ionis Pharmaceuticals Inc Compuestos y metodos para modular ube3a-ats.
CN118125057A (zh) 2019-05-03 2024-06-04 简·探针公司 用于分析系统的容器输送系统
US20220307093A1 (en) 2019-07-03 2022-09-29 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotides for use in determining the presence of trichomonas vaginalis in a sample
WO2021021673A1 (en) 2019-07-26 2021-02-04 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating gfap
CN114555621A (zh) 2019-08-15 2022-05-27 Ionis制药公司 键修饰的寡聚化合物及其用途
US20220298548A1 (en) 2019-08-23 2022-09-22 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for detecting treponema pallidum
TW202118873A (zh) 2019-08-27 2021-05-16 美商維泰克斯製藥公司 用於治療與重複性ｄｎａ有關之病症之組合物及方法
WO2021046270A1 (en) 2019-09-05 2021-03-11 Gen-Probe Incorporated Detection of chlamydia trachomatis nucleic acid variants
US20220396786A1 (en) 2019-11-14 2022-12-15 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Capturing Target Nucleic Acids
SG10201914033YA (en) 2019-12-31 2021-07-29 Wilmar International Ltd Polypeptides with Lipase Activity and Uses Thereof
JP2023510395A (ja) 2020-01-16 2023-03-13 ディーエヌエイイー ダイアグノスティックス リミテッド 標的ポリヌクレオチドを単離するための組成物、キットおよび方法
JP2023512075A (ja) 2020-01-31 2023-03-23 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド オリゴヌクレオチドを特徴解析するための液体クロマトグラフィーおよび質量分析の使用
MX2022010602A (es) 2020-02-28 2022-09-09 Ionis Pharmaceuticals Inc Compuestos y metodos para modular smn2.
KR20230017783A (ko) 2020-04-28 2023-02-06 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. 시험관내 세포 전달 방법
AU2021264010A1 (en) 2020-05-01 2022-12-08 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating ATXN1
CN115698325A (zh) 2020-05-07 2023-02-03 盖立复诊断解决方案公司 用于检测SARS-CoV-2核酸的方法和组合物
EP3922720A1 (en) 2020-06-09 2021-12-15 Universidad de Murcia Therapy to prevent adverse cardiac remodeling following an acute myocardial infarction
IL298530A (en) 2020-06-29 2023-01-01 Ionis Pharmaceuticals Inc Compounds and methods for modulating plp1
US20230243001A1 (en) 2020-07-17 2023-08-03 Gen-Probe Incorporated Detection of Macrolide-Resistant Mycoplasma Genitalium
WO2022034555A1 (en) 2020-08-13 2022-02-17 Janssen Biopharma, Inc. Polynucleotide constructs and uses thereof
US20220096606A1 (en) 2020-09-09 2022-03-31 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and Methods for Treatment of Duchenne Muscular Dystrophy
CN116323440A (zh) 2020-10-21 2023-06-23 简·探针公司 流体容器管理系统
EP4240854A1 (en) 2020-11-06 2023-09-13 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and methods for treatment of dm1 with slucas9 and sacas9
US11447521B2 (en) 2020-11-18 2022-09-20 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating angiotensinogen expression
CR20230303A (es) 2020-12-11 2023-09-01 Intellia Therapeutics Inc Composiciones y métodos para reducir el mhc de clase ii en una célula
AU2021394998A1 (en) 2020-12-11 2023-06-29 Intellia Therapeutics, Inc. Polynucleotides, compositions, and methods for genome editing involving deamination
AR124408A1 (es) 2020-12-18 2023-03-22 Ionis Pharmaceuticals Inc Compuestos y métodos para modular el factor xii
TW202239959A (zh) 2020-12-23 2022-10-16 美商英特利亞醫療公司 用於減少細胞中hla-a之組合物及方法
AU2021410751A1 (en) 2020-12-23 2023-07-13 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for genetically modifying ciita in a cell
CN116848235A (zh) 2020-12-30 2023-10-03 因特利亚治疗公司 工程化t细胞
US20240110160A1 (en) 2021-01-15 2024-04-04 Board Of Regents, The University Of Texas System A trans-complementation system for sars-cov-2
WO2022170193A2 (en) 2021-02-08 2022-08-11 Intellia Therapeutics, Inc. T-cell immunoglobulin and mucin domain 3 (tim3) compositions and methods for immunotherapy
JP2024505678A (ja) 2021-02-08 2024-02-07 インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド 免疫療法のためのリンパ球活性化遺伝子３（ｌａｇ３）組成物及び方法
WO2022170172A1 (en) 2021-02-08 2022-08-11 Intellia Therapeutics, Inc. Natural killer cell receptor 2b4 compositions and methods for immunotherapy
EP4298221A1 (en) 2021-02-26 2024-01-03 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and methods for treatment of myotonic dystrophy type 1 with crispr/slucas9
TW202302848A (zh) 2021-02-26 2023-01-16 美商維泰克斯製藥公司 以crispr/sacas9治療第1型肌強直性營養不良之組合物及方法
AU2022237386A1 (en) 2021-03-15 2023-10-05 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for biological sample processing
US20240165271A1 (en) 2021-03-26 2024-05-23 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Nucleotide editing to reframe dmd transcripts by base editing and prime editing
WO2022229851A1 (en) 2021-04-26 2022-11-03 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for using slucas9 scaffold sequences
WO2022234519A1 (en) 2021-05-05 2022-11-10 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for using sacas9 scaffold sequences
BR112023026050A2 (pt) 2021-06-18 2024-03-05 Ionis Pharmaceuticals Inc Compostos e métodos para reduzir expressão de ifnar1
KR20240038705A (ko) 2021-06-22 2024-03-25 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. 간 유전자의 생체 내 편집 방법
GB202110485D0 (en) 2021-07-21 2021-09-01 Dnae Diagnostics Ltd Compositions, kits and methods for sequencing target polynucleotides
JP2024526921A (ja) 2021-07-21 2024-07-19 ディーエヌエイイー ダイアグノスティックス リミテッド 標的ポリヌクレオチドを配列決定するための組成物、キット及び方法
GB202110479D0 (en) 2021-07-21 2021-09-01 Dnae Diagnostics Ltd Compositions, kits and methods for sequencing target polynucleotides
AU2022319876A1 (en) 2021-07-27 2024-01-18 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting gastrointestinal pathogens
WO2023018637A1 (en) 2021-08-09 2023-02-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Gene editing of regulatory elements
JP2024534114A (ja) 2021-08-24 2024-09-18 インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド 細胞療法用のプログラム細胞死タンパク質１（ｐｄ１）組成物及び方法
WO2023039444A2 (en) 2021-09-08 2023-03-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Precise excisions of portions of exon 51 for treatment of duchenne muscular dystrophy
US20230193406A1 (en) 2021-09-22 2023-06-22 Herbalife International Of America, Inc. Methods and compositions for processing botanical materials
MX2024005242A (es) 2021-11-03 2024-07-02 Intellia Therapeutics Inc Polinucleotidos, composiciones y metodos para la edicion del genoma.
CN118369110A (zh) 2021-11-03 2024-07-19 英特利亚治疗股份有限公司 用于免疫疗法的cd38组合物和方法
WO2023172926A1 (en) 2022-03-08 2023-09-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Precise excisions of portions of exons for treatment of duchenne muscular dystrophy
WO2023172927A1 (en) 2022-03-08 2023-09-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Precise excisions of portions of exon 44, 50, and 53 for treatment of duchenne muscular dystrophy
WO2023185697A2 (en) 2022-03-29 2023-10-05 Accuredit Therapeutics (Suzhou) Co., Ltd. Compositions and methods for treatment of transthyretin amyloidosis
TW202405173A (zh) 2022-04-18 2024-02-01 美商維泰克斯製藥公司 用於增強aav療法及降低aav向肝臟之趨性的組合物及方法
WO2023205148A1 (en) 2022-04-19 2023-10-26 Intellia Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor compositions and uses
WO2023245113A1 (en) 2022-06-16 2023-12-21 Intellia Therapeutics, Inc. Methods and compositions for genetically modifying a cell
TW202409271A (zh) 2022-06-16 2024-03-01 美商英特利亞醫療公司 用於減少細胞中之ｍｈｃ １類之組成物及方法
TW202413631A (zh) 2022-06-16 2024-04-01 美商英特利亞醫療公司 用於基因體編輯之組成物及方法
WO2024006955A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Intellia Therapeutics, Inc. Engineered t cells
WO2024020352A1 (en) 2022-07-18 2024-01-25 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Tandem guide rnas (tg-rnas) and their use in genome editing
WO2024026474A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for transferrin receptor (tfr)-mediated delivery to the brain and muscle
EP4311579A1 (en) 2022-07-29 2024-01-31 Association Française contre les Myopathies B cell-specific mab-sirna conjugates improve myasthenia
WO2024035952A1 (en) 2022-08-12 2024-02-15 Remix Therapeutics Inc. Methods and compositions for modulating splicing at alternative splice sites
WO2024054924A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Gen-Probe Incorporated Method of detecting nucleic acid analytes using dual-specificity primers
WO2024061296A2 (en) 2022-09-22 2024-03-28 Accuredit Therapeutics (Suzhou) Co., Ltd. Compositions and methods for treatment of hypercholesterolemia and/or cardiovascular disease
WO2024098002A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Calcium voltage-gated channel auxiliary subunit gamma 1 (cacng1) binding proteins and cacng1-mediated delivery to skeletal muscle
WO2024102677A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions
WO2024107765A2 (en) 2022-11-14 2024-05-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for fibroblast growth factor receptor 3-mediated delivery to astrocytes
WO2024137766A2 (en) 2022-12-21 2024-06-27 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for proprotein convertase subtilisin kexin 9 (pcsk9) editing
WO2024138189A2 (en) 2022-12-22 2024-06-27 Intellia Therapeutics, Inc. Methods for analyzing nucleic acid cargos of lipid nucleic acid assemblies
WO2024138115A1 (en) 2022-12-23 2024-06-27 Intellia Theraperutics, Inc. Systems and methods for genomic editing
WO2024161179A1 (en) 2023-01-31 2024-08-08 Mobidiag Oy Compositions and methods for detecting stx nucleic acids
WO2024168010A2 (en) 2023-02-09 2024-08-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Reversir molecules and methods of use thereof
WO2024186890A1 (en) 2023-03-06 2024-09-12 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for hepatitis b virus (hbv) genome editing
WO2024186971A1 (en) 2023-03-07 2024-09-12 Intellia Therapeutics, Inc. Cish compositions and methods for immunotherapy

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1340645C (en) * 1987-04-17 1999-07-13 Victor E. Marquez Acid stable dideoxynucleosides active against the cytopathic effects of human immunodeficiency virus
IL90359A0 (en) * 1988-05-26 1989-12-15 University Patents Inc Nucleoside and polynucleotide thiophosphoramidite and phosphorodithioate compounds and their production
US5216141A (en) * 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
JPH0231686A (ja) * 1988-07-22 1990-02-01 Yuki Gosei Kogyo Co Ltd トリフルオロチミジンの製造方法
JPH0725785B2 (ja) * 1989-01-11 1995-03-22 日本臓器製薬株式会社 アデノシン誘導体及び該化合物を有効成分として含有する医薬組成物
FR2642074B1 (fr) * 1989-01-20 1994-04-29 Oris Ind Derives de molecules polyhydroxylees permettant l'introduction d'au moins une ramification dans un oligonucleotide
GB8920534D0 (en) * 1989-09-11 1989-10-25 Wellcome Found Antiviral compounds
US5378825A (en) * 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
PT98562B (pt) * 1990-08-03 1999-01-29 Sanofi Sa Processo para a preparacao de composicoes que compreendem sequencias de nucleo-sidos com cerca de 6 a cerca de 200 bases resistentes a nucleases
EP0549686A4 (en) * 1990-09-20 1995-01-18 Gilead Sciences Inc Modified internucleoside linkages
EP0616612A4 (en) * 1991-12-12 1995-01-11 Gilead Sciences Inc NUCLEASE-STABLE OLIGOMERS SUITABLE FOR BINDING AND METHODS OF USE.
KR930016437A (ko) * 1992-01-22 1993-08-26 귀틀라인, 슈미트 올리고뉴클레오티드 유사체, 이의 제조방법 및 용도
AU678968B2 (en) * 1992-05-29 1997-06-19 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
KR0156945B1 (ko) 1998-10-15
IE921850A1 (en) 1992-12-02
KR0155574B1 (ko) 1998-10-15
EP1004593A3 (en) 2000-07-19
DE69230935T2 (de) 2000-10-19
NO934180D0 (no) 1993-11-18
JPH06504067A (ja) 1994-05-12
WO1992020822A1 (en) 1992-11-26
FI935114A (fi) 1993-12-30
US5378825A (en) 1995-01-03
EP0586570B1 (en) 2000-09-13
HUT66378A (en) 1994-11-28
JP2711180B2 (ja) 1998-02-10
FI935113A0 (fi) 1993-11-18
DE69230935D1 (de) 2000-05-25
JPH06503838A (ja) 1994-04-28
NO934179L (no) 1994-01-12
EP0586520A1 (en) 1994-03-16
EP1004593A2 (en) 2000-05-31
FI113870B (fi) 2004-06-30
CA2103464A1 (en) 1992-11-22
AU666121B2 (en) 1996-02-01
EP0586570A1 (en) 1994-03-16
NO934180L (no) 1994-01-11
AU2150292A (en) 1992-12-30
AU1998692A (en) 1992-12-30
AU662538B2 (en) 1995-09-07
BR9206026A (pt) 1994-12-27
ATE191933T1 (de) 2000-05-15
ATE196321T1 (de) 2000-09-15
NO934179D0 (no) 1993-11-18
IE921849A1 (en) 1992-12-02
HU9303290D0 (en) 1994-03-28
EP0586520B1 (en) 2000-04-19
DE69231441D1 (de) 2000-10-19
EP0586520A4 (en) 1996-01-10
EP0586570A4 (en) 1996-01-24
JP2625257B2 (ja) 1997-07-02
WO1992020823A1 (en) 1992-11-26
FI935113A (fi) 1994-01-03
DE69231441T2 (de) 2001-03-22
BR9206027A (pt) 1994-12-27
NO308703B1 (no) 2000-10-16
HUT65941A (en) 1994-08-29
HU9303289D0 (en) 1994-03-28
CA2103378A1 (en) 1992-11-22
FI935114A0 (fi) 1993-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU221806B1 (hu) Vázon módosított oligonukleotid analógok
US5602240A (en) Backbone modified oligonucleotide analogs
US5777092A (en) Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5965721A (en) Backbone modified oligonucleotide analogues
US6087482A (en) Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5677437A (en) Heteroatomic oligonucleoside linkages
US6025482A (en) Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling
US5541307A (en) Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
IE83315B1 (en) Backbone modified oligonucleotide analogs
US20020183502A1 (en) Backbone-modified oligonucleotide analogs and methods for using same
EP0649429B1 (en) Heteroatomic oligonucleoside linkages
WO1994022886A9 (en) Heteroatomic oligonucleoside linkages
WO1994022886A1 (en) Heteroatomic oligonucleoside linkages

Legal Events

Date Code Title Description
DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: ISIS PHARMACEUTICALS INC., US

Owner name: NOVARTIS AG., CH

DGB9 Succession in title of applicant

Owner name: NOVARTIS AG., CH

HFG4 Patent granted, date of granting

Effective date: 20021107