CN118369110A - 用于免疫疗法的cd38组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

提供用于在CD38基因内编辑，例如改变DNA序列的组合物和方法。提供用于免疫疗法的组合物和方法。

Description

用于免疫疗法的CD38组合物和方法
相关申请的交互参照
本申请要求2021年11月3日提交的美国临时申请号63/275,431的权益，其公开内容以引用方式全部并入本文。
背景技术
环状ADP核糖水解酶(CD38)为一种在某些免疫细胞表面上表达的胞外酶，已用作鉴定T细胞和淋巴细胞活化的生物标志物。它合成第二信使环状腺苷5'-二磷酸-核糖(cADP-核糖)和烟碱酰胺二核苷酸(NAD+)。NAD+为葡萄糖诱导的胰岛素分泌的第二信使。腺苷可由NAD+合成，并且腺苷与免疫抑制以及多发性骨髓瘤和肺癌的免疫调节有关。这些发现促使人们猜测CD38可能起到免疫检查点分子的作用。此外，CD38与衰老和年龄相关功能障碍、对微生物感染的反应以及过度炎性病症有关。此外，CD38调控抗肿瘤T细胞耗竭。
CD38在免疫细胞上表达，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、循环单核细胞、树突细胞、粒细胞、浆细胞、静息和循环NK细胞、嗜中性粒细胞和粒细胞。CD38也可用作这些细胞上的受体，并且此功能可活化免疫细胞，并且为这些细胞增殖所必需的。在T细胞表面上，CD38与其配体CD31相互作用，并引发与T细胞受体(TCR)/CD3活化重叠的下游效应。
CD38与若干种血液恶性肿瘤相关，在肿瘤微环境中在免疫抑制上发挥作用。例如，慢性淋巴细胞性白血病CD38+克隆已显示与CD38-克隆相比具有生存优势。CD38通常在积聚于骨髓中的多发性骨髓瘤浆细胞中过度表达，并通过上调PI3K/AKT/mTOR途径参与代谢重编程和细胞增殖。
发明内容
在某些方面，本文提供与使用CRISPR/Cas系统制备在CD38基因序列中具有基因修饰(例如，插入、缺失、取代)的工程化细胞以及制备在CD38基因序列中具有基因修饰(例如，减少或消除细胞对CD38的表达的修饰)的细胞相关的组合物和方法，以及这些细胞在各种方法中的用途，包括但不限于用于癌症(例如，表达CD38的癌症)的过继细胞转移疗法。
在一些实施方案中，本文所提供的工程化细胞为基因修饰的T细胞或自然杀伤(NK)细胞。在某些实施方案中，工程化细胞为已被修饰以表达嵌合抗原受体(CAR)，诸如对CD38多肽有特异性的CAR(即，全长CAR蛋白或其片段，包括例如MHC呈递的CD38肽)的细胞。在某些实施方案中，工程化细胞表达重组T细胞受体(TCR)，诸如对CD38多肽有特异性的重组TCR。在一些实施方案中，工程化细胞可包含另外的基因组序列中的其他基因修饰，包括减少和/或消除TCR表达的T细胞受体(TCR)基因座，例如TRAC或TRBC基因座处的修饰；减少和/或消除一个或多个MHC I类分子的表达的基因组基因座，例如B2M和HLA-A基因座处的修饰；减少和/或消除一个或多个MHC II类分子的表达的基因组基因座，例如CIITA基因座处的修饰；和/或在一个或多个检查点抑制剂基因座，例如CD244(2B4)基因座、TIM3基因座、LAG3和PD-1基因座处的修饰。在一些实施方案中，此类细胞用于治疗受试者的癌症(例如，受试者的表达CD38的癌症)。在一些实施方案中，此类基因修饰的细胞用于组合疗法中，所述疗法还包括向受试者施用CD38靶向治疗剂，诸如CD38特异性单克隆抗体(例如，达雷木单抗、伊沙妥昔单抗(isatuximab))。
在一些实施方案中，本公开涉及细胞群，包含对其CD38基因序列和任选地本文所公开的其他基因组基因座有基因修饰的细胞。在某些实施方案中，此类细胞群可用于过继细胞(例如，T细胞、NK细胞)转移疗法中。在一些实施方案中，本公开涉及对CD38序列有基因修饰的细胞的组合物和用途，其用于疗法，例如癌症疗法和免疫疗法中。
在某些方面，本文提供一种工程化细胞，其包含人CD38序列中的基因修饰，诸如chr4:15766497-15871496的基因组坐标内的基因修饰。
还公开任何前述实施方案的细胞的组合物和/或制剂制备用于治疗受试者的药剂的用途。受试者可为人或动物(例如人或非人动物，例如食蟹猴)。在某些实施方案中，受试者为人。
在一些方面，公开了用于例如使用CRISPR/Cas系统在CD38基因序列内产生基因修饰(例如插入、取代或缺失)的任何前述组合物或制剂。在一些实施方案中，本文提供可用于细胞基因组编辑的gRNA分子、CRISPR系统、细胞和方法。在某些实施方案中，CD38基因序列内的基因修饰造成核酸序列的变化，由此例如通过形成框移或无意义突变阻止全长CD38蛋白的翻译，使得翻译提前终止。在一些实施方案中，基因修饰可包括在剪接位点即剪接受体位点或剪接供体位点处的插入、取代或缺失，使得异常剪接导致框移突变、无意义突变或截短的mRNA，从而使翻译提前终止。在一些实施方案中，基因修饰也可破坏所编码蛋白质的翻译或折叠，导致翻译提前终止。在某些实施方案中，本文所提供的组合物和方法用于在CD38序列内产生基因修饰，由此造成CD38蛋白的表达(例如，来自CD38序列的CD38蛋白的细胞表面表达)减少。
在某些方面，本文提供向受试者提供免疫疗法的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的本文所述的细胞(例如，本文所述的基因修饰的T细胞或NK细胞)。在一些实施方案中，免疫疗法用于治疗受试者的癌症。在某些实施方案中，癌症为表达CD38的癌症。在一些实施方案中，所述疗法还包括向受试者施用CD38靶向治疗剂，诸如CD38特异性单克隆抗体(例如达雷木单抗、伊沙妥昔单抗)。在某些实施方案中，细胞中CD38基因序列的修饰使得细胞对CD38靶向治疗剂(例如，另一种CD38靶向过继转移细胞和/或CD38特异性治疗剂，诸如抗CD38单克隆抗体)的靶向具有抗性。在某些实施方案中，对靶向的抗性是细胞上CD38表达减少的结果。在一些实施方案中，对靶向的抗性是所表达的CD38蛋白的修饰的结果，所述修饰消除CD38靶向治疗剂所识别的表位。
在实施方案中，免疫治疗方法包括在施用本文所述的细胞或细胞群之前进行淋巴细胞耗竭。在一些实施方案中，所述方法包括在向受试者施用有效量的如本文所述的细胞，例如任何前述细胞方面和实施方案的细胞之前，施用淋巴细胞耗竭剂或免疫抑制剂。在某些实施方案中，治疗方法包括使用本文提供的方法制备细胞(例如，细胞群)，使得它们在向受试者施用之前已减少和/或消除CD38表达。
在另一方面，本文提供一种制备用于免疫疗法的细胞(例如，细胞群，诸如T细胞或NK细胞)的方法，所述方法包括：(a)通过减少或消除CD38蛋白和任选地T细胞受体(TCR)的一种或多种或所有组分的表达来修饰细胞，例如通过将gRNA分子(如本文所述)或多于一种如本文所公开的gRNA分子引入所述细胞中来实现所述减少或消除；和(b)扩增所述细胞。本文提供的细胞适用于进一步工程化，例如，通过引入编码靶向受体的一个或多个异源序列，所述靶向受体为例如介导TCR/CD3ζ链信号传导的蛋白质。在一些实施方案中，蛋白质为选自非内源TCR或CAR序列(例如，编码对CD38多肽有特异性的TCR或CAR的序列)的靶向受体。在一些实施方案中，蛋白质为野生型或变体TCR。本文提供的细胞也可适用于进一步工程化，通过引入编码替代抗原结合部分的异源序列，例如通过引入编码替代(非内源)T细胞受体(例如嵌合抗原受体(CAR))的异源序列，所述受体被工程化以靶向特定蛋白质(例如CD38)。CAR也称为嵌合免疫受体、嵌合T细胞受体或人工T细胞受体)。
在另一方面，本文提供一种治疗受试者的方法，其包括施用通过本文所述的方法(例如，造成CD38蛋白表达减少和/或消除的方法)制备的细胞(例如，细胞群，诸如T细胞群或NK细胞群)。在一些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用另外的治疗剂。另外的治疗剂可为CD38靶向疗法，诸如抗CD38抗体(例如，达雷木单抗、伊沙妥昔单抗)、CD38的小分子抑制剂、NAD+类似物、类黄酮或包含特异性结合至CD38的嵌合抗原受体的细胞。在一些实施方案中，受试者因癌症、感染和/或衰老病症而接受治疗。癌症可为实体肿瘤或血液癌症。在一些实施方案中，癌症为表达CD38的癌症。在一些实施方案中，癌症为多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病、肺癌、前列腺癌或黑色素瘤。
在权利要求书和附图中通篇提供并描述进一步实施方案。
附图说明
图1为示出在用递送如表5所示靶向CD38的Cas9 mRNA和gRNA的LNP处理后没有CD38表面表达的NK细胞的百分比的图。
图2为示出具有或没有CD38表面表达以及具有或没有GFP表达的NK细胞的百分比的图。
图3示出在用固定剂量的BC22 mRNA和尿嘧啶糖苷酶抑制剂(UGI)mRNA以及剂量递减的呈100聚体或91聚体形式的CD38sgRNA进行LNP处理后4天收获的T细胞的编辑频率。
图4示出在用固定剂量的BC22 mRNA和UGI mRNA以及剂量递减的呈100聚体或91聚体形式的B2M和CD38 sgRNA处理后，CD38表面受体呈阴性的CD8+T细胞的百分比。
图5A示出在用各种指导浓度编辑后通过流式细胞术评估的CD38阴性NK细胞的平均百分比。
图5B示出在用各种mRNA浓度编辑后通过流式细胞术评估的CD38阴性NK细胞的平均百分比。
图6示出在基因编辑后通过流式细胞术评估的CD38 KO的平均百分比。
具体实施方式
现将详细参考本文所公开的某些实施方案。本教示还涵盖各种替代、修改和等同方案，如本领域技术人员将理解。
在详细描述本教示之前，应当理解本公开不限于特定组合物或过程步骤，因为它们可变化。应注意，除非上下文另有清楚说明，否则如在本说明书和所附权利要求书中所使用，单数形式“一(个/种)(a/an)”和“所述(the)”包括复数个指示物。因此，举例而言，提及“一个缀合物”包括多个缀合物并且提及“一个细胞”包括多个细胞(例如细胞群)等。
数值范围包括定义范围的数字。考虑到有效数字和与测量相关的误差，测量值和可测量值被理解为近似值。在一些实施方案中，细胞群是指至少103、104、105或106个细胞，优选地107、2×107、5×107或108个细胞的群。
“包含(comprise)”、“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“含有(contain)”、“含有(contains)”、“含有(containing)”、“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(including)”的使用不意欲具有限制性。应当理解，前述一般描述和详细描述都只为示例性和解释性的，而不为对教示的限制。除非在说明书中特别注明，否则说明书中列举“包含”各种组分的实施方案也被认为是“由所列举组分组成”或“基本上由所列举组分组成”；说明书中列举“由各种组分组成”的实施方案也被认为是“包含”所列举组分或“基本上由所列举组分组成”；并且说明书中列举“基本上由各种组分组成”的实施方案也被认为是“由所列举组分组成”或“包含”所列举组分(此互换性不适用于这些术语在权利要求书中的使用)。
除非上下文另有明确说明，否则术语“或”在说明书中的使用具有包容性，即等同于“和/或”。
术语“约”在列表前使用时限定列表中的各成员。术语“约”应理解为涵盖本领域内的容许变化或误差，例如，相对于平均值或用于进行测量的方法的灵敏度有2个标准偏差。当“约”出现在系列中的第一个值之前时，其可理解为限定系列中的各值。
范围应理解为包括范围末尾的数值以及其间的所有逻辑值。举例而言，5-10个核苷酸应理解为5、6、7、8、9或10个核苷酸，而5-10％应理解为包含5％和10％以及其间所有可能的值。
20个核苷酸的序列中的至少17个核苷酸应理解为包括所提供序列中的17、18、19或20个核苷酸，即使没有特别提供，也提供上限，如将被清楚地理解一般。类似地，至多3个核苷酸将理解为涵盖0、1、2或3个核苷酸，即使没有特别提供，也提供下限。当“至少”、“至多”或其他类似语言修饰数字时，可理解为限定系列中的各数字。
如本文所用，“不超过”或“小于”被理解为与短语相邻的值和从上下文来看为合乎逻辑的逻辑较低值或整数直至零。例如，“不超过2个核苷酸碱基对”的双链区具有2、1或0个核苷酸碱基对。当“不超过”或“小于”出现在一系列数字或范围之前时，应理解所述系列或范围中的各数字被限定。
如本文所用，范围包括上限和下限。
如果申请中的序列与指定的登录号或登录号中的位置发生冲突，则以申请中的序列为准。
如果化学名称与结构之间发生冲突，则以结构为准。
如本文所用，“检测分析物”等应理解为执行其中可检测到分析物(如果存在)的测定，其中分析物以高于测定的检测水平的量存在。
如本文所用，应理解当值的最大量由100％(例如，100％抑制或100％封装)表示时，所述值受检测方法的限制。举例而言，100％抑制应理解为抑制到低于测定的检测水平的水平，并且100％封装应理解为在囊泡外检测不到旨在封装的材料。
如本文所用，“消除”应理解为意指将水平降低至低于测定的检测阈值。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，并且不应被解释为以任何方式限制所需主题。如果以引用方式并入的任何材料与本说明书中定义的任何术语或本说明书的任何其他明确内容相矛盾，则以本说明书为准。
定义
除非另有说明，否则本文中使用的以下术语和短语意欲具有以下含义：
“多核苷酸”和“核酸”在本文中用于指包含核苷或核苷类似物的多聚体化合物，其具有沿主链连接在一起的含氮杂环碱基或碱基类似物，包括常规RNA、DNA、混合RNA-DNA和作为其类似物的聚合物。核酸“主链”可由多种键联组成，包括以下中的一者或多者：糖-磷酸二酯键联、肽-核酸键(“肽核酸”或PNA；PCT号WO 95/32305)、硫代磷酸酯键联、甲基膦酸酯键联或其组合。核酸的糖部分可为核糖、脱氧核糖或具有取代(例如2'甲氧基或2'卤化物取代)的类似化合物。RNA可包含一个或多个脱氧核糖核苷酸，例如作为修饰，并且类似地，DNA可包含一个或多个核糖核苷酸。含氮碱基可为常规碱基(A、G、C、T、U)、其类似物(例如，修饰的尿苷，如5-甲氧基尿苷、假尿苷或N1-甲基假尿苷等)；肌苷；嘌呤或嘧啶的衍生物(例如，N4-甲基脱氧鸟苷、去氮杂-或氮杂-嘌呤、去氮杂-或氮杂-嘧啶、在位置5或6具有取代基的嘧啶碱基(例如，5-甲基胞嘧啶)、在位置2、6或8具有取代基的嘌呤碱基、2-氨基-6-甲基氨基嘌呤、O6-甲基鸟嘌呤、4-硫代嘧啶、4-氨基嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶和O4-烷基嘧啶；美国专利号5,378,825和PCT号WO 93/13121)。对于一般性讨论，参见The Biochemistry of theNucleic Acids 5-36，Adams等人编，第11版，1992)。核酸可包含一个或多个“无碱基”残基，其中主链不包含针对聚合物位置的含氮碱基(美国专利号5,585,481)。核酸可仅包含常规RNA或DNA糖、碱基和键联，或可包括常规组分和取代两者(例如，具有2'甲氧基取代基的常规核苷，或含有常规核苷和一种或多种核苷类似物的聚合物)。核酸包括“锁核酸”(LNA)和含有一个或多个LNA核苷酸单体的类似物，所述一个或多个LNA核苷酸单体具有模拟糖构象的锁定于RNA中的双环呋喃糖单元，其增强对互补RNA和DNA序列的杂交亲和力(Vester和Wengel，2004，Biochemistry 43(42):13233-41)。RNA和DNA具有不同糖部分，并且可因RNA中尿嘧啶或其类似物的存在和DNA中胸腺嘧啶或其类似物的存在而不同。
“指导RNA”、“gRNA”和简称“指导物”在本文中可互换使用，是指例如单指导RNA或crRNA与trRNA的组合(也称为tracrRNA)。crRNA与trRNA可缔合为单个RNA分子(单指导RNA，sgRNA)，或者，例如，在两个分开RNA链(双指导RNA，dgRNA)中。“指导RNA”或“gRNA”是指各类型。trRNA可为天然存在的序列或具有修饰或变化的trRNA序列。
如本文所用，“指导序列”是指指导RNA内的序列，所述序列与靶序列互补并起到通过RNA指导DNA结合剂将指导RNA引导至靶序列以进行结合或修饰(例如裂解)的作用。“指导序列”也可称为“靶向序列”或“间隔序列”。指导序列的长度可为20个碱基对，例如，在化脓性链球菌(即Spy Cas9)和相关Cas9同源物/异种同源物的情况下。也可使用更短或更长的序列作为指导物，例如长度为15、16、17、18、19、21、22、23、24或25个核苷酸。例如，在一些实施方案中，指导序列包含选自SEQ ID NO:1-88的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸。在一些实施方案中，靶序列例如在基因中或在染色体上，并且与指导序列互补。在一些实施方案中，指导序列与其相应靶序列之间的互补性或同一性程度为至少75％、80％、85％、90％、95％或100％。例如，在一些实施方案中，指导序列包含与选自SEQ ID NO:1–88的序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸具有至少75％、80％、85％、90％、95％或100％同一性的序列。在一些实施方案中，指导序列与靶区域可为100％互补或相同的。在其他实施方案中，指导序列与靶区域可含有至少一个错配，即不相同或不互补的一个核苷酸，这取决于参考序列。例如，指导序列和靶序列可含有1、2、3或4个错配，其中靶序列的总长度为17、18、19、20或更多个核苷酸。在一些实施方案中，指导序列和靶区域可含有1-4个错配，其中指导序列包含至少17、18、19、20或更多个核苷酸。在一些实施方案中，指导序列和靶区域可含有1、2、3或4个错配，其中指导序列包含20个核苷酸。换言之，指导序列与靶区域可形成具有17、18、19、20或更多个碱基对的双链体区域。在某些实施方案中，双链体区域可包含1、2、3或4个错配，使得指导链与靶序列不完全互补。例如，指导链与靶序列可在20个核苷酸的区域上互补，包含2个错配，使得指导序列与靶序列90％互补，提供20个碱基对中的18个碱基对的双链体区域。
RNA指导的DNA结合剂的靶序列包括基因组DNA的正链与负链(即给测序列和所述序列的反向互补序列)两者，因为RNA指导的DNA结合剂的核酸底物为双链核酸。因此，当指导序列被称为“与靶序列互补”时，应当理解指导序列可引导指导RNA结合至靶序列的有义链或反义链(例如反向互补序列)。因此，在一些实施方案中，在指导序列结合靶序列的反向互补序列的情况下，指导序列与靶序列(例如，不包括PAM的靶序列)的某些核苷酸相同，除了在指导序列中用U取代T以外。除非另有说明，否则本文提供的指导RNA序列中使用大写字母标识的核苷酸为具有2'-OH的RNA核苷酸。
如本文所用，“RNA指导的DNA结合剂”意指具有RNA和DNA结合活性的多肽或多肽复合物，或此种复合物的DNA结合亚基，其中DNA结合活性为序列特异性的并且取决于RNA的序列。示例性RNA指导的DNA结合剂包括Cas裂解酶/切口酶和其失活形式(“dCas DNA结合剂”)。如本文所用，“Cas核酸酶”包括Cas裂解酶、Cas切口酶和dCas DNA结合剂。dCas DNA结合剂可为包含非功能性核酸酶结构域(RuvC或HNH结构域)的死核酸酶。在一些实施方案中，Cas裂解酶或Cas切口酶包括被修饰以允许例如经由与FokI结构域融合而进行DNA裂解的dCas DNA结合剂。Cas裂解酶/切口酶和dCas DNA结合剂包括III型CRISPR系统的Csm或Cmr复合物、其Cas10、Csm1或Cmr2亚基、I型CRISPR系统的级联复合物、其Cas3亚基和2类Cas核酸酶。如本文所用，“2类Cas核酸酶”为具有RNA指导的DNA结合活性的单链多肽。2类Cas核酸酶包括2类Cas裂解酶/切口酶(例如，H840A、D10A或N863A变体)，其进一步具有RNA指导的DNA裂解酶或切口酶活性；以及2类dCas DNA结合剂，其中裂解酶/切口酶活性为失活的。2类Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9(例如，N497A、R661A、Q695A、Q926A变体)、HypaCas9(例如，N692A、M694A、Q695A、H698A变体)、eSPCas9(1.0)(例如，K810A、K1003A、R1060A变体)和eSPCas9(1.1)(例如，K848A、K1003A、R1060A变体)蛋白质和其修饰。Cpf1蛋白(Zetsche等人.，Cell，163:1-13(2015))与Cas9同源，并且含有RuvC样核酸酶结构域。Zetsche的Cpf1序列以引用方式全部并入。参见，例如，Zetsche，表S1和S3。参见，例如，Makarova等人，Nat Rev Microbiol，13(11):722-36(2015)；Shmakov等人，Molecular Cell，60:385-397(2015)。
如本文所用，术语“编辑器”是指包含能够在DNA序列内进行修饰的多肽的剂。在一些实施方案中，编辑器为裂解酶，诸如Cas9裂解酶。在一些实施方案中，编辑器能够使DNA分子内的碱基脱氨。在一些实施方案中，编辑器能够使DNA中的胞嘧啶(C)脱氨。在一些实施方案中，编辑器为融合蛋白，其包含与胞苷脱氨酶融合的RNA指导的切口酶。在一些实施方案中，编辑器为融合蛋白，其包含与APOBEC3A脱氨酶(A3A)融合的RNA指导的切口酶。在一些实施方案中，编辑器包含与APOBEC3A脱氨酶(A3A)融合的Cas9切口酶。在一些实施方案中，编辑器为融合蛋白，其包含与胞苷脱氨酶和尿嘧啶糖苷酶抑制剂(UGI)融合的RNA指导的切口酶。在一些实施方案中，编辑器缺乏UGI。
如本文所用，“胞苷脱氨酶”意指能够具有胞苷脱氨酶活性的多肽或多肽复合物；其催化胞苷或脱氧胞苷的水解脱氨，通常产生尿苷或脱氧尿苷。胞苷脱氨酶包括胞苷脱氨酶超家族中的酶，并且特别是APOBEC家族的酶(APOBEC1、APOBEC2、APOBEC4和APOBEC3酶亚组)、活化诱导的胞苷脱氨酶(AID或AICDA)和CMP脱氨酶(参见，例如Conticello等人，Mol.Biol.Evol.22:367-77，2005；Conticello，Genome Biol.9:229，2008；Muramatsu等人，J.Biol.Chem.274:18470-6，1999)；Carrington等人，Cells 9:1690(2020))。
如本文所用，术语“APOBEC3”是指APOBEC3蛋白，诸如由人APOBEC3基因座的七个基因(A3A-A3H)中的任一者表达的APOBEC3蛋白。APOBEC3可具有催化DNA或RNA编辑活性。已对APOBEC3A的氨基酸序列进行描述(UniPROT登录ID：p31941)。在一些实施方案中，APOBEC3蛋白为哺乳动物(例如，人)野生型APOBEC3蛋白或变体蛋白。变体包括具有与野生型APOBEC3蛋白相差一个或若干个突变(即取代、缺失、插入)诸如一个或多个单点取代的序列的蛋白质。例如，可使用缩短的APOBEC3序列，例如通过缺失若干个N端或C端氨基酸，优选地在所述序列的C端处的一至四个氨基酸。如本文所用，术语“变体”是指与APOBEC3参考序列同源的等位基因变体、剪接变体以及天然或人工突变体。变体为“功能性的”，因为它显示出DNA或RNA编辑的催化活性。在一些实施方案中，APOBEC3(诸如人APOBEC3A)具有野生型氨基酸位置57(如在野生型序列中编号的)。在一些实施方案中，APOBEC3(诸如人APOBEC3A)在氨基酸位置57(如在野生型序列中编号的)处具有天冬酰氨酸。
如本文所用，“切口酶”为在双链DNA中制造单链断裂(也称为“切口”)，即切割DNA双螺旋的一链但不切割另一链的酶。如本文所用，“RNA指导的DNA切口酶”意指具有DNA切口酶活性的多肽或多肽复合物，其中DNA切口酶活性为序列特异性的并且取决于RNA的序列。示例性RNA指导的DNA切口酶包括Cas切口酶。Cas切口酶包括以下切口酶形式：III型CRISPR系统的Csm或Cmr复合物、其Cas10、Csm1或Cmr2亚基、I型CRISPR系统的级联复合物、其Cas3亚基和2类Cas核酸酶。2类Cas切口酶包括两个催化结构域中仅一个被灭活的变体，它们具有RNA指导的DNA切口酶活性。2类Cas切口酶包括例如Cas9(例如，SpyCas9的H840A、D10A或N863A变体)、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9(例如，N497A、R661A、Q695A、Q926A变体)、HypaCas9(例如，N692A、M694A、Q695A、H698A变体)、eSPCas9(1.0)(例如，K810A、K1003A、R1060A变体)和eSPCas9(1.1)(例如，K848A、K1003A、R1060A变体)蛋白质和其修饰。Cpf1蛋白(Zetsche等人，Cell，163:1-13(2015))与Cas9同源，并且含有RuvC样蛋白质结构域。Zetsche的Cpf1序列以引用方式全部并入。参见，例如，Zetsche，表S1和S3。“Cas9”涵盖化脓性链球菌(Spy)Cas9、本文所列Cas9的变体和其等同物。参见，例如Makarova等人，Nat RevMicrobiol，13(11):722-36(2015)；Shmakov等人，Molecular Cell，60:385-397(2015)。
如本文所用，术语“融合蛋白”是指包含来自至少两种不同蛋白质的蛋白质结构域的杂合多肽。一种蛋白质可位于融合蛋白的氨基端(N端)部分或羧基端(C端)蛋白处，从而分别形成“氨基端融合蛋白”或“羧基端融合蛋白”。本文提供的任何蛋白质均可通过本领域中已知的任何方法产生。例如，本文提供的蛋白质可通过重组蛋白表达和纯化产生，所述方法尤其适用于包含肽接头的融合蛋白。重组蛋白的表达和纯化方法为熟知的，并且包括Green和Sambrook，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第4版，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(2012))中所述的那些方法，所述文献的全部内容以引用方式并入本文。
如本文所用，术语“接头”是指连接两个相邻分子或部分的化学基团或分子。通常，接头位于两个基团、分子或其他部分之间或两侧，并经由共价键彼此相连。在一些实施方案中，接头为一个氨基酸或多个氨基酸(例如肽或蛋白质)，诸如16个氨基酸残基的“XTEN”接头或其变体(参见，例如实施例和Schellenberger等人A recombinant pol ypeptideextends the in vivo half-life of peptides and proteins in atunablemanner.Nat.Biotechnol.27，1186-1190(2009))。在一些实施方案中，XTEN接头包含序列SGSETPGTSESATPES(SEQ ID NO:900)、SGSETPGTSESA(SEQ ID NO:901)或SGSETPGTSESATPEGGSGGS(SEQ ID NO:902)。
如本文所用，术语“尿嘧啶糖苷酶抑制剂”或“UGI”是指能够抑制尿嘧啶-DNA糖苷酶(UDG)碱基切除修复酶的蛋白质。
下文提供Cas9分子的示例性核苷酸和多肽序列。用于鉴定编码Cas9多肽序列的替代核苷酸序列(包括替代的天然存在的变体)的方法为本领域中已知的。还预期与Cas9核酸序列、氨基酸序列或编码本文提供的氨基酸序列的核酸序列中的任一者具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
Cas9的示例性开放阅读框
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Cas9的示例性氨基酸序列
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Cas9的示例性开放阅读框
AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGACAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCUAG
如本文所用，“核糖核蛋白”(RNP)或“RNP复合物”是指指导RNA连同RNA指导的DNA结合剂，例如Cas核酸酶，例如Cas裂解酶、Cas切口酶或dCas DNA结合剂(例如，Cas9)。在一些实施方案中，指导RNA将RNA指导的DNA结合剂如Cas9指导至靶序列，并且指导RNA与靶序列杂交并且所述剂结合至所述靶序列；在所述剂为裂解酶或切口酶的情况下，结合后可进行裂解或切口。
如本文所用，“靶序列”是指靶基因中与gRNA的指导序列具有互补性(即与指导序列充分互补以容许指导序列的特异性结合)的核酸序列。靶序列与指导序列的相互作用引导RNA指导的DNA结合剂以便在靶序列内结合，并可能在靶序列内产生切口或裂解(取决于剂的活性)。
如本文所用，如果第一序列与第二序列的比对表明整个第二序列的所有位置与第一序列匹配，则第一序列被认为与第二序列“相同”或具有“100％同一性”。例如，序列AAG与序列AAGA具有100％同一性，原因是由于第一序列的所有三个位置均存在匹配而无缺口，因此比对将给出100％同一性。可使用常规方法计算小于100％的同一性。例如，ACG与AAGA具有67％同一性，因为第一序列的三个位置中有两个与第二序列匹配(2/3＝67％)。RNA与DNA之间的差异(通常是尿苷交换为胸苷，反之亦然)和核苷类似物(如修饰的尿苷)的存在不会导致多核苷酸之间的同一性或互补性差异，只要相关核苷酸(如胸苷、尿苷或修饰的尿苷)具有相同互补序列(例如，对于胸苷、尿苷或修饰的尿苷全部，为腺苷；另一个实例为胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶，两者都具有鸟苷或修饰的鸟苷作为互补序列)。因此，例如，序列5'-AXG(其中X为任何修饰的尿苷，诸如假尿苷、N1-甲基假尿苷或5-甲氧基尿苷)被认为与AUG100％相同，因为两者与同一序列(5'-CAU)完全互补。示例性比对算法为本领域中熟知的Smith-Waterman和Needleman-Wunsch算法。本领域技术人员将理解选择哪一种算法和参数设置适用于待比对的给测序列对；对于具有大体上类似长度并且预期氨基酸同一性>50％或核苷酸同一性>75％的序列，EBI在www.ebi.ac.uk网络服务器上提供的Needleman-Wunsch算法界面的带有默认设置的Needleman-Wunsch算法通常为合适的。
类似地，如本文所用，当第一序列的所有核苷酸与第二序列互补而无缺口时，第一序列被认为与第二序列“完全互补”或“100％互补”。例如，序列UCU将被认为与序列AAGA完全互补，因为来自第一序列的每个核碱基皆与第二序列的核苷酸有碱基配对，而无缺口。序列UGU被认为与序列AAGA有67％互补性，因为第一序列的三个核碱基中的两个与第二序列的核碱基有碱基配对。本领域技术人员将理解，可利用具有各种参数设置的算法，以便使用例如NCBI BLAST界面(blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)或Needleman-Wunsch算法来确定任何一对序列的互补性百分比。
“mRNA”在本文中用于指代包含可翻译成多肽(即，可作为核糖体和氨基酰化tRNA的翻译底物)的开放阅读框的多核苷酸。mRNA可包含磷酸-糖主链，包括核糖残基或其类似物，例如2'-甲氧基核糖残基。在一些实施方案中，mRNA磷酸-糖主链的糖基本上由核糖残基、2'-甲氧基核糖残基或其组合组成。
可用于本文所述的指导RNA组合物和方法中的示例性指导序列示于表1和整个申请中。例如，其中表1示出可在指导RNA中使用以将RNA指导的DNA结合剂，例如核酸酶，诸如Cas核酸酶，诸如Cas9，引导至靶序列的指导序列。靶序列在表1中作为基因组坐标提供，并且包含基因组DNA的正链和负链(即给测序列和序列的反向互补序列)。在一些实施方案中，在指导序列结合靶序列的反向互补序列的情况下，指导序列与靶序列(例如，不包括PAM的靶序列)的某些核苷酸相同，除了在指导序列中用U取代T以外。
如本文所用，“插入缺失(indel)”是指由许多核苷酸组成的插入/缺失突变，这些核苷酸在靶核酸的双链断裂(DSB)位点处插入或缺失。
如本文所用，“抑制表达”等是指特定基因产物(例如蛋白质、mRNA或这两者)表达的减少。蛋白质(即基因产物)的表达可通过以下操作来测量：检测来自感兴趣的组织或细胞群的蛋白质的总细胞量，检测蛋白质作为细胞群的个体成员的表达，例如通过细胞分选以定义表达蛋白质的细胞的百分比，或检测呈聚集物形式的细胞中蛋白质的表达，例如，通过ELISA或蛋白质印迹法。表达的抑制可由基因序列例如基因组序列的基因修饰引起，使得全长基因产物或任何基因产物不再表达，例如基因的敲低。某些基因修饰可造成框移或无意义突变的引入，从而阻止全长基因产物的翻译。在剪接位点处，例如在足以靠近剪接受体位点或剪接供体位点以破坏剪接的位置处的基因修饰可阻止全长蛋白质的翻译。表达的抑制可由基因产物表达所需的基因组序列内调控序列的基因修饰引起，所述调控序列例如启动子序列、3'UTR序列，例如加帽序列、5'UTR序列，例如poly A序列。表达的抑制也可由破坏基因产物翻译所需的调控因子的表达或活性引起，例如，不产生基因产物。例如，抑制全长转录因子表达的转录因子序列的基因修饰可具有下游效应并抑制由转录因子控制的一种或多种基因产物的表达。因此，可通过基因组或mRNA序列的变化来预测表达的抑制。因此，预期造成表达抑制的突变可通过已知方法检测，包括对从感兴趣的组织或细胞群分离的mRNA进行测序。表达的抑制可确定为群中具有预定水平的蛋白质表达的细胞的百分比，即群中以至少一定水平表达感兴趣的蛋白质的细胞的百分比或数量的减少。表达的抑制也可通过确定总蛋白质水平在例如细胞或组织样品(例如活检样品)中的降低来评估。在某些实施方案中，可在流体样品例如细胞培养基或体液中评估所分泌蛋白质的表达的抑制。蛋白质可存在于体液例如血液或尿液中以允许分析蛋白质水平。在某些实施方案中，蛋白质水平可通过蛋白质活性或代谢产物在例如尿液或血液中的水平来确定。在一些实施方案中，“表达的抑制”可指代特定基因产物表达的一些损失，例如，mRNA转录量的减少或由细胞群所表达的蛋白质的量的减少。在一些实施方案中，“抑制”可指代特定基因产物(例如细胞表面处的CD38基因产物)表达的一定损失。应理解，敲低水平是相对于相同类型的受试者样品中的起始水平。例如，与组织样品(例如活检样品)相比，在来自受试者的流体样品(例如血液或尿液)中更容易进行蛋白质水平的常规监测。应理解，敲低水平是针对所分析的样品。类似地，在可获得连续组织样品(例如肝组织)的动物研究中，敲低靶标可在其他组织中表达。因此，敲低水平不一定为全身敲低水平，而是在组织、细胞类型或所采样的流体中的水平。
如本文所用，“基因修饰”为DNA水平的变化，例如由CRISPR/Cas9 gRNA和Cas9系统诱导的变化。基因修饰可包括插入、缺失或取代(即，碱序列取代，即突变)，通常在限定的序列或基因组基因座内。基因修饰改变DNA的核酸序列。基因修饰可在单个核苷酸位置处。基因修饰可在多个核苷酸处，例如2、3、4、5或更多个核苷酸，通常彼此非常接近，例如连续核苷酸。基因修饰可在编码序列中，例如外显子序列。基因修饰可在剪接位点处，即足够靠近剪接受体位点或剪接供体位点以破坏剪接。基因修饰可包括插入并非基因组基因座内源的核苷酸序列，例如插入异源开放阅读框或基因的编码序列。如本文所用，优选地，基因修饰阻止在基因组基因座的基因修饰之前具有全长蛋白质的氨基酸序列的全长蛋白质的翻译。阻止全长蛋白质或基因产物的翻译包括防止任何长度的蛋白质或基因产物的翻译。全长蛋白质的翻译可受到阻止，例如，通过导致提前终止密码子的产生的框移突变或通过无意义突变的产生。可通过破坏剪接来阻止全长蛋白质的翻译。
如本文所用，“异源编码序列”是指作为外源性来源引入细胞内的编码序列(例如，插入基因组基因座处，诸如安全港基因座，包括TCR基因座)。即，引入的编码序列至少就其插入位点而言为异源的。由此异源编码序列基因表达的多肽被称为“异源多肽”。异源编码序列可为天然存在的或工程化的，并且可为野生型或变体。异源编码序列可包含不同于编码异源多肽的序列的核苷酸序列(例如，核糖体内部进入位点)。异源编码序列可为作为野生型或变体(例如，突变体)在基因组中天然存在的编码序列。例如，虽然细胞含有感兴趣的编码序列(作为野生型或作为变体)，但相同编码序列或其变体可作为外源性来源引入，例如，用于在高度表达的基因座处表达。异源编码序列也可为非天然存在于基因组中的编码序列，或表达非天然存在于基因组中的异源多肽的编码序列。“异源编码序列”、“外源编码序列”和“转基因”可互换使用。在一些实施方案中，异源编码序列或转基因包括外源核酸序列，例如，核酸序列对于受体细胞而言不是内源的。在一些实施方案中，异源编码序列或转基因包括外源核酸序列，例如，非天然存在于受体细胞中的核酸序列。例如，异源编码序列相对于其插入位点和相对于其受体细胞可为异源的。
“安全港”基因座为基因组内的基因座，基因可插入其中而不会对细胞产生明显有害的影响。本文使用的核酸酶所靶向的安全港基因座的非限制性实例包括AAVS1(PPP1R12C)、TCR、B2M或白蛋白。在一些实施方案中，在靶向敲低的一个或多个基因座处的插入(诸如TRC基因，例如TRAC基因)对细胞有利。其他合适的安全港基因座为本领域中已知的。
如本文所用，“靶向受体”是指存在于细胞例如T细胞表面上以允许细胞结合至靶位点例如生物体中的特定细胞或组织的受体。靶向受体包括但不限于嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)和包含靶标结合物(例如，细胞表面分子或配体)的受体，其至少通过内部信号传导结构域中的跨膜结构域与靶标可操作地连接，并且能够在结合蛋白质的细胞外受体部分后活化T细胞。如本文所用，“受体”与“配体”对包括任何结合对，包括抗原与特异性结合所述抗原的抗体。
如本文所用，“嵌合抗原受体”是指细胞外靶标识别结构域，例如scFv、VHH、纳米抗体；可操作地连接至细胞内信号传导结构域，当结合靶标时活化T细胞。CAR由以下四个区域构成：靶标识别结构域、细胞外铰链区、跨膜结构域和细胞内T细胞信号传导结构域。此类受体为本领域中熟知的(参见例如WO2020092057、WO2019191114、WO2019147805、WO2018208837，其各自内容的相应部分以引用方式并入本文)。还预期经由衔接分子促进免疫细胞与靶细胞结合的反向通用CAR(参见，例如WO2019238722，其内容全部并入本文)。CAR可靶向任何靶标(例如抗原)，结合物(例如，抗体)可针对其产生，并且CAR通常针对呈现在待靶向的细胞或组织表面上的分子。
如本文所用，“治疗”是指对受试者的疾病或病症的治疗剂的任何施用或应用，并且包括抑制疾病、阻止其发展、缓解疾病的一种或多种症状、治愈疾病、预防疾病的一种或多种症状、或预防疾病的一种或多种症状的复发。治疗自体免疫或炎症反应或病症可包含减轻与特定病症相关的炎症，从而导致疾病特异性症状的减轻。用本文所述的工程化T细胞进行的治疗可在另外的治疗剂之前、之后使用或与另外的治疗剂组合使用，例如，用于待治疗的适应症的护理标准。
人野生型CD38序列可在以下处获得：NCBI Gene ID:952(www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/952，在提交本申请的日期时可用的版本)；Ensembl:ENSG00000004468，chr4:15,778,275-15,853,232。分化簇38(CD38)蛋白为II型跨膜糖蛋白，其合成并水解环状腺苷5'-二磷酸-核糖。CD38基因含有8个外显子。ADP-核苷基环化酶/环状ADP-核糖水解酶和外烟碱酰胺腺嘌呤二核苷酸糖水解酶为CD38的基因同义词。CD38提高气道收缩高反应性并且在哮喘患者的肺中为增加的，从而放大那些患者的气道平滑肌的炎症反应
如本文所用，“T细胞受体”或“TCR”是指T细胞中的受体。一般而言，TCR为异二聚体受体分子，含有两条TCR多肽链，即α和β。α和β链TCR多肽可与各种CD3分子复合，并在抗原结合后引发免疫反应，包括炎症和自体免疫。如本文所用，TCR的敲低是指任何TCR基因的部分或全部敲低，例如TRBC1基因的部分缺失，单独或与其他TCR基因的部分或全部敲低组合。
“TRAC”用于指代T细胞受体α链。人野生型TRAC序列可在以下处获得：NCBI GeneID:28755；Ensembl:ENSG00000277734。T细胞受体α恒定区、TCRA、IMD7、TRCA和TRA为TRAC的基因同义词。
“TRBC”用于指代T细胞受体β链，例如TRBC1和TRBC2。“TRBC1”和“TRBC2”是指编码T细胞受体β链的两种同源基因，它们为TRBC1或TRBC2基因的基因产物。
人野生型TRBC1序列可在以下处获得：NCBI Gene ID:28639；Ensembl:ENSG00000211751。T细胞受体β恒定区，V_segment翻译产物、BV05S1J2.2、TCRBC1和TCRB为TRBC1的基因同义词。
人野生型TRBC2序列可在以下处获得：NCBI Gene ID:28638；Ensembl:ENSG00000211772。T细胞受体β恒定区、V_segment翻译产物和TCRBC2为TRBC2的基因同义词。
“T细胞”在暴露于抗原后的免疫反应中起核心作用。T细胞可为天然存在的或非天然的，例如，当T细胞通过工程化(例如从干细胞工程化)或通过转分化(例如重编程体细胞)而形成时。T细胞可由细胞表面上T细胞受体的存在而与其他淋巴细胞区分开。此定义包括常规适应性T细胞，包括辅助性CD4+T细胞、细胞毒性CD8+T细胞、记忆性T细胞和调控性CD4+T细胞，以及先天样T细胞，包括自然杀伤T细胞、粘膜相关不变T细胞和γδT细胞。在一些实施方案中，T细胞为CD4+。在一些实施方案中，T细胞为CD3+/CD4+。
如本文所用，“MHC”或“MHC蛋白”是指主要组织相容性复合物分子(或复数个)，并且包括例如MHC I类分子(例如，人中的HLA-A、HLA-B和HLA-C)和MHC II类分子(例如，人中的HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR)。
如本文所用，“CIITA”、“CIITA”或“C2TA”是指“II类主要组织相容性复合物反式活化因子”的核酸序列或蛋白质序列。人CIITA基因具有登录号NC_000016.10(范围10866208..10941562)，参考GRCh38.p13。细胞核中的CIITA蛋白充当MHC II类基因转录的正调节因子并且为MHC II类蛋白表达所必需的。
如本文所用，“β2M”或“B2M”是指“β-2微球蛋白”的核酸序列或蛋白质序列。人B2M基因具有登录号NC_000015(范围44711492..44718877)，参考GRCh38.p13。B2M蛋白作为有核细胞表面上的异二聚体与MHC I类分子相关，并且为MHC I类蛋白表达所必需的。
本文在HLA-A蛋白的上下文中使用的术语“HLA-A”是指MHC I类蛋白分子，它为由重链(由HLA-A基因编码)和轻链(即，β-2微球蛋白)组成的异二聚体。本文在核酸上下文中使用的术语“HLA-A”或“HLA-A基因”是指编码HLA-A蛋白质分子重链的基因。HLA-A基因也称为“HLA I类组织相容性，Aα链；”人HLA-A基因具有登录号NC_000006.12(29942532..29945870)。已知HLA-A基因在群中有数千种不同的版本(也称为“等位基因”)(并且个体可能会得到HLA-A基因的两种不同的等位基因)。可在IPD-IMGT/HLA:www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/处访问HLA-A等位基因的公共数据库，包括序列信息。HLA-A的所有等位基因均由术语“HLA-A”和“HLA-A基因”涵盖。
如本文所用，术语“在基因组坐标内”包括给定的基因组坐标范围的边界。例如，如果给出chr6:29942854-chr6:29942913，则涵盖坐标chr6:29942854-chr6:29942913。在本申请通篇，所参考的基因组坐标基于来自基因组参考联盟(Genome ReferenceConsortium)的人基因组GRCh38(也称为hg38)组装体中的基因组注释，可在www.ncbi.nlm.nih.gov(国家生物技术信息中心网站)处获得。用于在一个组装体与另一个组装体之间转换基因组坐标的工具和方法为本领域中已知的，并且可用于将本文提供的基因组坐标转换为人基因组的另一组装体中的相应坐标，包括转换为由相同机构或使用相同算法生成的更早组装体(例如，GRCh38至GRCh37)，以及由不同机构或算法生成的组装体的转换(例如，GRCh38至NCBI33，由国际人基因组测序联盟(International Human GenomeSequencing Consortium)生成)。本领域已知的可用方法和工具包括但不限于NCBI GenomeRemapping Service，可在国家生物技术信息中心网站获得；UCSC LiftOver，可在UCSCGenome Brower网站获得；以及Assembly Converter，可在Ensembl.org网站获得。
如本文所用，“剪接位点”是指构成受体剪接位点或供体剪接位点(定义如下)的三个核苷酸，或本领域已知的作为剪接位点的一部分的任何其他核苷酸。参见，例如Burset等人，Nucleic Acids Research 28(21):4364-4375(2000)(描述哺乳动物基因组中的规范和非规范剪接位点)。构成“受体剪接位点”的三个核苷酸为位于内含子3’处的两个保守残基(例如人中的AG)和边界核苷酸(即AG外显子3’的第一核苷酸)。受体剪接位点的“剪接位点边界核苷酸”在下图中指定为“Y”并且在本文中也可称为“受体剪接位点边界核苷酸”或“剪接受体位点边界核苷酸”。术语“受体剪接位点”、“剪接受体位点”、“受体剪接序列”或“剪接受体序列”在本文中可互换使用。
构成“供体剪接位点”的三个核苷酸为位于内含子5’末端处的两个保守残基(例如，人中的GT(基因)或GU(在RNA中，诸如前体mRNA))和边界核苷酸(即，GT外显子5’处的第一核苷酸)。供体剪接位点的“剪接位点边界核苷酸”在下图中指定为“X”并且在本文中也可称为“供体剪接位点边界核苷酸”或“剪接供体位点边界核苷酸”。术语“供体剪接位点”、“剪接供体位点”、“供体剪接序列”或“剪接供体序列”在本文中可互换使用。
包含指导RNA(gRNA)的组合物
本文提供可用于例如使用指导RNA与RNA指导的DNA结合剂(例如，CRISPR/Cas系统)在CD38基因内改变DNA序列，例如诱导单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)的组合物。靶向CD38基因的指导序列在表1中的SEQ ID NO:1–88处示出，也示出此类指导RNA所靶向的基因组坐标。
表1中的SEQ ID NO:1–88处示出的指导序列中的每一者可还包含另外的核苷酸以形成crRNA，例如，在其3'末端处的指导序列之后具有以下示例性核苷酸序列：在5'至3'方向上，GUUUUAGAG CUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO:200)。
在sgRNA的情况下，上述指导序列可还包含另外的核苷酸以形成sgRNA，例如，在指导序列的3'末端之后具有以下示例性核苷酸序列：在5'至3'方向上，GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUA AAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ ID NO:201)。
在sgRNA的情况下，上述指导序列可还包含另外的核苷酸以形成sgRNA，例如，在指导序列的3'末端之后具有以下示例性核苷酸序列：在5'至3'方向上，GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUA AAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO:202)。
在sgRNA的情况下，指导序列可整合至以下修饰的基序中：mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmA mGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUU AUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmC mGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU(SEQ ID NO:300)，其中“N”可为任何天然或非天然核苷酸，优选地RNA核苷酸；核苷酸的糖部分可为核糖、脱氧核糖或具有取代的类似化合物；m为2'-O-甲基修饰的核苷酸，并且*为核苷酸残基之间的硫代磷酸酯键联；并且其中N共同为指导序列的核苷酸序列。
在一些实施方案中，sgRNA可包含SEQ ID NO:1220-1225(表12)中任一者的序列，其中“N”可为任何天然或非天然核苷酸，优选地RNA核苷酸；核苷酸的糖部分可为核糖、脱氧核糖或具有取代的类似化合物；m为2'-O-甲基修饰的核苷酸，并且*为核苷酸残基之间的硫代磷酸酯键联；并且其中N共同为指导序列的核苷酸序列。
在sgRNA的情况下，指导序列可还包含SpyCas9 sgRNA序列。SpyCas9 sgRNA序列的实例在下表中示出(SEQ ID NO:201GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCC GUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC-示例性SpyCas9 sgRNA-1)，包括在指导序列的3’末端处，并具备如下表所示的结构域。LS为下茎。B为凸起。US为上茎。H1和H2分别为发夹1和发夹2。H1和H2统称为发夹区域。所述结构的模型在WO2019237069的图10A中提供，所述专利以引用方式并入本文。
示例性SpyCas9 sgRNA-1的核苷酸序列可充当特定化学修饰、序列取代和截短的模板序列。
在某些实施方案中，gRNA例如为sgRNA或dgRNA，并且它任选地包含化学修饰。在一些实施方案中，修饰的sgRNA包含指导序列和SpyCas9 sgRNA序列，例如示例性SpyCas9sgRNA-1。gRNA，诸如sgRNA，可能在指导序列的5’末端和/或在SpyCas9 sgRNA序列的3’末端包括修饰，例如示例性SpyCas9 sgRNA-1在一个或多个末端核苷酸，例如在3’末端或在5’末端的1、2、3或4个核苷酸处包括修饰。在某些实施方案中，修饰的核苷酸选自2'-O-甲基(2'-OMe)修饰的核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-O-moe)修饰的核苷酸、2'-氟(2'-F)修饰的核苷酸、核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键联、反向无碱基修饰的核苷酸或其组合。在某些实施方案中，修饰的核苷酸包括2'-OMe修饰的核苷酸。在某些实施方案中，修饰的核苷酸包括PS键联。在某些实施方案中，修饰的核苷酸包括2'-OMe修饰的核苷酸和PS键联。
在某些实施方案中，使用SEQ ID NO:201(“示例性SpyCas9sgRNA-1”)作为实例，(参见WO2019237069，其内容以引用方式并入本文)，示例性SpyCas9 sgRNA-1还包含以下中的一者或多者：
A.缩短的发夹1区域，或取代和任选地缩短的发夹1区域，其中
1.发夹1中至少一个以下核苷酸对被Watson-Crick配对核苷酸取代：H1-1与H1-12、H1-2与H1-11、H1-3与H1-10、或H1-4与H1-9，并且发夹1区域任选地缺少
a.H1-5至H1-8中的任一者或两者，
b.以下核苷酸对中的一者、两者或三者：H1-1与H1-12、H1-2与H1-11、H1-3与H1-10、和H1-4与H1-9，或
c.发夹1区域的1-8个核苷酸；或者
2.缩短的发夹1区域缺少4-8个核苷酸，优选地4-6个核苷酸；并且
a.位置H1-1、H1-2或H1-3中的一者或多者相对于示例性SpyCas9 sgRNA-1(SEQ IDNO:201)为缺失或取代的，或
b.位置H1-6至H1-10中的一者或多者相对于示例性SpyCas9sgRNA-1(SEQ ID NO:201)为取代的；或者
3.缩短的发夹1区域缺少5-10个核苷酸，优选地5-6个核苷酸，并且位置N18、H1-12或n中的一者或多者相对于示例性SpyCas9sgRNA-1(SEQ ID NO:201)为取代的；或者
B.缩短的上茎区域，其中缩短的上茎区域缺少1-6个核苷酸并且其中缩短的上茎区域的6、7、8、9、10或11个核苷酸包括少于或等于4个相对于示例性SpyCas9 sgRNA-1(SEQID NO:201)的取代；或者
C.在LS6、LS7、US3、US10、B3、N7、N15、N17、H2-2和H2-14中的任一者或多者处相对于示例性SpyCas9 sgRNA-1(SEQ ID NO:201)的取代，其中取代基核苷酸既不是后面跟着腺嘌呤的嘧啶，也不是前面跟着嘧啶的腺嘌呤；或者
D.具有上茎区域的示例性SpyCas9 sgRNA-1(SEQ ID NO:201)，其中上茎修饰包括对上茎区域的US1-US12中的任一者或多者的修饰，其中
1.修饰的核苷酸任选地选自2'-O-甲基(2'-OMe)修饰的核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-O-moe)修饰的核苷酸、2'-氟(2'-F)修饰的核苷酸、核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键联、反向无碱基修饰的核苷酸或其组合；或
2.修饰的核苷酸任选地包括2'-OMe修饰的核苷酸。
在某些实施方案中，示例性SpyCas9 sgRNA-1或sgRNA，诸如包含示例性SpyCas9sgRNA-1的sgRNA，还包含3'尾，例如1、2、3、4或更多个核苷酸的3'尾。在某些实施方案中，所述尾包含一个或多个修饰的核苷酸。在某些实施方案中，修饰的核苷酸选自2'-O-甲基(2'-OMe)修饰的核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-O-moe)修饰的核苷酸、2'-氟(2'-F)修饰的核苷酸、核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键联和反向无碱基修饰的核苷酸或其组合。在某些实施方案中，修饰的核苷酸包括2'-OMe修饰的核苷酸。在某些实施方案中，修饰的核苷酸包括核苷酸之间的PS键联。在某些实施方案中，修饰的核苷酸包括2'-OMe修饰的核苷酸以及核苷酸之间的PS键联。
在某些实施方案中，发夹区域包含一个或多个修饰的核苷酸。在某些实施方案中，修饰的核苷酸选自2'-O-甲基(2'-OMe)修饰的核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-O-moe)修饰的核苷酸、2'-氟(2'-F)修饰的核苷酸、核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键联、反向无碱基修饰的核苷酸；或其组合。在某些实施方案中，修饰的核苷酸包括2'-OMe修饰的核苷酸。
在某些实施方案中，上茎区包含一个或多个修饰的核苷酸。在某些实施方案中，修饰的核苷酸选自2'-O-甲基(2'-OMe)修饰的核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-O-moe)修饰的核苷酸、2'-氟(2'-F)修饰的核苷酸、核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键联、反向无碱基修饰的核苷酸或其组合。在某些实施方案中，修饰的核苷酸包括2'-OMe修饰的核苷酸。
在某些实施方案中，示例性SpyCas9 sgRNA-1包含一个或多个YA二核苷酸，其中Y为嘧啶，其中YA二核苷酸包括修饰的核苷酸。在某些实施方案中，修饰的核苷酸选自2'-O-甲基(2'-OMe)修饰的核苷酸、2'-O-(2-甲氧基乙基)(2'-O-moe)修饰的核苷酸、2'-氟(2'-F)修饰的核苷酸、核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键联、反向无碱基修饰的核苷酸或其组合。在某些实施方案中，修饰的核苷酸包括2'-OMe修饰的核苷酸。
在某些实施方案中，示例性SpyCas9 sgRNA-1包含一个或多个YA二核苷酸，其中Y为嘧啶，其中YA二核苷酸包括取代的核苷酸，即序列取代的核苷酸，其中嘧啶被嘌呤取代。在某些实施方案中，当嘧啶在单指导中形成Watson-Crick碱基对时，取代的嘧啶核苷酸的基于Watson-Crick的核苷酸被取代以维持Watson-Crick碱基配对。
在一些实施方案中，本文提供一种组合物，其包含一种或多种指导RNA(gRNA)，所述一种或多种指导RNA包含指导序列，所述指导序列将RNA指导的DNA结合剂引导至CD38中的靶DNA序列，所述RNA指导的DNA结合剂可为核酸酶(例如，Cas核酸酶，诸如Cas9)。gRNA可包含crRNA，其包含表1中所示的指导序列，任选地为SEQ ID NO:37、34、36、26、35、27、31、25、28、38、16、9、10、8、3、11、23、48、53、58、59、71、74、79和81；或SEQ ID NO:8、9、10、11、16、23、25、27、28、31、34、35、36和37；或SEQ ID NO:8、9、10、11、16、25、27、28、31、34、35和36；或SEQ ID NO:8、9、10、11、16、23、25、27、31、35、38、48、53、58、71、79和81；或SEQ ID NO:3、8、11、28、35和SEQ ID NO:37；或SEQ ID NO:9、10、11、27和35；或SEQ ID NO:10、11和35；或SEQID NO:8和SEQ ID NO:35。gRNA可包含crRNA，其包含表1中所示的指导序列的17、18、19或20个连续核苷酸。在一些实施方案中，gRNA包含crRNA，其包含与表1中所示的指导序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸具有至少75％、80％、85％、90％或95％、或100％同一性的序列，所述指导序列任选地为SEQ ID NO:37、34、36、26、35、27、31、25、28、38、16、9、10、8、3、11、23、48、53、58、59、71、74、79和81；或SEQ ID NO:8、9、10、11、16、23、25、27、28、31、34、35、36和37；或SEQ ID NO:8、9、10、11、16、25、27、28、31、34、35和36；或SEQ ID NO:8、9、10、11、16、23、25、27、31、35、38、48、53、58、71、79和81；或SEQ ID NO:3、8、11、28、35和SEQ ID NO:37；或SEQ ID NO:9、10、11、27和35；或SEQ ID NO:10、11和35；或SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:35。在一些实施方案中，gRNA包含crRNA，其包含与表1中所示的指导序列具有至少75％、80％、85％、90％或95％、或100％同一性的序列，所述指导序列任选地为SEQ ID NO:37、34、36、26、35、27、31、25、28、38、16、9、10、8、3、11、23、48、53、58、59、71、74、79和81；或SEQ IDNO:8、9、10、11、16、23、25、27、28、31、34、35、36和37；或SEQ ID NO:8、9、10、11、16、25、27、28、31、34、35和36；或SEQ ID NO:8、9、10、11、16、23、25、27、31、35、38、48、53、58、71、79和81；或SEQ ID NO:3、8、11、28、35和SEQ ID NO:37；或SEQ ID NO:9、10、11、27和35；或SEQ IDNO:10、11和35；或SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:35。gRNA可还包含trRNA。在本文所述的各实施方案中，crRNA与trRNA可缔合为单个RNA(sgRNA)或可在分开的RNA(dgRNA)上。在sgRNA的情况下，crRNA和trRNA组分可共价连接，例如，经由磷酸二酯键或其他共价键。
在本文所述的某些实施方案中，指导RNA可包含两个RNA分子作为“双指导RNA”或“dgRNA”。dgRNA包含含有crRNA的第一RNA分子和含有trRNA的第二RNA分子，所述crRNA包含例如表1中所示的指导序列。第一RNA分子与第二RNA分子可不共价连接，但可经由crRNA与trRNA的部分之间的碱基配对形成RNA双链体。
在一些实施方案中，指导RNA可包含单个RNA分子作为“单指导RNA”或“sgRNA”。sgRNA可包含与trRNA共价连接的crRNA(或其部分)，其包含表1中所示的指导序列，任选地为SEQ ID NO:37、34、36、26、35、27、31、25、28、38、16、9、10、8、3、11、23、48、53、58、59、71、74、79和81；或SEQ ID NO:8、9、10、11、16、23、25、27、28、31、34、35、36和37；或SEQ ID NO:8、9、10、11、16、25、27、28、31、34、35和36；或SEQ ID NO:8、9、10、11、16、23、25、27、31、35、38、48、53、58、71、79和81；或SEQ ID NO:3、8、11、28、35和SEQ ID NO:37；或SEQ ID NO:9、10、11、27和35；或SEQ ID NO:10、11和35；或SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:35。sgRNA可包含表1中所示的指导序列的17、18、19或20个连续核苷酸，所述指导序列任选地为SEQ ID NO:37、34、36、26、35、27、31、25、28、38、16、9、10、8、3、11、23、48、53、58、59、71、74、79和81；或SEQ IDNO:8、9、10、11、16、23、25、27、28、31、34、35、36和37；或SEQ ID NO:8、9、10、11、16、25、27、28、31、34、35和36；或SEQ ID NO:8、9、10、11、16、23、25、27、31、35、38、48、53、58、71、79和81；或SEQ ID NO:3、8、11、28、35和SEQ ID NO:37；或SEQ ID NO:9、10、11、27和35；或SEQ IDNO:10、11和35；或SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:35。在一些实施方案中，crRNA与trRNA经由接头共价连接。在一些实施方案中，sgRNA经由crRNA和trRNA的部分之间的碱基配对而形成茎环结构。在一些实施方案中，crRNA与trRNA经由一个或多个不是磷酸二酯键的键来共价连接。
在一些实施方案中，trRNA可包含全部或部分源自天然存在的CRISPR/Cas系统的trRNA序列。在一些实施方案中，trRNA包含截短或修饰的野生型trRNA。trRNA的长度取决于使用的CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，trRNA包含以下或由以下组成：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或超过100个核苷酸。在一些实施方案中，trRNA可包含某些二级结构，例如一个或多个发夹或茎环结构，或一个或多个凸起结构。
在一些实施方案中，本文提供一种组合物，其包含一种或多种指导RNA，所述一种或多种指导RNA包含以下中的任一者的指导序列：SEQ ID NO:1–88，优选地SEQ ID NO:37、34、36、26、35、27、31、25、28、38、16、9、10、8、3、11、23、48、53、58、59、71、74、79和81；或SEQID NO:8、9、10、11、16、23、25、27、28、31、34、35、36和37；或SEQ ID NO:8、9、10、11、16、25、27、28、31、34、35和36；或SEQ ID NO:8、9、10、11、16、23、25、27、31、35、38、48、53、58、71、79和81；或SEQ ID NO:3、8、11、28、35和SEQ ID NO:37；或SEQ ID NO:9、10、11、27和35；或SEQID NO:10、11和35；或SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:35。
在一些实施方案中，本文提供一种组合物，其包含一种或多种sgRNA，所述一种或多种sgRNA包含以下中的任一者：SEQ ID NO:125、122、124、114、123、115、119、113、116、126、104、97、98、96、91、99、111、136、141、146、147、159、162、167和169；或96、97、98、99、104、111、113、115、116、119、122、123、124和125；或96、97、98、99、104、113、115、116、119、122、123和124；或96、97、98、99、104、111、113、115、119、123、126、136、141、146、159、167和169；或91、96、99、116、123和125；或96和123。
在一方面，本文提供一种组合物，其包含gRNA，所述gRNA包含与以下的任何核酸具有至少100％或至少95％或90％同一性的指导序列：SEQ ID NO:1–88，优选地SEQ ID NO:37、34、36、26、35、27、31、25、28、38、16、9、10、8、3、11、23、48、53、58、59、71、74、79和81；或SEQ ID NO:8、9、10、11、16、23、25、27、28、31、34、35、36和37；或SEQ ID NO:8、9、10、11、16、25、27、28、31、34、35和36；或SEQ ID NO:8、9、10、11、16、23、25、27、31、35、38、48、53、58、71、79和81；或SEQ ID NO:3、8、11、28、35和SEQ ID NO:37；或SEQ ID NO:9、10、11、27和35；或SEQ ID NO:10、11和35；或SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:35。
在其他实施方案中，所述组合物包含至少一种，例如至少两种gRNA，其包含选自以下指导序列中的任何两者或更多者的指导序列：SEQ ID NO:1–88，优选地SEQ ID NO:37、34、36、26、35、27、31、25、28、38、16、9、10、8、3、11、23、48、53、58、59、71、74、79和81；或SEQID NO:8、9、10、11、16、23、25、27、28、31、34、35、36和37；或SEQ ID NO:8、9、10、11、16、25、27、28、31、34、35和36；或SEQ ID NO:8、9、10、11、16、23、25、27、31、35、38、48、53、58、71、79和81；或SEQ ID NO:3、8、11、28、35和SEQ ID NO:37；或SEQ ID NO:9、10、11、27和35；或SEQID NO:10、11和35；或SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:35。在一些实施方案中，所述组合物包含至少两种gRNA，其各自包含与以下中的任何核酸具有100％或至少95％或90％同一性的指导序列：SEQ ID NO:1–88，优选地SEQ ID NO:37、34、36、26、35、27、31、25、28、38、16、9、10、8、3、11、23、48、53、58、59、71、74、79和81；或SEQ ID NO:8、9、10、11、16、23、25、27、28、31、34、35、36和37；或SEQ ID NO:8、9、10、11、16、25、27、28、31、34、35和36；或SEQ ID NO:8、9、10、11、16、23、25、27、31、35、38、48、53、58、71、79和81；或SEQ ID NO:3、8、11、28、35和SEQ IDNO:37；或SEQ ID NO:9、10、11、27和35；或SEQ ID NO:10、11和35；或SEQ ID NO:8和SEQ IDNO:35。
在某些实施方案中，本文提供的指导RNA组合物被设计以识别CD38基因中的靶序列(例如，与其杂交)。例如，CD38靶序列可通过所提供的包含指导RNA的Cas裂解酶识别并裂解。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂诸如Cas裂解酶可通过指导RNA引导至CD38基因的靶序列，其中指导RNA的指导序列与靶序列杂交并且RNA指导的DNA结合剂诸如Cas裂解酶将靶序列裂解。
在一些实施方案中，一种或多种指导RNA的选择是基于CD38基因内的靶序列来确定的。
不受任何特定理论的束缚，基因某些区域中的突变(例如，由插入缺失即插入或缺失引起的框移突变，作为核酸酶介导的DSB的结果而发生)可能比基因其他区域中的突变更不能容许，因此，DSB的位置为可能产生的蛋白质敲低的量或类型的重要因素。在一些实施方案中，与CD38内的靶序列互补或具有互补性的gRNA用于将RNA指导的DNA结合剂引导至适当的CD38基因中的特定位置。在一些实施方案中，gRNA被设计为具有与CD38的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7或外显子8中的靶序列互补或具有互补性的指导序列。
在一些实施方案中，指导序列与人CD38基因中存在的靶序列具有100％或至少95％或90％同一性。在一些实施方案中，靶序列可与指导RNA的指导序列互补。在一些实施方案中，指导RNA的指导序列与其对应靶序列之间的互补性或同一性程度可为至少80％、85％、90％、或95％；或100％。在一些实施方案中，靶序列与gRNA的指导序列可为100％互补或相同。在其他实施方案中，靶序列和gRNA的指导序列可含有至少一个错配。例如，靶序列和gRNA的指导序列可含有1、2、3或4个错配，其中指导序列的总长度为20。在一些实施方案中，靶序列和gRNA的指导序列可含有1-4个错配，其中指导序列为20个核苷酸。
在一些实施方案中，本文公开的组合物或制剂包含含有开放阅读框(ORF)的mRNA，所述开放阅读框编码RNA指导的DNA结合剂，诸如本文所述的Cas核酸酶。在一些实施方案中，提供、使用或施用包含编码RNA指导的DNA结合剂诸如Cas核酸酶的ORF的mRNA。
修饰的gRNA和mRNA
在一些实施方案中，gRNA被化学修饰。包含一个或多个修饰的核苷或核苷酸的gRNA称为“修饰的”gRNA或“化学修饰的”gRNA，以描述一种或多种非天然或天然存在组分或构型的存在，所述组分或构型用于代替或补充规范A、G、C和U残基。在一些实施方案中，修饰的gRNA是用非规范核苷或核苷酸合成的，在此称为“修饰”。修饰的核苷和核苷酸可包括以下中的一者或多者：(i)改变，例如，替换磷酸二酯主链键联中的一个或两个非连接磷酸氧或一个或多个连接磷酸氧(示例性主链修饰)；(ii)改变，例如，替换核糖的组分，例如核糖上的2'羟基(示例性糖修饰)；(iii)用“去磷酸化”接头批量替换磷酸部分(示例性主链修饰)；(iv)天然存在的核碱基的修饰或替换，包括用非规范核碱基修饰(示例性碱基修饰)；(v)核糖-磷酸主链的替换或修饰(示例性主链修饰)；(vi)寡核苷酸的3'端或5'端的修饰，例如末端磷酸基团的移除、修饰或替换或者部分、帽或接头的缀合(此类3'或5'帽修饰可包含糖或主链修饰)；和(vii)糖的修饰或替换(示例性糖修饰)。
可将化学修饰，诸如上面列出的那些组合，以提供修饰的gRNA或mRNA，其包含可具有二个、三个、四个或更多个修饰的核苷和核苷酸(统称为“残基”)。例如，修饰的残基可具有修饰的糖和修饰的核碱基。在一些实施方案中，gRNA的各碱基都修饰，例如，所有碱基都具有修饰的磷酸基团，诸如硫代磷酸酯基团。在某些实施方案中，gRNA分子的所有或实质上所有磷酸酯基团被硫代磷酸酯基团替换。在一些实施方案中，修饰的gRNA在RNA的5’末端处或附近包含至少一个修饰的残基。在一些实施方案中，修饰的gRNA在RNA的3’末端处或附近包含至少一个修饰的残基。
在一些实施方案中，gRNA包含一个、两个、三个或更多个修饰的残基。在一些实施方案中，至少5％(例如，至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或者100％)修饰的gRNA中的位置为修饰的核苷或核苷酸。
未修饰的核酸可能易于由例如细胞内核酸酶或血清中的核酸酶降解。例如，核酸酶可水解核酸磷酸二酯键。因此，在一方面，本文所述的gRNA可含有一种或多种修饰的核苷或核苷酸，例如以引入对细胞内或基于血清的核酸酶的稳定性。在一些实施方案中，本文所述的修饰的gRNA分子在体内和离体引入细胞群时可表现出降低的先天免疫反应。术语“先天免疫反应”包括对外源核酸(包括单链核酸)的细胞反应，其涉及诱导细胞因子表达和释放，尤其干扰素和细胞死亡。
在主链修饰的一些实施方案中，修饰残基的磷酸基团可通过用不同取代基替换一个或多个氧来修饰。此外，修饰的残基，例如存在于修饰的核酸中的修饰的残基，可包括用本文所述的修饰磷酸基团对未修饰磷酸基团的全部替换。在一些实施方案中，磷酸主链的主链修饰可包括导致不带电荷的接头或具有不对称电荷分布的带电荷接头的改变。
修饰的磷酸酯基团的实例包括硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼酸磷酸盐(boranophosphate)、硼酸磷酸酯(borano phosphate ester)、膦酸氢酯、氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯和磷酸三酯。未修饰的磷酸酯基团中的磷原子为非手性的。然而，用上述原子或原子团之一替换非桥接氧之一可使磷原子具有手性。立体异构磷原子可具有“R”构型(此处为Rp)或“S”构型(此处为Sp)。还可通过用氮(桥接氨基磷酸酯)、硫(桥接硫代磷酸酯)和碳(桥接亚甲基膦酸酯)替换桥接氧(即，将磷酸盐与核苷连接的氧)来修饰主链。替换可发生在任一连接氧或两个连接氧处。
在某些主链修饰中，磷酸酯基团可由不含磷的连接物替换。在一些实施方案中，带电荷的磷酸基团可由中性部分替换。可替换磷酸酯基团的部分的实例可包括但不限于例如膦酸甲酯、羟基氨基、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基、氨基甲酸酯、酰胺、硫醚、环氧乙烷接头、磺酸酯、磺酰胺、硫代甲缩醛、甲缩醛、肟、亚甲基亚氨基、亚甲基甲基亚氨基、亚甲基亚肼基、亚甲基二甲基亚肼基和亚甲基氧基甲基亚氨基。
还可构建可模拟核酸的支架，其中磷酸酯接头和核糖由核酸酶抗性核苷或核苷酸替代物替换。这些修饰可包括主链和糖修饰。在一些实施方案中，核碱基可由替代性主链束缚。实例可包括但不限于吗啉代、环丁基、吡咯烷和肽核酸(PNA)核苷替代物。
修饰的核苷和修饰的核苷酸可包括对糖基团的一种或多种修饰，即糖修饰。例如，2'羟基(OH)可修饰，例如被许多不同“氧基”或“脱氧”取代基替换。在一些实施方案中，对2'羟基的修饰可增强核酸的稳定性，因为羟基不再能去质子化以形成2'-醇盐离子。
2'羟基修饰的实例可包括烷氧基或芳氧基(OR，其中“R”可为例如烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)，O(CH2CH2O)nCH2CH2OR，其中R可为例如H或任选地取代的烷基，并且n可为0至20的整数(例如0至4、0至8、0至10、0至16、1至4、1至8、1至10、1至16、1至20、2至4、2至8、2至10、2至16、2至20、4至8、4至10、4至16、和4至20)。在一些实施方案中，2'羟基修饰可为2'-O-Me。在一些实施方案中，2'羟基修饰可为2'-氟修饰，其用氟化物替换2'羟基。在一些实施方案中，2'羟基修饰可包括“锁”核酸(LNA)，其中2'羟基可例如通过C1-6亚烷基或C1-6杂亚烷基桥连接至相同核糖的4'碳，其中示例性桥可包括亚甲基、亚丙基、醚或氨基桥；O-氨基(其中氨基可为例如NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺或聚氨基)和氨基烷氧基、O(CH2)n-氨基(其中氨基可为例如NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基或二杂芳基氨基、乙二胺或聚氨基)。在一些实施方案中，2'羟基修饰可包括“解锁”核酸(UNA)，其中核糖环缺少C2'-C3'键。在一些实施方案中，2'羟基修饰可包括甲氧基乙基(MOE)(OCH2CH2OCH3，例如PEG衍生物)。
“脱氧”2'修饰可包括氢(即脱氧核糖，例如，在部分dsRNA的突出部分)；卤基(例如，溴、氯、氟或碘)；氨基(其中氨基可为例如NH2；烷基氨基、二烷基氨基、杂环基、芳基氨基、二芳基氨基、杂芳基氨基、二杂芳基氨基或氨基酸)；NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-氨基(其中氨基可例如如本文所述)、-NHC(O)R(其中R可为例如烷基、环烷基、芳基、芳烷基、杂芳基或糖)、氰基；巯基；烷硫基烷基；硫代烷氧基；和烷基、环烷基、芳基、烯基和炔基，它们可任选地被例如本文所述的氨基取代。
糖修饰可包含糖基团，所述糖基团也可含有一个或多个具有与核糖中相应碳的立体化学构型相反的立体化学构型的碳。因此，修饰的核酸可包括含有例如阿拉伯糖作为糖的核苷酸。修饰的核酸也可包含无碱基糖。这些无碱基糖也可在一个或多个组成糖原子处进一步修饰。修饰的核酸也可包含一种或多种L型糖，例如L-核苷。
可并入修饰的核酸中的本文描述的修饰的核苷和修饰的核苷酸可包含修饰的碱基，也称为核碱基。核碱基的实例包括但不限于腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。可修饰或完全替换这些核碱基以提供可并入修饰的核酸中的修饰的残基。核苷酸的核碱基可独立地选自嘌呤、嘧啶、嘌呤类似物或嘧啶类似物。在一些实施方案中，核碱基可包括例如碱基的天然存在和合成衍生物。
在使用双指导RNA的实施方案中，crRNA和tracr RNA中的每一者都可含有修饰。这些修饰可在crRNA或tracr RNA的一端或两端。在包含sgRNA的实施方案中，sgRNA的一端或两端的一个或多个残基可被化学修饰，或者内部核苷可修饰，或者整个sgRNA可被化学修饰。某些实施方案包括5'末端修饰。某些实施方案包括3'末端修饰。另外的实施方案包括5’末端修饰和3’末端修饰。
在一些实施方案中，本文公开的指导RNA包含标题为“Chemically ModifiedGuide RNAs”的WO2018/107028A1或标题为“Modified Guide RNAs for Gene Editing”的WO2021119275中公开的修饰模式之一，所述专利各自的内容特此以引用方式全部并入。在一些实施方案中，本文公开的指导RNA包含US20170114334中公开的结构/修饰模式之一，其内容特此以引用方式全部并入。在一些实施方案中，本文公开的指导RNA包含WO2017/136794中公开的结构/修饰模式之一，其内容特此以引用方式全部并入。
在一些实施方案中，sgRNA包含本文所示的任何修饰模式，其中N为任何天然或非天然核苷酸，并且其中N的整体包含如表1中所述的CD38指导序列。在一些实施方案中，修饰的sgRNA包含以下序列：mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmG mCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAG UCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU(SEQ ID NO:300)，其中“N”可为任何天然或非天然核苷酸，并且其中N的整体包含如表1中所述的CD38指导序列。例如，其中N被表1中本文公开的任何指导序列替换，任选地其中N被以下替换：SEQ ID NO:37、34、36、26、35、27、31、25、28、38、16、9、10、8、3、11、23、48、53、58、59、71、74、79和81；或SEQ ID NO:8、9、10、11、16、23、25、27、28、31、34、35、36和37；或SEQ ID NO:8、9、10、11、16、25、27、28、31、34、35和36；或SE Q ID NO:8、9、10、11、16、23、25、27、31、35、38、48、53、58、71、79和81；或SEQ ID NO:3、8、11、28、35和SEQ ID NO:37；或SEQ ID NO:9、10、11、27和35；或SEQ ID NO:10、11和35；或SEQID NO:8和SEQ ID NO:35。在一些实施方案中，表1中所列的sgRNA根据SEQ ID NO:300的修饰模式进行修饰。在一些实施方案中，sgRNA可包含SEQ ID NO:1220-1225(表12)中任一者的序列，其中“N”可为任何天然或非天然核苷酸，优选地RNA核苷酸；核苷酸的糖部分可为核糖、脱氧核糖或具有取代的类似化合物；m为2'-O-甲基修饰的核苷酸，并且*为核苷酸残基之间的硫代磷酸酯键联；并且其中N共同为指导序列的核苷酸序列。
下文描述的任何修饰均可存在于本文描述的gRNA和mRNA中。
术语“mA”、“mC”、“mU”或“mG”可用于表示已用2'-O-Me修饰的核苷酸。
2'-O-甲基的修饰可描述如下：
已显示影响核苷酸糖环的另一种化学修饰为卤素取代。例如，核苷酸糖环上的2'-氟(2'-F)取代可增加寡核苷酸结合亲和力和核酸酶稳定性。
在本申请中，术语“fA”、“fC”、“fU”或“fG”可用于表示已被2'-F取代的核苷酸。
2'-F的取代可描述如下：
硫代磷酸酯(PS)键联或键是指其中硫取代磷酸二酯键联中的一个非桥接磷酸氧的键，例如核苷酸碱基之间的键。当硫代磷酸酯用于产生寡核苷酸时，修饰的寡核苷酸也可称为S-寡核苷酸。
“*”可用于描述PS修饰。在本申请中，术语A*、C*、U*、或G*可用于表示通过PS键与下一个(例如，3')核苷酸连接的核苷酸。
在本申请中，术语“mA*”、“mC*”、“mU*”、或“mG*”可用于表示已被2'-O-Me取代并且通过PS键连接到下一个(例如，3')核苷酸的核苷酸。
下图示出将S-取代成非桥接磷酸氧，生成PS键代替磷酸二酯键：
无碱基核苷酸是指那些缺少含氮碱基的核苷酸。下图描绘了一个寡核苷酸，其无碱基(也称为无嘌呤)位点缺少一个碱基：
反向碱基是指那些具有与正常5'至3'键联反向的键联(即5'至5'键联或3'至3'键联)。例如：
无碱基核苷酸可通过反向键联来连接。例如，无碱基核苷酸可经由5'至5'键联连接至末端5'核苷酸，或者无碱基核苷酸可经由3'至3'键联连接至末端3'核苷酸。在末端5'或3'核苷酸处的反向无碱基核苷酸也可称为反向无碱基端帽。
在一些实施方案中，5'末端的前三个、四个或五个核苷酸中的一者或多者和3'末端的最后三个、四个或五个核苷酸中的一者或多者被修饰。在一些实施方案中，修饰为2'-O-Me、2'-F、反向无碱基核苷酸、PS键或在本领域中熟知增加稳定性或性能的其他核苷酸修饰。
在一些实施方案中，5'末端的前四个核苷酸和3'末端的最后四个核苷酸通过硫代磷酸酯(PS)键连接。
在一些实施方案中，5'末端的前三个核苷酸和3'末端的最后三个核苷酸包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰的核苷酸。在一些实施方案中，5'末端的前三个核苷酸和3'末端的最后三个核苷酸包含2'-氟(2'-F)修饰的核苷酸。在一些实施方案中，5'末端的前三个核苷酸和3'末端的最后三个核苷酸包含反向无碱基核苷酸。
在一些实施方案中，指导RNA包含修饰的sgRNA。在一些实施方案中，sgRNA包含以下所示的修饰模式：mN*mN*mN*NNNNNN NNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU(SEQ ID NO:300)，其中N为任何天然或非天然核苷酸，并且其中N的整体包含将核酸酶引导至CD38中的靶序列的指导序列，例如表1所示的基因组坐标。在一些实施方案中，sgRNA可包含SEQ ID NO:1220-1225(表12)中任一者的序列，其中“N”可为任何天然或非天然核苷酸，优选地RNA核苷酸；核苷酸的糖部分可为核糖、脱氧核糖或具有取代的类似化合物；m为2'-O-甲基修饰的核苷酸，并且*为核苷酸残基之间的硫代磷酸酯键联；并且其中N共同为指导序列的核苷酸序列。
在一些实施方案中，指导RNA包含含有SEQ ID NO:1-88的任一指导序列的sgRNA和sgRNA的保守部分，例如，如示例性SpyCa s9 sgRNA-1所示的sgRNA的保守部分或表1和说明书通篇所示的gRNA的保守部分。在一些实施方案中，指导RNA包含含有SEQ ID NO:1-88的任一指导序列的sgRNA和GUUUUAGAGCUAGAAAUA GCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAG UGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO:202)的核苷酸，其中核苷酸位于指导序列的3'末端，并且其中sgRNA可如本文所示或在以下序列中进行修饰：mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNG UUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAA UAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAm GmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU(SEQID NO:300)。在一些实施方案中，sgRNA包含本文提供的示例性SpyCas9 sgRNA-1或其修饰形式，或下表9中提供的形式，其中N的整体包含将核酸酶引导至靶序列的指导序列。“N”可为任何天然或非天然核苷酸，优选地RNA核苷酸；核苷酸的糖部分可为核糖、脱氧核糖或具有取代的类似化合物；m为2'-O-甲基修饰的核苷酸，并且*为核苷酸残基之间的硫代磷酸酯键联；并且其中N共同为指导序列的核苷酸序列。各N独立地修饰或未修饰。在某些实施方案中，在没有修饰指示的情况下，核苷酸为未修饰的RNA核苷酸残基，即核糖和磷酸二酯主链。在一些实施方案中，sgRNA可包含SEQ ID NO:1220-1225(表12)中任一者的序列，其中“N”可为任何天然或非天然核苷酸，优选地RNA核苷酸；核苷酸的糖部分可为核糖、脱氧核糖或具有取代的类似化合物；m为2'-O-甲基修饰的核苷酸，并且*为核苷酸残基之间的硫代磷酸酯键联；并且其中N共同为指导序列的核苷酸序列。
如上所示，在一些实施方案中，本文公开的组合物或制剂包含含有开放阅读框(ORF)的mRNA，所述开放阅读框编码RNA指导的DNA结合剂，诸如Cas核酸酶，例如本文所述的Cas9核酸酶。在一些实施方案中，提供、使用或施用包含编码RNA指导的DNA结合剂诸如Cas核酸酶例如Cas9核酸酶的ORF的mRNA。在一些实施方案中，编码RNA指导的DNA核酸酶的ORF为“修饰的RNA指导的DNA结合剂ORF”或简称为“修饰的ORF”，用作指示ORF被修饰的简写。
在一些实施方案中，mRNA和/或修饰的ORF可在至少一个、多个或所有尿苷位置处包含修饰的尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为在位置5例如用卤素或甲基或乙基修饰的尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为在位置1例如用卤素或甲基或乙基修饰的假尿苷。修饰的ORF包含一个或多个修饰的尿苷，其可为例如假尿苷、N1-甲基-假尿苷、5-甲氧基尿苷、5-碘尿苷或其组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为5-甲氧基尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为5-碘尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为假尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为N1-甲基-假尿苷。在一些实施方案中，修饰的尿苷为假尿苷和N1-甲基-假尿苷的组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为假尿苷和5-甲氧基尿苷的组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为N1-甲基-假尿苷和5-甲氧基尿苷的组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为5-碘尿苷和N1-甲基-假尿苷的组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为假尿苷和5-碘尿苷的组合。在一些实施方案中，修饰的尿苷为5-碘尿苷和5-甲氧基尿苷的组合。
在一些实施方案中，本文公开的mRNA包含5'帽，诸如Cap0、Cap1或Cap2。5'帽通常为7-甲基鸟嘌呤核糖核苷酸(可进一步修饰，如下面例如关于ARCA所讨论)，其经由5'-三磷酸连接至mRNA的5'至3'链的第一个核苷酸，即第一个帽近端核苷酸的5'位置。在Cap0中，mRNA的第一个和第二个帽近端核苷酸的核糖都包含2'-羟基。在Cap1中，mRNA的第一个和第二个转录核苷酸的核糖分别包含2'-甲氧基和2'-羟基。在Cap2中，mRNA的第一个和第二个帽近端核苷酸的核糖均包含2’-甲氧基。参见，例如，Katibah等人(2014)Proc Natl AcadSci USA 111(33):12025-30；Abbas等人(2017)Proc Natl Acad Sci USA 114(11):E2106-E2115。大多数内源高等真核生物mRNA，包括哺乳动物mRNA，诸如人mRNA，包含Cap1或Cap2。Cap0和其他不同于Cap1和Cap2的帽结构可能在哺乳动物(诸如人)中具有免疫原性，因为先天免疫系统的组分(诸如IFIT-1和IFIT-5)将其识别为“非自身”，从而可能导致细胞因子水平升高，包括I型干扰素。先天免疫系统的组分如IFIT-1和IFIT-5也可能与eIF4E竞争以便与具有Cap1或Cap2以外的帽的mRNA结合，从而可能抑制mRNA的翻译。
可共转录地包含帽。例如，ARCA(抗反向帽类似物；Thermo Fisher Scientific目录号AM8045)为一种帽类似物，其包含连接到鸟嘌呤核糖核苷酸5'位置的7-甲基鸟嘌呤3'-甲氧基-5'-三磷酸，它可在起始时在体外被整合到转录物中。ARCA产生一个Cap0帽，其中第一个帽近端核苷酸的2'位置为羟基。参见，例如，Stepinski等人，(2001)“Synthesis andproperties of mRNAs containing the novel‘anti-reverse’cap analogs 7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3'deo xy)GpppG,”RNA 7:1486–1495。ARCA结构如下图所示。
CleanCapTM AG(m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG；TriLink Biotechn ologies目录号N-7113)或CleanCapTM GG(m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG；TriLink Biotechnologies目录号N-7133)可用于共转录提供Cap1结构。CleanCapTM AG和CleanCapTM GG的3'-O-甲基化形式也可从TriLink Biotechnologies分别以目录号N-7413和N-7433获得。Clean CapTM AG结构如下图所示。
或者，可在转录后将帽添加到RNA。例如，牛痘加帽酶为可商购获得的(NewEngland Biolabs目录号M2080S)，并且具有RNA三磷酸酶和鸟苷酸转移酶活性，由其D1亚基提供，和鸟嘌呤甲基转移酶，由其D12亚基提供。因此，在S-腺苷甲硫氨酸和GTP存在下，它可向RNA添加7-甲基鸟嘌呤，从而产生Cap0。参见，例如Guo，P.和Moss，B.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，4023-4027；Mao，X.和Shuman，S.(1994)J.Biol.Chem.269，24472-24479。
Poly-A尾
在一些实施方案中，mRNA还包含多腺苷酸化(poly-A)尾。在一些实施方案中，poly-A尾序列包含100-400个核苷酸。在一些实施方案中，poly-A尾包含至少20、30、40、50、60、70、80、90或100个腺嘌呤。在一些实施方案中，polyA序列包含非腺嘌呤核苷酸。在一些情况下，poly-A尾在poly-A尾内的一个或多个位置处被一个或多个非腺嘌呤核苷酸“锚”“中断”。poly-A尾可包含至少8个连续的腺嘌呤核苷酸，但也包含一个或多个非腺嘌呤核苷酸。如本文所用，“非腺嘌呤核苷酸”是指不包含腺嘌呤的任何天然或非天然核苷酸。鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶核苷酸为示例性非腺嘌呤核苷酸。因此，本文所述的mRNA上的poly-A尾可包含位于编码本文所公开的多肽的核苷酸3’处的连续腺嘌呤核苷酸。在一些情况下，mRNA上的poly-A尾包含位于编码RNA指导的DNA结合剂或感兴趣的序列的核苷酸3’处的非连续腺嘌呤核苷酸，其中非腺嘌呤核苷酸以规则或不规则之间隔中断腺嘌呤核苷酸。
在一些实施方案中，poly-A尾在用于体外转录mRNA的质粒中编码并成为转录物的一部分。在质粒中编码的poly-A序列，即poly-A序列中连续腺嘌呤核苷酸的数量，可能不准确，例如，质粒中100poly-A序列可能不会在所转录的mRNA中产生精确的100poly-A序列。在一些实施方案中，poly-A尾不在质粒中编码，而是通过PCR加尾或酶促加尾添加，例如使用大肠杆菌poly(A)聚合酶。
在一些实施方案中，一个或多个非腺嘌呤核苷酸被定位以中断连续的腺嘌呤核苷酸，使得poly(A)结合蛋白可结合一段连续的腺嘌呤核苷酸。在一些实施方案中，一个或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8、9、10、11或12个连续的腺嘌呤核苷酸之后。在一些实施方案中，一个或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8-50个连续的腺嘌呤核苷酸之后。在一些实施方案中，一个或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8-100个连续的腺嘌呤核苷酸之后。在一些实施方案中，非腺嘌呤核苷酸在一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个腺嘌呤核苷酸之后并且其后为至少8个连续的腺嘌呤核苷酸。
本公开的poly-A尾可包含一个连续的腺嘌呤核苷酸序列，其后为一个或多个非腺嘌呤核苷酸，任选地其后为另外的腺嘌呤核苷酸。
在一些实施方案中，poly-A尾包含或含有一个非腺嘌呤核苷酸或一段连续的2-10个非腺嘌呤核苷酸。在一些实施方案中，一个或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8、9、10、11或12个连续的腺嘌呤核苷酸之后。在一些情况下，一个或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8-50个连续的腺嘌呤核苷酸之后。在一些实施方案中，一个或多个非腺嘌呤核苷酸位于至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个连续的腺嘌呤核苷酸之后。
在一些实施方案中，非腺嘌呤核苷酸为鸟嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。在一些情况下，非腺嘌呤核苷酸为鸟嘌呤核苷酸。在一些实施方案中，非腺嘌呤核苷酸为胞嘧啶核苷酸。在一些实施方案中，非腺嘌呤核苷酸为胸腺嘧啶核苷酸。在一些情况下，当存在多于一种非腺嘌呤核苷酸时，非腺嘌呤核苷酸可选自：a)鸟嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸；b)鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸；c)胸腺嘧啶和胞嘧啶核苷酸；或d)鸟嘌呤、胸腺嘧啶和胞嘧啶核苷酸。
核糖核蛋白复合物
在一些实施方案中，涵盖一种本文提供的组合物，其包含一种或多种gRNA，所述一种或多种gRNA包含来自表1的一个或多个指导序列或来自表1的一种或多种sgRNA；以及RNA指导的DNA结合剂，例如核酸酶，诸如Cas核酸酶，诸如Cas9。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂具有裂解酶活性，其也可称为双链核酸内切酶活性。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂包含Cas核酸酶。Cas9核酸酶的实例包括化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌和其他原核生物的II型CRISPR系统的那些(参见，例如，下一段中的列表)，和其修饰(例如，工程化或突变体)形式。参见，例如，US20160312198；US20160312199。Cas核酸酶的其他实例包括III型CRISPR系统的Csm或Cmr复合物、或其Cas10、Csm1或Cmr2亚基；以及I型CRISPR系统的级联复合物、或其Cas3亚基。在一些实施方案中，Cas核酸酶可来自IIA型、IIB型或IIC型系统。对于各种CRISPR系统和Cas核酸酶的讨论，参见，例如Makarova等人，NAT.REV.MICROBIOL.9:467-477(2011)；Makarova等人，NAT.REV.MICROBIOL，13:722-36(2015)；Shmakov等人，MOLECULARCELL，60:385-397(2015)。
可产生Cas核酸酶的非限制性示例性物种包括化脓性链球菌、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、链球菌属、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、无害李斯特菌(Listeria innocua)、嘉氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、新凶手弗朗西丝菌(Francisella novicida)、产琥珀酸沃廉菌(Wolinella succinogenes)、华德萨特菌(Sutterella wadswarthensis)、丙型变形菌纲(Gammaprotectobacterium)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、产琥珀酸拟杆菌(Fibrobacter succinogene)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、达松维尔拟诺卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)、始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)、绿色色素链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)、绿色色素链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)、粉红链孢囊菌(Streptosporangium roseum)、粉红链孢囊菌(Streptosporangium roseum)、酸热脂环酸杆菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、假蕈状芽孢杆菌(Bacilluspseudomycoides)、硒减少芽孢杆菌(Bacillus selenitireducens)、西伯利亚微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、海洋微颤菌(Microscilla marina)、伯克霍尔德氏菌(Burkholderies bacterium)、食萘极地单胞菌(Polaromonas naphtalenivorans)、极地单胞菌属(Polaroonas sp.)、瓦氏鳄球藻(Crophosphaera watsonii)、蓝藻属(Cyanocecesp.)、铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)、聚球藻属(Synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋盐杆菌(Acetohalobium arabaticum)、德根氏产氨菌(Ammonifex degensii)、热解纤维素菌(Caldicellosiruptor becscii)、金矿菌(Candidatus Desulforudis)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clodidium difficile)、大芬戈尔德菌(Finegoldiamagna)、嗜热盐碱厌氧菌(Natranaerobius thermophilus)、嗜热丙酸厌氧肠状菌(Pelotomaculum thermaloproponicum)、喜温嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、嗜酸氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、酒色着色菌(Allochromatiumvinosum)、海杆菌属(Marinobacter sp.)、嗜盐亚硝化球菌(Nitrosococcus halophilus)、瓦氏亚硝化球菌(Nitrosococcus watsoni)、盐浮游假交替单胞菌(Pseudoalteromonashaloplanotis)、总状纤线杆菌(Ktedonobacter raceriifer)、发现甲烷耐盐菌(Methanohalobium evestigatum)、多变鱼腥藻(Anabaena variabilis)、泡沫节球藻(Nodularia spumigena)、念珠藻属(Nostoc sp.)、极大节旋藻(Arthrospira maxima)、钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)、节螺菌属(Arthrospira sp.)、鞘丝藻属(Lyngbyasp.)、原型微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、颤藻属(Oscillatoria sp.)、运动石袍菌(Petrotoga mobilis)、非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)、巴氏链球菌(Streptococcus pasteurianus)、灰色奈瑟球菌(Neisseria cinerea)、红嘴鸥弯曲杆菌(Campylobacter lari)、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavantivorans)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、氨基酸球菌属(Acidominococcus sp.)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)细菌ND2006和海洋蓝藻菌(Acaryochloris marina)。
在一些实施方案中，Cas核酸酶为来自化脓性链球菌的Cas9核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶为来自嗜热链球菌的Cas9核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶为来自脑膜炎奈瑟球菌的Cas9核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶为来自金黄色葡萄球菌的Cas9核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶为来自新凶手弗朗西丝菌的Cpf1核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶为来自氨基酸球菌属的Cpf1核酸酶。在一些实施方案中，Cas核酸酶为来自毛螺菌科细菌ND2006的Cpf1核酸酶。在进一步实施方案中，Cas核酸酶为来自土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、毛螺菌科细菌、瘤胃溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrioproteoclasticus)、异域菌门(Peregrinibacteria)细菌、俭菌总门(Parcubacteria)细菌、史密斯氏菌(Smithella)、氨基酸球菌属、候选白蚁甲烷支原体(CandidatusMethanoplasma termitum)、挑剔真杆菌(Eubacterium eligens)、牛眼莫拉氏菌(Moraxella bovoculi)、稻田钩端螺旋体(Leptospira inadai)、狗口腔卟啉单胞菌(Porphyromonas crevioricanis)、解糖胨普雷沃菌(Prevotella disiens)或猕猴卟啉单胞菌(Porphyromonas macacae)的Cpf1核酸酶。在某些实施方案中，Cas核酸酶为来自氨基酸球菌属或毛螺菌科的Cpf1核酸酶。
在一些实施方案中，gRNA与RNA指导的DNA结合剂一起被称为核糖核蛋白复合物(RNP)。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂为Cas核酸酶。在一些实施方案中，gRNA连同Cas核酸酶一起被称为Cas RNP。在一些实施方案中，RNP包含I型、II型或III型组分。在一些实施方案中，Cas核酸酶为来自II型CRISPR/Cas系统的Cas9蛋白。在一些实施方案中，gRNA连同Cas9一起被称为Cas9 RNP。
野生型Cas9有两个核酸酶结构域：RuvC和HNH。RuvC结构域裂解非靶DNA链，并且HNH结构域裂解DNA的靶链。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含多于一个RuvC结构域或多于一个HNH结构域。在一些实施方案中，Cas9蛋白为野生型Cas9。在组合物、用途和方法实施方案中的各者中，Cas诱导靶DNA中的双链断裂。
在一些实施方案中，使用嵌合Cas核酸酶，其中蛋白质的一个结构域或区域由不同蛋白质的一部分替换。在一些实施方案中，Cas核酸酶结构域可被来自不同核酸酶诸如Fok1的结构域替换。在一些实施方案中，Cas核酸酶可为修饰的核酸酶。
在其他实施方案中，Cas核酸酶可来自I型CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，Cas核酸酶可为I型CRISPR/Cas系统级联复合物的组分。在一些实施方案中，Cas核酸酶可为Cas3蛋白。在一些实施方案中，Cas核酸酶可来自III型CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，Cas核酸酶可具有RNA裂解活性。
在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂具有单链切口酶活性，即可切割一条DNA链以产生单链断裂，也称为“切口”。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂包含Cas切口酶。切口酶为在dsDNA中产生切口的酶，即切割DNA双螺旋的一条链但不切割另一条链。在一些实施方案中，Cas切口酶为Cas核酸酶(例如，上文讨论的Cas核酸酶)的一种形式，其中核酸内切活性位点被灭活，例如，通过催化结构域中的一个或多个改变(例如，点突变)。关于Cas切口酶和示例性催化结构域改变的讨论，参见例如美国专利号8,889,356。在一些实施方案中，Cas切口酶诸如Cas9切口酶具有失活RuvC或HNH结构域。
在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂被修饰为仅含有一个功能性核酸酶结构域。例如，剂蛋白可被修饰为使得核酸酶结构域之一发生突变或完全或部分缺失以降低其核酸裂解活性。在一些实施方案中，使用具有活性降低的RuvC结构域的切口酶。在一些实施方案中，使用具有无活性RuvC结构域的切口酶。在一些实施方案中，使用具有活性降低的HNH结构域的切口酶。在一些实施方案中，使用具有无活性HNH结构域的切口酶。
在一些实施方案中，Cas蛋白核酸酶结构域内的保守氨基酸被取代以降低或改变核酸酶活性。在一些实施方案中，Cas核酸酶可包含RuvC或RuvC样核酸酶结构域中的氨基酸取代。RuvC或RuvC样核酸酶结构域中的示例性氨基酸取代包括D10A(基于化脓性链球菌Cas9蛋白)。参见，例如，Zetsche等人(2015)Cell 10月22:163(3):759-771。在一些实施方案中，Cas核酸酶可包含HNH或HNH样核酸酶结构域中的氨基酸取代。HNH或HNH样核酸酶结构域中的示例性氨基酸取代包括E762A、H840A、N863A、H983A和D986A(基于化脓性链球菌Cas9蛋白)。参见，例如，Zetsche等人(2015)。进一步示例性氨基酸取代包括D917A、E1006A和D1255A(基于新凶手弗朗西丝菌U112 Cpf1(FnCpf1)序列(UniProtKB-A0Q7Q2(CPF1_FRATN))。
在一些实施方案中，编码切口酶的mRNA与分别同靶序列的有义链和反义链互补的一对指导RNA组合提供。在此实施方案中，指导RNA将切口酶引导至靶序列并通过在靶序列的相反链上产生切口(即，双切口)引入DSB。在一些实施方案中，使用双切口可提高特异性并减少脱靶效应。在一些实施方案中，切口酶与靶向相反DNA链的两个单独指导RNA一起使用以在靶DNA中产生双切口。在一些实施方案中，切口酶与两个单独指导RNA一起使用，这两个指导RNA被选择为非常接近以在靶DNA中产生双切口。
在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂缺乏裂解酶和切口酶活性。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂包含dCas DNA结合多肽。dCas多肽具有DNA结合活性，但本质上缺乏催化(裂解酶/切口酶)活性。在一些实施方案中，dCas多肽为dCas9多肽。在一些实施方案中，缺乏裂解酶和切口酶活性的RNA指导的DNA结合剂或dCas DNA结合多肽为Cas核酸酶(例如，上文讨论的Cas核酸酶)的形式，其中其核酸内切活性位点被灭活，例如，通过其催化结构域中的一个或多个改变(例如，点突变)。参见，例如US20140186958；US20150166980。
在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂包含一个或多个异源功能结构域(例如，为或包含融合多肽)。
在一些实施方案中，异源功能结构域可促进RNA指导的DNA结合剂转运至细胞核中。例如，异源功能结构域可为核定位信号(NLS)。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可与1-10个NLS融合。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可与1-5个NLS融合。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可与一个NLS融合。当使用一个NLS时，NLS可连接在RNA指导的DNA结合剂序列的N端或C端。它也可插入RNA指导的DNA结合剂序列中。在其他实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可与多于一个NLS融合。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可与2、3、4、或5个NLS融合。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可与两个NLS融合。在某些情况下，两个NLS可能相同(例如，两个SV40 NLS)或不同。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂与在羧基端连接的两个SV40 NLS序列融合。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可与两个NLS融合，一个在N端连接，一个在C端连接。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可与3个NLS融合。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可不与NLS融合。在一些实施方案中，NLS可为单部分序列，诸如SV40 NLS、PKKKRKV或PKKKRRV。在一些实施方案中，NLS可为二分序列，诸如核质蛋白的NLS，KRPAATKKAGQAKKKK。在一个具体实施方案中，单个PKKKRKV NLS可连接在RNA指导的DNA结合剂的C端。一个或多个接头任选地包含在融合位点处。
在一些实施方案中，异源功能结构域可能够改变RNA指导的DNA结合剂的细胞内半衰期。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂的半衰期可增加。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂的半衰期可减少。在一些实施方案中，异源功能结构域可能够提高RNA指导的DNA结合剂的稳定性。在一些实施方案中，异源功能结构域可能够降低RNA指导的DNA结合剂的稳定性。在一些实施方案中，异源功能结构域可充当蛋白质降解的信号肽。在一些实施方案中，蛋白质降解可由蛋白水解酶，例如蛋白酶体、溶酶体蛋白酶或钙蛋白酶介导。在一些实施方案中，异源功能结构域可包含PEST序列。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂可通过添加泛素或多泛素链来修饰。在一些实施方案中，泛素可为泛素样蛋白(UBL)。泛素样蛋白的非限制性实例包括小泛素样修饰剂(SUMO)、泛素交叉反应蛋白(UCRP，也称为干扰素刺激基因-15(ISG15))、泛素相关修饰剂-1(URM1)、神经元前体细胞表达的发育下调蛋白-8(NEDD8，在酿酒酵母中也称为Rub1)、人白血球抗原F相关(FAT10)、自噬-8(ATG8)和自噬-12(ATG12)、Fau泛素样蛋白(FUB1)、膜锚定UBL(MUB)、泛素折叠修饰剂-1(UFM1)和泛素样蛋白-5(UBL5)。
在一些实施方案中，异源功能结构域可为标志物结构域。标志物结构域的非限制性实例包括荧光蛋白、纯化标签、表位标签和报告基因序列。在一些实施方案中，标志物结构域可为荧光蛋白。合适的荧光蛋白的非限制性实例包括绿色荧光蛋白(例如GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、sfGFP、EGFP、Emerald、Azami Green、Monomeric Azami Green、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1)、黄色荧光蛋白(例如YFP、EYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1)、蓝色荧光蛋白(例如EBFP、EBFP2、Azurite、mKalamal、GFPuv、Sapphire、T-sapphire)、青色荧光蛋白(例如ECFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、Midorishi-Cyan)、红色荧光蛋白(例如mKate、mKate2、mPlum、DsRed-Monomer、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed-Monomer、HcRed-Tandem、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred)和橙色荧光蛋白(mOrange、mKO、Kusabira-Orange、MonomericKusabira-Orange、mTangerine、tdTomato)或任何其他合适的荧光蛋白。在其他实施方案中，标志物结构域可为纯化标签或表位标签。非限制性示例性标签包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、几丁质结合蛋白(CBP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、硫氧还蛋白(TRX)、聚(NANP)、串联亲和纯化(TAP)标签、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Softag 1、Softag 3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6xHis、8xHis、生物素羧基载体蛋白(BCCP)、聚-His和钙调蛋白。非限制性示例性报告基因包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、辣根过氧化酶(HRP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、荧光素酶或荧光蛋白。
在另外的实施方案中，异源功能结构域可将RNA指导的DNA结合剂靶向特定的细胞器、细胞类型、组织或器官。在一些实施方案中，异源功能结构域可将RNA指导的DNA结合剂靶向线粒体。
在进一步实施方案中，异源功能结构域可为效应结构域。当RNA指导的DNA结合剂被引导至其靶序列时，例如，当Cas核酸酶由gRNA引导至靶序列时，效应结构域可修饰或影响靶序列。在一些实施方案中，效应结构域可选自核酸结合结构域、核酸酶结构域(例如，非Cas核酸酶结构域)、表观遗传修饰结构域、转录活化结构域或转录抑制结构域。在一些实施方案中，异源功能结构域为核酸酶，诸如FokI核酸酶。参见，例如美国专利号9,023,649。在一些实施方案中，异源功能结构域为转录活化物或抑制物。参见，例如Qi等人，“Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific controlof gene expression，“Cell 152:1173-83(2013)；Perez-Pinera等人，“RNA-guided geneactivation by CRISPR-Cas9-based transcription factors,”Nat.Methods 10:973-6(2013)；Mali等人，“CAS9transcriptional activators for target specificityscreening and paired nickases for cooperative genome engineering,”Nat.Biotechnol.31:833-8(2013)；Gilbert等人，“CRISPR-mediated modular RNA-guidedregulation of transcription in eukaryotes，“Cell 154:442-51(2013)。因此，RNA指导的DNA结合剂本质上变为转录因子，其可由指导RNA引导以结合所需靶序列。在一些实施方案中，异源功能结构域为脱氨酶，诸如胞苷脱氨酶或腺嘌呤脱氨酶。在某些实施方案中，异源功能结构域为C至T碱基转换子(胞苷脱氨酶)，诸如载脂蛋白B mRNA编辑酶(APOBEC)脱氨酶。
在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂选自以下之一：化脓性链球菌Cas9、脑膜炎奈瑟菌Cas9(例如Nme2Cas9)、嗜热链球菌Cas9、金黄色葡萄球菌Cas9、新弗朗西斯氏菌Cpf1、氨基酸球菌属Cpf1、毛螺菌科细菌Cpf1、C至T碱基编辑器、A至G碱基编辑器、Cas12a、Mad7核酸酶、ARCUS核酸酶和CasX。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂包含选自以下之一的多肽：化脓性链球菌Cas9、脑膜炎奈瑟菌Cas9(例如Nme2Cas9)、嗜热链球菌Cas9、金黄色葡萄球菌Cas9、新弗朗西斯氏菌Cpf1、氨基酸球菌属Cpf1、毛螺菌科细菌Cpf1、C至T碱基编辑器、A至G碱基编辑器、Cas12a和CasX。
在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂包含编辑器。示例性编辑器为BC22n，其包括通过XTEN接头与化脓性链球菌-D10ACas9切口酶融合的智人APOBEC3A，以及编码BC22n的mRNA。提供编码BC22n的mRNA(SEQ ID NO:804或805)。
gRNA功效的测定
在一些实施方案中，当与形成RNP的其他组分一起递送或表达时，测定gRNA的功效。在一些实施方案中，gRNA与RNA指导的DNA结合剂(诸如Cas蛋白，例如Cas9)一起表达。在一些实施方案中，gRNA被递送至或表达于已稳定表达RNA指导的DNA核酸酶(诸如Cas核酸酶或切口酶，例如Cas9核酸酶或切口酶)的细胞系中。在一些实施方案中，gRNA作为RNP的一部分递送至细胞中。在一些实施方案中，将gRNA连同编码RNA指导的DNA核酸酶(诸如Cas核酸酶或切口酶，例如Cas9核酸酶或切口酶)的mRNA一起递送至细胞中。
如本文所述，使用本文所公开的RNA指导的DNA核酸酶和指导RNA会造成DNA双链断裂，由此可在由细胞机制修复后产生插入/缺失(插入缺失)突变形式的错误。许多由插入缺失引起的突变改变阅读框或引入提前终止密码子，并且因此产生非功能性蛋白质。在一些实施方案中，特定gRNA的功效为基于体外模型测定的。在一些实施方案中，体外模型为稳定表达Cas9的HEK293细胞(HEK293_Cas9)。在一些实施方案中，体外模型为外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，体外模型为T细胞，诸如原代人T细胞。在一些实施方案中，体外模型为NK细胞，诸如原代人NK细胞。关于使用原代细胞，可使用可商购获得的原代细胞来提供实验之间更大的同一性。在一些实施方案中，在体外模型(例如，在T细胞或NK细胞中)中发生缺失或插入的脱靶位点的数量为例如通过分析来自用Cas9 mRNA和指导RNA在体外转染的细胞的基因组DNA来确定。在一些实施方案中，此类确定包括分析来自用Cas9 mRNA、指导RNA和供体寡核苷酸在体外转染的细胞的基因组DNA。工作实施例中提供此类确定的示例性程序，其中使用HEK293细胞、PBMC、人CD3+T细胞和人NK细胞。
在一些实施方案中，特定gRNA的功效为在用于gRNA选择过程的多个体外细胞模型中测定的。在一些实施方案中，对数据与所选gRNA的细胞系进行比较。在一些实施方案中，进行多细胞模型中的交叉筛选。
在一些实施方案中，指导RNA的功效通过CD38的插入缺失百分比或基因修饰百分比来测量。在一些实施方案中，指导RNA的功效通过CD38基因座处插入缺失百分比或基因修饰百分比来测量。在一些实施方案中，指导RNA的功效通过表1的基因组坐标处CD38的插入缺失百分比或基因修饰百分比来测量。在一些实施方案中，将CD38的编辑百分比与实现CD38蛋白产物敲低所必需的插入缺失或基因修饰百分比相比较。在一些实施方案中，指导RNA的功效通过减少或消除的CD38蛋白表达来测量。在实施方案中，所述减少或消除的CD38蛋白表达为通过流式细胞术测量的，例如如本文所述。
在一些实施方案中，使用本文所公开的方法和组合物减少或消除细胞群中的CD38蛋白表达。在一些实施方案中，如通过流式细胞术所测量，细胞群相对于未修饰的细胞群为至少55％、60％、65％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％CD38阴性的。
“一种未修饰的细胞”(或“多种未修饰的细胞”)是指实验或测试中相同细胞类型的一种对照细胞(或多种对照细胞)，其中“未修饰的”对照细胞未与CD38指导接触。因此，一种未修饰的细胞(或多种细胞)可为未与指导RNA接触的细胞，或已与不靶向CD38的指导RNA接触的细胞。
在一些实施方案中，指导RNA的功效通过靶细胞类型(诸如T细胞或NK细胞)基因组内脱靶序列处的插入缺失或基因修饰的数量或频率来测量。在一些实施方案中，提供有效的指导RNA，其以极低频率(例如，<5％)在细胞群中或相对于靶位点处插入缺失的生成频率在脱靶位点处产生插入缺失。因此，本公开提供在靶细胞类型(例如，T细胞或NK细胞)中不呈现脱靶插入缺失形成或在细胞群中或相对于靶位点处插入缺失的生成频率产生<5％的脱靶插入缺失形成频率的指导RNA。在一些实施方案中，本公开提供在靶细胞类型(例如，T细胞或NK细胞)中不呈现任何脱靶插入缺失形成的指导RNA。在一些实施方案中，提供例如如通过本文所述的一种或多种方法所评估在少于5个脱靶位点处产生插入缺失的指导RNA。在一些实施方案中，提供例如如通过本文所述的一种或多种方法所评估在少于或等于4、3、2或1个脱靶位点处产生插入缺失的指导RNA。在一些实施方案中，一个或多个脱靶位点不出现在靶细胞(例如，肝细胞)基因组的蛋白质编码区中。
在一些实施方案中，检测基因编辑事件诸如插入/缺失(“插入缺失”)突变的形成和靶DNA中的插入或同源定向修复(HDR)事件利用带有标记引物的线性扩增和分离标记扩增产物(以下称为“LAM-PCR”或“线性扩增(LA)”方法)。在一些实施方案中，指导RNA的功效通过包含基因表达的蛋白质产物的功能性蛋白质复合物的水平来测量。在一些实施方案中，指导RNA的功效通过CD38表达的流式细胞术分析来测量，通过流式细胞术分析编辑的活细胞群的CD38损失。
T细胞受体(TCR)
在一些实施方案中，包含例如编码CD38的内源核酸序列的基因修饰的工程化细胞或细胞群还包含编码TCR基因序列(例如，TRAC或TRBC)的内源核酸序列的修饰，例如敲低。
在一些实施方案中，包含例如编码CD38的内源核酸序列的基因修饰(例如敲低)和编码靶向受体的异源序列向细胞中的插入的工程化细胞或细胞群还包含编码TCR基因序列(例如，TRAC或TRBC)的内源核酸序列的修饰，例如敲低。
通常，TCR为包含两条TCR多肽链(即α和β)的异二聚体受体分子。用于敲低的合适的α和β基因组序列或基因座为本领域中已知的。在一些实施方案中，工程化T细胞包含TCRα链基因序列(例如TRAC)的修饰，例如敲低。参见，例如NCBI Gene ID:28755；Ensembl:ENSG00000277734(T-cell receptor Alpha Constant)、US2018/0362975和WO2020081613。
在一些实施方案中，工程化细胞或细胞群包含编码CD38的内源核酸序列的基因修饰、编码TCR基因序列(例如TRAC或TRBC)的内源核酸序列的基因修饰(例如敲低)；和MHC I类基因(例如B2M或HLA-A)的修饰，例如敲低。在一些实施方案中，MHC I类基因为HLA-B基因或HLA-C基因。
在一些实施方案中，工程化细胞或细胞群包含编码CD38的内源核酸序列的基因修饰和编码TCR(例如TRAC或TRBC)的内源核酸序列的基因修饰(例如敲低)；以及MHC II类基因(例如CIITA)的基因修饰，例如敲低。
在一些实施方案中，工程化细胞或细胞群包含编码CD38的内源核酸序列的修饰、编码TCR(例如TRAC或TRBC)的内源核酸序列的基因修饰(例如敲低)；以及检查点抑制剂基因(例如TIM3、2B4、LAG3或PD-1)的基因修饰，例如敲低。
在一些实施方案中，工程化细胞或细胞群包含CD38基因的基因修饰，如通过测序(例如，NGS)所评估，其中至少50％、55％、60％、65％，优选地至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的细胞包含内源CD38序列中的插入、缺失或取代。在一些实施方案中，群中至少50％的细胞包含选自内源CD38序列中的插入、缺失和取代的修饰。在一些实施方案中，群中至少55％的细胞包含选自内源CD38序列中的插入、缺失和取代的修饰。在一些实施方案中，群中至少60％的细胞包含选自内源CD38序列中的插入、缺失和取代的修饰。在一些实施方案中，群中至少65％的细胞包含选自内源CD38序列中的插入、缺失和取代的修饰。在一些实施方案中，群中至少70％的细胞包含选自内源CD38序列中的插入、缺失和取代的修饰。在一些实施方案中，群中至少75％的细胞包含选自内源CD38序列中的插入、缺失和取代的修饰。在一些实施方案中，群中至少85％的细胞包含选自内源CD38序列中的插入、缺失和取代的修饰。在一些实施方案中，群中至少70％的细胞包含选自内源CD38序列中的插入、缺失和取代的修饰。在一些实施方案中，群中至少90％的细胞包含选自内源CD38序列中的插入、缺失和取代的修饰。在一些实施方案中，群中至少95％的细胞包含选自内源CD38序列中的插入、缺失和取代的修饰。在一些实施方案中，与合适的对照(例如，其中CD38基因未修饰)相比，CD38减少了至少50％、55％、60％、65％，优选地至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％，或减少至低于测定的检测限。在一些实施方案中，与合适的对照(例如，其中CD38基因未修饰)相比，CD38的表达减少了至少50％或减少至低于测定的检测限。在一些实施方案中，与合适的对照(例如，其中CD38基因未修饰)相比，CD38的表达减少了至少55％或减少至低于测定的检测限。在一些实施方案中，与合适的对照(例如，其中CD38基因未修饰)相比，CD38的表达减少了至少60％或减少至低于测定的检测限。在一些实施方案中，与合适的对照(例如，其中CD38基因未修饰)相比，CD38的表达减少了至少65％或减少至低于测定的检测限。在一些实施方案中，与合适的对照(例如，其中CD38基因未修饰)相比，CD38的表达减少了至少70％或减少至低于测定的检测限。在一些实施方案中，与合适的对照(例如，其中CD38基因未修饰)相比，CD38的表达减少了至少80％或减少至低于测定的检测限。在一些实施方案中，与合适的对照(例如，其中CD38基因未修饰)相比，CD38的表达减少了至少90％或减少至低于测定的检测限。在一些实施方案中，与合适的对照(例如，其中CD38基因未修饰)相比，CD38的表达减少了至少95％或减少至低于测定的检测限。CD38蛋白和mRNA表达的测定为本领域中已知的。“CD38的表达”是指编码转录物(例如，CD38 mRNA)的表达或CD38蛋白或其一部分的表达。抑制CD38的表达可导致CD38编码转录物(例如CD38mRAN)的水平降低或CD38蛋白或其一部分的水平降低。CD38表达的抑制可通过检测或量化CD38编码转录物(例如，mRNA)、CD38蛋白、CD38蛋白的部分或CD38活性来评估。
在一些实施方案中，工程化细胞或细胞群包含通过基因编辑获得的TCR基因序列的修饰(例如敲低)，例如如通过测序(例如NGS)所评估，其中至少50％、55％、60％、65％，优选地至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的细胞包含内源TCR基因序列中的插入、缺失或取代。在一些实施方案中，与合适的对照(例如，其中TCR基因未修饰)相比，TCR减少了至少50％、55％、60％、65％，优选地至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或减少至低于测定的检测限。在某些实施方案中，TCR为TRAC或TRBC。TCR蛋白和mRNA表达的测定为本领域中已知的。
在一些实施方案中，工程化细胞或细胞群包含通过基因编辑获得的编码靶向受体的序列的插入，例如如通过测序(例如NGS)所评估。
在一些实施方案中，特异性靶向TCR基因(例如TRAC基因)内的位点的指导RNA用于提供TCR基因的修饰，例如敲低。
在一些实施方案中，使用指导RNA与RNA指导的DNA结合剂在T细胞中修饰(例如敲低)TCR基因。在一些实施方案中，本文公开通过例如使用指导RNA与RNA指导的DNA结合剂(例如，CRISPR/Cas系统)在T细胞的TCR基因内诱导断裂(例如，双链断裂(DSB)或单链断裂(切口))而工程化的T细胞。所述方法可用于体外或离体例如制造用于抑制免疫反应的细胞产物。
在一些实施方案中，指导RNA通过RNA指导的DNA结合剂(例如，Cas核酸酶)介导TCR基因内本文所述的位点处的靶标特异性切割。应理解，在一些实施方案中，指导RNA包含结合或能够结合所述区域的指导序列。
方法和用途，包括治疗方法和制备工程化细胞或免疫疗法试剂的用途和方法
在某些实施方案中，本文所公开的gRNA以及相关方法和组合物可用于制备细胞疗法(例如，免疫疗法)试剂，诸如工程化细胞(例如，工程化T细胞和/或工程化NK细胞)。
免疫疗法为通过活化或抑制免疫系统来治疗疾病。旨在引发或放大免疫反应的免疫疗法被归类为活化免疫疗法。基于细胞的免疫疗法已证明可有效治疗某些癌症。免疫效应细胞诸如淋巴细胞、巨噬细胞、树突细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)可被编程以响应肿瘤细胞表面上表达的异常抗原来发挥作用。因此，癌症免疫疗法允许免疫系统的组分破坏肿瘤或其他癌细胞。
免疫疗法也可用于治疗慢性感染性疾病，例如B型和C型肝炎病毒感染、人免疫缺陷病毒(HIV)感染、结核病感染和疟疾感染。包含靶向受体诸如转基因TCR或CAR的免疫效应细胞可用于免疫疗法，诸如本文所述的那些。
在一些实施方案中，包含表1的指导序列以及RNA指导的DNA核酸酶(诸如Cas核酸酶)的gRNA诱导双链断裂(DSB)以及在修复期间的非同源末端连接(NHEJ)，从而在CD38基因中产生修饰，例如突变。在一些实施方案中，NHEJ导致核苷酸的缺失或插入，从而在CD38基因中诱导框移或无意义突变。在某些实施方案中，包含靶向TCR序列(例如TRAC和TRBC)的指导序列的gRNA也与RNA指导的DNA核酸酶(诸如Cas核酸酶)一起或分别递送至细胞，以在TCR序列产生基因修饰，从而抑制全长TCR序列的表达。在某些实施方案中，gRNA为sgRNA。
在一些实施方案中，受试者为哺乳动物。在一些实施方案中，受试者为人。在一些实施方案中，受试者为非人灵长类动物。
在一些实施方案中，指导RNA、组合物和制剂用于离体产生细胞，例如免疫细胞，例如在CD38基因中具有基因修饰的T细胞。修饰的T细胞可为自然杀伤(NK)T细胞。修饰的T细胞可表达T细胞受体，诸如通用TCR或修饰的TCR。T细胞可表达CAR或具有ζ链信号传导基序的CAR构建体。
gRNA组合物的递送
脂质纳米颗粒(LNP)为用于递送核苷酸和蛋白质货物的熟知手段，并且可用于离体和体外递送本文所公开的指导RNA和组合物。在一些实施方案中，LNP将核酸、蛋白质或核酸连同蛋白质一起递送。
在一些实施方案中，本文提供一种用于将本文所公开的任何一种细胞或细胞群递送至受试者的方法，其中gRNA经由LNP递送。在一些实施方案中，gRNA/LNP也与Cas9或编码Cas9的mRNA有关。
在一些实施方案中，本文提供一种组合物，其包含所公开的任何一种gRNA和LNP。在一些实施方案中，所述组合物还包含Cas9或编码Cas9的mRNA。
在一些实施方案中，与本文所公开的gRNA相关的LNP用于制备供治疗疾病或病症之用的药剂。
电穿孔为用于递送货物的熟知手段，并且任何电穿孔方法均可用于递送本文所公开的任何一种gRNA。在一些实施方案中，电穿孔可用于递送本文所公开的任何一种gRNA和Cas9或编码Cas9的mRNA。
在一些实施方案中，本文提供一种用于将本文所公开的任何一种gRNA递送至离体细胞的方法，其中gRNA与LNP相关或不与LNP相关。在一些实施方案中，gRNA/LNP或gRNA也与Cas9或编码Cas9的mRNA相关。
在一些实施方案中，单独或在一种或多种载体上编码的本文所述的指导RNA组合物被配制在脂质纳米颗粒中或经由脂质纳米颗粒施用(参见，例如，WO2017/173054和PCT/US2021/29446，其各自的内容特此以引用方式全部并入本文)。
在某些实施方案中，本文提供DNA或RNA载体，其编码包含本文所述的任何一个或多个指导序列的任何指导RNA。在一些实施方案中，除了指导RNA序列之外，载体还包含不编码指导RNA的核酸。不编码指导RNA的核酸包括但不限于启动子、增强子、调控序列和编码RNA指导的DNA核酸酶(其可为核酸酶，诸如Cas9)的核酸。在一些实施方案中，载体包含编码crRNA、trRNA或crRNA与trRNA的一个或多个核苷酸序列。在一些实施方案中，载体包含编码sgRNA的一个或多个核苷酸序列和编码RNA指导的DNA核酸酶(其可为Cas核酸酶，诸如Cas9或Cpf1)的mRNA。在一些实施方案中，载体包含编码crRNA、trRNA的一个或多个核苷酸序列和编码RNA指导的DNA核酸酶(其可为Cas蛋白，诸如Cas9)的mRNA。在一实施方案中，Cas9来自化脓性链球菌(即，SpyCas9)。在一些实施方案中，编码crRNA、trRNA或crRNA与trRNA(其可为sgRNA)的核苷酸序列包含指导序列或由指导序列组成，所述指导序列两侧为来自天然存在的CRISPR/Cas系统的重复序列的全部或一部分。包含crRNA、trRNA或crRNA和trRNA或由其组成的核酸可还包含载体序列，其中载体序列包含不与crRNA、trRNA或crRNA和trRNA一起天然发现的核酸或由其组成。
在一些实施方案中，组分可作为裸核酸、作为与诸如脂质体或泊洛沙姆的剂复合的核酸引入，或者它们可通过病毒载体(例如，腺病毒、AAV、疱疹病毒、逆转录病毒、慢病毒)递送。用于核酸的非病毒递送的方法和组合物包括电穿孔、脂质转染、显微注射、基因枪、病毒颗粒、脂质体、免疫脂质体、LNP、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸核酸(例如，裸DNA/RNA)、人工病毒粒子和剂增强的DNA摄取。使用例如Sonitron 2000系统(Rich-Mar)的声孔作用也可用于递送核酸。
此描述和示例性实施方案不应被视为限制。出于本说明书和所附权利要求书的目的，除非另有说明，否则所有表示数量、百分比或比例的数字，以及说明书和权利要求书中使用的其他数值，应理解为在所有情况下皆由术语“约”修饰，只要它们尚未如此修饰。因此，除非有相反指示，否则在以下说明书和所附权利要求书中阐述的数字参数为近似值，其可根据寻求获得的期望特性而变化。至少，而非试图将等同原则的应用限制在权利要求书的范围内，各数字参数应该至少根据报告的有效数字的数量并通过应用普通舍入技术来解释。
组合疗法
gRNA连同RNA指导的DNA核酸酶一起的递送可与一种或多种另外的疗法组合，所述RNA指导的DNA核酸酶诱导双链断裂(DSB)和在修复期间的非同源末端连接(NHEJ)，由此在CD38基因中产生修饰，例如突变，如本文所述。在一些实施方案中，另外的疗法为癌症疗法。在一些实施方案中，另外的疗法为化学疗法、激素疗法、免疫疗法、放射疗法或靶向疗法。
gRNA连同RNA指导的DNA核酸酶一起的递送可与一种或多种另外的疗法组合，所述RNA指导的DNA核酸酶诱导双链断裂(DSB)和在修复期间的非同源末端连接(NHEJ)，由此在CD38基因中产生突变，如本文所述。在一些实施方案中，另外的疗法为癌症疗法。在一些实施方案中，另外的疗法为化学疗法、激素疗法、免疫疗法、放射疗法或靶向疗法。
在一些实施方案中，另外的疗法可为抗CD38抗体。将在CD38基因中产生至少一种突变的gRNA/Cas治疗方法与另一种抗CD38疗法(例如，抗CD38靶向疗法)组合可在逃脱gRNA/Cas治疗方法的那些细胞中降低CD38活性。另外的疗法也可为另一种gRNA/Cas疗法，其包含靶向其他基因(例如，TCR基因)的gRNA。
抗CD38抗体为本领域中已知的并且已显示在降低CD38活性和治疗或预防某些疾病(例如，多发性骨髓瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、T细胞白血病)中有效(或正在进行临床试验以证实其有效性)。因此，本文预期特异性结合CD38并至少部分抑制其活性的抗体。在一些实施方案中，抗CD38抗体为达雷木单抗，即一种IgG1k人单克隆抗体，已显示其在治疗多发性骨髓瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和套细胞淋巴瘤中有效(或正在进行临床试验以证实有效性)。此外，已显示，施用CD38耗竭的NK细胞减少或消除由达雷木单抗引起的自相残杀，并提高NK细胞的有效性(Kararoudi等人，Blood(2020)136(21):2416–2427。在一些实施方案中，抗CD38抗体为伊沙妥昔单抗(IgG1人单克隆抗体)。在一些实施方案中，抗CD38抗体为双特异性抗体。在一些实施方案中，抗CD38抗体为TAK-079或MOR-202，它们目前皆在临床试验中。
在一些实施方案中，CD38抑制剂为小分子。在一些实施方案中，小分子为4-氨基-喹啉。-氨基-喹啉的实例包括但不限于CD38抑制剂78c、CD38抑制剂1ah和CD38抑制剂1ai。这些类型的CD38抑制剂通常竞争性抑制CD38的NAD酶活性。CD38抑制剂78c(结构如下所示)已显示可有效减少路易斯(Lewis)肺癌小鼠模型中的肿瘤质量。
NAD+类似物也抑制CD38，并且在本文中被认为是可与靶向CD38的gRNA/Cas系统组合的另外治疗剂。作为CD38抑制剂的NAD+类似物包括但不一定限于Ara-F-NAD+、Ara-F-NMN、Ara-F-NMN磷酸酯/C48、Carba-NAD和假-Carba-NAD。
NAD+类似物也抑制CD38，并且在本文中被认为是可与靶向CD38的gRNA/Cas系统组合的另外治疗剂。作为CD38抑制剂的NAD+类似物包括但不一定限于Ara-F-NAD+、Ara-F-NMN、Ara-F-NMN磷酸酯/C48、Carba-NAD和假-Carba-NAD。
在一些实施方案中，抗CD38抑制剂为类黄酮。类黄酮CD38抑制剂通常对人没有毒性，并且已在肥胖、心脏缺血、肾损伤、病毒感染和癌症的动物模型中观察到有益作用。CD38的类黄酮抑制剂包括但不限于槲皮素、芹菜素、木犀草啶、矢车菊素和大黄酸/K-大黄酸。类黄酮，如NAD+类似物，倾向于一般通过竞争性抑制来抑制CD38的NAD酶活性。
在一些实施方案中，另外的癌症疗法为CAR-T细胞疗法。嵌合抗原受体(CAR)为将肿瘤相关表面抗原的基于抗体的特异性与具有特异性抗肿瘤细胞免疫活性的T细胞受体活化细胞内结构域相结合的分子(Eshhar，1997，Cancer Immunol Immunother 45(3-4)131-136；Eshhar等人，1993，Proc Natl Acad Sci USA 90(2):720-724；Brocker和Karjalainen，1998，Adv Immunol 68:257-269)。这些CAR允许T细胞通过单链Fv(scFv)抗原特异性细胞外区域与提供T细胞活化和共刺激信号的细胞内结构域融合来实现非MHC依赖性初级活化。第二代和第三代CAR也经由CD28和/或CD137(4-1BB)细胞内活化基序提供适当的共刺激信号，由此增强多种实体瘤和白血病模型中的细胞因子分泌和抗肿瘤活性(Pinthus等人，2004，J Clin Invest114(12):1774-1781；Milone等人，2009，Mol Ther 17(8):1453-1464；Sadelain等人，2009，Curr Opin Immunol 21(2):215-223)。嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法涉及对患者的自体T细胞进行基因修饰以表达对肿瘤抗原具有特异性的CAR，其后进行离体细胞扩增并重新输回患者体内。CAR为来自特定单克隆抗体的选定单链可变片段与一个或多个T细胞受体细胞内信号传导结构域的融合蛋白。此T细胞基因修饰可通过基于病毒的基因转移方法或非病毒方法诸如基于DNA的转座子、CRISPR/Cas9技术或通过电穿孔直接转移体外转录的mRNA而发生。
适应症
在一些实施方案中，本文所述的方法可用于治疗任何癌症，包括任何癌性或癌前肿瘤。可通过本文提供的方法和组合物治疗的癌症包括但不限于膀胱癌、血液癌、骨癌、骨髓癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、食道癌、胃肠癌、牙龈癌、头癌、肾癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、颈癌、卵巢癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、舌癌或子宫癌。此外，癌症具体地可为以下组织学类型，但不限于这些：恶性肿瘤；癌；未分化癌；巨细胞癌和纺锤细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛发基质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；混合型肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉；实体癌；恶性类癌瘤；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡性腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；无包膜形成的硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳腺佩吉特病(mammary paget'sdisease)；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴鳞状上皮化生；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质瘤；恶性泡膜细胞瘤；恶性粒层细胞瘤；和恶性乳母细胞瘤(malignant roblastoma)；塞尔托利氏细胞癌(sertoli cell carcinoma)；恶性莱氏细胞瘤(malignant leydig cell tumor)；恶性脂肪细胞瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳腺外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管肉瘤(glomangiosarcoma)；恶性黑色素瘤；无黑色素性黑色素瘤；浅表扩散性黑色素瘤；巨大色素痣中的恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑色素瘤；恶性蓝痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；恶性混合瘤；米勒管混合瘤(mullerian mixedtumor)；肾胚细胞瘤；肝胚细胞瘤；癌肉瘤；恶性间充质瘤；恶性布伦纳瘤；恶性叶状肿瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢肿瘤；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西肉瘤(kaposi's sarcoma)；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁成骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性软骨母细胞瘤；间充质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因氏肉瘤(ewing's sarcoma)；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞性牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性神经胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维状星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突胶质细胞瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；节细胞神经母细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金氏病(Hodgkin's disease)；霍奇金氏淋巴瘤；类肉芽肿；小淋巴细胞恶性淋巴瘤；弥漫性大细胞恶性淋巴瘤；滤泡性恶性淋巴瘤；蕈样肉芽肿；其他特定的非霍奇金氏淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；骨髓性白血病；嗜碱细胞性白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；髓样肉瘤；和毛细胞白血病。
在一些实施方案中，所治疗的癌症为表达CD38的癌症。
在一些实施方案中，癌症包括实体瘤。在一些实施方案中，肿瘤为腺癌、肾上腺肿瘤、肛门肿瘤、胆管肿瘤、膀胱肿瘤、骨肿瘤、血源性肿瘤、脑/CNS肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、结肠直肠肿瘤、子宫内膜肿瘤、食道肿瘤、尤因氏肿瘤、眼肿瘤、胆囊肿瘤、胃肠道肿瘤、肾肿瘤、喉或下咽肿瘤、肝肿瘤、肺肿瘤、间皮瘤肿瘤、多发性骨髓瘤肿瘤、肌肉肿瘤、鼻咽肿瘤、神经母细胞瘤、口腔肿瘤、骨肉瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、阴茎肿瘤、垂体肿瘤、原发性肿瘤、前列腺肿瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺肿瘤、软组织肉瘤、黑色素瘤、转移性肿瘤、基底细胞癌、梅克尔细胞瘤(Merkel cell tumor)、睾丸肿瘤、胸腺肿瘤、甲状腺肿瘤、子宫肿瘤、阴道肿瘤、外阴肿瘤或威尔姆斯肿瘤(Wilms tumor)。
在某些实施方案中，癌症为多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、成人中最常见的白血病、肺癌、前列腺癌或黑色素瘤。
实施例
提供以下实施例以说明某些公开的实施方案，不应解释为以任何方式限制本公开的范围。
实施例1.一般方法
1.1.脂质纳米颗粒的制备
一般而言，将脂质组分以不同摩尔比溶解在100％乙醇中。将RNA货物(例如，Cas9mRNA和sgRNA)溶解在25mM柠檬酸盐缓冲液、100mM NaCl，pH 5.0中，导致RNA货物的浓度为大约0.45mg/mL。
脂质核酸组装体含有可电离脂质A((9Z,12Z)-3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八-9,12-二烯酸酯，也称为3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸酯)、胆固醇、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)和1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲基聚氧乙烯二醇2000(PEG2k-DMG)，摩尔比相应地为50:38:9:3。除非另有说明，否则脂质核酸组装体为以约6的脂质胺与RNA磷酸盐(N:P)摩尔比和1:2的gRNA与mRNA的重量比来配制。
LNP为使用错流技术制备的，所述技术利用乙醇中的脂质与两体积的RNA溶液和一体积的水进行碰撞喷射混合。经由混合十字管使乙醇中的脂质与两体积的RNA溶液混合。经由直列三通使第四股水流与十字管的出口流混合(参见WO2016010840图2)。将LNP在室温下放置1小时，并且进一步用水稀释(大约1:1v/v)。在平板滤芯(Sartorius，100kD MWCO)上使用切向流过滤浓缩LNP，并使用PD-10脱盐柱(GE)将缓冲液交换为50mM Tris、45mM NaCl、5％(w/v)蔗糖，pH 7.5(TSS)。或者，任选地使用100kDa Amicon旋转过滤器浓缩LNP，并使用PD-10脱盐柱(GE)将缓冲液交换到TSS中。然后使用0.2μm无菌过滤器过滤所得混合物。最终将LNP储存在4℃或-80℃直至进一步使用。
1.2.mRNA的体外转录(“IVT”)
使用线性化质粒DNA模板和T7 RNA聚合酶通过体外转录生成含有N1-甲基假U的加帽和多腺苷酸化mRNA。将含有T7启动子、转录序列和多腺苷酸化区域的质粒DNA通过在37℃下与XbaI在以下条件下孵育2小时而线性化：200ng/μL质粒、2U/μL XbaI(NEB)和1x反应缓冲液。通过在65℃下加热反应20min使XbaI失活。从酶和缓冲盐中纯化线性化质粒。通过在以下条件下在37℃下孵育1.5-4小时来进行生成修饰mRNA的IVT反应：50ng/μL线性化质粒；GTP、ATP、CTP和N1-甲基假UTP(Trilink)各2-5mM；10-25mM ARCA(Trilink)；5U/μL T7 RNA聚合酶(NEB)；1U/μL鼠RNA酶抑制剂(NEB)；0.004U/μL无机大肠杆菌焦磷酸酶(NEB)；和1x反应缓冲液。添加TURBO DNA酶(ThermoFisher)至终浓度为0.01U/μL，并且将反应再孵育30分钟以移除DNA模板。根据制造商的方案，使用MegaClear转录清理试剂盒(ThermoFisher)或RNeasy Maxi试剂盒(Qiagen)纯化mRNA。或者，经由沉淀方案纯化mRNA，在一些情况下，随后进行基于HPLC的纯化。简言之，在DNA酶消化后，使用LiCl沉淀、乙酸铵沉淀和乙酸钠沉淀纯化mRNA。对于HPLC纯化的mRNA，在LiCl沉淀和重构后，通过RP-IP HPLC纯化mRNA(参见，例如Kariko等人，Nucleic Acids Research，2011，第39卷，第21期e142)。将选择用于汇集的级分合并并通过如上所述乙酸钠/乙醇沉淀来脱盐。在另一种替代方法中，用LiCl沉淀法纯化mRNA，然后通过切向流过滤进一步纯化。通过测量260nm处的吸光度(Nanodrop)确定RNA浓度，并通过毛细管电泳以Bioanlayzer(Agilent)分析转录物。
化脓性链球菌(“Spy”)Cas9 mRNA为从编码根据SEQ ID NO:801-803(参见表9中的序列)的开放阅读框的质粒DNA中生成的。BC22n mRNA为从编码根据SEQ ID NO:804或805的开放阅读框的质粒DNA中生成的。UGI mRNA为从编码根据SEQ ID NO:807或808的开放阅读框的质粒DNA中生成的。当此段中引用的序列在下文中关于RNA提及时，应理解T应替换为U(其为如上所述的N1-甲基假尿苷)。实施例中使用的信使RNA包含5'帽和3’多腺苷酸化区域，例如，多达100nts。
1.3.下一代测序(“NGS”)和中靶编辑效率分析
根据制造商方案，使用QuickExtractTMDNA提取溶液(Lucigen，目录号QE09050)提取基因组DNA。为了定量测定基因组中靶位置的编辑效率，利用深度测序来鉴定通过基因编辑引入的插入和缺失的存在。PCR引物围绕感兴趣的基因(例如，CD38)内的靶位点设计，并扩增感兴趣的基因组区域。按照本领域中的标准进行引物序列设计。
根据制造商的方案(Illumina)进行额外PCR以添加用于测序的化学物质。在Illumina MiSeq仪器上对扩增子测序。在消除质量分数低的读段之后，将读段与人参考基因组(例如，hg38)比对。将与感兴趣的靶区域重叠的读段与局部基因组序列重新比对以改进比对。接着计算野生型读段的数量与含有C至T突变、C至A/G突变或插入缺失的读段的数量。在以预测的Cas9裂解位点为中心的20bp区域中对插入和缺失进行评分。插入缺失百分比被定义为在20bp评分区域内插入或缺失一个或多个碱基的测序读段的总数除以包括野生型的测序读段的总数。在40bp区域中对C至T突变或C至A/G突变进行评分，所述区域包含20bp sgRNA靶序列的10bp上游和10bp下游。C至T编辑百分比被定义为在40bp区域内具有一个或多个C至T突变的测序读段的总数除以包括野生型的测序读段的总数。类似地计算C至A/G突变的百分比。
实施例2-使用Cas9和BC22n在T细胞中筛选CD38指导RNA
2.1T细胞制备
使用Cas9或BC22n和UGI mRNA在CD38基因座处编辑T细胞，以评估编辑结果和CD38表达的相应损失。所用的指导序列和靶区域列于表1中。如表1所示，包含指导序列的各sgRNA包含SEQ ID NO:202的指导支架，并且已根据SEQ ID NO:300的修饰模式进行修饰。
健康人供体血球分离术是商购获得的(Hemacare)，并且将细胞洗涤并重悬于LOVO装置上的CliniMACS PBS/EDTA缓冲液(Miltenyi Biotec，目录号130-070-525)中。使用CliniMACS Plus和CliniMACS LS一次性试剂盒，使用CD4和CD8磁珠(Miltenyi Biotec，目录号130-030-401/130-030-801)经由阳性选择分离T细胞。将T细胞等分至小瓶中并冷冻保存在Cryostor CS10(StemCell Technologies，目录号07930)中以备将来使用。解冻后，将T细胞以1.0x 106个细胞/mL的密度铺涂于T细胞X-VIVO 15扩增培养基中，所述培养基由含有5％(v/v)胎牛血清(ThermoFisher，目录号A3160902)、50μM(1X)2-巯基乙醇(ThermoFisher，目录号31350010)、1％青霉素-链霉素(ThermoFisher，目录号15140122)、1M N-乙酰基L-胱氨酸(Fisher，目录号ICN19460325)的X-VIVO 15(Lonza，目录号BE02-06Q)构成，它们稀释于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中并归一化至pH 7，补充有100U/mL重组人白介素-2(Peprotech，目录号200-02)、5ng/mL重组人白介素-7(Peprotech，目录号200-07)和5ng/mL重组人白介素-15(Peprotech，目录号200-15)。将T细胞用TransActTM(1:100稀释度，Miltenyi Biotec，目录号130-111-160)活化。在mRNA电穿孔之前，将细胞在37℃下扩增72小时。
2.2用RNA电穿孔进行T细胞编辑
在无菌水中制备含有编码Cas9蛋白(SEQ ID NO:801-803)、BC22n(SEQ ID NO:804或805)或UGI(SEQ ID NO:807或808)的mRNA的溶液。从其储存板中取出50μM CD38靶向sgRNA，并在95℃下变性2分钟，并在室温下孵育5分钟。活化后七十二小时，收获T细胞，将其离心并以12.5x 106个T细胞/mL的浓度重悬于P3电穿孔缓冲液(Lonza)中。对于待电穿孔的各孔，将1x 105个T细胞与200ng Cas9或BC22n mRNA、200ng UGI mRNA和20pmol sgRNA在最终体积为20μL的P3电穿孔缓冲液中混合，如表2中所述。将此混合物一式两份转移至96孔NucleofectorTM板中，并使用制造商的脉冲代码进行电穿孔。将电穿孔的T细胞立即在80μL不含细胞因子的X-VIVO 15培养基中静置15分钟，之后转移至新的平底96孔板中，其中含有额外的90μL X-VIVO 15培养基，补充有2X细胞因子。将所得板在37℃下孵育10天。为了促进扩增，在电穿孔后第3天和第6天，使用含有1X细胞因子的新鲜X-VIVO 15培养基将T细胞分别以1:4和1:3的比率分裂。电穿孔后第9天，将细胞在2个U型底板中以1:2分裂并收集一个板用于NGS测序，而另一个板则在第10天用于流式细胞术。
2.3流式细胞术和NGS测序
在编辑后第10天，通过流式细胞术对T细胞进行表型分析以测定CD38受体表达。简言之，将T细胞与针对CD3(BioLegend，目录号317340)、CD4(BioLegend，目录号300537)、以1:200稀释的CD8(BioLegend，目录号344706)和以1:100稀释于细胞染色缓冲液(BioLegend，目录号420201)中的CD38(BioLegend，目录号303546)的抗体混合物在4℃下孵育30min。随后洗涤细胞并用以1:10,000稀释于细胞染色缓冲液中的DAPI(BioLegend，目录号422801)染色。接着将细胞在Cytoflex流式细胞器(Beckman Coulter)上处理并使用FlowJo软件包进行分析。根据大小、形状、活力和CD38表达对T细胞进行门控。
在第9天，对DNA样品进行PCR和后续的NGS分析，如实施例1中所述。表2示出用BC22n或Cas9编辑的细胞的CD38基因编辑和CD38阳性结果。
表2-使用Cas9或BC22n碱基编辑器编辑CD38后的编辑百分比和CD38阳性细胞百分比
“n.a.”表示无法计算出标准偏差；“无数据”表示运行不成功。
实施例3.脱靶分析
3.1生化脱靶分析
使用生化方法(参见，例如Cameron等人，Nature Methods.6，600-606；2017)使用靶向CD38的特定指导确定由Cas9裂解的潜在脱靶基因组位点。使用NA24385基因组DNA(Coriell Institute)以及具有已知脱靶概况的三个对照指导筛选二十一个靶向人CD38的sgRNA(如表3和表4所示)。在生化测定中使用192nM gRNA和64nM Cas9蛋白的指导浓度检测中靶和潜在脱靶裂解位点的数量，其结果示于表3和表4中。
表3：生化脱靶分析
指导物ID 靶基因 位点
G019768 CD38 10
G019769 CD38 54
G019770 CD38 53
G019771 CD38 6
G019776 CD38 24
G019783 CD38 134
G019785 CD38 11
G019787 CD38 50
G019791 CD38 98
G019795 CD38 60
G019808 CD38 127
G019813 CD38 124
G019818 CD38 208
G019819 CD38 154
G019831 CD38 318
G019834 CD38 45
G019839 CD38 308
G019841 CD38 182
G000644 EMX1 393
G000645 VEGFA 4613
G000646 RAG1B 70
表4：生化脱靶分析
指导物ID 靶基因 位点
G019763 CD38 4
G019788 CD38 124
G019797 CD38 205
G000644 EMX1 276
G000645 VEGFA 3259
G000646 RAG1B 32
3.2用于验证潜在脱靶位点的靶向测序
可使用已鉴定的潜在脱靶位点的靶向测序来评估通过检测测定诸如上面使用的生化方法预测的潜在脱靶位点以确定是否检测到该位点处的脱靶裂解。
在一种方法中，将Cas9和感兴趣的sgRNA(例如，具有用于评估的潜在脱靶位点的sgRNA)引入原代T细胞中。接着溶解T细胞，并使用潜在脱靶位点侧翼的引物生成用于NGS分析的扩增子。在一定水平上对插入缺失的鉴定可验证潜在脱靶位点，而在潜在脱靶位点处所见的插入缺失的缺乏可表明所利用的脱靶预测测定中存在假阳性。
在细胞中编辑后，在潜在脱靶位点处使用扩增子测序进一步评估G019771可能的脱靶插入缺失形成。通过上述生化测定或通过计算机模拟预测来鉴定潜在脱靶位点。
一式三份制备样品。如实施例6中所述制备T细胞。同时用3种LNP处理细胞，每种LNP用SpyCas9 mRNA、UGI mRNA或G019771的单一RNA货物配制。LNP通常如实施例1中所述制备，脂质摩尔比为50脂质A:38.5胆固醇:10DPSC:1.5PEG。将LNP在20ug/ml人ApoE3中预孵育。将大约50,000个细胞用通过如下RNA重量所测量的LNP处理：334ug Cas9 mRNA、334ugG019771、100ug UGI mRNA。将细胞在37C下孵育24小时，接着重悬于新鲜培养基中以供进一步生长。在LNP处理后大约72小时，收获细胞并通常如实施例1中所述或经由rhAmpSeqCRISPR分析系统(IDT)，按照制造商方案，使用被设计以鉴定预测的脱靶位点处插入缺失百分比的引物进行NGS分析。在脱靶裂解位点处具有统计相关插入缺失率的基因座处手动检查修复结构，以确认插入缺失修复结构。在所检查的37个潜在脱靶位点中，一个位于基因间区域的位点显示出与未处理的对照相比少于1％具有统计显著性的插入缺失。与未处理的对照相比，没有其他检查位点显示出统计上显著的编辑。
实施例4.NK细胞中的剂量依赖性编辑
使用2个指导物，以渐增浓度编辑自然杀伤(NK)细胞。根据制造商方案，使用EasySep人NK细胞分离试剂盒(STEMCELL，目录号17955)，从商购获得的白细胞单采物(leukopak)中分离NK细胞。分离后，冷冻保存人原代NK细胞。解冻后，将细胞在含有10％胎牛血清(FBS)、100U/mL白介素-2(IL-2)和1％ Pen-Strep的RPMI 1640培养基中培养过夜。通过将细胞与照射处理的K562 4-1BBL细胞在含有10％ FBS和1％ Pen-Strep的RPMI 1640培养基中1:1培养三天来活化NK细胞。
将NK细胞用递送如表5所示靶向CD38的Cas9 mRNA(SEQ ID NO:802)和gRNA(G019768或G019795)的LNP处理。LNP通常如实施例1中所述制备，其中脂质组合物的摩尔比为50可电离脂质A/38.5胆固醇/10DSPC/1.5PEG。LNP是以约6的脂质胺与RNA磷酸盐(N:P)摩尔比和1:2的gRNA与mRNA的重量比来配制。将LNP在37℃下与1μg/ml重组人ApoE3(Peprotech，350-02)在RPMI培养基中预孵育15分钟。在表5中所示的总RNA货物浓度下，将预孵育的LNP一式两份添加至NK细胞中。在LNP处理后12天，通过流式细胞术分析细胞以测量CD38表面表达率。简言之，将NK细胞与靶向CD3(Biolegend，目录号317344)、CD56(Biolegend，目录号362518)和CD38(Biolegend，目录号303510)的抗体一起孵育。随后洗涤细胞，在Cytoflex仪器(Beckman Coulter)上处理并使用FlowJo软件包进行分析。根据大小和CD3/CD56状态来对NK细胞进行门控。表5和图1示出没有CD38表面表达的NK细胞的百分比。
表5-在编辑的NK细胞中CD38阴性细胞的平均％
实施例5.具有CD38破坏和AAVS1插入的多重编辑
依次编辑自然杀伤(NK)细胞，首先破坏CD38，其次将GFP插入AAVS1基因座中。使用EasySep人NK细胞分离试剂盒(STEMCELL，目录号17955)，根据制造商方案将NK细胞从血沉棕黄层中分离。分离后，冷冻保存人原代NK细胞。解冻后，将人原代NK细胞以1x106个细胞/ml在含有5％胎牛血清和1％ Pen-Strep(CTS OpTmizer完全培养基)与500U/ml IL-2的CTSOpTmizer培养基(Gibco，A10221-01)中培养过夜。通过将细胞与照射处理的K562 4-1BBL细胞在CTS OpTmizer完全培养基中1:1培养1天来活化NK细胞。将细胞洗涤并以0.5x106个细胞/ml铺涂于含有500U/ml IL-2和5ng/ml IL-15的CTS OpTmizer培养基中。
将NK细胞用递送Cas9 mRNA(SEQ ID NO:802)和靶向CD38的gRNA G019768的LNP处理。LNP通常如实施例1中所述制备，其中脂质的摩尔比为50可电离脂质A/38.5胆固醇/10DSPC/1.5PEG。将LNP在37℃下与5μg/ml重组人ApoE3(Peprotech，350-02)在含有2.5％人AB血清(GemCell，100-512)的CTS OpTmizer完全培养基中预孵育15分钟。将预孵育的LNP以5μg/ml总RNA货物一式两份添加至NK细胞中。
在CD38 LNP暴露后一天，用LNP和AAV6处理细胞以在AAVS1基因座处插入GFP。LNP通常如实施例1中所述制备，其中脂质组合物的摩尔比为50可电离脂质A/38.5胆固醇/10DSPC/1.5PEG。将LNP以约6的脂质胺与RNA磷酸盐(N:P)摩尔比和1:2的gRNA与mRNA的重量比来配制。将LNP在37℃下与10μg/ml APOE3在含有2.5％人AB血清、500U/mL IL-2和5ng/mlIL-15的OpTmizer培养基中预孵育约15分钟。将预孵育的LNP以10μg/ml总RNA货物一式两份添加至NK细胞中。编辑后，将编码由其自身启动子驱动的GFP基因和AAVS1序列(SEQ ID1001)的侧翼同源臂的AAV6载体以600,000个基因组拷贝的感染复数(MOI)添加至细胞中。将细胞孵育6天。
活化后八天，通过流式细胞术分析细胞以测量CD38表面表达和GFP表达的速率。简言之，将NK细胞与靶向CD3(Biolegend，目录号317344)、CD56(Biolegend，目录号362518)、CD38(Biolegend，目录号303510)和DAPI的抗体一起孵育。随后洗涤细胞，在Cytoflex仪器(Beckman Coulter)上处理并使用FlowJo软件包进行分析。根据大小和CD3/CD56状态来对NK细胞进行门控。表6和图2显示没有CD38表面表达和有GFP表达的NK细胞的百分比。使用LNP在NK细胞中实现顺序基因破坏和序列插入编辑。
表6-编辑后具有表达表型的NK细胞的百分比。
表达 平均 SD n
CD38-GFP- 27.90 1.75 3
CD38+GFP+ 47.70 3.08 3
CD38-GFP+ 17.13 0.74 3
对于各crRNA，所示20nt指导序列包含在N20GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG核酸序列中，其中“N20”表示指导序列。
使用人参考基因组(例如，hg38)和用户定义的感兴趣的基因组区域(例如，CD38)以计算机模拟进行初始指导选择，以鉴定感兴趣区域中的PAM。对于每个鉴定的PAM，均进行分析并报告统计。基于本领域中已知的许多标准(例如，GC含量、预测的中靶活性和潜在的脱靶活性)进一步选择gRNA分子并排序。
实施例6.CD38的敲除以防止工程化细胞自活化和自相残杀
将健康的人供体T细胞用靶向受体工程化，所述受体将工程化细胞靶向CD38，有或没有CD38的破坏。在T细胞扩增后，工程化细胞的特征为自活化和自相残杀。
实施例6.1.T细胞制备
健康人供体血球分离术是商购获得的(Hemacare)，并且将细胞洗涤，重悬于PBS/EDTA缓冲液(Miltenyi Biotec目录130-070-525)中并在MultiMACSTMCell24 Separator Plus装置(Miltenyi Biotec)中处理。使用人StraightfromCD4/CD8 MicroBead试剂盒(Miltenyi Biotec目录130-122-352)，经由阳性选择分离T细胞。将T细胞等分至小瓶中并冷冻保存于CS10(StemCellTechnologies，目录号07930)中以备将来使用。
解冻后，将T细胞以1.0x 10^6个细胞/mL的密度铺涂于T细胞生长培养基(TCGM)中，所述生长培养基包含CTS OpTmizer T细胞扩增SFM和T细胞扩增补充剂(ThermoFisher目录A1048501)、5％人AB血清(GeminiBio，目录100-512)、1X青霉素-链霉素、1X Glutamax、10mM HEPES、200U/mL重组人白介素-2(Peprotech，目录200-02)、5ng/ml重组人白介素7(Peprotech，目录200-07)和5ng/ml重组人白介素15(Peprotech，目录200-15)。将T细胞在此培养基中静置24小时，此时将它们铺涂以通过脂质纳米颗粒进行编辑。
实施例6.2多重编辑T细胞以通过顺序LNP递送靶向CD38
将T细胞经由一系列基因破坏和插入来工程化。将健康供体T细胞依次用至多3个LNP处理，每个LNP与编码Cas9的mRNA和靶向TRBC(G016239)和TRAC(G013006)的sgRNA在有或没有CD38(G019771)的情况下共同配制。通过使用腺相关病毒(AAV)递送同源定向修复模板，将用于将工程化细胞靶向表达CD38的细胞的转基因受体整合至TRAC切割位点中。
实施例6.3.LNP处理和T细胞的扩增
在每个LNP处理之前，将T细胞以500g离心5min，并重悬于以下T细胞铺涂培养基(TCPM)中：无血清形式的TCGM，含有400U/mL重组人白介素-2(Peprotech，目录200-02)、10ng/ml重组人白介素7(Peprotech，目录200-07)和10ng/ml重组人白介素15(Peprotech，目录200-15)。
LNP通常如实施例1中所述来制备。具有TRAC或TRBC gRNA的LNP使用以下比率：50/38.5/10/1.5脂质A、胆固醇、DSPC和PEG2k-DMG。具有CD38 gRNA的LNP使用以下比率：50/38/9/3脂质A、胆固醇、DSPC和PEG2k-DMG。将LNP以重量比1:2的gRNA与mRNA来制备。每天在以下T细胞处理培养基(TCTM)中制备LNP：含有20ug/mL rhApoE3而无白介素2、5或7的TCGM形式。将LNP在37℃下孵育15分钟并以1:1的体积比递送至T细胞。
第1天，将含有Cas9 mRNA和TRBC sgRNA的LNP以5ug/mL的浓度在含有20ug/mLrhApoE3(Peprotech，目录350-02)的TCTM中孵育。同时，收获T细胞，将其洗涤并以2x106个细胞/mL的密度重悬于具有T Cell TransAct人试剂(Miltenyi，目录130-111-160)的1:50稀释度的TCPM中。将T细胞与LNP-培养基以1:1的比率混合并将T细胞铺涂于培养瓶中直至第3天。
第3天，将含有Cas9 mRNA和TRAC sgRNA的LNP以5ug/mL的浓度在含有20ug/mLrhApoE3(Peprotech，目录350-02)和1μMDNA蛋白激酶抑制剂的TCTM中孵育。同时，洗涤T细胞，并以1x106个细胞/mL的密度重悬于TCPM中。将T细胞与LNP-培养基在培养瓶中以1:1的体积比混合。将携带编码靶向受体的同源定向修复模板的腺相关病毒(AAV)以3x105个基因组拷贝/细胞的MOI添加至T细胞中。培养T细胞直至第4天。
第4天，进行两次单独的处理。对于第1组，将含有Cas9 mRNA和CD38 sgRNA的LNP以5μg/mL的浓度在含有20μg/mL rhApoE3(Peprotech，目录350-02)的TCTM中孵育。同时，洗涤T细胞，并以1x106个细胞/mL的密度重悬于TCPM中。将T细胞与LNP-培养基在培养瓶中以1:1的体积比混合。对于第2组，洗涤T细胞，并以1x106个细胞/mL的密度重悬于TCPM中。将T细胞与含有20ug/mL rhApoE3但无LNP的TCTM以1:1混合。
第5天，将T细胞洗涤并转移至6M孔GREX板(Wilson Wolf，目录80660M)的T细胞生长培养基(TCGM)中，所述生长培养基包含CTS OpTmizer T细胞扩增SFM和T细胞扩增补充剂(ThermoFisher目录A1048501)、5％人AB血清(GeminiBio，目录100-512)、1X青霉素-链霉素、1X Glutamax、10mM HEPES、200U/mL重组人白介素-2(Peprotech，目录200-02)、5ng/ml重组人白介素7(Peprotech，目录200-07)和5ng/ml重组人白介素15(Peprotech，目录200-15)。根据制造商方案，将T细胞在不更换培养基的情况下扩增9天。收获T细胞，通过流式细胞术评估，并冷冻保存于CS10(StemCell Technologies目录号07930)中。
实施例6.4.通过流式细胞术对T细胞编辑的评估
扩增后，通过流式细胞术分析编辑的T细胞，以评估CD38表达的损失。将T细胞与靶向以下分子的抗体混合物一起孵育：CD4(Biolegend，目录317434)、CD8(Biolegend，目录301046)、CD3(Biolegend，目录317336)和CD38(Biolegend，目录303516)。随后洗涤细胞，在Cytoflex LX仪器(Beckman Coulter)上使用FlowJo软件包进行分析。根据大小和CD4/CD8状态对T细胞进行门控，之后测定任何标志物的表达。在用CD38 LNP编辑的T细胞中证实CD38表达的损失。
实施例6.5.通过流式细胞术对T细胞活化的评估
将表达本文所述的靶向受体的工程化T细胞(CD38+/-)与多发性骨髓瘤(MM1.S)靶细胞共培养，所述靶细胞以1:2的效应物与靶标比表达高水平的CD38。为了评估自活化或自相残杀的发生，将表达CD38+/-靶向受体的T细胞在没有靶MM1.S细胞的情况下培养。在包含CTS OpTmizer T细胞扩增SFM和T细胞扩增补充剂(ThermoFisher目录A1048501)、5％人AB血清(GeminiBio，目录100-512)、1X青霉素-链霉素、1X Glutamax和10mM HEPES的无细胞因子培养基中进行共培养。
24小时后，通过流式细胞术分析共培养物以评估CD8+效应T细胞的活化。为此，将细胞与靶向以下分子的抗体混合物一起孵育：CD4(Biolegend，目录317434)、CD8(Biolegend，目录301046)、CD38(Biolegend，目录303516)、CD25(Biolegend，目录302632)和CD69CD25(Biolegend，目录310906)。随后洗涤细胞，在Cytoflex LX仪器(BeckmanCoulter)上使用FlowJo软件包进行分析。根据大小和CD4/CD8状态对T细胞进行门控，之后测定任何标志物的表达。
在MM1.S靶细胞存在下，CD38+和CD38-效应T细胞皆显示出活化标志物CD25和CD69的强烈表达。更重要地，在MM1.S靶细胞不存在下，CD38+效应T细胞显示出可检测的活化标志物表达，而CD38-效应T细胞表达的活化标志物并未高于背景水平。
实施例6.6.CD38 KO效应T细胞的基于荧光素酶的细胞毒性分析
将有和没有CD38破坏的工程化表达靶向受体的T细胞以1:2的效应物与靶标比与表达高水平的CD38的荧光化多发性骨髓瘤(MM1.S)细胞共培养。在包含CTS OpTmizer T细胞扩增SFM和T细胞扩增补充剂(ThermoFisher目录A1048501)、5％人AB血清(GeminiBio，目录100-512)、1X青霉素-链霉素、1X Glutamax和10mM HEPES的无细胞因子培养基中进行共培养。
48小时后，按照制造商说明书，通过Bright-Glo测定(Promega Cat.E2620)测量由活MM1.S细胞产生的荧光素酶的量，其与工程化T细胞毒性成反比。使用Synergy Neo2Hybrid Multi-Mode Reader(BioTek Instruments)测量发光。
虽然表达靶向受体的CD38+和CD38-T细胞均显示出针对靶MM1.S细胞的细胞毒性反应，但CD38-T细胞显示出比CD38+T细胞更大的细胞毒性。
实施例6.7.由CD38+/-T细胞对促炎生物标志物的分泌
为了评估自活化或自相残杀的发生，在MM1.S靶细胞不存在下培养有和没有CD38破坏的表达靶向受体的T细胞。在包含CTS OpTmizer T细胞扩增SFM和T细胞扩增补充剂(ThermoFisher目录A1048501)、5％人AB血清(GeminiBio，目录100-512)、1X青霉素-链霉素、1X Glutamax和10mM HEPES的无细胞因子培养基中进行培养。
24小时后，将培养物以500g离心5min并收集100uL上清液以评估在MM1.S靶细胞不存在下由CD38+和CD38-T细胞分泌的促炎分析物的水平。按照制造商方案，使用来自MesoScale Discovery(目录K15338K-2)的多重免疫测定，并使用MESO QuickPlex SQ 120仪器测量白介素-2(IL2)、干扰素-γ(IFNG)、肿瘤坏死因子-α(TNF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和颗粒酶A(GZMA)的浓度。
在MM1.S靶细胞不存在下，CD38+T细胞显示出分泌的可检测水平的促炎生物标志物，指示自活化或自相残杀。相比之下，CD38-T细胞不分泌高于背景水平的促炎生物标志物，表明没有自相残杀。
实施例7用BC22n、UGI和91聚体sgRNA编辑人T细胞
将如通过NGS所评估的91聚体sgRNA的碱基编辑功效和/或受体敲除与具有相同指导序列的100聚体sgRNA对照进行比较。
实施例7.1.T细胞制备
健康人供体血球分离术是商购获得的(Hemacare)，并且将细胞洗涤，重悬于PBS/EDTA缓冲液(Miltenyi Biotec目录130-070-525)中并在MultiMACSTMCell24 Separator Plus装置(Miltenyi Biotec)中处理。使用人StraightfromCD4/CD8MicroBead试剂盒(Miltenyi Biotec目录130-122-352)，经由阳性选择分离T细胞。将T细胞等分并冷冻保存于CS10(StemCell Technologies，目录07930)中以备将来使用。
解冻后，将T细胞以1.0x 10^6个细胞/mL的密度铺涂于T细胞生长培养基(TCGM)中，所述生长培养基包含CTS OpTmizer T细胞扩增SFM和T细胞扩增补充剂(ThermoFisher目录A1048501)、5％人AB血清(GeminiBio，目录100-512)1X青霉素-链霉素、1X Glutamax、10mM HEPES、200U/mL重组人白介素-2(Peprotech，目录200-02)、5ng/ml重组人白介素7(Peprotech，目录200-07)和5ng/ml重组人白介素15(Peprotech，目录200-15)。将T细胞在此培养基中静置24小时，此时将它们用以1:100体积比添加的T Cell TransActTM，人试剂(Miltenyi，目录130-111-160)活化。在LNP处理之前，将T细胞活化48小时。
实施例7.2.T细胞LNP处理和扩增
活化后四十八小时，收获T细胞，以500g离心5min，并以1x10^6个T细胞/mL的浓度重悬于以下T细胞铺涂培养基(TCPM)中：无血清形式的TCGM，含有400U/mL重组人白介素-2(Peprotech，目录200-02)、10ng/ml重组人白介素7(Peprotech，目录200-07)和10ng/ml重组人白介素15(Peprotech，目录200-15)。将TCPM中的50μL T细胞(5x 10^4个T细胞)每孔添加至平底96孔板中以待处理。
将LNP如实施例1中所述以35/15/47.5/2.5(脂质A/胆固醇/DSPC/PEG2k-DMG)的比率来制备。将LNP以约6的脂质胺与RNA磷酸盐(N:P)摩尔比来配制。LNP包裹单一RNA种类：G019771、G023522、BC22n mRNA或UGI mRNA。
在T细胞处理之前，将包裹sgRNA的LNP在以下T细胞处理培养基(TCTM)中稀释至6.64μg/mL：含有20ug/mL rhApoE3而无白介素2、5或7的TCGM形式。将这些LNP在37℃下孵育15分钟并使用TCTM以1:4连续稀释，得到范围为6.64μg/mL至零的8点稀释系列。类似地，将含有BC22n mRNA或UGI mRNA的单一货物LNP在TCTM中分别稀释至3.32和1.67μg/mL，在37℃下孵育15分钟，并以1:1的体积比与在上一步中连续稀释的sgRNA LNP混合。最后，将来自所得混合物的50μL以1:1的体积比添加至96孔板中的T细胞中。将T细胞在37℃下孵育24小时，此时收获它们，以500g离心5min，重悬于200μL TCGM中并返回孵育箱中。
实施例7.3.通过下一代测序(NGS)对编辑结果的评估
LNP处理后四天，对T细胞进行裂解、各靶向基因座的PCR扩增和后续的NGS分析，如实施例1中所述。表7和图3示出在用质量递减的靶向CD38的100聚体或91聚体sgRNA处理的T细胞中的编辑水平和C至T编辑纯度。
与100聚体形式相比，91聚体sgRNA在以相同浓度递送时产生更高的编辑频率。观察到C至T编辑纯度在100聚体与91聚体sgRNA之间相似。
表7-在用100聚体(G019771)或91聚体形式(G023522)的sgRNA处理的T细胞中CD38基因座处的平均编辑百分比。
实施例7.4.通过流式细胞术对受体敲除的评估
LNP处理后7天，通过流式细胞术分析T细胞以评估受体敲除。将T细胞与可固定的活性染料(Beckman Coulter，目录C36628)和靶向以下分子的抗体混合物一起孵育：CD3(Biolegend，目录317336)、CD4(Biolegend，目录317434)和CD8(Biolegend，目录301046)、B2M(Biolegend，目录316306)、CD38(Biolegend，目录303516)、HLA-A2(Biolegend，目录343304)和HLA-DR，DP，DQ(Biolegend，目录361714)。随后洗涤细胞，在Cytoflex LX仪器(Beckman Coulter)上使用FlowJo软件包进行分析。根据大小、活力和CD8阳性对T细胞进行门控，之后测定任何标志物的表达。将所得数据绘制在GraphPad Prism v.9.0.2上，并使用可变斜率(四参数)非线性回归进行分析。
如表8和图4所示，所测试的91聚体sgRNA优于100聚体形式。
表8–在用100聚体或91聚体形式的靶向CD38的sgRNA处理后，CD38表面受体呈阴性的CD8+T细胞的平均百分比。
实施例8.NK细胞中的剂量依赖性编辑
使用不同浓度的指导RNA或SpyCas9 mRNA编辑自然杀伤(NK)细胞。将来自两个供体的冷冻保存的NK细胞在以下NK生长培养基(NKGM)中培养过夜：CTS OpTmizer培养基(Gibco)，补充有5％人AB血清、10mM HEPES、1X Glutamax和1％ Pen-Strep。通过将细胞与照射处理的K562 4-1BBL细胞在含有500U/ml IL-2和5ng/ml IL-15的NKGM中1:1培养三天来活化NK细胞。
将NK细胞用两种LNP处理，一种递送SpyCas9 mRNA(SEQ ID NO:802)，而另一种递送靶向CD38的gRNA G023522。LNP通常如实施例1中所述使用摩尔比为35脂质A/15DSPC/47.5胆固醇/2.5PEG的脂质组合物来制备。将LNP以约6的脂质胺与RNA磷酸盐(N:P)摩尔比来配制。将G023522LNP从3.3μg/ml开始用0.83μg/ml标准浓度的SpyCas9 mRNA LNP进行4倍连续稀释直至7点并在37℃下用2.5μg/ml重组人ApoE3(Peprotech，350-02)在以下NK编辑培养基(NKEM)中预孵育约10分钟：补充有2.5％人AB血清、10mM HEPES、1X Glutamax、1％Pen-Strep、500U/ml IL-2和5ng/ml IL-15的CTS OpTmizer培养基(Gibco)。也将SpyCas9mRNA LNP从3.3μg/ml开始用0.83μg/ml标准浓度的G023522进行4倍连续稀释并如上所示用ApoE3预孵育。
将预孵育的LNP在表9所示的mRNA和gRNA浓度下一式三份添加至5e5个NK细胞中。在LNP处理后7天，通过流式细胞术分析细胞以测量CD38表面表达率。简言之，将NK细胞与靶向CD3(Biolegend，目录号317344)、CD56(Biolegend，目录号362518)和CD38(Biolegend，目录号303510)的抗体一起孵育。随后洗涤细胞，在Cytoflex仪器(Beckman Coulter)上处理并使用FlowJo软件包进行分析。根据大小和CD3/CD56状态对NK细胞进行门控。表9和图5A-5B示出在没有CD38表面表达的情况下NK细胞的百分比。
表9-在编辑的NK细胞中CD38阴性细胞的平均％
实施例9另外的生化脱靶分析
使用实施例3中所述的方法评估使用91个核苷酸形式的指导物的潜在脱靶DNA裂解，但有以下例外。将基因组DNA在使用前用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)处理。通过用3指导RNA:1Cas9蛋白的摩尔比形成的16nM Cas9 RNP进行生化测定。表10显示为各指导所检测的裂解位点(包括中靶位点)的数量。使用实施例3中所述的靶向测序来验证这些潜在脱靶位点和计算预测的脱靶位点。
表10-生化裂解位点
指导物 靶标 发现的独特位点的总数
G028179 CD38 47
G028542 CD38 53
G028545 CD38 88
G028546 CD38 53
G028547 CD38 133
G000644 EMX1 113
G000645 VEGFA 1254
G000646 RAG1B 117
实施例10用91个核苷酸指导物在NK细胞中的剂量响应性编辑
使用91个核苷酸指导物(G028179、G028542、G028543、G028544、G028545–表12中所示的序列)来评估编辑功效，所述指导物是使用脂质纳米颗粒(LNP)递送至自然杀伤(NK)细胞。将细胞从新鲜分离的CD3耗竭的脐带血单核细胞中扩增5天，在NK MACS培养基(Miltenyi)中用EBV-LCL饲养细胞活化并在培养2天后补充含有IL-2的人AB血清(hAB)。收获细胞并将其重悬于含有2.5％hAB、补充性IL-2(500IU/mL)和IL-15(5ng/mL)细胞因子、和2.5ug/ml ApoE3(Sigma)的OpTmizer培养基中。在96孔组织培养板中，将细胞以每孔1e5个细胞等分。
LNP通常如实施例1中所述使用摩尔比为35脂质A/15DSPC/47.5胆固醇/2.5PEG的脂质组合物和gRNA:mRNA重量比为1:1的货物来制备。将LNP在含有2.5％hAB以及补充性IL-2和IL-15细胞因子的OpTmizer培养基中进行两倍连续稀释。将LNP以表11所示的总RNA货物重量的浓度添加至来自3个供体的NK细胞的双份样品中。在LNP应用后一天，将培养基更换为补充有IL-2(500IU/mL)的NK MACS(Miltenyi)并将细胞返回培养。
LNP处理后八天，通过流式细胞术评估细胞中CD38表面抗原的存在。简言之，将NK细胞与以下抗体混合物一起孵育：抗人CD56Brilliant Violet 650(Biolegend#362532)、抗人CD16 Alexa Fluor 700(Biolegend#302026)、抗人CD38 PerCp-Cy5.5(Biolegend#356614)、抗人NKG2D Brilliant Violet 421(Biolegend#320822)和抗人NKG2AAPC(Biolegend#375108)。随后洗涤细胞，在BD FACSCelesta流式细胞仪上处理并使用FlowJo软件包进行分析。根据FSC/SSC、单细胞、活力、饲养细胞的不存在和表达CD38的NK细胞来对细胞进行门控。表11和图6示出通过在3个供体中的平均编辑计算的CD38 KO的平均百分比。供体均值是在重复中计算的。对于各重复，CD38 KO百分比被计算为100-[(样品的％CD38阳性细胞)/(模拟处理的％同一供体的CD38阳性细胞)x 100]。
表11–在基因编辑后通过流式细胞术所评估的CD38 KO平均百分比(N＝3)
表12.另外的序列

Claims (124)

1.一种工程化细胞，其包含人CD38序列中在chr4:15766497-15871496的基因组坐标内的基因修饰。
2.如权利要求1所述的工程化细胞，其中所述基因修饰在15778541-15778621内。
3.如权利要求1或2所述的工程化细胞，其中所述基因修饰选自插入、缺失和取代。
4.如权利要求1-3中任一项所述的工程化细胞，其中所述基因修饰抑制CD38基因的表达、CD38基因产物的功能或这两者。
5.如权利要求1-4中任一项所述的工程化细胞，其中所述基因修饰包括选自以下的基因组坐标内的至少一个核苷酸的修饰：
；
或任选地选自由以下所靶向的那些的基因组坐标：CD38-8、CD38-9、CD38-10、CD38-11、CD38-16、CD38-23、CD38-25、CD38-27、CD38-28、CD38-31、CD38-34、CD38-35、CD38-36和CD38-37；或CD38-8、CD38-9、CD38-10、CD38-11、CD38-16、CD38-25、CD38-27、CD38-28、CD38-31、CD38-34、CD38-35和CD38-36；或CD38-8、CD38-9、CD38-10、CD38-11、CD38-16、CD38-23、CD38-25、CD38-27、CD38-31、CD38-35、CD38-38、CD38-48、CD38-53、CD38-58、CD38-71、CD38-79和CD38-81；或CD38-3、CD38-8、CD38-11、CD38-28、CD38-35和CD38-37；或CD38-9、CD38-10、CD38-11、CD38-27和CD38-35；或CD38-10、CD38-11和CD38-35；或CD38-8和CD38-35；或CD38-10；或CD38-11；或CD38-35。
6.如权利要求1-5中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞具有减少的CD38蛋白的细胞表面表达。
7.如权利要求6所述的工程化细胞，其中CD38的细胞表面表达低于检测水平。
8.如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞，其中所述基因修饰包括插入缺失。
9.如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞，其中所述基因修饰包括异源编码序列的插入。
10.如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞，其中所述基因修饰包括取代。
11.如权利要求10所述的工程化细胞，其中所述取代包括C至T的取代或A至G的取代。
12.如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞，其中所述基因修饰造成核酸序列的变化，由此在基因修饰之前阻止具有全长蛋白质的氨基酸序列的所述全长蛋白质的翻译。
13.如权利要求12所述的工程化细胞，其中所述基因修饰造成核酸序列的变化，由此在所述全长蛋白质的编码序列中产生提前终止密码子。
14.如权利要求12所述的工程化细胞，其中所述基因修饰造成核酸序列的变化，由此在来自基因组基因座的前体mRNA的剪接中产生变化。
15.如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞，其中所述基因修饰造成来自包含基因修饰的基因的蛋白质的细胞表面表达减少。
16.如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞，其中所述基因修饰造成由包含基因修饰的基因所调控的蛋白质的细胞表面表达减少。
17.如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞包含编码靶向受体的外源核酸，所述靶向受体在所述工程化细胞的表面上表达。
18.如权利要求17所述的工程化细胞，其中所述靶向受体为CAR。
19.如权利要求17所述的工程化细胞，其中所述靶向受体为TCR。
20.如权利要求19所述的工程化细胞，其中所述靶向受体为对CD38具有特异性的CAR。
21.如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞为免疫细胞。
22.如权利要求21所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞为单核细胞、巨噬细胞、肥大细胞、树突细胞或粒细胞。
23.如权利要求21所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞为淋巴细胞。
24.如权利要求23所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞为T细胞。
25.如权利要求21所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞为NK细胞。
26.一种药物组合物，其包含如权利要求1-25中任一项所述的工程化细胞。
27.一种细胞群，其包含如权利要求1-25中任一项所述的工程化细胞。
28.一种药物组合物，其包含如权利要求27所述的细胞群。
29.一种向有需要的受试者施用如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞、细胞群或药物组合物的方法。
30.一种向受试者施用如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞、细胞群或药物组合物作为过继细胞转移(ACT)疗法的方法。
31.如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞、细胞群或药物组合物，用作ACT疗法。
32.一种CD38指导RNA，其与包含选自以下的核苷酸序列的CD38序列特异性杂交：
a.指导序列，其包含选自SEQ ID NO:3、8、9、10、11、16、23、25、26、27、28、31、34、35、36、37、38、48、53、58、59、71、74、79和81的核苷酸序列；
b.指导序列，其包含选自SEQ ID NO:3、8、9、10、11、16、23、25、26、27、28、31、34、35、36、37、38、48、53、58、59、71、74、79、81的序列的核苷酸序列的至少17、18、19或20个连续核苷酸的核苷酸序列；
c.指导序列，其包含与选自SEQ ID NO 3、8、9、10、11、16、23、25、26、27、28、31、34、35、36、37、38、48、53、58、59、71、74、79、81的核苷酸序列具有至少95％同一性或至少90％同一性的核苷酸序列；
d.指导序列，其包含选自SEQ ID NO:8、9、10、11、16、23、25、27、28、31、34、35、36和37的核苷酸序列；
e.指导序列，其包含选自SEQ ID NO:8、9、10、11、16、25、27、28、31、34、35和36的核苷酸序列；
f.指导序列，其包含选自SEQ ID NO:8、9、10、11、16、23、25、27、31、35、38、48、53、58、71、79和81的核苷酸序列；
g.指导序列，其包含选自SEQ ID NO:3、8、11、28、35和37的核苷酸序列；
h.指导序列，其包含选自SEQ ID NO:9、10、11、27和35的核苷酸序列；
i.指导序列，其包含选自SEQ ID NO:10、11和35的核苷酸序列；
j.指导序列，其包含SEQ ID NO:10中列出的核苷酸序列；
k.指导序列，其包含SEQ ID NO:11中列出的核苷酸序列；
l.指导序列，其包含SEQ ID NO:35中列出的核苷酸序列；以及
m.指导序列，其包含选自SEQ ID NO:8和35的核苷酸序列。
33.一种包含指导序列的CD38指导RNA，所述指导序列将RNA指导的DNA结合剂引导至以下基因组坐标内的染色体位置：选自由SEQ ID NO:3、8、9、10、11、16、23、25、26、27、28、31、34、35、36、37、38、48、53、58、59、71、74、79和81所靶向的那些，任选地选自由SEQ ID NO:8、9、10、11、16、23、25、27、28、31、34、35、36和37所靶向的基因组坐标的基因组坐标，任选地选自由SEQ ID NO:8、9、10、11、16、25、27、28、31、34、35和36所靶向的基因组坐标，任选地选自由SEQ ID NO:8、9、10、11、16、23、25、27、31、35、38、48、53、58、71、79和81所靶向的基因组坐标，任选地选自由SEQ ID NO:3、8、11、28、35和37所靶向的基因组坐标，任选地选自由SEQID NO:9、10、11、27和35所靶向的基因组坐标，任选地选自由SEQ ID NO:10、11和35所靶向的基因组坐标，任选地选自由SEQ ID NO:8和35所靶向的基因组坐标，任选地由SEQ ID NO:10所靶向的基因组坐标，任选地由SEQ ID NO:11所靶向的基因组坐标或任选地由SEQ IDNO:35所靶向的基因组坐标。
34.如权利要求32或33所述的指导RNA，其中所述指导RNA为双指导RNA(dgRNA)。
35.如权利要求32或33所述的指导RNA，其中所述指导RNA为单指导RNA(sgRNA)。
36.如权利要求35所述的指导RNA，其还包含在所述指导序列3’处的SEQ ID NO:201的核苷酸序列，其中所述指导RNA包含5’末端修饰或3’末端修饰。
37.如权利要求35所述的指导RNA，其还包含5’末端修饰或3’末端修饰以及包含以下中的一者或多者的gRNA的保守部分：
A.相对于SEQ ID NO:201缩短的发夹1区域，或取代和任选地缩短的发夹1区域，其中
1.在所述取代和任选地缩短的发夹1中至少一个以下核苷酸对被Watson-Crick配对核苷酸取代：H1-1与H1-12、H1-2与H1-11、H1-3与H1-10、或H1-4与H1-9，并且所述发夹1区域任选地缺少
a.H1-5至H1-8中的任一者或两者，
b.以下核苷酸对中的一者、两者或三者：H1-1与H1-12、H1-2与H1-11、H1-3与H1-10、和H1-4与H1-9，或
c.发夹1区域的1-8个核苷酸；或者
2.所述缩短的发夹1区域缺少4-8个核苷酸，优选地4-6个核苷酸；并且
a.位置H1-1、H1-2或H1-3中的一者或多者相对于SEQ ID NO:201是缺失或取代的，或
b.位置H1-6至H1-10中的一者或多者相对于SEQ ID NO:201是取代的；或者
3.所述缩短的发夹1区域缺少5-10个核苷酸，优选地5-6个核苷酸，并且位置N18、H1-12或n中的一者或多者相对于SEQ ID NO:201是取代的；或者
B.缩短的上茎区域，其中所述缩短的上茎区域缺少1-6个核苷酸并且其中所述缩短的上茎区域的6、7、8、9、10或11个核苷酸包含少于或等于4个相对于SEQ ID NO:201的取代；或者
C.在LS6、LS7、US3、US10、B3、N7、N15、N17、H2-2和H2-14中的任一者或多者处相对于SEQID NO:201的取代，其中所述取代基核苷酸既不是后面跟着腺嘌呤的嘧啶，也不是前面跟着嘧啶的腺嘌呤；或者
D.具有上茎区域的SEQ ID NO:201的SpyCas9 sgRNA-1，其中上茎修饰包括对所述上茎区域的US1-US12中的任一者或多者的修饰。
38.如权利要求35所述的指导RNA，其还包含所述指导序列3’处的核苷酸序列GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO:200)。
39.如权利要求35所述的指导RNA，其还包含所述指导序列3’处的核苷酸序列GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC(SEQ IDNO:201)，任选地所述指导序列3’处的
GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO:202)，任选地所述指导序列3’处的
GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU。
40.如权利要求38或39所述的指导RNA，其中所述指导RNA根据模式mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU(SEQ ID NO:300)或mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU(SEQ ID NO:414)进行修饰，其中“N”可为任何天然或非天然核苷酸，m为2'-O-甲基修饰的核苷酸，并且*为核苷酸残基之间的硫代磷酸酯键联；并且其中N共同为如前述权利要求中任一项所述的指导序列的核苷酸序列。
41.如权利要求41所述的指导RNA，其中各N独立地为任何天然或非天然核苷酸并且所述指导序列将Cas9靶向所述CD38基因。
42.如权利要求35-41中任一项所述的指导RNA，其中所述指导RNA包含修饰。
43.如权利要求42所述的指导RNA，其中所述修饰包括2'-O-甲基(2'-O-Me)修饰的核苷酸或2'-F修饰的核苷酸。
44.如权利要求42或43所述的指导RNA，其中所述修饰包括核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键。
45.如权利要求42-44中任一项所述的指导RNA，其中所述指导RNA为sgRNA并且所述修饰包括在所述指导RNA的5’末端处的五个核苷酸中的一者或多者处的修饰。
46.如权利要求42-45中任一项所述的指导RNA，其中所述指导RNA为sgRNA并且所述修饰包括在所述指导RNA的3’末端处的五个核苷酸中的一者或多者处的修饰。
47.如权利要求42-46中任一项所述的指导RNA，其中所述指导RNA为sgRNA并且所述修饰包括在所述指导RNA的5’末端处的四个核苷酸中的各者之间的PS键。
48.如权利要求42-47中任一项所述的指导RNA，其中所述指导RNA为sgRNA并且所述修饰包括在所述指导RNA的3’末端处的四个核苷酸中的各者之间的PS键。
49.如权利要求42-47中任一项所述的指导RNA，其中所述指导RNA为sgRNA并且所述修饰包括在所述指导RNA的5’末端处的前三个核苷酸中的各者处的2’-O-Me修饰的核苷酸。
50.如权利要求42-49中任一项所述的指导RNA，其中所述指导RNA为sgRNA并且所述修饰包括在所述指导RNA的3’末端处的最后三个核苷酸中的各者处的2’-O-Me修饰的核苷酸。
51.一种包含如权利要求33-50中任一项所述的指导RNA和RNA指导的DNA结合剂的组合物，其中所述RNA指导的DNA结合剂为多肽RNA指导的DNA结合剂或编码RNA指导的DNA结合剂多肽的核酸，任选地所述RNA指导的DNA结合剂为Cas9核酸酶。
52.如权利要求51所述的组合物，其中所述RNA指导的DNA结合剂为能够在DNA序列内进行修饰的多肽。
53.如权利要求52所述的组合物，其中所述RNA指导的DNA结合剂为化脓性链球菌Cas9核酸酶。
54.如权利要求51-53中任一项所述的组合物，其中所述核酸酶选自裂解酶、切口酶和死核酸酶的组。
55.如权利要求51所述的组合物，其中所述编码RNA指导的DNA结合剂的核酸选自：
a.DNA编码序列；
b.具有开放阅读框(ORF)的mRNA；
c.表达载体中的编码序列；
d.病毒载体中的编码序列。
56.如权利要求32-50中任一项所述的指导RNA或如权利要求51-55中任一项所述的组合物，其中所述组合物还包含药物上可接受的赋形剂。
57.如权利要求56所述的指导或组合物，其中所述组合物为无热原的。
58.如权利要求32-50中任一项所述的指导RNA或如权利要求51-55中任一项所述的组合物，其中所述指导RNA与脂质纳米颗粒(LNP)相关。
59.一种在细胞内对CD38序列进行基因修饰的方法，其包括使所述细胞与如权利要求32-58中任一项所述的指导RNA或组合物接触。
60.一种制备用于免疫疗法的细胞群的方法，其包括：
a.用如权利要求32-59中任一项所述的CD38指导RNA或组合物对所述群中所述细胞的CD38序列进行基因修饰；和
b.扩增培养中的所述细胞群。
61.如权利要求60所述的方法，其还包括使所述细胞与包含CD38指导RNA的LNP组合物接触。
62.如权利要求61所述的方法，其包括使所述细胞与包含指导RNA的第二LNP组合物接触。
63.一种细胞群，其通过如权利要求59-62中任一项所述的方法制得。
64.如权利要求63所述的细胞群，其中所述细胞群是离体改变的。
65.一种药物组合物，其包含如权利要求63或64所述的细胞群。
66.一种向有需要的受试者施用如权利要求63或64所述的细胞群或如权利要求65所述的药物组合物的方法。
67.一种向受试者施用如权利要求63或64所述的细胞群或如权利要求65所述的药物组合物作为过继细胞转移(ACT)疗法的方法。
68.如权利要求63或64所述的细胞群或如权利要求65的药物组合物，用作ACT疗法。
69.一种细胞群，其包含CD38基因的基因修饰，其中所述群中至少40％、45％、50％、55％、60％、65％，优选地至少70％、75％、80％、85％、90％或95％的细胞包含选自内源CD38序列中的插入、缺失和取代的修饰。
70.如权利要求69所述的细胞群，其中所述基因修饰如权利要求1-5中任一项所定义。
71.如权利要求69或70所述的细胞群，其中与合适的对照(例如，其中所述CD38基因未修饰)相比，CD38的表达减少了至少40％、45％、50％、55％、60％、65％，优选地至少70％、75％、80％、85％、90％、95％，或减少至低于测定的检测限。
72.如权利要求69-71中任一项所述的细胞群，其中所述群包含至少103、104、105或106个细胞，优选地107、2x 107、5x 107或108个细胞。
73.如权利要求69-72中任一项所述的细胞群，其中所述群中至少70％的细胞包含选自内源CD38序列中的插入、缺失和取代的修饰。
74.如权利要求69-73中任一项所述的细胞群，其中所述群中至少80％的细胞包含选自内源CD38序列中的插入、缺失和取代的修饰。
75.如权利要求69-74中任一项所述的细胞群，其中所述群中至少90％的细胞包含选自内源CD38序列中的插入、缺失和取代的修饰。
76.如权利要求69-75中任一项所述的细胞群，其中所述群中至少95％的细胞包含选自内源CD38序列中的插入、缺失和取代的修饰。
77.如权利要求69-76中任一项所述的细胞群，其中与合适的对照(例如，其中所述CD38基因未修饰)相比，CD38的表达减少了至少70％，或减少至低于测定的检测限。
78.如权利要求69-77中任一项所述的细胞群，其中与合适的对照(例如，其中所述CD38基因未修饰)相比，CD38的表达减少了至少80％，或减少至低于测定的检测限。
79.如权利要求69-78中任一项所述的细胞群，其中与合适的对照(例如，其中所述CD38基因未修饰)相比，CD38的表达减少了至少90％，或减少至低于测定的检测限。
80.如权利要求69-79中任一项所述的细胞群，其中与合适的对照(例如，其中所述CD38基因未修饰)相比，CD38的表达减少了至少95％，或减少至低于测定的检测限。
81.一种药物组合物，其包含如权利要求69-80中任一项所述的细胞群。
82.如权利要求69-80中任一项所述的细胞群或如权利要求81所述的药物组合物，用作ACT疗法。
83.如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞、组合物、药物组合物或方法，其中所述基因修饰在chr4:15778275-15853232的基因组坐标内。
84.如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞、组合物、药物组合物或方法，其中所述基因修饰在chr4:15778471-15778491的基因组坐标内。
85.如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞、组合物、药物组合物或方法，其中所述基因修饰在chr4:15778541-15778561的基因组坐标内。
86.如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞、组合物、药物组合物或方法，其中所述基因修饰在chr4:15778545-15778565的基因组坐标内。
87.如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞、组合物、药物组合物或方法，其中所述基因修饰在chr4:15778546-15778566的基因组坐标内。
88.如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞、组合物、药物组合物或方法，其中所述基因修饰在chr4:15778551-15778571的基因组坐标内。
89.如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞、组合物、药物组合物或方法，其中所述基因修饰在chr4:15778552-15778572的基因组坐标内。
90.如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞、组合物、药物组合物或方法，其中所述基因修饰在chr4:15778557-15778577的基因组坐标内。
91.如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞、组合物、药物组合物或方法，其中所述基因修饰在chr4:15778573-15778593的基因组坐标内。
92.如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞、组合物、药物组合物或方法，其中所述基因修饰在chr4:15778580-15778600的基因组坐标内。
93.如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞、组合物、药物组合物或方法，其中所述基因修饰在chr4:15778583-15778603的基因组坐标内。
94.如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞、组合物、药物组合物或方法，其中所述基因修饰在chr4:15778584-15778604的基因组坐标内。
95.如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞、组合物、药物组合物或方法，其中所述基因修饰在chr4:15778594-15778614的基因组坐标内。
96.如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞、组合物、药物组合物或方法，其中所述基因修饰在chr4:15778595-15778615的基因组坐标内。
97.如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞、组合物、药物组合物或方法，其中所述基因修饰在chr4:15778601-15778621的基因组坐标内。
98.如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞、组合物、药物组合物或方法，其中所述基因修饰在chr4:15778639-15778659的基因组坐标内。
99.如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞、组合物、药物组合物或方法，其中所述基因修饰在chr4:15816526-15816546的基因组坐标内。
100.如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞、组合物、药物组合物或方法，其中所述基因修饰在chr4:15824930-15824950的基因组坐标内。
101.如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞、组合物、药物组合物或方法，其中所述基因修饰在chr4:15824950-15824970的基因组坐标内。
102.如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞、组合物、药物组合物或方法，其中所述基因修饰在chr4:15824975-15824995的基因组坐标内。
103.如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞、组合物、药物组合物或方法，其中所述基因修饰在chr4:15838107-15838127的基因组坐标内。
104.如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞、组合物、药物组合物或方法，其中所述基因修饰在chr4:15840062-15840082的基因组坐标内。
105.如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞、组合物、药物组合物或方法，其中所述基因修饰在chr4:15840077-15840097的基因组坐标内。
106.如前述权利要求中任一项所述的工程化细胞、组合物、药物组合物或方法，其中所述基因修饰在chr4:15840087-15840107的基因组坐标内。
107.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求81-106中任一项所述的工程化细胞。
108.如权利要求107所述的方法，其还包括向所述受试者施用另外的治疗剂。
109.如权利要求108所述的方法，其中所述另外的治疗剂为CD38靶向疗法。
110.如权利要求109所述的方法，其中所述CD38靶向疗法为抗CD38抗体。
111.如权利要求110所述的方法，其中所述抗CD38抗体选自由达雷木单抗、伊沙妥昔单抗、TAK-079或MOR-202组成的组。
112.如权利要求108所述的方法，其中所述另外的治疗剂为CD38的小分子抑制剂。
113.如权利要求112所述的方法，其中所述小分子抑制剂选自由CD38抑制剂78c、CD38抑制剂1ah和CD38抑制剂1ai组成的组。
114.如权利要求108所述的方法，其中所述另外的治疗剂为NAD+类似物。
115.如权利要求114所述的方法，其中所述NAD+类似物选自由以下组成的组：Ara-F-NAD+、Ara-F-NMN、Ara-F-NMN磷酸酯/C48、Carba-NAD和假-Carba-NAD。
116.如权利要求108所述的方法，其中所述另外的治疗剂为类黄酮。
117.如权利要求116所述的方法，其中所述类黄酮选自由以下组成的组：槲皮素、芹菜素、木犀草啶、矢车菊素和大黄酸/K-大黄酸。
118.如权利要求108所述的方法，其中所述另外的治疗剂为包含嵌合抗原受体的细胞。
119.如权利要求119所述的方法，其中所述嵌合抗原受体特异性结合至CD38。
120.如权利要求107所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：膀胱癌、血液癌、骨癌、骨髓癌、脑癌、乳腺癌、结肠癌、食道癌、胃肠癌、牙龈癌、头癌、肾癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、颈癌、卵巢癌、前列腺癌、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、舌癌或子宫癌，此外，癌症具体地可为以下组织学类型，但不限于这些：恶性肿瘤；癌；未分化癌；巨细胞癌和纺锤细胞癌；小细胞癌；乳头状癌；鳞状细胞癌；淋巴上皮癌；基底细胞癌；毛发基质癌；移行细胞癌；乳头状移行细胞癌；腺癌；恶性胃泌素瘤；胆管癌；肝细胞癌；混合型肝细胞癌和胆管癌；小梁腺癌；腺样囊性癌；腺瘤性息肉中的腺癌；腺癌，家族性结肠息肉；实体癌；恶性类癌瘤；细支气管肺泡腺癌；乳头状腺癌；嫌色细胞癌；嗜酸细胞癌；嗜酸性腺癌；嗜碱细胞癌；透明细胞腺癌；颗粒细胞癌；滤泡性腺癌；乳头状和滤泡状腺癌；无包膜形成的硬化性癌；肾上腺皮质癌；子宫内膜样癌；皮肤附属器癌；大汗腺腺癌；皮脂腺癌；耵聍腺癌；粘液表皮样癌；囊腺癌；乳头状囊腺癌；乳头状浆液性囊腺癌；粘液性囊腺癌；粘液腺癌；印戒细胞癌；浸润性导管癌；髓样癌；小叶癌；炎性癌；乳腺佩吉特病；腺泡细胞癌；腺鳞癌；腺癌伴鳞状上皮化生；恶性胸腺瘤；恶性卵巢间质瘤；恶性泡膜细胞瘤；恶性粒层细胞瘤；和恶性乳母细胞瘤；塞尔托利氏细胞癌；恶性莱氏细胞瘤；恶性脂肪细胞瘤；恶性副神经节瘤；恶性乳腺外副神经节瘤；嗜铬细胞瘤；血管肉瘤；恶性黑色素瘤；无黑色素性黑色素瘤；浅表扩散性黑色素瘤；巨大色素痣中的恶性黑色素瘤；上皮样细胞黑色素瘤；恶性蓝痣；肉瘤；纤维肉瘤；恶性纤维组织细胞瘤；粘液肉瘤；脂肪肉瘤；平滑肌肉瘤；横纹肌肉瘤；胚胎性横纹肌肉瘤；肺泡横纹肌肉瘤；间质肉瘤；恶性混合瘤；米勒管混合瘤；肾胚细胞瘤；肝胚细胞瘤；癌肉瘤；恶性间充质瘤；恶性布伦纳瘤；恶性叶状肿瘤；滑膜肉瘤；恶性间皮瘤；无性细胞瘤；胚胎癌；恶性畸胎瘤；恶性卵巢肿瘤；绒毛膜癌；恶性中肾瘤；血管肉瘤；恶性血管内皮瘤；卡波西肉瘤；恶性血管外皮细胞瘤；淋巴管肉瘤；骨肉瘤；皮质旁成骨肉瘤；软骨肉瘤；恶性软骨母细胞瘤；间充质软骨肉瘤；骨巨细胞瘤；尤因氏肉瘤；恶性牙源性肿瘤；成釉细胞性牙肉瘤；恶性成釉细胞瘤；成釉细胞纤维肉瘤；恶性松果体瘤；脊索瘤；恶性神经胶质瘤；室管膜瘤；星形细胞瘤；原浆性星形细胞瘤；纤维状星形细胞瘤；星形母细胞瘤；胶质母细胞瘤；少突胶质细胞瘤；成少突神经胶质细胞瘤；原始神经外胚层；小脑肉瘤；节细胞神经母细胞瘤；神经母细胞瘤；视网膜母细胞瘤；嗅神经源性肿瘤；恶性脑膜瘤；神经纤维肉瘤；恶性神经鞘瘤；恶性颗粒细胞瘤；恶性淋巴瘤；霍奇金氏病；霍奇金氏淋巴瘤；类肉芽肿；小淋巴细胞恶性淋巴瘤；弥漫性大细胞恶性淋巴瘤；滤泡性恶性淋巴瘤；蕈样肉芽肿；其他特定的非霍奇金氏淋巴瘤；恶性组织细胞增生症；多发性骨髓瘤；肥大细胞肉瘤；免疫增生性小肠疾病；白血病；淋巴性白血病；浆细胞白血病；红白血病；淋巴肉瘤细胞白血病；骨髓性白血病；嗜碱细胞性白血病；嗜酸性粒细胞白血病；单核细胞性白血病；肥大细胞白血病；巨核细胞白血病；髓样肉瘤；和毛细胞白血病。
121.如权利要求107所述的方法，其中所述癌症包括实体瘤。
122.如权利要求107所述的方法，其中所述肿瘤为腺癌、肾上腺肿瘤、肛门肿瘤、胆管肿瘤、膀胱肿瘤、骨肿瘤、血源性肿瘤、脑/CNS肿瘤、乳腺肿瘤、宫颈肿瘤、结肠直肠肿瘤、子宫内膜肿瘤、食道肿瘤、尤因氏肿瘤、眼肿瘤、胆囊肿瘤、胃肠道肿瘤、肾肿瘤、喉或下咽肿瘤、肝肿瘤、肺肿瘤、间皮瘤肿瘤、多发性骨髓瘤肿瘤、肌肉肿瘤、鼻咽肿瘤、神经母细胞瘤、口腔肿瘤、骨肉瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、阴茎肿瘤、垂体肿瘤、原发性肿瘤、前列腺肿瘤、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺肿瘤、软组织肉瘤、黑色素瘤、转移性肿瘤、基底细胞癌、梅克尔细胞瘤、睾丸肿瘤、胸腺肿瘤、甲状腺肿瘤、子宫肿瘤、阴道肿瘤、外阴肿瘤或威尔姆斯肿瘤。
123.如权利要求107所述的方法，其中所述癌症选自由多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病、肺癌、前列腺癌或黑色素瘤组成的组。
124.如权利要求107-123中任一项所述的方法，其中所述癌症为表达CD38的癌症。
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