FI113870B - Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten rungosta modifioitujen oligonukleotidianalogien valmistamiseksi - Google Patents

Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten rungosta modifioitujen oligonukleotidianalogien valmistamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI113870B
FI113870B FI935113A FI935113A FI113870B FI 113870 B FI113870 B FI 113870B FI 935113 A FI935113 A FI 935113A FI 935113 A FI935113 A FI 935113A FI 113870 B FI113870 B FI 113870B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
mol
compound
added
nucleoside
mmol
Prior art date
Application number
FI935113A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI935113A0 (fi
FI935113A (fi
Inventor
Jacques Lebreton
Adrian Waldner
Phillip Dan Cook
Mesmaeker Alain De
Original Assignee
Novartis Ag
Isis Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=24826111&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=FI113870(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Novartis Ag, Isis Pharmaceuticals Inc filed Critical Novartis Ag
Publication of FI935113A0 publication Critical patent/FI935113A0/fi
Publication of FI935113A publication Critical patent/FI935113A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI113870B publication Critical patent/FI113870B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/04—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/14—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F7/00—Compounds containing elements of Groups 4 or 14 of the Periodic Table
    • C07F7/02—Silicon compounds
    • C07F7/08—Compounds having one or more C—Si linkages
    • C07F7/18—Compounds having one or more C—Si linkages as well as one or more C—O—Si linkages
    • C07F7/1804—Compounds having Si-O-C linkages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/06—Pyrimidine radicals
    • C07H19/10—Pyrimidine radicals with the saccharide radical esterified by phosphoric or polyphosphoric acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H11/00—Compounds containing saccharide radicals esterified by inorganic acids; Metal salts thereof

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Electric Double-Layer Capacitors Or The Like (AREA)
  • Organic Insulating Materials (AREA)
  • Other Resins Obtained By Reactions Not Involving Carbon-To-Carbon Unsaturated Bonds (AREA)

Description

1 113870
Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten rungosta modifioitujen oligonukleotidianalogien valmistamiseksi
Keksinnön ala 5 Tämä keksintö koskee menetelmää sellaisten nukleaa- sin kestävien oligonukleotidianalogien valmistamiseksi, jotka ovat käyttökelpoisia terapeuttisina aineina. Keksinnön mukaisissa oligonukleotidianalogeissa on muunneltuja sidoksia fosforidiesterisidosten sijaan, jotka normaalisti 10 toimivat sokereiden välisinä sidoksina luonnon nukleiinihapoissa. Keksinnön analogit kestävät nukleaasihajotuksen ja pystyvät moduloimaan DNA:n ja RNA:n vaikutusta.
Keksinnön tausta
Tiedetään hyvin, että useimmat elimistöön liittyvät 15 tilat nisäkkäissä, kuten useimmat sairaustilat, ovat proteiinien aiheuttamia. Tällaiset proteiinit myötävaikuttavat hyvin suurelta osalta moniin sairauksiin eläimissä ja ihmisessä joko vaikuttamalla suoraan tai entsymaattisten toimintojensa kautta.
20 Klassiset terapeuttiset aineet on yleensä kohdis tettu tällaisten proteiinien kanssa tapahtuviin vuorovaikutuksiin, kun on pyritty muuntelemaan niiden sairautta aiheuttavia tai sairautta mahdollistavia toimintoja. Viime aikoina on kuitenkin yritetty muunnella tällaisten proteii-25 nien todellista tuotantoa vuorovaikutuksilla sellaisten molekyylien kanssa (se on solusisäinen RNA), jotka kohdistuvat niiden synteesiin. Näihin vuorovaikutuksiin on kuulunut hybridisoituminen komplementaaristen "antisense"-oligonuk-leotidien tai niiden tiettyjen analogien RNA:hän. Hybridi-30 saatio on oligonukleotidien tai oligonukleotidianalogien järjestys-spesifinen vetysidos RNA:han tai yksijuosteiseen DNA:han. Proteiinituotantoon puuttumalla on toivottu, että saadaan aikaan terapeuttisia tuloksia mahdollisimman suurella vaikutuksella ja mahdollisimman pienillä sivuvaiku-35 tuksilla. Oligonukleotidianalogit voivat myös moduloida elimistön proteiinituotantoa samanlaisella mekanismilla.
2 113870
Antisense-oligonukleotidien ja oligonukleotidiana-logien, kuten muidenkin terapeuttisten aineiden, farmakologinen vaikutus riippuu useista tekijöistä, jotka vaikuttavat näiden aineiden tehokkaaseen konsentraatioon tietyissä 5 solunsisäisissä kohteissa. Eräs oligonukleotideille tärkeä tekijä on lajin pysyvyys nukleaasien läsnä ollessa. On epätodennäköistä, että muuntelemattomat oligonukleotidit ovat käyttökelpoisia terapeuttisina aineina, koska nukleaasit hajottavat ne nopeasti. Siten muunnelmat, joilla oligonuk-10 leotideista tehdään nukleaaseille kestäviä, ovat hyvin haluttuja.
Oligonukleotidien muunnelmat, joilla parannetaan kestävyyttä nukleaaseja vastaan, ovat yleensä kohdistuneet sokeri-fosfaattirungon fosforiatomiin. Fosforitioaateilla, 15 metyylifosfonaateilla, fosforiamidaateilla ja fosforitri-esteillä on raportoitu ilmenevän erilaisia nukleaasin kes-totasoja. Tämän tyyppisillä fosfaatti-muunnelluilla oligo-nukleotideilla on kuitenkin ollut ongelmana huonot hybri-disaatio-ominaisuudet. Cohen, J.S., toim. Oligonucleotides: 20 Antisense Inhibitors of Gene Expression, (CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1989).
Toinen päätekijä on antisense-yhdisteiden kyky kulkea sellaisten erityisten solujen plasmamembraanin läpi, jotka liittyvät tautiprosessiin. Solukalvot koostuvat lipi-25 di-proteiinikaksoiskerroksista, joista pienet, ionittomat, lipofiiliset yhdisteet voivat helposti kulkea läpi mutta joita suurin osa luonnollisista metaboliiteista ja terapeuttisista aineista ei läpäise. Wilson, D.B. Ann. Rev. Biochem. 47:933 - 965 (1978). Luonnollisten ja muunneltujen 30 oligonukleotidien biologiset ja virusvastaiset vaikutukset viljellyissä nisäkkään soluissa on hyvin dokumentoitu. Siten vaikuttaa siltä, että nämä aineet voivat tunkeutua kalvoihin ja saavuttaa niiden solun sisällä olevat kohteensa. Erilaisten nisäkässolujen, kuten HL-60-, syyrialaisen 35 hamsterin fibroblasti-, U937-, L929-, CV-1- ja ATH8-solujen suorittamaa antisense-yhdisteiden talteenottoa on tutkittu, 113870 3 käyttäen luonnollisia oligonukleotideja ja tiettyjä nuk-leaasin kestäviä analogeja, kuten alkyylitriestereitä. Miller, P.S., Braiteman, L.T. ja Ts'O, P.O.P., Biochemistry 16:1 988 - 1 996 (1977); metyylifosfonaatteja, Marcus- 5 Sekura, C.H., Woerner, A.M., Shinozuka, K., Zon, G. ja Quinman, G.V. , Nuc. Acids Res. 15:5 749 - 5 763 (1987) ja Miller, P.S., McParland, K.B., Hayerman, K. ja Ts'0, P.O.P., Biochemistry 16: 1 988 - 1 996 (1977) ja Loke, S.K., Stein, C., Zhang, X.H., Avigan, M., Cohen, J. ja 10 Neckers, L.M. Top. Microbiol. Immunol. 141: 282 - 289 (19-88) .
Muunneltuja oligonukleotideja ja oligonukleotidi-analogeja on usein vaikeampi sisäistää kuin niiden luonnollisia vastineita. Tämän tuloksena monien aikaisemmin saata-15 villa olleiden antisense-oligonukleotidien vaikutus ei ole ollut riittävä käytännön terapeuttisiin, tutkimus- tai diagnostisiin tarkoituksiin. Sinänsä tunnettujen oligonuk-leotidien, jotka on suunniteltu antisense-terapeuttisiksi aineiksi, kaksi muuta merkittävää puutetta on huono hybri-20 disoituminen solunsisäiseen RNA:han sekä määrätyn kemiallisen tai entsyymivälitteisen tapahtuman, joka päättää perus-RNA-toiminnot, puuttuminen.
Antisense-oligonukleotidien tehokkuuden parantamiseksi ja näiden ongelmien voittamiseksi tarkoitettuja muun-:* 25 nelmia on monenlaisia. Tällaisia muunnelmia ovat kantaren- kaan muunnelmat, sokeriosan muunnelmat ja sokeri - fosfaatti -rungon muunnelmat. Tunnetuilla sokeri-fosfaattirungon muunnelmilla, erityisesti fosforiatomiin tehdyillä muunnelmilla, on saatu aikaan eritasoisia kestävyyksiä nukleaaseja 30 vastaan. Vaikka antisense-oligonukleotidin kyky sitoutua spesifiseen DNA:han tai RNA:han täsmällisesti on olennaista antisense-metodologialle, muunnelluissa oligonukleotideissä on kuitenkin yleensä on ollut ongelmana niiden heikot hybridisaatio-ominaisuudet.
35 Fosforiatomin korvaaminen on ollut vaihtoehtoinen tapa yrittää välttää ongelmia, jotka liittyvät pro-kiraali- 113870 4 sessa fosfaattiosassa tapahtuviin muunnelmiin. Joitakin muunnelmia, joissa fosforiatomin korvaaminen on suoritettu, ovat tuoneet esille: Matteucci, M. Tetrahedron Letters 31:2 385 - 2 388 (1990), jossa fosforiatomin korvaamista 5 metyleeniryhmällä rajoittaa käytettävissä oleva metodologia, jonka avulla formasetaalisidosta ei saada yhtenäisesti sijoitettua kaikkialle runkoon, sekä sen pysymättömyys, josta syystä se ei sovi työhön; Cornier, et ai. Nucleic Acids Research 16:4 583 - 4 593 (1988), jossa fosforiosan 10 korvaamista di-isopropyylisilyyliosalla rajoittaa metodologia, homopolymeerien liukoisuus ja hybridisaatio-ominaisuu-det; Stirchak, et ai. Journal of Organic . Chemistry 52:4 202 - 4 206 (1987), jossa fosforisidoksen korvaamista rajoittaa metodologia, syntyneen molekyylin liukoisuus sekä 15 hybridisaatio-ominaisuudet; Mazur, et ai. Tetrahedron 40:-3 949 - 3 956 (1984), jossa fosforisidoksen korvaamista fosfonisidoksella ei ole kehitetty homotrimeerimolekyylin synteesiä pidemmälle; ja Goodchild, J., Bioconjugate Chemistry 1:165 - 187 (1990), jossa esteraasit hajottavat ent-20 symaattisesti esterisidokset ja siten niillä ei voida korvata fosfaattisidosta vastasovelluksissa.
Fosforirungon muuntelemiseen käytettävissä olevien menetelmien rajoitukset ovat johtaneet siihen, että on jatkuva ja pitkään kestänyt tarve muunnelmista, joiden avulla 25 saadaan nukleaasin kestäviä ja hybridisaatio-ominaisuuksil-taan tyydyttäviä diagnostisia, terapeuttisia ja tutkimukseen tarkoitettuja antisense-oligonukleotideja.
Keksinnön tarkoitus
Keksinnön tarkoituksena on saada oligonukleotidi-30 analogeja, joita käytetään terapeuttisissa antisense-oiigo-nukleotideissa.
Keksinnön tarkoituksena on edelleen saada oligonuk-leotidianalogeja, joilla on parantunut soluunotto.
Keksinnön toisena tarkoituksena on saada sellaisia 35 oligonukleotidianalogeja, jotka ovat tehokkaampia kuin muuntelemattomat antisense-oligonukleotidit.
113870
Keksinnön muuna tarkoituksena on edelleen saada menetelmiä tällaisten oligonukleotidianalogien syntetisoimi-seksi.
Nämä ja muut tarkoitukset tulevat selviksi asian-5 tuntijoille esillä olevan hakemuksen ja mukana seuraavien patenttivaatimusten katsauksesta.
Keksinnön yhteenveto
Koostumukset, jotka ovat käyttökelpoisia muunneltaessa RNA- tai DNA-molekyylin aktiivisuutta tämän keksinnön 10 mukaisesti, käsittävät yleensä oligonukleotidianalogeja, joissa ainakin osa niiden rungon sidoksista on muunneltu. Näissä muunnelmissa sokeri-fosfaattirungon fosforidiesteri-sidos, jollainen on luonnon nukleiinihapoissa, on korvattu erilaisilla neljäatomisilla sidoksen muodostavilla ryhmil-15 lä. Tällaiset neljäatomiset sidoksen muodostavat ryhmät säilyttävät halutun neljän atomin etäisyyden yhden sokerin tai sokerianalogin 31-hiilen ja viereisen sokerin tai soke-rianalogin 4'-hiilen välillä. Keksinnön mukaisesti valmistetut oligonukleotidianalogit koostuvat valitusta nukleoti-20 dijärjestyksestä, joka on erityisesti hybridisoitavissa etukäteen valitun yksijuosteisen tai kaksoisjuosteisen DNA:n tai RNA:n nukleotidijärjestyksen kanssa. Ne syntetisoidaan esimerkiksi tunnetun synteettisen kiinteä tila -metodologian kautta, jolloin niistä tulee komplementaarisia 25 etukäteen valitulle RNA:n tai DNA:n nukleotidijärjes-tykselle tai ne ovat ainakin spesifisesti hybridisortuvia sen kanssa. Nukleiinihapposyntetisaattoreita on kaupallisesti saatavissa, ja asiantuntijoille niiden käytöstä on yleisesti tiedossa, että ne ovat tehokkaita johdettaessa 30 lähes mitä tahansa oligonukleotidia tai oligonukleotidiana-* logia, jonka haluttu pituus on kohtuullinen.
Tämän keksinnön yhteydessä termillä "nukleosidi" tarkoitetaan yksikköä, joka on muodostunut heterosyklisestä emäksestä ja sen sokerista. Termillä "nukleotidi" tarkoite-35 taan nukleosidia, jonka 3'- tai 41-sokerihydroksyyliryhmässä on fosfaattiryhmä. Siten nukleosideissa, päinvastoin 113870 β kuin nukleotideissa, ei ole fosfaattiryhmää. "Oligonukleo-tidilla" tarkoitetaan suurta määrää yhteen liittyneitä nuk-leotidiyksiköitä, jotka ovat muodostuneet erityiseen järjestykseen luonnossa ilmenevistä emäksistä ja pentofurano-5 syyliryhmistä, jotka luonnossa esiintyvät fosfodiesterisi-dokset liittävät yhteen sokeriryhmän kautta. Nämä nukleoti-diyksiköt voivat olla nukleiinihappoemäksiä, kuten guanii-ni, adeniini, sytosiini, tyrniini tai urasiili. Sokeriryhmä voi olla deoksiriboosi tai riboosi. Tällä termillä tarkoi-10 tetaan sekä luonnossa ilmeneviä että synteettisiä lajeja, jotka on muodostettu luonnossa esiintyvistä alayksiköistä.
Tämän keksinnön yhteydessä käytettävällä termillä "oligonukleotidianalogi" tarkoitetaan osia, jotka toimivat samalla tavoin kuin oligonukleotidit mutta joissa ei ole 15 luonnossa esiintyviä osia. Oligonukleotidianalogeissa voi olla muutettuja sokeriosia, muutettuja emäsosia tai muutettuja sokerien välisiä sidoksia. Tämän keksinnön tarkoituksia varten oligonukleotidianalogia, jossa on ei-fosfo-diesterisidoksia, eli muutettu sokerien välinen sidos, voi-20 daan vaihtoehtoisesti pitää "oligonukleosidina". Tällaisella oligonukleosidilla tarkoitetaan siten suurta määrää yhteen liittyneitä nukleosidiyksiköitä, jotka liittää yhteen sidoksen muodostavat ryhmät, jotka eivät ole luonnossa esiintyviä sidoksen muodostavia fosfodiesteriryhmiä. Lisäk-25 si tämän keksinnön tarkoituksia varten termin "oligomeerit" voidaan katsoa käsittävän oligonukleotidit, oligonukleoti-dianalogit tai oligonukleosidit. Siten puhuttaessa "oligo-meereistä", tarkoitetaan sarjaa nukleosideja tai nukleosi-dianalogeja, jotka ovat liittyneet yhteen joko luonnollis-30 ten fosfodiesterisidosten tai muiden sidosten välityksellä, mukaan lukien tämän keksinnön neljäatomiset sidokset. Yleensä, vaikka sidos on yhden nukleosidin 31-hiiliatomista toisen nukleosidin 4'-hiiliatomiin, termi "oligomeeri" voi käsittää myös muita sidoksia, kuten 21-51-sidoksen.
35 Oligonukleotidianalogit voivat myös käsittää muita muunnelmia, jotka ovat tämän keksinnön hengen mukaisia, 113870 7 erityisesti sellaisia, jotka lisäävät nukleaasin kestoa ja siten helpottavat tietyn nukleotidin antisense-terapeut-tista käyttöä. Esimerkiksi kun nukleosidin tai nukleotidin sokeriosa korvataan karboksyyli- tai jollakin muulla osal-5 la, se ei enää ole sokeri. Ennen kaikkea, kun tehdään muita korvauksia, kuten korvauksia sokereiden väliseen fosforidi-esterisidokseen, syntynyt aine ei ole enää todellinen nuk-leiinihappolaji. Tällaisilla korvauksilla saatavat yhdisteet nimetään kaikki analogeiksi. Kaikkialla tässä hakemuk-10 sessa viittaus nukleiinihappolajin sokeriosaan tulee ymmärtää viittauksena joko todelliseen sokeriin tai lajiin, joka vie sokerin traditionaalisen tilan luonnon nukleiinihapoissa. Ennen kaikkea viittauksella sokereiden välisiin sidoksiin on tarkoitus käsittää osat, jotka liittävät sokeri-15 tai sokerianalogiosat yhteen luonnon nukleiinihappojen tavoin.
Esillä olevan keksinnön mukaisesti keksinnön avulla saadaan uudentyyppisiä antisense-oligonukleotidianalogeja ja oligonukleosideja, jotka on muunneltu siten, että so-20 luunotto, nukleaasin kesto ja hybridisaatio-ominaisuudet ovat parantuneet, ja keksinnön avulla saadaan määrätty kemiallinen tai entsyymivälitteinen tapahtuma, joka päättää olennaiset RNA-toiminnot.
Keksinnön kohteena on menetelmä terapeuttisesti * i : 25 käyttökelpoisen yhdisteen valmistamiseksi, jonka rakenne on: . · 8 113870 rhp I ? ? 51 w L, * >
R H p 2 O X
jossa Βχ on vaihtuva emäsosa; 5 Q on O, CH2, CHF tai CF2; X on H; OH; Ci-io-alempi-alkyyli, substituoitu alempi-alkyyli, alkaryyli tai aralkyyli; F; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; OCN; O-, S- tai N-alkyyli; O-, S- tai N-alke-nyyli; SOCH3; S02CH3; 0N02; N02; N3; NH2; heterosykloalkyy-10 li; heterosykloalkaryyli; aminoalkyyliamio; polyalkyyli-amino; tai substituoitu silyyli;
Li-L2-L3-L4 valitaan seuraavista: NR-C (0) -CH2-CH2< NR-C(S)-CH2-CH2, CH2-NR-C(0) -CH2f CH2-NR-C (S)-CH2, CH2-CH2- NR-C(O), CH2-CH2-NR-C (S) , C (0)-NR-CH2-CH2, C (S)-NR-CH2-CH2, 15 CH2-C(0) -NR-CH2 ja CH2-C (S)-NR-CH2, jossa R on vety, alkyy li, substituoitu alkyyli, aralkyyli, alkenyyli, alkaryyli, aminoalkyyli, hydroksialkyyli, heterosykloalkyyli tai hetero- sykloaralkyyli , ja
Rhpi ja Rhp2 ovat toisistaan riippumatta H tai 20 hydroksyyliryhmän suojaryhmä;
Edullisten suoritusmuotojen mukaan keksinnön oligo-nukleotidianalogeissa on sokeriosia siten, että Q on 0.
Edullisemmin oligonukleotidianalogeilla on jokin seuraavista kaavoista: 25 113870 9 X/ X/ χ . X , V , ρ Χρ1 Ιρι -Γ- ' Β -Γ" Β*
X' X
οΐ^ΝΗ Υ^0 I-. Β, Η Ν-1 Β Χ7 ^
On edullista, että oligonukleotidianalogit ovat sellaisia, että X on H tai OH, tai vaihtoehtoisesti F, 0-5 alkyyli tai O-alkenyyli, erityisesti kun Q on O. Bx-ryhmä on edullisesti adeniini, guaniini, urasiili, tyrniini, sy-tosiini, 2-aminoadenosiini tai 5-metyylisytosiini, joskin muita ei-luonnossa esiintyviä lajeja voidaan käyttää.
On edullista, että keksinnön mukaisissa oligonuk-10 leoatidianalogeissa on noin 4-50 alayksikköä ja vielä m· edullisemmin noin 5-20 alayksikköä, joilla on annettu rakenne. Vaikka kaikilla oligonukleotidianalogeilla voi olla olennaisesti mainittu rakenne, on myös edullista, että oleellisesti vaihtelevilla alayksiköillä on mainittu ra-15 kenne.
Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että se käsittää seuraavat vaiheet: 113870 10 muodostetaan ensimmäinen syntoni, jonka rakenne on (I), ja toinen syntoni, jonka rakenne on (II): R H P10 Bx R B 0x
RT X RHP2° X
(I) (ID
5 jossa: (a) Rt on NH2 ja RB on RA-CH2-CH2; (b) Rt on CH2-NH2 ja RB on RA-CH2; (c) RT on -CH2-CH2-NH2 ja Rb on RÄ; (d) RT on RÄ ja Rb on NH2-CH2-CH2 tai 10 (e) RT on CH2-Ra ja RB on NH2-CH2; jossa RA on C(0)0H, C(S)OH tai sen aktivoitu johdannainen; ja yhdistetään ensimmäinen ja toinen syntoni, jolloin muodostuu amidi- tai tioamidisidos Rt- ja RB-ryhmien vä-15 lille.
Tämän keksinnön oligonukleotidianalogit valmistetaan edullisesti farmaseuttisesti hyväksyttävään kantaja-aineeseen potilaille antoa varten. Analogeilla uskotaan olevan parantunut nukleaasin kestokyky vastaaviin luonnon 20 oligonukleotideihin verrattuna. Menetelmissä, joilla mukautetaan proteiinin tuotantoa tai aktiivisuutta elimistössä, elimistöön saatetaan oligonukleotidianalogi, joka erityisesti hybridisoituu vähintään osan kanssa nukleiinihappo-järjestystä, joka koodaa mainittua proteiinia, ja jossa ai-25 nakin joillakin analogin alayksiköistä on edellä oleva rakenne .
Hoidettaessa elimistöä, jossa on sairaus, jolle on luonteenomaista ei-toivottu proteiinituotanto, elimistöön saatetaan oligonukleotidianalogi, joka hybridisoituu aina-30 kin osan kanssa nukleiinihappojärjestystä, joka koodaa mai- 113870 11 nittua proteiinia, joko yksistään tai farmaseuttisesti hyväksyttävässä kantaja-aineessa, ja jossa ainakin joillakin analogin alayksiköillä on annettu rakenne.
Oligonukleotidianalogeja voidaan syntetisoida myös 5 siten, että hankitaan ensimmäinen osa, joka käsittää seu-raavan rakenteen: E> i* 10 ja toinen osa, joka käsittää seuraavan rakenteen:
Bx p jossa Βχ on muuttuva emäsosa; Q on 0, CH2, CHF tai CF2; ja 15 Ei ja E2 ovat samoja tai erilaisia ja ne ovat elektrofiili-siä reaktiivisia ryhmiä; ja yhdistetään mainittu ensimmäinen ja toinen osa sidoksen muodostavan ryhmän kanssa mai-: : nittujen elektrofiilisten reaktiivisten ryhmien kautta, jolloin muodostuu mainittu oligonukleotidianalogi. Edullis-20 ten menetelmien mukaisesti ensimmäisen osan elektrofiilinen reaktiivinen ryhmä käsittää halogeenimetyylin, trifluorime-tyylin, sulfonyylimetyylin, p-metyylibentseenisulfonyylime-. tyylin tai 31-C-formyylin, kun taas toisen osan elektrofii linen reaktiivinen ryhmä käsittää halogeenin, sulfonyylime-25 tyylin, p-metyylibentseenisulfonyylimetyylin tai aldehydin. On edullista, että sidoksen muodostava ryhmä on hydratsiini tai hydroksyyliamiini.
On käyttökelpoista formuloida terapeuttisia koostumuksia, joissa ainakin yksi mainitun oligonukleotidianalo- 113870 12 gin osa liitetään lisäoligonukleotidilajiin, jolloin saadaan mainittu lisäoligonukleotidianalogi, jossa luonnon fosfodiesterisidokset vuorottelevat olennaisesti näin yhdistettyjen alueiden kanssa. Liitos saadaan aikaan edulli-5 sesti halutun dinukleotidijärjestyksen fosfodiesterisidok-sella, ja mainitut dinukleotidit on aikaisemmin yhdistetty näin kuvatulla tavalla.
Prekursorinukleosideja tarkastellaan myös tässä keksinnössä, ja niiden rakenne on: 10 γ Bx Ό1
II
Z X
jossa Βχ on vaihtuva emäsosa, Q on O, CH2, CHF tai CF2; ja X on H; OH; Ci-io-alempi-alkyyli, substituoitu alempi-alkyyli, 15 alkaryyli tai aralkyyli; F; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; OCN; O-, S- tai N-alkyyli; O-, S- tai N-alkenyyli; SOCH3; S02CH3; 0N02; N02; N3; NH2; heterosykloalkyyli; heterosykloalkaryy-li; aminoalkyyliamino; polyalkyyliamino; substituoitu si-lyyli; RNA-poistuva ryhmä; ryhmä, jolla parannetaan oligo-20 nukleotidin farmakokineettisiä ominaisuuksia tai ryhmä, jolla parannetaan oligonukleotidin farmakodynaamisia ominaisuuksia .
Tällaisessa lajissa Y on hydroksyyli, aminometyyli, hydratsinometyyli, hydroksimetyyli, C-formyyli, ftaali-imi-25 dohydroksimetyyli, aryyli-substituoitu imidatsolidino, ami-nohydroksyylimetyyli, orto-metyyliaminobentseenitio, metyy-lifosfonaatti ja metyylialkyylifosfonaatti. Z on H, hydroksyyli, aminometyyli, hydratsinometyyli, hydroksimetyyli, C-formyyli, ftaali-imidohydroksimetyyli, aryyli-subsituoitu 30 imidatsolidino, aminohydroksyylimetyyli, orto-metyyliaminobentseenitio, metyylifosfonaatti tai metyylialkyylifosfonaatti. Kaikkiin edellä oleviin pätee, että kun Q on O ja Y
13 . 1 13870 on hydroks ime tyyli ja X on H tai OH, niin Z ei ole C-for-myyli; ja että kun Q on O ja X on H tai OH ja X on hydrok-syyli, niin Y ei ole aminohydroksyylimetyyli, hydratsinome-tyyli tai aryyli-substituoitu imidatsolidino. On edullista, 5 että X on H tai OH ja että Q on O.
Oligonukleotidianalogit, joissa on muunneltuja so-kerisidoksia, on todettu tehokkaiksi näiden päämäärien saavuttamiseksi. Oligonukleotidianalogit ovat pituudeltaan edullisesti noin 4-50 nukleiinihappoemäsalayksikköä, ja 10 vielä edullisemmin noin 5-20. Tässä keksinnössä kuvatut oligonukleotidianalogit voivat hybridisoitua ennalta valittujen yksijuosteisten tai kaksoisjuosteellisten DNA:n ja RNA:n nukleotidijärjestysten kanssa. Nukleiinihappoemäkset, jotka tämä keksintö käsittää, voivat olla pyrimidiinejä, 15 kuten tyrniini, urasiili tai sytosiini, tai puriineja, kuten guaniini tai adeniini, tai näiden muunnelmia, kuten 5-me-tyylisytosiini, jotka on järjestetty valittuun emäsjärjestykseen. Sokeriosa voi olla riboosi- tai deoksiriboosityyp-pinen tai sokerijäijitelmä, kuten karboksyklinen rengas.
20 Erään tämän keksinnön edullisen suoritusmuodon mukaan oligonukleotidianalogit tai oligonukleosidit hybridisoituvat HIV:n mRNA:han, joka koodaa tat-proteiinia, tai HIV-mRAN:n TAR-alueeseen. Oligonukleotidianalogit tai oligonukleosidit voivat jäljitellä HIV-mRNA:n TAR-alueen sekundaarista ra-25 kennetta tat-proteiinin sitomiseksi. Muita edullisia anti-sense-oligonukleotidianalogi- tai oligonukleosidijärjestyksiä ovat komplementaariset järjestykset herpes-, papilloma-ja muihin viruksiin.
Tämän keksinnön muunnellut sidokset käyttävät edul-30 lisesti neljän atomin sidosta korvaamaan luonnossa esiinty-vän fosfodiesteri-5'-metyleenisidoksen. Luonnossa esiintyvän sidoksen korvaaminen keksinnön mukaisilla neljäatomi-silla sidoksilla tekee syntyvästä oligonukleotidianalogista nukleaasin kestävän ja parantaa soluunottoa. Neljä atomi-35 seen sidokseen kuuluu edullisesti 31-deoksi-funktionaalinen ryhmä yhdessä sidotuista sokereista. Neljäatomisen sidoksen 113870 14 rakenne on -L1-L2-L3-L4, joka on edellä määritetty. On edullista, että muunneltu sidos esiintyy olennaisesti jokaisessa sidospaikassa. Vaihtoehtoisesti muuntelua voi esiintyä harvemmin kuin joka sidospaikassa, kuten vuorottelevissa 5 sidospaikoissa tai olennaisesti satunnaisesti. Sidos voi olla neutraali tai positiivisesti tai negatiivisesti varautunut .
Edellä kuvattujen oligonukleosidien syntetisoimi-seksi 31-deoksi-3'-substituoitu, erityisesti metyylisubsti-10 tuoitu nukleosidi yhdistetään 5'-deoksi-5'-substituoidun nukleosidin kanssa lisäämällä kaksiatominen fragmentti tai substituoitu kaksiatominen fragmentti. Lisäysreaktio voi tapahtua vaiheittaisella menetelmällä, jossa kunkin nukleosidin 3'- ja 5'-asemat aktivoidaan erilaisille sopiville 15 elektrofHiisille osille ja sen jälkeen lisätään sopiva sidoksen muodostava ryhmä, joka reagoi elektrofiilien kanssa. Vaihtoehtoisesti menetelmä voi olla yhteismenetelmä. Tällaisissa menetelmissä voidaan käyttää kiinteitä alustoja DNA-syntetisaattoria käyttämällä, käsittelemällä alustaa 20 käsin tai muulla tavoin. Menetelmässä, joilla moduloidaan elimistön proteiinien tuotantoa, saatetaan elimistöön koostumus, joka on formuloitu edellä olevat seikat huomioon ottaen. On edullista, että moduloitava RNA- tai DNA-osa valitaan ennalta siten, että se käsittää sen DNA- tai RNA-osan, 25 joka koodaa proteiinia, jonka muodostusta tai aktiivisuutta ollaan moduloimassa. Käytettävän koostumuksen kohdistusosa valitaan siten niin, että se on komplementaarinen ennalta valitulle DNA- tai RNA-osalle, josta tulee antisense-oligo-nukleotidi tähän osaan.
30 Hoidettaessa elimistöä, jossa on sairaus, jolle on luonteenomaista ei-toivottu proteiinituotanto, elimistöön saatetaan edellä olevat seikat käsittävä koostumus. Koostumus on edullisesti suunniteltu siten, että se sitoutuu erityisesti lähetti-RNA:n kanssa, joka koodaa proteiinia, jon-35 ka tuotantoa tai aktiivisuutta ollaan moduloimassa.
113870 15
Piirrustusten kuvaus
Kuvio 1 on kaaviomainen, keksinnön tiettyjen suoritusmuotojen mukainen synteesikaavio ja
Kuvio 2 on kaaviomainen, keksinnön lisäsuoritusmuo-5 tojen mukainen synteesikaavio.
Edullisten suoritusmuotojen yksityiskohtainen kuvaus
Aikaisemmin tarjolla olevien antisense-oligonuk-leotidien biologinen vaikutus ei ole yleensä ollut riittävä 10 käytännön terapeuttiseen käyttöön. Tämä keksintö koskee menetelmää terapeuttisesti käyttökelpoisten muunneltujen oli-gonukleotidien eli oligonukleotidianalogien tai oligonuk-leosidien valmistamiseksi. Nämä muunnellut oligonukleotidit ja oligonukleotidianalogit ovat pysyvyydeltään parempia 15 kuin niiden luonnossa esiintyvät vastineensa. Solun ulkopuoliset ja solunsisäiset nukleaasit eivät tavallisesti tunnista esillä olevan keksinnön rungoltaan muunneltuja oligonukleotidianalogeja tai oligonukleosideja eivätkä siten sitoudu niihin. Jokainen nukleaasin suorittama sitoutu-20 minen runkoon ei johda nukleosidisten sidosten lohkeamiseen herkkien, fosfori-happisidosten puuttumisen vuoksi. Lisäksi syntyneet uudet neutraalit tai positiivisesti varautuneet keksinnön mukaiset rungot voivat kulkeutua soluihin yksinkertaisen passiivisen kuljetuksen avulla sen sijaan, että ;* 25 tarvittaisiin monimutkaisia proteiinivälitteisiä prosesse ja. Esillä olevan keksinnön toisena etuna on se, että negatiivisesti varautuneen rungon puuttuminen helpottaa oligonukleotidianalogien tai oligonukleosidien järjestysspesi-fistä sitoutumista kohde-RNA:hän, jolla on negatiivisesti 30 varautunut runko ja joka siten hylkii tulevia saman varauk-*· sen omaavia oligonukleotideja. Esillä olevan keksinnön etu na on edelleen se, että näissä rakennetyypeissä on kohtia, joihin sellaiset funktionaaliset ryhmät voivat kiinnittyä, jotka voivat aloittaa kohde-RNA:n katalyyttisen lohkaisun.
35 Seuraavassa kuvataan menetelmiä oligonukleosidien valmistamiseksi, joissa on muunneltuja sokerien välisiä si- 113870 16 doksia. Nämä muunnelmat voidaan saada aikaan käyttäen kiinteitä alustoja, joita voidaan käsitellä käsin tai käyttää yhdessä DNA-syntetisaattoreiden kanssa, käyttäen yleisesti asiantuntijoiden tiedossa olevaa metodologiaa. Yleisesti 5 menetelmässä kahden nukleosidin, jotka ovat vierekkäin valitussa nukleotidijärjestyksessä, sokeriosista tehdään funktionaalisia ryhmiä. 5' - 3'-tapauksessa "yläjuoksun" nukleosidia yleensä muunnellaan 31-sokerikohdasta ja sitä kutsutaan tästä eteenpäin nimellä "viritin 1" tai "syntoni 10 1". Eräässä keksinnön menetelmässä adeniinin, guaniinin, sytosiinin, urasiilin, tymiinin ja niiden analogien ribo-ja 2'-deoksiribonukleosideja muunnellaan, jolloin saadaan niiden 3'-deoksi-3-hydroksimetyylianalogeja. Nämä 3'-hyd-roksimetyyliryhmät muutetaan sitten erityyppisiksi elekt-15 rofiilisiksi keskuksiksi. Tämä voidaan suorittaa monin eri tavoin, kuten seuraavassa kaaviossa esitetyllä edullisella tavalla.
Erästä lähtöaineluokkaa, 3'-deoksi-3'-hydroksime-tyyliribonukleosideja, voidaan valmistaa tavalla, jonka on 20 kuvannut Townsend et ai., Tetrahedron Letters, 31:3 101 -3 104 (1990), Samano, V. ja M.J. Morris, Journal of Organic Chemistry, 55:5 186 - 5 188 (1990) ja Bergstrom. D.E., Nucleosides and Nucleotides ((8):1 529 - 1 535 (1989). Sopi valla, tunnetulla, selektiivisellä näiden nukleosidien so-25 keri-hydroksyyliryhmän suojauksella ja sen jälkeen standardilla 2'-pelkistysmenetelmillä saadaan 21,3'-dideoksi-3'-hydroksimetyyliribonukleosideja. Tämän tyyppiset nukleosi-dit voidaan selektiivisesti suojata ja 31-hydroksimetyyli-osa voidaan funktionalisoida erilaisiksi sopiviksi elektro-30 fiilisiksi osiksi. Tämän keksinnön edullisten suoritusmuotojen mukaisesti tällaisia elektrofiilisiä osia ovat halo-geenimetyyli, trifluorimetyyli, sulfonyylimetyyli, p-metyy-libentseenisulfonyylimetyyli, hydratsinometyyli tai 31-C-formyyli.
35 "Alajuoksun" nukleosidia muunnellaan yleensä 5‘- sokerikohdasta ja siihen viitataan tästä eteenpäin nimellä 113870 17 "viritin 2" tai "syntoni 2". Muunnelmat, joilla saadaan adeniinin, guaniinin, sytosiinin, urasiilin, tymiinin ja niiden analogien ribo- ja 2'-deoksiribonukleosideja, niiden 51-hydroksimetyleeniryhmän kanssa, joka on muutettu eri-5 tyyppisiksi elektrofiilisiksi keskuksiksi, voidaan suorittaa erilaisilla menetelmillä, käyttäen kaupallisesti saatavia nukleosideja. Esimerkiksi 5'-deoksi-5'-halogeeni -nukleosidia, 51-deoksi-5'-tosyylinukleosideja ja 5'-aldehy-dinukleosideja on valmistanut Jones, G.H. ja J.G. Moffatt 10 julkaisussa Journal of the American Chemical Society 90:5 -337 - 5 338 (1968).
Yleisesti viritin 1 voidaan esittää seuraavalla kaavalla: f' !> 15 kun taas viritin 2 tavallisesti käsittää seuraavan rakenteen: E2 • * * ♦ 2 0 jossa Βχ on vaihtuva emäsosa; Q on 0, CH2, CHF tai CF2; ja Ei ja E2 ovat samoja tai erilaisia ja ne ovat elektrofiili-siä reaktiivisia ryhmiä.
Nämä kaksi viritintä yhdistetään sidoksen muodostani van ryhmän välityksellä, joka ryhmä reagoi elektrofiilisten 25 reaktiivisten ryhmien kanssa tai muutoin. Virittimen 1 ja 2 välinen liitostapahtuma voi olla joko vaiheittainen tai se voi tapahtua yhteismenetelmällä, ja siitä voidaan saada di-nukleosideja, jotka on sidottu esillä olevan keksinnön mukaisen muunnellun sidoksen kautta, tai siitä voidaan saada 1H 113870
X O
nukleosidien ketju, jossa kukin nukleosidi voidaan sitoa seuraavaan nukleosidiin mainitun muunnellun sidoksen välityksellä .
Yhdistäminen yhteismenetelmällä voi tapahtua virit-5 timen 1 ja virittimen 2 elektrofiilisten keskusten välillä, kuten ammoniakin tai ammoniakkijohdannaisen läsnä ollessa, jolloin muodostuu dinukleosidi. Esillä olevan keksinnön edullisena suoritusmuotona on tunnettujen, bromimetyyli-tyyppisten virittimien yhdistäminen lisäämällä hydratsii-10 nia, jolloin muodostuu edullinen sidos, jossa -L1-L2-L3-L4-on -CH2NHNHCH2-. Toisena esillä olevan keksinnön mukaisena suoritusmuotona on bromimetyylityyppisten virittimien liittäminen lisäämällä hydroksyyliamiinia, jolloin muodostuu sidos, jossa -Li-L2-L3-L4- on -CH2NHOCH2- tai -CH20NHCH2-.
15 Toinen menetelmä, jonka avulla voidaan muunnella sokerien välisiä sidoksia, jolloin saadaan tässä kuvattu dinukleosidirakenne, on Wittig-reaktio. Tällaisen reaktion lähtöaine on edullisesti 3'-ketonukleosidi, kuten on kuvannut Townsend, et ai., julkaisussa Tetrahedron Letters 20 31:3 101 - 3 104 (1990); Samano, V. ja M.J. Morris julkai sussa Journal of Organic Chemistry 55:5 186 - 5 188 (1990) ja Bergstrom, D.E., et ai. julkaisussa Nucleosides and Nucleotides 8(8):1 529 - 1 535 (1989); tai 5'-aldehydinuk-leosidi, kuten on kuvannut Jones, G.H. ja J.G. Moffatt jul-25 kaisussa Journal of the American Chemical Society 90:5 337 - 5 338 (1968). Lähtöaine saatetaan edullisesti reagoimaan fosforiylidin kanssa, jossa fosforiylidissä on bentsyyli-ryhmän tai jokin muu suojaryhmä. Eräs edullinen ylidi, joka on käyttökelpoinen tässä keksinnössä, on trifenyylifosfo-30 raani-bentsyylioksimetylidiini. Toinen käyttökelpoinen ylidi, jota voidaan edullisesti käyttää tässä keksinnössä, on trifenyylifosforaani-bentsyylioksietylidiini. Pelkistämällä vinyyliryhmä ja hydraamalla bentsyyliryhmän suojaryhmä saadaan hydroksimetyyli- ja hydroksietyyliosia, vastaavassa 35 järjestyksessä, jotka ovat guaniinin, adeniinin, sytosii-nin, tymiinin, urasiilin tai näiden nukleosidien analogien 113870 19 halutun nukleosidin 5'- tai 3'-asemissa. Lisäksi Wittig-reaktiota voidaan käyttää karbosyklisten nukleosidien 51 -ja 3'-hydroksialkyyliosien saamiseksi.
Muuttamalla hydroksyyliryhmät, jolloin saadaan 5 elektrofiilisiä keskuksia, ja tämän jälkeen liittämällä 3'-elektrofiilinen keskus 5'-nukleofiilisen keskuksen kanssa, saadaan esillä olevan keksinnön mukaisia dinukleosideja. Keksinnön eräässä suoritusmuodossa hydroksyyliryhmät muutetaan ja saadaan elektrofiilisiä keskuksia, kuten bromideja, 10 triflaatteja ja tosylaatteja. Yhdistämällä saadaan dinukleosideja, jotka hiiliatomiketju yhdistää yhden tai kahden heteroatomin kanssa. Edullisesti tällaisia heteroatomeja ovat 0, NH, NR3, S, SO, SO2, P(0)R4, P(S)R4 tai SiR5R6, jokta ovat aikaisemmin annetun yleisen kaavan mukaisia.
15 Muut käyttökelpoiset nukleosidit, jotka voidaan helposti johtaa Wittig-reaktiosta, kuten 3'- tai 5'-karbo-nyylinukleosidit ja trifenyylifosforiinimetylidiinidifenyy-lifosfonaatti, ovat fosfaattidinukleosideja. Tästä reaktiosta saadaan metyyli- tai etyylifosfonaatti, joka voidaan 20 kondensoida vastaavan 5'- tai 3'-hydroksiryhmän kanssa, jolloin saadaan 3'- tai 5'-fosfonaattisidoksellisia oligo-nukleosideja. Tämän tyyppinen kemia on kuvattu biokemiallisten menetelmien tutkimuksiin tarkoitettujen dinukleosi-dien fosfonaattien valmistuksen yhteydessä, Moffatt, J.G., 25 et ai., Journal of the American Chemical Society 92:5 510 -5 513 (1970) ja Mazur, A., B.E. Tropp ja R. Engel,
Tetrahedron 40:3 949 - 3 956 (1984). Käyttäen hyväksi tämän tyyppistä liitosta, eräs edullinen suoritusmuoto valmistetaan yhdistämällä 31-ketonukleosidi 5'-nukleosidiin symmet-30 riselllä bis(metyylitrifenyylifosfaani)fenyylifosfaatilla, jolloin saadaan 31,5'-dimetyylifosfonaattisidoksellisia oligonukleotideja.
Wittig-reaktion lisäksi 3'-hydroksimetyylinukleosi-deja voidaan valmistaa myös suorittamalla käänteisreaktio 35 alfa-karbosyklisille nukleosideille. Näin saadaan haluttu 31-hydroksimetyyliryhmä "ala"- tai alfa-päähän. Tämä ryhmä 113870 20 voidaan suojata ja 3''-hydroksyyliryhmä (joka tunnistaa ek-sosyklisen metyylin, joka on sidottu sokeriin 3'-asemaan, 3''-metyylinä) voidaan muuttaa hydroksimetyyliryhmäksi tai pidemmäksi alkyyliryhmäksi. Eräs menetelmä 311-ketoryhmän 5 muuttamiseksi käsittää hapetuksen ketoryhmäksi, sen jälkeen Wittig-reaktion trifenyylifosforiinimetylidiinidifenyyli- fosfonaatin kanssa sekä pelkistyksen. Pidemmät hydroksial-kyyliryhmät voidaan sijoittaa 3''-asemaan tällä tavoin. Tämän suoritusmuodon avulla saadaan myös 4'-desmetyyli-3'-10 hydroksimetyylinukleosidiviritin. Yhdistämällä tämä 4'-des-metyylinukleosidi ja normaali 3'-hydroksinukleosidi, käyttäen kaksiatomista yhdistäjää, saadaan dinukleosidiviritti-miä, jotka on kuvattu aikaisemmassa US-hakemuksessa Serial nro 566 836 ja joka on jätetty 13. elokuuta 1990, ja joka 15 hakemus siirretään tämän hakemuksen siirron saajalle. Yhdistämällä 4'-desmetyylihydroksyyliryhmä sopivien 3'-virit-timien kanssa edellä kuvatulla tavalla, saadaan joitakin erityyppisiä uusia dinukleosidivirittimiä.
Edelleen toinen lähestymistapa tehdä 3'-deoksi-3'-20 metyylinukleosidien metyyliryhmästä funktionaalista ryhmää on valmistus 3'-deoksi-3'-syaaninukleosideista. Parkes, K.E.B. ja K. Taylor, Tetrahedron Letters 29:2 995 - 2 996 (1988) kuvasivat yleisen synteesimenetelmän 3'-syaaninukle-osideille. Tässä menetelmässä 5'-trityylisuojatut 2'-deok-25 sinukleosidit 3'-jodataan metyylitrifenyylifosfoniumjodi-dilla. Näitä aineita käsitellään sitten heksametyyliditi-nalla, t-butyyli-isonitriilillä ja 2,2'-atsohisisobutyro-nitriilillä (AIBN), jolloin saadaan aikaan syaaniryhmän radikaali -additio 3'-asemaan. Syaaniryhmän muuttaminen alde-30 hydiksi tapahtui suurella saannolla. Tämän jälkeen välituote muutettiin hydroksimetyylifunktionaalisiksi ryhmiksi, jotka ovat arvokkaita prekursoreita elektrofiiliselle vi-rittimelle 1.
Lisämenetelmässä, jonka avulla sokerien välisiä si-35 doksia voidaan muunnella, jolloin saadaan dinukleosideja, käytetään hyväksi 3'-C-formyylijohdoksellisia nuklesideja „ "3870 virittimenä 1 ja 5'-aminohydroksijohdoksellisia nukleoside-ja virittimenä 2. Yhdistämällä virittimet 1 ja 2 suoraan, saadaan dinukleosidi, joka on yhdistetty oksiimisidoksen välityksellä. Tässä tapauksessa oksiimi on mukana E/Z-iso-5 meereina. Isomeeriyhdisteet erotetaan HPLC:tä hyväksi käyttäen. Edelleen tässä tapauksessa oksiimin typpiatomi on hiiliatomin vieressä yläjuoksun nukleosidin 3'-päässä. Di-nukleosideja, joissa oksiimin typpi on hiiliatomin vieressä 5'- tai alajuoksun nukleosidissa, syntetisoidaan käyttäen 10 hyväksi 51-C-formyylijohdoksellista nukleosidia virittimenä 2 ja 3'-deoksi-3'-aminohydroksimetyylijohdoksellista nukleosidia virittimenä 1. Tässä tapauksessa saadaa myös ok-siimi-E/Z-isomeereja. Kummassakin tapauksessa oksiimisidok-selliset dimeerit ovat käyttökelpoisia liitettäviksi suo-15 raan oligomeeriin, tai ne voidaan pelkistää vastaavaksi hydroksiaminosidokselliseksi dinukleosidiksi. Pelkistämällä oksiimisidokselliset dinukleosidit joko dinukleosidina tai dinukleosidiosana oligomeerissä natriumsyaaniboorihydridil-lä, saadaan vastaavia aminohydroksyylisidoksellisia yhdis-20 teitä. Hydroksiaminosidoksellinen dinukleosidi tai suurempi oligomeeri voitaisiin alkyloida aminohydroksyylisidoksen amino-osasta, jolloin saadaan vastaava N-alkyyliaminosidos.
31-C-formyylijohdoksellinen viritin 1 voidaan muodostaa useiden synteesireittien kautta. Esillä olevassa 25 edullisessa menetelmässä käytetään hyväksi vastaavan 3'-deoksi-3'-jodinukleosidin radikaali-karbonylaatiota. Jodi-yhdistettä käsitellään CO:lla, AIBNrllä, se on 2,2'-atsobi-sisobutyronitriili, ja TTMS:llä, se on tris(trimetyylisi-lyyli)silääni. Vaihtoehtoisesti se voidaan syntetisoida jo-30 ko 3'-deoksi-3'-syaanisokerista tai nukleosidista. Sekä 5'- « *** C-formyyli- (tunnetaan myös 5'-aldehydona) että 3'-C-for- myyliryhmä voidaan salvata helpolla tavalla, käyttäen hyväksi o-metyyliaminobentseenitiolia salpaavana ryhmänä.
Sekä 5'- että 3'-C-formyyliryhmistä voidaan poistaa salpaus 35 hopeanitraattihapetuksella.
Vaihtoehtoisessa 3'-C-formyylinukleosidisynteesissä 113870 22 l-O-metyyli-3 ’ -deoksi-3 ' -O-metyyliaminobentseenitio-5 1 -O-trityyli-S-D-erytro-pentofuranosidia voidaan käyttää sen valmistuksessa. Tämä yhdiste toimii sitten prekursorina mille tahansa 31-deoksi-3'-C-formyylinukleosidille. 1-0-me-5 tyyli-31-deoksi-3'-O-metyyliaminobentseenitioli-5'-0-tri-tyyli-S-D-erytro-pentofuranosidi saatetaan reagoimaan sopivan emäksen kanssa, käyttäen hyväksi standardeja glykosy-laatio-olosuhteita, ja sen jälkeen poistetaan salpaus, jolloin saadaan nukleosidi. Edelleen vaihtoehtoisessa menetel-10 mässä 31-deoksi-31-syaaninukleosidi valmistetaan joko vastaavasta 3'-deoksi-31 -jodinukleosidista tai glykosylaatio-reaktion kautta l-O-metyyli-31-deoksi-3'-O-syaani-51-O-tri-tyyli-S-D-erytro-pentofuranosidista.
3''-0-amino-3'1-hydroksimetyylinukleosidi ja vas-15 taava 51-O-aminonukleosidi voidaan tarkoituksenmukaisesti valmistaa suojatun ftaali-imidovälituotteen kautta Mit-sunobu-olosuhteissa, käyttäen N-hydroksiftaali-imidiä, tri-fenyylifosfiinia ja di-isopropyyliatsodikarboksylaattia. Tämä vuorostaan valmistetaan siten, että suoritetaan Mit-20 sunobu-reaktio nukleosidin suojaamattomalle hydroksyyliryhmälle. Muodostettaessa 31'-O-amino-3''-hydroksimetyylinuk-leosidia, trityyli toimii salpaavana ryhmänä nukleosidin 51-hydroksyyliryhmälle. Sekä puriini- että pyrimidiininuk-leosidien tapauksessa, ennenkuin ne saatetaan reagoimaan N-25 hydroksiftaali-imidin kanssa, 3'-hydroksiryhmä suojataan TBDPS:llä. Pyrimidiiniemästen tapauksessa, muodostettaessa 5'-O-aminonukleosidia, 3'-hydroksyyli voidaan suojata TBDPS-suojaryhmillä sen jälkeen, kun ftaali-imido on liitetty 5'-asemaan.
30 Lisämenetelmässä, jonka avulla sokerien välisiä si doksia voidaan muunnella, jolloin saadaan fosfonaattisidok-sellisia dinukleotideja, käytetään hyväksi Michaelis-Arbuzovin menetelmää, jonka on kuvannut Mazur et ai., Tetrahedron 20:3 949 (1984) 3'-C-fosfonaattidimeerien val- 35 mistamiseksi. Tässä menetelmässä käytetään hyväksi 3'-hyd-roksimetyylinukleosideja virittimenä 1. Tätä käsitellään N- 113870 23 bromisukkinimidillä, jolloin saadaan vastaava 31'-bromime-tyylijohdannainen. Virittimeksi 2 valitaan 5'-fosfiitti. Yhdistämällä virittimet 1 ja 2, saadaan dinukleosidi, joka on liitetty 3'-C-fosfonaattisidoksen välityksellä. Vastaa-5 vat 51-C-fosfonaattidimeerit voidaan saada siten, että ensin saatetaan sopivasti salvattu fosfiitti reagoimaan vi-rittimen 1 kanssa, sen jälkeen poistetaan salpaus, jolloin saadaan 3 '-CH2-fosfiittivälituote. Virittimeksi 2 valitaan 51-brominukleosidi. 31-CH2-fosfiittivälituote saatetaan 10 sitten reagoimaan virittimen 2 kanssa, jolloin saadaan 5'-C-fosfaattidimeeri. Valitsemalla tribentsyylifosfiitti salvatuksi fosfiitiksi sen jälkeen, kun se on liitetty virit-timeen 1, bentsyyliryhmät voidaan poistaa hydraamalla. Vaihtoehtoisesti 5'-deoksi-5'-brominukleosidi saatetaan 15 reagoimaan fosfiittiesterin kanssa, jolloin saadaan 5'-fos-fonaatti. Tämä vuorostaan saatetaan reagoimaan 3'-hydroksi-metyylinukleosidin kanssa, jolloin saadaan 5'-C-fosfonaat-tisidoksellinen dimeeri.
Dinukleosidit, jotka saadaan mistä tahansa edellä 20 kuvatusta menetelmästä ja joissa sidokset ovat muodostaneet hydratsiinit, hydroksyyliamiinit ja muut esillä olevan keksinnön mukaiset sidoksen muodostavat ryhmät, voidaan suojata dimetoksitrityyliryhmällä 5'-hydroksyylistä ja aktivoida yhdistämistä varten 31-hydroksyylin kohdalta syaanietyyli-25 di-isopropyylifosf iittiosilla. Nämä dimeerit voidaan sijoittaa mihin tahansa haluttuun järjestykseen standardilla kiinteäfaasisella automatisoidulla DNA-synteesillä, käyttäen hyväksi fosforamidiittiliitoskemiaa. Siten suojatut dinukleosidit sidotaan tarkoin määrätyn DNA-ketjun yksiköi-30 den kanssa, käyttäen hyväksi normaaleja fosfodiesterisidok-siä. Syntyneellä oligonukleotidianalogilla tai oligomeeril-lä on seosrunko -- osittain normaaleja fosfodiesterisidok-sia ja osittain uusia neljäatomisia keksinnön mukaisia sidoksia. Tällä tavoin 15-meeri, järjestysspesifinen oligo-35 nukleotidi, voidaan helposti syntetisoida siten, että siinä on hydroksyyliamiini-, hydratsiini- tai muun tyyppisesti 113870 24 sidottuja dinukleosideja. Tällaisen rakenteen avulla liukoisuus veteen kasvaa verrattuna luonnon fosfodiesterisi-doksellisiin oligonukleotideihin.
Oligonukleosideja, joissa on yhteinäinen runkosi-5 dos, voidaan syntetisoida käyttäen kiinteää CPG-alustaa ja standardeja nukleiinihapposynteesilaitteita, se on Biosys-tems Inc. 380B ja 394 ja Milligen/Biosearch 7500 ja 8800s. Aloitusnukleosidi (numero 1 31-päässä) kiinnitetään kiinteään alustaan, kuten kontrolloituun huokoiseen lasiin. Jo-10 kainen uusi nukleosidi kiinnitetään ketjulle ominaisessa järjestyksessä joko käsin manipuloimalla tai automatisoidulla syntetisaattorijärjestelmällä. Metyleenihydratsiini-sidoksen tapauksessa toistuva nukleosidiyksikkö voi olla kahta yleistä tyyppiä, esim. nukleosidi, jossa on 5'-suo-15 jattu aldehydi -funktionaalinen ryhmä ja 3'-deoksi-3'-C-hydratsinometyyliryhmä, tai nukleosidi, jossa on 5'-deoksi-5'-hydratsinoryhmä, joka on suojattu happolabiililla ryhmällä, ja 31-deoksi-31-C-formyyliryhmä. Kummassakin tapauksessa olosuhteet, jotka toistetaan kullakin kierroksella 20 lisättäessä seuraava järjestyksen edellyttämä emäs, ovat seuraavat: happopesu 5'-aldehydin suojaryhmän poistamiseksi; seuraavan nukleosidin lisääminen 3'-metyleenihydrat-sinoryhmällä, jolloin muodostuu vastaava hydratsoniyhteys; ja pelkistys jollakin monesta aineesta, jolla saadaan ha-25 luttuja metyleenihydratsiinisidoksellisia CPG:hen sidottuja oligonukleosideja. Eräs tällainen käyttökelpoinen pelkistin on natriumsyaaniboorihydridi.
Edullinen menetelmä kuvataan kuvassa 1. Tässä menetelmässä käytetään kiinteää alustaa, jonka päällä viritin 30 2, jossa on suojattu 5'-ryhmä, muodostaa sidoksen. Edul lisesti mainitun virittimen 51-kohta voidaan suojata DMT:llä. Tämän jälkeen virittimen 2 51-kohta vapautetaan laimealla hapolla, pestään ja hapetetaan, jolloin saadaan välituote. Eräässä edullisessa suoritusmuodossa aldehydi-35 johdannainen reagoi Ν,Ν-difenyylietyleenidiamiinin kanssa, jolloin muodostuu välituote, 51-difenyyli-imidatsolidino- 113870 25 suojattu viritin 2. Edullisemmassa suoritusmuodossa 5'-di-fenyyli-imidatsolidinosuojattu viritin 2 laitetaan suoraan alustalle. Jompaa kumpaa menetelmää käyttäen välituotteesta voidaan tämän jälkeen poistaa suojaus, jolloin saadaan vi-5 ritin 2, jossa on nukleofiilinen 5'-asema. Virittimen 1, jossa on suojattu 5'-aldehydiryhmä, kuten 5'-difenyyli-imi-datsolidinosuojattu 31-deoksi-3'-C-hydratsiiniemäs, liittäminen voi sitten tapahtua, kuten lisättäessä natriumsyaani-boorihydridiä, kiinnitetyn virittimen 2 kanssa. Pesun jäl-10 keen muodostuu dinukleosidi, joka on sitoutunut hydratsino-osan välityksellä. Tämän jälkeen kierros voidaan toistaa haluttaessa lisäämällä viritin 1 -lajia, sen jälkeen suorittamalla hapon/emäksen suojauksen poisto, jolloin muodostuu moniviritin - syntynyt oligomeeri, jossa on haluttu 15 nukleosidijärjestys - joka on sitoutunut muunneltujen sokerien välisten sidosten välityksellä. Eräissä tämän keksinnön edullisissa suoritusmuodoissa viritin 1 -laji voi olla 5'-DMT-suojattu 3'-C-hydratsiiniemäs.
Eräässä tällaisen vaiheittaisen menetelmän edulli-20 sessa suoritusmuodossa käytetään hyväksi difenyylietyylidi-amiiniadditiotuotetta (1,3-disubstituoitua imidatsolidinoa) virittimen 2 elektrofiilisen keskuksen suojaamiseksi kiinteän alustan kiinnittämisen ajaksi. Moffatt, J.G., et ai., Journal of American Chemical Society 90:5 337 - 5 338 25 (1968), Viritin 2 voidaan edullisesti kiinnittää kiinteää alustaan, kuten kontrolloituun huokoiseen lasialustaan tai muihin sopiviin alustoihin, jotka ovat asiantuntijoiden tiedossa. Kiinnitys voi tapahtua perusmenetelmän mukaisesti. Gait, M.J.., toim., Oligonucleotide Synthesis, A Prac-30 tical Approach (IRL Press 1984). Vaihtoehtoisesti valmistus voi tapahtua siten, että hapetetaan suojattu sidoksellinen nukleosidi suoraan erilaisilla standardeilla hapetusmene-telmillä. Sidottu viritin 2 saatetaan edullisesti reagoimaan hydratsiinin kanssa, jolloin muodostuu Schiffin emäs, 35 joka voidaan tämän jälkeen pelkistää. Hydroksyyliamiini on myös edullinen reagoiva aine, joka on käyttökelpoinen tässä 113870 26 menetelmässä.
Lisämenetelmä sellaisten oligonukleosidien valmistamiseksi, joiden rungon sidokset ovat yhtenäisiä, kuvataan kuvassa 2. Tässä menetelmässä käytetään myös kiinteää alus-5 taa, jonka päällä viritin 2, jossa on suojattu 5'-kohta, muodostaa sidoksen. Tässä tapauksessa virittimen 5'-kohta suojataan ftaali-imidoryhmällä. Tämän jälkeen virittimen 2 5'-kohta vapautetaan metyylihydratsiinilla DCMrssä ja pestään DCM-.metanolilla. Virittimen 1 5'-asemassa oleva amino-10 hydroksyyliryhmä suojataan myös ftaali-imidoryhmällä. Tällainen viritin 1 on 5'-ftaali-imidosuojattu 3'-deoksi-3'-C-formyylinukleosidi. Viritin 1 saatetaan reagoimaan virittimen 2 kanssa, sen jälkeen poistetaan suojaus 5'-asemasta ja pestään seuraavan 51-aminohydroksireaktiokohdan vapauttami-15 seksi. Kierros toistetaan lisäämällä lisää viritintä 1 riittävän kauan, kunnes haluttu järjestys on muodostunut.
Tämän nukleosidijärjestyksen kukin nukleosidi sidotaan yhteen oksiimisidoksella. Halutun oligonukleosidin päätenuk-leosidi lisätään järjestykseen 5'-DMT-salvattuna 3'-deoksi-20 31-C-formyylinukleosidina. Oksiimisidoksellinen oligonuk- leosidi voidaan poistaa alustasta. Mikäli halutaan amino-hydroksyylisidoksellinen oligonukleosidi, oksiimisidokset pelkistetään natriumsyaaniboorihydridillä. Vaihtoehtoisesti pelkistys voidaan suorittaa samalla, kun oksiimisidokselli-25 nen oligonukleosidi on edelleen kiinni alustassa.
Tämän keksinnön oligonukleotidianalogeja voidaan käyttää terapeuttisina aineina. Terapeuttista käyttöä varten oligonukleotidianalogi annetaan eläimelle, joka kärsii sairaudesta, jota jokin proteiini moduloi. On edullista an-30 taa potilaille, joiden epäillään kärsivän tai jotka kärsi vät tällaisesta sairaudesta, oligonukleotidianalogia määränä, joka tehokkaasti vähentää sairauden oireita. Asiantuntija voi määrittää optimaalisen annostuksen ja hoito-ohjelman tällaisia hoito-ohjeita varten.
35 Yleensä on edullista antaa tämän keksinnön mukaiset terapeuttiset aineet sisäisesti, kuten suun kautta, suonen- 113870 27 sisäisesti tai lihakseen. Muut antomuodot, kuten anto ihon läpi, paikallisesti tai vaurionsisäisesti, voivat myös olla käyttökelpoisia. Myös lääkepuikot voivat olla käyttökelpoisia. Farmakologisesti hyväksyttävien kantaja-aineiden käyt-5 tö on myös edullista joissakin suoritusmuodoissa.
Esimerkit
Seuraavat esimerkit valaisevat mutta eivät rajoita keksintöä.
Yhtenäisten metyleenihydratsiini (3'-CH2-NH-NH-CH2-10 5') -sidoksellisten oligonukleosidien synteesi
Esimerkki 1 CPG:hen sidottujen nukleosidien; difenyyli-imidat-solidinosuojatun 5'-aldehyditymidiinin ja 5'-deok-si-5-hydratsinotymidiinin synteesi 15 CPG:hen sidottua tymidiiniä (30 mikromoolia tymi- diiniä yhdessä grammassa CPG-alustaa, ABI, Foster City, Ca) käsitellään ympäristön lämpötilassa seoksella, jossa on DMSO:ta, bentseeniä, DCC:tä, pyridiiniä ja trifluorietikka-happoa (15 ml/15 ml/2,48 g/0,4 ml/0,2 ml, vastaa hapetusme-20 netelmää, jonka on kuvannut Pfizer, K.E. ja J.G. Moffatt, Journal of American Chemical Society 85:3 027 (1963), jol loin saadaan 51-aldehydinukleosideja. Seos suodatetaan sen jälkeen, kun sitä on säilytetty yön yli. Alusta pestään oksaalihapolla (1,3 g 5 ml:ssa bentseeni/ DMSO:ta, 1:1) ja 25 sitä käsitellään 1,2-dianilinoetyleenillä (3,0 g) yhden tunnin ajan, se suodatetaan ja se pestään asetonitriilillä, jolloin saadaan 51-difenyyli-imidatsolidinosuojattu 5'-al-dehyditymidiini. Käsittelemällä alustaan sidottua 5'-alde-hyditymidiiniä liuoksella, jossa on hydratsiinihydraat-30 tia/natriumsyaaniboorihydridiä asetonitriilissä, saadaan ··* CPG-3 '-sidoksellinen 5 '-deoksi-5 1-hydratsinotymidiini, joka varastoidaan sen hydrokloridisuolana.
113870 28
Esimerkki 2 51-difenyyli-imidatsolidinosuojattu-31-deoksi-3'-C- hydratsinometyylitymidiinin synteesi
Kaupallisesti saatava 3'-O-asetyylitymidiini hape-5 tettiin ja suojattiin tämän jälkeen sen N,N-difenyyliety-leenidiamiinijohdannaisena (1,3-difenyyli-imidatsolidino).
Näin saadaan tunnettu 5'-deoksi-5'-difenyyli-imidatsolidi-no-3'-asetyylitymidiini. Pfitzer, K.E. ja J.G. Moffatt, Journal of American Chemical Society 85:3 027 (1963) . Tämän 10 aineen hydrolyysi suoritettiin käsittelemällä metanolipi-toisella ammoniakilla ympäristön lämpötilassa 15 tuntia.
51-deoksi-51-difenyyli-imidatsolidinotymidiini (4,5 g) liuotettiin DMF:iin (100 ml) ja sitä käsiteltiin trifenyy-limetyylifosfoniumjodidilla huoneenlämpötilassa 15 tunnin 15 ajan. Liuotin poistettiin alennetussa paineessa ja syntynyt jäännös uudelleenkiteytettiin metanolista, jolloin saatiin 31-deoksi-3'-jodijohdannainen.
31-deoksi-3'-jodi-5’-difenyyli-imidatsolinotymidii-ni liuotettiin tolueeniin ja sitä käsiteltiin heksametyyli-20 ditinalla, t-butyyli-isonitriilillä ja AIBN:llä. Tästä ra-dikaalireaktiosta saadaan 3'-deoksi-3'-syaanijohdannainen, joka tämän jälkeen pelkistettiin di-isobutyylialuminiumhyd-ridillä (DIBAL-H), joka oli tolueeni/THF:ssa, 0 °C:ssa, jolloin saatiin 3'-deoksi-3'C-formyyli,5'-difenyyli-imidat-25 solidinotymidiini. Tätä ainetta käsiteltiin hydratsiinihyd-raatilla ja natriumboorihydridillä, joka oli asetonitrii-lissä, jolloin saatiin 5'-difenyyli-imidatsolidinosuojattu 31-deoksi-31-C-hydratsinometyylitymidiini. Tämä aine varastoidaan tarkoituksenmukaisesti asetaattisuolana.
30 Esimerkki 3
Yhtenäisten metyleenihydratsiinisidoksellisten oli- gonukleosidien synteesi Applied Biosystems Inc.
380B-DNA-syntetisaattoria käyttäen CPG:hen sidottu tymidiini, jossa on difenyyli-imi-35 datsolidinosuojattu 5'-aldehydi, josta tulee 31-päätenuk-leosidi, laitetaan Applied Biosystems, Inc. (ABI) -pylvää- 113870 29 seen (250 mg, 10 mikromoolia sidottua nukleosidia) ja kytketään ABI 380B -automatisoituun DNA-syntetisaattoriin. Kierron automatisoidut (tietokoneella valvottavat) vaiheet, jotka tarvitaan desmetyylinukleosidiyksikön liittämiseksi 5 kasvavaan ketjuun, ovat seuraavat.
Vaihe Reagenssi tai liuotinseos Aika (min:sek) 1 3 % DCA dikloorietaanissa 3:00 2 Dikloorietaanipesu 1:30 10 3 51-deoksi-5(1,3-difenyyli- imidatsolidino)-31-deoksi-31 -C-metyleenihydratsiininukleosidi (toinen nukleosidi); 20 mikromoolia 30 ml:ssa asetonitriiliä 2:50 15 4 Natriumboorihydridi (50 mikromoolia 1:1 THF/EtOH:ssa, 50 ml) 3:00 5 Dikloorietaanipesu 2:00 6 Uusi kierros lähtien vaiheesta 1 (happopesu) 3:00 20 Tästä menetelmästä saadaan nukleosidituotteena 51 -dimetoksitrityylisubstituoitu nukleosidiyksikkö.
Synteesin lopussa emäksen suojauksen poisto ja oli-gomeerin poistaminen alustasta suoritetaan perusmenetelmil-*: 25 lä. Trityyli/HPLC-puhdistuksella, sen jälkeen etikkahapolla suoritettavalla suojauksen poistolla ja saostuksella saadaan oligonukleosidit asetaattisuoloina.
Epäsäännöllisten metyleenihydratsiini (3'-CH2-NH-NH-CH25*)-sidoksellisten oligonukleosidien synteesi 30 Esimerkki 4 ·* 5' -deoksi-51 -hydratsinotymidiinihydrokloridin syn teesi 5'-bentsyylikarbatsyyli-5'-deoksitymidiinin valmistamiseksi, 51-O-tosyylitymidiiniä Nucleosides & Nucleotides 35 9:89 (1990) (1,98 g, 5 mmol), bentsyylikarbatsidia (4,15 g, 25 mmol) , aktivoituja molekyyliseuloja (3A, 2 g) ja vede- 113870 30 töntä dimetyyliasetamidia (100 ml) sekoitettiin keskenään kosteudelta suojattuna 110 °C:ssa (hauteen lämpötila) 16 tuntia. Tuotteet jäähdytettiin ja väkevöitiin alennetussa paineessa (hauteen lämpötila < 50 °C) . Jäännös puhdistet-5 tiin silikageelipylväässä (5 x 45 cm) CH2Cl2/MeOH:n (9:1 vol/vol) toimiessa liuottimena. Homogeeniset fraktiot yhdistettiin, haihdutettiin kuiviin ja vaahto uudelleenkitey-tettiin EtOH:sta, jolloin saatiin 0,7 g (36 %) 5'-bentsyy- likarbatsyyli-51-deoksitymidiiniä; s.p. 201 °C; ΧΗ NMR (Me2-10 SO-d6) δ 1,79 (s, 3, CH3) , 2,00 - 2,18 (m, 2, C2.CH2) , 2,95 (t, 2, C5'CH2), 3,75 (m, 1, C4-H) , 4,18 (m, 1, C3.H) , 4,7 (brs, 1, 02NH) , 5,03 (s, 2, PhCH2) , 5,2 (d, 1, C3'H) , 6,16 (t, 1, Ci'H) , 7,2 - 7,4 (m, 5, C6H5) , 7,6 (s, 1, C6H) , 8,7 (brs, 1, CH2NH) , 11,2 (brs, 1, C3NH) .
15 51-deoksi-51-hydratsinotymidiinin valmistamiseksi hygroskooppisena jauheena, seosta, jossa oli edellä oleva karbatsaatti (0,78 g, 2 mmol) ja palladioitua hiiltä (10 %, 150 mg) vedettömässä MeOH/HCl:ssa (30 ml, 2 %, HC1 painon mukaan), sekoitettiin vetyatmosfäärissä huoneenlämpötilassa 20 1,5 tuntia. Metanoliliuos suodatettiin Celiten läpi kata lyytin poistamiseksi. Suodoskakku pestiin EtOH:lla (2 x 25 ml) . Suodos väkevöitiin tyhjössä ja jäännöstä kuivattiin yön yli HC1-jäänteiden poistamiseksi. Keltainen jäännös liuotettiin metanoliin (3 ml) ja lisättiin tipoittain no-25 peasti sekoitettuun liuokseen, jossa oli etyyliasetaattia (150 ml) . Suodatettu saostuma pestiin etyyliasetaatilla (3 x 100 ml) ja haalean keltainen kiinteä aine kuivattiin tyhjössä, jolloin saatiin 0,51 g (88 %) 51-deoksi-5'-hydratsi-notymidiinihydrokloridia (hygroskooppinen jauhe); XH NMR 30 (Me2SO-d6) δ 1,81 (s, 3, CH3) , 2,02 - 2,22 (m, 2, C2.CH2) , 3,2 (m, 2, C5'CH2), 3,8 (m, 1, C4.H) , 4,2 (m, 1, C3.H) , 6,17 (t, 1, Ci .H), 7,54 (s, 1, C6H) , 11,18 (brs, 1, C3NH) , hyd-ratsino ja 3'-OH eivät näkyneet, koska näyte oli märkä.
113870 31
Esimerkki 5 51 -trityyli-1-[2,3-dideoksi-3-C-(formyyli)-β-D-erytro-pento£uranosyyli]urasiilin ja -tymiinin synteesi 5 Sekoitettuun liuokseen, jossa oli 31-syaani-21,31 - dideoksi-51-O-trityyliuridiinia (0,96 g, 2 mmol) (katso Tetrahedron Letters 29:2 995 (1988) tymidiinianalogin syn teesi) kuivassa THFissa (20 ml), argonatmosfäärissä, lisättiin liuos, jossa oli DIBAL-H:ta tolueenissa (Aldrich) (1 10 M, 4 ml) -10 °C:ssa, 10 min aikana. 30 min kuluttua reaktio tukahdutettiin MeOH:lla (5 ml) -10 °C:ssa. Seosta sekoitettiin edelleen ympäristön lämpötilassa 30 min ja laimennettiin sitten CH2Cl2:lla (25 ml) ennen tyhjössä väkevöimistä.
Tämä prosessi toistettiin CH2Cl2:lla (3 x 25 ml) jäljellä 15 olevan THF:n poistamiseksi. Jäännös puhdistettiin flash-kromatografoimalla silikageelillä (25 g) . Eluoiden CH2Cl2:lla (9:1, v/v) ja kiteyttämällä CH2Cl2/MeOH:sta, saatiin 51-0-trityyli-3'-C-formyyli-21,3'-dideoksiuridiinia (0,53 g, 53 %) ; s.p. 100 °C; XH NMR (CDCl3) δ 2,25 - 2,8 (m, 20 2, CH2) , 3,4 (m, 1, C3'H) , 3,45 - 3,6 (m, 2, C5'H2) , 4,37 (m, 1, C4.H), 5,4 (d, 1, C5H), 6,1 (m, 1, Ci-H) , 7,2 - 7,4 (m; 15, CSH5) , 7,81 (d, 1, C6H) , 7,95 (brs, 1, NH) , 9,61 (s, 1, HC=0).
Esimerkki 6 Y 25 l-metyyli-5-(t-butyylidifenyylisilyyli)-2,3-dideok- si-3-C-(formyyli)-D-erytropentofuranoosin synteesi 31-C-formyyli-sokeriprekursori saatiin öljynä 90 % saannolla, käyttäen DIBAL-H-pelkistystä 31-C-syaanisokeril-le, Tetrahedron Letters 44:625 (1988), edellä kuvatulla ta-30 valla.
113870 32
Esimerkki 7
Metyleenihydratsiinisidoksellisten (3 1 -CH2-NH-NH- XH2-5') 51-dimetoksitrityyli-3'-β-syaanietoksidi- isopropyylifosforamidiittidinukleosidien synteesi 5 Sekoitettuun liuokseen, jossa oli 51-O-trityyli-1- [2,3-dideoksi-3-C-(formyyli)-β-D-erytro-pentofuranosyyli]-tymiiniä (1 mmol), 51-deoksi-51-hydratsinotymidiinihydro- kloridia (1 mmol) ja kuivaa THF:a (25 ml) argonatmosfääris-sa, lisättiin kuivattuja molekyyliseuloja (1 g) . Reaktion 10 annettiin edetä yön yli ja sitten sitä käsiteltiin bromi-kresolivihreällä (5 mg). Sitten lisättiin natriumsyaaniboo-rihydridiä (4 mmol), sen jälkeen tipoittain ruiskun kautta p-tolueenisulfonihappoa, joka oli THF:ssa (4 mmol 4 ml:ssa), siten, että reaktioseoksen kullanruskea väri py-15 syi. Seos suodatettiin ja kiinteät aineet pestiin kuivalla MeOHrlla (3 x 10 ml) . Yhdistetyt suodokset yhdistettiin ja väkevöitiin. Jäännös puhdistettiin pylväskromatografoimal-la, jolloin saatiin metyleenihydratsiinisidoksellisia (31-CH2-NH-NH-CH2-5') tymidiinidimeerejä. Tämän aineen hydrat-20 sinosidos monobentsoyloitiin lyhyellä menetelmällä, jonka on kuvannut Gait, M.J., toim., Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach (IRL Press 1984). 5'-hydroksyyli- ja 3'-hydroksyyli muutetaan 51-O-dimetoksitrityyli-3'-β-syaani-etoksidi-isopropyylifosforamidiitiksi perusmenetelmien mu-25 kaisesti.
Esimerkki 8
Epäsäännöllisten metyleenihydratsiinisidoksellisten (3 ' -CH2-NH-NH-CH2-5 ') oligonukleosidien synteesi CPG:hen sidottua tymidiiniä (tai jotakin muuta nuk-30 leosidia, josta tulee 3'-pääte-emäs) laitetaan Applied Bio-systems, Inc. (ABI) -pylvääseen (250 mg, 10 mikromoolia si-doksellista nukleosidia) ja kytketään ABI 380B -automatisoituun DNA-syntetisaattoriin. Käytetään standardeja, automatisoituja (tietokoneohjattuja) vaiheita, käyttäen hyväksi 35 fosforamidiittikemiaa metyleenihydratsiinitymidiinidimeerin sijoittamiseksi mihin tahansa haluttuun kohtaan nukleosidi- 113870 33 järjestyksessä.
Esimerkki 9 51-O-trityyli-1-[2,3-dideoksi-3-C-(formyyli)-β-D- erytro-pentofuranosyyli]urasiilin ja -tymidiinin 5 vaihtoehtoinen synteesi
Seosta, jossa oli 3'-deoksi-31-jodi-5'-O-trityyli-tymidiiniä (0,59 g, 4 mmol); Tet. Letters, 29:2 995 (1988), tris(trimetyylisilyyli)silaania (2,87 g, 1,2 mmol), AIBNrää (12 mg, 0,072 mmol) ja tolueenia (20 ml), sekoitettiin la-10 siastiassa ja kyllästettiin argonilla (annettiin kuplia huoneenlämpötilassa). Lasiastia laitettiin ruostumattomasta teräksestä valmistettuun paineastiaan, paineistettiin hiilimonoksidilla (80 psi), suljettiin ja kuumennettiin (90 °C, haude) 26 tuntia. Reaktioseos jäähdytettiin (0 °C) 15 ja CO:n annettiin poistua varovasti (vetokaapissa) . Tuote puhdistettiin flash-kromatografoimalla silikageelillä (20 g). Eluoiden EtOAc:heksaaneilla (2:1, v/v) ja yhdistäen sopivat fraktiot, saatiin 0,30 g (61 %) otsikon yhdistettä vaahtona.
20 2',3'-dideoksi-31 -jodi-5'-O-trityyliuridiinin radi- kaalikarbonylaatiosta, joka suoritetaan samalla tavalla, saadaan 31-C-formyyliuridiinijohdannainen.
Esimerkki 10 5'-O-ftaali-imidotymidiinin ja 2 *-deoksi-5'-O-ftaa-25 li-imidouridiinin synteesi
Sekoitettuun seokseen, jossa oli tymidiiniä (1,21 g, 5 mmol), N-hydroksiftaali-imidiä (1,09 g, 6,6 mmol), trifenyylifosfiinia (1,75 g, 6,6 mmol) kuivassa DMF:ssa (25 ml) , lisättiin di-isopropyyliatsodikarboksy-30 laattia (1,5 ml, 7,5 mmol) 30 min aikana 0 °C:ssa. Sekoit-• tamista jatkettiin 12 tunnin ajan huoneenlämpötilassa.
Liuotin haihdutettiin tyhjössä ja jäännös pestiin dietyyli-eetterillä (2 x 50 ml) . Jäännös suspensoitiin kuumaan EtOH-.iin (50 ml) , jäähdytettiin ja suodatettiin, jolloin 35 saatiin 1,54 g (80 %) otsikon yhdistettä valkoisena jauheena.
113870 34
Vastaavasta reaktiosta, joka suoritettiin 2'-deok-siuridiinille, saatiin vastaavaa 2'-deoksi-51-ftaali-imi-douridiinia; s.p. 241 - 242 °C.
Esimerkki 11 5 5 1 -O-f taali-imido-3 1 -O-tert-butyyli (difenyyli) si- lyylitymidiinin ja 21-deoksi-51-O-ftaali-imido-3'- O-tert-butyyli(difenyyli)silyyliuridiinin synteesi Käsittelemällä 51-O-ftaali-imidotymidiiniä tai 2'-deoksi-51-O-ftaali-imidouridiinia tert-butyyli(difenyyli)-10 kloorisilaanilla pyridiinissä ja imidatsolissa tunnetulla tavalla, saatiin 5'-O-ftaali-imido-3'-O-tert-butyyli(difenyyli) silyylitymidiiniä ja 2'-deoksi-51-O-ftaali-imido-3'-0-tert-butyyli(difenyyli)silyyliuridiinia kiteisinä tuotteina. 1H NMR tymidiinijohdannaiselle CDCl3:ssa: δ 1,10 (s, 15 9, C(CH3)3), 1,95 (S, 3, CH3) , 2,2 (m, 2, C2, CH2) , 3,63 -4,15 (m, 3, C3, H ja C5<, CH2) , 4,80 (m, 1, C4, H), 6,45 (t, 1, Ci, H), 7,4 (m, 15, ArH, CSH) , 8,2 (br s, 1, NH) .
Esimerkki 12 51-O-amino-31-O-tert-butyyli(difenyyli)silyylitymi-20 diinin synteesi
Sekoitettuun seokseen, jossa oli 5'-O-ftaali-imido-3'-O-tert-butyyli(difenyyli)silyylitymidiiniä kuivassa CH2Cl2:ssa (10 ml), lisättiin metyylihydratsiinia (3 mmol) vedettömissä olosuhteissa, huoneenlämpötilassa. Liuosta se-25 koitettiin 12 tuntia, se jäähdytettiin (0 °C) ja suodatettiin. Saostuma pestiin CH2Cl2:lla (2 x 10 ml) ja yhdistetyt suodokset väkevöitiin. Jäännös puhdistettiin flash-kromato-grafoimalla (silikageeli, 20 g) . Eluoiden CH2Cl2 :MeOH: 11a (9:1, v/v), saatiin haluttu 5 '-O-amino-3 '-O-tert-butyyli -30 (difenyyli)silyylitymidiini kiteisenä tuotteena (65 %) ; XH NMR (CDC13) δ 1,10 (s, 9, C(CH3)3), 1,80 (s, 3, CH3) , 1,81 ja 2,24 (2 m, 2, C2, CH2) , 3,25 ja 3,60 (2 m, 2, C5, CH2) , 4,0 (m, 1, C3, H), 4,25 (m, 1, C4, H), 5,4 (v, br, s, NH2) , 6,25 (t, 1, Ci, H), 7,2 (s, 1, C6H) , 7,25 - 7,60 (m, 10, 35 ArH), 8,4 (br s, 1, NH).
113870 35
Esimerkki 13 (3 1 -CH=N-0-CH2-5 1) - ja (3 1 -CH2-NH-0-CH2-5 ')-sidok- sellisten oligonukleosidien synteesi
Seosta, jossa oli 3'-deoksi-C-formyyli-5'-O-trityy-5 litymidiiniä (0,99 g, 2 mmol) ja 51-O-amino-3'-O-tert-bu-tyyli(difenyyli)silyylitymidiiniä (0,99 g, 2 mmol) kuivassa CH2Cl2:ssa (25 ml), sekoitettiin yksi tunti huoneenlämpötilassa. Liuotin haihdutettiin tyhjössä ja jäännös liuotettiin kuivaan THF:iin (20 ml). Lisättiin THF-liuos, jossa 10 oli tetrabutyyliammoniumfluoridia (1 M, 5 ml) sekoitettuun reaktioseokseen. Sekoittamista jatkettiin tunnin ajan huoneenlämpötilassa, ja liuotin haihdutettiin, jolloin saatiin kumimainen jäännös. Jäännös puhdistettiin lyhyellä silika-geelipylväskromatografilla (20 g) ja eluoitiin 15 CH2CI2 :MeOH:11a (99:4, v/v), jolloin saatiin haluttu dimeeri vaahtona. Tuote liuotettiin vedettömään MeOH:iin (50 ml) ja tähän lisättiin kylläistä metanolipitoista HCl-liuosta (2,5 ml). Reaktioseosta sekoitettiin huoneenlämpö-tilassa 15 tuntia. Vedetöntä pyridiiniä (10 ml) lisättiin 20 edellä olevaan liuokseen ja liuottimet haihdutettiin, jolloin saatiin käsittelemätön oksiimisidoksellinen dinukleo-sidi. Oksiimi puhdistettiin silikageeli (20 g) -pylväskro-matografoimalla. Eluoiden CH2CI2 :MeOH:11a (92:8, v/v), saatiin 0,69 g (70 %) oksiimisidoksellista dimeeriä Z/E-iso-*: 25 meerien seoksena. XH NMR (DMS0-ds) δ 1,78 ja 1,80 (2 s, 6H, 2 CH3) , 2,02 - 2,40 (m, 4, 2C2, CH2) , 3,15 (m, 1, C3, H), 3,45 ja 3,65 (2 m, 2, C5, CH2) , 3,95 (m, 2, 2 C4, H), 4,15 - 5,25 (m, 3, C3, H, ja C5, CH2) , 5,20 (t, 1, S'OH) , 5,40 (d, 1, 3.0H), 6,05 (t, 1, Ci, H), 6,18 (t, 1, C1# H), 6,85 (d, 30 1, C3..H), 7,4 ja 7,44 (2 S, 1, C6H) , 7,46 (d, 1, C3..H), 7,78 ja 7,80 (2 s, 1, C6H) ja 11,25 (2 br s, 2, NH).
Kaksi geometristä isomeeriä (E/Z) erotettiin kään-teisfaasi-HPLC:llä ja karakterisoitiin täydellisesti erilaisin analyyttisin menetelmin. Isomeerinen dimeeri muutet-35 tiin edelleen sen 51-O-dimetoksitrityylijohdannaiseksi di-meerin 5'-hydroksyyliryhmästä ja sen 31-Ο-β-syaanietoksidi- 113870 36 isopropyylifosforamidiittijohdannaiseksi dimeerin 3'-hyd-roksiryhmästä, käyttäen hyväksi peruskemiaa. Tämän dimeeri-johdoksen 31P NMR DMSO-d6:ssa resonoi arvoissa δ 150,4, 150,7 ja 150,8 ppm. Suojattua dimeeriä voidaan tarkoituk-5 senmukaisesti säilyttää ja käyttää liittämiseen automatisoitua DNA-syntetisaattoria (ABI 380B) hyväksi käyttäen, kun se halutaan erityisesti lisätä oligomeereihin, jotka ovat terapeuttisesti arvokkaita. Kuten alla esitetään, oli-gomeeri, jossa on oksiimisidoksellinen nukleosididimeeri, 10 pelkistetään oligomeeriksi, jossa on vastaava hydroksyyli-amiinisidoksellinen nukleosididimeeri.
Esimerkki 14
Epäsäännöllisen (3 1 -CH=N-0-CH2-5 1) - tai (3 1 -CH2-NH-O-CH2-51)-sidoksellisten oligonukleosidien synteesi 15 Sopiva 21-deoksinukleosidi, josta tulee oligonuk- leosidin 31-päätenukleosidi, liitetään sidoksella CPG-pyl-vääseen ABI 380B -automatisoidussa DNA-syntetisaattorissa käyttöä varten. Käytettiin standardeja fosforamidiittike-mian ohjelmavaiheita dimeerin, jossa on (3'-CH=N-0-CH2-5 1)-20 tai (3'-CH2-NH-O-CH2-5')-sidoksia, liittämiseksi haluttuun asemaan tai haluttuihin asemiin valitussa nukleosidijärjes-tyksessä.
Esimerkki 15
Yhtenäisten (3 -CH=N-0-CH2-5 ') - tai (3 ' -CH2-NH-0-25 CH2-51)-sidoksellisten oligonukleosidien synteesi ABI 380B -DNA-syntetisaattorilla kolmea nukleosidi-alayksikköä hyväksi käyttäen
Alayksikkö 1: CPG:hen sidottu 51O-ftaali-imidotymi-diini valmistettiin menetelmällä, joka on kuvattu julkai-30 sussa Nucleic Acids Research, 18:3813 (1990), ja käytettiin 31-pääteyksikkönä oligonukleosidisynteesissä.
Alayksikkö 2: Bifunktionaalinen (3'-C-formyyli- ja 5'-O-ftaali-imidodeoksiribonukleosidi) johdetaan standardilla metyyli-2,3-dideoksi-3-syaani-5-0-(ftaali-imido)-β-D-35 erytro-pentofuranosidin glykosylaatiolla sopivan emäksen kanssa ja suorittamalla DIBAL-H-pelkistys nukleosidituot- 113870 37 teelle.
Alayksikkö 3: 5'-O-DMT-31-C-formyylitymidiiniä käytetään viimeisen (oligonukleosidin 5'-pääte) nukleosidin liittämiseksi.
5 Automatisoidut vaiheet kierrossa, joka tarvitaan yhtenäisten sidosten syntetisoimiseksi (10 μΜ:η mittakaava :CPG: lie lisätty yksikkö 1) ovat seuraavat:
Vaihe Reagenssi/liuotin Aika/min 10 1 5 % metyylihydratsiini DCMrssä 10 2 DCM:MeOH (9:1, v/v) 5 3 DCM-pesu 2 4 31-C-formyyli-5'-O-ftaali-imido-deoksiribonukleosidi (yksikkö 2, 15 20 μΜ 20 ml:ssa DCM:ää) 3 5 DCM:asetoni (9:1, v/v): kate 2 6 DCM-pesu 3
Edellä olevat vaiheet 1-6 toistetaan kullekin 20 nukleosidiyksikön lisäykselle, riippuen halutusta ketjusta ja pituudesta. Sitten lisätään viimeinen yksikkö: 8 Viimeinen nukleosidi (20 μΜ 20 ml:ssa DCM:ää) tai yksikkö 3 5 25 NaCNBH3-pelkistysvaihe (31 -CG=N-0-CH2-51)-sidoksen muuttamiseksi (3 1 -CH2-NH-O-CH2-5')-sidokseksi dimeerisidok-sessa tai oligonukleosidin sidoksissa Esimerkki 16 Dimeerin pelkistys 30 Liuokseen, jossa oli dimeeriä (0,49 g, 1 mmol) jää- ** etikkahapossa (AcOH) (5 ml) , lisättiin natriumsyaaniboori- hydridiä (0,19, 3 mmol), joka oli AcOH-.ssa (1 ml), argonat-mosfaarissa, huoneenlämpötilassa. Suspensiota sekoitettiin yksi tunti ja lisättiin uudelleen NaBH3CN:a AcOH:ssa (1 35 ml) , ja sekoittamista jatkettiin tunnin ajan. Ylimäärä AcOH:a poistettiin alennetussa paineessa huoneeniämpötilas- 113870 38 sa. Jäännös haihdutettiin yhdessä tolueenin kanssa (2 x 50 ml) ja puhdistettiin silikageeli (25 g) -pylväskromatogra-foimalla. Eluoiden CH2C12:MeOH: 11a (9:1, v/v) ja yhdistä mällä sopivat fraktiot, sen jälkeen haihduttamalla, saatiin 5 0,36 g (75 %) kiteistä dimeeriä.
Esimerkki 17
Oligonukleosidin pelkistys CPG:hen sidottua oligonukleosidia (1 μΜ) , joka sisältää yhden (tai useamman) rungoltaan muunnelun sidoksen, 10 otetaan pois DNA-syntetisaattorista sen jälkeen, kun sen synteesikierrot ovat päättyneet. 1,0-M:ista NaBH3CN-liuosta, joka on THF:AcOH:ssa (10 ml, 1:1 v/v), pumpataan CPG:hen sidotun aineen läpi standardilla tavalla, käyttäen hyväksi ruiskutekniikkaa, 30 minuutin ajan. Kolonni pestään 15 THF:lla (50 ml) ja pelkistetty oligonukleosidi johdetaan alustakolonnista standardilla tavalla.
Esimerkki 18
Oligonukleosidin vaihtoehtoinen pelkistys
Vaihtoehtoisesti edellä oleva pelkistys voidaan 20 suorittaa myös sen jälkeen, kun CPG-alusta on poistettu. Synteesin lopussa oligonukleosidi poistetaan CPG-alustasta standardimenetelmin. 5'-O-trityyli-oligonukleosidi puhdistetaan HPLC:llä ja pelkistetään sitten NaBH3CN/AcOH/THF-menetelmällä edellä kuvatulla tavalla.
25 Esimerkki 19 (3 1 -CH2-0-N=CH-5 1) - ja (3 '-CH2-0-NH-CH2-5 ·)-sidok- sellisten oligonukleosidien synteesi 3'-C-formyyli-51-O-trityylitymidiini pelkistettiin ylimäärällä NaBH4:ää, jolloin saatiin 31 -hydroksimetyylity-30 midiiniä, josta trifenyylifosfiinilla, N-hydroksiftaali-imidillä ja di-isopropyyliatsodikarboksylaatilla THF:ssa käsittelemällä saatiin 31-ftaali-imidometyylianalogia, josta metyylihydratsiinilla suoritetun hydratsinolyysin jälkeen saatiin 3'-hydroksimetyyli-(O-amino)-5'-O-trityylity-35 midiiniä kokonaissaannolla, joka oli 64 %.
1-(4-C-formyyli-3-0-tert-butyyli(difenyyli)silyyli- 113870 39 2-deoksi-6-D-erytro-pentofuranosyyli)tymidiini valmistettiin menetelmällä, joka on kuvattu julkaisussa Nucleotides, 9:533 (1990). Liittämällä tämä nukleosidi 3'-hydroksimetyy-li-(O-amino)-5'-O-trityylitymidiinin kanssa DCM:ssä edellä 5 kuvatulla tavalla, saatiin oksiimi, josta NaCNBH3CN: llä pelkistettäessä saatiin dimeeri. Dimeeri suojataan sopivasti ja aktivoidaan 5'-0-DMT- ja 31-O-fosforamidijohdan-nai-sena laitettavaksi haluttuihin kohtiin oligonukleosideissa standardin DNA-syntetisaattorikemian avulla.
10 Esimerkki 20 (3-CH2-P(O)2-O-CH2-51)- ja (31-CH2-O-P (O) 2-CH2-51)- sidoksellisten oligonukleosidien synteesi A. 3'-C-fosfonaattidimeerin synteesi 31-hydroksimetyyli-51 -(O-tert-butyyli(difenyyli)si-15 lyyli)tymidiini muutetaan sen bromidiksi käsittelemällä NBSrllä. Bromidille suoritetaan Arbuzovin reaktio, jolloin saadaan fosfonaattidiesteri. Fosfonaattidiesterin lohkai-susta trimetyylibromisilaanilla saadaan vapaa happo, josta käsittelemällä 3'-(O-tert-butyyli(difenyyli)silyyli)tyrni -20 diinillä ja DCCtllä pyridiinissä saadaan dimeeri.
B. 3·-C-fosfonaattisidoksellisten oligonukleosidien synteesi
Edellä oleva dimeeri voidaan liittää oligonuk-leosidiin sopivasti suojaamalla ja aktivoimalla dimeeri 5'-25 O-DMT- ja 3'-O-fosforami di johdannaisena ja sijoittamalla haluttuihin kohtiin oligonukleosideissa standardia DNA-syn-tetisaattorikemiaa käyttäen.
C. 51-C-fosfonaattisidoksellisten oligonukleosidien synteesi 30 Vastaavat 51-C-fosfonaattidimeerit voidaan saada « *·* siten, että saatetaan 5'-deoksi-5 '-brominukleosidi reagoi maan fosfiittiesterin kanssa, jolloin syntyy 5'-fosfonaat-ti. Tämä vuorostaan saatetaan reagoimaan 3'-hydroksimetyy-linukleosidin kanssa, jolloin saadaan 5'-C-fosfonaattisi-35 doksellinen dimeeri.
40 113870
Esimerkki 21
Yhdisteen (13), rakenteen (III), jossa Rei on O-(dimetoksitrityyli), Re2 on 0-(2-syaanietyyli-Ν,Ν,Ν', Ν'-tetraisopropyylifosfordiamidyyli) ja Re3 5 on H, synteesi CH t «n—1 „
HY
0 CH, H H-1 N\/NRE3
1p)T
R E 2 (III) A. Yhdiste (2), rakenne (IV), jossa Rei on O-(t-bu-10 tyylidifenyylisilyyli), Re2 on O-(p-tolueenitioformyyli) ja Re3 on H.
CH, /f* πρητ’·* RE2 (IV) 113870 41
Yhdiste (1) [rakenne (IV), jossa Rei on O-t-butyy-lidifenyylisilyyli, Re2 on OH, Re3 on H; 11,45 g; 23,82 x 10'3 mol] liuotetaan argonatmos f äärissä CH2Cl2:een (100 ml). Tähän liuokseen lisätään NEt3:a (2,41 g; 23,82 x 10'3 mol), 5 DMAP:tä (4-N,N-dimetyyliaminopyridiiniä; 2,911 23,82 x 10'3 mol) ja p-tolueenitiokloroformiaattia (4,44 g; 23,82 x 10~3 mol). Kun on sekoitettu 20 tuntia huoneenlämpötilassa, seos laimennetaan CH2Cl2:lla (50 ml), pestään NaH2P04:n vesi-liuoksella (2 x 50 ml), sitten suolaliuoksella (2 x 50 ml) 10 ja kuivataan Na2S04:lla. Kun liuotin on haihdutettu, jäännös kromatografoidaan silikageelillä (heksaani:AcOEt, 4:1). Yhdiste (2) eristetään haalean keltaisena kiinteänä aineena (13,074 g; 20,72 x 10'3 mol; 87 %) . XH NMR (CDCl3, 500 MHz, δ (ppm), J (Hz) ) : 2,41 (H2·, ddd, 2J = 13,5, 3J2·^' = 5,9; 15 3J2'-i· = 9,3); 2,73 (%·, dd, 3J2--i· =5,0); 4,36 (H4·, ddd, 3J3'-4', = 0,9); 5,94 (H3-, dd) ; 6,51 (Hi·, dd) ; 7,58 (H6, q, 4H = 1,0): MS (FD: m/e) : 631 (M+) .
B. Yhdiste (3), rakenne (IV), jossa Rei on 0-(t-bu-tyylidifenyylisilyyli) , Re2 on allyyli ja Re3 on H.
20 Yhdiste (2) (5,0 g; 7,926 x 10"3 mol) liuotetaan argonatmosfaarissa kaasuttomaan bentseeniin (79 ml; 0,1 M; kaasujen poisto argonvirtauksella 30 minuutin ajan). Kun on lisätty allyylitri-n-butyylitinaa (13,12 g; 39,63 x 10‘3 mol) ja AIBN:ää (atso-bis-isobutyronitriiliä; 0,65 g; 3,963 25 x 10"3 mol) , seosta kuumennetaan palautus jäähdytys lämpötilassa. Neljän tunnin kuluttua lisätään jälleen AIBN:ää (0,26 g; 1,58 x 10'3) . Lähtöainetta ei ole havaittavissa 20 tunnin kuluttua analyyttisellä ohutkerroskromatografialla (silikageeli; heksaani:AcOEt, 1:1). Liuotin haihdutetaan 30 alennetussa paineessa ja jäännös kromatografoidaan silika-geelillä (heksaani:AcOEt, gradientti 6:1 - 2:1). Yhdiste (3) eristetään valkoisena kiinteänä aineena (3,12 g; 6,18 x 10"3 mol; 78 %) . 3H NMR (CDCl3, 500 MHz, δ (ppm) , J(Hz)):
2,15 - 2,19 (2H2·, m); 2,46 (H3·, m); 5,70 (CH=CH2; m); 6,11 35 (Hi-, dd 3Ji -2> = 5,1 ja 6,1); 7,51 (H6, q, 4J = 1,1). MS
(FD; m/e) : 505 (M+) .
113870 42 C. Yhdiste (4), rakenne (IV), jossa Rei on 0-(t-bu-tyylidifenyylisilyyli) , Re2 on CH2C(0)H ja Re3 on H.
Olefiinijohdannainen (3) (3,11 g; 6,16 x 10 3 mol) liuotetaan seokseen, jossa on 2:1 dioksaani-H20:ta (60 ml).
5 Lisätään 0sC>4:ää (0,157 g; 0,616 x 10‘3 mol), sen jälkeen liuos, jossa on NaI04:a (2,89 g; 13,55 x 10'3 mol) H20:ssa (25 ml) . Suspensiota sekoitetaan huoneenlämpötilassa neljä tuntia. Sitten lisätään CH2Cl2:ta (100 ml). Orgaaninen faasi pestään suolaliuoksella (2 x 50 ml) ja kuivataan 10 Na2S04:lla. Kun liuotin on haihdutettu, jäännös kromatogra-foidaan silikageelillä (heksaani:AcOEt, 1:1). Yhdiste (4) saadaan haalean keltaisena kiinteänä aineena (1,561 g; 3,08 x 10'3 mol; 50 %. XH NMR (CDC13, 500 MHz, δ (ppm), J(Hz)): 2,07 (H2., ddd, 2J = 14,9, 3J2.-i· = 7,0, 3J2.-3· = 7,9); 2,39 15 (H2i , ddd, 3J2i -i< = 4,9, 3J2'-3· = 8,3); 2,84 (H3-, m); 3,72 (H4., ddd, 3J3.-4. = 7,5); 6,14 (Hi·, dd) ; 9,72 (CHO; dd) .
D. Yhdiste (5), rakenne (IV), jossa Rei on 0-(t-bu-tyylidifenyylisilyyli) , Re2 on CH2C(0)0CH3 ja Re3 on H.
Aldehydi (4) (2,23 g; 4,401 x 10'3 mol) liuotetaan 20 DMF:iin (20 ml). MeOH:a (0,846 g; 26,40 x 10~3 mol) ja PDC:tä (pyridiniumdikromaattia; 10,137 g; 26,40 x 10~3 mol) lisätään. Syntynyttä tumman ruskeaa liuosta sekoitetaan huoneenlämpötilassa 20 tuntia, sitten se laimennetaan CH2Cl2: Ha (60 ml) ja pestään NaH2P04:llä (2 x 50 ml) ja 25 suolaliuoksella (2 x 50 ml). Na2S04:lla kuivaamisen jälkeen liuotin haihdutetaan ja jäännös kromatografoidaan silikageelillä (heksaani:AcOEt, 2:1). Yhdiste (5) (1,531 g; 2,869
x 10~3 mol; 65 %) eristetään valkoisena kiinteänä aineena. hl-NMR (CDC13, 500 MHz, δ (ppm), J(Hz)): 2,17 (Η2·, ddd, 2J
30 =14,3, 3 J2 -l = 7,0, 3J2.-3. = 7,2); 2,33 (H2·, ddd, 3J2'-i· = 5,0, 3 J2' -3' = 8,3); 2,82 (H3>, m); 3,68 (COOMe, s) ; 6,15 (Hi·, dd) .
113870 43 E. Yhdiste (6), rakenne (IV), jossa Rei on O-(t-bu-tyylidifenyylisilyyli), Re2 on CH2C(0)0H ja Re3 on H.
Esteri johdannainen (5) (7,197 g; 13,4 x 10~3 mol) liuotetaan seokseen, jossa on 1:1 THF-H20:ta (50 ml).
5 Liuos, jossa on 0,1-N:ista NaOH:a (26,8 ml; 26,81 x 10'3 mol), lisätään. Kun on sekoitettu 18 tuntia huoneenlämpötilassa, lisätään vielä 0,1 N NaOH:a (13,4 ml; 13,4 x 10 3 mol) ja seosta sekoitetaan kaksi tuntia, se neutraloidaan 1 N HCl:lla ja uutetaan CH2Cl2:lla (2 x 50 ml). Orgaaninen 10 faasi pestään suolaliuoksella (2 x 50 ml) ja kuivataan Na2S04:lla. Kun liuotin on haihdutettu, yhdiste (6) saadaan valkoisena kiinteänä aineena (6,38 g; 16,03 x 10"3 mol; 91 %) . ^-NMR (CDCls, 250 MHz, δ (ppm)): 6,14 (Hi·, dd) .
F. 51-atsido-21.5'-dideoksitymidiini (7), rakenne 15 (IV), jossa Rei on atsido, Re2 on hydroksyyli ja Re3 on H.
Yhdisteen (7) synteesi suoritettiin menetelmällä, jonka on kuvannut T. Lin, W. Prusoff, J. Med. Chem., 21, 109 (1978), kaupallisesti saatavasta pyrimidiinitymidiinistä (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI).
20 G. Yhdiste (8) , rakenne (IV), jossa Rei on atsido,
Re2 on O-(t-butyylidifenyylisilyyli) ja Re3 on H.
Yhdiste (7) (3,0 g; 11,22 x 10"3 mol) liuotetaan argonatmosfäärissä DMF:iin (20 ml). Lisätään imidatsolia (1,3 g; 19,08 x 10~3 mol) ja t-butyylidifenyylikloorisilaa-25 nia (4,627 g; 16,83 x 10~3 mol). Seosta sekoitetaan 48 tuntia huoneenlämpötilassa. DMF haihdutetaan pois alennetussa paineessa ja jäännös liuotetaan CH2Cl2:een (60 ml) ja Na-H2PO4: n vesiliuokseen (60 ml). Orgaaninen faasi pestään NaH2P04:n vesiliuoksella (50 ml) ja suolaliuoksella (50 ml) 30 ja kuivataan Na2S04:lla. Liuottimen haihduttamisen jälkeen jäljelle jäänyt aine kromatografoidaan silikageelillä (CH-Cl3:MeOH 20:1). Yhdiste (8) saadaan haalean keltaisena öljynä (5,39 g; 10,66 x 10'3 mol, 95 %) . 1H-NMR (CDC13, 250 MHz, δ (ppm), J (Hz) ) : 1,95 (Η2·, ddd) ; 2,36 (Η2·, ddd) ; 6,38 35 (Hi·, dd) .
113870 44 H. Yhdiste (9), rakenne (IV), jossa Rei on amino, Re2 on O-(t-butyylidifenyylisilyyli) ja Re3 on H.
Yhdiste (8) (7,3 g; 14,43 x 1CT3 mol) liuotetaan kaasuttomaan bentseeniin (144 ml; 0,1 M, kaasujen poisto 5 argonvirtauksella 30 minuutin ajan). Kun AIBN (0,237 g; 1,44 x 10'3 mol) ja n-tributyylitinahydridi (9,244 g; 31,76 x 10"3 mol) on lisätty, liuosta sekoitetaan 80 °C:ssa 15 tuntia. Lisätään vielä AIBN:ää (0,237 g; l,44x 10"3 mol) ja kuumentamista jatketaan viiden tunnin ajan. Liuotin 10 haihdutetaan ja jäännös kromatografoidaan silikageelillä (heksaani:AcOEt 1:2). Yhdiste (9) saadaan haalean keltaisena kiinteänä aineena (4,605 g; 9,6 x 10’3 mol; 85 %) . '’ή-NMR (CDC13, 500 MHz, δ (ppm), J(Hz)): 1,93 (Η2·, ddd, 2J = 13,5, 3 J2·-i· = 6,8, 3 J21 -31 =6,8) ; 2,35 (H2·, ddd, 3J2'-i' = 6,2, 15 3 J21 -31 = 4,2); 3,87 (H4·, ddd, 3J3'-4· = 3,7); 4,25 (H3., ddd); 6,31 (Hr, dd) .
I. Yhdiste (10), rakenne (III), jossa Rei on O-(t-butyylidifenyylisilyyli), Re2 on (O-t-butyylidifenyylisi-lyyli) ja Re3 on H.
2 0 Yhdiste (6) (0,468 g; 0,896 x 10"3 mol) liuotetaan
MeCN:iin (30 ml). Tähän värittömään liuokseen lisätään N-metyylimorfoliinia (0,099 g; 0,986 x 10'3 mol), N-hydroksi-bentsotriatsolia (0,06 g; 0,448 x 10"3 mol), O- (lH-N-hyd-roksibentsotriatsoli-l-yyli)-N,N,N',N'-tetrametyyliuronium-25 tetrafluoriboraattia (0,317 g; 0,986 x 10"3 mol). Seosta sekoitetaan 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Yhdiste (9) (0,43 g; 0,896 x 10'3 mol) liuotetaan sitten MeCN:iin (5 ml) ja siihen lisätään N-metyylimorfoliinia (0,136 g; 1,344 x 10"3 mol). Oltuaan 20 tuntia huoneenlämpötilassa, 30 asetonitriili haihdutetaan alennetussa paineessa. Jäännös liuotetaan CH2Cl2:een (60 ml) ja NaH2P04:ään (30 ml) . Orgaaninen faasi pestään NaH2P04:llä (2 x 30 ml) ja suolaliuoksella (2 x 30 ml) . Na2S04:lla kuivaamisen jälkeen liuotin haihdutetaan. Jäännös kromatografoidaan silikageelillä 35 (heksaani:AcOEt, 1:1). Yhdiste (10) saadaan haalean keltaisena kiinteänä aineena (0,692 g; 0,703 x 10"3 mol; 79 %) 1H- 45 113870 NMR (CDC13, 500 MHz, δ (ppm), J(Hz)): 5,79 (Hi·, dd, 3Ji.2· = 7,0); 6,20 (Hi·, dd, 3Ji.-2· = 6,4); 6,95 (He, q, 4J = 1,0); 7,27 (H6, q, 4J = 1,0). - MS (El; m/e) : 984 (M+) .
J. Yhdiste (11), rakenne (III), jossa Rei on 5 hydroksyyli, Rez on hydroksyyli ja Ee3 on H.
Yhdiste (10) (0,68 g; 0,69 x 10"3 mol) liuotetaan argonatmosfäärissä THF:iin (10 ml). Etikkahappoa (0,124 g; 2,07 x 10~3 mol) ja tetra-n-butyyliammoniumfluoridia (1,88 ml 1,1 M liuosta THF:ssa; 2,07 x 10'3 mol). Oltuaan 10 20 tuntia huoneenlämpötilassa, seos haihdutetaan yhdessä tolueenin kanssa (3 x) alennetussa paineessa. Jäännös kro-matografoidaan silikageelillä (AcOEtiMeOH, 20:1). Yhdiste (11) eristetään valkoisena kiinteänä aineena (0,295 g; 0,581 x 10'3 mol; 84 %) . 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz, δ (ppm), 15 J (Hz) ) : 5,95 (Hi·, dd, 3Ji._2, = 6,2, 3Ji.-2· =4,0); 6,22 (Hi·, dd, 3Ji>-2' = 6,2, 3Ji--2. = 7,9); 7,47 (H6, q, 4J = 0,8); 7,85 (He, q, 4J =0,8) .
K. Yhdiste (12), rakenne (III), jossa Rei on O-(di-metoksi tri tyyli), Re2 on hydroksyyli ja RE3 on H.
20 Yhdiste (11) (0,29 g; 0,571 x 10"3 mol) liuotetaan argonatmosfaarissa pyridiiniin (10 ml). DMTC1:a (4,4'-dime-toksitrifenyylimetyylikloridia; 0,194 g; 0,571 x 10"3 mol) lisätään. Kun on sekoitettu 18 tuntia huoneenlämpötilassa, lisätään vielä DMTCl:a (0,097 g; 0,285 x 10'3 mol). Reaktio f: 25 tukahdutetaan MeOH:lla (1 ml) ja 40 tunnin kuluttua laimennetaan CH2C12:11a (50 ml) ja Na2C03:n vesiliuoksella (50 ml) . Orgaaninen faasi pestään suolaliuoksella (2 x 30 ml) ja kuivataan Na2S04:lla. Liuotin haihdutetaan yhdessä tolueenin kanssa (3 x) alennetussa paineessa. Jäännös kroma-30 tografoidaan silikageelillä (AcOEtrMeOH, gradientti 50:1 -10:1 + 1 % N-metyylimorfoliini) . Yhdiste (12) (0,426 g; 0,526 x 10"3 mol; 92 %) eristetään haalean keltaisena kiinteänä aineena. 1H-NMR (CDCI3, 500 MHz, δ (ppm)): 1,44 (Me, d) ; 1,88 (Me, d); 3,80 (2 x OMe, s); 7,66 (He, q) .
35 113870 46 L. Yhdiste (13), rakenne (III), jossa Rei on O-(di-metoksitrityyli), RE2 on 0-(2-syaanietyyli-N,N,NlNl-tetra-isopropyylifosforidiamidyyli) ja RE3 on H.
Yhdiste (12) (0,413 g; 0,52 x 10~3 mol) lisätään 5 argonatmosfaarissa liuokseen, jossa on 2-syaanietyyli-N, N,N' ,N'-tetraisopropyylifosforidiamidiittia (0,172 g; 0,572 x 10"3 mol) ja N,N'-di-isopropyyliammoniumtetratsolidia (0,107 g; 0,624 x 10'3 mol) CH2Cl2:ssa (20 ml). Oltuaan 16 tuntia huoneenlämpötilassa, seokseen lisätään vielä 2-syaa-10 nietyyli-Ν,Ν,Ν',N'-tetraisopropyylifosforidiamidiittia (0,172 g; 0,572 x 10'3 mol). Kun seos on ollut 24 tuntia huoneenlämpötilassa, se tukahdutetaan NaHCO:n vesiliuoksella (20 ml) . Orgaaninen faasi pestään suolaliuoksella (2 x 30 ml) ja kuivataan Na2S04:lla. Kun liuotin on haihdu-15 tettu, jäännös kromatografoidaan silikageelillä (toluee-nirAcOEt, 1:1 + 1 % N-metyylimorfoliini). Yhdiste (13) (0,299 g; 0,296 x 10~3 mol; 57 %) eristetään valkoisena kiinteänä aineena. 31P-NMR (CDCI3, 101 MHz, δ (ppm)): 148,89 ja 149,31.
20 Esimerkki 22
Yhdisteen (17), rakenteen (IV), jossa Rei on O-(t- butyylidifenyylisilyyli), RE2 on C(0)0H ja Re3 on H, synteesi.
A. Yhdiste (14), rakenne (IV), jossa Rei on 0-(t-25 butyylidifenyylisilyyli) , RE2 on styryyli ja RE3 on H.
Yhdiste (2) (3,558 g; 5,569 x 10~3 mol), joka on valmistettu esimerkissä 2IA, liuotetaan argonatmosfaarissa kaasuttomaan bentseeniin (19 ml; 0,3 M; kaasunpoisto argon-virtauksella 30 minuutin ajan). AIBN-lisäyksen (0,183 g; 30 1,113 x 10"3 mol) ja l-fenyyli-2-n-tributyylitinaetyleenin (21,90 g; 55,69 x 10'3 mol) jälkeen liuosta kuumennetaan 80 °C:SSa. AIBN:ää lisätään joko 10. tunti (0,183 g; 1,113 x 10'3 mol) siten, että kokonaismäärä on 0,915 g (5,566 x 10'3 mol). Kun jäljellä ei ole yhtään lähtöainetta (ohut-35 kerroskromatografiän perusteella, käyttäen silikageeliä, heksaani:AcOEt, 1:1), liuotin haihdutetaan ja jäännös kro- 113870 47 matografoidaan silikageelillä (gradientti heksaani: AcOEt, 10:1 -> 4:1). Yhdiste (14) eristetään valkoisena kiinteänä aineena (2,367 g; 4,177 x 10'3 mol; 75 %) . 1H-NMR (CDC13, 500 NHz, δ (ppm), J(Hz)): 2,34 (Η2·, ddd, 2J =14,0, 3J2--i· = 5 3,0, 3J2--3· = 8,2), 2,46 (H2·, ddd, 3J2.-i· = 7,1, 3J2--3· = 10,2); 3,28 (H3., m); 3,88 (H4·, ddd, 3J3.-4· = 9,1); 6,21 (Hi-, dd); 7,58 (H6, q, 4J =1,0).
B. Yhdiste (15), rakenne (IV), jossa Rei on O-t-bu-tyylidifenyylisilyyli, Re2 on formyyli ja Re3 on H.
10 Johdannainen (14) (2,193 g; 3,869 x 10~3 mol) liuo tetaan seokseen, jossa on 2:1 dioksaania ja H20:ta (30 ml). Lisätään Os04:ää (0,098 g; 0,386 x 10'3 mol), sen jälkeen liuos, jossa on NaI04:a (1,82 g; 8,512 x 10'3 mol) H20:ssa (8 ml) . Syntynyttä suspensiota sekoitetaan kolme tuntia 15 huoneenlämpötilassa ja se uutetaan CH2Cl2:lla (3 x 50 ml) . Orgaaninen faasi pestään suolaliuoksella (2 x 30 ml) ja kuivataan Na2S04:lla. Kun liuotin on haihdutettu, jäännös kromatografoidaan silikageelillä (heksaani:AcOEt, 1:1). Al-dehydi (15) eristetään valkoisena kiinteänä aineena (1,334 20 g; 2,708 x 10'3 mol; 70 %) . ^-NMR (CDC13, 250 MHz, δ (ppm), J (Hz) ) : 2,26 (H2-, ddd, 2J = 15,3, 3J2.-i· = 6,1, 3J2.3· = 9,4); 2,77 (H2., ddd, 3J2'-i' = 3J2--3. = 6,2); 3,36 (H3·, m); 6 X 10 (Hi·, dd) .
C. Yhdiste (16), rakenne (IV), jossa Rei on O-φαί*: 25 tyylidifenyylisilyyli), Re2 on C(0)0CH3 ja Re3 on H.
Aldehydi (15) (1,091 g; 2,214 x 10'3 mol) liuote taan DMF:iin (10 ml). Lisätään MeOH:a (0,425 g; 13,287 x 10"3 mol) ja PDC:a (pyridiniumdikromaattia; 4,998 g; 13,287 x 10'3 mol). Syntynyttä ruskeaa liuosta sekoitetaan 20 tun-30 tia huoneenlämpötilassa, se laimennetaan CH2Cl2:lla (50 ml) < ja pestään NaH2P04:lla (2 x 50 ml) ja suolaliuoksella (2 x 50 ml). Na2S04:lla kuivaamisen jälkeen liuotin haihdutetaan ja jäännös kromatografoidaan silikageelillä (heksaa-ni:AcOEt, 1;1). Yhdiste (16) (0,661 g; 1,264 x 10"3 mol; 57 35 %) saadaan valkoisena kiinteänä aineena. 1H-NMR (CDC13, 500 MHz, δ (ppm), J (Hz) ) : 2,28 (Η2·, ddd, 2J =14,5, 3J2--i· = 5,6, 113870 48 3J2.3· = 9,1); 2,76 (Ha·, ddd, 3J2'-i· = 3J2.-3. = 6,9); 3,42 (H3·, ddd); 4,28 (H4., ddd, 3J3--4· = 7,0); 6,21 (Hi·, dd) .
D. Yhdiste (17), rakenne (IV), jossa Rei on 0-(t-butyylidifenyylisilyyli), Re2 on C(0)0H ja RE3 on H.
5 Esteri johdannainen (16) (2,2 g,- 4,209 x 10"3 mol) liuotetaan seokseen, jossa on 1:1 THF-H20:ta (50 ml). Liuos, jossa on 0,1 N NaOH:a (126,3 ml; 12,627 x 10"3 mol), lisätään. Kun seosta on sekoitettu huoneenlämpötilassa 16 tuntia, se neutraloidaan 1 N HCltlla, uutetaan CH2Cl2:lla 10 (2 x 50 ml). Orgaaninen faasi pestään suolaliuoksella (2 x 50 ml) ja kuivataan Na2S04:lla. Kun liuotin on haihdutettu, yhdiste (17) saadaan valkoisena kiinteänä aineena (2,015 g; 3,985 x 10"3 mol; 94 %) . ^-NMR (CDCl3, 250 MHz, δ (ppm)): 6,22 (Hi·, dd) .
15 Esimerkki 23
Yhdisteen (26), rakenteen (V), jossa Rei on O-(dimetoksitrityyli), RE2 on O-(2-syaanietyyli-Ν,Ν,Ν1 ,N'-tetraisopropyylifosforidiamidyyli) ja RE3 on H, synteesi.
20 CH,
rV
...
V
pY
R E 2 (V) 113870 49 A. Yhdiste (18), rakenne (IV), jossa Rei on O-(t-butyylidifenyylisilyyli) , Re2 on hydroks ie tyyli ja Re3 on H.
Yhdiste (4) (5,323 g; 10,5 x 10‘3 mol), joka on valmistettu esimerkissä 21C, liuotetaan MeOH:iin (60 ml).
5 NaBH4:ä (1,192 g; 31,51 x 10"3 mol) lisätään vähitellen 0 °C:ssa. Kun vedyn kehitys on päättynyt, reaktioseosta sekoitetaan huoneenlämpötilassa kaksi tuntia. NaH2P04:n vesi-liuosta (20 ml) lisätään varovasti. MeOH haihdutetaan ja jäännös uutetaan CH2Cl2:lla (2 x 50 ml). Orgaaninen faasi 10 pestään suolaliuoksella (50 ml) ja kuivataan Na2S04:lla. Liuotin haihdutetaan ja jäännös kromatografoidaan silika-geelillä (heksaani:AcOEt 1:1). Yhdiste (18) eristetään valkoisena kiinteänä aineena (5,01 g; 9,84 x 10~3 mol; 94 %) . ^-NMR (CDC13, 500 MHz, δ (ppm), J(Hz)): 21,5 (Η2·, ddd, 2J 15 = 13,5, 3J2.-i = 7,0, 3J2.-3' = 9,0); 2,27 (H2-, ddd, 3J2·-!· = 4,0, 3 J 21 -31 = 8,0); 2,49 (H3·, m); 3,77 (H4·, ddd); 6,11 (Hi·, dd) .
B. Yhdiste (19), rakenne (IV), jossa Rei on 0-(t-butyylidifenyylisilyyli), Re2 on etoksi-p-tolueenisulfonyy- 20 li ja Re3 on H.
Yhdiste (18) (0,334 g; 0,656 x 10"3 mol) liuote taan argonatmosfäärissä CHCl3:een (15 ml). DMAP:A (0,241 g; 1,969 x 10'3 mol), pyridiiniä (0,208 g; 2,626 x 10'3 mol) ja tosyylikloridia (0,375 g; 1,969 x 10"3 mol) lisätään peräk-25 käin. Kun on sekoitettu huoneenlämpötilassa 24 tuntia, lisätään vielä reagensseja seuraavasti: DMAP (0,12 g; 0,984 x 10'3 mol); pyridiini (0,102 g; 1,313 x 10'3 mol); tosyyli-kloridi (0,187 g; 0,984 x 10"3 mol). Reaktioseos laimennetaan CH2Cl2:lla (60 ml) 40 tunnin kuluttua ja pestään 30 NaH2P04:n vesiliuoksella (2 x 50 ml) ja suolaliuoksella (2 x 50 ml). Orgaaninen faasi kuivataan Na2S04:lla. Kun liuotin on haihdutettu, jäännös kromatografoidaan silikageelil-lä (heksaani:AcOEt, 2:1). Yhdiste (19) (0,369 g; 0,556 x 10'3 mol; 84 %) eristetään haalean keltaisena kiinteänä 35 aineena. ^-NMR (CDCl3, 250 MHz, δ (ppm) : 2,44 (pMe-Ph-S03-, s) .
113870 50 C. Yhdiste (20), jonka rakenne on (IV), jossa Rei on O-(t-butyylidifenyylisilyyli) , Re2 on atsidoetyyli ja RE3 on H.
Yhdiste (19) (0,365 g; 0,55 x 10~3 mol) liuotetaan
5 DMF:iin (10 ml) kuivassa argonatmosfaarissa. Tähän liuokseen lisätään LiN3:a (0,135 g; 2,75 x 10'3 mol) ja Nal:a (0,165 g; 1,1 x 10'3 mol). Seosta kuumennetaan 100 °C:ssa 17 tuntia, sitten se jäähdytetään huoneenlämpötilaan. Lisätään eetteriä (100 ml) , sitten suolaliuosta (50 ml) . Orgaaninen 10 faasi pestään suolaliuoksella (2 x 50 ml) ja kuivataan Na2S04:lla. Kun liuottimet on haihdutettu alennetussa paineessa, jäännös kromatografoidaan silikageelillä (hek-saani:AcOEt, 3:1). Yhdiste (20) eristetään haalean keltaisena öljynä (0,259 g; 0,485 x 10"3 mol; 88 %) . 3H-NMR
15 (CDC13, 500 MHz, δ (ppm), J(Hz)): 2,13 (Η2·, ddd, 2J =13,5, 3 J 21 -31 = 8,7, 3J2<-i> = 7,0); 2,26 (H2·, ddd, 3J2.-3· = 7,9, 3J2'i> = 4,0); 2,47 (H3·, m); 3,73 (H4·, ddd, 3J4.-3. = 8,0); 6,11 (Hi>, dd) .
D. Yhdiste (21), rakenne (IV), jossa Rei on 0-(t-20 butyylidifenyylisilyyli) , Re2 on aminoetyyli ja Re3 on H.
Atsidijohdannainen (20) (0,255 g; 0,477 x 10'3 mol) liuotetaan argonatmosfaarissa kaasuttomaan liuokseen, jossa on bentseeniä (0,1 M; kaasunpoisto argonvirtauksella 30 minuutin ajan; 5 ml). AIBN:ää (0,008 g; 0,047 x 10'3 mol) ja . 25 n-tributyylitinahydridiä (0,347 g; 1,19 x 10'3 mol) lisä tään huoneenlämpötilassa. Seosta kuumennetaan 80 °C:ssa viisi tuntia. Liuotin haihdutetaan alennetussa paineessa. Jäännös kromatografoidaan silikageelillä (gradientti CHC13-:MeOH, 50:1 - 10:1). Yhdiste (21) eristetään haalean kel- 30 täisenä öljynä (0,23 g; 0,452 x 10~3 mol; 95 %) . ^-NMR (CD-Cl3, 500 MHz, δ (ppm), J(Hz)): 2,12 (Η2·, ddd, 3J2.-i· = 6,9); 2,24 (H2., ddd, 3J2'-i' = 4,0); 2,38 (H3', m); 3,74 (H4 , ddd, 3J3'-4. = 8,0); 6,09 (Hr, dd) . MS (FD, m/e) : 508 (M+) .
51 113870 E. Yhdiste (22), rakenne (IV), jossa Rei on C(0)0H, Re2 on O-(t-butyylidifenyylisilyyli) ja Re3 on H.
Yhdiste (22) valmistettiin yleensä menetelmillä, jotka on kuvattu julkaisussa Tetrahedron Letters, 30(37): 5 4 969 - 4 972 (1989).
F. Yhdiste (23), rakenne (V), jossa Rei on O-(t-butyylidifenyylisilyyli) , Re2 on O-(t-butyylidifenyylisilyyli) ja Re3 on H.
Yhdiste (22) (2,205 g; 4,459 x 10~3 mol) liuotetaan 10 MeCN:iin (80 ml) ja THFriin (10 ml). Tähän liuokseen lisätään N-metyylimorfoliinia (0,496 g; 4,905 x 10"3 mol), N-hydraoksibentsotriatsolia (0,301 g; 2,229 x 10‘3 mol) ja 0-(lH-N-hydroksibentsotriatsoli-l-yyli)-N,N,N',N'-tetrametyy-liuroniumtetrafluoriboraattia (1,575 g; 4,9 χ 10'3 mol). 15 Seosta sekoitettiin 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Yhdiste (21) (2,264 g; 4,45 χ 10"3 mol), liuotettuna MeCN:iin (20 ml), lisätään N-metyylimorfoliinin (0,676 g; 6,688 x 10'3 mol) kanssa. Oltuaan 20 tuntia huoneenlämpötilassa, liuottimet poistetaan alennetussa paineessa. Jäännös liuo-20 tetaan CH2Cl2:iin (100 ml) ja NaH2P04:n vesiliuokseen (50 ml) . Orgaaninen faasi pestään NaH2P04:lla (2 x 50 ml) ja suolaliuoksella (2 x 50 ml) ja kuivataan Na2S04:lla. Liuotin haihdutetaan ja jäännös kromatografoidaan silika-geelillä (heksaani:AcOEt, 1:2). Yhdiste (23) eristetään 25 valkoisena kiinteänä aineena (4,11 g; 4,175 χ 10'3 mol; 93 %) . ^-NMR (CDC13, 500 Mhz, δ (ppm), J(Hz)): 2,34 (Η2·, ddd, 2J = 14,3, 3J21 -31 = 4,3, 3J2.-i- = 9,9); 4,01 (Hs·, m); 4,28 (H4., s); 4,55 (H3-, d) ; 6,07 (Hv, dd, 3Jv-2' = 6,5, 3Ji.2. = 3,8); 6,17 (Hv, dd, 3Jv-2· = 5,0). MS (CI; m/e) : 984 30 M+.
» G. Yhdiste (24), rakenne (V), jossa Eei on hydrok-syyli, Re2 on hydroksyyli ja Re3 on H.
Yhdiste (23) (1,292 g; 1,312 χ 10'3 mol) liuotetaan argonatmosfäärissä THF:iin (30 ml) . Etikkahappoa (0,236 g; 35 3,937 χ 10~3 mol) ja tetra-n-butyyliammoniumfluoridia (3,58 ml 1,1 M liuos THF:ssa; 3,937 χ 10'3 mol) lisätään.
113870 52
Kun seos on ollut 24 tuntia huoneenlämpötilassa, se haihdutetaan yhdessä tolueenin kanssa (3 x) alennetussa paineessa. Jäännös kromatografoidaan silikageelillä (AcOEt: MeOH, 20:1). Yhdiste (24) eristetään valkoisena kiinteänä 5 aineena (0,647 g; 1,27 x 10'3 mol; 97 %) . 3H-NMR (CD3OD, 500 MHz, δ (ppm), J (Hz) ) : 4,25 (H4., d, 3J4'-3· = 1,9); 6,05 (Hi-, dd, 3Ji'2' = 2,1, 3Ji1 -21 = 7,8) ; 6,21 (Hi<, dd, Ji'-2' = 5,9, 3Jl1 -2' = 8,4); 7,88 (H6, q) ; 8,03 (H6, q) .
H. Yhdiste (25), rakenne (V), jossa Rei on O-(dime-10 toksi tri tyyli), Re2 on hydroksyyli ja Re3 on H.
Yhdiste (24) (0,64 g; 1,261 x 10"3 mol) liuotetaan argonatmosfaarissa pyridiiniin (10 ml). Lisätään DMTCl:a (4,41-dimetoksitrifenyylimetyylikloridia; 0,428 g; 1,263 x 10'3 mol) . Kun on sekoitettu 17 tuntia huoneenlämpötilassa, 15 lisätään vielä DMTCl:a (0,428 g; 1,263 x 10'3 mol). Reak-tioseos tukahdutetaan MeOH:11a (1 ml) 40 tunnin kuluttua ja laimennetaan CH2Cl2:lla (60 ml) ja Na2C03:n vesiliuoksella (50 ml) . Orgaaninen faasi pestään suolaliuoksella (2 x 30 ml) ja kuivataan Na2S04:lla. Liuotin haihdutetaan yhdessä 20 tolueenin kanssa (3 x) alennetussa paineessa. Jäännös kromatografoidaan silikageelillä (AcOEt:MeOH, gradientti 50:1 10:1 + 1 % N-metyylimor f Oliini) . Yhdiste (25) (0,902 ; 1,11 x 10'3 mol; 88 %) eristetään valkoisena kiinteänä aineena. 3H-NM (CD3OD, 500 MHz, δ (ppm), J(Hz)): 4,23 (H4., d, 25 3 J41 -31 = 1,8); 6,06 (Hv, dd, 3Ji'-2' = 2,4, 3Ji'-2' = 7,5); 6,19 (Hi-, dd, 3Ji1 -21 = 5,0, 3Ji1 -21 = 9,0). MS (CI: m/e) : 809 (M+) .
I. Yhdiste (26), rakenne (V), jossa Rei on O-(dime-toksitrityyli), Re2 on O-(2-syaanietyyli-N,N,N',N'-tet-raisopropyylifosforidiamidyyli) ja Re3 on H.
30 Yhdiste (25) (0,89 g; 1,121 x 10'3 mol) lisätään argonatmosfaarissa liuokseen, jossa on 2-syaanietyyli-N, Ν,Ν'Ν'-tetraisopropyylifosforidiamidaattia (0,371 g; 1,233 x 10 3 mol) ja N,N'-di-isopropyyliammoniumtetrat-solidia (0,23 g; 1,345 x 10"3 mol) CH2Cl2:ssa (30 ml). Oltu-35 aan 18 tuntia huoneenlämpötilassa, lisätään vielä 2-syaanietyyli-N, N, N' ,N'-tetraisopropyylifosforidiamidaattia 53 113870 (0,371 g; 1,233 x 10'3 mol). Kun seos on ollut 24 tuntia huoneenlämpötilassa, se tukahdutetaan NaHC03:n vesiliuoksella (20 ml). Orgaaninen faasi pestään suolaliuoksella (2 x 30 ml) ja kuivataan Na2S04:lla. Kun liuotin on haihdu-5 tettu, jäännös kromatografoidaan silikageelillä (heksaani:-AcOEt, 1:2 + 1 % N-metyylimorfoliini) . Yhdiste (26) eristetään haalean keltaisena kiintenä aineena (0,624 g; 0,617 x 10'3 mol; 55 %) . 31P-NMR (CDC13, 101 MHz, δ (ppm): 148,17 ja 150,57.
10 Esimerkki 24
Yhdisteen (30), rakenteen (IV), jossa Rei on O-(t-butyylidifenyylisilyyli), Re2 on aminometyyli ja Re3 on H, synteesi A. Yhdiste (27), rakenne (IV), jossa Rei on O-(t-15 butyylidifenyylisilyyli) , Re2 on hydroks ime tyyli ja Res on H.
Aldehydi (15) (0,759 g; 1,541 x 10~3 mol), joka on valmistettu esimerkissä 22A-B kuvatulla tavalla, liuotetaan argonatmosfaarissa MeOH:iin (6 ml). Liuos jäähdytetään 20 0 °C:seen ja lisätään NaNH4:ä (0,291 g; 7,708 x 10'3 mol).
Oltuaan 30 minuuttia tässä lämpötilassa, seosta sekoitetaan 25 °C:ssa 20 tuntia. Tähän liuokseen lisätään NaH2P04:n vesiliuosta (30 ml). MeOH haihdutetaan alennetussa paineessa ja vesifaasi uutetaan CH2Cl2:lla (3 x 30 ml). Orgaaninen *. 25 faasi pestään suolaliuoksella (2 x 20 ml) ja kuivataan
Na2S04:lla. Kun liuotin on poistettu, jäännös kromatografoidaan silikageelillä (heksaani:AcOEt, 1:2). Yhdiste (27) eristetään valkoisena kiinteänä aineena (0,381 ; 0,77 x 10' 3 mol; 50 %) . XH-NMR (CDC13, 500 MHz, δ (ppm), J(Hz)): 2,14 30 (H2., ddd, 2J = 14,0, 3J2'-i· = 5,2, 3J2.3. = 8,8); 2,29 (H2., ddd, 3J21 -11 = 6,8, 3J21 -3' = 5,9); 2,60 (H3<, m) ; 3,94 (H4, dd) . MS (FD, m/e) : 495 (M+) .
113870 54 B. Yhdiste (28), rakenne (IV), jossa Rei on O-(t-butyylidifenyylisilyyli), RE2 on metoksi-p-tolueenisulfo-nyyli ja RE3 on H.
Yhdiste (27) (0,397 g; 0,802 x 10~3 mol) liuotetaan 5 argonatmosfaarissa CH2Cl3:een (15 ml) . Tähän liuokseen, joka on jäähdytetty 0 °C:seen, lisätään pyridiiniä (0,254 g; 3,21 x 10"3 mol), DMAP:a (0,294 g; 2,407 x 10'3 mol) ja tosyylikloridia (0,459 g; 2,407 x 10'3 mol). Kun seos on ollut 0 °C:ssa 10 minuuttia, sitä sekoitetaan huo-10 neenlämpötilassa. Analyyttinen ohutkerroskromatografia (heksaani:AcOEt, 1:1) osoittaa, että jäljellä on jonkin verran lähtöainetta. Siten lisätään vielä tosyylikloridia (0,306 g; 1,6 x 10"3 mol), pyridiiniä (0,127 g; 1,605 x 10~3 mol) ja DMAP:a (0,196 g; 1,6 x 10~3 mol). 40 tunnin kulut-15 tua tämä liuos laimennetaan CHCl3:lla (50 ml), pestään NaH2P04:n vesiliuoksella (2 x 40 ml), NaHC03:n vesiliuoksella (2 x 40 ml) ja suolaliuoksella (2 x 40 ml) ja kuivataan Na2S04:lla. Kun liuotin on haihduetettu alennetussa paineessa, jäännös kromatografoidaan silikageelillä (hek-20 saani:AcOEt, 2:1). Yhdiste (28) eristetään värittömänä kiinteänä aineena (0,429 g; 0,661 x 10'3 mol; 82 %) . 1H-NMR (CDC13, 500 MHz, δ (ppm), J(Hz)): 2,14 (Η2·, ddd, 2J = 14,8, 3J2--i' = 5,6, 3J2'-3< = 9,0); 2,22 (H2>, ddd, 3J2--i· = 6,8, 3J2.3. = 6,8); 2,84 (H3·, m); 3,85 (H4., ddd, 3J3.-4· = 7,0); 25 6,05 (Hi>, dd) . MS (FD, m/e) : 649 (M+) .
C. Yhdiste (29), rakenne (IV), jossa Rei on O-(t-butyylidifenyylisilyyli), RE2 on atsidometyyli ja Re3 on H.
Tosyyli johdannainen (29) (0,425 g; 0,655 x 10"3 mol) liuotetaan argonatmosfaarissa DMF:iin (15 ml). Tähän 30 liuokseen lisätään LiN3:a (0,16 g; 3,275 x 10’3 mol) ja Nal:a (0,196 g; 1,31 x 10'3 mol) huoneenlämpötilassa. Seosta sekoitetaan 20 tuntia 100 °C:ssa. Reaktiota seurataan analyyttisellä ohutkerroskromatografiällä (heksaani:AcOEt, 1:3). Kun reaktio on päättynyt, lisätään eetteriä (100 ml).
35 Tämä liuos pestään suolaliuoksella (3 x 50 ml) ja kuivataan Na2S04:lla. Suodattamisen jälkeen jäännös kromatografoidaan 113870 55 silikageelillä (heksaani:AcOEt, 2:1). Atsidijohdannainen (29) saadaan värittömänä lasina (0,262 g; 0,504 x 10‘3 mol; 77 %) . ^-NMR (CDCls, 500 MHz, δ (ppm), J(Hz)): 2,19 (Η2·, ddd, 2J = 14,3, 3J2'-3- = 8,9, 3J2'-r =5,5); 2,28 (H2-, ddd, 5 3 J21 -31 = 3J2'-i· = 6,5); 2,67 (H3., m); 3,37 (CH2-N3, d, 3J = 6,3); 7,46 (H6, q, 4J = 1,0). MS (FD, m/e) : 520 (M+) .
D. Yhdiste (30), rakenne (IV), jossa Rei on 0-(t-butyylidifenyylisilyyli), RE2 on aminometyyli ja Re3 on H.
At s idi johdannainen (29) (0,245 g; 0,471 x 10'3 mol) 10 liuotetaan argonatmosfaarissa kaasuttomaan bentseeniliuokseen (0,1 M; kaasunpoisto argonvirtsuksella 30 minuutin ajan). AIBN:ää (0,008 g; 0,0471 x 10“3 mol) ja nBu3SnH:ä (n-tributyylitinahydridiä (0,343 g; 1,178 x 10'3 mol) lisätään huoneenlämpötilassa. Seosta kuumennetaan 80 °C:ssa seitse-15 män tuntia. Analyyttinen ohutkerroskromatografia (heksaa ni :AcOEt, 1:1) osoittaa, että jonkin verran lähtöainetta on vielä jäljellä reaktioseoksessa. Siten lisätään AIBN:ä (0,008 g; 0,0471 x 10'3 mol). Reaktioseosta kuumennetaan vielä 17 tuntia 80 °C:ssa. Liuotin haihdutetaan alennetussa 20 paineessa. Jäännös (haalean keltainen öljy) kromatografoi- daan silikageelillä (tuike-kromatografia; gradientti
AcOEt :MeOH, 50:1 20:1 -» 10:1 sisältäen 1 % NEt3:a)
Amiini (30) eristetään valkoisena jauheena (0,196 g; 0,397 x 10'3 mol; 84 %) . ^-NMR (CD3OD, 500 MHz, δ (ppm), J(Hz)): 25 2,28 (2H2>, m); 2,58 (H3·, m); 2,70 (C3.-CH2NH2, dd, 2J = 12,2, 3J = 8,0); 2,82 (C3·-CH2-NH2, dd, 3J = 5,4); 6,11 (Hi·, dd, 3J = 5,9), 7,54 (He, q, 4J = 1,1). MS (FD, m/e): 494 (M+) .
« 56 1 13870
Esimerkki 25
Yhdisteen (42), rakenteen (VI), jossa Rex on O-(dime toksi tri tyyli ) , Re2 on O- (2-syaanietyyli-N,N,Nl, N*-tetraisopropyylifosforiamidyyli) ja Re3 on H.
5 CH, HHy>° rf° ΙρΎ REj (VI) A. Yhdiste (31), rakenne (IV), jossa Rei on hydrok-syyli, Re2 on O-(t-butyylidifenyylisilyyli) ja Re3 on H.
10 Yhdiste (31) valmistettiin yleisesti menetelmillä, jotka on kuvattu julkaisussa Tetrahedron Letters, 22(26): 2 641 - 2 644 (1982) .
B. Yhdiste (32), rakenne (IV), jossa Rei on hydrok-syyli, Re2 on O-(t-butyylidifenyylisilyyli) ja Re3 on 15 CH2OCH2Ph.
Sekoitettuun liuokseen, jossa oli yhdistettä (31) (3,53 g, 7,4 mmol) 15 ml:ssa kuivaa asetonitriiliä, lisättiin huoneenlämpötilassa argonatmosfaarissa DBU:ta (2,2 ml, 14,8 mmol), sen jälkeen bentsyylikioorimetyylieetteriä (2,0 20 g, 12,8 mmol). Kun reaktio oli ollut huoneenlämpötilassa 4 tuntia, se laimennettiin 150 ml :11a CH2Cl2:ta ja orgaaninen faasi pestiin kaksi kertaa 25 ml :11a 10-%:ista KHSC>4:n 57 113870 vesiliuosta, kerran 70 ml:lla H20:ta ja kerran 50 ml:lla suolaliuosta. Kun orgaaninen faasi oli kuivattu Na2S04:lla, se väkevöitiin alennetussa paineessa. Kromatografoilla jäännös silikageelillä (gradientti heksaani:AcOEt), saatiin 5 suojattu tymidiini (32) valkoisena vaahtona (3,21 g, 73 %).
XH NMR (CDC13, 300 MHz) δ: 1,01 (9H, s, 31-0'-SitBu) , 1,79 (3H, s, Me-5), 4,61 (2H, s, 0-CH2-Ph), 5,40 (2H, s, -N-CH2-O) .
C. Yhdiste (33), rakenne (IV), jossa Rei on 10 =CHC(0)0CH3, Re2 on O-(t-butyylidifenyylisilyyli) ja Res on CH2OCH2Ph.
Sekoitettuun liuokseen, jossa oli oksalyylikloridia (0,65 ml, 7,3 mmol) 25 mlrssa kuivaa CH2Cl2:ta -78 °C:ssa, argonatmosfaarissa, lisättiin liuos, jossa oli kuivaa 15 DMS0:a (1,05 ml, 14,6 mmol) 5 ml:ssa CH2Cl2:ta. Lisäys suoritetaan viiden minuutin aikana. Syntynyttä seosta sekoitetaan yksi tunti -78 °C:ssa, ja lisätään liuos, jossa on yhdistettä (32) (2,91 g, 4,84 mmol) 25 ml:ssa CH2Cl2:ta, 10 minuutin aikana. Kun reaktio on ollut tunnin -78 °C:ssa, 20 lisätään kuivaan trietyyliamiinia (4,1 ml, 29,2 mmol) ja reaktioseoksen annetaan lämmetä 0 °C:seen. Lisätään metok-sikarbonyylimetyleenitrifenyylifosforaania (2,45 g, 7,2 mmol) kiinteänä aineena ja reaktiota sekoitetaan huoneenlämpötilassa kaksi tuntia. 200 ml:n annos CH2Cl2:ta li-*; 25 sätään, sen jälkeen 50 ml H20:ta. Syntynyttä seosta sekoi tettiin 10 minuuttia ja kerrokset erotetaan. Orgaaninen kerros pestiin kahdella 50 ml:n erällä H20:ta ja kerran 50 ml :11a suolaliuosta. Orgaaninen kerros kuivattiin Na2S04:lla ja väkevöitiin alennetussa paineessa. Kromato-30 grafoimalla silikageelillä (4:1 heksaani/etyyliasetaatti) , saatiin a,β-tyydyttymätöntä metyyliesteriä (33) (2,95 g; 93 %) . ΧΗ NMR (CDCI3, 300 MHz) δ: 0,875 (9H, s, 3'-OSitBu) ; 5,66 (1H, dd, J = 16 Hz, J = 1,5 Hz, H-6'), 6,45 (1H, dd, J = 7 Hz, H-l1), 6,41 (1H, dd, J = 16 Hz ja J = 6 Hz).
35 58 113870 D. Yhdiste (34), rakenne (IV), jossa Rei on CH2-C(0)0CH3, Re2 on O- (t-butyylidif enyylisilyyli) ja Re3 on H.
Voimakkaasti sekoitettua liuosta, jossa oli yhdistettä (33) (2,72 g, 4,1 mmol) 85 ml:ssa MeOH:a, hydrattiin 5 vedyn kanssa (ilmanpaine) huoneenlämpötilassa jauhemaisen 10-%:isen Pd/C:n (960 mg) kanssa kolme päivää. Reaktioseos suodatettiin Si02-suodattimen läpi ja suodoskakku pestiin MeOH:lla (n. 100 ml) . Väkevöimällä suodos alennetussa paineessa, saatiin käsittelemätöntä yhdistettä (34) (2,1 g, 95 10 %) värittömänä vaahtona. Tämä aine käytettiin seuraavassa vaiheessa enempää puhdistamatta. ^-NMR (CDC13, 300 MHz) δ: 1,82 (3H, s, Me-5), 3,56 (3H, s, OMe), 6,25 (1H, dd, J = 6 Hz, H-l') , 6,95 (1H, s, H-6), 8,6 (1H, s leveä, N-H) .
E. Yhdiste (35), rakenne (IV), jossa Rei on CH2C(0)-15 OH, Re2 on O- (t-butyylidifenyylisilyyli) ja Re3 on H.
Liuokseen, jossa oli käsittelemätöntä yhdistettä (34) (2,1 g, 3,9 mmol) MeOH-.ssa (10 ml) huoneenlämpötilas sa, lisättiin 40 ml 2 M liuosta, jossa oli KOH:a MeOH/ H20:ssa (7:3). Oltuaan kaksi tuntia huoneenlämpötilassa, 20 liuos tehtiin happamaksi pH-arvoon 4 Dowex 50W x 4:llä (Fluka). Suspensio suodatettiin sitten ja kiinteä aine pestiin 150 ml :11a CH2Cl2:lla ja 50 ml :11a H20:ta. Kerrokset erotettiin. Vesikerros uutettiin CH2Cl2:lla. Yhdistetyt orgaaniset kerrokset pestiin 50 ml :11a H20:ta ja suolaliu-25 osta. Orgaaninen kerros kuivattiin Na2S04:lla ja väkevöi-tiin alennetussa paineessa, jolloin saatiin happoa (34) (1,27 g, 84 %) valkoisena jauheena. 1H NMR (CDC13, 300 MHz) δ: 1,82 (3H, s, Me-5), 3,9 (1H, m, H-4 ' ) , 6,25 (1H, s, H- 11) , 6,95 (1H, s, H-6) .
30 F. Yhdiste (36), rakenne (IV), jossa Rei on O-(tri- tyyli) , Re2 on atsido ja Res on H.
Yhdiste (36) valmistettiin yleisesti menetelmillä, jotka ovat kuvanneet Lin, T. ja W. Prusoff, J. Med. Chem. 21; 109 (1978).
35 113870 59 G. Yhdiste (37), rakenne (IV), jossa Rei on O-(tri-tyyli), Re2 on amino ja Re3 on H.
10 g:n erä (0,02 mol) atsidia (36) liuotetaan 100 ml:aan dioksaania. Kun on lisätty 0,5 g 10-%:ista Pd/ 5 C:tä, hydraus suoritetaan ilmanpaineessa 25 °C:ssa. Suodattamalla 16 tunnin kuluttua ja haihduttamalla alennetussa paineessa saatiin käsittelemätön amiini, joka kiteytettiin CH2C12/Et02:11a. Amino johdannaisen (37) saanto 7,0 g. ’'H-NMR (DMS0-d6) : 1,50 (s, 3H, CH3) ; 6,15 (m, 1H, H(l')); 7,50 (s, 10 1H, H (6) ) .
H. Yhdiste (38), rakenne (IV), jossa Ei on O-(tri-tyyli), Re2 on O- (t-butyylidifenyylisilyyli) ja RE3 on H.
(38)
Sekoitettuun seokseen, jossa oli yhdistettä (35) 15 (313 mg, 0,6 mmol) ja amiinia (37) (289 mg, 0,6 mmol)
5 ml:ssa kuivaa CH2Cl2:ta, argonatmosfaarissa, huoneenlämpötilassa, lisättiin N,N'-disykloheksyylikarbodi-imidiä (144 mg, 0,7 mmol) ja DMAP:tä (30 mg, 0,25 mmol). Oltuaan 12 tuntia huoneenlämpötilassa, seos laimennetaan 100 ml :11a 20 CH2Cl2:ta ja pestiin 20 ml:lla 0,1-N:ista HCl:a, 3 x 20 ml :11a H20:ta ja 2 x 20 ml :11a suolaliuosta. Orgaaninen kerros kuivattiin Na2S04:lla ja väkevöitiin alennetussa paineessa, jolloin saatiin öljyä (0,95 g), joka kromatogra-foitiin silikageelillä (98:2 kloroformi:metanoli), jolloin *; 25 saatiin dimeeri (38) (0,46 g, 78 %) valkoisena vaahtona. XH
NMR (CDCls, 300 MHz) δ: 1,32 ja 1,80 (3H, s, Me-5), 5,96 ja 6,25 (1H, dd, J = 6 Hz, H-l'), 6,52 (1H, d, J = 6 Hz, N-H (ketju)), 6,9 ja 7,5 (1H, s, H-6) , 9,18 ja 9,37 (1H, s leveä, N3-H).
30 I. Yhdiste (39), rakenne (VI), jossa Rei on hydrok- syyli, Re2 on O-(t-butyylidifenyylisilyyli) ja RE3 on H.
Liuosta, jossa oli yhdistettä (38) (1,01 g, 1,02 mmol) seoksessa, jossa oli etikkahappoa (1,6 ml) ja vettä (0,4 ml), kuumennettiin 80 °C:ssa yksi tunti 30 minuuttia.
35 Liuotin poistettiin alennetussa paineessa ja jäännös kroma-tografoitiin silikageelillä (CH2Cl2/MeOH/Et3N, 95:4:1), joi- 113870 60 loin saatiin yhdiste (39) (591 mg, 78 %) valkoisena vaahtona. ^-NMR (CDC13/ 300 MHz) δ: 1,76 ja 1,82 (3H, s, Me-5) , 6,02 ja 6,10 (1H, dd, J = 6 Hz, H-l'), 6,9 ja 7,6 (1H, s, H-6) , 7,05 (1H, d leveä, NH (ketju)), 9,82 ja 9,92 (1H, s 5 leveä, N3-H).
J. Yhdiste (40), rakenne (VI), jossa Rei on O-(dime toksi tri tyyli), Re2 on O- (t-butyylidifenyylisilyyli) ja Re3 on H.
Liuokseen, jossa oli yhdistettä (39) (860 mg, 1,15 10 mmol) 20 ml:ssa CH2Cl2:ta, huoneenlämpötilassa, argonatmos-faarissa, lisättiin DMAPrtä (210 mg, 1,7 mmol) ja Et3N:a (0,5 ml, 3,5 mmol), sen jälkeen dimetoksitrityylikloridia (575 mg, 1,7 mmol). Kun oli sekoitettu huoneenlämpötilassa 12 tuntia, lisättiin vielä dimetoksitrityylikloridia 15 (300 mg, 8,8 mmol). Oltuaan 24 tuntia huoneenlämpötilassa, reaktioseos laimennettiin CH2Cl2:lla (n. 100 ml) ja pestiin suolaliuoksella. Orgaaninen faasi kuivattiin Na2S04:lla ja väkevöitiin alennetussa paineessa, jolloin saatiin öljyä, joka puhdistettiin kromatografoimalla silikageelillä (CH2C-20 l2/MeOH/Et3N 94:5:1), jolloin saatiin yhdiste (40) (575 mg, 48 %) . *Η NMR (CDC13; 300 MHz) δ: 1,46 ja 1,92 (3H, S, Me- 5) , 3,88 (6H, s, OMe), 6,13 ja 6,4 (1H, s, H-l'), 7,07 (1H, s, H6), 9,5 ja 9,6 (1H, s leveä, N3-H).
K. Yhdiste (41), rakenne (VI), jossa Ei on O-(dime-25 toksi tri tyyli), RE2 on hydroksyyli ja RE3 on H.
Liuokseen, jossa oli yhdistettä (40) (405 mg, 0,39 mmol) 3 ml:ssa THF:a huoneenlämpötilassa, lisättiin tetra-n-butyyliammoniumfluoridia (141 mg, 0,5 mmol) yhdellä kertaa kiinteänä aineena. Oltuaan kolme tuntia huoneeniämpöti-30 lassa, liuotin haihdutettiin pois alennetussa paineessa ja jäännökset puhdistettiin kromatografoimalla silikageelillä (CH2Cl2/Et3N/metanoli, 93:1:6), jolloin saatiin yhdiste (41) (310 mg, 100 %) valkoisena vaahtona. 1H NMR (CDC13, 300 MHz) δ: 1,21 ja 1,73 (3H, s, Me-5), 3,64 (6H, s, OMe), 6,00 35 ja 6,22 (3H, dd, J = 6 Hz, H-l'), 7,25 ja 7,55 (1H, s, H- 6) .
113870 61 L. Yhdiste (42), rakenne (VI), jossa Rei on O-(dimetoksitrityyli), Re2 on O-(2-syaanietyyli-N,N,N',N'-tetraisopropyylifosforiamidyyli) ja RE3 on H.
Sekoitettuun liuokseen, jossa oli yhdistettä (41) 5 (310 mg, 0,39 mmol) 5 ml:ssa kuivaa CH2Cl2:a, joka sisälsi di-isopropyyliammoniumtetratsolidia (55 mg, 0,32 mmol), ar-gonatmosfaarissa, huoneenlämpötilassa, lisättiin 2-syaani-etyyli-Ν,Ν,Ν',N'-tetraisopropyylifosforiamidiittia (0,180 ml, 0,6 mmol). Oltuaan 13 tuntia huoneenlämpötilassa, reak-10 tioseos laimennettiin 100 ml :11a CH2Cl2:a, pestiin 5-%:isella NaHC03-vesiliuoksella, H20:lla ja suolaliuoksella. Na2S04:lla kuivaamisen jälkeen liuotin poistettiin alennetussa paineessa. Käsittelemätön öljy puhdistettiin kromato-grafoimalla silikageelillä (CH2Cl2/N-metyylimorfoliini/me-15 tanoli 98:1:1), jolloin saatiin yhdiste (42) (285 mg, 74 %) [joka haihdutettiin kolme kertaa yhdessä 150 ml:n kanssa kuivaa bentseeniä, jolloin saatiin valkoista vaahtoa]. 31P NMR (CDC13, 100 MHz) δ: 148,658 ja 148,070 ppm.
Esimerkki 26 20 Yhdisteen (48), rakenteen (IV), jossa Rei on C (O)OH, Re2 on O-(t-butyylidifenyylisilyyli) ja RE3 on H.
A. Yhdiste (43), rakenne (IV), jossa Rei on aminometyyli, Re2 on hydroksyyli ja Re3 on H.
·. 25 Yhdiste (43) valmistettiin yleisesti menetelmillä, jotka on kuvattu julkaisussa Chem. Coim. s. 422 (1968).
B. Yhdiste (44), rakenne (IV), jossa Rei on aminome tyyli, Re2 on O- (t-butyylidimetyylisilyyli) ja Re3 on H.
30 Seokseen, jossa oli käsittelemätöntä aminoalkoholia · ‘ (43) (1,40 g, 5,5 mmol) kuivassa DMF:ssa (10 ml) ja kui vassa CH2Cl2:ssa (5 ml) , lisättiin huoneenlämpötilassa ar-gonatmosfaarissa imidatsolia (520 mg, 7,6 mmol) ja t-bu-tyylidimetyylikloorisilaania (1,08 g, 7,2 mmol). Syntynyttä 35 seosta sekoitettiin kahdeksan tuntia huoneenlämpötilassa ja lisättiin lisää reagensseja: imidatsolia (210 mg, 113870 62 3,1 mmol); t-butyylidimetyylikloorisilaania (420 mg, 2,8 mmol). 22 tunnin kuluttua liuottimet poistettiin kor-keatyhjössä (n. 10-2 mmHg, 45 °C) . Käsittelemätön kiinteä aine puhdistettiin silikageelillä (CH2Cl2/MeOH/Et3N) , jol-5 loin saatiin yhdiste (44) (1,70 g, 83 %) haalean keltaisena vaahtona. ’Ή NMR (CDC13; 300 MHz) δ: 0,00 (6H, s, 3’-OSiMe2) ; 0,81 (9H, s, 3'-O'SitButyyli) ; 1,75 (2H, m, H-5'); 1,97 (3H, s, MeT); 2,15 (2H, m, H-2'), 3,40 (2H, m, H-6'); 3,74 (1H, m, H-4 1 ) ; 4,05 (1H, m, H-3'); 6,07 (1H, t, J = 10 6,5 Hz; H-l'); 7,06 (1H, s, H-6), 8,10 (1H, S, N-H).
C. Yhdiste (45), rakenne (IV), jossa Rei on CH=CH2, Re2 on O- (t-butyylidifenyylisilyyli) ja Re3 on CH2OCH2Ph.
Sekoitettuun liuokseen, jossa oli oksalyylikloridia (2,2 ml, 25 mmol) 45 ml:ssa kuivaa CH2Cl2:a, -78 °C:Ssa, 15 argonatmosfaarissa, lisättiin liuos, jossa oli kuivaa DMS0:a (3,6 ml, 50 mmol) 15 mlrssa CH2Cl2:a, viiden minuutin aikana. Kun oli sekoitettu tunti -78 °C:ssa, lisättiin liuos, jossa oli yhdistettä (32) (10 g, 10,64 mmol), joka oli valmistettu esimerkkien 25A-B mukaisesti ja joka oli 50 20 ml:ssa CH2Cl2:a. Oltuaan 45 minuuttia -78 °C:ssa, lisättiin kuivaa trietyyliamiinia (14,8 ml, 0,1 mmol) viiden minuutin aikana, ja reaktioseoksen annettiin lämmetä -30 °C:seen tunnin ajan. Viimeksi mainittuun liuokseen lisättiin 78 °C:ssa liuos, jossa oli metyleenitrifenyylifosforaania, 25 joka oli valmistettu lisäämällä 1,6-N:ista heksaanissa olevaa n-butyylilitiumia (62,5 ml, 0,1 mol) sekoitettuun suspensioliuokseen, jossa oli metyylitrifenyylifosfonium-bromidia (35,7 g, 0,1 mol) 150 ml:ssa kuivaa THF:a -78 °C:ssa, sen jälkeen sekoittamalla huoneenlämpötilassa 30 kaksi tuntia. Syntyneen seoksen annettiin lämmetä huoneenlämpötilaan ja sitä sekoitettiin kaksi tuntia. Sitten lisättiin 100 ml H20:ta ja seos väkevöitiin alennetussa paineessa noin 150 ml:ksi, minkä jälkeen se laimennettiin 300 ml :11a eetteriä. Orgaaninen kerros pestiin vedellä ja suo-35 laliuoksella ja kuivattiin natriumsulfaatilla. Poistamalla liuotin, saatiin öljyä, joka puhdistettiin kromatografoi- 113870 63 maila silikageelillä (heksaani-etyyliasetaatti 4:1), jolloin saatiin yhdiste (45) (3,55 g, 35 %) . XH NMR (CDC13; 300 MHz) δ: 1,02 (9H, s, 3' -OSitBu) ; 1,80 (3H, s, Me-5); 4,62 (2H, s, Ph-CH2-0) ; 5,5 (1H, m, H-5'); 6,32 (1H, dd, 5 J = 6,0 Hz, H-11); 6,95 (1H, s, H-8).
D. Yhdiste (46), rakenne (IV), jossa REi on hydrok-simetyyli, Re2 on O-(t-butyylidifenyylisilyyli) ja Re3 on CH2OCH2Ph.
Sekoitettuun liuokseen, jossa oli yhdistettä (45) 10 (252 mg, 0,42 mmol) 5 ml:ssa kuivaa THF:a ja joka oli jääh
dytetty 0 °C:seen, argonatmosfaarissa, lisättiin 0,25 ml (2,5 mmol) 10-M:ista dimetyylisulfidikompleksia, joka oli THF:ssa. Oltuaan kaksi tuntia 0 °C:ssa, seos tukahdutettiin lisäämällä hitaasti, jatkuvasti 4 ml 2-N:ista NaOH-vesi-15 liuosta ja 1 ml 30-%:ista H202:n vesiliuosta. Reaktioseok-sen annettiin lämmetä huoneenlämpötilaan 10 minuutin ajan, se laimennettiin 50 ml :11a CH2Cl2:a ja pestiin H20:lla ja suolaliuoksella. Kuivaamisen (MgS04) jälkeen orgaaninen faasi väkevöitiin alennetussa paineessa. Kromatografoimalla 20 silikageelillä (heksaani-etyyliasetaatti, 2:1 - 1:1), saatiin yhdiste (46) (186 mg, 72 %) värittömänä öljynä, ΧΗ NMR
(CDC13) , 300 MHz) δ: 1,01 (9H, s, 31-OSitBu) , 1,80 (3H, s, Me-5), 3,51 (2H, m, CH2-6'), 5,41 (2H, s, 0-CH2-N) , 6,27 (1H, dd, J = 6 Hz, H-l'), 6,87 (1H, s, H-6). ί 25 E. Yhdiste (46), rakenne (IV), jossa Rei on hydrok- simetyyli, Re2 on 0-(t-butyylidifenyylisilyyli) ja Re3 on H.
Voimakkaasti sekoitettua liuosta, jossa oli yhdistettä (46) (1,03 g, 1,67 mmol) 37 ml:ssa MeOH:a, hydrat- tiin (ilmanpaine) huoneenlämpötilassa jauhemaisen 10-%risen 30 Pd/C:n kanssa (520 mg) kolme päivää. Reaktioseos suodatet-“ tiin silikageelisuodattimen läpi. Kiinteä aine pestiin
MeOH:lla (100 ml) . Suodokseen lisättiin KOH:a (n. 200 mg, 3,6 mmol) ja syntynyttä seosta sekoitettiin yksi tunti huoneenlämpötilassa. Liuos väkevöitiin alennetussa paineessa 35 noin 20 ml:ksi ja laimennettiin CH2Cl2:lla (100 ml), ja orgaaninen faasi pestiin H20:lla ja suolaliuoksella. Kuivaa- 113870 64 misen (MgS04) jälkeen liuotin poistettiin alennetussa paineessa, jolloin saatiin yhdiste (47) (742 mg, 90 %) . Tämä aine käytettiin seuraavassa vaiheessa enempää puhdistamatta. XH NMR (CDC13, 300 MHz) δ: 0,94 (9H, s, 3 '-OSitBu) , 5 1,73 (s, 3H, Me-5), 3,45 (2H, m, CH2-6'), 6,17 (1H, dd, J = 6,5 Hz, H-l'), 6,85 (1H, s, H6).
F. Yhdiste (48), rakenne (IV), jossa Rei on C{0)0H, Re2 on 0-(t-butyylidifenyylisilyyli) ja Res on H.
Voimakkaasti sekoitettuun liuokseen, jossa oli yh-10 diste (47) (710 mg, 1,5 mmol) 5 ml:ssa kuivaa DMF:a huo neenlämpötilassa, argonatmosfaarissa, lisättiin pyridinium-dikromaattia (PDC) (1,5 g, 4 mol). 14 tunnin kuluttua ruskea liuos laimennettiin 35 ml :11a EtOAc:a ja sitä sekoitettiin viisi minuuttia. Suspensio suodatettiin silikageeli-15 suodattimen läpi ja kiinteä aine pestiin 75 ml :11a EtOAc:a. Liuottimet haihduttamalla ja kromatograformalla jäännös silikageelillä (etyyliasetaatti-metanoli 95:5), saatiin happoa (48). XH NMR (CDC13, 300 MHz) δ: 1,09 (9H, s, 3 '-0-SitBu), 1,83 (3H, s, Me-5), 2,38 (2H, m, CH2-5'), 6,32 (1H, 20 dd, J = 6,5 Hz, H-l'), 7,23 (1H, s, H-6).
Esimerkki 27
Yhdisteen (50), rakenteen (IV), jossa Rei on C(O)- CH3, Rw2 on O-t-butyylidifenyylisilyyli ja Res on CH2OCH2Ph, synteesi.
25 A. Yhdiste (49), rakenne (IV), jossa Rei on =(1,3- ditian-2-yyli), Re2 on 0-(t-butyylidifenyylisilyyli) ja Re3 on CH2OCH2Ph.
Sekoitettuun liuokseen, jossa oli oksalyylikloridia (2,2 ml, 25 mmol) 45 ml:ssa kuivaa CH2Cl2:a -78 °C:ssa, ar-30 gonatmosfaarissa, lisättiin liuos, jossa oli kuivaa DMSO (3,6 ml, 50 mmol) 15 ml:ssa CH2Cl2:ssa, viiden minuutin aikana. Kun oli sekoitettu yksi tunti -78 °C:ssa, liuos, jossa oli yhdistettä (32) (10 g, 10,64 mmol) 50 ml:ssa CH2Cl2:a, lisättiin 20 minuutin aikana. Oltuaan 45 mi-35 nuuttia -78 °C:ssa, lisättiin kuivaa trietyyliamiinia (14,8 ml, 0,1 mol) viiden minuutin aikana, ja reaktioseok- 113870 65 sen annettiin lämmetä 30 °C:seen tunnin ajan. Viimeksi mainittuun liuokseen lisättiin -78 °C:ssa liuos, jossa oli fosfoniumylidiä [valmistettu lisäämällä 0,5-N:ista kalium-bis(trimetyylisilyyli)amidia, joka oli tolueenissa (85 ml, 5 42,2 mmol), sekoitettuun suspensioon, jossa oli 1,3-ditian- 2-yylitrifenyylifosfoniumkloridia (16 g, 38,4 mmol) 135 ml:ssa kuivaa THF:a -78 °C:ssa, sen jälkeen sekoittamalla huoneenlämpötilassa kolme tuntia]. Syntyneen seoksen annettiin lämmetä huoneenlämpötilaan ja sitä sekoitet-10 tiin kaksi tuntia. Sitten lisättiin 300 ml CH2Cl2:a ja 100 ml H20:ta. Seosta sekoitettiin 10 minuuttia ja kerrokset erotettiin. Vesikerros uutettiin 200 ml :11a CH2Cl2:ta. Yhdistetyt orgaaniset kerrokset pestiin suolaliuoksella, kuivattiin MgS04:lla ja väkevöitiin alennetussa paineessa. 15 Jäännös puhdistettiin kromatografoimalla silikageelillä (heksaani-EtOAc), jolloin saatiin yhdiste (49) (10,1 g, 87 %) , MS (FD; m/e) : 701 (M+) .
B. Yhdiste (50), rakenne (IV), jossa REi on C(O)- OCH3, Re2 on O-(t-butyylidifenyylisilyyli) ja Re3 on 20 CH2OCH2Ph.
Sekoitettuun liuokseen, jossa oli yhdistettä (49) (1,3 g, 1,85 mmol) MeOH:H20:ssa (9:1; 50 ml), palautusjääh-dytyslämpötilassa, argonatmosfaarissa, lisättiin merkuri-kloridia (2,9 g, 10,7 mmol). 40 minuutin kuluttua reak-: : 25 tioseos jäähdytettiin huoneenlämpötilaan, suolat suodatet tiin, emäliuos väkevöitiin alennetussa paineessa ja jäännös laimennettiin 100 ml :11a CH2Cl2:a. Orgaaninen kerros pestiin kaksi kertaa 30 ml :11a H20:ta ja kerran suolaliuoksella. MgS04:lla kuivaamisen jälkeen liuotin poistettiin ja 30 jäännös puhdistettiin kromatografoimalla silikageelillä '* (heksaani-etyyliasetaatti, 7:3), jolloin saatiin yhdiste (50). XH NMR (CDCI3, 300 MHz) δ: 1,02 (9H, s, 3 '-OSitBu) , 1,80 (3H, s, Me-5) , 2,28 (2H, m, CH2-5'), 3,52 (3H, s, MeO) , 5,41 (2H, s, 0-CH2-N) , 6,29 (1H, dd, J = 6,4 Hz, H-35 1'), 7,03 (1H, H-6).
113870 66
Arviointi
Menetelmä 1
Hybridisaatioanalyysi
Keksinnön oligonukleotidin, oligonukleotidianalogin 5 tai oligonukleosidin suhteellista kykyä sitoutua komplementaarisiin aminohappoihin voidaan verrata siten, että määritetään tietyn hybridisaatiokompleksin sulampislämpötila. Sulamislämpötila (Tm), kaksoisjuosteiselle RNA:lie ominainen fysikaalinen ominaisuus, tarkoittaa sitä lämpötilaa 10 Celsius-asteina, jossa on mukana 50 % kierteistä muotoa suhteessa rihmamuotoon (hybridisoitumaton). Tm mitataan UV-spektriä käyttäen ja määritetään hybridisäätiön muodostus ja hajoaminen (sulaminen). Emästen pinoutumisen, joka ilmenee hybridisäätiön aikana, mukana seuraa UV-absorbtion 15 vähentyminen (hypokromisaatio). Siten UV-absorbtion väheneminen on osoituksena suuremmasta Tm-arvosta. Mitä suurempi on Tm, sitä suurempi on juosteiden sitoutumisvahvuus. Ei-Watson-Crick-emäsparien muodostumisella on voimakas epästa-biloiva vaikutus Tm-arvoon. Siten emäsparien muodostumisen 20 on oltava ehdottoman tarkkaa, jotta vastaoligonukleotidi tai oligonukleosidi sitoutuu optimaalisesti sen kohde-KNA:hän.
A. Oligonukleotidianalogien hybridisaation termodynamiikan arviointi 25 Keksinnön oligonukleotidianalogien kyky hybridisoi- tua niiden komplementaarisiin RNA- tai DNA-järjestyksiin, voidaan määrittää termisellä sulamisanalyysillä. RNA-komp-lementti syntetisoidaan T7 RNA -polymeraasista ja DNA-mal-line-promoottorista, joka on syntetisoitu Applied Biosys-30 tems, Inc. 380B -nukleiinihapposyntetisaattorilla. RNA-laji puhdistetaan ionivaihdolla, käyttäen FPLC:tä (LKB Pharmacia, Inc.). Antisense-oligonukleotidianalogit lisätään joko RNA- tai DNA-komplementiin stökiömetrisinä kon-sentraatioina, ja absorbanssi (260 nm) -hyperkromisuutta 35 sen jälkeen, kun kahdentuminen satunnaiseen kierteen muu- toskohtaan on tapahtunut, seurataan Gilford Response II - 113870 67
spektrofotometriä käyttäen. Nämä mittaukset suoritetaan puskurissa, jossa on 10 mM Na-fosfaattia, pH 7,4, 0,1 mM
EDTA:a ja NaCl:a, jolloin ionivahvuudeksi saadaan joko 0,1 M tai 1,0 M. Tietoja voidaan käsitellä esittämällä graafi-5 sesti l/Tm ln[Ct]:n suhteen, jossa [Ct] on kokonaisoligo-nukleotidikonsentraatio.
Termodynaamiset parametrit määritetään tämän analyysin perusteella. Perustuen saatuihin tietoihin, jotka koskevat muodostuneen hetero-kahdentuman kahdentumisen 10 pysyvyyttä, muunneltujen sidosten sijoittumisesta oligonuk-leotidianalogeihin arvioidaan niiden vaikutusta kierteen pysyvyyteen. Muunnelmilla, jotka muuttavat huomattavasti hybridin pysyvyyttä, ilmenee vapaan energian (delta G) vähenemistä, ja tehdään päätelmiä, jotka koskevat niiden 15 käyttökelpoisuutta antisense-oiigonukleotideina.
B. Oligonukleotidianalogien hybridisaation tarkkuus
Keksinnön antisense-oligonukleotidianalogien kyky hybridisoitua ehdottomalla tarkkuudella kohde-mRNA:hän voidaan osoittaa Northern-tahra-analyysillä, joka suoritetaan 20 puhdistetulle kohde-mRNA:lie kokonaissolu-RNA:n läsnä ollessa. Kohde-mRNA syntetisoidaan vektorista, joka sisältää cRNA:n kohde-mRNA:ta varten, joka sijaitsee juosteessa T7 RNA -polymeraasipromoottorin alapuolella. Syntetisoidulle mRNA:lie suoritetaan elektroforeesi agaroosigeelissä ja se *: 25 siirretään sopiva-alustaiseen membraaniin (esim. nitrosel- luloosa). Alustamembraani salvataan ja sitä tutkitaan koet-timella, käyttäen [32P]-merkattuja oligonukleotidianaloge-ja. Rihmaisuus määritetään replikaattitahroilla ja pesten joko kohotetuissa lämpötiloissa tai ionivahvuudeltaan al-30 haisemmassa pesupuskurissa. Autoradiografia suoritetaan he-* terokahdentumamuodostuksen läsnäolon määrittämiseksi ja au- toradiogrammi kvantitoidaan laserdensitometrillä (LKB Pharmacia, Inc.). Hybridimuodostuksen spesifisyys määritetään eristämällä kokonaissolu-RNA standardimenetelmiä käyttäen 35 ja sen analyysi agaroosi-elektroforeesia käyttäen, kalvossa tapahtuva siirtyminen ja tutkailu koetinta käyttäen 113870 68 merkityillä oligonukleotidianalogeilla. Rihmaisuus määritetään etukäteen muuntelemattomalle vastaoligonukleotidille, ja käytetyt olosuhteet ovat sellaiset, että ainoastaan spesifinen kohde-mRNA voi muodostaa heterokahdentuman oligo-5 nukleotidianalogin kanssa.
Menetelmä 2
Nukleaasin kesto A. Oligonukleotidianalogien seerumin ja sytoplasman nukleaasien keston arviointi 10 Keksinnön oligonukleotidianalogien kestävyyttä see rumin nukleaaseille voidaan arvioida inkuboimalla oligonuk-leotidianalogia väliaineessa, joka sisältää erilaisia kon-sentraatioita vasikkasikiön seerumia tai aikuisen ihmisen seerumia. Merkattuja oligonukleotidianalogeja inkuboidaan 15 erilaisia aikoja, niitä käsitellään proteaasi K:11a ja sitten ne analysoidaan geelielektroforeesilla 20-%:11a polyak-ryyliamiiniurea-denaturoivilla geeleillä ja tämän jälkeen autoradiografiällä. Autoradiogrammit kvantitoidaan laser-densitometrillä. Perustuen muunnellun sidoksen sijaintiin 20 ja oligonukleotidin tunnettuun pituuteen, on mahdollista määrittää tietyn muunnelman vaikutus nukleaasihajotukseen. Sytoplasman nukleaaseille voidaan käyttää HL 60 - so lui inj aa. Post-mitokondriaalinen sakan yläpuolella oleva neste voidaan valmistaa differentiaalisentrifugoimalla, ja 25 merkattuja oligonukleotidianalogeja inkuboidaan tässä sakan yläpuolelta saadussa nesteessä erilaisia aikoja. Inkuboin-nin jälkeen oligonukleotidianalogeista arvioidaan edellä seerumin nukleolyyttiselle hajoamiselle kuvattua hajoamista. Autoradiografiästä saadut tulokset kvantitoidaan muun-30 telemattornien ja keksinnön oligonukleotidianalogien vertai lemiseksi.
B. Oligonukleotidianalogien spesifisten endo- ja ekso-nukleaasien keston arviointi
Luonnon oligonukleotidien ja keksinnön oligonukleo-35 tidianalogien kestoa spesifisille nukleaaseille (eli endonukleaasit, 3',5'-ekso- ja 5',3'-eksonukleaasit) voi- 69 1ΠΤ3Η70 daan arvioida, kun halutaan määrittää muunnellun sidoksen tarkka vaikutus hajoamiseen. Oligonukleotidianalogeja in-kuboidaan määritellyissä reaktiopuskureissa, jotka ovat spesifisiä erilaisille valituille nukleaaseille. Sen jäl-5 keen, kun tuotteita on käsitelty proteaasi K:11a, lisätään ureaa ja suoritetaan analyysi 20-%:isillä polyakryyliami-digeeleillä, jotka sisältävät ureaa. Geelituotteita tutkitaan visuaalisesti värjäämällä ne Stains All -reagenssilla (Sigma Chemical Co.). Laserdensitometriä käytetään hajoa-10 misen määrän kvantitointiin. Muunnellun sidoksen vaikutukset määritetään spesifisille nukleaaseille ja niitä verrataan tuloksiin, jotka on saatu seerumi- ja sytoplasmasys-teemeistä.
Menetelmä 3 15 5-lipo-oksigenaasianalyysi# terapeuttisia aineita ja kokeita A. Terapeuttiset aineet
Terapeuttista käyttöä varten eläintä, jolla epäillään olevan sairaus, jolle on luonteenomaista ylenmääräinen 20 tai epänormaali 5-lipo-oksigenaasitarjonta, käsitellään siten, että annetaan tämän keksinnön mukaisia oligonukleotidianalogeja. Perustiedot omaava asiantuntija voi helposti määrittää optimaaliset annostukset, antomenetelmät ja toistojen määrät. Tällaista hoitoa jatketaan tavallisesti niin :* 25 kauan, kunnes joko hoito tehoaa tai saavutetaan sairausti lassa kohentumista. Pitkäaikainen hoito on mahdollista joissakin sairauksissa.
B. In vitro -kokeet 5-lipo-oksigenaasin solukokeissa käytetään edulli-30 sesti ihmisen promyelosyyttisiä leukemiasolulinjaa HL-60.
·* Nämä solut voidaan saada erilaistumaan joko monosyytin kal taiseksi soluksi tai neutrofiilin kaltaiseksi soluksi erilaisilla tunnetuilla aineilla. Näiden solujen käsittelyn l,3-%:isella dimetyylisulfoksidilla, DMSO, tiedetään edis-35 tävän solujen erilaistumista neutrofiileiksi. Nyt on havaittu, että kanta-HL-60-solut eivät syntetisoi havaitta- 70 113870 via 5-lipo-oksigenaasiproteiinitasoja tai eritä leukotriee-nejä (5-lipo-oksigenaasista polveutuva tuote). Solujen erilaistamisesta DMSO:lla saadaan aikaan 5-lipo-oksigenaa-siproteiinin ja leukotrieenin biosynteesi 48 tunnin kulut-5 tua DMSO:n lisäämisestä. Siten 5-lipo-oksigenaasiproteiini-synteesin aiheuttamista voidaan käyttää hyväksi koejärjestelmänä analysoitaessa vastaoligonukleotidianalogeja, jotka puuttuvat 5-lipo-oksigenaasisynteesiin näissä soluissa.
Toisessa koejärjestelmässä, jolla tutkitaan vasta-10 oligonukletideja, käytetään hyväksi sitä tosiasiaa, että 5-lipo-oksigenaasi on "itsemurha"-entsyymi, sillä se inakti-voi itsensä sen jälkeen, kun se on reagoinut substraatin kanssa. Erilaistuneiden HL-60- tai muiden solujen, joissa ilmenee 5-lipo-oksigenaasia, käsittely 10 μΜ A23187:llä, 15 kalsiumionoforilla, edistää 5-lipo-oksigenaasin siirtymistä sytosolista kalvoon, minkä jälkeen entsyymi aktivoituu. Aktivoitumisen ja useiden katalyysikierrosten jälkeen entsyymistä tulee katalyyttisesti inaktiivinen. Siten solujen käsittely kalsiumionoforilla inaktivoi endogeenisen 5-lipo-20 oksigenaasin. Soluilta menee noin 24 tuntia palautua A23187-käsittelystä, mitattuna niiden kykynä syntetisoida leukotrieeni B4:ää. Oligonukleotidianalogeista, jotka on kohdistettu 5-lipo-oksigenaasia vastaan, voidaan tutkia niiden vaikutusta kahdessa HL-60-mallijärjestelmässä, käyt-: 25 täen seuraavia kvantitatiivisia kokeita. Kokeet kuvataan suorimmasta mitasta, joka kuvaa 5-lipo-oksigenaasiproteii-nisynteesin estoa vahingoittumattomissa soluissa, enemmän alajuoksulla tapahtuviin tapahtumiin, kuten mittaan, joka kuvaa 5-lipo-oksigenaasiaktiivisuutta vahingoittumattomissa 30 soluissa.
Suorin vaikutus, joka oligonukleotidianalogeilla voi olla vahingoittumattomiin soluihin ja joka voidaan helposti kvantitoida, on 5-lipo-oksigenaasiproteiinisynteesin spesifinen esto. Tämän tekniikan suorittamiseksi, soluja 35 voidaan merkata 35S-metioniinilla (50 μΟί/πιΙ) kaksi tuntia 37 °C:ssa juuri syntetisoidun proteiinin merkkaamiseksi.
113870 71
Solut uutetaan solujen kaikkien proteiinien solubili-soimiseksi, ja 5-lipo-oksigenaasi immuno-saostetaan 5-lipo-oksigenaasivasta-aineella, sen jälkeen eluoidaan proteiini A Sepharose -pallosista. Immuno-saostetut proteiinit liuo-5 tetaan uudelleen SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja ne autoradiografoidaan. Immuno-saostetun 5-lipo-oksige-naasin määrä kvantitoidaan tuikedensitometrillä.
Odotettavissa oleva tulos näistä tutkimuksista voisi olla seuraavanlainen. Sen 5-lipo-oksigenaasiproteiinin 10 määrä, joka on immuno-saostunut kontrollisoluista, voitaisiin normalisoida 100 prosentiksi. Solujen käsittely 1 μΜ, 10 μΜ ja 30 μΜ-.lla tehokkaita oligonukleotidianalogeja 48 tunnin ajan vähentäisi immuno-saostunutta 5-lipo-oksigenaa-sia vastaavasti 5 %, 25 % ja 75 %:lla kontrollista.
15 5-lipo-oksigenaasientsyymiaktiivisuuden mittausta soluhomogenaateissa voitaisiin myös käyttää kvantitoitaessa mukana olevaa entsyymimäärää, joka pystyy syntetisoidaan leukotrieenejä. Radiometristä koetta on nyt kehitetty 5-lipo-oksigenaasientsyymiaktiivisuuden kvantitoimiseksi so-20 luhomogenaateissa käänteisfaasi-HPLCra käyttäen. Solut rikotaan ultraäänellä puskurissa, joka sisältää proteaasin estäjiä ja EDTArta. Soluhomogenaattia sentrifugoidaan nopeudella 10 000 x g 30 minuuttia ja sakan yläpuolella olevasta nesteestä analysoidaan 5-lipo-oksigenaasiaktiivisuus.
:*· 25 Sytosolin proteiineja inkuboidaan 10 μΜ 14C-arakidonihapon, 2 mM ATP :n, 50 μΜ vapaan kalsiumin, 100 μg/ml
fosfatidyylikoliinin ja 50 mM bis-Tris-puskurin kanssa, pH
7,0, viisi minuuttia 37 °C:ssa. Reaktiot tukahdutetaan lisäämällä yhtä suuri tilavuus asetonia, ja rasvahapot 30 uutetaan etyyliasetaatilla. Substraatti ja reaktiotuotteet erotetaan käänteisfaasi-HPLC:llä Novapak C18 -kolonnissa (Waters Inc., Millford, MA). Radioaktiiviset piikit detek-toidaan Beckman malli 171 -radiokromatografidetektorilla. Arakidonihapon määrää, joka on muuttunut di-HETE:iksi ja 35 mono-HETE:iksi, käytetään mittana 5-lipo-oksigenaasiaktii- suudelle.
113870 72
Odotettavissa oleva tulos, kun DMSO-.lla erilaistuneiksi saatettuja HL-60-soluja käsitellään 72 tuntia tehokkailla oligonukleotidianalogeilla konsentraatioina, jotka ovat 1 μΜ, 10 μΜ ja 3 0 μΜ, voisi olla seuraavanlainen.
5 Kontrollisolut hapettavat 200 pmol arakidonihappoa/-5 min/106 solua. Soluja, joita on käsitelty 1 μΜ, 10 μΜ ja 30 μΜ:11a tehokkaita oligonukleotidianalogeja, voisivat hapettaa vastaavasti 195 pmol, 140 pmol ja 60 pmol arakidoni-happoa/5 min/106 solua.
10 On kehitetty kvantitatiivinen kilpaileva entsyymi- sidoksellinen immunosorbenttikoe (ELISA), jolla mitataan 51-lipo-oksigenaasikokonaisproteiinia soluissa. Ihmisen 5-lipo-oksigenaasia, joka ilmenee E. coli:ssa ja joka on puhdistettu uuttamalla, Q-Sepharosea, hydroksiapatiittia ja 15 käänteisfaasi-HPLC:a käytetään standardina ja primaarisena antigeeninä mikrotiitterilevyjen peittämiseksi. 25 ng:n erä puhdistettua 5-lipo-oksigenaasia sidotaan mikrotiitterile-vyihin yön yli 4 °C:ssa. Kolot salvataan 90 minuutiksi 5-%:isella vuohen seerumilla, joka on laimennettu 20 mM:iin 20 Tris.HCl-puskuria, pH 7,4, siten, että mukana on 150 mM NaCl (TBS):ä. Solu-uutteita (0,2 % Triton X 100, 12 000 x g 30 minuuttia) tai puhdistettua 5-lipo-oksigenaasia inkuboi-tiin 1:4 000 laimennoksessa, jossa oli 5-lipo-oksigenaasin polykloonaalista vasta-ainetta kokonaistilavuudessa, joka 25 oli 100 μΐ, mikrotiitterikoloissa 90 minuutin ajan. Vasta-aineet valmistettiin immunisoimalla kaneja puhdistetulla ihmisen rekombinantti-5-lipo-oksigenaasilla. Kolot pestään TBS:llä, joka sisälsi 0,05 % Tween 20:tä (TBST), sitten niitä inkuboidaan 100 μ1:η kanssa 1:1 000 laimennoksella 30 peroksidaasikonjugoitua vuohen anti-kani IgG:tä (Cappel Laboratories, Malvern, PA) 60 min 25 °C:ssa. Kolot pestään TBST:llä ja peroksidaasilla merkatun toisen vasta-aineen määrä määritetään kehittämällä tetrametyylibentsidiinillä.
Odotettavissa olevat tulokset tällaisesta kokeesta, 35 kun käytetään 30-meeri-oligonukleotidianalogia 1 μΜ, 10 μΜ ja 30 μΜ:^, voisivat olla vastaavassa järjestyksessä 113870 73 30 ng, 18 ng ja 5 ng 5-lipo-oksigenaasia per 106 solua käsittelemättömille soluille, jotka sisältävät noin 34 ng 5-lipo-oksigenaasia.
5-lipo-oksigenaasin biosynteesin eston nettovaiku-5 tus on stimuloiduista soluista vapautuvien leukotrieenien määrän väheneminen. DMSOrlla erilaistuneiksi tehtyjä HL-60-solut vapauttavat leukotrieeni B4:ä sen jälkeen, kun niitä on stimuloitu kalsiumionoforilla A23187. Leukotrieeni B4, joka on vapautunut soluväliaineeseen, voidaan määrittää 10 kvantitatiivisesti radioimmunokokeella, käyttäen kaupallisesti saatavia diagnostisia sarjoja (New England Nuclear, Boston, MA) . Leukotrieeni B4 -tuotanto voidaan havaita HL-60 soluissa 48 tunnin kuluttua siitä, kun on lisätty DMSO:ta solujen erilaistumiseksi neutrofiilin kaltaiseksi 15 soluksi. Soluja (2 x 105 solua/ml) käsitellään kasvavilla konsentraatioilla oligonukleotidianalogeja 48 -72 tuntia siten, että mukana on 1,3 % DMSO:ta. Solut pestään ja sus-pensoidaan uudelleen konsentraationa, joka on 2 x 106 solua/ml Dulbecco'n fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen, 20 joka sisältää 1 % lipiditöntä naudan seerumialbumiinia.
Soluja stimuloidaan 10 μΜ kalsiumionoforilla A23187 15 minuutin ajan, ja LTB4:n tuotettu määrä 5 x 105 solusta määritetään radioimmunokokeella valmistajan kuvaamalla tavalla.
2 5 Tätä koetta käyttäen voitaisiin saada seuraavat tulokset 15-meerillä, muunnellun sidoksen omaavalla anti-sense-oligonukleotidilla (GCAAGGTCACTGAAG), joka on kohdistettu 5-L0-mRNA:han. Soluja käsitellään 72 tuntia joko 1 μΜ, 10 μΜ tai 30 μΜ oligonukleotidianalogilla siten, että 30 mukana on 1,3 % DMSO:ta. Muodostuneen LTB4:n määrä 5 x 105 solusta voisi olla noin 75 ng, 50 ng ja 35 ng, vastaavassa järjestyksessä, käsittelemättömillä erilaistuneilla soluilla, jotka tuottavat 75 ng LTB4:ää.
113870 74 C. In vivo -koe 5-lipo-oksigenaasin tuotannon esto hiiressä voidaan osoittaa seuraavan koemenettelyn mukaisesti. Arakidonihapon anto paikallisesti saa aikaan nopean leukotrieeni B4, leu-5 kotrieeni C4 ja prostaglandiini E2 -tuotannon ihossa, mistä seuraa turvotus ja soluuntunkeutuminen. Tiettyjen 5-lipo-oksigenaasin estäjien tiedetään vaikuttavan tässä kokeessa. Koetta varten hiiren korvaan levitetään 2 mg arakidonihap-poa, vastakkaisen korvan toimiessa kontrollina. Polymorfo-10 nukleaarinen soluuntunkeutuminen tutkitaan myeloperoksidaa-siaktiivisuuden avulla homogenaateissa, jotka on otettu ohutneulanäytteestä tunnin kuluttua arakidonihapon annosta. Turvotusvaste määritetään kvantitatiivisesti mittaamalla korvan paksuus ja puhkaistun ohutneulanäytteen märkäpaino. 15 Tuotetun leukotrieeni B4:n mittaaminen ohutneulanäytteen-otolla suoritetaan suorana kudoksen 5-lipo-oksigenaasiak-tiivisuuden mittauksena. Oligonukleotidianalogit annetaan paikallisesti kumpaankin korvaan 12 ja 24 tuntia ennen arakidonihapon antoa yhdisteiden optimivaikutuksen mahdollis-20 tamiseksi. Kumpaakin korvaa esikäsitellään 24 tuntia joko 0,1 μναοί, 0,3 Mmol tai 1,0 Mmol :11a oligonukleotidianalogia ennen arakidonihapolle altistamista. Arvot ilmoitetaan keskiarvona kolmelle eläimelle konsentraatiota kohden. Poly-morfonukleaarisen soluuntunkeutumisen eston 0,1 μπιοί, 0,3 25 Mmol ja 1 Maolille odotetaan olevan noin 10 %, 75 % ja 92 % kontrollin vaikutuksesta, vastaavassa järjestyksessä. Turvotuksen eston odotetaan olevan noin 3 %, 58 % ja 90 %, vastaavassa järjestyksessä, kun taas leukotrieeni B4 -tuotannon esto voisi olla noin 15 %, 79 % ja 99 %, vastaavassa 30 järjestyksessä.

Claims (6)

113870 75
1. Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen yhdisteen valmistamiseksi, jonka rakenne on: 5 rhpi? S> 11 L, * > L J I 4 n 01 R H p 2 0 X jossa Bx on vaihtuva emäsosa; 10. on 0, CH2, CHF tai CF2; X on H; OH; Ci-i0-alempi-alkyyli, substituoitu alem-pi-alkyyli, alkaryyli tai aralkyyli; F; Cl; Br; CN; CF3; OCF3; OCN; O-, S- tai N-alkyyli; O-, S- tai N-alkenyyli; S0CH3; S02CH3; 0N02; N02; N3; NH2; heterosykloalkyyli; hete-15 rosykloalkaryyli; aminoalkyyliamio; polyalkyyliamino; tai * substituoitu silyyli; Lx-L^-Ls-Im valitaan seuraavista: NR-C (O)-CH2-CH2, NR-C(S)-CH2-CH2, CH2-NR-C(0)-CH2, CH2-NR-C(S) -ch2, ch2-ch2-nr- C(O), CH2-CH2-NR-C(S) , C(O)-NR-CH2-CH2/ C(S)-nr-ch2-ch2, ch2-20 C(0)-NR-CH2 ja CH2-C (S) -NR-CH2, jossa R on vety, alkyyli, . substituoitu alkyyli, aralkyyli, alkenyyli, alkaryyli, ami- noalkyyli, hydroksialkyyli, heterosykloalkyyli tai hetero-sykloaralkyyli, ja Rhpi ja Rhp2 ovat toisistaan riippumatta H tai hydrok-25 syyliryhmän suojaryhmä; tunnettu siitä, että se käsittää seuraavat vaiheet: 113870 76 muodostetaan ensimmäinen syntoni, jonka rakenne on (I), ja toinen syntoni, jonka rakenne on (II): R H P1? !* RB B x RT X RHP2° X (!) (II) 5 jossa: (a) RT on NH2 ja RB on RA-CH2-CH2; (b) RT on CH2-NH2 ja RB on RA-CH2; (c) RT on -CH2-CH2-NH2 ja RB on RA; 10 (d) RT on Ra ja RB on NH2-CH2-CH2 tai (e) RT on CH2-RA ja RB on NH2-CH2; jossa Ra on C(0)0H, C(S)OH tai sen aktivoitu johdannainen; ja yhdistetään ensimmäinen ja toinen syntoni, jolloin 15 muodostuu amidi- tai tioamidisidos RT- ja RB-ryhmien välille .
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Q on 0.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, t u n-20 n e t t u siitä, että X on H.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että X on OH.
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että X on H, OH, F, O-alkyyli tai 0- 25 alkenyyli ja Q on 0.
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Bx on adeniini, guaniini, urasiili, tyrniini, sytosiini, 2-aminoadenosiini tai 5-metyylisytosii-ni. 113870 77
FI935113A 1991-05-21 1993-11-18 Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten rungosta modifioitujen oligonukleotidianalogien valmistamiseksi FI113870B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US07/703,619 US5378825A (en) 1990-07-27 1991-05-21 Backbone modified oligonucleotide analogs
US70361991 1991-05-21
PCT/US1992/004305 WO1992020823A1 (en) 1991-05-21 1992-05-21 Backbone modified oligonucleotide analogs
US9204305 1992-05-21

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI935113A0 FI935113A0 (fi) 1993-11-18
FI935113A FI935113A (fi) 1994-01-03
FI113870B true FI113870B (fi) 2004-06-30

Family

ID=24826111

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI935114A FI935114A (fi) 1991-05-21 1993-11-18 Oligonukleotidanaloger med modifierad stomme
FI935113A FI113870B (fi) 1991-05-21 1993-11-18 Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten rungosta modifioitujen oligonukleotidianalogien valmistamiseksi

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI935114A FI935114A (fi) 1991-05-21 1993-11-18 Oligonukleotidanaloger med modifierad stomme

Country Status (14)

Country Link
US (1) US5378825A (fi)
EP (3) EP1004593A3 (fi)
JP (2) JP2711180B2 (fi)
KR (2) KR0156945B1 (fi)
AT (2) ATE196321T1 (fi)
AU (2) AU662538B2 (fi)
BR (2) BR9206026A (fi)
CA (2) CA2103378A1 (fi)
DE (2) DE69231441T2 (fi)
FI (2) FI935114A (fi)
HU (2) HUT65941A (fi)
IE (2) IE921850A1 (fi)
NO (2) NO308703B1 (fi)
WO (2) WO1992020822A1 (fi)

Families Citing this family (584)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6444798B1 (en) * 1988-06-06 2002-09-03 Steven Albert Benner Chimeras of sulfur-linked oligonucleotide analogs and DNA and RNA
US6358931B1 (en) 1990-01-11 2002-03-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating RNA
US5681941A (en) * 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5872232A (en) * 1990-01-11 1999-02-16 Isis Pharmaceuticals Inc. 2'-O-modified oligonucleotides
US6783931B1 (en) 1990-01-11 2004-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US20040142899A1 (en) * 1990-01-11 2004-07-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhanced biostability and altered biodistribution of oligonucleotides in mammals
US6399754B1 (en) 1991-12-24 2002-06-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides
US6005087A (en) * 1995-06-06 1999-12-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modified oligonucleotides
US7037646B1 (en) 1990-01-11 2006-05-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US6339066B1 (en) 1990-01-11 2002-01-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotides which have phosphorothioate linkages of high chiral purity and which modulate βI, βII, γ, δ, Ε, ζ and η isoforms of human protein kinase C
US5859221A (en) * 1990-01-11 1999-01-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modified oligonucleotides
US6753423B1 (en) 1990-01-11 2004-06-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhanced biostability and altered biodistribution of oligonucleotides in mammals
US5602240A (en) * 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5623070A (en) * 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US6121433A (en) * 1990-07-27 2000-09-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds having nitrogen-containing linkages
US5378825A (en) * 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5610289A (en) * 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5618704A (en) * 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5541307A (en) * 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5386023A (en) * 1990-07-27 1995-01-31 Isis Pharmaceuticals Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling
US5998603A (en) * 1994-09-29 1999-12-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4'-desmethyl nucleoside analogs, and oligomers thereof
DK0541722T3 (da) * 1990-08-03 1996-04-22 Sterling Winthrop Inc Forbindelser og fremgangsmåder til inhibering af genekspression
US5789573A (en) * 1990-08-14 1998-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of ICAM-1, E-selectin, and CMV IE1/IE2
JPH06505704A (ja) * 1990-09-20 1994-06-30 ギリアド　サイエンシズ，インコーポレイテッド 改変ヌクレオシド間結合
US5965722A (en) 1991-05-21 1999-10-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of ras gene with chimeric and alternating oligonucleotides
US7015315B1 (en) 1991-12-24 2006-03-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligonucleotides
US6335434B1 (en) 1998-06-16 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc., Nucleosidic and non-nucleosidic folate conjugates
US8153602B1 (en) 1991-11-19 2012-04-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Composition and methods for the pulmonary delivery of nucleic acids
US5359044A (en) * 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
US5543507A (en) * 1992-03-05 1996-08-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Covalently cross-linked oligonucleotides
EP0635023B1 (en) * 1992-03-05 2002-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Covalently cross-linked oligonucleotides
US6537973B1 (en) 1992-03-16 2003-03-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide inhibition of protein kinase C
US6117847A (en) * 1992-03-16 2000-09-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides for enhanced modulation of protein kinase C expression
GB9207380D0 (en) * 1992-04-03 1992-05-13 Ici Plc Compounds
US5434257A (en) * 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
US5817781A (en) * 1992-06-01 1998-10-06 Gilead Sciences, Inc. Modified internucleoside linkages (II)
DE69334241D1 (de) * 1992-06-24 2008-10-09 Isis Pharmaceuticals Inc Heteroatomische oligonukleosidbindungen
AU680449B2 (en) * 1992-10-05 1997-07-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide inhibition of the ras gene
US5985558A (en) 1997-04-14 1999-11-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense oligonucleotide compositions and methods for the inibition of c-Jun and c-Fos
US5872242A (en) * 1992-10-05 1999-02-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide inhibition of ras
US6784290B1 (en) 1992-10-05 2004-08-31 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide inhibition of ras
US20030013670A1 (en) * 1992-10-05 2003-01-16 Monia Brett P. Antisense oligonucleotide inhibition of ras
AU6551094A (en) * 1993-03-31 1994-10-24 Sterling Winthrop Inc. Bifunctional nucleosides, oligomers thereof, and methods of making and using the same
ATE160572T1 (de) * 1993-03-31 1997-12-15 Sanofi Sa Oligonucleotide mit amidverkettungen die phosphoesterverkettungen einsetzen
GB9311682D0 (en) * 1993-06-05 1993-07-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
US6605708B1 (en) 1993-07-28 2003-08-12 Hybridon, Inc. Building blocks with carbamate internucleoside linkages and oligonucleotides derived therefrom
US6653458B1 (en) 1993-09-03 2003-11-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modified oligonucleotides
AU679566B2 (en) 1993-09-03 1997-07-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
CA2180727A1 (en) * 1994-01-26 1995-08-03 Alain De Mesmaeker Modified oligonucleotides
US5625050A (en) * 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5981731A (en) * 1994-05-31 1999-11-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of B-raf gene expression
US6391636B1 (en) 1994-05-31 2002-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of raf gene expression
WO1996005298A1 (en) * 1994-08-09 1996-02-22 Ciba-Geigy Ag Antitumor antisense oligonucleotides
GB9417746D0 (en) * 1994-09-03 1994-10-19 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
GB9417938D0 (en) * 1994-09-06 1994-10-26 Ciba Geigy Ag Compounds
US5681940A (en) * 1994-11-02 1997-10-28 Icn Pharmaceuticals Sugar modified nucleosides and oligonucleotides
EP0714907A1 (en) * 1994-11-30 1996-06-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Oligoribonucleotides with amide backbone
US5807718A (en) 1994-12-02 1998-09-15 The Scripps Research Institute Enzymatic DNA molecules
US6207826B1 (en) 1995-03-27 2001-03-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Macrocyclic compounds having nitrogen-containing linkages
US6107482A (en) * 1995-03-27 2000-08-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nitrogenous macrocyclic compounds
US6420549B1 (en) * 1995-06-06 2002-07-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide analogs having modified dimers
US6251939B1 (en) 1995-06-07 2001-06-26 Promega Biosciences, Inc. Carbamate-based cationic lipids
US5665721A (en) * 1995-06-07 1997-09-09 Abbott Laboratories Heterocyclic substituted cyclopentane compounds
US6143749A (en) * 1995-06-07 2000-11-07 Abbott Laboratories Heterocyclic substituted cyclopentane compounds
US5855911A (en) * 1995-08-29 1999-01-05 Board Of Regents, The University Of Texas System Liposomal phosphodiester, phosphorothioate, and P-ethoxy oligonucleotides
GB9604669D0 (en) * 1996-03-05 1996-05-01 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
US5856099A (en) * 1996-05-21 1999-01-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense compositions and methods for modulating type I interleukin-1 receptor expression
US20040266706A1 (en) * 2002-11-05 2004-12-30 Muthiah Manoharan Cross-linked oligomeric compounds and their use in gene modulation
US20070275921A1 (en) * 1996-06-06 2007-11-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric Compounds That Facilitate Risc Loading
US7812149B2 (en) * 1996-06-06 2010-10-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2′-Fluoro substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
US20050119470A1 (en) * 1996-06-06 2005-06-02 Muthiah Manoharan Conjugated oligomeric compounds and their use in gene modulation
US9096636B2 (en) * 1996-06-06 2015-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
US20050053976A1 (en) * 1996-06-06 2005-03-10 Baker Brenda F. Chimeric oligomeric compounds and their use in gene modulation
US20040203024A1 (en) * 1996-06-06 2004-10-14 Baker Brenda F. Modified oligonucleotides for use in RNA interference
US20040161777A1 (en) * 1996-06-06 2004-08-19 Baker Brenda F. Modified oligonucleotides for use in RNA interference
US20040147022A1 (en) * 1996-06-06 2004-07-29 Baker Brenda F. 2'-methoxy substituted oligomeric compounds and compositions for use in gene modulations
US5898031A (en) * 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
US20050042647A1 (en) * 1996-06-06 2005-02-24 Baker Brenda F. Phosphorous-linked oligomeric compounds and their use in gene modulation
GB9612600D0 (en) 1996-06-13 1996-08-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
AU3340797A (en) * 1996-06-28 1998-01-21 Novartis Ag Modified oligonucleotides
US7309692B1 (en) 1996-07-08 2007-12-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of chronic myelogenous leukemic cell growth by liposomal-antisense oligodeoxy-nucleotides targeting to GRB2 or CRK1
US6077954A (en) * 1996-08-01 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted heterocyclic compounds
CA2262019C (fr) * 1996-08-02 2011-11-15 Bio Merieux Procede d'amplification d'une sequence d'un acide nucleique cible
US6111085A (en) * 1996-09-13 2000-08-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbamate-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US6977244B2 (en) * 1996-10-04 2005-12-20 Board Of Regents, The University Of Texas Systems Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides
US5780241A (en) 1996-11-05 1998-07-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Complex chemical libraries
US6319906B1 (en) 1996-12-31 2001-11-20 Isis Pharmaceuticals Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
US6077833A (en) * 1996-12-31 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
US7235653B2 (en) 1996-12-31 2007-06-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
US6172209B1 (en) * 1997-02-14 2001-01-09 Isis Pharmaceuticals Inc. Aminooxy-modified oligonucleotides and methods for making same
US6127533A (en) * 1997-02-14 2000-10-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-aminooxy-modified oligonucleotides
US6576752B1 (en) * 1997-02-14 2003-06-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy functionalized oligomers
US6639062B2 (en) * 1997-02-14 2003-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Aminooxy-modified nucleosidic compounds and oligomeric compounds prepared therefrom
CN1261920A (zh) 1997-04-29 2000-08-02 斯克里普斯研究学院 酶促dna分子
JP2002510319A (ja) 1997-07-01 2002-04-02 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド オリゴヌクレオチドの消化管を介したデリバリーのための組成物及び方法
US6133246A (en) * 1997-08-13 2000-10-17 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense oligonucleotide compositions and methods for the modulation of JNK proteins
US6809193B2 (en) 1997-08-13 2004-10-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide compositions and methods for the modulation of JNK proteins
US5877309A (en) * 1997-08-13 1999-03-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotides against JNK
US20070149472A1 (en) * 1997-08-13 2007-06-28 Mckay Robert Antisense oligonucleotide compositions and methods for the modulation of jnk proteins
US6518017B1 (en) * 1997-10-02 2003-02-11 Oasis Biosciences Incorporated Combinatorial antisense library
US20030165888A1 (en) * 2001-07-18 2003-09-04 Brown Bob D. Oligonucleotide probes and primers comprising universal bases for diagnostic purposes
US7704962B1 (en) 1997-10-03 2010-04-27 Board Of Regents, The University Of Texas System Small oligonucleotides with anti-tumor activity
US7285288B1 (en) 1997-10-03 2007-10-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides
US6232463B1 (en) 1997-10-09 2001-05-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5948902A (en) 1997-11-20 1999-09-07 South Alabama Medical Science Foundation Antisense oligonucleotides to human serine/threonine protein phosphatase genes
US5968748A (en) * 1998-03-26 1999-10-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of human HER-2 expression
US7321828B2 (en) * 1998-04-13 2008-01-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. System of components for preparing oligonucleotides
US20040186071A1 (en) * 1998-04-13 2004-09-23 Bennett C. Frank Antisense modulation of CD40 expression
WO1999060167A1 (en) * 1998-05-21 1999-11-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for topical delivery of oligonucleotides
WO1999060012A1 (en) * 1998-05-21 1999-11-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for non-parenteral delivery of oligonucleotides
US6300319B1 (en) 1998-06-16 2001-10-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeted oligonucleotide conjugates
US6867294B1 (en) 1998-07-14 2005-03-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages
US20040009938A1 (en) * 1998-08-07 2004-01-15 Muthiah Manoharan Methods of enhancing renal uptake of oligonucleotides
US6673912B1 (en) 1998-08-07 2004-01-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2′-O-aminoethyloxyethyl-modified oligonucleotides
US6043352A (en) 1998-08-07 2000-03-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-Dimethylaminoethyloxyethyl-modified oligonucleotides
US6175004B1 (en) 1998-09-01 2001-01-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for the synthesis of oligonucleotides incorporating 2-aminoadenosine
US6077709A (en) 1998-09-29 2000-06-20 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of Survivin expression
US6069243A (en) * 1998-10-06 2000-05-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for oligonucleotide synthesis
US6667176B1 (en) 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
US6492111B1 (en) 1998-11-25 2002-12-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. In situ binary synthesis of biologically effective molecules
US20030180789A1 (en) * 1998-12-30 2003-09-25 Dale Roderic M.K. Arrays with modified oligonucleotide and polynucleotide compositions
US6087112A (en) * 1998-12-30 2000-07-11 Oligos Etc. Inc. Arrays with modified oligonucleotide and polynucleotide compositions
US6403779B1 (en) 1999-01-08 2002-06-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Regioselective synthesis of 2′-O-modified nucleosides
US6399765B1 (en) 1999-03-17 2002-06-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for removing dimethoxytrityl groups from oligonucleotides
WO2000055314A2 (en) 1999-03-18 2000-09-21 United Therapeutics Corporation Inhibitors of endothelin-1 synthesis
US6235891B1 (en) 1999-03-31 2001-05-22 South Alabama Medical Science Foundation Glucocorticoid receptor agonist and decreased PP5
KR20020013519A (ko) * 1999-04-08 2002-02-20 추후제출 보편적 및/또는 축퇴성 염기를 포함하는 안티센스올리고뉴클레오티드
US7098192B2 (en) 1999-04-08 2006-08-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of STAT3 expression
US6656730B1 (en) 1999-06-15 2003-12-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides conjugated to protein-binding drugs
US6147200A (en) * 1999-08-19 2000-11-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers
US6277982B1 (en) 1999-08-20 2001-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Alkylation of alcohols, amines, thiols and their derivatives by cyclic sulfate intermediates
US6261840B1 (en) 2000-01-18 2001-07-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of PTP1B expression
US20020055479A1 (en) 2000-01-18 2002-05-09 Cowsert Lex M. Antisense modulation of PTP1B expression
US7105962B2 (en) * 2000-08-03 2006-09-12 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Brushless motor for partable electronic equipment with wire treatment technique of coils
US7767802B2 (en) 2001-01-09 2010-08-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
AU2002315393A1 (en) 2001-06-21 2003-01-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of superoxide dismutase 1, soluble expression
US6964950B2 (en) 2001-07-25 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of C-reactive protein expression
US7425545B2 (en) 2001-07-25 2008-09-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of C-reactive protein expression
US20030096772A1 (en) 2001-07-30 2003-05-22 Crooke Rosanne M. Antisense modulation of acyl CoA cholesterol acyltransferase-2 expression
US7407943B2 (en) 2001-08-01 2008-08-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein B expression
US7227014B2 (en) 2001-08-07 2007-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of apolipoprotein (a) expression
CA2457565A1 (en) 2001-10-09 2003-04-17 Genentech, Inc. Novel acidic mammalian proteins and polynucleotides encoding the same
ATE516364T1 (de) 2001-10-09 2011-07-15 Isis Pharmaceuticals Inc Antisense-modulation der expression des insulinähnlicher-wachstumsfaktor-bindungsprotei s 5
US6750019B2 (en) 2001-10-09 2004-06-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of insulin-like growth factor binding protein 5 expression
DE10159904A1 (de) * 2001-12-06 2003-07-03 Adnagen Ag Oligonukleotidanordnung, Verfahren zum Nukleotidnachweis sowie Vorrichtung hierfür
US6965025B2 (en) 2001-12-10 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of connective tissue growth factor expression
US20040043950A1 (en) * 2002-01-03 2004-03-04 Board Of Regents, The University Of Texas System WT1 antisense oligos for the inhibition of breast cancer
EP2221377B2 (en) 2002-02-01 2017-05-17 Life Technologies Corporation Oligonucleotide compositions with enhanced efficiency
WO2003064621A2 (en) * 2002-02-01 2003-08-07 Ambion, Inc. HIGH POTENCY siRNAS FOR REDUCING THE EXPRESSION OF TARGET GENES
US20060009409A1 (en) 2002-02-01 2006-01-12 Woolf Tod M Double-stranded oligonucleotides
US20030191075A1 (en) * 2002-02-22 2003-10-09 Cook Phillip Dan Method of using modified oligonucleotides for hepatic delivery
US7169916B2 (en) * 2002-04-01 2007-01-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chloral-free DCA in oligonucleotide synthesis
US7199107B2 (en) 2002-05-23 2007-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of kinesin-like 1 expression
US20040248094A1 (en) * 2002-06-12 2004-12-09 Ford Lance P. Methods and compositions relating to labeled RNA molecules that reduce gene expression
US20100075423A1 (en) * 2002-06-12 2010-03-25 Life Technologies Corporation Methods and compositions relating to polypeptides with rnase iii domains that mediate rna interference
US20040106785A1 (en) * 2002-07-25 2004-06-03 Micrologix Biotech Inc. Inhibitors of RNA dependent RNA polymerase and uses thereof
MXPA05001355A (es) 2002-08-05 2005-09-30 Atugen Ag Formas nuevas adicionales de moleculas de arn de interferencia.
US20040029275A1 (en) * 2002-08-10 2004-02-12 David Brown Methods and compositions for reducing target gene expression using cocktails of siRNAs or constructs expressing siRNAs
US20050196382A1 (en) * 2002-09-13 2005-09-08 Replicor, Inc. Antiviral oligonucleotides targeting viral families
KR101360955B1 (ko) * 2002-09-13 2014-02-10 레플리코르 인코포레이티드 비서열 상보적 항바이러스 올리고뉴클레오티드
US20040137471A1 (en) * 2002-09-18 2004-07-15 Timothy Vickers Efficient reduction of target RNA's by single-and double-stranded oligomeric compounds
US7229976B2 (en) 2002-09-26 2007-06-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of forkhead box O1A expression
EP1560840B1 (en) * 2002-11-05 2015-05-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2'-modified nucleosides for use in gene modulation
EP1560839A4 (en) 2002-11-05 2008-04-23 Isis Pharmaceuticals Inc CHIMERIC OLIGOMER COMPOUNDS AND THEIR USE IN GENE MODULATION
DK2336318T3 (da) 2002-11-13 2013-07-15 Genzyme Corp Antisense-modulering af apolipoprotein b-ekspression
JP4986109B2 (ja) 2002-11-13 2012-07-25 ジェンザイム・コーポレーション アポリポタンパク質ｂ発現のアンチセンス調節
US7144999B2 (en) 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
CA2515484C (en) 2003-02-11 2011-09-20 Antisense Therapeutics Ltd Modulation of insulin like growth factor i receptor expression
US7002006B2 (en) * 2003-02-12 2006-02-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Protection of nucleosides
US7803781B2 (en) 2003-02-28 2010-09-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of growth hormone receptor expression and insulin-like growth factor expression
CA2518475C (en) 2003-03-07 2014-12-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Irna agents comprising asymmetrical modifications
US20040185559A1 (en) 2003-03-21 2004-09-23 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 1 expression
US7598227B2 (en) 2003-04-16 2009-10-06 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of apolipoprotein C-III expression
EP2666858A1 (en) 2003-04-17 2013-11-27 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Modified iRNA agents
US7399853B2 (en) 2003-04-28 2008-07-15 Isis Pharmaceuticals Modulation of glucagon receptor expression
US20040219533A1 (en) * 2003-04-29 2004-11-04 Jim Davis Biological bar code
US8679789B2 (en) * 2003-05-01 2014-03-25 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotides comprising a molecular switch
US7897582B2 (en) 2003-05-23 2011-03-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
US7960355B2 (en) 2003-05-23 2011-06-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
CA2540692C (en) * 2003-06-02 2013-05-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide synthesis with alternative solvents
CN1984921B (zh) 2003-06-03 2010-06-16 Isis药物公司 存活蛋白表达的调节
DK3604537T3 (da) 2003-06-13 2022-02-28 Alnylam Europe Ag Dobbeltstrenget ribonukleinsyre med forøget effektivitet i en organisme
US20060241072A1 (en) * 2003-06-20 2006-10-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds for use in gene modulation
WO2005017108A2 (en) * 2003-06-30 2005-02-24 United Soybean Board Soybean selection system based on aec-resistance
WO2005013901A2 (en) 2003-07-31 2005-02-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and compositions for use in modulation of small non-coding rnas
US7825235B2 (en) 2003-08-18 2010-11-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 2 expression
US20070123480A1 (en) * 2003-09-11 2007-05-31 Replicor Inc. Oligonucleotides targeting prion diseases
CA2538252C (en) * 2003-09-18 2014-02-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4'-thionucleosides and oligomeric compounds
NZ545134A (en) 2003-09-18 2009-06-26 Lilly Co Eli Modulation of eIF4E expression
US7125945B2 (en) * 2003-09-19 2006-10-24 Varian, Inc. Functionalized polymer for oligonucleotide purification
US20050191653A1 (en) 2003-11-03 2005-09-01 Freier Susan M. Modulation of SGLT2 expression
EP2363480A3 (en) 2004-01-20 2015-10-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of glucocorticoid receptor expression
US8569474B2 (en) * 2004-03-09 2013-10-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double stranded constructs comprising one or more short strands hybridized to a longer strand
US20050244869A1 (en) * 2004-04-05 2005-11-03 Brown-Driver Vickie L Modulation of transthyretin expression
US7674778B2 (en) 2004-04-30 2010-03-09 Alnylam Pharmaceuticals Oligonucleotides comprising a conjugate group linked through a C5-modified pyrimidine
JP2008509226A (ja) 2004-05-24 2008-03-27 ジェンボールト コーポレイション 回収可能な形式での安定なタンパク質保管および安定な核酸保管
WO2005118806A2 (en) 2004-05-28 2005-12-15 Ambion, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS INVOLVING MicroRNA
US8394947B2 (en) * 2004-06-03 2013-03-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Positionally modified siRNA constructs
CA2569036A1 (en) * 2004-06-03 2005-12-22 Balkrishen Bhat Chimeric gapped oligomeric compositions
JP2008501694A (ja) * 2004-06-03 2008-01-24 アイシス ファーマシューティカルズ、インク． 遺伝子調節の使用のために個別に修飾された鎖を有する二本鎖組成物
US20090048192A1 (en) * 2004-06-03 2009-02-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Double Strand Compositions Comprising Differentially Modified Strands for Use in Gene Modulation
US7968762B2 (en) * 2004-07-13 2011-06-28 Van Andel Research Institute Immune-compromised transgenic mice expressing human hepatocyte growth factor (hHGF)
AU2005272816B2 (en) 2004-08-10 2011-08-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Chemically modified oligonucleotides
MX2007002043A (es) 2004-08-16 2007-10-11 Quark Biotech Inc Usos terapeuticos de los inhibidores del rtp801.
DK1797183T3 (da) 2004-09-02 2012-10-01 Univ Yale Regulering af onkogener med mikrornas
US7884086B2 (en) * 2004-09-08 2011-02-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugates for use in hepatocyte free uptake assays
JP2008513507A (ja) 2004-09-17 2008-05-01 アイシス ファーマシューティカルズ インコーポレイティッド 増強されたアンチセンスオリゴヌクレオチド
ES2534300T3 (es) 2004-11-12 2015-04-21 Asuragen, Inc. Procedimientos y composiciones que implican miARN y moléculas inhibidoras de miARN
CN101193905B (zh) 2005-02-11 2014-06-25 纪念斯隆-凯特林癌症中心 用于检测抗药egfr突变体的方法和组合物
WO2006110314A2 (en) 2005-03-25 2006-10-19 Ambion, Inc. Methods and compositions for depleting abundant rna transcripts
US8124335B2 (en) 2005-05-06 2012-02-28 Gen-Probe Incorporated Compositions and assays to detect influenza virus A and B nucleic acids
US8354384B2 (en) * 2005-06-23 2013-01-15 Yale University Anti-aging micrornas
US8067571B2 (en) 2005-07-13 2011-11-29 Avi Biopharma, Inc. Antibacterial antisense oligonucleotide and method
AU2006304721B2 (en) 2005-10-17 2012-01-19 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect Legionella pneumophila nucleic acid
JP5111385B2 (ja) * 2005-10-28 2013-01-09 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド ハンチンチン遺伝子の発現を抑制するための組成物および方法
AU2006311730B2 (en) 2005-11-09 2010-12-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of Factor V Leiden mutant gene
UY30097A1 (es) 2006-01-20 2007-08-31 Atugen Ag Usos terapeuticos de inhibidores de rtp801
CA2640171C (en) 2006-01-27 2014-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-modified bicyclic nucleic acid analogs
EP1987166A4 (en) 2006-02-03 2010-06-02 Univ Columbia DEOXYRIBOZYME BINARY PROBES FOR ANALYSIS OF NUCLEIC ACID
EP2511383B1 (en) 2006-03-31 2013-12-25 Columbia University Binary probes for fluorescent analysis of nucleic acids
ES2471978T3 (es) * 2006-05-05 2014-06-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compuestos y procedimientos para modular la expresión de ApoB
US7666854B2 (en) * 2006-05-11 2010-02-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs
WO2007134181A2 (en) * 2006-05-11 2007-11-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-modified bicyclic nucleic acid analogs
EP3249052B1 (en) 2006-05-11 2019-04-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the pcsk9 gene
ATE514794T1 (de) * 2006-05-12 2011-07-15 Gen Probe Inc Zusammensetzungen und verfahren für den nachweis von enterokokken-nukleinsäuren
US20090209625A1 (en) * 2006-05-23 2009-08-20 Sanjay Bhanot Modulation of chrebp expression
WO2008011473A2 (en) 2006-07-19 2008-01-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and their uses directed to hbxip
JP2009544281A (ja) 2006-07-21 2009-12-17 サイレンス・セラピューティクス・アーゲー プロテインキナーゼ３の発現を阻害するための手段
EP3159417B1 (en) 2006-08-01 2021-10-06 Gen-Probe Incorporated Methods of nonspecific target capture of nucleic acids
US20090131348A1 (en) 2006-09-19 2009-05-21 Emmanuel Labourier Micrornas differentially expressed in pancreatic diseases and uses thereof
WO2008036776A2 (en) 2006-09-19 2008-03-27 Asuragen, Inc. Mir-15, mir-26, mir -31,mir -145, mir-147, mir-188, mir-215, mir-216 mir-331, mmu-mir-292-3p regulated genes and pathways as targets for therapeutic intervention
AU2007299629C1 (en) 2006-09-21 2012-05-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the HAMP gene
CA3144493A1 (en) 2006-10-03 2008-04-10 Arbutus Biopharma Corporation Lipid containing formulations
JP2010507387A (ja) 2006-10-25 2010-03-11 クアーク・ファーマスーティカルス、インコーポレイテッド 新規のｓｉＲＮＡおよびその使用方法
EP2407558A1 (en) 2006-10-31 2012-01-18 Noxxon Pharma AG Methods for the detection of a single- or double-stranded nucleic acid molecule
CN101675165A (zh) 2006-12-08 2010-03-17 奥斯瑞根公司 Let-7微小rna的功能和靶标
EP3095873B1 (en) 2006-12-21 2018-04-18 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for nucleic acid amplification
US20100093836A1 (en) 2007-01-29 2010-04-15 Isis Pharmaceuticals, Inc Compounds and methods for modulating protein expression
PE20090064A1 (es) 2007-03-26 2009-03-02 Novartis Ag Acido ribonucleico de doble cadena para inhibir la expresion del gen e6ap humano y composicion farmaceutica que lo comprende
BRPI0721697A2 (pt) 2007-05-11 2014-08-05 Univ Jefferson " métodos para tratar e/ou prevenir uma doença ou distúrbio neurodegenerativo em um indivíduo, para tratar e/ou prevenir um indivíduo com ou em risco de demência vascular, para tratar e/ou prevenir uma doença ou distúrbio associado com uma barreira hematoencefálica anormal em um indivíduo, para diminuir o acúmulo beta amilóide no cérebro de um indivíduo, para tratar e/ou prevenir mal de alzheimer em um indivíduo e para prevenir ou reduzir o risco de desenvolver mal de alzhheimer, e, uso de um agente que inibe a expressão e/ou atividade da proteína lp-pla2."
AU2008251467B2 (en) * 2007-05-11 2014-07-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods of treatment of skin ulcers
US8278425B2 (en) 2007-05-30 2012-10-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
EP2173760B2 (en) 2007-06-08 2015-11-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Carbocyclic bicyclic nucleic acid analogs
DK2171088T3 (en) 2007-06-19 2016-01-25 Stratos Genomics Inc Nucleic acid sequencing in a high yield by expansion
CA2692579C (en) * 2007-07-05 2016-05-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. 6-disubstituted bicyclic nucleic acid analogs
CN101688206B (zh) 2007-07-05 2013-05-15 诺瓦提斯公司 用于治疗病毒感染的dsRNA
CN101821277B (zh) 2007-08-15 2014-05-07 Isis制药公司 四氢吡喃核酸类似物
JP2010539978A (ja) 2007-10-02 2010-12-24 アムジェン インコーポレイテッド マイクロ−ｒｎａおよびその前駆体にハイブリダイズしうる核酸を用いるエリスロポエチンの増加
CA2701845A1 (en) 2007-10-03 2009-04-09 Quark Pharmaceuticals, Inc. Novel sirna structures
US8916531B2 (en) * 2007-11-20 2014-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of CD40 expression
CA2930393C (en) 2007-12-04 2022-11-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Carbohydrate conjugates as delivery agents for oligonucleotides
CA2715991A1 (en) 2007-12-26 2009-07-09 Gen-Probe Incorporated Amplification oligomers and methods to detect candida albicans 26s rrna or encoding dna
JP5677703B2 (ja) 2008-01-10 2015-02-25 リサーチ ディベロップメント ファウンデーション Ｅｈｒｌｉｃｈｉａｃｈａｆｆｅｅｎｓｉｓにのためのワクチンおよび診断
EP2265627A2 (en) * 2008-02-07 2010-12-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexitol nucleic acid analogs
WO2009111375A2 (en) * 2008-03-01 2009-09-11 Abraxis Bioscience, Llc Treatment, diagnostic, and method for discovering antagonist using sparc specific mirnas
WO2009117589A1 (en) 2008-03-21 2009-09-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising tricyclic nucleosides and methods for their use
DK2285819T3 (da) * 2008-04-04 2013-12-02 Isis Pharmaceuticals Inc Oligomere forbindelser omfattende neutralt bundne, terminale bicykliske nukleosider
EP2274423A2 (en) * 2008-04-04 2011-01-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleosides and having reduced toxicity
CA2721183C (en) 2008-04-11 2019-07-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Site-specific delivery of nucleic acids by combining targeting ligands with endosomolytic components
US20090280167A1 (en) * 2008-05-07 2009-11-12 Abraxis Bioscience, Llc Enhancement of drug therapy by mirna
WO2009137807A2 (en) 2008-05-08 2009-11-12 Asuragen, Inc. Compositions and methods related to mirna modulation of neovascularization or angiogenesis
US20100209957A1 (en) * 2008-06-20 2010-08-19 Genvault Corporation Biosample storage devices and methods of use thereof
WO2010017509A1 (en) * 2008-08-07 2010-02-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of transthyretin expression for the treatment of cns related disorders
US8283165B2 (en) * 2008-09-12 2012-10-09 Genvault Corporation Matrices and media for storage and stabilization of biomolecules
EP3587434A1 (en) 2008-09-23 2020-01-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Chemical modifications of monomers and oligonucleotides with click components for conjugation with ligands
US8604192B2 (en) * 2008-09-24 2013-12-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Cyclohexenyl nucleic acids analogs
DK2356129T3 (da) * 2008-09-24 2013-05-13 Isis Pharmaceuticals Inc Substituerede alpha-L-bicykliske nukleosider
JP5809058B2 (ja) 2008-10-15 2015-11-10 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド 第１１因子発現の調節
CN102264374B (zh) 2008-10-24 2015-01-07 Isis制药公司 5′和2′双取代的核苷和由其制备的低聚化合物
EP2358398A2 (en) 2008-10-24 2011-08-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and methods
JP5805538B2 (ja) 2008-11-07 2015-11-04 リサーチ ディベロップメント ファウンデーション Ｃｒｉｐｔｏ／ＧＳＰ７８複合体形成およびシグナル伝達を阻害するための組成物および方法
KR102042721B1 (ko) 2008-11-10 2019-11-11 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 치료제 운반용 신규 지질 및 조성물
EP2367838A4 (en) 2008-11-21 2012-10-03 Univ Columbia SPLIT DNA ENZYME FOR VISUAL SINGLE-NUCLEOTIDE POLYMORPHISMUSTYPIZATION
BRPI0923225A2 (pt) 2008-12-02 2016-10-04 Chiralgen Ltd metodo para sintese de acidos nucleicos modificados no atomo de fosforo
WO2010080452A2 (en) 2008-12-18 2010-07-15 Quark Pharmaceuticals, Inc. siRNA COMPOUNDS AND METHODS OF USE THEREOF
WO2010088404A1 (en) 2009-01-28 2010-08-05 Columbia University Microarrays of binary nucleic acid probes for detecting nucleic acid analytes
WO2010090969A1 (en) 2009-02-06 2010-08-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Tetrahydropyran nucleic acid analogs
WO2010091308A2 (en) 2009-02-06 2010-08-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds and methods
WO2010091878A2 (en) 2009-02-13 2010-08-19 Silence Therapeutics Ag Means for inhibiting the expression of opa1
EP2398903A1 (en) 2009-02-18 2011-12-28 Silence Therapeutics Aktiengesellschaft Means for inhibiting the expression of ang2
AU2010221419B2 (en) 2009-03-02 2015-10-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acid chemical modifications
JP2012521359A (ja) * 2009-03-20 2012-09-13 アリオス バイオファーマ インク． 置換されたヌクレオシドアナログおよびヌクレオチドアナログ
US20110045080A1 (en) * 2009-03-24 2011-02-24 William Marsh Rice University Single-Walled Carbon Nanotube/Bioactive Substance Complexes and Methods Related Thereto
EP2258858A1 (en) 2009-06-05 2010-12-08 Universitätsklinikum Freiburg Transgenic LSD1 animal model for cancer
KR20230098713A (ko) 2009-06-10 2023-07-04 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 향상된 지질 조성물
AU2010266234B2 (en) 2009-07-01 2013-07-25 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for nucleic acid amplification
KR101885383B1 (ko) 2009-07-06 2018-08-03 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 신규한 핵산 프로드러그 및 그의 사용 방법
US9512164B2 (en) 2009-07-07 2016-12-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide end caps
US8927513B2 (en) 2009-07-07 2015-01-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 5′ phosphate mimics
WO2011017521A2 (en) 2009-08-06 2011-02-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs
EP2810643A3 (en) 2009-08-14 2015-03-11 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Lipid formulated compositions and mehods for inhibiting expression of a gene from the ebola virus
DK2504435T3 (da) 2009-11-26 2019-12-09 Quark Pharmaceuticals Inc Sirna-forbindelser omfattende terminale substitutioner
EP3296398A1 (en) 2009-12-07 2018-03-21 Arbutus Biopharma Corporation Compositions for nucleic acid delivery
EP2510098B1 (en) 2009-12-09 2015-02-11 Quark Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating diseases, disorders or injury of the cns
ES2562499T3 (es) 2009-12-09 2016-03-04 Nitto Denko Corporation Modulación de la expresión de HSP47
WO2011075656A1 (en) 2009-12-18 2011-06-23 The University Of British Columbia Methods and compositions for delivery of nucleic acids
WO2011084193A1 (en) 2010-01-07 2011-07-14 Quark Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compounds comprising non-nucleotide overhangs
WO2011085102A1 (en) 2010-01-11 2011-07-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Base modified bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
WO2011100131A2 (en) 2010-01-28 2011-08-18 Alnylam Pharmacuticals, Inc. Monomers and oligonucleotides comprising cycloaddition adduct(s)
WO2011094580A2 (en) 2010-01-28 2011-08-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Chelated copper for use in the preparation of conjugated oligonucleotides
US9181593B2 (en) 2010-02-17 2015-11-10 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods to detect Atopobium vaginae nucleic acid
WO2011108930A1 (en) 2010-03-04 2011-09-09 Interna Technologies Bv A MiRNA MOLECULE DEFINED BY ITS SOURCE AND ITS DIAGNOSTIC AND THERAPEUTIC USES IN DISEASES OR CONDITIONS ASSOCIATED WITH EMT
WO2011115818A1 (en) 2010-03-17 2011-09-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-substituted bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
US9102938B2 (en) 2010-04-01 2015-08-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. 2′ and 5′ modified monomers and oligonucleotides
EP3587593B1 (en) 2010-04-21 2023-09-27 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits to detect herpes simplex virus nucleic acids
US9725479B2 (en) 2010-04-22 2017-08-08 Ionis Pharmaceuticals, Inc. 5′-end derivatives
US20130260460A1 (en) 2010-04-22 2013-10-03 Isis Pharmaceuticals Inc Conformationally restricted dinucleotide monomers and oligonucleotides
WO2011133876A2 (en) 2010-04-22 2011-10-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising acyclic and abasic nucleosides and analogs
EP3091027B1 (en) 2010-04-28 2018-01-17 Ionis Pharmaceuticals, Inc. 5' modified nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
US9156873B2 (en) 2010-04-28 2015-10-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modified 5′ diphosphate nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
JP6005628B2 (ja) 2010-04-28 2016-10-12 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッドＩｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． 修飾ヌクレオシド、その類似体、およびこれらから調製されるオリゴマー化合物
BR112012027547B1 (pt) 2010-04-29 2022-06-14 Ionis Pharmaceuticals, Inc Oligonucleotídeo modificado de fita simples, composição, e seus usos para tratar amiloidose transtirretina, reduzir os seus sintomas e para reduzir a expressão de mrna ou de proteína de transtirretina
US20130156845A1 (en) 2010-04-29 2013-06-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated single stranded rna
KR101981705B1 (ko) 2010-05-28 2019-05-24 사렙타 쎄러퓨틱스, 인코퍼레이티드 변형된 서브유니트간 결합 및/또는 말단 그룹을 갖는 올리고뉴클레오타이드 유사체
WO2011156278A1 (en) 2010-06-07 2011-12-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
US8846637B2 (en) 2010-06-08 2014-09-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted 2′-amino and 2′-thio-bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
JP5824515B2 (ja) 2010-06-24 2015-11-25 クォーク ファーマシューティカルズ インコーポレーティッドＱｕａｒｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． Ｒｈｏａに対する二本鎖ｒｎａ化合物およびその使用
EP2588629B1 (en) 2010-06-30 2017-05-17 Gen-Probe Incorporated Method and apparatus for identifying analyte-containing samples using single-read determination of analyte and process control signals
NZ719520A (en) 2010-07-06 2017-07-28 Int Tech Bv Mirna and its diagnostic and therapeutic uses in diseases or conditions associated with melanoma, or in diseases or conditions associated with activated braf pathway
EP2593569B1 (en) 2010-07-12 2018-01-03 Gen-Probe Incorporated Compositions and assays to detect seasonal h1 influenza a virus nucleic acids
US20130323269A1 (en) 2010-07-30 2013-12-05 Muthiah Manoharan Methods and compositions for delivery of active agents
US20130202652A1 (en) 2010-07-30 2013-08-08 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for delivery of active agents
CA2807440A1 (en) 2010-08-04 2012-02-09 Cizzle Biotechnology Limited Methods and compounds for the diagnosis and treatment of cancer
WO2012030856A2 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and reaction mixtures for the detection of xenotropic murine leukemia virus-related virus
WO2012031243A2 (en) 2010-09-03 2012-03-08 Avi Biopharma, Inc. dsRNA MOLECULES COMPRISING OLIGONUCLEOTIDE ANALOGS HAVING MODIFIED INTERSUBUNIT LINKAGES AND/OR TERMINAL GROUPS
EP2616555B1 (en) 2010-09-16 2017-11-08 Gen-Probe Incorporated Capture probes immobilizable via l-nucleotide tail
GEP20156313B (en) 2010-09-22 2015-07-10 Alios Biopharma Inc Substituted nucleotide analogs
JP5868324B2 (ja) 2010-09-24 2016-02-24 株式会社Ｗａｖｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｊａｐａｎ 不斉補助基
GB2497495B (en) 2010-10-04 2018-06-06 Gen Probe Prodesse Inc Compositions, methods and kits to detect adenovirus nucleic acids
US20140134231A1 (en) 2010-10-11 2014-05-15 Sanford-Burnham Medical Research Institute Mir-211 expression and related pathways in human melanoma
WO2012061412A1 (en) 2010-11-01 2012-05-10 Gen-Probe Incorporated Integrated capture and amplification of target nucleic acid for sequencing
US8569220B2 (en) 2010-11-12 2013-10-29 Jelmar, Llc Hard surface cleaning composition
WO2012068405A2 (en) 2010-11-17 2012-05-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of alpha synuclein expression
AU2011338682B2 (en) 2010-12-06 2017-04-27 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double stranded oligonucleotide compounds comprising threose modifications
DK3202760T3 (da) 2011-01-11 2019-11-25 Alnylam Pharmaceuticals Inc Pegylerede lipider og deres anvendelse til lægemiddelfremføring
EP2474617A1 (en) 2011-01-11 2012-07-11 InteRNA Technologies BV Mir for treating neo-angiogenesis
SG193280A1 (en) 2011-03-03 2013-10-30 Quark Pharmaceuticals Inc Oligonucleotide modulators of the toll-like receptor pathway
JP6000287B2 (ja) 2011-03-03 2016-09-28 クォーク ファーマシューティカルズ インコーポレーティッドＱｕａｒｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． 肺疾患および損傷を治療するための組成物および方法
US9512467B2 (en) 2011-03-10 2016-12-06 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for the selection and optimization of oligonucleotide tag sequences
EP3272886B1 (en) 2011-04-25 2019-09-25 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting bv-associated bacterial nucleic acid
TWI658830B (zh) 2011-06-08 2019-05-11 日東電工股份有限公司 Ｈｓｐ47表現調控強化用類視色素脂質體
US10196637B2 (en) 2011-06-08 2019-02-05 Nitto Denko Corporation Retinoid-lipid drug carrier
WO2012170347A1 (en) 2011-06-09 2012-12-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
US20140227293A1 (en) 2011-06-30 2014-08-14 Trustees Of Boston University Method for controlling tumor growth, angiogenesis and metastasis using immunoglobulin containing and proline rich receptor-1 (igpr-1)
JP6150795B2 (ja) 2011-07-15 2017-06-28 ジェン−プロウブ インコーポレイテッド シングルプレックス又はマルチプレックスアッセイにおいてヒトパルボウイルス核酸を検出及びａ型肝炎ウイルス核酸を検出するための組成物及び方法
CN103796657B (zh) 2011-07-19 2017-07-11 波涛生命科学有限公司 合成官能化核酸的方法
EP2742135B2 (en) 2011-08-11 2020-06-10 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Linkage modified gapped oligomeric compounds and uses thereof
EP2751270B1 (en) 2011-08-29 2018-08-22 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomer-conjugate complexes and their use
EP3620533B1 (en) 2011-09-06 2023-01-18 Gen-Probe Incorporated Closed nucleic acid structures
EP2753714B1 (en) 2011-09-06 2017-04-12 Gen-Probe Incorporated Circularized templates for sequencing
EP3255155B1 (en) 2011-09-08 2019-04-24 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting bv-associated bacterial nucleic acid
WO2013040251A2 (en) 2011-09-13 2013-03-21 Asurgen, Inc. Methods and compositions involving mir-135b for distinguishing pancreatic cancer from benign pancreatic disease
JP6250543B2 (ja) 2011-09-27 2017-12-20 アルニラム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド ジ脂肪族置換ｐｅｇ化脂質
WO2013063519A1 (en) 2011-10-26 2013-05-02 Asuragen, Inc. Methods and compositions involving mirna expression levels for distinguishing pancreatic cysts
AU2012332517B9 (en) 2011-11-03 2017-08-10 Quark Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for neuroprotection
AU2012318290B2 (en) 2011-11-04 2015-07-30 Gen-Probe Incorporated Molecular assay reagents and methods
US20140323549A1 (en) 2011-11-08 2014-10-30 Quark Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for treating diseases, disorders or injury of the nervous system
EA202090338A1 (ru) 2011-11-18 2021-04-30 Сарепта Терапьютикс, Инк. Функционально-модифицированные олигонуклеотиды и их субъединицы
DE102011120550B4 (de) 2011-12-05 2013-11-07 Gen-Probe Prodesse, Inc. Zusammensetzungen, Verfahren und Kits zur Detektion von Adenovirusnukleinsäuren
EP2794630A4 (en) 2011-12-22 2015-04-01 Alios Biopharma Inc SUBSTITUTED PHOSPHORTHIOAT NUCLEOTIDE ANALOGUE
US10174314B2 (en) 2011-12-22 2019-01-08 Interna Technologies B.V. MiRNA for treating head and neck cancer
HUE041509T2 (hu) 2011-12-22 2019-05-28 Janssen Biopharma Inc Szubsztituált nukleozidok, nukleotidok és ezek analógjai
US20150216998A1 (en) 2012-01-01 2015-08-06 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Endo180-targeted particles for selective delivery of therapeutic and diagnostic agents
JP2016528161A (ja) 2012-01-12 2016-09-15 クォーク ファーマシューティカルズ インコーポレーティッドＱｕａｒｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． 聴覚およびバランス障害を治療するための併用療法
CN104169438B (zh) 2012-02-01 2019-02-26 简·探针公司 非对称发夹靶标捕获低聚物
WO2013123996A1 (en) 2012-02-24 2013-08-29 Astrazeneca Uk Limited Novel sirna inhibitors of human icam-1
EP2822963A2 (en) 2012-03-09 2015-01-14 Vestaron Corporation Toxic peptide production, peptide expression in plants and combinations of cysteine rich peptides
EP2639238A1 (en) 2012-03-15 2013-09-18 Universität Bern Tricyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
CN104321333A (zh) 2012-03-21 2015-01-28 沃泰克斯药物股份有限公司 硫代氨基磷酸酯核苷酸前药的固体形式
USRE48171E1 (en) 2012-03-21 2020-08-25 Janssen Biopharma, Inc. Substituted nucleosides, nucleotides and analogs thereof
US9441007B2 (en) 2012-03-21 2016-09-13 Alios Biopharma, Inc. Substituted nucleosides, nucleotides and analogs thereof
WO2013142157A1 (en) 2012-03-22 2013-09-26 Alios Biopharma, Inc. Pharmaceutical combinations comprising a thionucleotide analog
US9221864B2 (en) 2012-04-09 2015-12-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Tricyclic nucleic acid analogs
WO2013154799A1 (en) 2012-04-09 2013-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. Tricyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
AU2013205110B2 (en) 2012-04-24 2016-10-13 Gen-Probe Incorporated Compositions, Methods and Kits to Detect Herpes Simplex Virus Nucleic Acids
WO2013179289A1 (en) 2012-05-31 2013-12-05 Bio-Lab Ltd. Pyrazolotriazolyl nucleoside analogues and oligonucleotides comprising them
AU2013205064B2 (en) 2012-06-04 2015-07-30 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Amplifying and Characterizing HCV Nucleic Acid
AU2013205087B2 (en) 2012-07-13 2016-03-03 Gen-Probe Incorporated Method for detecting a minority genotype
SG11201500239VA (en) 2012-07-13 2015-03-30 Wave Life Sciences Japan Asymmetric auxiliary group
AU2013202793B2 (en) 2012-07-31 2014-09-18 Gen-Probe Incorporated System, method and apparatus for automated incubation
ES2761920T3 (es) 2012-08-30 2020-05-21 Gen Probe Inc Amplificación de ácido nucleico multifásica
DK2895608T3 (en) 2012-09-12 2019-01-21 Quark Pharmaceuticals Inc DOUBLE-STRENGTHED OIGONUCLEOTIDE MOLECULES FOR P53 AND PROCEDURES FOR USING IT
WO2014043291A1 (en) 2012-09-12 2014-03-20 Quark Pharmaceuticals, Inc. Double-stranded nucleic acid compounds
ES2872349T3 (es) 2012-09-12 2021-11-02 Quark Pharmaceuticals Inc Moléculas de oligonucleótidos bicatenarios para DDIT4 y métodos de uso de las mismas
EP2897633B1 (en) 2012-09-18 2020-01-01 UTI Limited Partnership Treatment of pain by inhibition of usp5 de-ubiquitinase
US20140100124A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Asuragen, Inc. Diagnostic mirnas for differential diagnosis of incidental pancreatic cystic lesions
AU2013205122B2 (en) 2012-10-11 2016-11-10 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Detecting Human Papillomavirus Nucleic Acid
US9029335B2 (en) 2012-10-16 2015-05-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted 2′-thio-bicyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
US10201556B2 (en) 2012-11-06 2019-02-12 Interna Technologies B.V. Combination for use in treating diseases or conditions associated with melanoma, or treating diseases or conditions associated with activated B-raf pathway
AU2013205090B2 (en) 2012-12-07 2016-07-28 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Detecting Gastrointestinal Pathogen Nucleic Acid
US10398661B2 (en) 2013-02-28 2019-09-03 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods for classifying a cancer as susceptible to TMEPAI-directed therapies and treating such cancers
US10174352B2 (en) 2013-03-14 2019-01-08 Aegea Biotechnologies, Inc. Methods for amplification of nucleic acids on solid support
JP2016512696A (ja) 2013-03-15 2016-05-09 アーノルド, ライル, ジェイ.ARNOLD, Lyle, J. アセンブラ配列を利用する断片化された標的核酸の増幅方法
US9944992B2 (en) 2013-03-15 2018-04-17 The University Of Chicago Methods and compositions related to T-cell activity
WO2014145138A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Arnold Lyle J Methods for amplification of nucleic acids utilizing clamp oligonuleotides
WO2014160871A2 (en) 2013-03-27 2014-10-02 The General Hospital Corporation Methods and agents for treating alzheimer's disease
AU2014259759B2 (en) 2013-05-01 2020-06-18 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods
CN105452465B (zh) 2013-07-31 2019-06-21 奇比艾企业有限公司 鞘脂-聚烷基胺-寡核苷酸化合物
EP3027223A1 (en) 2013-07-31 2016-06-08 QBI Enterprises Ltd. Methods of use of sphingolipid polyalkylamine oligonucleotide compounds
US10053742B2 (en) 2013-08-14 2018-08-21 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting HEV nucleic acid
EP2853595A1 (en) 2013-09-30 2015-04-01 Soluventis GmbH NOTCH 1 specific siRNA molecules
US11162096B2 (en) 2013-10-14 2021-11-02 Ionis Pharmaceuticals, Inc Methods for modulating expression of C9ORF72 antisense transcript
CA2929555A1 (en) 2013-11-08 2015-05-14 Baylor Research Institute Nuclear localization of glp-1 stimulates myocardial regeneration and reverses heart failure
DK3077510T3 (da) 2013-12-02 2020-06-08 Ionis Pharmaceuticals Inc Antisense-forbindelser og anvendelser deraf
KR102423317B1 (ko) 2014-01-16 2022-07-22 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 키랄 디자인
WO2015123551A1 (en) 2014-02-13 2015-08-20 Du Luqin Microrna composition for the treatment of neuroblastoma
EP3119789B1 (en) 2014-03-17 2020-04-22 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic carbocyclic nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
IL247600B (en) 2014-03-19 2022-06-01 Ionis Pharmaceuticals Inc Preparations for the modulation of ataxin 2 expression
US10006027B2 (en) 2014-03-19 2018-06-26 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods for modulating Ataxin 2 expression
SI3126499T1 (sl) 2014-04-01 2020-09-30 Biogen Ma Inc. Sestave za moduliranje izražanja SOD-1
WO2015164693A1 (en) 2014-04-24 2015-10-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising alpha-beta-constrained nucleic acid
EP3137476B1 (en) 2014-04-28 2019-10-09 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Linkage modified oligomeric compounds
BR122020024443B1 (pt) 2014-05-01 2022-02-22 Ionis Pharmaceuticals, Inc Composto e composição farmacêutica para modulação da expressão de angptl3
RU2701645C2 (ru) 2014-05-01 2019-09-30 Ионис Фармасьютикалз, Инк. Композиции и способы модулирования экспрессии фактора комплемента в
EP4039807A1 (en) 2014-06-10 2022-08-10 Erasmus University Rotterdam Medical Center Antisense oligonucleotides useful in treatment of pompe disease
WO2016033424A1 (en) 2014-08-29 2016-03-03 Genzyme Corporation Methods for the prevention and treatment of major adverse cardiovascular events using compounds that modulate apolipoprotein b
US11390885B2 (en) 2014-09-15 2022-07-19 Children's Medical Center Corporation Methods and compositions to increase somatic cell nuclear transfer (SCNT) efficiency by removing histone H3-lysine trimethylation
US20170304459A1 (en) 2014-10-10 2017-10-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for inhalation delivery of conjugated oligonucleotide
EP3739062B1 (en) 2014-10-20 2023-08-16 Gen-Probe Incorporated Red blood cell lysis solution
WO2016083624A1 (en) 2014-11-28 2016-06-02 Silence Therapeutics Gmbh Means for inhibiting the expression of edn1
EP3230445B1 (en) 2014-12-12 2024-01-24 Tod M. Woolf Compositions and methods for editing nucleic acids in cells utilizing oligonucleotides
JP2018504380A (ja) 2014-12-18 2018-02-15 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． Ｒｅｖｅｒｓｉｒ（商標）化合物
US9688707B2 (en) 2014-12-30 2017-06-27 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic morpholino compounds and oligomeric compounds prepared therefrom
US10793855B2 (en) 2015-01-06 2020-10-06 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for modulating expression of C9ORF72 antisense transcript
WO2016112252A1 (en) 2015-01-09 2016-07-14 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for diagnosing bacterial vaginosis
WO2016115490A1 (en) 2015-01-16 2016-07-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulation of dux4
US11421229B2 (en) 2015-02-20 2022-08-23 Baylor College Of Medicine p63 inactivation for the treatment of heart failure
US11129844B2 (en) 2015-03-03 2021-09-28 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating MECP2 expression
EP3271484B1 (en) 2015-03-16 2021-06-02 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for detecting bacterial nucleic acid and diagnosing bacterial vaginosis
US10407678B2 (en) 2015-04-16 2019-09-10 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions for modulating expression of C9ORF72 antisense transcript
EP3302489A4 (en) 2015-06-04 2019-02-06 Sarepta Therapeutics, Inc. METHOD AND COMPOUNDS FOR THE TREATMENT OF DISEASES AND SUFFERING IN CONNECTION WITH LYMPHOCYTES
EP3324980B1 (en) 2015-07-17 2021-11-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Multi-targeted single entity conjugates
EP3353303B1 (en) 2015-09-25 2023-08-02 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating ataxin 3 expression
CA3001005A1 (en) 2015-10-14 2017-04-20 Bio-Path Holding, Inc. P-ethoxy nucleic acids for liposomal formulation
MX2018005277A (es) 2015-11-06 2018-08-01 Ionis Pharmaceuticals Inc Modular la expresion de apolipoproteina (a).
EP3389670A4 (en) 2015-12-04 2020-01-08 Ionis Pharmaceuticals, Inc. METHODS OF TREATING BREAST CANCER
WO2017099579A1 (en) 2015-12-07 2017-06-15 Erasmus University Medical Center Rotterdam Enzymatic replacement therapy and antisense therapy for pompe disease
EP4249609A3 (en) 2016-01-04 2023-12-20 Gen-Probe Incorporated Methods and compositions for detecting candida species
WO2017120365A1 (en) 2016-01-05 2017-07-13 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods for reducing lrrk2 expression
EP3429690A4 (en) 2016-03-16 2019-10-23 Ionis Pharmaceuticals, Inc. METHOD FOR MODULATING KEAP1
US10577607B2 (en) 2016-03-16 2020-03-03 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of DYRK1B expression
US20190177391A1 (en) 2016-03-31 2019-06-13 Baylor Research Institute Angiopoietin-like protein 8 (angptl8)
EP3228326A1 (en) 2016-04-05 2017-10-11 Silence Therapeutics GmbH Nucleic acid linked to a trivalent glycoconjugate
EP3443090A4 (en) 2016-04-14 2019-12-11 University of Florida Research Foundation, Incorporated USE OF MIR-223-3P AS CANCER THERAPEUTIC AND METHOD FOR THE TREATMENT OF CANCER THEREWITH
AU2017286811A1 (en) 2016-06-17 2018-11-22 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of gys1 expression
NL2017295B1 (en) 2016-08-05 2018-02-14 Univ Erasmus Med Ct Rotterdam Antisense oligomeric compound for Pompe disease
NL2017294B1 (en) 2016-08-05 2018-02-14 Univ Erasmus Med Ct Rotterdam Natural cryptic exon removal by pairs of antisense oligonucleotides.
KR20190053905A (ko) 2016-09-16 2019-05-20 바이오-패쓰 홀딩스 인크. 리포솜 안티센스 올리고뉴클레오타이드와의 병용 요법
KR20190065341A (ko) 2016-10-06 2019-06-11 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 올리고머 화합물들의 접합 방법
AU2017346854B2 (en) 2016-10-19 2024-05-23 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting or quantifying hepatitis C virus
JOP20190104A1 (ar) 2016-11-10 2019-05-07 Ionis Pharmaceuticals Inc مركبات وطرق لتقليل التعبير عن atxn3
CN110088302A (zh) 2016-11-21 2019-08-02 简·探针公司 用于检测或定量乙型肝炎病毒的组合物和方法
EP3548620A4 (en) 2016-12-02 2020-07-22 Cold Spring Harbor Laboratory MODULATION OF THE EXPRESSION OF LNC05
NZ754739A (en) 2016-12-22 2024-01-26 Intellia Therapeutics Inc Compositions and methods for treating alpha-1 antitrypsin deficiency
US11197928B2 (en) 2017-01-13 2021-12-14 Board Of Regents, The University Of Texas System Sustained production of high affinity antigen specific antibody by high dose BAFF receptor-targeting mAb-siRNA conjugate
US11180756B2 (en) 2017-03-09 2021-11-23 Ionis Pharmaceuticals Morpholino modified oligomeric compounds
WO2018175883A1 (en) 2017-03-24 2018-09-27 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting or quantifying parainfluenza virus
EP3601618A1 (en) 2017-03-25 2020-02-05 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits to detect adenovirus, metapneumovirus and/or rhinovirus nucleic acids
EP3385272A1 (en) 2017-04-05 2018-10-10 Silence Therapeutics GmbH Further novel oligonucleotide-ligand conjugates
WO2018185253A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Silence Therapeutics Gmbh Ligand modified double-stranded nucleic acids
WO2018185252A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Silence Therapeutics Gmbh Nucleic acid conjugates
WO2018209068A1 (en) 2017-05-11 2018-11-15 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for isolating target nucleic acids
EP4276201A3 (en) 2017-06-07 2024-01-17 Gen-Probe Incorporated Detecting babesia species nucleic acid in a sample
US20210155978A1 (en) 2017-07-10 2021-05-27 Gen-Probe Incorporated Analytical systems and methods for nucleic acid amplification using sample assigning parameters
EP3665309B1 (en) 2017-08-11 2023-02-22 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting staphylococcus aureus
EP3668984A4 (en) 2017-08-18 2021-09-08 Ionis Pharmaceuticals, Inc. MODULATION OF THE NOTCH SIGNALING PATH FOR THE TREATMENT OF RESPIRATORY DISORDERS
US10517889B2 (en) 2017-09-08 2019-12-31 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulators of SMAD7 expression
MX2020003608A (es) 2017-09-29 2020-09-25 Intellia Therapeutics Inc Composiciones y métodos para la edición del gen ttr y el tratamiento de la amiloidosis attr.
SG11202002562QA (en) 2017-09-29 2020-04-29 Intellia Therapeutics Inc Polynucleotides, compositions, and methods for genome editing
WO2019087144A1 (en) 2017-11-02 2019-05-09 Alios Biopharma, Inc. Oligonucleotide constructs and uses thereof
EP3704250A1 (en) 2017-11-03 2020-09-09 InteRNA Technologies B.V. Mirna molecule, equivalent, antagomir, or source thereof for treating and/or diagnosing a condition and/or a disease associated with neuronal deficiency or for neuronal (re)generation
TWI809004B (zh) 2017-11-09 2023-07-21 美商Ionis製藥公司 用於降低snca表現之化合物及方法
CN111465707A (zh) 2017-11-17 2020-07-28 简·探针公司 用于检测C1orf43核酸的组合物和方法
US11662281B2 (en) 2017-12-13 2023-05-30 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for biological sample processing
EP3724354A1 (en) 2017-12-15 2020-10-21 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting toxigenic clostridium difficile
WO2019126641A2 (en) 2017-12-21 2019-06-27 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of frataxin expression
PE20211242A1 (es) 2018-01-15 2021-07-09 Ionis Pharmaceuticals Inc Moduladores de la expresion dnm2
US20190233816A1 (en) 2018-01-26 2019-08-01 Massachusetts Institute Of Technology Structure-guided chemical modification of guide rna and its applications
WO2019148169A1 (en) 2018-01-29 2019-08-01 Gen-Probe Incorporated Analytical systems and methods
JP2021513508A (ja) 2018-02-12 2021-05-27 インテアールエヌエー テクノロジーズ ビー．ヴイ．ＩｎｔｅＲＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｂ．Ｖ． 抗がんマイクロｒｎａ及びその脂質製剤
AU2019228607B2 (en) 2018-03-02 2024-03-07 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulators of IRF4 expression
US11732260B2 (en) 2018-03-02 2023-08-22 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for the modulation of amyloid-β precursor protein
US11661601B2 (en) 2018-03-22 2023-05-30 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Methods for modulating FMR1 expression
EP3549610A1 (en) 2018-04-05 2019-10-09 Silence Therapeutics GmbH Nucleic acid conjugates
CN112041440A (zh) 2018-04-11 2020-12-04 Ionis制药公司 Ezh2表达的调节剂
MX2020011911A (es) 2018-05-09 2021-01-29 Ionis Pharmaceuticals Inc Compuestos y metodos para reducir de la expresion de atxn3.
JOP20200280A1 (ar) 2018-05-09 2020-11-05 Ionis Pharmaceuticals Inc مركبات وطرق لتقليل التعبير الوراثي عن fxi
GB2590210B (en) 2018-06-13 2023-01-25 Gen Probe Inc Compositions and methods for detecting group B Streptococcus nucleic acid
AU2019287635A1 (en) 2018-06-14 2020-12-17 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for increasing STMN2 expression
UY38282A (es) 2018-06-27 2019-12-31 Ionis Pharmaceuticals Inc Compuestos y métodos para la reducción de la expresión de lrrk2
JP7470095B2 (ja) 2018-07-10 2024-04-17 ジェン－プローブ・インコーポレーテッド 核酸を検出および定量するための方法およびシステム
AU2019310097A1 (en) 2018-07-25 2021-02-04 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for reducing ATXN2 expression
JP2021531804A (ja) 2018-07-31 2021-11-25 インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド 原発性高シュウ酸尿症１型（ｐｈ１）を治療するためのヒドロキシ酸オキシダーゼ１（ｈａｏ１）遺伝子編集のための組成物および方法
JP7469290B2 (ja) 2018-08-01 2024-04-16 ジェン－プローブ・インコーポレーテッド エプスタイン－バールウイルスの核酸を検出するための組成物および方法
EP3841223A1 (en) 2018-08-08 2021-06-30 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for detecting mycoplasma genitalium
JP2021534101A (ja) 2018-08-09 2021-12-09 ヴェルソー セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｃｃｒ２及びｃｓｆ１ｒを標的とするためのオリゴヌクレオチド組成物ならびにその使用
WO2020041414A1 (en) 2018-08-21 2020-02-27 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for amplifying, detecting or quantifying human cytomegalovirus
KR20210063347A (ko) 2018-08-24 2021-06-01 젠-프로브 인코포레이티드 세균성 핵산을 검출하고 세균성 질염을 진단하기 위한 조성물 및 방법
WO2020069085A2 (en) 2018-09-27 2020-04-02 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting bordetella pertussis and bordetella parapertussis nucleic acid
AU2019347517A1 (en) 2018-09-28 2021-05-06 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for lactate dehydrogenase (LDHA) gene editing
AU2019362879A1 (en) 2018-10-16 2021-05-27 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for immunotherapy
JP7472121B2 (ja) 2018-10-18 2024-04-22 インテリア セラピューティクス，インコーポレーテッド アルブミン遺伝子座からの導入遺伝子発現のための組成物及び方法
MX2021004282A (es) 2018-10-18 2021-09-08 Intellia Therapeutics Inc Construcciones de ácido nucleico y métodos de uso.
CA3116331A1 (en) 2018-10-18 2020-04-23 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for expressing factor ix
WO2020082047A1 (en) 2018-10-18 2020-04-23 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating alpha-1 antitrypsin deficiencey
CA3116895A1 (en) 2018-10-22 2020-04-30 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for amplifying, detecting or quantifying human polyomavirus bk virus
TW202028222A (zh) 2018-11-14 2020-08-01 美商Ionis製藥公司 Foxp3表現之調節劑
JP2022509059A (ja) 2018-11-15 2022-01-20 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド Ｉｒｆ５発現の調節因子
TW202030333A (zh) 2018-12-20 2020-08-16 美商簡 探針公司 用於檢測瘧原蟲物種核酸之組成物及方法
US11214803B2 (en) 2019-01-31 2022-01-04 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Modulators of YAP1 expression
MX2021010152A (es) 2019-02-27 2021-09-14 Ionis Pharmaceuticals Inc Moduladores de la expresion de malat1.
US20220098647A1 (en) 2019-03-22 2022-03-31 Gen-Probe Incorporated Compositions and Methods for Detecting Group A Streptococcus
EP3946598A1 (en) 2019-03-28 2022-02-09 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods comprising a ttr guide rna and a polynucleotide encoding an rna-guided dna binding agent
CA3135172A1 (en) 2019-03-28 2020-10-01 Intellia Therapeutics, Inc. Polynucleotides, compositions, and methods for polypeptide expression
WO2020198706A1 (en) 2019-03-28 2020-10-01 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for ttr gene editing and treating attr amyloidosis comprising a corticosteroid or use thereof
JOP20210261A1 (ar) 2019-03-29 2023-01-30 Ionis Pharmaceuticals Inc مركبات وطرق لتعديل ube3a-ats
CN118083476A (zh) 2019-05-03 2024-05-28 简·探针公司 用于分析系统的容器输送系统
US20220307093A1 (en) 2019-07-03 2022-09-29 Gen-Probe Incorporated Oligonucleotides for use in determining the presence of trichomonas vaginalis in a sample
EP3956450A4 (en) 2019-07-26 2022-11-16 Ionis Pharmaceuticals, Inc. COMPOUNDS AND METHODS FOR MODULATION OF GFAP
JP2022544587A (ja) 2019-08-15 2022-10-19 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド 結合修飾オリゴマー化合物及びその使用
CA3152309A1 (en) 2019-08-23 2021-03-04 Gen-Probe Incorporated Compositions, methods and kits for detecting treponema pallidum
WO2021041546A1 (en) 2019-08-27 2021-03-04 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and methods for treatment of disorders associated with repetitive dna
US20220333162A1 (en) 2019-09-05 2022-10-20 Gen-Probe Incorporated Detection of chlamydia trachomatis nucleic acid variants
EP4058187A1 (en) 2019-11-14 2022-09-21 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for capturing target nucleic acids
SG10201914033YA (en) 2019-12-31 2021-07-29 Wilmar International Ltd Polypeptides with Lipase Activity and Uses Thereof
US20230227896A1 (en) 2020-01-16 2023-07-20 Dnae Diagnostics Limited Compositions, Kits and Methods for Isolating Target Polynucleotides
BR112022014992A2 (pt) 2020-01-31 2022-10-11 Regeneron Pharma Métodos de caracterização de uma amostra, de tratamento, para fazer uma composição e de caracterização de uma amostra, e, composição
BR112022016238A2 (pt) 2020-02-28 2022-10-11 Ionis Pharmaceuticals Inc Compostos e métodos para modular smn2
EP4143304A2 (en) 2020-04-28 2023-03-08 Intellia Therapeutics, Inc. Methods of in vitro cell delivery
JP2023524065A (ja) 2020-05-01 2023-06-08 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド Ａｔｘｎ１を調節するための化合物及び方法
EP4146821A1 (en) 2020-05-07 2023-03-15 Grifols Diagnostic Solutions Inc. Methods and compositions for detecting sars-cov-2 nucleic acid
EP3922720A1 (en) 2020-06-09 2021-12-15 Universidad de Murcia Therapy to prevent adverse cardiac remodeling following an acute myocardial infarction
KR20230029837A (ko) 2020-06-29 2023-03-03 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 Plp1을 조절하기 위한 화합물 및 방법
JP2023534457A (ja) 2020-07-17 2023-08-09 ジェン－プローブ・インコーポレーテッド マクロライド耐性Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅｎｉｔａｌｉｕｍの検出
WO2022034555A1 (en) 2020-08-13 2022-02-17 Janssen Biopharma, Inc. Polynucleotide constructs and uses thereof
US20220096606A1 (en) 2020-09-09 2022-03-31 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and Methods for Treatment of Duchenne Muscular Dystrophy
US20230393163A1 (en) 2020-10-21 2023-12-07 Gen-Probe Incorporated Fluid container management system
US20230414648A1 (en) 2020-11-06 2023-12-28 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and Methods for Treatment of DM1 with SLUCAS9 and SACAS9
TW202227101A (zh) 2020-11-18 2022-07-16 美商Ionis製藥公司 用於調節血管收縮素原表現之化合物及方法
TW202235617A (zh) 2020-12-11 2022-09-16 美商英特利亞醫療公司 用於減少細胞中ii類mhc之組合物及方法
EP4259792A1 (en) 2020-12-11 2023-10-18 Intellia Therapeutics, Inc. Polynucleotides, compositions, and methods for genome editing involving deamination
TW202239959A (zh) 2020-12-23 2022-10-16 美商英特利亞醫療公司 用於減少細胞中hla-a之組合物及方法
JP2024501246A (ja) 2020-12-23 2024-01-11 インテリア セラピューティクス，インコーポレイテッド 細胞中のｃｉｉｔａを遺伝子修飾するための組成物及び方法
CA3206484A1 (en) 2020-12-30 2022-07-07 Intellia Therapeutics, Inc. Engineered t cells
US20240110160A1 (en) 2021-01-15 2024-04-04 Board Of Regents, The University Of Texas System A trans-complementation system for sars-cov-2
WO2022170172A1 (en) 2021-02-08 2022-08-11 Intellia Therapeutics, Inc. Natural killer cell receptor 2b4 compositions and methods for immunotherapy
WO2022170194A2 (en) 2021-02-08 2022-08-11 Intellia Therapeutics, Inc. Lymphocyte activation gene 3 (lag3) compositions and methods for immunotherapy
CN117042794A (zh) 2021-02-08 2023-11-10 因特利亚治疗公司 用于免疫疗法的t细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(tim3)组合物和方法
WO2022182959A1 (en) 2021-02-26 2022-09-01 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and methods for treatment of myotonic dystrophy type 1 with crispr/slucas9
WO2022182957A1 (en) 2021-02-26 2022-09-01 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and methods for treatment of myotonic dystrophy type 1 with crispr/sacas9
AU2022237386A1 (en) 2021-03-15 2023-10-05 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for biological sample processing
WO2022204476A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Nucleotide editing to reframe dmd transcripts by base editing and prime editing
WO2022229851A1 (en) 2021-04-26 2022-11-03 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for using slucas9 scaffold sequences
WO2022234519A1 (en) 2021-05-05 2022-11-10 Crispr Therapeutics Ag Compositions and methods for using sacas9 scaffold sequences
EP4355759A1 (en) 2021-06-18 2024-04-24 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for reducing ifnar1 expression
KR20240038705A (ko) 2021-06-22 2024-03-25 인텔리아 테라퓨틱스, 인크. 간 유전자의 생체 내 편집 방법
GB202110485D0 (en) 2021-07-21 2021-09-01 Dnae Diagnostics Ltd Compositions, kits and methods for sequencing target polynucleotides
GB202110479D0 (en) 2021-07-21 2021-09-01 Dnae Diagnostics Ltd Compositions, kits and methods for sequencing target polynucleotides
WO2023002203A1 (en) 2021-07-21 2023-01-26 Dnae Diagnostics Limited Method and system comprising a cartridge for sequencing target polynucleotides
WO2023010008A1 (en) 2021-07-27 2023-02-02 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for detecting gastrointestinal pathogens
WO2023018637A1 (en) 2021-08-09 2023-02-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Gene editing of regulatory elements
WO2023028471A1 (en) 2021-08-24 2023-03-02 Intellia Therapeutics, Inc. Programmed cell death protein 1 (pd1) compositions and methods for cell-based therapy
WO2023039444A2 (en) 2021-09-08 2023-03-16 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Precise excisions of portions of exon 51 for treatment of duchenne muscular dystrophy
US20230193406A1 (en) 2021-09-22 2023-06-22 Herbalife International Of America, Inc. Methods and compositions for processing botanical materials
CA3237303A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Intellia Therapeutics, Inc. Polynucleotides, compositions, and methods for genome editing
WO2023081200A2 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Intellia Therapeutics, Inc. Cd38 compositions and methods for immunotherapy
WO2023172926A1 (en) 2022-03-08 2023-09-14 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Precise excisions of portions of exons for treatment of duchenne muscular dystrophy
TW202345911A (zh) 2022-03-08 2023-12-01 美商維泰克斯製藥公司 用於治療杜興氏肌肉失養症(duchenne muscular dystrophy)之部分外顯子44、50及53之精確切除
WO2023185697A2 (en) 2022-03-29 2023-10-05 Accuredit Therapeutics (Suzhou) Co., Ltd. Compositions and methods for treatment of transthyretin amyloidosis
WO2023205606A1 (en) 2022-04-18 2023-10-26 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Compositions and methods for enhancing aav therapy and decreasing tropism of aav to the liver
WO2023205148A1 (en) 2022-04-19 2023-10-26 Intellia Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptor compositions and uses
WO2023245113A1 (en) 2022-06-16 2023-12-21 Intellia Therapeutics, Inc. Methods and compositions for genetically modifying a cell
WO2023245108A2 (en) 2022-06-16 2023-12-21 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for reducing mhc class i in a cell
WO2023245109A2 (en) 2022-06-16 2023-12-21 Intellia Therapeutics, Inc. Compositions and methods for genomic editing
WO2024006955A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Intellia Therapeutics, Inc. Engineered t cells
WO2024020352A1 (en) 2022-07-18 2024-01-25 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Tandem guide rnas (tg-rnas) and their use in genome editing
WO2024026474A1 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for transferrin receptor (tfr)-mediated delivery to the brain and muscle
EP4311579A1 (en) 2022-07-29 2024-01-31 Association Française contre les Myopathies B cell-specific mab-sirna conjugates improve myasthenia
WO2024035952A1 (en) 2022-08-12 2024-02-15 Remix Therapeutics Inc. Methods and compositions for modulating splicing at alternative splice sites
WO2024054924A1 (en) 2022-09-08 2024-03-14 Gen-Probe Incorporated Method of detecting nucleic acid analytes using dual-specificity primers
WO2024061296A2 (en) 2022-09-22 2024-03-28 Accuredit Therapeutics (Suzhou) Co., Ltd. Compositions and methods for treatment of hypercholesterolemia and/or cardiovascular disease
WO2024098002A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Calcium voltage-gated channel auxiliary subunit gamma 1 (cacng1) binding proteins and cacng1-mediated delivery to skeletal muscle
WO2024102677A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions
WO2024107765A2 (en) 2022-11-14 2024-05-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for fibroblast growth factor receptor 3-mediated delivery to astrocytes

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1340645C (en) * 1987-04-17 1999-07-13 Victor E. Marquez Acid stable dideoxynucleosides active against the cytopathic effects of human immunodeficiency virus
IL90359A0 (en) * 1988-05-26 1989-12-15 University Patents Inc Nucleoside and polynucleotide thiophosphoramidite and phosphorodithioate compounds and their production
US5216141A (en) * 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
JPH0231686A (ja) * 1988-07-22 1990-02-01 Yuki Gosei Kogyo Co Ltd トリフルオロチミジンの製造方法
JPH0725785B2 (ja) * 1989-01-11 1995-03-22 日本臓器製薬株式会社 アデノシン誘導体及び該化合物を有効成分として含有する医薬組成物
FR2642074B1 (fr) * 1989-01-20 1994-04-29 Oris Ind Derives de molecules polyhydroxylees permettant l'introduction d'au moins une ramification dans un oligonucleotide
GB8920534D0 (en) * 1989-09-11 1989-10-25 Wellcome Found Antiviral compounds
US5378825A (en) * 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
DK0541722T3 (da) * 1990-08-03 1996-04-22 Sterling Winthrop Inc Forbindelser og fremgangsmåder til inhibering af genekspression
JPH06505704A (ja) * 1990-09-20 1994-06-30 ギリアド　サイエンシズ，インコーポレイテッド 改変ヌクレオシド間結合
WO1993012135A1 (en) * 1991-12-12 1993-06-24 Gilead Sciences, Inc. Nuclease stable and binding competent oligomers and methods for their use
KR930016437A (ko) * 1992-01-22 1993-08-26 귀틀라인, 슈미트 올리고뉴클레오티드 유사체, 이의 제조방법 및 용도
AU678968B2 (en) * 1992-05-29 1997-06-19 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates

Also Published As

Publication number Publication date
DE69231441T2 (de) 2001-03-22
DE69230935D1 (de) 2000-05-25
FI935113A0 (fi) 1993-11-18
EP1004593A2 (en) 2000-05-31
ATE191933T1 (de) 2000-05-15
JPH06504067A (ja) 1994-05-12
HU9303290D0 (en) 1994-03-28
CA2103378A1 (en) 1992-11-22
NO934180L (no) 1994-01-11
NO934179D0 (no) 1993-11-18
JPH06503838A (ja) 1994-04-28
WO1992020822A1 (en) 1992-11-26
BR9206027A (pt) 1994-12-27
JP2625257B2 (ja) 1997-07-02
AU2150292A (en) 1992-12-30
EP1004593A3 (en) 2000-07-19
JP2711180B2 (ja) 1998-02-10
BR9206026A (pt) 1994-12-27
HUT65941A (en) 1994-08-29
HU221806B1 (hu) 2003-01-28
KR0155574B1 (ko) 1998-10-15
IE921849A1 (en) 1992-12-02
EP0586570B1 (en) 2000-09-13
ATE196321T1 (de) 2000-09-15
EP0586570A1 (en) 1994-03-16
KR0156945B1 (ko) 1998-10-15
DE69230935T2 (de) 2000-10-19
EP0586570A4 (en) 1996-01-24
FI935113A (fi) 1994-01-03
FI935114A0 (fi) 1993-11-18
NO308703B1 (no) 2000-10-16
DE69231441D1 (de) 2000-10-19
HU9303289D0 (en) 1994-03-28
HUT66378A (en) 1994-11-28
AU1998692A (en) 1992-12-30
AU662538B2 (en) 1995-09-07
IE921850A1 (en) 1992-12-02
EP0586520B1 (en) 2000-04-19
AU666121B2 (en) 1996-02-01
CA2103464A1 (en) 1992-11-22
NO934180D0 (no) 1993-11-18
FI935114A (fi) 1993-12-30
EP0586520A4 (en) 1996-01-10
NO934179L (no) 1994-01-12
US5378825A (en) 1995-01-03
EP0586520A1 (en) 1994-03-16
WO1992020823A1 (en) 1992-11-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI113870B (fi) Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisten rungosta modifioitujen oligonukleotidianalogien valmistamiseksi
US5965721A (en) Backbone modified oligonucleotide analogues
US5808023A (en) Modified oligonucleotides
US5777092A (en) Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5602240A (en) Backbone modified oligonucleotide analogs
US5618704A (en) Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5489677A (en) Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5792844A (en) Oligonucleoside linkages containing adjacent nitrogen atoms
US5541307A (en) Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
IE83315B1 (en) Backbone modified oligonucleotide analogs
EP0649429B1 (en) Heteroatomic oligonucleoside linkages
WO1994022894A1 (en) Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling

Legal Events

Date Code Title Description
GB Transfer or assigment of application

Owner name: ISIS PHARMACEUTICALS, INC.

MA Patent expired
MA Patent expired