KR0155574B1 - 주쇄가 변성된 올리고뉴클레오티드 유사체 - Google Patents

주쇄가 변성된 올리고뉴클레오티드 유사체

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KR0155574B1
KR0155574B1 KR1019930703560A KR930703560A KR0155574B1 KR 0155574 B1 KR0155574 B1 KR 0155574B1 KR 1019930703560 A KR1019930703560 A KR 1019930703560A KR 930703560 A KR930703560 A KR 930703560A KR 0155574 B1 KR0155574 B1 KR 0155574B1
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비. 린네 파르샬
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Abstract

증가된 뉴클레아제 내성 및 증가된 세포흡수성을 갖는 치료용 올리고뉴클레오티드 유사체에 관한 것이다. 천연 소중합체에서 발견되는 포스포디에스테르 당-사이 결합을 네원자 연결기로 치환하여 RNA발현의 조절 및 치료에 유용한 독특한 디- 및 폴리-뉴클레오시드 및 뉴클레오티드를 형성한다. 합성방법 및 용도 또한 포함되어 있다.

Description

[발명의 명칭]
주쇄가 변성된 올리고뉴클레오티드 유사체
[관련출원]
본 출원은 미국 특허출원 제 566,836호(1990. 8. 13) 및 제 558,663호(1990. 7. 27)의 일부 계속 출원인 미국 특허출원 제 703,619호(1991. 5. 21)의 일부계속출원이다.
[발명의 분야]
본 발명은 치료, 진단 및 연구 시약으로 유용한, 뉴클리아제에 내성을 가진 올리고뉴클레오티드 유사체에 관한 것이다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드는, 천연 핵산에서 당 사이를 결합시키는 포스포로디에스테르 결합 대신에, 변성된 결합을 갖는다. 본 발명의 유사체는 뉴클레아제 분해에 내성이 있고 DNA 및 RNA의 활성을 조절할 수 있다. 본 발명은 또한 이들 올리고뉴클레오티드 유사체를 합성하는 방법 및 이들 올리고뉴클레오티드를 사용하여 단백질 생산을 조절하는 방법을 제공한다.
[발명의 배경]
대부분의 질병 상태를 포함하여 포유동물의 생체는 단백질에 의해 영향을 받는다는 것이 공지되어 있다. 직접 또는 효소기능을 통해 작용하는 그러한 단백질은 동물 및 인간의 질병에 많은 영향을 끼치게 된다.
종래의 치료는 일반적으로 그러한 단백질과의 작용으로 그들의 질병을 일으키는 혹은 악화시키는 기능을 완화시키려는 노력에 중점을 두고 있었다. 그러나, 최근에는 그들의 합성과 관련된 분자(즉, 세포내 RNA)와의 작용에 의해 그러한 단백질의 실질적인 생산을 완화시키려는 시도가 행해져 왔다. 이러한 작용은 대응 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 이들의 유사체의 RNA에 대한 잡종화를 포함한다. 잡종화란 RNA 또는 단일가닥 DNA에 대한 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체의 염기서열-특정 수소결합이다. 단백질의 생성을 저해함으로써 최대한의 효과 및 최소한의 부작용을 갖는 치료결과를 기대할 수 있다. 올리고뉴클레오티드 유사체는 또한 비슷한 메카니즘으로 기관에 의한 단백질 생성을 조절할 수도 있다.
다른 치료와 마찬가지로 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체의 약리학적 작용은 특정 세포내 표적에서 이들 시약의 유효농도에 영향을 주는 인자의 수에 의존한다. 올리고뉴클레오티드에 대해 한가지 중요한 인자는 뉴클레아제의 존재하에서의 안정성이다. 변성되지 않은 올리고뉴클레오티드 뉴클레아제에 의해 빠르게 분해되므로 치료제로 유용할 것 같지 않다. 올리고뉴클레오티드의 변성을 뉴클레아제에 대해 내성을 갖게 하므로 매우 바람직하다. 뉴클레아제 내성을 증가시키는 올리고뉴클레오티드의 변성은 당-인산염 주쇄의 인 원자에서 일반적으로 일어난다. 포스포로티오에이트, 메틸 포스포네이트, 포스포르아미데이트 및 포스포로트리에스테르가 여러 가지 레벨의 뉴클레아제 내성을 갖는 것으로 보고되어 왔다. 그러나, 이러한 형태의 인산염-변성 올리고뉴클레오티드는 낮은 잡종화 성질 때문에 곤란하였다. Cohen, J.S., ed. Oligonucleotides: Antisense Inhibitors of Gens Expression,(CRC Press Inc., Boca Raton FL, 1989).
다른 주요 인자로는 질병과정중에는 포함되는 특정세포의 플라즈마 세포막을 통과하는 안티센스 화합물의 성능이 있다. 세포막은 지질-단백질 이중층으로 구성되어 작은, 비이온성, 친유성 화합물을 자유롭게 투과시키나 대부분의 천연 대사물질 및 치료제는 투과시키지 않는다. Wilson, D.B. Ann. Rev. Biochem. 47:933-965(1978).
포유동물의 조직 세포에서의 천연 및 변성된 올리고뉴클레오티드의 생물화적 및 항 비루스 효과는 공지되어 있다. 따라서 이들 시약은 막을 투과하여 세포내 표적에까지 도달할 수 있다. HL-60, 시리안 행스터 섬유아세포, U 937, L 927, CV-1 및 ATH8 세포를 포함하는 다수의 포유동물 세포에의 안티센스 화합물의 적용이 천연 올리고뉴클레오티드 및 뉴클레아제에 내성을 갖는 다른 유사체, 예를 들어 알킬 트리에스테르를 사용하여 연구되어 왔다. Miller, P.S., Braiterman, L.T.-Ts' O, P.O.P., Biochemistry 16:1988-1996(1977); methyl phosphonates, Marcus-Sekura, C.H., Woerner, A.M., Shinozuka, K., Zon, G.,-Quinman, G.V., Nuc. Acids Res. 15:5749-5763(1987)-Miller, P.S., McParland, K.B., Hayerman, K.-Ts' O, P.O.P., Biochemistry 16: 1988-1996(1977)-Loke, S.K., Stein, C., Zhang, X.H. Avigan, M., Cohen, J.-Neckers, L.M. Top. Microbiol. Immunol. 141:282:289(1988).
변성된 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드는 유사체는 천연물보다 쉽게 체내적응이 되지 않는 경우가 있다. 그 결과, 다수의 안티센스 뉴클레오티드들이 실제 치료, 연구 또는 진단 목적으로 사용하기에 불충분하였다.
안티센스 치료를 위해 디자인된 선행기술 올리고뉴클레오티드의 두 가지 다른 심각한 결점은 세포내 RNA에 대한 낮은 잡종화 및 필수적인 RNA 기능을 종료시키는 일정한 화학적 또는 효소가 매개된 작용의 부족이다.
안티센스 올리고뉴클레오티드의 효과를 증가시키고 이러한 문제를 해결하기 위한 변성은 여러 가지 형태로 행해질 수 있다. 이들 변성은 염기 고리 변성, 당 반복단위의 변성, 및 당-인산염 주쇄의 변성을 포함한다. 선행기술의 당-인산염 주쇄의 변성, 특히 인 원자상의 변성은 뉴클레아제에 대한 다양한 레벨의 내성을 갖게 하는데는 효과가 있었다. 그러나, 정확도가 안티센스 방법론에 기초를 두고 있는 특정 DNA 또는 RNA에 결합하는 안티센스 뉴클레오티드의 능력에 불구하고 변성된 인의 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 낮은 잡종화 성질 때문에 곤란하였다.
인 원자의 치환은 프로카이랄 인산염 반복단위상의 변성과 관련된 문제점을 피하기 위한 시도에서 다른 접근방법이었다. 인 원자의 치환으로 얻어진 몇 변성은 Matteucci, M. Tetrahedron Letters 31: 2385-2388(1990)에 기재된 것, 주쇄를 통해 포름아세탈 결합이 균일하게 삽입되지 않으므로 사용 가능한 방법론에 제한이 있었고 불안정하였으며 작업에 부적합하였고; Cormier, Nucleic Acids Rexsearch 16: 4583-4594(1988)에 기재된 것, 인 원자를 디이소프로필실일으로 치환하는 것으로 방법론, 단일중합체의 용해도 및 잡종화 성질에 의해 제한되었고; Stirchak, Jourmal of Organic Chemistry 52: 4202-4206(1987)에 기재된 것, 인 결합을 카바메이트 또는 모르폴리노 결합을 포함하는 짧은 단일중합체로 치환하는 것으로, 방법론, 생성분자의 용해도 및 잡종화 성질에 의해 제한되었으며; Mazur Tetrahedrou 40: 3949-3956(1984)에 기재된 것, 인 결합을 포스폰 결합으로 치환한 것으로 단일 삼중합체분자의 합성 이상으로 발전되지 못했고; 및 Goochild, J., Bioconjugate Chemistry 1: 165-187(1990)에 기재된 것, 에스테르 결합이 에스테르 분해효소에 의해 분해되고 따라서 안티센스 적용에서 인산염 결합을 치환하기에 부적합한 것, 등이 있었다.
인 주쇄의 사용 가능한 변성방법의 제한으로 인해 뉴클레아제에 내성 및 안티센스 올리고뉴클레오티드 진단 치료, 및 연구를 위한 만족스런 잡종화 성질을 갖게 하는 다른 변성이 끊임없이 오래도록 요구되어져 왔다.
[발명의 목적]
본 발명의 목적은 안티센스 올리고뉴클레오티드 진단, 연구시약 및 치료에 사용하기 위한 올리고뉴클레오티드 유사체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 증가된 세포 흡수성을 가지는 올리고뉴클레오티드 유사체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 변성되지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드보다 큰 효율성을 갖는 올리고뉴클레오티드 유사체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 그러한 올리고뉴클레오티드의 합성방법 및 용도를 제공하는 것이다.
이러한 목적 및 다른 목적들은 본 명세서 및 특허청구범위에 의해 당업자에게 명백해질 것이다.
[발명의 요약]
본 발명에 따라 RNA 또는 DNA 분자의 활성을 조절하는데 사용되는 조성물은 일반적으로 주쇄가 변성된 올리고뉴클레오티드로 구성된다. 이러한 변성에서 천연 핵산에서 발견되는 당-인산염 주쇄의 포스포로디에스테르 결합은 다양한 네원자 결합기로 치환된다. 그러한 네원자 결합기는 하나의 당 또는 당 유사체의 3'-탄소 및 바로 옆의 당 또는 당 유사체의 4'-탄소 사이에 바람직한 네원자 스페이스를 유지한다. 본 발명에 따라 제조되는 올리고뉴클레오티드 유사체는 단일가닥 또는 이중가닥 DNA 또는 RNA의 미리 선택된 뉴클레오티드 염기서열과 특정적으로 잡종화 가능한 선택된 염기서열로 구성되어 있다. 이들은 예를 들어, 공지의 고체상 합성방법을 통해 합성되어 RNA 또는 DNA의 미리 선택된 뉴클레오티드 염기서열과 대응 또는 특정적으로 잡종화 가능하게 된다. 일반적으로 핵산 합성기를 사용할 수 있으며 이것의 사용은 일반적으로 바람직한 길이의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체를 생성하는데 유효한 것으로 당업자에게 이해된다.
본 발명에서 뉴클에오시드는 헤테로고리염기 및 그것의 당으로 구성된 단위를 말한다. 뉴클레오티드는 3' 또는 5' 당 히드록실기에 인산염기를 갖는 뉴클레오시드를 말한다. 따라서, 뉴클레오티드와 달리 뉴클레오시드는 인산염기를 갖지 않는다. 올리고뉴클레오티드는 천연 포스포디에스테르 결합에 의해 당을 통해 결합된 펜토푸라노실그룹 및 천연염기로부터 특정 염기서열로 형성되는 다수의 결합된 뉴클레오티드 단위를 말한다. 이러한 뉴클레오티드 단위는 구아닌, 아데닌, 시토신, 티민 또는 우라실과 같은 핵산 염기를 갖는다. 당은 디옥시리보스 또는 리보스이다. 이것은 천연 및 천연 하부단위로부터 형성된 합성 당을 포함한다.
본 발명에서, 올리고뉴클레오티드 유사체는 올리고뉴클레오티드에 유사하게 작용하고 비-천연 부분을 갖는 것을 말한다. 올리고뉴클레오티드 유사체는 변성된 당 반복단위, 변성된 염기 반복단위 또는 변성된 당-사이 결합을 가질 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 비-포스포디에스테르결합, 즉 변성된 당-사이 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드 유사체는 천연 포스포디에스테르 결합기가 아닌 결합기에 의해 결합된 다수의 뉴클레오시드 단위로된 올리고뉴클레오시드일 수도 있다. 또한, 본 발명의 목적을 위해 소중합체는 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 유사체 또는 올리고뉴클레오시드의 약어일 수 있다. 따라서 소중합체라는 것을 본 발명의 네원자 결합기를 포함하는 다른 결합을 통하거나 천연 포스포디에스테르 결합을 통해 서로 결합된 일련의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 유사체를 말한다. 일반적으로 결합은 한 뉴클레오시드의 3' 탄소로부터 두 번째 뉴클레오시드의 5' 탄소로 이어지나 소중합체는 2'-5' 결합과 같은 다른 결합을 포함할 수 있다.
올리고뉴클레오티드 유사체는 또한 본 발명의 범위에서 다른 변성, 특히 뉴클레아제 내성을 증가시키고 안티센스 치료, 진단, 또는 연구 시약용의 특정 올리고뉴클레오티드로 사용하기 용이한 변성체로 구성될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드의 당 부분이 탄소고리 또는 다른 반복단위로 치환될 때 그것은 더 이상 당이 아니다. 또한, 당-사이 포스포로 디에스테르 결합에 대한 치환과 같은 다른 치환이 있을때 생성물질은 더 이상 진정한 핵산 종류가 아니다. 그러한 치환으로부터 생성되는 화합물을 유사체로 부른다. 본 명세서에서 핵산의 당 부분은 진정한 당 또는 천연 핵산의 당의 일반적인 스페이스를 취한 것이다. 또한, 당-사이 결합은 천연 핵산에서와 같은 형태로 당 또는 당 유사 부분을 서로 결합시키는 반복단위를 포함한다.
본 발명에 따른, 신규의 안티센스 올리고뉴클레오티드 유사체 및 올리고뉴클레오시드는 세포내 흡수, 뉴클레아제 내성 및 잡종화 성질이 증가되고, 지정된 화학적 또는 효소적으로 매개되어 필수적인 RNA 기능을 종료시킨다.
몇 종류의 올리고뉴클레오티드 유사체 조성물은 본 발명의 다른 목적 및 치료에 유용할 수 있다. 그러한 올리고뉴클레오티드 유사체는 몇 개 이상이 하기의 구조를 갖는 하부단위로 형성되어 있다.
상기식에서 : Bx는 다양한 염기 부(moiety);
Q는 O, CH2, CHF 또는 CF2;
X는 H, OH, C1-C10의 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알크아릴 또는 아르알킬; F, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, OCN; O-, S- 또는 N-알킬; O-, S- 또는 N-알켄일; SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알크알릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실일, RNA 분해그룹, 올리고뉴클레오티드의 약리동역학적 성질을 증가시키기 위한 그룹, 또는 올리고뉴클레오티드의 약리역학적 성질을 증가시키기 위한 그룹;
L1및 L4는 CH2, C=O, C=S, C-NH2, C-NHR3, C-OH, C-SH, C-O-R1또는 C-S-R1;
L2및 L3는 각각 CR1R2, C=CR1R2, C=NR3, P(O)R4, P(S)R4, C=O, C=S, O, S, SO, SO2, NR3또는 SiR5R6; 또는 함께 알켄, 알킨, 방향족고리, 탄소고리 또는 헤테로고리 부분을 형성하고; 또는
L1, L2. L3및 L4는 함께 CH=N-NH-CH2또는 CH2-O-N=CH 단위를 형성하며;
R1및 R2는 각각 H, OH, SH, NH2, C1-C10알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 알크아릴, 아르알킬, 알콕시, 티오알콕시, 알킬아미노, 아르알킬아미노, 치환된 알킬아미노, 폴리알킬아미노, 할로, 포르밀, 케토, 벤즈옥시, 카르복스아미도, 티오카르복스아미도; 에스테르, 티오에스테르, 카르복스아미딘, 카르바밀, 우레이도, 구아니디노, RNA 분해그룹, 올리고뉴클레오티드의 약리동역학적 성질을 증가시키기 위한 그룹, 또는 올리고뉴클레오티드의 약리역학적 성질을 증가시키기 위한 그룹;
R3는 H, OH, NH2, 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알콕시, 저급 알켄일, 아르알킬, 알킬아미노, 아르알킬아미노, 치환된 알킬아미노, 헤테로고리알킬, 헤테로고리알킬아미노, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, RNA 분해그룹, 올리고뉴클레오티드의 약리동역학적 성질을 증가시키기 위한 그룹, 또는 올리고뉴클레오티드의 약리역학적 성질을 증가시키기 위한 그룹;
R4는 OH, SH, NH2. O-알킬, S-알킬, NH-알킬, O-알킬헤테로고리, S-알킬헤테로고리, N-알킬헤테로고리 또는 질소-함유 헤테로고리;
R5및 R6는 각각 C1-C6알킬 또는 알콕시;
L2가 P(O)R4, R4가 OH, X가 OH, Bx가 우라실 또는 아데닌이면 L3가 O가 아니며; 또는 L1, L2및 L4가 CH2, X가 H 또는 OH, Q가 O이면 L3가 S, SO 또는 SO2가 아닌 것을 조건으로 한다.
본 발명의 바람직한 예에서, 올리고뉴클레오티드 유사체는 Q가 O인 당으로 구성된다. 다른 예에서는 각 L1및 L4는 CR1R2또는 C=O, 바람직하게는 CR1R2이다. L2및 L3가 각각 CR1R2, O, P(O)R4, P(S)R4또는 NR3이고 특히 L2및 L3의 하나가 CR1R2이고 L2및 L3의 다른 하나가 P(O)R4또는 P(S)R4인 것이 또한 바람직하다. L2가 O이고 L3가 P(O)R4또는 P(S)R4인 경우 또한 바람직하다.
본 발명의 다른 예에서, 올리고뉴클레오티드 유사체는 각 L2및 L3가 NR3이고 R3가 바람직하게 H인 것이다. 혹은, 본 발명의 유사체는 L2와 L3가 함께 시클로프로필, 시클로부틸, 에틸렌옥시, 에틸아지리딘 또는 치환된 에틸아지리딘 고리의 일부를 형성하는 것일 수 있다. L2및 L3는 함께 C3-C6탄소고리 또는 4-, 5- 또는 6-원 질소 헤테로고리의 일부를 형성할 수도 있다.
X가 H 또는 OH이거나, F, O-알킬 또는 O-알켄일, 특히 Q가 O인 올리고뉴클레오티드 유사체가 바람직하다. 그룹 Bx는 바람직하게 아데닌, 구아닌, 우라실, 티민, 시토신, 2-아미노아데노신 또는 5-메틸시토신이나 다른 비-천연 종을 사용할 수 있다.
다른 바람직한 예로는 L1및 L4가 각각 CH2, 특히 L2및 L3가 각각 NH인 것이 있다.
혹은 L2및 L3의 하나, 바람직하게는 L3가 O이고 L2및 L3의 다른 하나가 NH인 것도 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 유사체는 주어진 구조의 5 내지 50 하부단위로 구성된다. 올리고뉴클레오티드 유사체의 각 하부단위는 상기 구조를 가질 수 있지만, 하부 단위는 교대로 상기 구조를 갖는 것도 바람직하다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 유사체는 환자의 치료를 위한 투여에 적합한 약제학적 담체내에 바람직하게 제조된다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 유사체는 상응하는 천연 올리고뉴클레오티드에 비해 증가된 뉴클레아제 내성을 나타낸다.
본 발명은 또한 단백질에 대한 핵산 염기서열 코드의 적어도 일부와 특정적으로 잡종화 가능한 올리고뉴클레오티드 유사체로 기관을 접촉시키는 것으로 구성되는 기관내 단백질의 활성 또는 생성을 조절하는 방법에 있어, 올리고뉴클레오티드 유사체의 하부 단위의 적어도 일부가 상기 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.
또한 본 발명은 단백질에 대한 핵산 염기서열 코드의 적어도 일부와 특정적으로 잡종화 가능한 올리고뉴클레오티드 유사체로 단독 또는 약제학적으로 수용가능한 담체와 함께, 기관을 접촉시키는 것으로 구성되는 바람직하지 않은 단백질 생성이 특징적인 질병을 갖는 기관을 처치하는 방법에 있어서, 올리고뉴클레오티드 유사체의 하부단위의 적어도 일부가 상기 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 하기 구조의 첫 번째 단위:
및 하기 구조의 두 번째 단위;
를 제공하고,
상기식에서 Bx는 다양한 염기 단위; Q는 O, CH2, CHF 또는 CF2; E1및 E2는 같거나 다르고 친전자 반응기;
상기 첫번째 및 두번째 단위를 상기 천전자 반응기를 통해 연결기로 커플링하여 상기 올리고뉴클레오티드를 형성하는 것으로 구성되는, 본 발명의 치료방법에 사용하기에 유용한 것을 포함하는, 올리고뉴클레오티드 유사체의 합성방법을 제공한다.
바람직한 방법에서 첫 번째 단위의 친전자 반응기는 할로메틸, 트리플루오로메틸, 술포닐메틸, P-메틸-벤젠 술포닐-메틸, 또는 3'-C-포르밀이고 두번째 단위의 친전자 반응기는 할로겐, 술포닐메틸, P-메틸-벤젠 술포닐 메틸 또는 알데히드이다. 연결기가 히드라진 또는 히드록실아민인 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 상기한 바와 같이 L2또는 L3의 하나가 NR3이고 R3가 H인 올리고뉴클레오티드 유사체의 L2또는 L3질소단위를 보호하는 방법을 제공한다. 이 방법은 질소 단위를 펜옥시 아세틸 클로라이드로 보호하고, 올리고뉴클레오티드 유사체를 더 반응시켜 변성시킨 후 수산화암모늄의 질소단위로 보호기를 제거하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 이작용기의 하나가 알데히드인 이작용성 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 유사체를 보호하는 방법을 제공한다. 이 방법은 메톡시아민과 반응시켜 알데히드의 옥심 유도체를 형성하고, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체를 더 반응시켜 변성한 후 옥심을 아세트 알데히드와 반응시켜 알데히드를 재생하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한 펜타푸라노실 뉴클레오시드의 3' 탄소원자에 라디칼을 생성시키고, 다른 펜타푸라노실 뉴클레오시드의 5' 위치상에 있는 옥심단위와 상기 라디칼을 반응시키는 것을 포함하는 상기 올리고뉴클레오티드 유사체의 합성 방법을 제공한다.
적어도 일부의 상기 올리고뉴클레오티드 유사체를 다른 올리고뉴클레오티드 중에서 결합시켜 커플링된 부분과 교대로 천연 형태의 포스포디에스테르 결합을 갖는 상기의 다른 올리고뉴클레오티드 유사체를 제공하는 것으로 치료 조성물을 제제형으로 만들 수 있다. 결합은 바람직하게 미리 커플링된, 바람직한 염기서열의 디뉴클레오티드의 포스포디에스테르 결합에 의해 얻어진다.
전구체 뉴클레오시드 또한 본 발명에 의해 제공되며 하기의 구조를 갖는다.
상기식에서;
Bx는 사양한 염기부;
Q는 O, CH2, CHF 또는 CF2;
X는 H, OH, C1-C10저급알킬, 치환된 저급알킬, 알크아릴 또는 아르알킬; F, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, OCN; O-, S- 또는 N-알킬; O-, S- 또는 N-알켄일; SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실일, RNA 분해그룹, 올리고뉴클레오티드의 약리 동역학적 성질을 증가시키는 그룹, 또는 올리고뉴클레오티드의 약리역학적성질을 증가시키는 그룹;
Y는 히드록실, 아미노메틸, 히드라지노메틸, 히드록시메틸, C-포르밀, 프탈이미도히드록시메틸, 아릴-치환된 이미다졸이디노, 아미노히드록시메틸, O-메틸아미노벤젠티오, 메틸포스포네이트 및 메틸알킬포스포네이트;
Z는 H, 히드록실 아미노메틸, 히드라지노메틸, 히드록시메틸, C-포르밀, 프탈이미도히드록시메틸, 아릴-치환된 이미다졸이디노, 아미노히드록시메틸, O-메틸아미노벤젠티오, 메틸포스포네이트 또는 메틸알킬포스포네이트; 이고
Q가 O이고 Y가 히드록시메틸이며 X가 H 또는 OH일 때 Z는 C-포르밀이 아니고; Q가 O이고 X가 H 또는 OH이며 Z가 히드록실일 때 Y는 아미노히드록시메틸, 히드라지노메틸 또는 아릴치환된 이미다졸이디노가 아닌 것을 조건으로 한다. X가 H 또는 OH이고 Q가 O인 것이 바람직하다.
본 발명자들은 이러한 목적들을 수행하는데 효과적인 변성된 당 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드 유사체를 발견하였다. 올리고뉴클레오티드 유사체는 바람직하게 5 내지 50 핵산염기 하부단위를 갖는다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 유사체는 단일가닥 또는 이중가닥 DNA 및 RNA의 미리 선택된 뉴클레오티드 염기서열과 잡종화될 수 있다.
본 발명을 구성하는 핵산염기는 티민, 우라실 또는 시토신과 같은 피리미딘 또는 구아닌 또는 아데닌과 같은 퓨린, 또는 5-메틸시토신과 같은 이들의 변성체일 수 있으며, 선택된 염기서열로 배열된다. 당 단위는 리보스 또는 디옥시리보스형태 또는 탄소고리와 같은 당 유사체일 수 있다. 본 발명의 바람직한 예에서, 올리고뉴클레오티드 유사체 또는 올리고뉴클레오시드는 단백질을 코드화하는 HIV mRNA 또는 HIV mRNA의 TAR 구역에 잡종화될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 유사체 또는 올리고뉴클레오티드는 단백질을 결합시키는 HIV mRNA의 TAR 구역의 이차구조와 유사할 수 있다. 다른 바람직한 안티센스 올리고뉴클레오티드 유사체 또는 올리고뉴클레오티드 염기서열은 헤르페스, 파필로마 및 다른 비루스의 대응 염기서열을 포함한다.
본 발명의 변성된 결합은 바람직하게 네원자 연결기를 사용하여 천연의 포스포디에스테르-5'-메틸렌 결합을 대치한다. 본 발명의 이러한 결합은 뉴클레아제 내성 및 세포 흡수성을 증가시킨다. 네원자 연결기에 바람직하게 포함되는 것은 결합된 당 하나상의 3'-디옥시 작용기이다. 네원자 연결기는 L1및 L4가 메틸렌 탄소원자 또는 치환된 탄소원자이고 L2및 L3가 메틸렌 탄소원자, 치환된 탄소원자, 산소원자, 질소원자 또는 치환된 질소원자, 치환된 인원자, 황 또는 치환된 황원자 또는 치환된 규소원자인-L1-L2-L3-L4구조이다. 변성된 결합은 각 결합위치에서 바람직하게 일어난다. 혹은, 교대로 된 결합위치에서 또는 불규칙하게 변성이 일어날 수도 있다. 결합은 중성 또는 음 또는 양으로 하전될 수 있다.
본 발명은 또한 그러한 올리고뉴클레오시드의 합성방법에 관한 것이다. 본 발명은 두 원자 분절 또는 치환된 두 원자 분절의 부가를 통해 3'-디옥시-3'-치환된, 특히 메틸 치환된, 뉴클레오시드를 5'-디옥시-5' 치환된 뉴클레오시드와 커플링하는 방법을 제공한다. 부가반응은 각 뉴클레오시드의 3' 및 5' 위치를 여러 가지 적합한 친전자 단위로 활성화시키고, 적합한 연결기를 부가하여 친전자체와 반응시키는 것을 포함하는 단계적 과정을 통해 일어날 수 있다. 혹은, 그 과정은 간단한 방법으로 수행될 수 있다. 그러한 방법은 DNA 합성기에서 고체 담지체를 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 방법으로 제제형화된 조성물로 기관을 접촉시키는 것으로 구성된 기관에 의한 단백질 생성을 조절하는 방법에 관한 것이다. 단백질의 활성이나 형성을 코드화 하는 DNA 또는 RNA 부분을 미리 선택하여 조절하는 것이 바람직하다. 사용되는 조성물의 표적 부분은, 따라서 미리 선택된 DNA 또는 RNA 부분에 대응하도록 선택된다. 즉 그 부분에 안티센스 뉴클레오티드가 된다.
본 발명은 또한 바람직하지 못한 단백질 생성이 특징인 질병을 갖는 기관의 처치방법에 관한 것이다. 이 방법은 상기 방법으로 제조된 조성물로 기관을 접촉하는 것으로 구성된다. 조성물은 바람직하게 활성이나 생성이 조절될 단백질에 대해 코드화하는 mRNA와 특정적으로 결합하도록 디자인된 것이다. 본 발명은 또한 세포내 비정상 RNA분자의 존재 또는 정상 RNA 분자의 비정상적인 발현을 측정하기 위한 진단방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 연구 및 진단 목적을 위한 RNA의 선택적인 결합방법에 관한 것이다. 그러한 선택적인 강한 결합은 그러한 RNA 또는 DNA를 뉴클레아제 분해에 내성을 갖고 공지의 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체보다 보다 강하게 쉽게 잡종화할 수 있는 본 발명의 조성물과 작용시키는 것으로 수행된다.
[도면의 간단한 설명]
제1도는 본 발명의 일예에 따른 합성 개요도.
제2도는 본 발명의 다른예에 따른 합성 개요도이다.
[발명의 상세한 설명]
선행기술의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 생물학적 활성은 일반적으로 실제 치료 연구 또는 진단용으로 충분히 못했다. 본 발명은 변성된 올리고뉴클레오티드, 즉 올리고뉴클레오티드 유사체 또는 올리고뉴클레오시드, 및 유용한 변성 방법에 관한 것이다.
이들 변성된 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드 유사체는 상응하는 천연물에 비해 증가된 안정성을 나타낸다. 세포외 및 세포내 뉴클레아제는 일반적으로 본 발명의 주쇄가 변성된 올리고뉴클레오티드 유사체 또는 올리고뉴클레오시드를 인식하지 못하며 따라서 결합할 수 없다. 뉴클레아제에 의한 주쇄의 어떤 결합도 감응, 인-산소 결합의 부족으로 인해 분해를 일으키지는 못한다. 또한, 본 발명의 신규의 중성 또는 양하전된 주쇄는 복잡한 단백질 매개과정이 아닌 간단한 통과수송으로 세포로 들어갈 수 있다. 본 발명의 다른 장점은 음하전된 주쇄의 부족으로 음하전된 주쇄를 갖는 표적 RNA에 올리고뉴클레오티드 유사체 또는 올리고뉴클레오시드가 염기서열 특정적 결합을 쉽게 할 수 있고 들어오는 유사하게 하전된 올리고뉴클레오티드를 밀어낼 수 있다는 것이다. 본 발명의 또 다른 장점은 표적 RNA의 촉매적 분해를 시작할 수 있는 작용기의 부착을 위한 자리가 이러한 구조 형태에서 발견된다는 것이다.
본 발명의 바람직한 예로서는, 당간 포스페이트 그룹을 치환하여 하기 구조의 결합기를 갖는 올리고뉴클레오티드의 생성에 관한 것이다.
상기식에서:
Bx는 다양한 염기 부;
Q는 O, CH2, CHF 또는 CF2;
X는 H, OH, C1-C10의 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알크아릴 또는 아르알킬; F, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, OCN; O-, S- 또는 N-알킬; O-, S- 또는 N-알켄일; SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실일, RNA 분해그룹, 올리고뉴클레오티드의 약리동역학적 성질을 증가시키기 위한 그룹, 또는 올리고뉴클레오티드의 약리역학적 성질을 증가시키기 위한 그룹;
L1및 L4는 각각 CH2, C=O, C=S, C-NH2, C-NHR3, C-OH, C-SH, C-O-R, 또는 C-S-R1;
L2및 L3는 각각 CR1R2, C=CR1R2, C=NR3, P(O)R4, P(S)R4, C=O, C=S, O, S, SO, SO2, NR3또는 SiR5R6; 또는 함께 알켄, 알킨, 방향족고리, 탄소고리 또는 헤테로고리 부분을 형성하고;
L1, L2, L3및 L4는 함께 CH=N-NH-CH2또는 CH2-O-N=CH 단위를 구성하고;
R1및 R2는 각각 H, OH, SH, NH2, C1-C10알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 알크아릴, 아르알킬, 알콕시, 티오알콕시, 알킬아미노, 아르알킬아미노, 치환된 알킬아미노, 폴리알킬아미노, 할로, 포르밀, 케토, 벤즈옥시, 카르복스아미도, 티오카르복스아미도; 에스테르, 티오에스테르, 카르복스아미딘, 카르바밀, 우레이도, 구아니디노, RNA 분해그룹, 올리고뉴클레오티드의 약리동역학적 성질을 증가시키기 위한 그룹, 또는 올리고뉴클레오티드의 약리역학적 성질을 증가시키기 위한 그룹;
R3는 H, OH, NH2, 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알콕시, 저급 알켄일, 아르알킬, 알킬아미노, 아르알킬아미노, 치화된 알킬아미노, 헤테로고리알킬, 헤테로고리알킬아미노, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, RNA 분해그룹, 올리고뉴클레오티드의 약리동역학적 성질을 증가시키기 위한 그룹, 또는 올리고뉴클레오티드의 약리역학적 성질을 증가시키기 위한 그룹;
R4는 OH, SH, NH2, O-알킬, S-알킬, O-알킬헤테로고리, S-알킬헤테로고리, N-알킬헤테로고리 또는 질소-함유 헤테로고리;
R5및 R6는 각각 C1-C6알킬 또는 알콕시;
단, L1이 C=O 또는 C=S인 경우에 L2는 NR3가 아니다; 또는 L4가 C=O 또는 C=S인 경우에 L3는 NR3가 아니다; 또는 L2또는 L3의 어느 하나가 C=O 또는 C=S 인 경우에 L2또는 L3의 다른 하나가 NR3가 아니다; 또는 L2는 P(O)R4이고 R4는 OH이고 X는 OH이고 Bx는 우라실 또는 아데닌인 경우에 L3가 O가 아니다; 또는 L1, L2및 L4가 CH2이고 X가 H 또는 OH이고 Q가 O인 경우에 L3가 S, SO 또는 SO2가 아닌 것을 조건으로 한다.
본 발명의 바람직한 예에서 L1및 L4는 메틸렌 그룹이다. 그러나 바람직한 예에서 L2또는 L3의 하나는 아미노 그룹이고 다른 하나는 아미노그룹 또는 산소로 구성될 수 있다. 따라서, L2및 L3는 함께 히드라지노, 아미노히드록실 또는 히드록실아미노일 수 있다. 다른 바람직한 예에서 L1또는 L4의 하나와 L2또는 L3의 하나는 함께 CH=N 그룹일 수 있고 L2또는 L3의 다른 하나는 산소 또는 질소원자이어서 연결기가 옥심 및 히드라존 그룹을 각각 포함할 수 있다. 그러한 옥심 또는 히드라존 연결기는 상기 아미노히드록실 또는 히드라진 그룹으로 환원될 수 있다.
다른 바람직한 예에서, L2및 L3는 치환된 탄소, 아미노, 치환된 아민, 산소, 황, 황의 산화물인 규소이다. 탄소상의 치환기는 수소, 히드록시, 티오, 아미노, 저급알킬, 치환된 저급알킬, 알콕시, 티오알콕시, 저급 알켄일, 아르알킬, 알킬아미노, 아르알킬아미노, 치환된 알킬아미노, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알킬아미노, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 할로겐, 포르밀, 케토, 벤즈옥시, 카르복스아미노, 티오카르복스아미노, 에스테르, 티오에스테르, 카르복스아미딘, 카르바밀, 우레이도, 구아니디노, RNA 분해그룹, 올리고뉴클레오티드의 약리동역학적 성질을 증가시키는 그룹 또는 올리고뉴클레오티드의 약리역학적 성질을 증가시키는 그룹이다. 또 다른 바람직한 예는 L2및 L3가 함께 C=C인 것을 포함한다. 다른 바람직한 예는 L2및 L3가 함께 C-C, C=C, C-N 또는 N-C 이원자 쌍의 고리 구조로 탄소고리, 방향족, 헤테로 방향족 또는 헤테로 고리를 포함하는 것이다. 또 다른 바람직한 예는 L1및 L4가 각각 카르복실, 티오카르복시, 메틸아미노, 메틸히드록시, 메틸티오, 에테르 또는 티오에테르인 것이다.
본 발명은 또한 변성된 당 사이 결합을 갖는 올리고뉴클레오시드의 제조방법에 관한 것이다. 이들 변성은 수동 조작되거나 DNA 합성기와 함께 사용될 수 있는 고체 담지체를 사용하여 효과적으로 행할 수 있다. 일반적으로, 이 과정은 선택된 염기서열에서 서로 인접한 5' 대 3' 의미에서, 상부 뉴클레오시드는 일반적으로 3' 당 자리에서 변성되고 합성단위 1로 불리워진다. 본 발명에서 아데닌, 구아닌, 시토신, 우라실, 티민 및 이들의 유사체의 리보- 및 2'-디옥시리보뉴클레오시드는 변성되어 이들의 3'-디옥시-3'-히드록시메틸 유사체가 된다. 이들 3'-히드록시메틸 그룹은 다양한 형태의 친전자 중심으로 전환된다. 이것은 하기의 바람직한 방법과 같은 여러 가지 방법으로 수행될 수 있다.
한 종류의 출발물질, 3'-디옥시-3'-히드록시메틸 리보뉴클레오시드는 Townsend, Tetrahedron Letters, 31: 3101-3104(1990), Samano, V- M, J Morris, J.O.C 55: 5186-5188(1990) 및 Bergstorm, D.E., Nucleosider 및 Nucleotides 8(8): 1529-1535(1989)에 기재된 바에 의해 제조할 수 있다. 이들 뉴클레오시드의 선택적인 당 히드록실 보호는 표준 2'-탈산화 과정에 의해 수행되고 2', 3'-디디옥시-3'-히드록시메틸 리보뉴클레오시드가 된다. 이 형태의 뉴클레오시드는 선택적으로 보호되고 3'-히드록시메틸 단위는 작용화되어 다양한 적절한 친전자 단위가 된다. 본 발명의 바람직한 예에서, 그러한 친전자 단위는 할로메틸, 트리플루오로메틸, 술포닐메틸, p-메틸벤젠 술포닐메틸, 히드라지노메틸 또는 3'-C-포르밀이다.
하부 뉴클레오시드는 일반적인 5' 당 자리에서 변성되고 합성단위 2로 불리워진다. 아데닌, 구아닌, 시토신, 우라실, 티민 및 이들의 유사체의 리보 및 2'-디옥시리보뉴클레오시드를 이들의 5'-히드록시메틸 그룹으로 변성하여 다양한 형태의 친전자 중심으로 전환하는 것은 일반적인 뉴클레오시드를 사용하는 다양한 방법을 통해 수행될 수 있다. 예를 들어, 5'-디옥시-5'-할로뉴클레오시드, 5'-디옥시-5'-토실 뉴클레오시드 및 5'-알데히드 뉴클레오시드는 Jones G.H.-J.G.Moffat J.A.C.S 90:5337-5338(1968)에 의해 제조되었다.
일반적으로, 합성단위 I은 하기 구조로 구성되고:
합성단위 Ⅱ는 하기 구조로 구성된다:
상기식에서 Bx는 다양한 염기 부이고; Q는 O, CH2, CHF 또는 CF2이고; E1및 E2는 같거나 다르며 친전자 반응기이다.
두 합성단위는 친전자 반응기와 반응하는 연결기를 통해 또는 다른 방법으로 커플링된다. 합성단위 I 및 합성단위 Ⅱ 사이의 커플링은 단계적으로 또는 일체의 방법으로 수행될 수 있으며 본 발명의 변성된 결합을 통해 결합된 디뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 사슬을 형성할 수 있고, 이들 각각은 상기 변성된 결합을 통해 다시 결합될 수 있다.
함축된 작용을 통한 커플링은 암모니아 또는 암모니아 유도체의 존재하에 합성단위 1과 합성단위 2의 친전자 중심 사이에서 일어나며 디뉴클레오시드를 생성한다. 본 발명의 바람직한 예는 히드라진 부가에 의한 공지의 브로모메틸 형태의 합성단위의 커플링으로 CH2NHNHCH2와 같은 -L1-L2-L3-L4-를 갖는 바람직한 결합을 생성하는 것이다. 다른 바람직한 예는 히드록실 아민의 부가에 의해 브로모메틸 형태의 합성단위를 커플링하여 -CH2NHOCH2- 또는 -CH2ONHCH2-와 같은 -L1-L2-L3-L4를 갖는 결합을 생성하는 것이다.
당-사이 결합을 변성하여 디뉴클레오시드 구조를 갖게 하는 다른 방법은 위티그 반응을 사용하는 것이다. 바람직하게, 그러한 반응의 출발물질은 다음 문헌에 기재된 3'-케토뉴클레오시드; Townsend, Tetra hedron Letters 31: 3010-3104(1990); Samano, V- M.J.Morris, J.O.C 55: 5186-5188(1990); 및 Bergstrom, D.E., Nucleoszdes and Nucleotides 8(9): 1529-1535(1989); 또는 다음 문헌에 기재된 5'-알데히드 뉴클레오시드이다; Jones, G.H.-J.G Moffatt J.A.C.S 90: 5337-5338(1968). 출발물질은 벤질 또는 다른 보호기를 갖는 포스포러스 일리드와 반응한다. 본 발명에 유용한 일리드의 하나는 트리페닐포스포란-벤질옥시메틸리덴이다. 본 발명에 유용한 다른 일리드로는 트리페닐 포스포란-벤질옥시에틸리덴이 있다.
비닐그룹의 환원 및 벤질보호기의 수소화 분해로 구아닌, 아데닌, 시토신, 티민, 우라실의 바람직한 뉴클레오시드 또는 이들 뉴클레오시드의 유사체의 5' 또는 3' 위치에 각각 히드록시메틸 및 히드록시에틸 단위가 생긴다. 또한, 위티그반응은 탄소고리 뉴클레오시드의 5' 및 3' 히드록시 알킬 단위를 생성하는데도 사용된다.
친전자 중심을 제공하는 히드록실 그룹의 전환 및 3' 친전자 중심과 5' 친핵 중심의 커플링으로 본 발명의 디뉴클레오시드를 형성할 수 있다. 본 발명의 일예에서, 히드록실 그룹은 전환되어 브롬, 트리플레이트 및 토실레이트와 같은 친전자 중심을 제공한다. 커플링으로 하나 또는 두 개의 헤테로원자를 가진 탄소사슬에 의해 연결된 디뉴클레오시드가 형성된다. 바람직하게 그러한 헤테로원자는 R3, R4, R5및 R6가 상기와 같은 O, NH, NR3, S, SO, SO2, P(O)R4, P(S)R4또는 SiR5R6이다.
3' 또는 5' 카르보닐 뉴클레오시드 및 트리페닐포스포린 메틸리덴 디페닐포스포네이트를 포함하는, 위티그 반응으로부터 유도될 수 있는, 다른 유용한 디뉴클레오시드는 포스포네이트 디뉴클레오시드이다. 이 반응은, 상응하는 5'-또는 3'-히드록실그룹과 축합되어 3'-또는 5' 포스포네이트 결합된 올리고뉴클레오시드를 형성할 수 있는, 메틸 또는 에틸 포스포네이트를 제공한다. 이런 형태의 화학은 생화학적 과정의 연구를 위한 디뉴클레오시드의 포스포네이트의 제조에 기재되어 있다; Moffatt, J.G. J.A.C.S 92: 5510-5513(1970) 및 Mazur A.-B.E. Tropp-R. Engel, Tetrahedrou 40: 3949-3956(1984). 이러한 형태의 커플링을 이용하여, 대칭 비스(메틸트리페닐포스판) 페닐 포스페이트로 3'-케토 뉴클레오시드를 5'-뉴클레오시드에 커플링하여 바람직한 예의 3', 5'-디메틸포스포네이트 결합된 올리고뉴클레오티드를 제조할 수 있다.
위티그 반응외에, 알파 탄소고리 뉴클레오시드의 전환에 의해 3'-히드록시메틸 뉴클레오시드를 제조할 수도 있다. 이것은 하부 또는 알파면에 바람직한 3'-히드록시메틸 그룹을 제공하게 된다. 이 그룹은 보호될 수 있고 3-히드록실그룹(당의 3' 위치에 결합된 고리외 메틸을 3-메틸로 나타냄)은 히드록시메틸 또는 더 긴 히드록시 알킬그룹으로 전환될 수 있다. 3그룹을 전환시키는 한 방법은 케토그룹을 산화시킨후 트리페닐 포스포린 메틸리덴 디페닐 포스포네이트로 위티그 반응시키고 환원시키는 것이다. 더 긴 히드록시알킬 그룹은 이러한 방법으로 3-위치에서 생성될 수 있다. 이 예는 또는 4'-데스메틸-3'-히드록시메틸 뉴클레오시드 합성단위를 제공한다. 이원자 커플링제를 사용하는 이 4'-데스메틸 뉴클레오시드 및 일반적인 3'-히드록시-뉴클레오시드의 커플링은 선행 특허출원 제 566,836호(1990. 8. 13)에 기재된 디뉴클레오시드 합성단위를 제공한다. 상기와 같이 적절한 3'-합성단위로 4-데스메틸 히드록실 그룹을 커플링하면 다수의 다른 형태의 신규한 디뉴클레오시드 합성단위가 생기게 된다.
3'-디옥시-3'-메틸 뉴클레오시드의 메틸그룹을 작용화시키는 또 다른 방법은 3'-디옥시-3'-시아노뉴클레오시드를 이용하는 것이다. Parkers, K.E.B.K.Tay 102, Tetrahedron Letters 29: 2995-2996에는 3'-시아노 뉴클레오시드의 일반적인 합성방법이 기재되어 있다. 이 방법에서 5'-트리틸 보호된 2'-디옥시 뉴클레오시드는 메틸 트리페닐포스포늄 이오다이드로 3'-요오드화된다. 이 물질을 헥사메틸디틴, t-부틸이소니트릴 및 2, 2'-아조.비스이소부티로니트릴(AIBN)으로 처리하여 3'-위치에 시아노 그룹을 라디칼 부가한다. 시아노 그룹을 알데히드로 전환하는 것은 높은 수율로 행할 수 있다. 중간체를 히드록시메틸 작용기를 가지도록 전환하여 친전자 합성단위(1)의 유용한 전구체를 만든다.
당-사이 결합을 변성하여 디뉴클레오시드를 만드는 다른 방법은 3'-C-포르밀 유도된 뉴클레오시드를 합성단위 1로 5'-아미노히드록시 유도된 뉴클레오시드를 합성단위 2로 이용하는 것이다. 합성단위 1 및 2의 직접 커플링으로 옥심 결합을 통해 커플링된 디뉴클레오시드를 얻을 수 있다. 여기에서 옥심은 E/Z 이성질체로 존재한다.
이성질체 화합물은 HPLC로 분리할 수 있다. 여기에서, 옥심 질소원자는 상부 뉴클레오시드의 3'-말단상의 탄소원자에 인접해 있다. 5' 또는 하부 뉴클레오시드의 탄소 원자에 인접한 옥심 질소를 갖는 디뉴클레오시드는 5'-C-포르밀-유도된 뉴클레오시드를 합성단위 2로 3'-디옥시-3'-아미노히드록시메틸 유도된 뉴클레오시드를 합성단위 1로 사용하여 합성할 수 있다. 여기에서도 옥심 E/Z 이성질체가 얻어진다. 두 경우 모두 옥심 결합된 이합체는 소중합체로 직접 결합되는데 유용하고 상응하는 히드록시아미노 결합된 디뉴클레오시드로 환원될 수도 있다. 옥심 결합된 디뉴클레오시드를 디뉴클레오시드 상태 또는 소중합체중의 디뉴클레오시드 단위 상태로서 소듐 시아노보로하이드라이드로 환원하면 상응하는 아미노히드록실 결합된 화합물이 형성된다. 히드록시 아미노 결합된 디뉴클레오시드 또는 큰 소중합체는 아미노히드록실 결합의 아미노 단위에서 알킬화될 수 있고 상응하는 N-알킬아미노 결합을 형성한다.
3'-C-포르밀 유도된 합성단위 1은 몇가지 합성방법에 의해 형성될 수 있다. 바람직한 최근 방법은 상응하는 3'-디옥시-3'-이오도 뉴클레오시드의 라디칼 카르보닐화를 이용하는 것이다. 요오드 화합물은 CO, AIBN, 및 TTMS(트리스(트리메틸실일)실란)으로 처리한다. 혹은 3'-디옥시-3'-시아노 당 또는 뉴클레오시드로부터 합성할 수도 있다. 5'-C-포르밀(5'-알데히드로도 불리워짐) 및 3'-C-포르밀 그룹은 모두 O-메틸 아미노 벤젠 티올을 보호기로 사용하는 쉬운 방법으로 보호될 수 있다. 두 그룹은 모두 질산은 산화에 의해 보호기가 제거될 수 있다.
3'-C-포르밀 뉴클레오시드 합성의 다른 방법은 1-O-메틸-3'-디옥시-3'-O-메틸아미노벤젠티올-5'-트리필-β-D-에리쓰로-펜토 푸라노시드를 사용하는 것이다. 이 화합물은 3'-디옥시-3'-C-포르밀 뉴클레오시드에 대한 전구체로 사용된다. 1-O-메틸-3'-디옥시-3'-O-메틸아미노벤젠티올-5'-트리틸-β-D-에리쓰로-펜토 푸라노시드를 표준 글리코실화 조건을 사용하여 적당한 염기와 반응시킨 후 보호기를 제거하여 뉴클레오시드를 형성한다. 또 다른 방법으로 상응하는 3'-디옥시-3'-이오도 뉴클레오시드로부터 또는 1-O-메틸-3'-디옥시-3'-O-메틸아미노벤젠티올-5'-트리틸-β-D-에리쓰로-펜토 푸라노시드와의 글리코실화 반응을 통해 3'-디옥시-3'-시아노-뉴클레오시드를 제조하는 방법이 있다.
3-O-아미노-3-히드록시메틸 뉴클레오시드 및 상응하는 5'-O-아미노-뉴클레오시드는 N-히드록시프탈이미드, 트리페닐포스핀 및 디이소프로필 아조디카르복실레이트를 사용하는 미쯔노부 조건으로 보호된 프탈이미도 중간체를 통해 용이하게 제조할 수 있다. 3-O-아미노-3-히드록시메틸 뉴클레오시드의 제조에 있어, 트리틸을 뉴클레오시드의 5' 히드록실 그룹에 대한 보호기로 사용한다. 퓨린 및 피리미딘 뉴클레오시드 모두에 대해, N-히드록시프탈 이미드로 반응시키기 전에 3'-히드록시 그룹을 TBDPS로 보호한다. 피리미딘 염기로, 5'-O-아미노-뉴클레오시드를 제조하는데 있어, 3'-히드록실은 5'-위치에 프탈이미도를 도입한 후 TBDPS 보호기로 보호할 수 있다.
당-사이 결합을 변성하여 포스포네이트 결합된 뉴클레오티드를 제조하는 다른 방법으로 3'-C-포스포네이트 이합체 제조를 위한 Mazur, Tetrahedron, 20: 3949(1984)의 Michaelis-Arbuzov 방법을 이용하는 것이 있다. 이 방법은 합성단위 1로 3'-히드록시메틸 뉴클레오시드를 사용한다. 이것을 N-보로모숙신이미드로 처리하여 상응하는 3-브로모메틸 유도체를 생성한다. 합성단위 2는 5'-포스파이트로 선택한다. 합성단위 1 및 2의 커플링으로 3'-C-포스포네이트 결합에 의해 커플링된 디뉴클레오시드를 얻는다. 적합한 보호된 포스파이트를 합성단위 1로 반응시키고 보호기를 제거하여 3'-CH2-포스파이트 중간체를 생성하는 것으로 5'-C-포스포네이트 이합체를 얻을 수 있다. 합성단위 2를 5'-브로모뉴클레오시드를 선택한다. 3'-CH2-포스파이트 중간체를 합성단위 2와 반응시켜 5'-C-포스페이트 이합체를 얻는다. 합성단위 1에 커플링한 후 보호된 포스파이트로서 트리벤질포스파이트를 선택하여 벤질그룹은 수소화분해로 제거할 수 있다. 혹은 5'-디옥시-5'-브로모뉴클레오시드를 포스파이트 에스테르와 반응시켜 5'-포스포네이트를 얻을 수 있다. 이것을 차례로 3'-히드록시메틸 뉴클레오시드와 반응시켜 5'-C-포스포네이트 결합된 이합체를 얻는다.
히드라진, 히드록실 아민 및 다른 본 발명의 연결기로 결합되는, 상기 방법으로부터 생성되는 디뉴클레오시드는 5'-히드록실에서 디메록시트리틸그룹에 의해 보호될 수 있고 3'-히드록실에서의 커플링을 위해 시아노에틸 디이소프로필 포스파이트 단위로 활성화 될 수 있다. 이들 이합체는 포스포르아미디트 커플링 화학에 사용하는 표준, 고체상, 자동화된 DNA 합성에 의해 바람직한 염기서열에 삽입될 수 있다. 따라서 보호된 디뉴클레오시드는 일반적인 포스포디에스테르 결합을 사용하여 특정된 DNA 염기서열의 단위와 결합된다. 생성 올리고뉴클레오티드 유사체 또는 소중합체는 혼합된 주쇄-일부의 일반적인 포스포디에스테르 결합 및 일부의 본 발명의 신규한 네원자 결합-를 갖는다. 이 방법을 15-합체, 염기서열-특정 올리고뉴클레오티드를 용이하게 합성하여 7개의 히드록실아민, 히드라진 또는 다른 형태로 결합된 디뉴클레오티드를 갖도록 할 수 있다. 그러한 구조는 천연의 포스포디에스테르 결합된 올리고뉴클레오티드에 비해 증가된 수용성을 갖는다.
균일한 주쇄 결합을 갖는 올리고뉴클레오티드를 CPG 고체 담지체 및 표준 핵산 합성기, 즉 Biosystem Inc의 380B 및 394 그리고 Milligen/Biosearch 의 7500 및 8800S를 사용해 합성할 수 있다. 초기의 뉴클레오시드(3'-말단에서 1번)을 조절된 공극유리와 같은 고체 담지체에 부착시킨다. 각 새로운 뉴클레오시드를 수동 또는 자동화된 시스템으로 염기서열 특정적인 순서로 부착시킨다. 메틸렌히드라진 결합의 경우, 반복되는 뉴클레오시드 단위는 두 개의 일반형태, 예를 들어 5'-보호된 알데히드 작용기 및 3'-디옥시-3'-C-히드라지노메틸 그룹을 갖는 뉴클레오시드, 또는 5'-디옥시-5'-히드라지노 그룹 및 3'-디옥시-3'-C-포르밀 그룹을 갖는 뉴클레오시드일 수 있다.
각 경우에, 필요한 염기를 후속 염기서열로 부가하는 각 순환을 위해 반복되는 조건은 다음을 포함한다; 5'-알데히드 보호기를 제거하기 위한 산 세척; 3'-메틸렌히드라지노 그룹과 함께 다음 뉴클레오시드를 부가하여 각 히드라존 결합 형성; 및 다양한 시약으로 환원하여 바람직한 메틸렌-히드라진 결합된 CPG-기초 뉴클레오시드 제조. 그러한 유용한 환원제의 하나는 소듐 시아노보로하이드라이드이다.
제1도에 도시된 것은 바람직한 방법이다. 이 방법은 그 위에 보호된 5' 자리를 갖는 합성단위 2가 결합된 고체담지체를 사용한다. 바람직하게, 상기 합성단위의 5' 자리는 DMF로 보호된다. 그 후 합성단위 2의 5' 자리는 약산으로 유리되고 세척되며 산화되어 중간체 생성물을 생성하게 된다. 바람직한 일례로, 알데히드 유도체는 N, N-디페닐에틸렌 디아민과 반응하여 중간체 생성물, 5'-디페닐이미다졸이디노 보호된 합성단위 2를 생성한다. 보다 바람직한 방법에서, 5'-디페닐이미다졸이디노 보호된 합성단위 2는 직접 담지체상에 부하된다. 어떤 방법으로도 중간체 생성물의 보호기를 제거하면 친핵 5' 위치를 갖는 합성단위 2를 얻을 수 있다. 보호된 5'-알데히드 그룹, 예를 들어 5'-디페닐 이미다졸이디노 보호된 3'-디옥시-3'-C-히드라진 염기를 갖는 합성단위 1을 가하여, 예를 들어 소듐 보로시아노 하이드라이드의 부가에 의해, 부착된 합성단위 2와 반응시킬 수 있다. 세척후, 히드라지노 단위를 통해 결합된 디뉴클레오시드를 얻는다. 그후 합성단위 1을 부가하고 산/염기 탈보호로 변성된 당-사이 결합을 통해 서로 결합된 바람직한 염기서열의 소중합체를 얻는 순환을 반복한다.
본 발명의 바람직한 몇 예에서 합성단위 1은 5'-DMT 보호된 3'-C-히드라진 염기이다.
이 단계적 방법의 바람직한 일례는 고체 담지체에 부착하는 동안 합성단위 2의 친전자 중심을 보호하기 위해 디페닐에틸 디아민 부가물(1, 3-디치환된 이미다졸이디노)을 사용한다. Moffatt, J.A.C.S. 90 : 5337-5338(1968). 합성단위 2는 바람직하게 조절된 공극유리 담지체 또는 공지된 다른 적합한 담지체에 부착될 수 있다. 부착은 표준방법으로 수행된다. Gait, M.J. Oligonucleotide Synthesis A Practical Approadh(IRL press 1984) 혹은, 다양한 표준 산화방법으로 보호되고 결합된 뉴클레오시드를 직접산화하여 제조할 수도 있다. 결합된 합성단위 2는 바람직하게 히드라진과 반응하여 환원될 수 있는 시프 염기를 생성한다. 히드록실아민 또한 이 방법에 바람직한 반응물이다.
균일한 주쇄로 결합된 올리고뉴클레오티드의 다른 합성방법이 제2도에 도시되어 있다. 이 방법도 보호된 5' 자리를 갖는 합성단위 2가 결합된 고체 담지체를 사용한다. 이 경우, 합성단위의 5' 자리를 프탈이미도 그룹으로 보호한다. 그후 합성단위 2의 5' 자리를 DCM중의 메틸히드라진으로 유리시키고 DCM : 메탄올로 세척한다. 합성단위 1의 5' 위치의 아미노히드록실 그룹도 프탈이미도 그룹으로 보호한다. 그러한 합성단위 1은 5'-프탈이미도 보호된 3'-디옥시-3'-C-포르밀 뉴클레오시드이다. 합성단위 1을 합성단위 2와 반응시키고 5' 위치의 보호기를 제거한 후 세척하여 다음 5'-아미노히드록시 반응자리를 유리시킨다. 바람직한 염기서열이 이루어질 때까지 충분한 시간동안 합성단위 1을 더 부가하면서 순환을 반복한다. 이 염기서열의 각 뉴클레오시드는 옥심 결합으로 서로 연결되어 있다. 바람직한 올리고뉴클레오시드의 말단 뉴클레오시드는 5'-DMT 보호된 3'-디옥시-3'-C-포르밀 뉴클레오시드로서 염기서열에 부가된다. 옥심결합된 올리고뉴클레오시드를 담지체로부터 제거할 수 있다. 아미노히드록실 결합된 올리고뉴클레오시드가 필요하다면 옥심결합을 소듐 시아노보호하이드라이드로 환원시킨다. 혹은 환원을 옥심결합된 올리고뉴클레오시드가 담지체에 결합된 상태로 수행한다.
본 발명에 따라 하기 구조를 갖는 뉴클레오시드가 또한 제공된다.
상기식에서 : Bx는 다양한 염기 단위 : Q는 O, CH2, CHF 또는 CF2; X는 H, OH, C1-10저급알킬, 치환된 저급알킬, 알크알릴 또는 아르알킬 ; F, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, OCN ; O-, S- 또는 N-알킬 ; O-, S- 또는 N-알켄일 ; SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알크아릴, 아미노알킬아미노, 폴리알킬아미노, 치환된 실일, RNA 분해그룹, 올리고뉴클레오티드의 약리 동역학적 성질을 증가시키는 그룹, 또는 올리고뉴클레오티드의 약리역학적성질을 증가시키는 그룹 ;
Y는 히드록실, 아미노메틸, 히드라지노메틸, 히드록시메틸, C-포르밀, 프탈이미도히드록시메틸, 아릴-치환된 이미다졸이디노, 아미노히드록시메틸, O-메틸아미노벤젠티오, 메틸포스포네이트 및 메틸알킬포스포네이트이다. Z는 H, 히드록실, 아미노메틸, 히드라지노메틸, 히드록시메틸, C-포르밀, 프탈이미도히드록시메틸, 아릴-치환된 이미다졸이디노, 아미노히드록시메틸, O-메틸아미노벤젠티오, 메틸포스포네이트 또는 메틸알킬포스포네이트 ; 이고 Q가 O이고 Y가 히드록시메틸이며 X가 H 또는 OH일 때 Z는 C-포르밀이 아니고 ; Q가 O이고 X가 H 또는 OH이며 Z가 히드록실일 때 Y는 아미노히드록시메틸, 히드라지노메틸 또는 아릴치환된 이미다졸이디노가 아닌 것을 조건으로 한다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 유사체는 진단, 치료 및 연구용 시약으로 사용할 수 있다. 치료용 올리고뉴클레오티드 유사체는 어떤 단백질에 의해 조절되는 질병으로 고통받는 동물에 투여된다. 그러한 질병으로 고통받는 환자에게 그 질병의 증상을 감소시키기에 유효한 양의 올리고뉴클레오티드 유사체를 투여하는 것이 바람직하다.
당업자는 그러한 치료를 위한 처치계획 및 적절한 복용량을 결정할 수 있다. 본 발명의 치료제는 경우, 정맥 또는 근육을 통해 투여하는 것이 일반적으로 바람직하다. 다른 형태의 투여도 또한 가능하다. 담체에 함유시키는 것도 유용하다. 약리학적으로 수용가능한 담체가 몇 예에서 바람직하게 사용된다.
[실시예]
하기 실시예들은 예시적인 것이며 본 발명은 제한하는 것은 아니다. 이들 실시예에 있어서, NMR 이량체 및 기타 그 이상의 올리고뉴클레오시드를 위한, 이량체, 및 기타 그 이상의 올리고뉴클레오시드의 단량체 단위는 5' 터미너스(terminus) 뉴클레오시드부터 3' 터미너스 뉴클레오시드까지의 T1, T2로 표시된다. 즉, T-T 이량체의 5' 뉴클레오시드는 T1이고 3' 뉴클레오시드는 T2이다.
[실시예 1 : 올리고뉴클레오시드에 연결된 메틸렌 히드라진(즉 3'-CH2-NH-CH2-5')용 CPG-바운드 뉴클레오시드의 합성]
[디페닐이미다졸리디노 보호 5'-알데히드 티미딘]
CPG-바운드 티미딘(CPG 기재 1g에 티미딘 30미크로몰, ABI, Foster City, Ca)을 대기 온도에서 Pfitzer, K.E. 및 J.G. Moffatt 의 산화방법과 유사한 방법으로(Journal of Americal Chemical Society 85 : 3027 (1963)) DMSO, 벤젠, DCC, 피리딘 및 트리플루오로아세트산(15㎖/15㎖/2,48g/0.44㎖/0.2㎖)의 혼합물로 처리하여 5'-알데히드 뉴클레오시드를 생성한다. 이 혼합물을 밤새 저장한 다음 여과한다. 이 기재를 옥살산(1:1의 벤젠/DMSO 5㎖내에 1.3g)으로 세척하고, 1,2-디아닐리노 에틸렌(3.0g)으로 1시간동안 처리하고, 여과하여 아세토니트릴로 세척하여 5'-디페닐이미다졸리디노 보호 5'-알데히드 티미딘을 생성한다.
[5'-데옥시-5'-히드라지노-티미딘]
아세토니트틸내에서 히드라진 히드레이트/나트륨 시아노보로히드라이드 용액으로 기재-바운드 5'-알데히드 티미딘을 처리하여 히드로클로라이드염으로서 저장되는 CPG-3'-바운드 5'-데옥시-5'-히드라지노 티미딘을 제공한다.
[5'-디페닐리미다졸리디노 보호-3'-데옥시-3'-C-히드라지노-메틸티미딘]
상업적으로 이용가능한 3'-O-아세틸티미딘을 산화시킨 후 N,N-디페닐에틸렌디아민 유도체(1,3-디페닐이미다졸리디노)로서 보호한다. 이는 공지된 5'-데옥시-5'-디페닐이미다졸리디노-3'-O-아세틸-티미딘을 제공한다.(Pfitzer, K.E. 및 J.G. Moffatt, Journal of American Chemical Society 85 : 3027 (1963)). 이 물질의 가수분해는 대기온도에서 15시간 동안 메탄올 암모니아 처리에 의하여 행해진다. 5'-데옥시-5'-디페닐-이미다졸리디노티미딘(4.5g)을 DMF(100㎖)에 용해시키고 실내온도에서 15시간 동안 트리페닐메틸 포스포니움 요오드로써 처리한다. 이 용매를 감압하에서 제거하고 결과 잔류물을 메탄올로부터 제결정하여 3'-데옥시-3'-요오드-5'-디페닐이미다졸리노 티미딘을 톨루엔 용해시키고 헥사메틸디틴, t-부틸이소니트릴, 및 AIBN으로 처리한다. 이 라디칼 반응은 3'-데옥시-3'-C-포밀-5'-디페닐이미다졸리디노티미딘을 제공하기 위하여, 0℃에서 톨루엔/THF 내에서 디이소부틸알루미늄 히드라이드(DIBAL-H)로써 환원된 3'-데옥시-3'-시아노 유도체를 생성한다. 이 물질을 아세토니트릴내에서 히드라진 히드레이트 및 나트륨 시아노보로 히드라이드로써 처리하여 5'-디페닐이미다졸리디노 보호-3'-데옥시-3'-C-히드라지노메틸 티미딘을 생성한다.
이 물질은 아세테이트 염으로써 편리하게 저장된다.
[실시예 2 : 올리고 뉴클레오시드를 DNA 신디사이저에 연결한 균일한 3'-CH2-NH2-NH-CH2-5' 즉 메틸렌히드라진의 합성]
실시예 1로부터의 디페닐이미다졸리디노 보호 5'-알데히드를 갖는 3'-터미날 뉴클레오시드가 되는 CPG-바운드 디미딘을 Applied Biosystems, Inc. 의(ABI) 칼럼(250㎎, 바운드 뉴클레오시드 10미크로몰)내에 넣고 DNA 신디사이저를 자동화하는 ABI 380 B에 부착시킨다. 데스메틸 뉴클레오시드 단위를 성장쇄에 결합시키기에 필요한 사이클의 컴퓨터 제어 자동 단계는 다음과 같다.
이 절차는 그 생성 뉴클레오시드로서 5'-디메톡시트리틸 치환 뉴클레오시드 단위를 생성한다. 합성의 완료시점에서, 기재로부터의 염기 탈보호와 올리고머 제거가 올리고뉴클레오티드 합성(a practical approach, Ed. M.J. Gait, IRL Press(1984))에 설명된 표준 절차에 의하여 행해진다. 트리틸-온 HPLC 정화후에 수반되는 아세트산탈보호 및 침전은 아세테이트 염으로서 올리고뉴클레오시드를 생성한다.
[실시예 3 : 5'-데옥시-5'-히드라지노 뉴클레오시드의 합성]
[5'-데옥시-5'-히드라지노티미딘 히드로클로라이드]
5'-벤질카르바질-5'-데옥시티미딘을 생성하기 위하여, 5'-O-토실티미딘[Nucleosides Nucleotides 9:89 (1990)](1.98g, 5m㏖), 벤질카르바지드(4.15g, 25m㏖), 활성 분자 시이브(3A, 2g), 및 무수 디메틸아세트아미드(100㎖)를 110℃(욕 온도)에서 16시간 동안 습기를 배제하여 교반시킨다. 생성물을 냉각시키고 감압하에 농축시킨다(욕 온도50℃). 잔류물은 용매로서 CH2Cl2/MeOH (9:1, v/v)를 사용하여 실리카겔 칼럼(5×45㎝)상에서 정제시킨다.
균질 부분을 수집하여 건조될 때까지 증발시키고 EtOH로부터 재결정된 포옴은 0.7g(36%)의 하기 특성을 갖는 5'-벤질카르바질-5'-데옥시티미딘을 생성한다 : 용융점 210℃ ;
흡수성의 분말로서 5'-데옥시-5'-히드라지노티미딘의 히드로클로라이드 염을 제공하기 위하여, 무수 MeOH/HCl(30㎖, HCl 2중량%)내에 목탄(10%, 150㎖)상에 상기 카르바제이트(0.78g, 2m㏖) 및 팔라륨의 혼합물을 실내온도에서 수소대기하에서 1.5시간동안 교반시킨다. 촉매를 제거하기 위하여 셀라이트를 통하여 메탄올계 용액을 여과한다. 필터 케이크는 EtOH(2×25㎖)로써 세척한다. 여과물을 진공하에서 농축시키고 잔류물은 HCl의 미량을 제거하기 위하여 밤새 건조시킨다. 노란색의 잔류물을 메탄올(3㎖)내에 융해시키고 급격히 교반된 에틸 아세테이트(150㎖)용액에 한 방울씩 부가시킨다. 여과된 침전물은 에틸 아세테이트(3×100㎖)로써 세척하고 옅은 노란색의 고형분은 진공에서 건조시켜 0.51g(88%)의 하기 특정을 갖는 5'-데옥시-5'-히드라지노티미딘 히드로클로라이드(흡수성의 분말)을 생성시킨다;
[실시예 4 : 5'-트리틸-1-[2,3-디데옥시-3-C-(포밀)-β-D-에리트로-펜토푸라노실]-티민 및 우라실의 합성]
[3'-C-시아노-3'-데옥시-5'-O-트리틸티미딘]
하기의 제법은 후드하에서 행해져야 하고 어떤 시약의 증기도 흡입해서는 안된다는 것을 주의하여야 한다.
톨루엔(나트륨/벤조페논에서 청정 증류된 21t)내에 3'-데옥시-3'-요오드-O-트리틸티미딘(Verheyden, J.P.H. ; Moffatt, J.G., J. Org. Chem., 35:2868 (1970)) (60g, 0.1㏖), 헤가메틸디틴(36g, 22.7㎖, 0.11㏖), t-부틸이소시아나이드(166G, 225㎖, 2㏖), 및 AIBN(1.6g, 10m㏖)의 현탁액을 30분간 그 반응 혼합물을 통하여 아르곤을 발포시킴으로써 철저히 탈산화시키고 다시 13시간 동안 38℃로 가열시킨다. 그 반응 혼합물을 60℃로 냉각시키고 AIBN(1.6g, 10m㏖)을 부가시켜서 24시간 동안 가열을 계속 한다. 이 기간 동안, 동일한 방법으로 AIBN을 3번 반복하여 부가시킨다.
이 반응 혼합물을 실내온도까지 냉각시키고 미리 포장된 실리카겔 칼럼(헥산내에 1.5㎏)의 상부에 이동시키고 헥산 : Et2O(100%헥산 → 1ℓt의 용해제거물을 사용하여 매번 10%의 물매 변화를 갖는 100% Et2O)로써 용해 제거한다. 대부분의 불순물을 비극성 화합물과 같은 물매 용해중에 제거한다.
Et2O(2ℓt)로써 최종 용해제거하고 적절한 분율로 수집하고 증발시켜 이들이 수집된 순서대로 두 화합물을 생성한다 :(i) 백색 분말(톨루엔/Et2O로부터 결정화된 것, 용융점 153∼157℃)로서의 12.93g(25%)의 3'-C-시아노-3'-데옥시-5'-O-트리틸티미딘);
이 반응 혼합물은 또한 하기 특성을 갖는 4.82g(10%)의 1-(3'-C-시아노-2',3'-디데옥시-5'-O-트리틸-β-D-트레오-펜토푸라노실)-티민을 생성한다.;
에피머라이제이션(Epimerization) ; 메탄올(20㎖)내에 3'-C-시아노-2', 3'-디데옥시-5'-O-트리틸-β-D-트레오-펜토푸라노실)-티민(0.30g, 0.61gm㏖) 현탁액에서 용액의 pH가 약 9에 도달할 때까지 1N의 NaOMe 용액을 한 방울씩 부가시킨다. 그 결과 혼합물을 20시간동안 환류하면서 가열시킨다. 이 용액을 0℃까지 냉각시키고 1N HCl/MeOH로 중화시키고 감압하에서 증발시킨다. 잔류물을 상기 설명과 같이 정제하여 0.185g(62%)의 3'-C-시아노-3'-데옥시-5'-O-트리틸티미딘을 제공한다 (3'-데옥시-3'-C-시아노-5'-O-트리틸티민의 합성은 Tetrahedron Letters 29:2995 (1988)에 보고되었다.) 이 보고서는 3'-데옥시-3'-C-시아노-5'-O-트리틸티민은 단일의 생성물로 생성된다고 제시하고 있지만, 여기서는 혼합물이 생성됨을 발견하였다. 상기 에피머라이제이션에 의하여, 이 혼합물의 크실로(xylo) 화합물은 관심있는 3'-데옥시-3'-C-시아노-5'-O-트리틸티민의 화합물로 변환된다).
[3'-데옥시-3'-C-포밀-5'-O-트리틸티민]
DIBAL-H(톨루엔내의 1M, 5시간에 걸쳐 5부분내의 50㎖)를 아르곤하에서 0℃로 건조 THF(10㎖)내에서 3'-C-시아노-3'-데옥시-5'-O-트리틸티민(9.92g, 20m㏖)의 교반 용액에 부가시킨다. 이 용액은 실내온도에서 1시간동안 교반시켜서 다시 0℃까지 냉각시킨다. 냉각된 용액을 교반시키면서 MeOH(25㎖)를 한 방울씩 부가시키고, 그 부가가 완료된 후에 용액을 실내온도까지 유지시킨다. 포화 Na2SO4수용액(11㎖)을 반응 혼합물에 부가시키고 12시간 동안 교반시킨다. 분말의 무수 Na2SO4(30g)을 그 반응 혼합물에 부가시키고 그 현탁액을 30분간 교반시킨다. 이 현탁액을 여과하여 모든 생성물이 모두 세척되어 분리될 때까지 잔류물을 철저히 MeOH:CH2Cl2(1:9 v/v)로써 세척한다. 이 여과물을 모아서 진공하에서 농축시켜 점착성의 잔류물을 얻는다. 이 잔류물을 용해제거를 위하여 CH2Cl2:MeOH(100% CH2Cl2→ 9:1 v/v)를 사용한 실리카 겔 크로마토그래피에 의하여 정제하여 다음의 특성을 갖는 백색 포움(foam)의 5.45g(55%)의 3'-데옥시-3'-C-포밀-5'-트리틸티민을 얻는다 ;
[1-[3-데옥시-3-C-(포밀)-5-O-트리틸-β-D-에리트로-펜도푸라노실]우라실]
상기의 티미딘 유사체와 동일한 방법으로 제조한 3'-시아노-2', 3'-디데옥시-5'-O-트리틸우리딘의 교반용액에, 아르곤하에서 건조 THF(20㎖)내에서, 10분간에 걸쳐 -10℃로 톨루엔내의 DIBAL-H 용액(Aldrich, 1M. 4㎖)을 부가시킨다. 30분후에 이 반응을 MeOH(5㎖)로써 -10℃로 급냉시킨다. 이 혼합물을 디시 30분간 대기온도에서 교반시키고 진공하에서 농축하기 전에 CH2Cl2(25㎖)로써 희석시킨다. 이 공정을 CH2Cl2(3×25㎖)로써 반복하여 잔류 THF를 제거한다. 이 잔류물을 실리카겔(25g)상에서 플래쉬(flash) 크로마토그래피에 의하여 정제시킨다. CH2Cl2(9:1, v/v)로써 용해제거하고 CH2Cl2/MeOH로부터 결정화하여 다음의 특성을 갖는 5'-O-트리틸-3'-C-포밀-2', 3'-디데옥시우리딘(0.53g, 53%)을 생성시킨다 ;
[방법 B]
[1-[3-데옥시-3-C-(포밀)-5-O-트리틸-β-D-에리트로-펜토푸라노실]티민]
1-메틸-5-O-(t-부틸디페닐실릴)-2,3-디데옥시-3-C-(포밀)-D-에리트로-펜토푸라노제를 Tetrahedron, 44:625(1988)에 개시된 바와 같은 1-메틸-5-(T-부틸디페닐실릴)-2,3-디데옥시-3-C-시아노-D-에리트로-펜토푸라노제의 DIBAL-H 환원을 통하여 90% 수율로 오일로서 얻는다. 3-C-포밀기는 메톡시아민으로써 옥심(Oxime)으로 유도된다. 옥심 블록 중간체는 실리에이트화 티민으로써 글리코실레이트화되어 위 화합물의 α 및 β혼합물을 생성한다. 탈블록후에, β 아노머는 방법 A에 의하여 제조된 것과 필적한다.
[방법 C]
[1-[3-데옥시-3-C-(포밀)-5-O-트리틸-β-D-에리트로-펜토푸라노실]-우라실 및 티민]
3'-데옥시-3'-요오드-5'-O-트리틸티미딘(0.59g, 4m㏖), 트리스(트리메틸실릴)실란(2.87, 1.2m㏖), AIBN(12㎎, 0.072m㏖), 및 톨루엔(20㎖)의 혼합물을 유리 용기내에 혼합시키고 아르곤(실온에서 발포된)으로 포화시킨다. 유리 용기를 스테인레스 스틸 압력 반응로속에 넣고 일산화탄소로 가압하며(80psi), 26시간동안 밀폐시켜 가열한다(90℃ 욕). 이 반응 혼합물을 0℃까지 냉각시키고 일산화탄소가 증기 후드 아래로 조심스럽게 방출되게 한다. 이 생성물을 실리카겔(20g)상에 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의하여 정제한다. EtOAc : 헥산(2:1, v/v)으로 용해 제거하고 적절한 부분을 수집하여 위의 화합물 0.30g(61%)을 포옴으로 얻는다.
2', 3'-디데옥시-3'-요오드-5'-트리틸우리딘의 라디칼 카본화반응은 유사한 방법으로 3'-C-포밀 우리딘 유도체를 생성한다.
[실시예 5 : 메틸렌히드라존 연결(3'-CH=NH-NH-CH2-5'), 메틸렌히드라진 연결(3'-CH2-NH-NH-CH2-5'), 및 메틸렌(디메틸히드라조)연결 (3'-CH2-N(CH3)-5') 디뉴클레시드의 합성]
[3'-데(옥시포스피니코)-3'-[메틸렌(히드라존)]-5'-0-트리틸티미딜릴-(3'→5')'5'-데옥시티미딘]
건조 CH2Cl2/MeOH/AcOH/(20㎖/10㎖/0.5㎖)내에 3'-데옥시-3'-C-포밀-5'-O-트리틸티미딘(0.645g, 1.30m㏖)과 5'-데옥시-5'-히드라지노티미딘 히드로클로라이드(0.397g, 1.36m㏖)의 혼합물을 실온에서 30분간 교반시킨다. 이 용매를 진공하에서 증발시키고, 히드라존 중간체를 다음과 같이 분석한다;
[3'-데(옥시포스피니코)-3'-[메틸렌(디메틸히드라조)]-5'-0-트리틸티미딜릴-(3'→5')'5'-데옥시티미딘]
상기 히드라존 이량체를 AcOH(10㎖)에 융해시키고 여기에 NaBH3CN(4×0.12g, 7.74m㏖))의 소량을 실온에서 30분간 교반하면서 부가시킨다. 이 용액을 HCHO 수용액(20%, 3.9㎖, 26m㏖), NaBH3CN(3.9m㏖), 및 AcOH(10㎖)를 부가시키기 전에 15분간 교반시킨다. 이 현탄액을 다시 15분간 교반시키고, 진공하에서 증발시킨다. 잔류물은 MeOH(3×25㎖)로 공증발시켜서 다음의 특성을 갖는 메틸렌히드라조 이량체를 생성시킨다;
[3'-데(옥시포스피니코)-3'-[메틸렌(디메틸히드라조)]-티미딜릴-(3'→5')'5'-데옥시티미딘]
상기 히드라진 이량체를 24시간 동안 실온에서 MeOH(25㎖)에서 HCl 수용액 37%(1㎖)로써 교반시킨다. 그 결과 혼합물을 NH4OH(PH 약 8)로써 중화시키고 건조되도록 증발시킨다. 그 잔류물은 역상 HPLC(supelcosil LC 18, 5m, H2O : CH3CN gradient)에 의하여 정제시키고 0.6g의 위의 메틸렌(디메틸히드라진) 연결 이량체(89%)를 다음과 같이 생성한다 ;
[실시예 6 : 메틸렌(디메틸히드라진) 연결 (3'-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-5')-5'-디메톡시 트리틸-3'-β-시아노-에톡시디이소프로필포스포르아미다이트디뉴클레오시드의 합성]
[3'-데(옥시포스피니코)-3'-[메틸렌(디메틸히드라조)]-5'-0-디메톡시트리페닐메틸-(3'→5')-3'-0-(β-시아노에틸-N-디이소프로틸아미노포스피릴)티미딘
실시예 5의 메틸렌(디메틸히드라진) 이량체를 올리고 뉴클레오티드 합성(a practical approach, Ed. M.J. Gait, IRL Press, 1984)에 개선된 표준절차에 따라 디메톡시트리틸레이트화하여 하기의 균질의 포옴을 제공하고;
올리고뉴클레오티드 합성(a practical approach, Ed. M.J. Gait, IRL Press, 1984)에 개선된 절차에 따라 위의 화합물의 65% 수율을 다음과 같이 얻는다;
[실시예 7 : 중간 메틸렌(디메틸 히드라진)(3'-CH2-NCH3-NCH3-CH2-5') 연결 올리고뉴클레오시드의 합성]
CPG-바운도 티미딘(또는 3'-터미널 기재가 되는 기타 뉴클레오시드)을 Applied Biosystems, Ind.(ABI) 칼럼(250㎎, 바운드 뉴클레오시드의 10미크로몰)내에 넣고 ABI 380 B 자동 DNA 신디사이저에 부착한다. 포스포르아미다이트 화학물질을 이용하는 컴퓨터 제어 표준 단계를 이용하여 메틸렌히드라진 티미딘 이량체를 필요한 위치에 차례로 위치시킨다.
[실시예 8 : (3'-CH2-NH-S-CH2-5') 연쇄의 합성]
[3'-데(옥시포스피니코)-3'-[메틸렌(메틸술페닐)]-티미딜릴-((3'→5')-5'-데옥시티미딘]
위의 화합물은 두개의 중간체 뉴클레오시드부터 제조된다. 첫 번째 뉴클레오시드인 3'-O-벤질-5'-데옥시-5'-머르캅토티미딘은, 5'-S-[9-(4-메톡시페닐)크산텐-9-일]기의 형성과 5'-SH기의 생성을 위한 탈블록을 통하여 J.H Marriott등(Tet. Letts., 31:7385(1990)의 절차에 따라 3'-O-벤조일티미딘으로부터 3단계로 제조한다. 두번째의 뉴클레오시드인 3'-C-메틸아미노-5'-O-트리틸티아민은 상기 실시예 4에 설명된 3'-C-포밀-5'-O-트리틸티미딘으로부터 3단계로 제조한다. 이 3단계 절차는 포밀 기를 NaBH4로 환원하고 LiN3/DMF로써 아지도 기로 변환하고 3'-C-CH2NH2기를 제공하기 위하여 TBTH/톨루엔으로 환원하는 것을 포함한다. 3'-C-메틸아미노-5'-O-트리틸티미딘 뉴클레오시드(1m㏖)을 나트륨 히포클로라이드 수용액(4m㏖)에 부가시켜 클로로아미드 중간체를 제공하고 0℃까지 냉각시키고 3'-O-벤질-5'-데옥시-5'-머르캅토티미딘 뉴클레오시드(0.9m㏖)와 15분간 반응시키고 통상의 공정과 크로마토그래피에 의한 정제에 의하여 위의 화합물을 생성한다.
[실시예 9 : 5'-O-프탈이미도 뉴클레오시드의 합성]
[5'-O-프탈이미도티미딘]
건조 DMF(400㎖)내에 티미딘(24.22g, 0.1㏖), N-히드록시크탈이미드(21.75g, 0.13㏖)의 교반용액에 0℃에서 3시간에 걸쳐 디이소프로필아조디카르복실레이트(30㎖, 0.15㏖)를 부가시킨다. 이 용액을 진공하에서(0.1㎜, 40℃이하) 농축시켜 오렌지-적색의 잔류물을 얻는다. 잔류 검(gum)은 Et2O로써 여러번 세척하고 세척물은 폐기시킨다. 반-고체 잔류물은 EtOH(500㎖)에 부유시키고 90℃로 가열시켜 생성물을 융해시킨다. 냉각하여 30.98g의 5'-O-프탈이미도티미딘(80%)를 용융점 233-235℃인 백색의 결정체 물질로 3번 수집하며 그 특성은 다음과 같다.
[2'-데옥시-5'-O-프탈이미도우리딘]
2'-데옥시우리딘상에 유사한 반응을 시켜 융용점이 241∼242℃인 대응 2'-데옥시-5'-O-프탈이미도우리딘을 얻는다.
[실시예 10 : 5'-O-프탈이미도-3'-O-(t-부틸-디페닐실릴)티미딘 및 2'-데옥시-5'-O-프탈이미도-3'-O-(t-부틸디페닐실릴)우리딘의 합성]
[3'-O-(t-부틸디페닐실릴)-5'-O-프탈이미도티미딘]
5'-O-프탈이미도티미딘(8.54g, 22m㏖), t-부틸디페닐실릴 클로라이드(6.9㎖, 26.5m㏖), 이미다졸(3.9g, 57.3m㏖), 및 건조 DMF(130㎖)의 혼합물을 아르곤하에서 16시간동안 실온에서 교반시킨다. 이 반응 혼합물을 아이스-워터(600㎖)속에 넣고 그 용액을 CH2Cl2(2×400㎖)로써 추출시킨다. 유기층을 물(2×250㎖)과 건조된 MgSO4로써 세척한다.CH2Cl2층을 농축시켜 점착성의 잔류물을 생성하고 실리카겔 크로마토그래피(EtOAc;헥산=1:1, v/v으로 융해제거한)에 의하여 정제시켜서 다음의 특성을 갖는 3'-O-(t-부틸디페닐실릴)-5'-O-프탈이미도티미딘을 결정성 물질(융용점 172∼173.5℃)로서 얻는다;
[3'-O-(t-부틸디페닐실릴)-2'-데옥시-5'-O-프탈이미도우리딘]
2'-데옥시-5'-O-프탈이미도우리딘의 유사반응에 의하여 대응 3'-O-(t-부틸디페닐실릴)-2'-데옥시-5'-O-프탈이미도우리딘을 얻는다.
[실시예 11 : 5'-O-아미노 뉴클레오시드의 합성]
[5'-O-아미노-3'-O-(t-부틸디페닐실릴)티미딘]
건조 CH2Cl2(100㎖)내에 3'-O-(t-부틸디페닐실릴)-5'-O-프탈이미도티미딘(10g, 16m㏖)의 교반용액에 실온에서 아르곤하에서 메틸히드라진(1.3㎖, 24m㏖)을 부가시키고, 이 용액을 12시간동안 교반시킨다. 이 용액을 0℃까지 냉각시키고 여과한다. 백색의 잔류물을 CH2Cl2(2×25㎖)로써 세척하고 결합된 여과물을 증발시켜 점착성의 잔류물을 생성시킨다. 그 잔류물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(CH2Cl2:MeOH=98:2, v/v로써 용해제거) 정제하여 융용점이 141∼143℃이고 CH2Cl2/MeOH로부터 결정화된 하기의 특성을 갖는 5'-O-아미노-3'-O-(t-부틸디페닐실릴)-티미딘 7.03g(89%)을 얻는다 ;
[실시예 12 : (3'-CH=N-O-CH2-5')연결 올리고뉴클레오시드(옥심 연결 이량체)의 합성]
[3'-데(옥시포스피니코)-3'-(메틸리딘니트릴로)티미딜릴-(3'→5')-티미딘]
건조 CH2Cl2(20㎖)내에 3'-데옥시-3'-C-포밀-5'-O-트리틸티민(0.99g, 2m㏖) 및 AcOH(0.3㎖)를 실온에서 1시간동안 교반시킨다. 용매를 진공하에서 증발시키고 천연의 블록 3'-데(옥시포스피니코)-3'-(메틸리딘니트릴로)티미딜릴-(3'→5')티미딘 생성물을 THF(20㎖)에 용해시킨다. nBu4NF(1M, 5㎖)의 THF용액을 실온에서 교반된 용액 혼합물을 부가시킨다. 1시간후에 용액을 실리카겔 크로마토그래피(CH2Cl2:MeOH=99:4, v/v로써 용해제거)에 의하여 정제하여 3'-탈블록 이량체를 제공한다. 이량체를 무수 MeOH(50㎖)에 용해시키고 여기에 MeOH/HCl 용액(0.14M, 2.5㎖)을 부가시킨다. 이 용액혼합물을 15시간동안 실온에서 교반시킨다. 무수 피리딘(10㎖)을 상기 용액에 부가시키고 용매를 건조되도록 증발시켜 천연의 옥심 이량체를 생성한다. 이 천연의 생성물을 실리카겔크로마토그래피(CH2Cl2:MeOH=98:2, v/v로써 용해제거)에 의하여 정제시켜 위의 화합물인 E/Z 이성질체의 혼합물로서 3-데(옥시포스피니코)-3'-메틸리딘니트릴로)티미딜릴-(3'→5')-티미딘(0.87g, 89%)을 생성한다. 다음의 두 개의 기하학적 이성질체가 역상 HPLC(Supelcosil LC18, 5μ,H2O:CH3CN gradient)에 의하여 분리된다 ;
[실시예 13 : 포스포르아미테이트 함유(3'-CH=N-O-CH2-5')연결 올리고뉴클레오시드]
[3'-데(옥시포스피니코)-3'-(메틸리딘니트릴로)-5'-0-(디메톡시트리페닐메틸)-티미딜릴-(3'→5')-3'-0-(β-시아노에틸디이소프로필아미노포스피릴)티미딘]
실시예 12의 이성질체 이량체를 올리고뉴클레오시드 합성(a practical approach, Ed. M.J. Gait, IRL Press, 1984)에 개시된 절차에 따라 5' 터미너스 뉴클레오시드의 히드록실기에서 디메톡시트리틸화하고 그 이량체의 3' 터미너스 뉴클레오시드의 히드록실기에서 3'-O-β-시아노에틸디이소프로필포스포르아미다이트로 전환시켜 다음 특성을 갖는 위의 화합물을 생성한다 ;
보호 이량체는 편리하게 저장할 수 있고 치료적 가치를 갖는 올리고머속으로 특정의 결합을 하고자 할 때 자동 DNA 신디사이저 (ABI 380B)를 이용하여 결합할 목적으로 사용될 수 있다. 또한 옥심 연결 이량체는 대응 히드록실아민 연쇄를 갖는 이량체로 환원되고 이는 차례로 히드록실메틸아민 또는 다른 히드록시알킬아민 연쇄로 알킬화될 수 있다.
[실시예 14 : (3'-CH2-NH-O-CH2-5')연결 올리고뉴클레오시드의 합성]
[3'-데(옥시포스피니코)-3'-(메틸이미노)티미딜릴-(3'→5')-티미딘]
빙상결정의 AcOH(5㎖)내의 블록 이량체 3'-데(옥시포스피니코)-3'-(메틸리딘니트릴로)티미딜릴-(3'→5')-3'-O-(t-부틸디페닐실릴)티미딘(0.49g, 1m㏖)의 교반용액의 NaBH3CN(0.19g, 3m㏖)을 실온에서 아르곤하에서 3번 부가한다. 이 현탁액을 용액의 발포가 중지될 때까지 1시간동안 교반시킨다. 부수적인 NaBH3CN(0.19g, 3m㏖)을 유사한 방법으로 부가시키고 1시간동안 계속하여 교반한다. AcOH를 감압하에서 제거하여 3'데(옥시포스피니코)-3'-(메틸렌이미노)티미딜릴-(3'→5')-3'-O-(t-부틸디페닐실릴)-티미딘을 생성한다. nBu4NF/THF 및 HCl/MeOH를 사용하기 전에 개시된 바와 같은 이 이량체의 탈블록은 위의 화합물인 3'-데(옥시포스피니코)-3'-(메틸렌이미노)티미딜릴-(3'→5')-티미딘(0.44g, 99%)을 백색 분말로서 생성시킨다. 이 이량체를 HPLC(실시예 12의 3'-데(옥시포스피니코)-3'-(메틸리딘니트릴로)티미딜릴-(3'→5')-티미딘 이량체에 대하여 설명된 바와 같은)에 의하여 정제하여 하기 특성을 갖는 분석적으로 순수한 시료를 얻는다 ;
[실시예 15 : 메틸화[3'-CH2-N(CH3)-O-CH2-5' 연결 올리고뉴클레오시드의 합성]
[3'-데(옥시포스피니코)-3'-[메틸렌(메틸이미노)티미딜릴-(3'→5')-티미딘]
빙상결정의 AcOH(10㎖)내의 3'데(옥시포스피니코)-3'-(메틸렌이미노)티미딜릴-(3'→5')-3'-O-(t-부틸디페닐실릴)-티미딘 이량체(0.99g, 1m㏖)의 교반용액에 HCHO 수용액(20%, 3㎖)을 부가시킨다. 이 용액을 실온에서 5분간 교반시키고 여기에 NaBH3CN(0.19g, 3m㏖)을 실온에서 아르곤하에서 세부분으로 부가시킨다.
NaBH3CN(0.19g)의 부가를 한번 더 반복하고 용액을 1시간동안 더 교반시킨다. 이 반응 혼합물을 농축시켜 천연의 3'데(옥시포스피니코)-3'-(메틸렌이미노)티미딜릴-(3'→5')-3'-O-(t-부틸디페닐실릴)-티미딘을 이량체를 생성하고, nBu4NF/THF, HCl/MeOH를 탈블록하여 백색 고체로서의 위의 화합물인 3'-데(옥시포스피니코)-3'-[메틸렌(메틸이미노)]티미딜릴-(3'→5')-티미딘 이량체를 준비한 HPLC에 의하여 정제하여 하기 특성을 갖는 분석적으로 순수한 시료를 얻는다 ;
[실시예 16 : 포스포르아미데이트 함유[3'-CH2-N(CH3)-O-CH2-5']연결 올리고뉴클레오시드의 합성]
[3'-데(옥시포스피니코)-3'-[메틸렌(메틸이미노)5'-0-(디메톡시트리페닐메틸)]티미딜릴-(3'→5')-3'-0-(β-시아노에틸디이소프로필아미노포스피릴)티미딘]
실시예 15의 3'-데(옥시포스피니코)-3'-[메틸렌(메틸이미노)]티미딜릴-(3'→5')-티미딘 이량체를 올리고뉴클레오티드 합성(a practical approach, Ed. M.J. Gait, IRL Press, 1984)에 기재된 바와 같이 전체수율이 82%가 되도록 트리틸화하고 포스피틸화한다. 보호 이량체를 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(CH2Cl2:MeOH:Et3N=9:1:0.1, v/v)에 의하여 정제하고 균질의 부분을 수집하여 증발시켜 순수한 3'데(옥시포스피니코)-3'-[메틸렌(메틸이미노)]티미딜릴-5'-O-(디메톡시트리페닐메틸)]-(3'→5')-3'-O-(β-시아노에틸디이소프로필아미노포스피릴)티미딘을(DNA 합성을 위하여 사용된 것과 같이) 백색의 포움으로 생성한다. 이 생성물은 디아스테오이성질체의 혼합물로서 분리하며, 그 특성은 다음과 같다.
이량체를 함유하는 상기의 보호 포스포르아미데이트는 편리하게 저장될 수 있고 치료적 가치를 갖는 올리고머속으로 특정의 결합을 하고자 할 때 자동 DNA 신디사이저(ABI 380B)를 이용하여 결합할 목적으로 사용될 수 있다. 본 발명에서의 다른 이량체들은 예시적인 것에 불과하며 상기 열거한 메틸리딘니트릴로, 즉 옥심 및 메틸렌이미노, 즉 아미노히드콕시에 한정되는 것이 아니며, 이량체는 이 실시예에서와 동일한 방법으로 그들의 대응 포스포르아미데이트 유도체로 전환되어 하기 설명하는 표준 방법으로 올리고뉴클레오티드 속으로 결합된다. 옥심 연결 뉴클레오시드 이량체를 함유하는 올리고머는 대응 히드록실아민 연결 뉴클레오시드 이량체를 함유하는 올리고머로 환원된다. 다른 실시예에서 언급된 바와 같이, 환원반응은 CPG 바운드 올리고머로서의 효과를 가질수 있고 CPG로부터 제거한 후에 행해질 수 있다.
[실시예 17 : 중간체의 (3'-CH=N-O-CH2-5') 즉 옥심 ; (3'-CH2-NH3-O-CH2-5') 즉 아미노히드록시 ; (3'-CH2-N(CH3)-O-CH2-5') 즉 N-메틸-아미노히드록시 ; (3'-CH2-O-N(CH3)-CH2-5') 즉 N-메틸-히드록시아미노 ; 또는 (3'-CH2-N(CH3)-N(CH3)-O-CH2-5') 즉 N,N'-디메틸-히드라지노 연결 올리고뉴클레오시드]
올리고뉴클레오시드의 3'-터미널 뉴클레오시드가 되는 적절한 2'-데옥시뉴클레오시드는 ABI 380B 자동 DNA 신디사이저상에 사용할 목적으로 CPG 칼럼에 결합된다. 표준의 포스포르아미다이트케미스트리 프로그램 방법이 (3'-CH=N-O-CH2-5') 즉 옥심 ; (3'-CH2-NH3-O-CH2-5') 즉 아미노히드록시 ; (3'-CH2-N(CH3)-O-CH2-5') 즉 N-메틸-아미노히드록시 ; (3'-CH2-O-N(CH3)-CH2-5') 즉 N-메틸-히드록시아미노 ; 또는 (3'-CH2-N(CH3)-N(CH3)-O-CH2-5') 즉 N,N'-디메틸히드라지노 연쇄를 함유하는 이량체를 서열내의 선택된 위치 또는 필요한 위치에 위치시키는데 사용된다.
[실시예 18 : 세 개의 뉴클레오시드 부단위를 이용하여 ABI 380B DNA 신디사이저를 통하여 균일한 (3'-CH=N-O-CH2-5') 또는 (3'-CH2-NH-O-CH2-5') 연결 올리고뉴클레오시드의 합성]
부단위 1 : Nucleic Acids Research, 18:3813(1990)의 절차에 따라 제조되고 올리고뉴클레오시드 합성에 대하여 3'-터미널 단위로서 사용된 CPG-바운드 5'-O-프탈이미도티미딘
부단위 2 : 적절한 염기로써 메틸 3-데옥시-3-C-시아노-5-O-(프탈-이미도)-β-D-에리트로-펜토푸라노시드를 표준 글리코실화하고 이 뉴클레오시드 생성물을 DIBAL-H 환원하여 유도된 이중기능의 (3'-C-포밀 및 5'-프탈이미도 데옥시리보뉴클레오시드).
부단위 3 : 최종의 (올리고뉴클레오시드의 5'-말단기) 뉴클레오시드의 결합용으로 사용된 5'-O-DMT-3'-C-포밀 티미딘.
균일한 연쇄(10μM 스케일 : CPG에 단위 1의 적재)를 합성하기에 필요한 한 사이클의 자동 단계는 다음과 같다 :
[실시예 19 : (3'-CH=N-O-CH2-5') 연쇄를 (3'-CH2-NH-O-CH2-5')로 전환하기 위한 일반적이고 구체적인 NaBH3CN 환원
[이량체의 환원]
빙상결정의 아세트산(AcOH)(5㎖)의 이량체(0.49g, 1m㏖)의 용액에 실온의 아르곤 대기하에서 AcOH(1㎖)내의 나트륨 시아노브로히드라이드(0.19g, 3m㏖)를 부가시킨다.
이 현탁액을 1시간동안 교반시키고, AcOH(1㎖)내의 NaBH3CN의 부수적인 양을 부가시키고 1시간동안 계속하여 교반시킨다. AcOH의 과량을 실온의 감압하에서 제거한다. 잔류물은 톨루엔(2×50㎖)로써 공증발시키고 실리카겔(25g) 칼럼 크로마토그래피에 의하여 정제한다. CH2Cl2:MeOH(9:1, v/v)로써 용해제거하고 적절한 분율을 수집하여 증발시킴으로써 0.36g(75%)의 고형의 이량체를 생성한다.
[올리고뉴클레오시드의 환원]
하나(또는 그 이상의) 주쇄 변형 연쇄를 포함하는 CPG-바운드 올리고뉴클레오시드(1μM)를 합성이 완료된 다음 DMA 신디사이저로부터 분리시킨다. THF:AcOH(10㎖, 1:1 v/v)내에, 1.0M의 NaBH3CN 용액을 30분간 주사기술을 이용한 표준 방법으로 CPG-바운드 물질을 통하여 품어낸다. 이 칼럼을 THF(50㎖)로 세척하고, 환원된 올리고뉴클레오시드를 표준방법으로 기재 칼럼으로부터 방출시킨다.
[올리고뉴클레오시드의 선택적 환원]
상기 환원에 대한 선택적 방법으로, CPG 기재로부터 제거한 후에 환원이 행해질 수 있다. 합성이 완료될 때 올리고뉴클레오시드를 표준절차에 의하여 CPG-기재로부터 제거한다. 5'-O-트리틸-온(on)올리고뉴클레오시드를 HPLG에 의하여 정제한 다음 상기 설명한 NaBH3CN/AcOH/THF 방법에 의하여 환원시킨다.
[실시예 20 : 5' 터미널 뉴클레오시드로서 2', 3'-디데히드로 뉴클레오시드를 갖는(3'-CH2-N(CH3)-O-CH2-5')연결 올리고뉴클레오시드의 합성]
[3'-데(옥시포스피니코)-2', 3'-디데히드로-3'-[메틸렌(메틸이미노)]티미딜릴-(3'→5')티미딘]
1-[5'-O-(MMTr)-β-D-글리세로펜토푸란-3'-울로실]-티민 (0.13m㏖; T.-C.Wu, 등의 Tetrahedron, 45:855(1989)의 절차에 따라 제조된), 5'-O-(메틸렌아미노)-3'-O-(t-부틸디페닐실릴)-티미딘(0.13m㏖ ; F. Debart등의 Tet. Letters, 33, in press(1992)의 절차에 따라 제조된), 에틸렌 글리콜(0.5m㏖), 및 HMPA(0.5㎖)의 교반 용액에 THF(3m㏖)내의 SmI2(0.1㏖, 3㎖)를 실온에서 부가시킨다. SmI2의 색상은 반응이 진행됨에 따라 희미해져서 원하는 내전물을 생성한다. 출발 물질이 완전히 사라진 후에 그 반응 혼합물을 통상적인 방법으로 제조한다. (이 생성물은 특성화를 위하여 실리카칼럼 크로마토그래피에 의하여 정제될 수 있다). 3'-에피머 내전물의 천연의 혼합물은 다른 실시예에 설명된 바와 같이 HCHO/NaCNBH3/AcOH 알킬화시킨다. 메틸화 생성물을 다시 피리딘내에서 메틸슬포닐클로라이드로써 처리하여 3'-에피머 메실레이드를 얻고, 그것을 염기 처리하여 위의 화합물을 생성한다.
[실시예 21 : (3'-CH2-CH2-NH-CH2-5') 연결 올리고뉴클레오시드의 합성]
[3'-데(옥시포스피니코)-3'-(1,2 에탄디일이미노)티미딜릴-5'-0-(t-부틸디메틸실릴)-(3'→5')-3'-0-(t-부틸디페닐실릴)-5'-데옥시티미딘]
디클로로에탄(65㎖)내의 알데히드 [2.5g, 6.5m㏖, Fiandor, J. 및 Tam. S.Y., Tetrahedron Letts., 33 : 597(1990)에 개시된 절차에 따라 제조된], 5'-아미노-3'-O-(t-부틸디페닐실릴)-5'-데옥시티미딘[3.13g, 6.5m㏖, Hata 등의 J. Chem. Soc. Perkin I. P. 306 (1980)의 방법으로 5'-아지도-5'-데옥시티미딘의 3'-O-실리화와 Poopeiko 등의 Syn. Lett., P. 342 (1991)의 방법에 의하여 상기 생성물을 환원하는 두 단계로 제조된], AcOH(0.39g, 6.5m㏖)의 교반 용액에 아르곤하에서 NaBH(OAc)3(2.759g, 13.08m㏖)을 부가시킨다. 이 현탁액을 실온에서 3시간동안 교반시킨다.
이 반응 혼합물을 CH2Cl2(250㎖)로써 희석시키고 물(2×100㎖)로써 세척한다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고 농축하여 시럽상태의 천연의 생성물을 생성한다. 이 생성물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의하여 정제하여 백색 포옴의 위의 화합물(3.5g, 64%)을 생성하며, 이에 대한 특성은 다음과 같다.
[3'-데(옥시포스피니코)-3'-(1,2에틴디일이미노)티미딜릴-(3'→5')5'-데옥시티미딘]
보호 이량체를 THF내의 (Bu)4NF를 사용한 표준 절차에 따라 81%의 수율로 탈블록한다. 탈블록된 이량체를 HPLC에 의하여 정제하여 하기와 같은 분석치를 갖는다.
[실시예 22 : 이중기능의 뉴클레오시드의 합성]
[실시예 18의 부단위 2의 대체방법]
[3'-데옥시-3'-C-[(메톡시이미노)메틸]-티미딘]
3'-데옥시-3'-C-포밀-5'-O-트리틸티미딘(0.59g, 1m㏖, CH2Cl2: MeOH(2 : 1, 30 vol)내에서 실시예 4에 의하여 제조된)의 교반 용액에 AcOH(0.5㎖)와 메톡시아민 히드로클로라이드(0.189g, 2.2m㎖)을 실온에서 부가시킨다. 이 혼합물을 30분간 교반하고, 진공하에서 농축하여 그 잔류물을 MeOH(20㎖)에서 용해시킨다. 이 용액에 농축 HCl(0.1㎖)을 부가하고 1시간동안 교반시킨다. 이 용액을 NH4OH(약 2㎖)로써 중화시키고 진공하에서 농축하여 티미딘의 3'-C-[(메톡시이미도)]메틸유도체를 생성하며, 그 특성은 다음과 같다 ;
[3'-데옥시-3'-C-[(메톡시이미노)메틸]-5-메틸시티민]
5-메틸 시티딘 유사체를 상기 티미딘과 유사한 방법으로 제조하며, 이는 하기 특성을 갖는다.
[3'-데옥시-3'-C-[(메톡시이미노)메틸]-5'-O-프탈이미도-티미딘]
Ph3P로 처리한 3'-데옥시-3'-C-[(메톡시이미노)메틸]-티미딘, N-히드록시프탈이미드 및 DEAE(미프노부 조건)은 하기의 특성을 갖는 5'-O-프탈이미노티미딘 유도체를 생성한다 ;
[3'-데옥시-3'-C-포밀메틸옥심-5'-프탈이미도-5-메틸시티민]
5-메틸 시티딘 유사체를 상기 티미딘과 유사한 방법으로 제조하여 하기 특성을 갖는 것을 얻는다 ;
[3'-데옥시-3'-C-포밀-5'-O-프탈이미도티미딘]
MeOH 내에서 CH3CHO로 처리한 3'-데옥시-3'-C-포밀-5'-O-프탈이미도티미딘은 3'-C-포밀기를 재생한다. 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의하여 그 생성물을 정제하여 3단계에 걸쳐 81% 수율로 균질의 물질인 하기 특성을 갖는 위의 화합물을 생성한다 ;
[실시예 23 : 용액상 방법을 통항 균일한 3'-CH=N-O-CH2-5', 3'-CH2-NH-O-CH2-5' 또는 3'-CH2-N(CH3)-O-CH2-5' 연결 테트라머의 합성]
[3'→5' 신장]
5'-O-아미노-3'-O-(t-부틸디페닐실릴)티미딘과 3'-데옥시-3'-C-포밀-5'-O-프탈이미도티미딘과의 표준 결합(실시예 12에 기재된 바와 같은)은 3'데(옥시포스피니코)-3'-(메틸리딘니트릴로)-티미딜릴-5'-O-프탈이미도-(3'→5')-3'-O-(t-부틸디페닐실릴)-티미딘을 생성한다. 후자의 생성물을 메틸히드라진(실시예 11에 기재된 바와 같은)으로 처리하여 5'-O-NH2-T-3'-CH=N-O-CH2-5'-T-3'-O-TBDPSi를 생성하고, 5'-O-Phth-T-3'-CHO와 결합하여 트리머 5'-O-Phth-T-3'-CH=N-O-CH2-5'-T-3'-CH=N-O-CH2-5'-T-3'-O- TBDPSi를 전체 83%의 수율로 생성한다. 테트라머를 NaBH3CN/AcOH를 사용하여 실시예 14에 따라 환원하여 5'-O-Tr-T-3'-CH2NH-O-CH2-5'-T-3'-CH2-NH-O-CH2-5'-T-3'- CH2-NM-O-CH2-5'-T-3'-TBDPSi를 생성한다. 이 환원된 테트라머를 HCHO/NaBH3CN/ AcOH를 사용하여 환원 알킬화반응을 행하면 5'-O-Tr-T-3'-CH2-N(CH3)-O-CH2-5'-T-3' -CH2-N(CH3)-O-CH2-5'-T-3'-CH2-N(CH3)-O-CH2-5'-T-3'-O-TBDPSi를 생성한다. 이 메틸화된 테트라머를 최종적으로 HCl 및 n(Bu)4NF를 사용하여 탈블록하여 자유 테트라머 5'-OH-T-3'-CH2-N(CH3)-O-CH2-5'-T-3'-CH2-N(CH3)-O-CH2-5'-T-3'-CH2-N(CH3)-O-CH2-5'-T-3'-OH를 79%의 전체 수율로 얻는다. 이 테트라머는 역상 칼럼(Supelcosil LC 18 5μ, 15㎝ × 4.5㎝) 및 H2O→CH3CN(H2O:CH3CN, 95:5, 1분:8:2, 2O분;7:3, 30분;32:8, 40분/㎖)물매로써 용해제거하는 HPLC에 의하여 정제한다. 이 테트라머는 용해제거된 전체의 생성물의 86%에 대응하는 단일 분리 피이크로서 26.96분후에 용해제거된다. 26∼27.5분에서의 일부를 수집하고 동결 건조시켜 백색의 분말을 생성한다. 테트라머의 추출분자량은 MS FAB : m/z 1045 (M+H)+에 의하여 결정된다. 상기 설명과 같이, NMR 데이터에 대하여 링은 5' 터미너스로부터 3' 터미너스까지 숫자가 붙여진다.1H NMR(D2O, 40℃) TOSEY(30, 100M sec Mix)
상기 액상 반응은 위의 설명과 같이 3-뉴클레오시드 부단위를 이용하여 ABI 380 B DNA 신디사이저로 용이하게 전달될 수 있다.
[실시예 24 : (3' -CH2-O-N=CH-5' ), (3'-CH2-O-NH-CH2-5' ) 및 (3' -CH2-O-N(CH3)-CH2-5' ) 연쇄에 대한 단량체 단위의 합성
[1-[3'-데옥시-3'-C-(히드록시메틸)-5'-O-(트리틸)-β-D-에리트로펜토푸라노실]티민]
NaBH4(1.36g, 9.6mmol)의 현탁액을 EtOH:H2O (22㎖, 3:1, v/v)내의 3'-C-포밀-5'-O-트리틸티미딘의 교반용액에 실온에서 한 방울씩 부가시킨다. 3시간후에, EtOAc(300㎖)을 부가시키고 유기층을 H2O(2×150㎖)로써 세척한다. MgSO4로 건조한 EtOAc 추출물을 감압하에서 증발시키고 그 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의하여 정제한다. CH2Cl2: MeOH (9:1, v/v)로써 용해제거하고 적절한 부분을 수집하여 농축시켜서 하기 특성을 갖는 위의 화합물(1.13g, 83%)을 생성한다.
[1-[3'-데옥시-3'-C-[O-(프탈이미도히드록시메틸)]-5'-O-트리틸-β-D-에리트로-펜토푸라노실]-티민]
디이소프로필아조디카르복실레이트(0.47㎖, 2.41m㏖)을 건조 THF(10㎖)내의 3'-데옥시-3'-C-(히드록시메틸)-5'-O-트리틸-티이민(0.8g, 1.62m㏖), N-히드록시프탈이미드(0.35g, 2.15m㏖), 트리페닐포스틴(0.56g, 2.15m㏖)의 교반용액에 실온에서 부가시킨다. 48시간 후에, 그 생성물을 농축시키고 잔류물을 NaHCO3(5%, 100㎖) 및 (100㎖)로써 세척한다. MgSO4건조 추출물을 감압하에서 증발시키고 잔류물을 숏(short)-실리카 겔 크로마토그래피에 의하여 정제한다. EtOAc : 헥산(1:1, v/v)으로 용해제거하고 적절한 일부를 수집하고 농축시켜 하기의 특성을 갖는 백색 포움(0.82g, 79%)형태의 위의 화합물을 생성한다.
[1-{3'-데옥시-3'-C-[O-(아미노히드록시메틸)]-5'-O-트리틸-β-D-에리트로-펜토푸라노실]-티민]
메틸히드라진(0.12㎖, 2.25m㏖)을 건조 CH2Cl2(9㎖)내에서 3'-데옥시-3'-C-[0-(프탈이미도히드록시메틸)-5'-O-트리틸티미딘(0.77g, 1.2m㏖)의 교반용액에 실온에서 부가시킨다. 1시간후에, 그 침전물을 여과하고 잔류물을 CH2Cl2(2×10㎖)로서 세척한다. 결합된 여과물을 농축하고 잔류물을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의하여 정제한다.
CH2Cl2:MeOH(97:3, v/v)로써 용해제거하고, 적절한 일부를 수집하여 증발시켜서 하기의 특성을 갖는 백색의 분말(0.43g, 70%)로서의 위의 화합물을 생성한다 ;
[실시예 25 : (3'-CH2-O-N=CH-5'), (3'-CH2-O-NH-CH2-5') 및 (3'-CH2-O-N(CH3)- CH2-5') 연결 올리고뉴클레오시드의 합성]
[1-데(옥시포스피니코)-3'-[메틸렌옥시(메틸이미노)]티미딜릴-(3'→5')-5' -데옥시티미딘]
1-[4-C-포밀-3-O-(t-부틸디페닐실릴)-β-D-에리트로-펜토푸라노실)티민[1m㏖, Nucleosides and Nucleotides, 9:533 (1990)의 절차에 따라 제조된], 3'-데옥시-3'-C-[0-(아미노히드록시메틸)]-5'-O-트리틸티미딘(1m㏖), AcOH(0.1㎖), 및 건조 CH2Cl2(25㎖)의 혼합물을 1시간동안 실온에서 교반시킨다. 용매를 증발시키고 잔류물을 빙상결정의 AcOH(5㎖)내에 용해시킨다. NaBH3CN(3m㏖)을 교반된 AcOH 반응 혼합물에 부가시킨다. 1시간후에 NaBH3CN(3m㏖)의 부가적인 양을 부가키고 그 혼합물을 1시간동안 교반시킨다.. 이 반응물을 진공하에서 농축시키고 잔류물을 실리카 겔 크로마토그래피에 의하여 정제시켜서 하기 특성을 갖는 5'-O-Tr-T-3'-CH2-O-NH-CH2-5'-T-3'-O-TBDPSi 이량체를 생성한다 ;
후자의 이량체를 HCHO/NaBH3CN/AcOH를 사용하여 메틸화시키고 nBu4NF/THF 및 HF/CH3CN으로 탈블록하여 하기 특성을 갖는 위의 화합물(65% 수율)을 생성한다 ;
[실시예 26 : 포스포르아미데이트 함유 (3'-CH2-O-N(CH3)-CH2-5') 연결 올리고뉴클레오시드의 합성
[3-데(옥시포스피니코)-3'-[메틸렌옥시(메틸이미노)]-티미딜릴-5'-O-(디메톡시트리페닐메틸)-(3'→5')-3' -(O-β-시아노에틸디이소프로필아미노포스피릴)티미딘]
올리고뉴클레오티드 합성(a practical approach, Ed. M.J. Gait, IRL Press, 1984)에 개시된 절차에 따라 이량체 5'-OH-T-3'-CH2-O-NCH3-CH2-5'-T-3'-OH의 디메톡시트리틸화 반응은 하기 특성을 갖는 백색 포움형태의 5'-O-DMTr 보호 이량체를 생성한다.
상기 화합물은 올리고뉴클레오티드 합성(a practical approach, Ed. M.J. Gait, IRL Press, 1984)에 개시된 절차에 따라 포스피틸레이트화하여 하기 특성을 갖는 백색 분말로서의 70% 수율로 위의 화합물을 생성한다 ;
[실시예 27 : 내부에 위치한 기를 변형하는 약리운동학적 및 약리기능학적 성질을 포함하는 특성을 포함하는 연쇄를 갖는 올리고뉴클레오시드의 합성]
[3'-데(옥시포스피니코)-3'-[메틸렌(벤질이미노)]-티미딜릴-5'-O-(디메톡시트리페닐메틸)-(3'→5')-3' -(O-β-시아노에틸디이소프로필아미노포스피릴)티미딘]
실시예 12에 개시된 바와 같이 3'-데옥시-3'-C-포밀-5'-O-트리틸티미딘(1.5m㏖)을 5'-O-아미노-3'-O-(t-부틸디페닐실릴)티미딘(1.5m㏖)로 환원 결합하여 5'-O-Tr-T-3'-CH2-NH-O- CH2-5'-T-3'-O-TBDPSi 이량체를 생성한다. 이 이량체는 위의 설명된 메틸화반응과 동일한 방법으로 C6H5CHO/NaBH3CN/AcOH로써 벤질화하여 N-벤질레이트화 이량체인 5'-O-Tr-T-3'-CH2-NBz-O-CH2-5'-T-3'-O-TBDPDSi를 생성한다.
이 후자의 이량체를 위의 실시예에서 설명된 바와 같이 nBu4NF/THF 및 HCl/MeOH 방법을 사용하여 탈블록하여 탈블록된 이랑체 5'-OH-T-3'-CH2-NBn-O-CH2-5'T-3'-OH를 생성하고, 이를 올리고뉴클레오티드 합성(a practical approach, Ed. M.J. Gait, IRL Press, 1984)에 개시된 절차에 따라 디메톡시트리틸화 반응 및 포스티틸화 반응을 행하여 하기의 특성을 갖는 위의 화합물(전체 수율 45%)을 생성한다 ;
포스필틸레이트와 이량체는 실시예 8의 방법에 따른 자동 DNA 신디사이저를 사용하여 올리고머속으로 결합시키고 올리고뉴클레오티드의 DNA 합성전에 주쇄속으로 기를 변형하는 여러 가지 약리운동학적 및 약리기능학적 특성을 가짐을 나타낸다.
[실시예 28 : (3'-CH2-NH-CH2-CH2-5'),(3'-CH2-N(CH3)-CH2-CH2-5') 및 포스프르아미테이트 유도체의 합성]
[3'-데(옥시포스피니코)-3'-[메틸렌이미노)메틸렌]-5'-O-(디메톡시트리틸)티미딜릴-(3'→5')티미딘]
AcOH의 존재하에서 3'-데옥시-3'-C-포밀-5'-O-트리틸티미딘(1m㏖)을 1-[6'-아미노-2', 5', 6'-트리데옥시-3'-O-(t-부틸디페닐실릴)-β-D-에리트로-헥사푸라노실]티민 [1.2m㏖, G. Et Zold 등의 J. C. S. Chem. Comms., 422(1968)의 절차에 따라 제조된]으로 환원 아민화반응 [A.F. Abdel-Magid 등의 Tetrahedron Letts. 31:5595 (1990)의 절차에 따른]을 행하여 블록 이량체 5'-OH-T-3'-CH2-NH-CH2-CH2-5'-T-3'-OH 이량체(수율 70%)를 생성한다 ;
[PKa 결정]
PH를 변경시키기 위한 위의 이량체 N-Me 기의 양자 화학적 변형의 감도를 주쇄아민의 PKa 의 표시로서 NMR에 의하여 측정하였다. 이 화학적 변형은 아미노기가 양자화될 때 하부쪽으로 이동한다. 5'-OH-T-3'-CH2-NCH3-CH2-CH2-5'-T-3'-OH 이량체의 시료 4㎎을 0.5㎖의 30mM 바이카르보네이트 완충액내에 용해시킨다. 이 PH는 6단계로 0.1N NaOH를 사용하여 5.1 및 10.0 사이에서 변한다. N-메틸 양자의 화학적 변형은 2.26 및 2.93에서 변하고 7.8±0,1의 PKa값을 발생시킨다. 이론에 구애받지 않고, 생리적인 PH에서 이 주쇄는 양자화될 것이라고 믿어진다.
[3'-데(옥시포스피니코)-3'-[메틸렌(메틸이미노)메틸렌]-5'-O-(디메톡시트리틸)-트리딜릴-(3'→5')-3'-O-(β-시아노에틸디이소프로필아미노포스피릴)티미딘]
앞의 이량체를 AcOH 내에서 HCHO/NaBH3CN을 사용하여 메틸화하여 5'-OH-T-3'-CH2- N(CH3)-CH2-CH2-5'-T-3'-OH 이량체를 생성하고, 이를 올리고뉴클레오시드 합성(a practical approach, Ed. M.J. Gait, IRL Press, 1984)에 설명된 절차에 따라 디메톡시트리틸화반응하고 포스피틸화 반응하며 하기 특성을 갖는 포옴형태의 위의 화합물(수율 68%)을 얻는다.
[실시예 29 : (3'-CH2-N(불안정한 블록기)-O-CH2-5') 이량체 및 포스포르아미데이트 유도체-(3'-CH2-NH-O-CH2-5') 연쇄의 재생을 위한 불안정한 N-보호기를 갖는 3'-데(옥시포스피니코)-3'-(메틸렌이미노)(3'→5') 결합 이량체]
[3'-데(옥시포스피니코)-3'-[메틸렌(페녹시아세틸이미노)]-티미딜릴-(3'→5')티미딘]
건조 피리딘(10㎖)내의 5'-O-Tr-T-3'-CH2-NH-O-CH2-5'-T-3'-O-TBDPSi(1m㏖, F. Debart 등의 Tetrahedron Letts., 33 : in press (1992)의 절차에 따라 제조된)의 교반 용액에 페녹시아세틸트로라이드(1.2m㏖)를 부가시킨다. 12시간 후에, 그 생성물을 CH2Cl2(200㎖)로 희석시키고, 포화 NaHCO3(2×50㎖), 물(2×50㎖), 및 건조 MgSO4로 세척한다. CH2Cl2추출물을 농축시키고 잔류물은 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제한다. CH2Cl2:MeOH (9:1, v/v)로 용해제거하고 적절한 부분을 수집하여 증발시켜서 하기 특성을 갖는 백색 포옴형태의 5'-O-Tr-T-3'-CH2-N(COOph)-O-CH2-5'-T-3'-O-TBDPSi 이량체를 생성한다 ;
앞의 이량체를 HF(48%)/CH3CN (5:95, v/v)로써 연속적으로 탈블록화하여 트리틸기를 제거하고, 그 생성물을 nBu4NF/THF로 처리하여 실릴기를 제거하여 하기의 특성을 갖는 백색 분말의 위의 화합물을 얻는다(3단계에 걸친 수율 70%) ;
후자의 이량체를 올리고뉴클레오티드 합성(a practical approach, Ed. M.J. Gait, IRL Press, 1984)에 기재된 절차에 따라 디메톡시트리틸레이트화하여, 하기의 특성을 갖는 희미한 노란색의 포옴형태의 5'-O-DMT-T-3'-CH2-N(COCH2Oph)-O-CH2-T-3'-OH를 생성한다 ;
올리고뉴클레오티드 합성((a practical approach, Ed. M.J. Gait, IRL Press, 1984)에 기재된 절차에 따라 상기 이량체를 포스피틸레이트화 반응시켜 하기의 특성을 갖는 포옴형태의 포스포르아미데이트 유도 이량체(DNA 신디사이저에 사용하기에 적합한)을 생성한다. (2단계에서의 수율 75%) ;
[실시예 30 : 올리고뉴클레오티드내에서 (3'-CH2-N(불안정한 블록기)-CH2-CH2-5')로부터 (3'-CH2-NH-O-CH2-5') 연쇄의 재생]
실시예 29의 포스피틸레이트화 이량체를 실시예 8의 절차에 따라 올리고뉴클레오티드내에 결합시킨다. 기재상의 올리고뉴클레오티드의 완료후에 올리고뉴클레오티드를 기재로부터 표준 수산화 암모니움 조건을 이용하여 절개한다.
기재로부터의 절개와 함께 수산화 암모니움으로 처리하면 결합(3'-CH2-N(COCH2Oph)-O- CH2-5')의 이미노 질소로부터 페녹시아세틸 블록기를 더 절개하여 올리고뉴클레오티드 구조내에서 (3'-CH2-NH-O-CH2-5') 연결 올리고뉴클레오시드 이량체를 생성한다.
[실시예 31 : (3'-CH2-P(O)2-O-CH2-5') 및 (3'-CH2-O-P(O)2-O-CH2-5') 연결 올리고뉴클레오시드의 합성]
[3'-C-포스포네이트 이량체의 합성]
3'-히드록시메틸-5'-O-(t-부틸디페닐실릴)티미딘을 NBS로 처리하면 그 브롬속으로 전환시킨다. 이 브롬은 Arbuzov 반응을 행하여 포스포네이트 디에스테르를 생성한다. 트리메틸브롬시란으로 포스포네이트 디에스테르를 절개하면 자유산을 생성하고, 이를 피리딘내에서 3'-O-(t-부틸디페닐실릴)티미딘 및 DCC로 처리하여 이량체를 생성한다.
[3'-C-포스포네이트 연결 올리고뉴클레오시드의 합성]
상기 이량체를 표준 DNA 신디사이저 케미스트리 방법에 의하여 올리고뉴클레오시드내의 바람직한 위치속에 삽입하기 위한 5'-O-DMT 및 3'-O-포스포르아미드 유도체로서 적절히 보호하고 활성화함으로써 올리고뉴클레오시드속으로 결합한다.
[5'-C-포스포네이트 연결 올리고뉴클레오시드의 합성]
대응 5'-C-포스포네이트 이량체를 5'-데옥시-5'-브로모뉴클레오시드와 5'-포스포네이트를 초래하는 포스파이트 에스테르를 반응시켜서 얻는다. 이는 3'-히드록시메틸 뉴클레오시드와 반응하여 5'-C-포스포르네이트 연결 이량체를 생성시킨다.
[평가]
[절차 1 -올리고뉴클레오티드의 구조와 모습]
[A. 올리고뉴클레오티드의 개요]
[올리고뉴클레오티드의 효소숙성]
여러 가지 안티센스 올리고뉴클레오티드에서와 같이 주쇄 변형의 결합은 하기 규약을 이용한 효서 가수분해에 의하여 입증된다. 이 절차의 시퀸스 리스트에 있어서, '*는 시퀸스내에서의 본 발명의 연쇄의 위치를 표시하기 위하여 사용되고, 같은 방법으로 P는 정상적인 포스포디에스테르 연쇄의 위치를 표시하기 위하여 사용된다.
변형된 올리고뉴클레오티드인
A260 ㎚에서 0.2OD는 0.1M 트라스-HCl 완충액(PH8.3, 200㎕)내에 용해시키고 스네이크 베놈 포스포디에스테라제(0.4㎍), 알카리 포스파타제(0.4㎍), 및 송아지 비장 포스포디에스테라제(0.4㎍)로써 37℃에서 24∼60시간동안 처리한다. 결과 혼합물을 희석시키고 다음과 같이 HPLC에 의하여 분석한다 ;
칼럼 : C-18 뉴클레오실(5μ), 유속 : 1㎖/분, 용매 A : 10mM 트리에틸암모니움 아세테이트, 용매 B : 아세토니트릴/물(1:), 0% B에서 50%까지의 B까지의 20분 선형 물매. 이 물질의 정량은 뉴클레오시드 성분의 소멸 계수에 의하여 유도되는 피이크 영역에 기초를 두고 결정된다. 이량체를 포함하는 각각의 변형된 주쇄의 정체는 합성 시료를 완전히 숙성된 올리고뉴클레오티드로써 주사함으로써 입증된다. 모든 경우에 있어서, HPLC 분석의 피이크의 적분치는 숙성된 올리고뉴클레오티드의 전체성분을 나타낸다.
[B. 주쇄 연결의 모습]
또한 변형된 주쇄의 각각의 결합 모습은 동일한 ABI 380B DNA 신디사이저에서 제조된 CpT*TpG 테트라머의1H 및31P NMR 분석에 의하여 지지된다. 그래서 신디사이저상의 컴퓨터 프로그램을 간접적으로 유효하게 한다.
[절차 2-교잡 분석]
상보 뉴클레오산을 결합하기 위한 본 발명의 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 유사체 또는 올리고뉴클레오시드의 상대적인 활성은 특정의 교잡복합체의 용융점을 측정함으로써 비교될 수 있다. 상보 뉴클레오산의 특징적인 물리적 성질인 용융점(Tm)은 50% 더블 헬리컬과 균일(교잡되지 않은) 형태가 존재할 때의 온도를 섭씨로 나타낸 것이다. Tm은 교잡의 형성과 분열(용융)을 결정하는 UV 스텍트럼을 이용하여 측정한다. 교잡중에 발생하는 베이스 스태킹(base stacking)은 UV 흡수(히포크로미시티 : hypoghromicity)에서 환원은 더 높은 Tm을 나타낸다. Tm이 높을수록, 스트랜드(strand)결합의 강도는 더 커진다. Non-Watson-Crick 염기 짝짓기는 그 Tm에서 강한 탈안정효과를 갖는다. 결과적으로 염기 짝짓기의 절대적인 동일성은 그 표적 RNA 에 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오시드의 최적의 결합을 위하여 필요하다.
[A. 올리고뉴클레오티드 유사체의 교잡의 열역학적 평가]
상보 RNA 또는 DNA 서열에 교잡하기 우한 본 발명의 선택된 올리고뉴클레오티드 유사체의 활성은 열용융 분석에 의하여 결정된다. RNA 상보체는 Applied Biosystems, Inc의 380B 뉴클레오산 신디사이저로써 합성된 DNA 템플레이트-프로모터와 T7 RNA 폴리머라제부터 합성된다. RNA 는 FPLC (LKB pharmacia, Inc.)를 사용한 이온교환에 의하여 정제된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 유사체는 양론적 농도에서 RNA 또는 DNA 상보체에 부가되고 임의의 코일 전이에 중복되는 흡수(260㎚) 하이퍼크로미시티는 Gilford Response Ⅱ 스텍트로프토미터를 사용하여 추적한다. 이러한 측정은 10mM Na-포스페이트, PH 7.4 01mM EDTA, 및 NaCl의 완충용액내에서 행해져서 0.1 또는 1.0M의 이온강도를 생성시킨다. 이들 데이타는 1/Tm 대 ℓn[Ct]의 그래프 도식에 의하여 분석될 수 있고, 여기서 [Ct]는 전체의 올리고뉴클레오티드 농도이다.
본 발명의 선택된 올리고뉴클레오티드 유사체의 교잡에 대한 열역학적 분석결과는 표1에 나타나 있다. 이 표의 시퀸스 리스트에 있어서 *는 시퀸스내에서 본 발명의 연쇄의 위치를 나타내기 위하여 사용되고, 같은 방법으로 P는 정상적인 포스포디에스테르 연쇄의 위치를 나타내기 위하여 사용된다. 또한 하기의 표에 있어서, 본 발명의 여러 가지 주쇄 연결이 일반적인 화학명과 다음과 같이 표현한 약식 명칭이 서로 참고가 된다 :
(3'-CH=N-O-CH2-5')는 옥심 : (3'-CH2-NH-O-CH2-5')는 아미노히드록시 ; (3'-CH2-N(CH3)-O-CH2-5')는 N-메틸-아미노히드록 ; (3'-CH2-O-N(CH3)-CH2-5')는 N-메틸-히드록시아미노 ; 및 (3'-CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-5')는 N,N'-디메틸히드라지노를 나타냄.
나아가서, 본 발명의 변형된 연쇄를 갖는 올리고뉴클레오티드의 염성쌍 특성이 더 연구되었다. 이 연구는 C,G, 또는 U와 미스매치(mismatch)되는 것과 비교하여 RNA 상보체(T : rA 쌍)내에서 A에 매치될 때의 서열내에서 T*T 이량체의 5'-T의 결합을 나타낸다. 모든 염기쌍의 미스매치의 평균치는 표2에 나타나 있다. 표2는 상보 스트랜드에 대한 본 발명의 주쇄연쇄의 필수적인 Wstson-Crik 염기 쌍 특성이 일치하지 않음을 나타낸다.
[B. 올리고뉴클레오티드 유사체의 교잡의 동일성]
표적 mRNA에 대한 절대적 특성을 갖도록 교잡하기 위한 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드 유사체의 활성은 전체적인 세포질 RNA의 존재하에서 정제된 표적 mRNA를 노던 블롯(Northern blot)분석함으로써 나타낼 수 있다. 표적 mRNA는 T7 RNA 포리머라제 프로모터로부터 하부쪽으로 위치한 표적 mRNA에 대하여 cDNA를 함유하는 벡터로부터 합성된다. 합성된 mRNA는 아가로제 겔내에서 전기 영동되고 적절한 기재 멤브레인(즉 니트로셀룰로우즈)에 전달된다.이 기재 멤브레인은 블록되어 [ P]-라벨 올리고뉴클레오티드 유사체를 이용하여 검사된다. 그 결합도는 복제 블록(blot)에 의하여 그리고 상승된 온도 또는 세척 완충액의 감소된 이온 강도에서 세척하여 결정한다. 방사선 사진 촬영을 행하여 헤테로듀플레스 형성의 존재와 레이저 덴시토메트리(LKB Pharmacia, Inc.)에 의하여 정량된 방사선 사진을 검사한다. 교잡 형성체의 특성은 표준 방법에 의한 전체 세포질 RNA의 분리와 아가로제 전기 영동, 멤브레인 전달 및 라벨 올리고뉴클레오티드 유사체로의 검사에 의한 분석에 의하여 결정된다. 결합도는 변형되지 않는 안티센스 올리고뉴클레오티드에 대하여 미리 결정되고 특정의 표적 mRNA가 올리고뉴클레오티드 유사체를 갖는 헤테로듀플렉스를 형성할 수 있는 조건을 사용한다.
[절차 3-뉴클레아제 저항]
[A. 혈청 및 세포질 뉴클레아제에 대한 올리고뉴클레오티드 유사체의 저항에 대한 평가]
본 발명의 올리고뉴클레오티드 유사체는 송아지 태아 혈청의 여러 가지 농도를 함유하는 중간체내에서 올리고뉴클레오티드 유사체를 잠복시킴으로써 혈청 뉴클레아제에 대한 저항을 측정할 수 있다. 라벨 올리고뉴클레오티드 유사체는 여러번 잠복시키고, 프로테아제 K로써 처리한 다음 20% 폴리아크릴아민-우레아 변성 겔 상에서 겔 전기 영동시키고 방사선 촬영에 의하여 분석한다.
방사선 촬영은 레이저 덴시트메트리에 의하여 정량분석한다. 변형된 연쇄의 위치와 올리고뉴클레오티드의 공지된 길이에 기초하여 특정의 변형에 의한 뉴클레아제 분해에 대한 효과를 측정할 수 있다. 세포질 뉴클레아제에 대하여 HL 60 세포라인이 사용될 수 있다. 포스트-미토콘드리아 부유물을 미분 원심분리에 의하여 제조하고 라벨 올리고뉴클레오티드 유사체를 여러 번 이 부유물에 잠복시킨다. 잠복시킨 후에, 이 올리고뉴클레오티드 유사체를 혈청 뉴클레오 분해에 대하여 상기 언급한 바와 같이 분해에 대하여 평가한다. 방사선 촬영 결과는 변형되지 않은 것과 본 발명의 올리고뉴클레오티드 유사체를 비교하기 위하여 정량분석한다.
표 3은 10% 송아지 태아 혈청에 대하여 본 발명의 특정 연쇄의 뉴클레아제 저항을 나타낸다. 표3에 나타낸 바와 같이, 모든 연쇄는 천연의 뉴클레오티드에 비하여 송아지 태아 혈정의 뉴클레아제에 대하여 더 큰 안정성을 나타낸다. 표3에서 N에서 N-1 전이 및 N-1에서 N-2 전이의 t가 나타나 있다. 이 표의 시퀸스 리스트에서, *는 시퀸스내에서 본 발명의 연쇄의 위치를 나타내기 위하여 사용된 것이고, 같은 방법으로 P는 정상적인 포스포디에스테르 연쇄를 나타내기 위하여 사용된 것이다.
[절차 4-5-리폭시게나제 분석, 치료 및 평가]
[A. 치료]
치료 목적으로, 5-리폭시게나제의 과도한 또는 비정상적인 공급으로 인한 질병을 갖는 동물에 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드 유사체를 주사하여 처리한다. 이 분야의 통상의 지식을 가진 자는 적절한 용량, 주사방법, 및 반복회수등을 용이하게 결정할 수 있다. 치료의 효과가 있거나 또는 질병 상태가 약화될 때까지 이러한 치료를 계속한다. 대부분의 질병은 장기적인 치료를 요한다.
[B. 연구시약]
본 발명의 올리고뉴클레오티드 유사체는 천연의 세포 리세이트(lysate)내에서 또는 부분적으로 또는 전체적으로 정제된 RNA 제법에서 5-리폭시게나제 mRNA를 절개하거나 변형시키는데 사용하고자 할 때 연구시약으로 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 이 응용은 표준 방법에 의하여 세포를 분해하고, RNA를 최적으로 추출하고, 그 다음 약 30∼약 50℃의 온도에서 약 4-10의 PH를 갖고, 50㎜ 포스페이트로 구성되는 완충용액내에서 전체 RNA의 10Mg에 대하여 약 100∼500ng 의 농도의 조성물로 처리함으로써 달성될 수 있다. 절개된 5-리폭시게나제 RNA는 아가로제 갤 전기영동과 라디오라벨 DNA 탐사로써 교잡하거나 또는 기타의 표준 방법에 의하여 분석될 수 있다.
[C. 진단]
본 발명의 올리고뉴클레오티드 유사체는 진단목적의 응용, 즉 비정상 또는 돌연변이된 RAN 종의 발현이나 여러 가지 세포조직내에서의 특정의 mRNA종의 발현을 측정하는데 사용될 수 있다. 이러한 예에서, 올리고뉴클레오티드 유사체는 비정상적인 시퀸스에 상보적으로 설계된 가설의 비정상적인 mRNA를 표적하지만, 정상적인 mRNA를 절개하거나 교잡하지는 않는다.
세포조직 시료는 균질화될 수 있고 RNA는 표준방법에 의하여 추출된다. 천연의 균질물 또는 추출물은 예를 들어 표적 RNA의 절개를 효과적으로 하기 위하여 처리될 수 있다. 이 생성물은 절개 위치의 5' 영역은 고형의 기재에 결합된다. 본 발명 화합물에 의하여 절개되는 비정상적인 RNA의 3' 영역은 기재에 결합되지 않고 따라서 정상적인 mRNA로부터 분리된다.
변형을 위한 표적 mRNA 종은 5-리폭시게나제와 관계있지만, 이 분야의 당업자들은 본 발명이 여기에 제한되지 않고 일반적으로 응용할 수 있음을 알 수 있다. 효소 5-리폭시게나제 생성의 억제 또는 변형은 질병의 치료에 있어서 현저한 치료적 효과를 갖는 것으로 기대된다. 조성물의 효과를 평가하기 위하여, 일련의 평가가 요구된다.
[D. 시험관 평가]
5-리폭시게나제에 대한 세포질 평가는 인체의 백혈병 세포 라인 HL-60을 사용하는 것이 바람직하다. 이들 세포는 여러 가지 공지의 시약에 의하여 세포와 같은 모노시트(monocyte) 또는 세포와 같은 뉴트로필속으로 분화시키도록 도입될 수 있다. 1.3% 디메틸술폭시드(DMSO)로써 세포를 처리하여 뉴트로필속으로 세포의 분화를 증진시키는 것은 공지되어 있다. 기초의 HL-60 세포는 5-리폭시게나제 단백질 또는 분비 류코트리엔(5-리폭시게나제의 후생성물)의 탈지가능한 수준을 합성하지 않는다. DMSO로써의 세포의 분화는 DMSO를 부과한 후 48시간 후에 5-리폭시게나제 단백질 및 류코트리엔생합성을 야기시킨다. 5-리폭시게나제 단백질 합성의 도입은 이들 세포내에서 5-리폭시게나제 합성과 간섭하는 안티센스 올리고뉴클레오티드 유사체의 분석을 위한 시험수단으로 사용될 수 있다. 안티센스뉴클레오티드에 대한 제2의 시험수험은 5-리폭시게나제가 기질과 함께 반응할 때 활성을 띠지 않는다는 점에 있어서 자살(suicide)효소라는 사실을 이용한다. 분화된 HL-60 또는 기타 세포 발현 5-리폭시게나제를 10㎛ A 23187 칼슘 이오노포트(ionophore)로써 처리하면 효소의 부수적인 활성화반응으로 시토솔(cytosol)로부터 멤브레인에게로 5-리폭시게나제의 전좌를 증진시킨다. 활성화 및 여러번의 분해를 행하여, 효소는 촉매적으로 비활성이다. 그래서 그 세포를 칼슘이오노포르로 처리하여 내생의 5-리폭시게나제를 비활성시킨다. 류코트리엔 B4를 합성하기 위한 활성에 의하여 측정한 바와 같이 A23187 처리로부터 회복하는 데에는 약 24시간이 걸린다. 5-리폭시게나제에 대향하여 유도된 올리고뉴클레오티드 유사체는 다음의 정량분석을 이용한 두가지 HL-60 모델 방법으로 활성을 시험할 수 있다. 이 평가는 본래의 세포에서 5-리폭시게나제 활성을 측정하는 것과 같이 더 많은 지류물질에 대하여 본래의 세포에서 5-리폭시게나제 단백질 합성 억제의 가장 직접적인 특징으로부터 설명된다.
올리고뉴클레오티드 유사체가 본래의 세포상에 영향을 미치고 용이하게 정량화될 수 있는 가장 직접적인 효과는 5-리폭시게나제 단백질 합성에 대한 특정의 억제이다.
이 방법을 행하기 위하여, 새롭게 합성된 단백질을 표시하기 위하여 세포를 37℃에서 2시간 동안 S-메티오닌(50μCi/㎖)으로 표시할 수 있다. 전체 세포질 단백질을 용해시키기 위하여 세포를 추출하고, 5-리폭시게나제를 5-리폭시게나제 항체로 면역침전시킨 후 단백질 A 세파로제 비이드(bead)로부터 용해제거한다. 면역침전된 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동에 의하여 다시 요해시키고 방사선 촬영을 한다.
면역침전된 5-리폭시게나제의 양은 스캐닝(scanning) 덴시코메트리에 의하여 정량된다.
이러한 실험으로부터 예측되는 결과는 다음과 같다. 제어 세포로부터 면역침전된 5-리폭시게나제 단백질 양은 100%까지 정상화된다. 세포를 1㎛, 10㎛ 및 30㎛의 효율적인 올리고뉴클레오티드 유사체를 48시간동안 처리하면 각각 5%, 25% 및 75% 제어의 면역침전된 5-리폭시게나제를 환원한다.
세포질 균질체내에서 일정량의 5-리폭시게나제 효소 활성이 류코트리엔을 합성할 수 있는 효소의 양을 정량하는데 사용될 수 있다. 방사선 평가는 역상 HPLC를 이용한 세포균질체내에서 5-리폭시게나제 효소 활성을 평가하도록 개발되었다. 세포는 프로테아제 역제제와 EDTA를 함유하는 완충용액내에서 고주파음에 의한 분해처리에 의하여 파열된다. 세포균질체는 10,000×g에서 30분간 원심분리되고, 그 부유물은 5-리폭시게나제 활성을 위하여 분해된다. 시토솔 단백질은 10㎛ C-아라키돈산, 2mM ATP, 50㎛ 자유 칼슘, 100㎍/㎖ 포스파티딜콜린, 및 50mM 비스-트리스 완충용액과 함께 P7.0, 37℃에서 5분간 잠복시킨다. 이 반응을 동일한 부피의 아세톤을 부가시켜 급냉시키고, 지방산을 에틸 아세테이트로 추출한다. 그 기질과 반응 생성물은 Novapak C18 칼럼(Waters Inc. Millford. MA)상에서 역상 HPLC에 의하여 분리한다. 방사선 피이크는 Beckman 모델 171 라디오크로마토그래피 검지기에 의하여 검지된다. di-HETE 및 mono-HETE로 전환한 아라키돈산의 양은 5-리폭시게나제 활성을 측정하기 위하여 사용된다. DMSO 분화 HL-60세포를 효율적인 올리고뉴클레오티드 유사체로서 1μM, 10μM 및 30μM에서 72시간동안 처리할 때 예측되는 결과는 다음과 같다. 제어세포는 200pmol 아라키돈산/5분/10 세포를 산화시킨다. 1μM, 10μM 및 30μM 의 효율적인 올리고뉴클레오티드 유사체로 처리한 세포는 각각 195pmol, 140pmol 및 60pmol 의 아라키돈산/5분/10 세포를 산화시킨다.
세포내에서 전체의 5-리폭시게나제 단백질을 측정하기 위한 정량적 경쟁 효소 연결 면역 흡수물 평가(ELISA)가 개발되었다. 인체 5-리폭시게나제는 E.Coli 내에서 발현되고 축출, Q-세파로제, 히드록시아파타이트에 의하여 정제되며, 역상 HPLC 표준으로서 그리고 미크로티터 플레이트를 피복하기 위한 주항원으로서 사용된다. 정제된 5-리폭시게나제 25ng을 4℃에서 밤새 미크로티터 플레이트에 결합시킨다. 웰(well)을 150mM NaCl(TBS) 존재하에서 20mM 트리스 HCl 완충용액(PH7.4)내에 희석시킨 5% 염소 혈청으로 90분간 블록시킨다. 세포 추출물(0.2%, Triton X-100, 30분간 12,000×g)또는 정제된 5-리폭시게나제를 미트로티터 웰내에서 전체 부피 100μL로 5-리폭시게나제 폴리클로날 항원의 1:4000 희석액으로 90분간 잠복시킨다. 웰을 TBST로 세척하고 퍼옥시다제 표시 제2의 항원의 양은 테트라메틸벤지딘으로 개발되어 결정된다.
1㎛, 10㎛ 및 30㎛에서 30머드 올리고뉴클레오티드 유사체를 사용하는 이러한 평가로부터 예측된 결과는 약 34ng 의 5-리폭시게나제를 함유하는 처리되지 않은 세포를 갖는 10 세포마다 각각 30ng, 18ng, 및 5ng의 5-리폭시게나제가 된다.
5-리폭시게나제 생합성의 억제의 실제 효과는 자극된 세포로부터 방출된 류코트리엔의 양을 감소하는 것이다. DMSO-분화 HL-60 세포는 칼슘 이오노포로 A23187로써 자극하여 류코트리엔 B4를 방출한다. 세포매체속으로 방출된 류코트리엔 B4는 상업적으로 이용가능한 진료키드(New England Nuclear, Boston, MA)를 사용한 방사선면역평가에 의하여 정량될 수 있다. 류코트리엔 B4의 생성은 세포를 뉴트로필과 같은 세포속으로 분화시키기 위하여 DMSO를 부가시킨 48시간 후에 HL-60세포내에서 감지될 수 있다. 세포(2×10 세포/mL)는 1.3% DMSO 의 존재하에서 48∼72시간동안 농도가 증가된 올리고뉴클레오티드 유사체로 처리된다. 이 세포를 세척하고 데리피테이트된 소의 혈청 알부민 1%를 함유한 Dulbecco의 포스페이트 완충 염수 용액내에서 2×10 세포/mL 의 농도로 재부유시킨다. 세포를 10㎛ 칼슘 이오노포르 A23187로써 15분간 자극시키고 5×10 세포로부터 생성된 LTB4의 양을 설명된 바와 같이 방사선면역평가에 의하여 결정된다.
이 평가를 이용할 때 하기의 결과가 5-L0 mRNA에 유도된 15-머르 변형 연쇄 함유 안티센스 올리고뉴클레오티드(GCAAGGTCACTGAAG)로써 얻어진다. 세포를 1.3% DMSO 존재하에서 1㎛, 10㎛ 또는 30㎛ 올리고뉴클레오티드 유사체로써 72시간동안 처리된다. 5×10 세포로부터 생성된 LTB4의 양은 75pg LTB4를 생성하는 처리되지 않은 분화 세포를 갖는 약 75pg, 50pg 및 35pg가 각각 될 것으로 예측된다.
[E. 생체 평가]
생쥐내의 5-리폭시게나제 생성의 억제는 하기 절차에 따라 입증될 수 있다. 아라키돈산의 국소적인 응용은 부종과 세포질 침투가 수반되는 표피내에서 류코트리엔 B4, 류코트리엔 C4 및 프로스타글란딘 E2의 급격한 생성을 초래한다. 5-리폭시게나제의 특정 억제제는 이 평가에서 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 이 평가에서, 2㎎의 아라키돈산을 제어 역할을 하는 반대측생의 귀를 갖는 생쥐 귀에 응용시킨다. 포리모르포뉴클리어 세포 침투물을 아라키돈산을 주사한 후 1시간 후에 생검으로부터 분리한 균질체내에 미엘로퍼록시다제 활성에 의하여 평가한다. 부종 반응은 귀의 두께와 생체검사의 습윤 중량의 측정에 따라 정량화한다. 생검 시료에 의하여 생성된 류코트리엔 B4의 측정을 생체조직내에서 5-리폭시게나제 활성의 직접적인 측정으로 행한다. 올리고뉴클레오티드 유사체를 화합물의 최적의 활성을 허락하도록 아라키돈산의 주사에 앞서 12∼24시간 전에 양쪽 귀에 인가시킨다. 아라키돈산으로 대항하기 전에 0.1μ㏖, 0.3μ㏖ 또는 1.0μ㏖의 올리고뉴클레오티드 유사체로 24시간동안 예비처리한다. 측정치는 농도마다 세 마리 동물에 대하여 나타낸다. 0.1μ㏖, 0.3μ㏖ 또는 1.0μ㏖에 대한 포리모르포뉴클리어 세포 침투의 억제는 각각 약 10%, 75% 및 92%의 제어 활성을 나타낸다. 부종의 억제 약 3%, 58% 및 90%가 예측되며, 반면 류코트리엔 B4 생성의 억제는 각각 약 15%, 79% 및 99%로 예측된다.

Claims (7)

  1. 유사체의 하부단위가 하기 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드 유사체 :
    상기식에서; Bx는 다양한 염기 부; Q는 O, CH2, CHF 또는 CF2; X는 H, OH, C1-C10의 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알크아릴 또는 아르아킬; F; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; OCN; O-, S- 또는 N-알킬; O-, S- 또는 N-알켄일; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2, N3; NH2; 헤테로시클로알킬; 헤테로시클로알크알릴; 아미노알킬아미노; 폴리알킬아미노; 또는 치환된 실일; L1및 L4는 CH2, C=O, C=S, C-NH2, C-NHR3, C-OH, C-SH, C-O-R1또는 C-S-R1; L2및 L3는 각각 CR1R2, C=CR1R2, C=NR3, P(O)R4, P(S)R4, C=O, C=S, O, S, SO, SO2, NR3또는 SiR5R6; 또는 함께 알켄, 알킨, 방향족고리, 탄소고리 또는 헤테로고리 부분을 형성하고; 또는 L1, L2. L3및 L4는 함께 -CH=N-NH-CH2- 또는 -CH2-O-N=CH- 성분을 형성하며; R1및 R2는 각각 H; OH; SH; NH2; C1-C10알킬, 치환된 알킬, 알켄일, 알크아릴, 또는 아르알킬; 알콕시; 티오알콕시; 알킬아미노; 아르알킬아미노; 치환된 알킬아미노; 헤테로시클로알킬; 헤테로시클로알킬아미노; 아미노알킬아미노; 폴리알킬아미노; 할로; 포르밀; 케토; 벤즈옥시; 카르복스아미도; 티오카르복스아미도; 에스테르; 티오에스테르; 카르복스아미딘; 카르바밀; 우레이도; 또는 구아니디노; R3는 H, OH, NH2, 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알콕시, 저급 알켄일, 아르알킬, 알킬아미노, 아르알킬아미노, 치환된 알킬아미노, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알킬아미노, 아미노알킬아미노, 또는 폴리알킬아미노; R4는 OH, SH, NH2. O-알킬, S-알킬, NH-알킬, O-알킬헤테로고리, S-알킬헤테로고리, N-알킬헤테로고리 또는 질소-함유 헤테로고리; 및 R5및 R6는 각각 C1-C6알킬 또는 알콕시; 단 Q는 O이고 L1이 C=O 또는 C=S 인 경우에 L2는 NR3가 아님; 또는 Q는 O이고 L4가 C=O 또는 C=S인 경우에 L3는 NR3가 아님; 또는 Q는 O이고 L2또는 L3의 어느 하나가 C=O 또는 C=S인 경우에 L2또는 L3의 다른 하나는 NR3가 아님; 또는 Q는 O이고 L1은 CH2이고 L2는 P(O)R4이고 R4는 OH이고 X는 OH이고 BX는 우라실 또는 아데닌인 경우에 L3가 O가 아님; 또는 L1, L2및 L4가 CH2이고 X가 H 또는 OH이고 Q가 O인 경우에 L3가 S, SO 또는 SO2가 아님.
  2. 제1항에 있어서, BX가 아데닌, 구아닌, 우라실, 티민, 시토신, 2-아미노아데노산, 또는 5-메틸시토신인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드 유사체.
  3. (상기식에서 BX는 다양한 염기 부; Q는 O, CH2, CHF 또는 CF2; 그리고 E1과 E2는 서로 같거나 다른 친전자 반응기이고 상기 E1은 할로메틸, 트리플루오로메틸, 술포닐메틸, p-메틸-벤젠 술포닐메틸 또는 3'-C-포르밀이고 E2는 할로겐, 술포닐메틸, p-메틸-벤젠 술포닐메틸 또는 알데히드임)
    상기 구조식(Ⅰ)로 구성되는 제1성분과 상기 구조식(Ⅱ)로 구성되는 제2성분을 제공하는 단계 ; 및 올리고뉴클레오티드 유사체를 형성하도록 상기 친전자 반응기를 통하여 상기 제1성분과 제2성분을 히드라진 또는 히드록실아민과 같은 연결기로 커플링하는 단계; 로 이루어지는 것을 특징으로 하는 제1항의 올리고뉴클레오티드 유사체의 합성방법.
  4. 하기 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 뉴클레오시드;
    상기식에서; Bx는 다양한 염기 부 Q는 O, CH2, CHF 또는 CF2; X는 H; OH; C1-C10의 저급 알킬, 치환된 저급 알킬, 알크아릴 또는 아르아킬; F; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; OCN; O-, S- 또는 N-알킬; O-, S- 또는 N-알켄일; SOCH3; SO2CH3; ONO2; NO2; N3; NH2; 헤테로시클로알킬; 헤테로시클로알크알릴; 아미노알킬아미노; 폴리알킬아미노; 또는 치환된 실일; Y는 히드록실, 아미노메틸, 히드라지노메틸, 히드록시메틸, C-포르밀, 프탈이미도히드록시메틸, 아릴-치환된 이미다졸이디노, 아미노히드록시메틸, Ortho-메틸아미노벤젠티오, 메틸포스포네이트 및 메틸알킬포스포네이트; 및 Z는 H, 히드록실 아미노메틸, 히드라지노메틸, 히드록시메틸, C-포르밀, 프탈이미도히드록시메틸, 아릴-치환된 이미다졸이디노, 아미노히드록시메틸, ortho-메틸아미노벤젠티오, 메틸포스포네이트 또는 메틸알킬포스포네이트; 단, Q가 O이고 Y가 히드록시메틸이며 X가 H 또는 OH인 경우에 Z는 H또는 C-포르밀이 아니고; Q가 O이고 X가 H 또는 OH이며 Z가 히드록실인 경우에 Y는 아미노히드록시메틸, 히드라지노메틸 또는 아릴치환된 이미다졸이디노가 아닌 것을 조건으로 함.
  5. 펜타푸라노실 뉴클레오시드의 3' 탄소원자에 라디칼을 생성하는 단계 ; 및 상기 라디칼을 다른 펜타푸라노실 뉴클레오시드의 5' 위치상에 있는 옥심단위와 반응시키는 단계; 로 구성되는 것을 특징으로 하는 제1항의 올리고뉴클레오티드 유사체의 합성방법.
  6. L2또는 L3의 하나가 NR3이고 R3가 H인 제1항의 올리고뉴클레오티드 유사체의 L2또는 L3질소 성분을 펜옥시 아세틸클로라이드로써 보호하는 단계; 상기 올리고뉴클레오티드를 변성시키기 위하여 상기 올리고뉴클레오티드 유사체를 더 반응시키는 단계; 및 상기 질소성분을 수산화암모늄으로 탈보호하는 단계; 로 구성되는 것을 특징으로 하는 제1항의 올리고뉴클레오티드 유사체의 L2또는 L3질소단위를 보호하는 방법.
  7. 두 관능기의 뉴클레오시드 또는 올리고뉴클레오티드 유사체의 두 관능기의 하나가 알데히드인 경우에 알데히드를 갖는 옥심 유도체를 형성하도록 상기 알데히드를 메톡시아민 산염과 반응시키는 단계; 상기 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체를 변성시키기 위하여 상기 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체를 더 반응시키는 단계; 및 상기 알데히드를 재생시키도록 상기 옥심을 아세트알데히드와 반응시키는 단계; 로 구성되는 것을 특징으로 하는 두 관능기의 하나가 알데히드인 경우에 두 관능기의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 유사체를 보호하는 방법.
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Families Citing this family (593)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6444798B1 (en) * 1988-06-06 2002-09-03 Steven Albert Benner Chimeras of sulfur-linked oligonucleotide analogs and DNA and RNA
US5872232A (en) * 1990-01-11 1999-02-16 Isis Pharmaceuticals Inc. 2'-O-modified oligonucleotides
US6783931B1 (en) 1990-01-11 2004-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US6399754B1 (en) * 1991-12-24 2002-06-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides
US6753423B1 (en) 1990-01-11 2004-06-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhanced biostability and altered biodistribution of oligonucleotides in mammals
US5681941A (en) * 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US6339066B1 (en) 1990-01-11 2002-01-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotides which have phosphorothioate linkages of high chiral purity and which modulate βI, βII, γ, δ, Ε, ζ and η isoforms of human protein kinase C
US7037646B1 (en) 1990-01-11 2006-05-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US6005087A (en) * 1995-06-06 1999-12-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modified oligonucleotides
US20040142899A1 (en) * 1990-01-11 2004-07-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhanced biostability and altered biodistribution of oligonucleotides in mammals
US6358931B1 (en) 1990-01-11 2002-03-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating RNA
US5859221A (en) * 1990-01-11 1999-01-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modified oligonucleotides
US5541307A (en) * 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5618704A (en) * 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5386023A (en) * 1990-07-27 1995-01-31 Isis Pharmaceuticals Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling
US5610289A (en) * 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US6121433A (en) * 1990-07-27 2000-09-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds having nitrogen-containing linkages
US5998603A (en) * 1994-09-29 1999-12-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4'-desmethyl nucleoside analogs, and oligomers thereof
US5602240A (en) * 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5623070A (en) * 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5378825A (en) * 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
PT98562B (pt) * 1990-08-03 1999-01-29 Sanofi Sa Processo para a preparacao de composicoes que compreendem sequencias de nucleo-sidos com cerca de 6 a cerca de 200 bases resistentes a nucleases
US5789573A (en) * 1990-08-14 1998-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of ICAM-1, E-selectin, and CMV IE1/IE2
EP0549686A4 (en) * 1990-09-20 1995-01-18 Gilead Sciences Inc Modified internucleoside linkages
US5965722A (en) 1991-05-21 1999-10-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of ras gene with chimeric and alternating oligonucleotides
US7015315B1 (en) 1991-12-24 2006-03-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligonucleotides
US6335434B1 (en) 1998-06-16 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc., Nucleosidic and non-nucleosidic folate conjugates
US8153602B1 (en) 1991-11-19 2012-04-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Composition and methods for the pulmonary delivery of nucleic acids
US5359044A (en) * 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
EP0635023B1 (en) * 1992-03-05 2002-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Covalently cross-linked oligonucleotides
US5543507A (en) * 1992-03-05 1996-08-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Covalently cross-linked oligonucleotides
US6537973B1 (en) 1992-03-16 2003-03-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide inhibition of protein kinase C
US6117847A (en) * 1992-03-16 2000-09-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides for enhanced modulation of protein kinase C expression
GB9207380D0 (en) * 1992-04-03 1992-05-13 Ici Plc Compounds
US5817781A (en) * 1992-06-01 1998-10-06 Gilead Sciences, Inc. Modified internucleoside linkages (II)
US5434257A (en) * 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
WO1994000467A1 (en) * 1992-06-24 1994-01-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5872242A (en) * 1992-10-05 1999-02-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide inhibition of ras
US20030013670A1 (en) * 1992-10-05 2003-01-16 Monia Brett P. Antisense oligonucleotide inhibition of ras
EP0670897A4 (en) * 1992-10-05 1997-08-06 Isis Pharmaceuticals Inc INHIBITION OF THE RAS GENE WITH COUNTERFLOWING OLIGONUCLEOTIDS.
US6784290B1 (en) 1992-10-05 2004-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide inhibition of ras
US5985558A (en) 1997-04-14 1999-11-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense oligonucleotide compositions and methods for the inibition of c-Jun and c-Fos
CA2159629A1 (en) * 1993-03-31 1994-10-13 Sanofi Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
HU9501978D0 (en) * 1993-03-31 1995-09-28 Sterling Winthorp Inc Bifunctional nucleosides, oligomers thereof, and methods of making and using the same
GB9311682D0 (en) * 1993-06-05 1993-07-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
US6605708B1 (en) * 1993-07-28 2003-08-12 Hybridon, Inc. Building blocks with carbamate internucleoside linkages and oligonucleotides derived therefrom
US6653458B1 (en) 1993-09-03 2003-11-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modified oligonucleotides
CA2170869C (en) 1993-09-03 1999-09-14 Phillip Dan Cook Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
JPH09508134A (ja) * 1994-01-26 1997-08-19 チバ−ガイギー アクチェンゲゼルシャフト 変型オリゴヌクレオチド
US5625050A (en) * 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5981731A (en) * 1994-05-31 1999-11-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of B-raf gene expression
US6391636B1 (en) 1994-05-31 2002-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of raf gene expression
JPH10503934A (ja) * 1994-08-09 1998-04-14 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト 抗腫瘍性アンチセンスオリゴヌクレオチド
GB9417746D0 (en) * 1994-09-03 1994-10-19 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
GB9417938D0 (en) * 1994-09-06 1994-10-26 Ciba Geigy Ag Compounds
US5681940A (en) * 1994-11-02 1997-10-28 Icn Pharmaceuticals Sugar modified nucleosides and oligonucleotides
EP0714907A1 (en) * 1994-11-30 1996-06-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Oligoribonucleotides with amide backbone
US5807718A (en) 1994-12-02 1998-09-15 The Scripps Research Institute Enzymatic DNA molecules
US6207826B1 (en) 1995-03-27 2001-03-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Macrocyclic compounds having nitrogen-containing linkages
EP0817787A4 (en) 1995-03-27 2000-09-13 Isis Pharmaceuticals Inc NITROGEN MACROCYCLIC COMPOUNDS
US6420549B1 (en) * 1995-06-06 2002-07-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide analogs having modified dimers
US6251939B1 (en) 1995-06-07 2001-06-26 Promega Biosciences, Inc. Carbamate-based cationic lipids
US5665721A (en) * 1995-06-07 1997-09-09 Abbott Laboratories Heterocyclic substituted cyclopentane compounds
US6143749A (en) * 1995-06-07 2000-11-07 Abbott Laboratories Heterocyclic substituted cyclopentane compounds
US5855911A (en) * 1995-08-29 1999-01-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Liposomal phosphodiester, phosphorothioate, and P-ethoxy oligonucleotides
GB9604669D0 (en) 1996-03-05 1996-05-01 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
US5856099A (en) * 1996-05-21 1999-01-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense compositions and methods for modulating type I interleukin-1 receptor expression
US20040203024A1 (en) * 1996-06-06 2004-10-14 Baker Brenda F. Modified oligonucleotides for use in RNA interference
US5898031A (en) * 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
US20040161777A1 (en) * 1996-06-06 2004-08-19 Baker Brenda F. Modified oligonucleotides for use in RNA interference
US20070275921A1 (en) * 1996-06-06 2007-11-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric Compounds That Facilitate Risc Loading
US9096636B2 (en) * 1996-06-06 2015-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
US20050119470A1 (en) * 1996-06-06 2005-06-02 Muthiah Manoharan Conjugated oligomeric compounds and their use in gene modulation
US7812149B2 (en) * 1996-06-06 2010-10-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2′-Fluoro substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
US20040266706A1 (en) * 2002-11-05 2004-12-30 Muthiah Manoharan Cross-linked oligomeric compounds and their use in gene modulation
US20040147022A1 (en) * 1996-06-06 2004-07-29 Baker Brenda F. 2'-methoxy substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
US20050053976A1 (en) * 1996-06-06 2005-03-10 Baker Brenda F. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
US20050042647A1 (en) * 1996-06-06 2005-02-24 Baker Brenda F. Phosphorous-linked oligomeric compounds and their use in gene modulation
GB9612600D0 (en) 1996-06-13 1996-08-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
WO1998000434A1 (en) * 1996-06-28 1998-01-08 Novartis Ag Modified oligonucleotides
US7309692B1 (en) 1996-07-08 2007-12-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of chronic myelogenous leukemic cell growth by liposomal-antisense oligodeoxy-nucleotides targeting to GRB2 or CRK1
US6077954A (en) 1996-08-01 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted heterocyclic compounds
WO1998005766A1 (fr) * 1996-08-02 1998-02-12 Bio Merieux Procede d'amplification d'une sequence d'un acide nucleique cible
US6111085A (en) * 1996-09-13 2000-08-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbamate-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US6977244B2 (en) 1996-10-04 2005-12-20 Board Of Regents, The University Of Texas Systems Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides
US5780241A (en) 1996-11-05 1998-07-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Complex chemical libraries
US6077833A (en) * 1996-12-31 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
US6319906B1 (en) 1996-12-31 2001-11-20 Isis Pharmaceuticals Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
US7235653B2 (en) 1996-12-31 2007-06-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
US6172209B1 (en) * 1997-02-14 2001-01-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Aminooxy-modified oligonucleotides and methods for making same
US6639062B2 (en) * 1997-02-14 2003-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy-modified nucleosidic compounds and oligomeric compounds prepared therefrom
US6127533A (en) 1997-02-14 2000-10-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-aminooxy-modified oligonucleotides
US6576752B1 (en) * 1997-02-14 2003-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy functionalized oligomers
AU735522C (en) 1997-04-29 2005-04-07 Scripps Research Institute, The Enzymatic dna molecules
ATE321882T1 (de) 1997-07-01 2006-04-15 Isis Pharmaceuticals Inc Zusammensetzungen und verfahren zur verabreichung von oligonukleotiden über die speiseröhre
US5877309A (en) 1997-08-13 1999-03-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotides against JNK
US20070149472A1 (en) * 1997-08-13 2007-06-28 Mckay Robert Antisense oligonucleotide compositions and methods for the modulation of jnk proteins
US6809193B2 (en) 1997-08-13 2004-10-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide compositions and methods for the modulation of JNK proteins
US6133246A (en) * 1997-08-13 2000-10-17 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense oligonucleotide compositions and methods for the modulation of JNK proteins
US20030165888A1 (en) * 2001-07-18 2003-09-04 Brown Bob D. Oligonucleotide probes and primers comprising universal bases for diagnostic purposes
US6518017B1 (en) * 1997-10-02 2003-02-11 Oasis Biosciences Incorporated Combinatorial antisense library
US7704962B1 (en) 1997-10-03 2010-04-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Small oligonucleotides with anti-tumor activity
US7285288B1 (en) 1997-10-03 2007-10-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides
US6232463B1 (en) 1997-10-09 2001-05-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5948902A (en) 1997-11-20 1999-09-07 South Alabama Medical Science Foundation Antisense oligonucleotides to human serine/threonine protein phosphatase genes
US5968748A (en) * 1998-03-26 1999-10-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of human HER-2 expression
US20040186071A1 (en) * 1998-04-13 2004-09-23 Bennett C. Frank Antisense modulation of CD40 expression
US7321828B2 (en) * 1998-04-13 2008-01-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. System of components for preparing oligonucleotides
JP2002515514A (ja) 1998-05-21 2002-05-28 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド オリゴヌクレオチドの局所送逹のための組成物及び方法
CA2329130A1 (en) * 1998-05-21 1999-11-25 Isis Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for non-parenteral delivery of oligonucleotides
US6300319B1 (en) 1998-06-16 2001-10-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeted oligonucleotide conjugates
US6867294B1 (en) 1998-07-14 2005-03-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages
US6673912B1 (en) 1998-08-07 2004-01-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2′-O-aminoethyloxyethyl-modified oligonucleotides
US20040009938A1 (en) * 1998-08-07 2004-01-15 Muthiah Manoharan Methods of enhancing renal uptake of oligonucleotides
US6043352A (en) 1998-08-07 2000-03-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-Dimethylaminoethyloxyethyl-modified oligonucleotides
US6175004B1 (en) 1998-09-01 2001-01-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for the synthesis of oligonucleotides incorporating 2-aminoadenosine
US6077709A (en) 1998-09-29 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of Survivin expression
US6069243A (en) * 1998-10-06 2000-05-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for oligonucleotide synthesis
US6667176B1 (en) 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
US6492111B1 (en) 1998-11-25 2002-12-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. In situ binary synthesis of biologically effective molecules
US6087112A (en) * 1998-12-30 2000-07-11 Oligos Etc. Inc. Arrays with modified oligonucleotide and polynucleotide compositions
US20030180789A1 (en) * 1998-12-30 2003-09-25 Dale Roderic M.K. Arrays with modified oligonucleotide and polynucleotide compositions
US6403779B1 (en) 1999-01-08 2002-06-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Regioselective synthesis of 2′-O-modified nucleosides
US6399765B1 (en) 1999-03-17 2002-06-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for removing dimethoxytrityl groups from oligonucleotides
AU3934000A (en) 1999-03-18 2000-10-04 United Therapeutics Corporation Inhibitors of endothelin-1 synthesis
US6235891B1 (en) 1999-03-31 2001-05-22 South Alabama Medical Science Foundation Glucocorticoid receptor agonist and decreased PP5
CA2365984A1 (en) * 1999-04-08 2000-10-19 Oasis Biosciences, Inc. Antisense oligonucleotides comprising universal and/or degenerate bases
US7098192B2 (en) 1999-04-08 2006-08-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of STAT3 expression
US6656730B1 (en) 1999-06-15 2003-12-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides conjugated to protein-binding drugs
US6147200A (en) * 1999-08-19 2000-11-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers
US6277982B1 (en) 1999-08-20 2001-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Alkylation of alcohols, amines, thiols and their derivatives by cyclic sulfate intermediates
US6261840B1 (en) 2000-01-18 2001-07-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of PTP1B expression
US20020055479A1 (en) 2000-01-18 2002-05-09 Cowsert Lex M. Antisense modulation of PTP1B expression
AU2001276691A1 (en) * 2000-08-03 2002-02-18 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Brushless motor and method of manufacturing the brushless motor
US7767802B2 (en) 2001-01-09 2010-08-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
EP1404698A4 (en) 2001-06-21 2004-12-22 Isis Pharmaceuticals Inc ANTI-SENSE MODULATION OF SOLUBLE SUPEROXIDE DISMUTASE 1 EXPRESSION
US7425545B2 (en) 2001-07-25 2008-09-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of C-reactive protein expression
US6964950B2 (en) 2001-07-25 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of C-reactive protein expression
US20030096772A1 (en) 2001-07-30 2003-05-22 Crooke Rosanne M. Antisense modulation of acyl CoA cholesterol acyltransferase-2 expression
US7407943B2 (en) 2001-08-01 2008-08-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein B expression
US7227014B2 (en) 2001-08-07 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein (a) expression
AU2002334895B2 (en) 2001-10-09 2006-10-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of insulin-like growth factor binding protein 5 expression
US6750019B2 (en) 2001-10-09 2004-06-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of insulin-like growth factor binding protein 5 expression
EP1488233A4 (en) 2001-10-09 2006-06-21 Genentech Inc NEW ACID MUDE PROTEINS AND THESE CODING POLYNUCLEOTIDES
DE10159904A1 (de) * 2001-12-06 2003-07-03 Adnagen Ag Oligonukleotidanordnung, Verfahren zum Nukleotidnachweis sowie Vorrichtung hierfür
US6965025B2 (en) 2001-12-10 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of connective tissue growth factor expression
WO2003061386A1 (en) * 2002-01-03 2003-07-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Wt1 antisense oligos for the inhibition of breast cancer
US20030166282A1 (en) * 2002-02-01 2003-09-04 David Brown High potency siRNAS for reducing the expression of target genes
ATE529512T1 (de) * 2002-02-01 2011-11-15 Life Technologies Corp Doppelsträngige oligonukleotide
US20060009409A1 (en) 2002-02-01 2006-01-12 Woolf Tod M Double-stranded oligonucleotides
US20030191075A1 (en) * 2002-02-22 2003-10-09 Cook Phillip Dan Method of using modified oligonucleotides for hepatic delivery
US7169916B2 (en) * 2002-04-01 2007-01-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chloral-free DCA in oligonucleotide synthesis
US7199107B2 (en) 2002-05-23 2007-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of kinesin-like 1 expression
US20100075423A1 (en) * 2002-06-12 2010-03-25 Life Technologies Corporation Methods and compositions relating to polypeptides with rnase iii domains that mediate rna interference
US20040248094A1 (en) * 2002-06-12 2004-12-09 Ford Lance P. Methods and compositions relating to labeled RNA molecules that reduce gene expression
WO2004011479A1 (en) * 2002-07-25 2004-02-05 Micrologix Biotech Inc. Inhibitors of rna dependent rna polymerase and uses thereof
SI3222724T1 (sl) 2002-08-05 2019-03-29 Silence Therapeutics Gmbh Nadaljnje nove oblike molekul interferenčne RNA
US20040029275A1 (en) * 2002-08-10 2004-02-12 David Brown Methods and compositions for reducing target gene expression using cocktails of siRNAs or constructs expressing siRNAs
US20050196382A1 (en) * 2002-09-13 2005-09-08 Replicor, Inc. Antiviral oligonucleotides targeting viral families
EA008940B1 (ru) * 2002-09-13 2007-10-26 Репликор, Инк. Антивирусные олигонуклеотиды, не связанные с комплементарностью последовательностей
EP1546344A4 (en) * 2002-09-18 2007-10-03 Isis Pharmaceuticals Inc EFFICIENT REDUCTION OF TARGET RNA USING OLIGOMERIC COMPOUNDS WITH SINGLE AND DOUBLE STRAPS
WO2004031350A2 (en) 2002-09-26 2004-04-15 Amgen, Inc. Modulation of forkhead box o1a expression
WO2004044138A2 (en) 2002-11-05 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
WO2004044132A2 (en) * 2002-11-05 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modified oligonucleotides for use in rna interference
ES2420914T3 (es) 2002-11-13 2013-08-27 Genzyme Corporation Modulación antisentido de la expresión de la apolipoproteína B
AU2003294281B2 (en) 2002-11-13 2010-05-20 Kastle Therapeutics, Llc Antisense modulation of apolipoprotein B expression
US7144999B2 (en) 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
WO2004072284A1 (en) 2003-02-11 2004-08-26 Antisense Therapeutics Ltd Modulation of insulin like growth factor i receptor expression
US7002006B2 (en) * 2003-02-12 2006-02-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Protection of nucleosides
US7803781B2 (en) 2003-02-28 2010-09-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of growth hormone receptor expression and insulin-like growth factor expression
EP3450559A1 (en) 2003-03-07 2019-03-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic compositions
US20040185559A1 (en) 2003-03-21 2004-09-23 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 1 expression
US7598227B2 (en) 2003-04-16 2009-10-06 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of apolipoprotein C-III expression
ES2702942T3 (es) 2003-04-17 2019-03-06 Alnylam Pharmaceuticals Inc Agentes de ARNi modificados
US7399853B2 (en) 2003-04-28 2008-07-15 Isis Pharmaceuticals Modulation of glucagon receptor expression
US20040219533A1 (en) * 2003-04-29 2004-11-04 Jim Davis Biological bar code
WO2004098386A2 (en) * 2003-05-01 2004-11-18 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotides comprising a molecular switch
US7897582B2 (en) 2003-05-23 2011-03-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
US7960355B2 (en) 2003-05-23 2011-06-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
WO2004108081A2 (en) * 2003-06-02 2004-12-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide synthesis with alternative solvents
CA2524495A1 (en) 2003-06-03 2005-01-13 Eli Lilly And Company Modulation of survivin expression
WO2005014782A2 (en) 2003-06-13 2005-02-17 Alnylam Europe Ag., Double-stranded ribonucleic acid with increased effectiveness in an organism
EP1636342A4 (en) * 2003-06-20 2008-10-08 Isis Pharmaceuticals Inc OLIGOMERIC COMPOUNDS FOR GENE MODULATION
US7525013B2 (en) * 2003-06-30 2009-04-28 United Soybean Board Soybean selection system based on AEC-resistance
WO2005013901A2 (en) 2003-07-31 2005-02-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding rnas
US7825235B2 (en) 2003-08-18 2010-11-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 2 expression
US20070123480A1 (en) * 2003-09-11 2007-05-31 Replicor Inc. Oligonucleotides targeting prion diseases
NZ576775A (en) 2003-09-18 2010-12-24 Isis Pharmaceuticals Inc Modulation of eIF4E expression
WO2005027962A1 (en) * 2003-09-18 2005-03-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4’-thionucleosides and oligomeric compounds
US7125945B2 (en) * 2003-09-19 2006-10-24 Varian, Inc. Functionalized polymer for oligonucleotide purification
US20050191653A1 (en) 2003-11-03 2005-09-01 Freier Susan M. Modulation of SGLT2 expression
EP2363480A3 (en) 2004-01-20 2015-10-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of glucocorticoid receptor expression
US8569474B2 (en) * 2004-03-09 2013-10-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand
US20050244869A1 (en) * 2004-04-05 2005-11-03 Brown-Driver Vickie L Modulation of transthyretin expression
US7674778B2 (en) 2004-04-30 2010-03-09 Alnylam Pharmaceuticals Oligonucleotides comprising a conjugate group linked through a C5-modified pyrimidine
CA2567720A1 (en) 2004-05-24 2005-12-08 Genvault Corporation Stable protein storage and stable nucleic acid storage in recoverable form
EP1771563A2 (en) 2004-05-28 2007-04-11 Ambion, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS INVOLVING MicroRNA
US8394947B2 (en) * 2004-06-03 2013-03-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Positionally modified siRNA constructs
CA2569036A1 (en) * 2004-06-03 2005-12-22 Balkrishen Bhat Chimeric gapped oligomeric compositions
US20090048192A1 (en) * 2004-06-03 2009-02-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double Strand Compositions Comprising Differentially Modified Strands for Use in Gene Modulation
JP2008501693A (ja) * 2004-06-03 2008-01-24 アイシス ファーマシューティカルズ、インク． 遺伝子調節で使用するための個別に調節された鎖を有する二本鎖組成物
US7968762B2 (en) * 2004-07-13 2011-06-28 Van Andel Research Institute Immune-compromised transgenic mice expressing human hepatocyte growth factor (hHGF)
JP5192234B2 (ja) 2004-08-10 2013-05-08 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド 化学修飾オリゴヌクレオチド
JP4468989B2 (ja) 2004-08-16 2010-05-26 クアーク・ファーマスーティカルス、インコーポレイテッド Ｒｔｐ８０１阻害剤の治療への使用
CA2583375C (en) 2004-09-02 2013-01-15 Yale University Regulation of oncogenes by micrornas
US7884086B2 (en) * 2004-09-08 2011-02-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays
EP1799859B1 (en) 2004-09-17 2014-07-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Enhanced antisense oligonucleotides
ES2534304T3 (es) 2004-11-12 2015-04-21 Asuragen, Inc. Procedimientos y composiciones que implican miARN y moléculas inhibidoras de miARN
CN101193905B (zh) 2005-02-11 2014-06-25 纪念斯隆-凯特林癌症中心 用于检测抗药egfr突变体的方法和组合物
US20090264635A1 (en) * 2005-03-25 2009-10-22 Applera Corporation Methods and compositions for depleting abundant rna transcripts
CA2605015C (en) 2005-05-06 2013-09-10 Gen-Probe Incorporated Compositions and assays to detect influenza virus a and b nucleic acids
US8354384B2 (en) * 2005-06-23 2013-01-15 Yale University Anti-aging micrornas
US8067571B2 (en) 2005-07-13 2011-11-29 Avi Biopharma, Inc. Antibacterial antisense oligonucleotide and method
AU2006304721B2 (en) 2005-10-17 2012-01-19 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect Legionella pneumophila nucleic acid
EP2325315B1 (en) 2005-10-28 2014-05-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of huntingtin gene
AU2006311730B2 (en) 2005-11-09 2010-12-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of Factor V Leiden mutant gene
DOP2007000015A (es) 2006-01-20 2007-08-31 Quark Biotech Inc Usos terapéuticos de inhibidores de rtp801
PL2314594T3 (pl) 2006-01-27 2014-12-31 Isis Pharmaceuticals Inc Zmodyfikowane w pozycji 6 analogi bicykliczne kwasów nukleinowych
EP1987166A4 (en) 2006-02-03 2010-06-02 Univ Columbia DEOXYRIBOZYME BINARY PROBES FOR ANALYSIS OF NUCLEIC ACID
EP2511383B1 (en) 2006-03-31 2013-12-25 Columbia University Binary probes for fluorescent analysis of nucleic acids
JP2009536222A (ja) 2006-05-05 2009-10-08 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド Ｐｃｓｋ９の発現を調節するための化合物および方法
JP5570806B2 (ja) 2006-05-11 2014-08-13 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｐｃｓｋ９遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法
CA2651453C (en) * 2006-05-11 2014-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-modified bicyclic nucleic acid analogs
US7666854B2 (en) * 2006-05-11 2010-02-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs
AU2007249286B2 (en) * 2006-05-12 2013-06-13 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect enterococci nucleic acid
EP2023938A4 (en) * 2006-05-23 2010-11-10 Isis Pharmaceuticals Inc MODULATION OF THE EXPRESSION OF ChREBP
US8198253B2 (en) 2006-07-19 2012-06-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and their uses directed to HBXIP
CN102321626B (zh) 2006-07-21 2014-12-10 赛伦斯治疗有限公司 用于抑制蛋白激酶3表达的方法
US9051601B2 (en) 2006-08-01 2015-06-09 Gen-Probe Incorporated Methods of nonspecific target capture of nucleic acids
EP2487240B1 (en) 2006-09-19 2016-11-16 Interpace Diagnostics, LLC Micrornas differentially expressed in pancreatic diseases and uses thereof
CA2663962A1 (en) 2006-09-19 2008-03-27 Asuragen, Inc. Mir-15, mir-26, mir-31,mir-145, mir-147, mir-188, mir-215, mir-216, mir-331, mmu-mir-292-3p regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
CA2663581C (en) 2006-09-21 2016-03-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the hamp gene
AU2007303205A1 (en) 2006-10-03 2008-04-10 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Lipid containing formulations
JP2010507387A (ja) 2006-10-25 2010-03-11 クアーク・ファーマスーティカルス、インコーポレイテッド 新規のｓｉＲＮＡおよびその使用方法
EP2407558A1 (en) 2006-10-31 2012-01-18 Noxxon Pharma AG Methods for the detection of a single- or double-stranded nucleic acid molecule
CA2671299A1 (en) 2006-12-08 2008-06-19 Asuragen, Inc. Functions and targets of let-7 micro rnas
CA2673017C (en) 2006-12-21 2015-08-04 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for nucleic acid amplification
EP2114981B1 (en) 2007-01-29 2013-05-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating protein expression
PE20090064A1 (es) 2007-03-26 2009-03-02 Novartis Ag Acido ribonucleico de doble cadena para inhibir la expresion del gen e6ap humano y composicion farmaceutica que lo comprende
EP2977452A3 (en) 2007-05-11 2016-05-25 Thomas Jefferson University Methods of treatment and prevention of neurodegenerative diseases and disorders
MX2009012197A (es) 2007-05-11 2010-01-15 Univ Pennsylvania Metodos para tratamiento de ulceras en la piel.
CA2688321A1 (en) 2007-05-30 2008-12-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
EP2173760B2 (en) 2007-06-08 2015-11-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic bicyclic nucleic acid analogs
JP5745842B2 (ja) 2007-06-19 2015-07-08 ストラトス ゲノミクス インコーポレイテッド 拡張によるハイスループット核酸配列決定
CN103215269B (zh) 2007-07-05 2015-01-21 诺瓦提斯公司 用于治疗病毒感染的dsRNA
ES2376507T5 (es) * 2007-07-05 2015-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos 6-disustituidos
WO2009023855A2 (en) * 2007-08-15 2009-02-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Tetrahydropyran nucleic acid analogs
EP2205741A2 (en) 2007-10-02 2010-07-14 Amgen Inc. Increasing erythropoietin using nucleic acids hybridizable to micro-rna and precursors thereof
JP5646997B2 (ja) 2007-10-03 2014-12-24 クォーク ファーマシューティカルズ インコーポレーティッドＱｕａｒｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． 新規ｓｉＲＮＡ構造
EP2222851B1 (en) 2007-11-20 2017-06-28 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of cd40 expression
CA3043911A1 (en) 2007-12-04 2009-07-02 Arbutus Biopharma Corporation Targeting lipids
US7595164B2 (en) * 2007-12-26 2009-09-29 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect Candida albicans nucleic acid
KR101588736B1 (ko) 2008-01-10 2016-01-26 리서치 디벨롭먼트 파운데이션 얼리키아 샤피엔시스에 대한 백신 및 진단제
WO2009100320A2 (en) * 2008-02-07 2009-08-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexitol nucleic acid analogs
WO2009111375A2 (en) * 2008-03-01 2009-09-11 Abraxis Bioscience, Llc Treatment, diagnostic, and method for discovering antagonist using sparc specific mirnas
WO2009117589A1 (en) 2008-03-21 2009-09-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising tricyclic nucleosides and methods for their use
WO2009124295A2 (en) * 2008-04-04 2009-10-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleosides and having reduced toxicity
WO2009124238A1 (en) * 2008-04-04 2009-10-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising neutrally linked terminal bicyclic nucleosides
AU2009234266B2 (en) 2008-04-11 2015-08-06 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components
WO2009137660A2 (en) * 2008-05-07 2009-11-12 Abraxis Bioscience, Llc Enhancement of drug therapy by mirna
EP2990487A1 (en) 2008-05-08 2016-03-02 Asuragen, INC. Compositions and methods related to mirna modulation of neovascularization or angiogenesis
US20100209957A1 (en) * 2008-06-20 2010-08-19 Genvault Corporation Biosample storage devices and methods of use thereof
EP2323667A4 (en) * 2008-08-07 2012-07-25 Isis Pharmaceuticals Inc MODULATION OF TRANSTHYRETIN EXPRESSION BY TREATMENT OF CNS DISEASES
US8283165B2 (en) 2008-09-12 2012-10-09 Genvault Corporation Matrices and media for storage and stabilization of biomolecules
CA2737661C (en) 2008-09-23 2019-08-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Chemical modifications of monomers and oligonucleotides with cycloaddition
DK2356129T3 (da) * 2008-09-24 2013-05-13 Isis Pharmaceuticals Inc Substituerede alpha-L-bicykliske nukleosider
DK2361256T3 (da) 2008-09-24 2013-07-01 Isis Pharmaceuticals Inc Cyclohexenyl-nukleinsyreanaloger
EP3335715A3 (en) 2008-10-15 2018-08-08 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of factor 11 expression
WO2010048549A2 (en) 2008-10-24 2010-04-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5' and 2' bis-substituted nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
EP2447274B1 (en) 2008-10-24 2017-10-04 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and methods
CN102272157B (zh) 2008-11-07 2015-11-25 研究发展基金会 用于抑制cripto/grp78复合物形成和信号的组合物和方法
NO2355851T3 (ko) 2008-11-10 2018-09-01
WO2010059944A1 (en) 2008-11-21 2010-05-27 Columbia University A split dna enzyme for visual single nucleotide polymorphism typing
CA2744987C (en) 2008-12-02 2018-01-16 Chiralgen, Ltd. Method for the synthesis of phosphorus atom modified nucleic acids
US20110288155A1 (en) 2008-12-18 2011-11-24 Elena Feinstein Sirna compounds and methods of use thereof
US8853134B2 (en) 2009-01-28 2014-10-07 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Microarrays of binary nucleic acid probes for detecting nucleic acid analytes
WO2010091308A2 (en) 2009-02-06 2010-08-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and methods
WO2010090969A1 (en) 2009-02-06 2010-08-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Tetrahydropyran nucleic acid analogs
WO2010091878A2 (en) 2009-02-13 2010-08-19 Silence Therapeutics Ag Means for inhibiting the expression of opa1
EP2398903A1 (en) 2009-02-18 2011-12-28 Silence Therapeutics Aktiengesellschaft Means for inhibiting the expression of ang2
AU2010221419B2 (en) 2009-03-02 2015-10-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid chemical modifications
EA201190178A1 (ru) * 2009-03-20 2012-06-29 Алиос Биофарма, Инк. Замещённые нуклеозидные и нуклеотидные аналоги
US20110045080A1 (en) * 2009-03-24 2011-02-24 William Marsh Rice University Single-Walled Carbon Nanotube/Bioactive Substance Complexes and Methods Related Thereto
EP2258858A1 (en) 2009-06-05 2010-12-08 Universitätsklinikum Freiburg Transgenic LSD1 animal model for cancer
KR20230098713A (ko) 2009-06-10 2023-07-04 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 향상된 지질 조성물
WO2011003020A1 (en) 2009-07-01 2011-01-06 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for nucleic acid amplification
AU2010270714B2 (en) 2009-07-06 2015-08-13 Wave Life Sciences Ltd. Novel nucleic acid prodrugs and methods use thereof
US8927513B2 (en) 2009-07-07 2015-01-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 5′ phosphate mimics
US9512164B2 (en) 2009-07-07 2016-12-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide end caps
EP2462153B1 (en) 2009-08-06 2015-07-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs
AP3574A (en) 2009-08-14 2016-02-08 Alnylam Pharmaceuticals Inc Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of a gene from the ebola virus
CN102597239A (zh) 2009-11-26 2012-07-18 夸克医药公司 包含末端取代的sirna化合物
EP3296398A1 (en) 2009-12-07 2018-03-21 Arbutus Biopharma Corporation Compositions for nucleic acid delivery
US8778904B2 (en) 2009-12-09 2014-07-15 Quark Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating diseases, disorders or injury of the CNS
AU2010328104B2 (en) 2009-12-09 2014-10-30 Nitto Denko Corporation Modulation of hsp47 expression
US20130017223A1 (en) 2009-12-18 2013-01-17 The University Of British Columbia Methods and compositions for delivery of nucleic acids
WO2011084193A1 (en) 2010-01-07 2011-07-14 Quark Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compounds comprising non-nucleotide overhangs
US8779118B2 (en) 2010-01-11 2014-07-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Base modified bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
WO2011094580A2 (en) 2010-01-28 2011-08-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Chelated copper for use in the preparation of conjugated oligonucleotides
US9198972B2 (en) 2010-01-28 2015-12-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Monomers and oligonucleotides comprising cycloaddition adduct(s)
WO2011103274A1 (en) 2010-02-17 2011-08-25 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect atopobium vaginae nucleic acid
EP2542678B1 (en) 2010-03-04 2017-04-12 InteRNA Technologies B.V. A MiRNA MOLECULE DEFINED BY ITS SOURCE AND ITS THERAPEUTIC USES IN CANCER ASSOCIATED WITH EMT
WO2011115818A1 (en) 2010-03-17 2011-09-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-substituted bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
WO2011123621A2 (en) 2010-04-01 2011-10-06 Alnylam Pharmaceuticals Inc. 2' and 5' modified monomers and oligonucleotides
CA3074551C (en) 2010-04-21 2021-05-04 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits to detect herpes simplex virus nucleic acids
WO2011133876A2 (en) 2010-04-22 2011-10-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising acyclic and abasic nucleosides and analogs
WO2011133868A2 (en) 2010-04-22 2011-10-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Conformationally restricted dinucleotide monomers and oligonucleotides
US9725479B2 (en) 2010-04-22 2017-08-08 Ionis Pharmaceuticals, Inc. 5′-end derivatives
CN103154014B (zh) 2010-04-28 2015-03-25 Isis制药公司 修饰核苷、其类似物以及由它们制备的寡聚化合物
US9127033B2 (en) 2010-04-28 2015-09-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5′ modified nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
WO2011139695A2 (en) 2010-04-28 2011-11-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modified 5' diphosphate nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
WO2011139911A2 (en) 2010-04-29 2011-11-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated single stranded rna
WO2011139917A1 (en) 2010-04-29 2011-11-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of transthyretin expression
TWI620756B (zh) 2010-05-28 2018-04-11 薩羅塔治療公司 具有經修飾之單元間連結及／或末端基團之寡核苷酸類似物
WO2011156278A1 (en) 2010-06-07 2011-12-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
US8846637B2 (en) 2010-06-08 2014-09-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted 2′-amino and 2′-thio-bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
WO2011163436A1 (en) 2010-06-24 2011-12-29 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double stranded rna compounds to rhoa and use thereof
AU2011272868B2 (en) 2010-06-30 2015-09-17 Gen-Probe Incorporated Method and apparatus for identifying analyte-containing samples using single-read determination of analyte and process control signals
CA2804599C (en) 2010-07-06 2023-01-31 Interna Technologies Bv Mirna and its diagnostic and therapeutic uses in diseases or conditions associated with melanoma, or in diseases or conditions associated with activated braf pathway
EP2593569B1 (en) 2010-07-12 2018-01-03 Gen-Probe Incorporated Compositions and assays to detect seasonal h1 influenza a virus nucleic acids
WO2012016188A2 (en) 2010-07-30 2012-02-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for delivery of active agents
WO2012016184A2 (en) 2010-07-30 2012-02-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for delivery of active agents
JP5952815B2 (ja) 2010-08-04 2016-07-13 シズル バイオテクノロジー リミテッド ガンの診断および処置のための方法および化合物
EP2611932A2 (en) 2010-08-30 2013-07-10 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and reaction mixtures for the detection of xenotropic murine leukemia virus-related virus
WO2012031243A2 (en) 2010-09-03 2012-03-08 Avi Biopharma, Inc. dsRNA MOLECULES COMPRISING OLIGONUCLEOTIDE ANALOGS HAVING MODIFIED INTERSUBUNIT LINKAGES AND/OR TERMINAL GROUPS
EP2616555B1 (en) 2010-09-16 2017-11-08 Gen-Probe Incorporated Capture probes immobilizable via l-nucleotide tail
CN103209987B (zh) 2010-09-22 2017-06-06 艾丽奥斯生物制药有限公司 取代的核苷酸类似物
EP2620428B1 (en) 2010-09-24 2019-05-22 Wave Life Sciences Ltd. Asymmetric auxiliary group
EP3438289A1 (en) 2010-10-04 2019-02-06 Gen-Probe Prodesse, Inc. Compositions, methods and kits to detect adenovirus nucleic acids
US20140134231A1 (en) 2010-10-11 2014-05-15 Sanford-Burnham Medical Research Institute Mir-211 expression and related pathways in human melanoma
EP3388532B1 (en) 2010-11-01 2021-03-10 Gen-Probe Incorporated Integrated capture and amplification of target nucleic acid for sequencing
US8569220B2 (en) 2010-11-12 2013-10-29 Jelmar, Llc Hard surface cleaning composition
JP6126009B2 (ja) 2010-11-17 2017-05-10 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッドＩｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． α−シヌクレイン発現の調節
SG190412A1 (en) 2010-12-06 2013-06-28 Quark Pharmaceuticals Inc Double stranded oligonucleotide compounds comprising threose modifications
EP2474617A1 (en) 2011-01-11 2012-07-11 InteRNA Technologies BV Mir for treating neo-angiogenesis
DK3202760T3 (da) 2011-01-11 2019-11-25 Alnylam Pharmaceuticals Inc Pegylerede lipider og deres anvendelse til lægemiddelfremføring
CA2828002A1 (en) 2011-03-03 2012-09-07 Quark Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating lung disease and injury
SG193280A1 (en) 2011-03-03 2013-10-30 Quark Pharmaceuticals Inc Oligonucleotide modulators of the toll-like receptor pathway
EP2683833B1 (en) 2011-03-10 2018-09-26 Gen-Probe Incorporated Methods for the selection and optimization of oligonucleotide tag sequences
EP2702166B1 (en) 2011-04-25 2018-06-06 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting bv-associated bacterial nucleic acid
TWI658830B (zh) 2011-06-08 2019-05-11 日東電工股份有限公司 Ｈｓｐ47表現調控強化用類視色素脂質體
US10196637B2 (en) 2011-06-08 2019-02-05 Nitto Denko Corporation Retinoid-lipid drug carrier
WO2012170347A1 (en) 2011-06-09 2012-12-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
US20140227293A1 (en) 2011-06-30 2014-08-14 Trustees Of Boston University Method for controlling tumor growth, angiogenesis and metastasis using immunoglobulin containing and proline rich receptor-1 (igpr-1)
CA3113828A1 (en) 2011-07-15 2013-01-24 Gen-Probe Incorporated Compositions and method for detecting human parvovirus nucleic acid and for detecting hepatitis a virus nucleic acids in single-plex or multiplex assays
SG10201700554VA (en) 2011-07-19 2017-03-30 Wave Life Sciences Pte Ltd Methods for the synthesis of functionalized nucleic acids
EP2742056B2 (en) 2011-08-11 2020-06-10 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Selective antisense compounds and uses thereof
US10023861B2 (en) 2011-08-29 2018-07-17 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomer-conjugate complexes and their use
EP2753714B1 (en) 2011-09-06 2017-04-12 Gen-Probe Incorporated Circularized templates for sequencing
EP3620533B1 (en) 2011-09-06 2023-01-18 Gen-Probe Incorporated Closed nucleic acid structures
EP2753713B1 (en) 2011-09-08 2017-07-19 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting bv-associated bacterial nucleic acid
WO2013040251A2 (en) 2011-09-13 2013-03-21 Asurgen, Inc. Methods and compositions involving mir-135b for distinguishing pancreatic cancer from benign pancreatic disease
EP2760477B1 (en) 2011-09-27 2018-08-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Di-aliphatic substituted pegylated lipids
US20130157884A1 (en) 2011-10-26 2013-06-20 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving mirna expression levels for distinguishing pancreatic cysts
WO2013067076A2 (en) 2011-11-03 2013-05-10 Quark Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for neuroprotection
EP3492604B1 (en) 2011-11-04 2021-01-06 Gen-Probe Incorporated Molecular assay reagents and methods
WO2013070821A1 (en) 2011-11-08 2013-05-16 Quark Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating diseases, disorders or injury of the nervous system
CA2854907C (en) 2011-11-18 2020-03-10 Sarepta Therapeutics, Inc. Functionally-modified oligonucleotides and subunits thereof
DE102011120550B4 (de) 2011-12-05 2013-11-07 Gen-Probe Prodesse, Inc. Zusammensetzungen, Verfahren und Kits zur Detektion von Adenovirusnukleinsäuren
AU2012358804B2 (en) 2011-12-22 2018-04-19 Alios Biopharma, Inc. Substituted phosphorothioate nucleotide analogs
ES2886147T3 (es) 2011-12-22 2021-12-16 Interna Tech B V MiARN para el tratamiento del cáncer de cabeza y de cuello
SG11201402826YA (en) 2011-12-22 2014-12-30 Alios Biopharma Inc Substituted nucleosides, nucleotides and analogs thereof
SG11201403756PA (en) 2012-01-01 2014-11-27 Qbi Entpr Ltd Endo180-targeted particles for selective delivery of therapeutic and diagnostic agents
CN104080912A (zh) 2012-01-12 2014-10-01 夸克制药公司 用于治疗听力和平衡障碍的组合疗法
EP3511426B1 (en) 2012-02-01 2022-08-17 Gen-Probe Incorporated Asymmetric hairpin target capture oligomers
WO2013123996A1 (en) 2012-02-24 2013-08-29 Astrazeneca Uk Limited Novel sirna inhibitors of human icam-1
WO2013134734A2 (en) 2012-03-09 2013-09-12 Vestaron Corporation Toxic peptide production, peptide expression in plants and combinations of cysteine rich peptides
EP2639238A1 (en) 2012-03-15 2013-09-18 Universität Bern Tricyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
USRE48171E1 (en) 2012-03-21 2020-08-25 Janssen Biopharma, Inc. Substituted nucleosides, nucleotides and analogs thereof
US9441007B2 (en) 2012-03-21 2016-09-13 Alios Biopharma, Inc. Substituted nucleosides, nucleotides and analogs thereof
WO2013142124A1 (en) 2012-03-21 2013-09-26 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Solid forms of a thiophosphoramidate nucleotide prodrug
US9012427B2 (en) 2012-03-22 2015-04-21 Alios Biopharma, Inc. Pharmaceutical combinations comprising a thionucleotide analog
WO2013154799A1 (en) 2012-04-09 2013-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Tricyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
EP2850092B1 (en) 2012-04-09 2017-03-01 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Tricyclic nucleic acid analogs
AU2013205110B2 (en) 2012-04-24 2016-10-13 Gen-Probe Incorporated Compositions, Methods and Kits to Detect Herpes Simplex Virus Nucleic Acids
WO2013179289A1 (en) 2012-05-31 2013-12-05 Bio-Lab Ltd. Pyrazolotriazolyl nucleoside analogues and oligonucleotides comprising them
AU2013205064B2 (en) 2012-06-04 2015-07-30 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Amplifying and Characterizing HCV Nucleic Acid
AU2013205087B2 (en) 2012-07-13 2016-03-03 Gen-Probe Incorporated Method for detecting a minority genotype
SG11201500239VA (en) 2012-07-13 2015-03-30 Wave Life Sciences Japan Asymmetric auxiliary group
AU2013202793B2 (en) 2012-07-31 2014-09-18 Gen-Probe Incorporated System, method and apparatus for automated incubation
AU2013308647B2 (en) 2012-08-30 2018-10-18 Gen-Probe Incorporated Multiphase nucleic acid amplification
WO2014043291A1 (en) 2012-09-12 2014-03-20 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded nucleic acid compounds
US9932578B2 (en) 2012-09-12 2018-04-03 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded oligonucleotide molecules to P53 and methods of use thereof
EP2895608B1 (en) 2012-09-12 2018-12-05 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded oligonucleotide molecules to p53 and methods of use thereof
WO2014045126A2 (en) 2012-09-18 2014-03-27 Uti Limited Partnership Treatment of pain by inhibition of usp5 de-ubiquitinase
US20140100124A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Asuragen, Inc. Diagnostic mirnas for differential diagnosis of incidental pancreatic cystic lesions
AU2013205122B2 (en) 2012-10-11 2016-11-10 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Detecting Human Papillomavirus Nucleic Acid
US9029335B2 (en) 2012-10-16 2015-05-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted 2′-thio-bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
US10201556B2 (en) 2012-11-06 2019-02-12 Interna Technologies B.V. Combination for use in treating diseases or conditions associated with melanoma, or treating diseases or conditions associated with activated B-raf pathway
AU2013205090B2 (en) 2012-12-07 2016-07-28 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Detecting Gastrointestinal Pathogen Nucleic Acid
EP2961853B1 (en) 2013-02-28 2018-09-19 The Board of Regents of The University of Texas System Methods for classifying a cancer as susceptible to tmepai-directed therapies and treating such cancers
CA2905144C (en) 2013-03-14 2023-08-22 Lyle J. Arnold Methods for amplification of nucleic acids on solid support
US10202629B2 (en) 2013-03-15 2019-02-12 Aegea Biotechnologies, Inc. Methods for amplification of nucleic acids utilizing clamp oligonucleotides
EP3404116B1 (en) 2013-03-15 2022-10-19 The University of Chicago Methods and compositions related to t-cell activity
CN105247076B (zh) 2013-03-15 2021-06-18 莱尔·J·阿诺德 使用拼装序列扩增片段化的目标核酸的方法
EP2978446B1 (en) 2013-03-27 2020-03-04 The General Hospital Corporation Anti-cd33 antibody for use in treating alzheimer's disease
RU2686080C2 (ru) 2013-05-01 2019-04-24 Ионис Фармасьютикалз, Инк. Композиции и способы
US20160208247A1 (en) 2013-07-31 2016-07-21 Qbi Enterprises Ltd. Methods of use of sphingolipid polyalkylamine oligonucleotide compounds
CN105452465B (zh) 2013-07-31 2019-06-21 奇比艾企业有限公司 鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物
EP4299767A3 (en) 2013-08-14 2024-03-27 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting hev nucleic acid
EP2853595A1 (en) 2013-09-30 2015-04-01 Soluventis GmbH NOTCH 1 specific siRNA molecules
US11162096B2 (en) 2013-10-14 2021-11-02 Ionis Pharmaceuticals, Inc Methods for modulating expression of C9ORF72 antisense transcript
WO2015070050A1 (en) 2013-11-08 2015-05-14 Baylor Research Institute Nuclear loclization of glp-1 stimulates myocardial regeneration and reverses heart failure
DK3077510T3 (da) 2013-12-02 2020-06-08 Ionis Pharmaceuticals Inc Antisense-forbindelser og anvendelser deraf
MX2016009290A (es) 2014-01-16 2017-02-28 Wave Life Sciences Ltd Diseño quiral.
US10087444B2 (en) 2014-02-13 2018-10-02 The Board Of Regents Of The University Of Texas System MicroRNA composition for the treatment of neuroblastoma
WO2015142910A1 (en) 2014-03-17 2015-09-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic carbocyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
US10006027B2 (en) 2014-03-19 2018-06-26 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods for modulating Ataxin 2 expression
EP3119888B1 (en) 2014-03-19 2021-07-28 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for modulating ataxin 2 expression
HUE050704T2 (hu) 2014-04-01 2020-12-28 Biogen Ma Inc Összetételek a SOD-1 expressziójának modulálására
WO2015164693A1 (en) 2014-04-24 2015-10-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising alpha-beta-constrained nucleic acid
EP3137476B1 (en) 2014-04-28 2019-10-09 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Linkage modified oligomeric compounds
KR102356388B1 (ko) 2014-05-01 2022-01-26 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 안지오포이에틴-유사 3 발현을 조절하기 위한 조성물 및 방법
RS59182B1 (sr) 2014-05-01 2019-10-31 Ionis Pharmaceuticals Inc Kompozicije i postupci za modulaciju ekspresije faktora b komplementa
WO2015190922A1 (en) 2014-06-10 2015-12-17 Erasmus University Medical Center Rotterdam Antisense oligonucleotides useful in treatment of pompe disease
WO2016033424A1 (en) 2014-08-29 2016-03-03 Genzyme Corporation Methods for the prevention and treatment of major adverse cardiovascular events using compounds that modulate apolipoprotein b
WO2016040748A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for detection of smn protein in a subject and treatment of a subject
KR102473092B1 (ko) 2014-09-15 2022-12-01 칠드런'즈 메디컬 센터 코포레이션 히스톤 h3-리신 트리메틸화를 제거함으로써 체세포 핵 이식(scnt) 효율을 증가시키는 방법 및 조성물
US20170304459A1 (en) 2014-10-10 2017-10-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for inhalation delivery of conjugated oligonucleotide
EP3209799B1 (en) 2014-10-20 2020-07-08 Gen-Probe Incorporated Red blood cell lysis solution
WO2016083624A1 (en) 2014-11-28 2016-06-02 Silence Therapeutics Gmbh Means for inhibiting the expression of edn1
EP3230445B1 (en) 2014-12-12 2024-01-24 Tod M. Woolf Compositions and methods for editing nucleic acids in cells utilizing oligonucleotides
EP3234141A4 (en) 2014-12-18 2018-06-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Reversir tm compounds
US9688707B2 (en) 2014-12-30 2017-06-27 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic morpholino compounds and oligomeric compounds prepared therefrom
WO2016112132A1 (en) 2015-01-06 2016-07-14 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for modulating expression of c9orf72 antisense transcript
EP3242956B1 (en) 2015-01-09 2020-06-17 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for diagnosing bacterial vaginosis
US10538763B2 (en) 2015-01-16 2020-01-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulation of DUX4
WO2016134293A1 (en) 2015-02-20 2016-08-25 Baylor College Of Medicine p63 INACTIVATION FOR THE TREATMENT OF HEART FAILURE
US11129844B2 (en) 2015-03-03 2021-09-28 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating MECP2 expression
JP6796593B2 (ja) 2015-03-16 2020-12-09 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド 細菌核酸を検出し細菌性膣炎を診断するための方法および組成物
US10407678B2 (en) 2015-04-16 2019-09-10 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for modulating expression of C9ORF72 antisense transcript
WO2016196897A1 (en) 2015-06-04 2016-12-08 Sarepta Therapeutics, Inc. Methods and compounds for treatment of lymphocyte-related diseases and conditions
AU2016295168B2 (en) 2015-07-17 2021-08-19 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Multi-targeted single entity conjugates
US10533175B2 (en) 2015-09-25 2020-01-14 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating Ataxin 3 expression
WO2017066643A1 (en) 2015-10-14 2017-04-20 Bio-Path Holding, Inc. P-ethoxy nucleic acids for liposomal formulation
CA2999341A1 (en) 2015-11-06 2017-05-11 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulating apolipoprotein (a) expression
WO2017096395A1 (en) 2015-12-04 2017-06-08 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating breast cancer
CA3007152A1 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Erasmus University Medical Center Rotterdam Enzymatic replacement therapy and antisense therapy for pompe disease
AU2017205399C1 (en) 2016-01-04 2023-06-15 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for detecting Candida species
CA3006599A1 (en) 2016-01-05 2017-07-13 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing lrrk2 expression
WO2017161168A1 (en) 2016-03-16 2017-09-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of dyrk1b expression
CA3013799A1 (en) 2016-03-16 2017-09-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods of modulating keap1
CA3019635A1 (en) 2016-03-31 2017-10-05 Baylor Research Institute Angiopoietin-like protein 8 (angptl8)
EP3228326A1 (en) 2016-04-05 2017-10-11 Silence Therapeutics GmbH Nucleic acid linked to a trivalent glycoconjugate
EP3443090A4 (en) 2016-04-14 2019-12-11 University of Florida Research Foundation, Incorporated USE OF MIR-223-3P AS CANCER THERAPEUTIC AND METHOD FOR THE TREATMENT OF CANCER THEREWITH
WO2017219017A1 (en) 2016-06-17 2017-12-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of gys1 expression
NL2017294B1 (en) 2016-08-05 2018-02-14 Univ Erasmus Med Ct Rotterdam Natural cryptic exon removal by pairs of antisense oligonucleotides.
NL2017295B1 (en) 2016-08-05 2018-02-14 Univ Erasmus Med Ct Rotterdam Antisense oligomeric compound for Pompe disease
MX2019003070A (es) 2016-09-16 2019-10-14 Bio Path Holdings Inc Terapia de combinacion con oligonucleotidos antisentido liposomales.
KR20190065341A (ko) 2016-10-06 2019-06-11 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 올리고머 화합물들의 접합 방법
WO2018075633A2 (en) 2016-10-19 2018-04-26 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting or quantifying hepatitis c virus
JOP20190104A1 (ar) 2016-11-10 2019-05-07 Ionis Pharmaceuticals Inc مركبات وطرق لتقليل التعبير عن atxn3
WO2018094171A1 (en) 2016-11-21 2018-05-24 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting or quantifying hepatitis b virus
WO2018102745A1 (en) 2016-12-02 2018-06-07 Cold Spring Harbor Laboratory Modulation of lnc05 expression
CN117737062A (zh) 2016-12-22 2024-03-22 因特利亚治疗公司 用于治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏症的组合物及方法
US11197928B2 (en) 2017-01-13 2021-12-14 Board Of Regents, The University Of Texas System Sustained production of high affinity antigen specific antibody by high dose BAFF receptor-targeting mAb-siRNA conjugate
WO2018165564A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Morpholino modified oligomeric compounds
CA3057154A1 (en) 2017-03-24 2018-09-27 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting or quantifying parainfluenza virus
CA3056135C (en) 2017-03-25 2024-02-20 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits to detect adenovirus nucleic acids
WO2018185252A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Silence Therapeutics Gmbh Nucleic acid conjugates
WO2018185253A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Silence Therapeutics Gmbh Ligand modified double-stranded nucleic acids
EP3385272A1 (en) 2017-04-05 2018-10-10 Silence Therapeutics GmbH Further novel oligonucleotide-ligand conjugates
CN110612354A (zh) 2017-05-11 2019-12-24 简·探针公司 用于分离靶核酸的组合物和方法
EP4276201A3 (en) 2017-06-07 2024-01-17 Gen-Probe Incorporated Detecting babesia species nucleic acid in a sample
CA3068994C (en) 2017-07-10 2023-06-27 Gen-Probe Incorporated Analytical systems and methods for nucleic acid amplification using sample assigning parameters
US11859257B2 (en) 2017-08-11 2024-01-02 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting Staphylococcus aureus
CA3071033A1 (en) 2017-08-18 2019-02-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of the notch signaling pathway for treatment of respiratory disorders
US10517889B2 (en) 2017-09-08 2019-12-31 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulators of SMAD7 expression
CN118530993A (zh) 2017-09-29 2024-08-23 因特利亚治疗公司 用于ttr基因编辑及治疗attr淀粉样变性的组合物及方法
TWI839337B (zh) 2017-09-29 2024-04-21 美商英特利亞醫療公司 用於基因組編輯之多核苷酸、組合物及方法
CA3079157A1 (en) 2017-11-02 2019-05-09 Janssen Biopharma, Inc. Oligonucleotide constructs and uses thereof
AU2018358016A1 (en) 2017-11-03 2020-05-07 Interna Technologies B.V. MiRNA molecule, equivalent, antagomir, or source thereof for treating and/or diagnosing a condition and/or a disease associated with neuronal deficiency or for neuronal (re)generation
TWI809004B (zh) 2017-11-09 2023-07-21 美商Ionis製藥公司 用於降低snca表現之化合物及方法
EP3710595A1 (en) 2017-11-17 2020-09-23 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting c1orf43 nucleic acid
US11662281B2 (en) 2017-12-13 2023-05-30 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for biological sample processing
EP3724354A1 (en) 2017-12-15 2020-10-21 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting toxigenic clostridium difficile
WO2019126641A2 (en) 2017-12-21 2019-06-27 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of frataxin expression
MX2020007369A (es) 2018-01-15 2020-10-28 Ionis Pharmaceuticals Inc Moduladores de la expresion de dnm2.
WO2019147743A1 (en) 2018-01-26 2019-08-01 Massachusetts Institute Of Technology Structure-guided chemical modification of guide rna and its applications
JP2021512303A (ja) 2018-01-29 2021-05-13 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド 分析システムおよび方法
EP3752164A1 (en) 2018-02-12 2020-12-23 InteRNA Technologies B.V. Anticancer microrna and lipid formulations thereof
TWI840345B (zh) 2018-03-02 2024-05-01 美商Ionis製藥公司 Irf4表現之調節劑
US11732260B2 (en) 2018-03-02 2023-08-22 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for the modulation of amyloid-β precursor protein
US11661601B2 (en) 2018-03-22 2023-05-30 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods for modulating FMR1 expression
EP3549610A1 (en) 2018-04-05 2019-10-09 Silence Therapeutics GmbH Nucleic acid conjugates
CA3094020A1 (en) 2018-04-11 2019-10-17 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulators of ezh2 expression
JOP20200280A1 (ar) 2018-05-09 2020-11-05 Ionis Pharmaceuticals Inc مركبات وطرق لتقليل التعبير الوراثي عن fxi
KR20210008497A (ko) 2018-05-09 2021-01-22 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 Atxn3 발현 감소용 화합물 및 방법
GB2590210B (en) 2018-06-13 2023-01-25 Gen Probe Inc Compositions and methods for detecting group B Streptococcus nucleic acid
AU2019287635A1 (en) 2018-06-14 2020-12-17 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for increasing STMN2 expression
TWI833770B (zh) 2018-06-27 2024-03-01 美商Ionis製藥公司 用於減少 lrrk2 表現之化合物及方法
US20210317515A1 (en) 2018-07-10 2021-10-14 Gen-Probe Incorporated Methods and systems for detecting and quantifying nucleic acids
AU2019310097A1 (en) 2018-07-25 2021-02-04 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for reducing ATXN2 expression
EP3830267A1 (en) 2018-07-31 2021-06-09 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for hydroxyacid oxidase 1 (hao1) gene editing for treating primary hyperoxaluria type 1 (ph1)
CA3106975A1 (en) 2018-08-01 2020-02-06 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting nucleic acids of epstein-barr virus
US20210310059A1 (en) 2018-08-08 2021-10-07 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for detecting mycoplasma genitalium
EP3833762A4 (en) 2018-08-09 2022-09-28 Verseau Therapeutics, Inc. OLIGONUCLEOTIDE COMPOSITIONS FOR TARGETING CCR2 AND CSF1R AND THEIR USES
WO2020041414A1 (en) 2018-08-21 2020-02-27 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for amplifying, detecting or quantifying human cytomegalovirus
JP7389111B2 (ja) 2018-08-24 2023-11-29 ジェン－プローブ・インコーポレーテッド 細菌の核酸を検出し、細菌性膣炎を診断するための組成物および方法
WO2020069085A2 (en) 2018-09-27 2020-04-02 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting bordetella pertussis and bordetella parapertussis nucleic acid
AU2019347517A1 (en) 2018-09-28 2021-05-06 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for lactate dehydrogenase (LDHA) gene editing
BR112021007025A2 (pt) 2018-10-16 2021-08-03 Intellia Therapeutics, Inc. composições e métodos para imunoterapia
MA53919A (fr) 2018-10-18 2021-08-25 Intellia Therapeutics Inc Constructions d'acides nucléiques et procédés d'utilisation
TW202027798A (zh) 2018-10-18 2020-08-01 美商英特利亞醫療公司 用於從白蛋白基因座表現轉殖基因的組成物及方法
BR112021007301A2 (pt) 2018-10-18 2021-07-27 Intellia Therapeutics, Inc. composições e métodos para expressar fator ix
MX2021004276A (es) 2018-10-18 2021-09-08 Intellia Therapeutics Inc Composiciones y metodos para tratar deficiencia de alfa-1 antitripsina.
CN113195743A (zh) 2018-10-22 2021-07-30 简·探针公司 扩增，检测或定量人类多瘤病毒bk病毒的组合物和方法
TW202028222A (zh) 2018-11-14 2020-08-01 美商Ionis製藥公司 Foxp3表現之調節劑
CN113646430A (zh) 2018-11-15 2021-11-12 Ionis制药公司 Irf5表达的调节剂
TW202030333A (zh) 2018-12-20 2020-08-16 美商簡 探針公司 用於檢測瘧原蟲物種核酸之組成物及方法
JP2022519532A (ja) 2019-01-31 2022-03-24 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド Ｙａｐ１発現のモジュレーター
MX2021010152A (es) 2019-02-27 2021-09-14 Ionis Pharmaceuticals Inc Moduladores de la expresion de malat1.
US20220098647A1 (en) 2019-03-22 2022-03-31 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Detecting Group A Streptococcus
CN113874076A (zh) 2019-03-28 2021-12-31 因特利亚治疗公司 包括ttr向导rna和对rna引导的dna结合剂进行编码的多核苷酸的组合物和方法
AU2020248337A1 (en) 2019-03-28 2021-11-04 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for ttr gene editing and treating ATTR amyloidosis comprising a corticosteroid or use thereof
SG11202110135YA (en) 2019-03-28 2021-10-28 Intellia Therapeutics Inc Polynucleotides, compositions, and methods for polypeptide expression
MX2021011916A (es) 2019-03-29 2021-10-26 Ionis Pharmaceuticals Inc Compuestos y metodos para modular ube3a-ats.
CN118125057A (zh) 2019-05-03 2024-06-04 简·探针公司 用于分析系统的容器输送系统
US20220307093A1 (en) 2019-07-03 2022-09-29 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotides for use in determining the presence of trichomonas vaginalis in a sample
WO2021021673A1 (en) 2019-07-26 2021-02-04 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating gfap
CN114555621A (zh) 2019-08-15 2022-05-27 Ionis制药公司 键修饰的寡聚化合物及其用途
US20220298548A1 (en) 2019-08-23 2022-09-22 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for detecting treponema pallidum
TW202118873A (zh) 2019-08-27 2021-05-16 美商維泰克斯製藥公司 用於治療與重複性ｄｎａ有關之病症之組合物及方法
WO2021046270A1 (en) 2019-09-05 2021-03-11 Gen-Probe Incorporated Detection of chlamydia trachomatis nucleic acid variants
US20220396786A1 (en) 2019-11-14 2022-12-15 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Capturing Target Nucleic Acids
SG10201914033YA (en) 2019-12-31 2021-07-29 Wilmar International Ltd Polypeptides with Lipase Activity and Uses Thereof
JP2023510395A (ja) 2020-01-16 2023-03-13 ディーエヌエイイー ダイアグノスティックス リミテッド 標的ポリヌクレオチドを単離するための組成物、キットおよび方法
JP2023512075A (ja) 2020-01-31 2023-03-23 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド オリゴヌクレオチドを特徴解析するための液体クロマトグラフィーおよび質量分析の使用
MX2022010602A (es) 2020-02-28 2022-09-09 Ionis Pharmaceuticals Inc Compuestos y metodos para modular smn2.
KR20230017783A (ko) 2020-04-28 2023-02-06 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. 시험관내 세포 전달 방법
AU2021264010A1 (en) 2020-05-01 2022-12-08 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating ATXN1
CN115698325A (zh) 2020-05-07 2023-02-03 盖立复诊断解决方案公司 用于检测SARS-CoV-2核酸的方法和组合物
EP3922720A1 (en) 2020-06-09 2021-12-15 Universidad de Murcia Therapy to prevent adverse cardiac remodeling following an acute myocardial infarction
IL298530A (en) 2020-06-29 2023-01-01 Ionis Pharmaceuticals Inc Compounds and methods for modulating plp1
US20230243001A1 (en) 2020-07-17 2023-08-03 Gen-Probe Incorporated Detection of Macrolide-Resistant Mycoplasma Genitalium
WO2022034555A1 (en) 2020-08-13 2022-02-17 Janssen Biopharma, Inc. Polynucleotide constructs and uses thereof
US20220096606A1 (en) 2020-09-09 2022-03-31 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and Methods for Treatment of Duchenne Muscular Dystrophy
CN116323440A (zh) 2020-10-21 2023-06-23 简·探针公司 流体容器管理系统
EP4240854A1 (en) 2020-11-06 2023-09-13 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and methods for treatment of dm1 with slucas9 and sacas9
US11447521B2 (en) 2020-11-18 2022-09-20 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating angiotensinogen expression
CR20230303A (es) 2020-12-11 2023-09-01 Intellia Therapeutics Inc Composiciones y métodos para reducir el mhc de clase ii en una célula
AU2021394998A1 (en) 2020-12-11 2023-06-29 Intellia Therapeutics, Inc. Polynucleotides, compositions, and methods for genome editing involving deamination
AR124408A1 (es) 2020-12-18 2023-03-22 Ionis Pharmaceuticals Inc Compuestos y métodos para modular el factor xii
TW202239959A (zh) 2020-12-23 2022-10-16 美商英特利亞醫療公司 用於減少細胞中hla-a之組合物及方法
AU2021410751A1 (en) 2020-12-23 2023-07-13 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for genetically modifying ciita in a cell
CN116848235A (zh) 2020-12-30 2023-10-03 因特利亚治疗公司 工程化t细胞
US20240110160A1 (en) 2021-01-15 2024-04-04 Board Of Regents, The University Of Texas System A trans-complementation system for sars-cov-2
WO2022170193A2 (en) 2021-02-08 2022-08-11 Intellia Therapeutics, Inc. T-cell immunoglobulin and mucin domain 3 (tim3) compositions and methods for immunotherapy
JP2024505678A (ja) 2021-02-08 2024-02-07 インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド 免疫療法のためのリンパ球活性化遺伝子３（ｌａｇ３）組成物及び方法
WO2022170172A1 (en) 2021-02-08 2022-08-11 Intellia Therapeutics, Inc. Natural killer cell receptor 2b4 compositions and methods for immunotherapy
EP4298221A1 (en) 2021-02-26 2024-01-03 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and methods for treatment of myotonic dystrophy type 1 with crispr/slucas9
TW202302848A (zh) 2021-02-26 2023-01-16 美商維泰克斯製藥公司 以crispr/sacas9治療第1型肌強直性營養不良之組合物及方法
AU2022237386A1 (en) 2021-03-15 2023-10-05 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for biological sample processing
US20240165271A1 (en) 2021-03-26 2024-05-23 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Nucleotide editing to reframe dmd transcripts by base editing and prime editing
WO2022229851A1 (en) 2021-04-26 2022-11-03 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for using slucas9 scaffold sequences
WO2022234519A1 (en) 2021-05-05 2022-11-10 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for using sacas9 scaffold sequences
BR112023026050A2 (pt) 2021-06-18 2024-03-05 Ionis Pharmaceuticals Inc Compostos e métodos para reduzir expressão de ifnar1
KR20240038705A (ko) 2021-06-22 2024-03-25 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. 간 유전자의 생체 내 편집 방법
GB202110485D0 (en) 2021-07-21 2021-09-01 Dnae Diagnostics Ltd Compositions, kits and methods for sequencing target polynucleotides
JP2024526921A (ja) 2021-07-21 2024-07-19 ディーエヌエイイー ダイアグノスティックス リミテッド 標的ポリヌクレオチドを配列決定するための組成物、キット及び方法
GB202110479D0 (en) 2021-07-21 2021-09-01 Dnae Diagnostics Ltd Compositions, kits and methods for sequencing target polynucleotides
AU2022319876A1 (en) 2021-07-27 2024-01-18 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting gastrointestinal pathogens
WO2023018637A1 (en) 2021-08-09 2023-02-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Gene editing of regulatory elements
JP2024534114A (ja) 2021-08-24 2024-09-18 インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド 細胞療法用のプログラム細胞死タンパク質１（ｐｄ１）組成物及び方法
WO2023039444A2 (en) 2021-09-08 2023-03-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Precise excisions of portions of exon 51 for treatment of duchenne muscular dystrophy
US20230193406A1 (en) 2021-09-22 2023-06-22 Herbalife International Of America, Inc. Methods and compositions for processing botanical materials
MX2024005242A (es) 2021-11-03 2024-07-02 Intellia Therapeutics Inc Polinucleotidos, composiciones y metodos para la edicion del genoma.
CN118369110A (zh) 2021-11-03 2024-07-19 英特利亚治疗股份有限公司 用于免疫疗法的cd38组合物和方法
WO2023172926A1 (en) 2022-03-08 2023-09-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Precise excisions of portions of exons for treatment of duchenne muscular dystrophy
WO2023172927A1 (en) 2022-03-08 2023-09-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Precise excisions of portions of exon 44, 50, and 53 for treatment of duchenne muscular dystrophy
WO2023185697A2 (en) 2022-03-29 2023-10-05 Accuredit Therapeutics (Suzhou) Co., Ltd. Compositions and methods for treatment of transthyretin amyloidosis
TW202405173A (zh) 2022-04-18 2024-02-01 美商維泰克斯製藥公司 用於增強aav療法及降低aav向肝臟之趨性的組合物及方法
WO2023205148A1 (en) 2022-04-19 2023-10-26 Intellia Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor compositions and uses
WO2023245113A1 (en) 2022-06-16 2023-12-21 Intellia Therapeutics, Inc. Methods and compositions for genetically modifying a cell
TW202409271A (zh) 2022-06-16 2024-03-01 美商英特利亞醫療公司 用於減少細胞中之ｍｈｃ １類之組成物及方法
TW202413631A (zh) 2022-06-16 2024-04-01 美商英特利亞醫療公司 用於基因體編輯之組成物及方法
WO2024006955A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Intellia Therapeutics, Inc. Engineered t cells
WO2024020352A1 (en) 2022-07-18 2024-01-25 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Tandem guide rnas (tg-rnas) and their use in genome editing
WO2024026474A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for transferrin receptor (tfr)-mediated delivery to the brain and muscle
EP4311579A1 (en) 2022-07-29 2024-01-31 Association Française contre les Myopathies B cell-specific mab-sirna conjugates improve myasthenia
WO2024035952A1 (en) 2022-08-12 2024-02-15 Remix Therapeutics Inc. Methods and compositions for modulating splicing at alternative splice sites
WO2024054924A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Gen-Probe Incorporated Method of detecting nucleic acid analytes using dual-specificity primers
WO2024061296A2 (en) 2022-09-22 2024-03-28 Accuredit Therapeutics (Suzhou) Co., Ltd. Compositions and methods for treatment of hypercholesterolemia and/or cardiovascular disease
WO2024098002A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Calcium voltage-gated channel auxiliary subunit gamma 1 (cacng1) binding proteins and cacng1-mediated delivery to skeletal muscle
WO2024102677A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions
WO2024107765A2 (en) 2022-11-14 2024-05-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for fibroblast growth factor receptor 3-mediated delivery to astrocytes
WO2024137766A2 (en) 2022-12-21 2024-06-27 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for proprotein convertase subtilisin kexin 9 (pcsk9) editing
WO2024138189A2 (en) 2022-12-22 2024-06-27 Intellia Therapeutics, Inc. Methods for analyzing nucleic acid cargos of lipid nucleic acid assemblies
WO2024138115A1 (en) 2022-12-23 2024-06-27 Intellia Theraperutics, Inc. Systems and methods for genomic editing
WO2024161179A1 (en) 2023-01-31 2024-08-08 Mobidiag Oy Compositions and methods for detecting stx nucleic acids
WO2024168010A2 (en) 2023-02-09 2024-08-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Reversir molecules and methods of use thereof
WO2024186890A1 (en) 2023-03-06 2024-09-12 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for hepatitis b virus (hbv) genome editing
WO2024186971A1 (en) 2023-03-07 2024-09-12 Intellia Therapeutics, Inc. Cish compositions and methods for immunotherapy

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1340645C (en) * 1987-04-17 1999-07-13 Victor E. Marquez Acid stable dideoxynucleosides active against the cytopathic effects of human immunodeficiency virus
IL90359A0 (en) * 1988-05-26 1989-12-15 University Patents Inc Nucleoside and polynucleotide thiophosphoramidite and phosphorodithioate compounds and their production
US5216141A (en) * 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
JPH0231686A (ja) * 1988-07-22 1990-02-01 Yuki Gosei Kogyo Co Ltd トリフルオロチミジンの製造方法
JPH0725785B2 (ja) * 1989-01-11 1995-03-22 日本臓器製薬株式会社 アデノシン誘導体及び該化合物を有効成分として含有する医薬組成物
FR2642074B1 (fr) * 1989-01-20 1994-04-29 Oris Ind Derives de molecules polyhydroxylees permettant l'introduction d'au moins une ramification dans un oligonucleotide
GB8920534D0 (en) * 1989-09-11 1989-10-25 Wellcome Found Antiviral compounds
US5378825A (en) * 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
PT98562B (pt) * 1990-08-03 1999-01-29 Sanofi Sa Processo para a preparacao de composicoes que compreendem sequencias de nucleo-sidos com cerca de 6 a cerca de 200 bases resistentes a nucleases
EP0549686A4 (en) * 1990-09-20 1995-01-18 Gilead Sciences Inc Modified internucleoside linkages
EP0616612A4 (en) * 1991-12-12 1995-01-11 Gilead Sciences Inc NUCLEASE-STABLE OLIGOMERS SUITABLE FOR BINDING AND METHODS OF USE.
KR930016437A (ko) * 1992-01-22 1993-08-26 귀틀라인, 슈미트 올리고뉴클레오티드 유사체, 이의 제조방법 및 용도
AU678968B2 (en) * 1992-05-29 1997-06-19 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
KR0156945B1 (ko) 1998-10-15
IE921850A1 (en) 1992-12-02
EP1004593A3 (en) 2000-07-19
DE69230935T2 (de) 2000-10-19
NO934180D0 (no) 1993-11-18
JPH06504067A (ja) 1994-05-12
WO1992020822A1 (en) 1992-11-26
FI935114A (fi) 1993-12-30
US5378825A (en) 1995-01-03
EP0586570B1 (en) 2000-09-13
HUT66378A (en) 1994-11-28
JP2711180B2 (ja) 1998-02-10
FI935113A0 (fi) 1993-11-18
DE69230935D1 (de) 2000-05-25
JPH06503838A (ja) 1994-04-28
NO934179L (no) 1994-01-12
EP0586520A1 (en) 1994-03-16
EP1004593A2 (en) 2000-05-31
FI113870B (fi) 2004-06-30
CA2103464A1 (en) 1992-11-22
AU666121B2 (en) 1996-02-01
EP0586570A1 (en) 1994-03-16
NO934180L (no) 1994-01-11
AU2150292A (en) 1992-12-30
AU1998692A (en) 1992-12-30
AU662538B2 (en) 1995-09-07
BR9206026A (pt) 1994-12-27
ATE191933T1 (de) 2000-05-15
ATE196321T1 (de) 2000-09-15
NO934179D0 (no) 1993-11-18
IE921849A1 (en) 1992-12-02
HU9303290D0 (en) 1994-03-28
EP0586520B1 (en) 2000-04-19
DE69231441D1 (de) 2000-10-19
EP0586520A4 (en) 1996-01-10
HU221806B1 (hu) 2003-01-28
EP0586570A4 (en) 1996-01-24
JP2625257B2 (ja) 1997-07-02
WO1992020823A1 (en) 1992-11-26
FI935113A (fi) 1994-01-03
DE69231441T2 (de) 2001-03-22
BR9206027A (pt) 1994-12-27
NO308703B1 (no) 2000-10-16
HUT65941A (en) 1994-08-29
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CA2103378A1 (en) 1992-11-22
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