CA2262019C - Procede d'amplification d'une sequence d'un acide nucleique cible - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un procédé d'amplification d'une séquence d'un acide nucléique cible, selon lequel: on dispose au moins: de la séquence d'un acide nucléique cible, d'au moins une amorce oligonucléotidique spécifique de la séquence cible, d'une ou plusieurs activités enzymatiques, de nucléotides; on amplifie, dans des conditions adaptées notamment à l'activité ou les activités enzymatiques, la séquence cible, selon lequel au moins un des nucléotides est un nucléotide préfonctionnalisé, différent des autres nucléotides au moins par la présence d'au moins une fonction réactive de covalence, non protégée, disposée en au moins un site prédéterminé de la base dudit nucléotide, pour obtenir un produit d'amplification préfonctionnalisé comprenant au moins undit nucléotide préfonctionnalisé. L'invention concerne aussi des nucléotides pour mettre en oeuvre ce procédé.

Description

RCV. V(N:EPA-NILE,NCHEN 03 - :25- 9-98 15:(rcr 04 72 69 84 31-= +43 89 23994465;# 8 l Procédé d'amplification d'une séquence d'un acide nucléique cible La présente invention concerne un procédé
d'amplification d'une séquence d'un acide nucléique cible.
On connaît selon le document EP-A-0 285 057, un procédé de traitement d'un nucléotide consistant à introduire sur l'un des éléments constitutifs dudit nucléotide, a savoir le sucre, la base purique ou pyrimidique, et les groupements phosphate, un groupement fonctionnel ayant diverses utilisations et notamment celles de marquage. Le nucléotide ainsi traité
obtenu pourrait être incorporé dans un polynucléotide, notamment sous la forme double-brin sans que la double hélice ne soit déstabilisée par la présence de ce nucléotide.
Toutefois dans ce cas, les groupements fonctionnels fixés sur le nucléotide selon cet art antérieur présentent différents phénomènes tels que par exemple l'encombrement stérique, des interactions hydrophobes ou des phénomènes de compl.exation, qui empêchent la reconnaissance du polynucléotide ayant incorporé ledit nucléotide traité, par la plupart des enzymes, qui reconnaitraient le polynucléotide correspondant, dans lequel ledit nucléotide traité n'a pas été incorporé.

Le document wO-A-92/00989 propose un procédé de marquage, par une protéine, d'une séquence d'acide nucléique, notamment pour obtenir une sonde marquée, par amplification d'un acide nucléique cible. Salon ce procédé, on dispose de nucléotides modifiée différant des nucléotides naturels par la présence d'une fonction réactive, on amplifie pour obtenir une sonde préfonctionnalizée, et on fait réagir la sonde obtenue par l'intermédiaire des fonctions réactives avec une protéine marqueur. A cet effet, la fonction réactive du nucléotide modifié est une fonction nucléophile choisie parmi les fonctions thiol, éventuellement protégées, et amine.
L'inconvénient de ce procédé réside dans le marqueur retenu qui, en raison de sa taille, - le poids moléculaire est de l'ordre de plusieurs milliers - limitera considérablement la vitesse et/ou le rendement du couplage covalent entre ledit marqueur et ladite fonction, ce problème s'accroissant avec le nombre de nucléotides modifiée incorporés dans la sonde. Au surplus, il peut entraîner un ralentissement des réactions dans lesquelles sera impliquée la sonde obtenue, en particulier dans une hybridation.

g c v . VON : EPA -`1l E : N C I 1 E N o:3 ; 2 - 0-98 ts : of > 04 7.1 69 84 81- +49 89 2099,14(,;5:4 9 Conformément â la présente invention, on apporte un procédé d'amplification qui pallie les inconvénients précédemment cités et qui notamment ne perturbe pas l'incorporation des nucléotides et en conséquence n'influence pas de manière significative le rendement et/ou la sensibilité
dans une réaction d'amplification de cible et qui de plus permet d'obtenir un excellent marquage des produits d'amplification en évitant des phénomènes d'instabilité du marqueur liés à une incorporation préalable de ce dernier.
Ainsi, la présente invention a pour objet un procédé
d'amplification d'une séquence d'un acide nucléique cible, selon lequel on dispose au moins de la séquence d'un acide nucléique cible, d'au moins une amorce oligonucléotidique

2 spécifique de la séquence cible, d'une ou plusieurs activités enzymatiques, de nucléotides, - on amplifie, dans des conditions adaptées notamment à l'activité ou les activités enzymatiques, la séquence cible, procédé selon lequel au moins un des nucléotides est un nucléotide préfonctionnalisé, différant des autres nucléotides au moins par la présence d'au moins une fonction réactive de covalence, non protégée, disposée en au moins un site prédéterminé de la base dudit nucléotide, pour obtenir un produit d'amplification préfonctionnalisé comprenant au moins undit nucléotide préfonctionnalisé.
Selon un procédé avantageux de l'invention il comprend en outre les étapes suivantes :
- on dispose d'un réactif comprenant une fonction anti-réactive de covalence, spécifique de la fonction réactive du nucléotide préfonctionnalisé, et un groupement fonctionnel, et - on fait réagir, directement ou indirectement, le produit d'amplification préfonctionnalisé, avec le réactif, pour obtenir un produit d'amplification fonctionnalisé.
Avant d'exposer l'invention de manière détaillée, certains termes employés dans la présente description sont ci-après définis.
Par nucléotide selon l'invention, on entend un monomère nucléotidique naturel ou modifié tel que défini ci-dessous.
Ainsi, le monomère nucléotidique peut être un nucléotide naturel d'acide nucléique dont les éléments constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base azotée; dans l'ARN le sucre est le ribose, dans l'ADN le sucre est le 2'-désoxy-ribose; selon qu'il s'agit de l'ADN ou l'ARN, la base azotée est choisie parmi l'adénine, la guanine, l'uracile, la cytosine, la thymine; ou un nucléotide modifié
dans l'un au moins des trois éléments constitutifs ; à titre d'exemple, la modification peut intervenir au niveau des bases, générant des produits modifiés telles que l'inosine, la méthyl-

3 5-désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine et toute autre base modifiée permettant l'hybridation, au niveau du sucre, à savoir par exemple le remplacement d'au moins un désoxyribose par un analogue (exemple: P.E. Nielsen et al, Science, 254, 1497-1500 (1991)), au niveau du groupement phosphate par exemple des dérivés boronates, alkylphosphonates ou phosphorothioates.
Par groupement protecteur, on entend les groupements utilisés de manière classique dans la synthèse chimique de nucléosides, nucléotides et oligonucléotides (voir par exemple:
Chemistry of Nucleosides and Nucleotides, Edited by Leroy B.
Townsend, Plenum Press, New York and London et Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties, Edited by Sudhir Agrawal, Humana Press, Totowa, New Jersey).
Un groupe fonctionnel de marquage de l'invention est une molécule susceptible de générer directement ou indirectement un signal détectable. Il est notamment choisi parmi les isotopes radioactifs, des enzymes notamment choisies parmi la peroxydase, la phosphatase alcaline, la b-galactosidase, et celles susceptibles d'hydrolyser un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent, des composés chimiques chromophores, chromogènes, fluorophores, fluorigènes ou luminescents, des analogues de bases nucléotidiques, et des ligands tels que la biotine.
Dans le cas où le marqueur ne peut générer directement un signal, par exemple, quand celui-ci est une enzyme, il est nécessaire d'ajouter un révélateur, par exemple un substrat correspondant à l'enzyme, la réaction enzyme/substrat générant un complexe détectable, par exemple un composé chromogène ou luminescent. A titre d'exemple, le réactif révélateur peut être l'ortho-phénylène -diamine, la 4-méthyl-umbelliféryl-phosphate.
La fonction réactive de covalence du nucléotide préfonctionnalisé et la fonction anti-réactive du réactif, sont respectivement des fonctions chimiques organiques électrophiles et nucléophiles, ou inversement.

4 La fonction chimique organique électrophile est avantageusement choisie parmi les fonctions aldéhyde, ester activé, acide carboxylique, isothiocyanate, dérivés haloacyles et chlorure de sulfonyle.
La fonction chimique organique nucléophile est avantageusement choisie parmi les fonctions amine, thiol, oxyamine, hydrazine et hydrazide, de préférence c'est la fonction alkoxyamine.
Selon une variante de l'invention, la fonction réactive de covalence du nucléotide modifié est greffée sur la base par l'intermédiaire d'un bras de couplage.et/ou la fonction anti-réactive de covalence du réactif est greffée sur le groupement fonctionnel par l'intermédiaire d'un bras de couplage.
Le bras de couplage est notamment choisi parmi les chaînes hydrocarbonées, saturées ou insaturées, éventuellement interrompues par des fonctions amine, amide et oxy.
Selon un procédé préférentiel, la fonction-réactive de -covalence est la fonction oxyamine, la fonction anti-réactive de covalence du réactif est la fonction aldéhyde, et cette dernière est liée à un groupement fonctionnel de marquage tel qu'un groupement fluorescent ou luminescent.
Avantageusement la fonction aldéhyde est liée au groupement fonctionnel par le bras de couplage -NH-CS-NH-(CH2)3-et le groupement fonctionnel du réactif est la fluorescéine.
Le produit nucléotidique préfonctionnalisé peut comprendre une ou plusieurs fonctions réactives de covalence, identiques ou différentes, introduites par un ou plusieurs nucléotides. Lesdites fonctions réactives de covalence peuvent réagir avec un ou plusieurs réactifs, identiques ou différents, de manière simultanée ou séquentielle. La détection des groupements fonctionnels de marquage du produit fonctionnalisé
peut être simultanée ou séquentielle.
Il est entendu que ce procédé de marquage peut être appliqué à un ou plusieurs produits nucléotidiques FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISA/EP

préfonctionnalisés, notamment pour différencier des produits préfonctionnalisés issus de cibles différentes.
Le produit d'amplification fonctionnalisé marqué peut être détecté qualitativement et/ou quantitativement en phase

5 homogène ou hétérogène.
En phase homogène, le réactif et le produit nucléotidique préfonctionnalisé interagissent dans le même milieu liquide. En phase hétérogène, le produit préfonctionnalisé peut être traité avec le réactif avant ou après capture sur un support solide, c'est à dire directement ou indirectement. La capture sur le support solide peut être réalisée par des moyens connus, tels que l'adsorption, la covalence, notamment en utilisant des fonctions anti-réactives de covalence disponibles à la surface du support solide ou par hybridation avec un composé polynucléotidique.
Le support solide, sous toutes formes appropriées telles que tube, cône, puits, plaque de microtitration, feuille, puce ou polymère soluble, est choisi parmi les polystyrènes, les copolymères styrène-butadiène, les copolymères styrène-butadiène en mélange avec des polystyrènes, des polypropylènes, des polycarbonates, des copolymères polystyrène-acrylonitrile, des copolymères styrène-méthylméthacrylate de méthyle, parmi les fibres synthétiques et naturelles, parmi les polysaccharides et les dérivés de la cellulose, le verre, le silicium et leurs dérivés.
Selon des variantes préférentielles du procédé de l'invention, - la séquence d'acide nucléique cible est une séquence d'ADN ou d'ADN, et les activités enzymatiques comprennent les activités ADN polymérase ARN- et/ou ADN-dépendantes, - les activités enzymatiques peuvent en outre comprendre l'activité ribonucléase H et l'activité ARN
polymérase ADN-dépendante, pour amplifier la séquence d'acide nucléique cible selon une suite de réactions de transcription inverse, de transcription et de digestion.

6 PCT/FR97/01445 Les activités enzymatiques ribonucléase H et ADN
polymérase peuvent être apportées par une seule enzyme ou bien chacune par une enzyme différente.
A titre d'exemple, le procédé de l'invention peut être utilisé pour l'amplification d'un acide nucléique cible dans un échantillon selon des techniques bien connues de l'homme de l'art, telles que la PCR (Polymerase Chain Reaction), la RT-PCR
(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction), la TMA
(Transcription Mediated Amplification) ou la technique NASBA
(Nucleic Acid Sequence Based Amplification) ou toute autre technique d'amplification enzymatique.
L'invention concerne également un analogue de nucléotide ou un nucléotide, préfonctionnalisé, susceptible d'être soumis à un traitement enzymatique.
Par traitement enzymatique d'un analogue de nucléotide ou d'un nucléotide, on inclut toutes les réactions, in vivo ou in vitro, au cours desquelles intervient au moins une enzyme dont l'activité est liée à un nucléotide. Ainsi on comprend toutes réactions comprenant au moins une étape enzymatique dans laquelle un nucléotide sert de substrat à l'enzyme, que ledit nucléotide soit transformé ou non au cours de cette étape enzymatique ; à titre d'exemple de telles réactions sont choisies parmi celles utilisées dans les techniques de biologie moléculaire telles que la transcription, la ligation, l'élongation, la coupure, et plus particulièrement dans les techniques d'amplification, (WINN-DEEN, Journal of Clinical Assay, vol 19, p21-26 (1996).
Ainsi les enzymes dont les activités sont liées à des nucléotides peuvent en particulier être sélectionnées dans la liste non exhaustive suivante les ADN polymérases ADN
dépendantes telles que le fragment de Klenow de l'ADN polymérase I de E. coli, la Taq polymérase, les T7, T4 ou T5 ADN
polymérases, les polymérases eucaryotes cellulaires ou virales a, b, g ; les ADN polymérases ARN dépendantes telles que les polymérases de AMV (Avian Myoblastosis Virus), de MMLV (Moloney Murine Leukemia Virus) ; les ARN polymérases telles que les T7,

7 T3, SP6, N4, PBSII ARN polymérases, l'ARN polymérase de E. coli les enzymes à activité nucléasique telles que les endonucléases de restriction, la RNAse H ; ou encore les polyA
polymérases, les réplicases, telle que la Q-béta-réplicase, les terminal transférases, ou les ligases.
Selon un mode préféré, on choisira. pour l'application du procédé de l'invention la technique TMA pour l'amplification d'une séquence d'acide nucléique cible ARN ou l'amplification d'une séquence d'acide nucléique cible ADN après une étape de transcription inverse, ladite technique étant décrite dans la demande internationale WO 91/01384 incorporée à titre de référence.
Un analogue de nucléotide, préfonctionnalisé selon l'invention répond à la formule générale (I) B-Zn-X

R2 Ri (I) dans laquelle B représente une base nucléique, Z représente un bras de couplage, n est un entier égal à 0 ou 1, X représente une fonction réactive de covalence fixée sur au moins un site de la base nucléique B, R1 représente H ou OH, R2 représente H, OH, un groupement mono- di- ou tri-phosphate, ou un groupement O-R dans lequel R représente un groupement protecteur, R3 représente H, un groupement protecteur, ou un groupement mono-, di- ou tri-phosphate.

8 De préférence, R1 et R2 représentent chacun indépendamment l'un de l'autre--H, OH et R3 représente un groupement mono-, di- ou tri-phosphate.
Un nucléotide préfonctionnalisé de l'invention est choisi parmi les nucléotides suivants :
-un nucléotide dont la base nucléique est dérivée de la cytosine et comporte, au moins sur la fonction aminée en position 4 du cycle pyrimidique, au moins une fonction réactive de covalence nucléophile, non protégée, et n'influençant pas, de manière significative, le traitement enzymatique dudit nucléotide, la fonction réactive de covalence étant choisie parmi les fonctions NH2, O-NH2, SH, hydrazine et hydrazide et la fonction réactive de covalence est liée à ladite fonction aminée en position 4 du cycle pyrimidique par un bras de couplage choisi parmi (-CH2-)n1, (-O-CH2-)nl dans lequel nl est un entier compris entre 1 et 12 ; (-CH2-O-CH2-)n2, (-CH2-CH2-0-CH2-CH2-)n2, (-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-)n2, (-CH2-O-CH2-CH2-)n2, dans lequel n2 est =un entier compris entre 1 et 6 ; et -NH-CH2-O-CH2-CH2. Avantageusement, la fonction réactive de covalence est liée à ladite fonction aminée par l'intermédiaire d'un bras de couplage choisi parmi -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-, et NH-CH2-O-CH2-CH2.

- un nucléotide dont la base est dérivée de l'uracile et comporte au moins sur la position 5 du cycle pyrimidique, au moins une fonction réactive de covalence nucléophile, non protégée, et n'influençant pas, de manière significative, le traitement enzymatique, caractérisé en ce que la fonction réactive de covalence est choisie parmi les fonctions NH2, 0-NH2, SH, hydrazine et hydrazide; avantageusement, la fonction réactive de covalence est liée à ladite fonction aminée par l'intermédiaire d'un bras de couplage choisi parmi -C=C-CH2-, et -C=C-CH2-NH-CO-CH2-, -CH=CH-CH2-NH-CO-CH2- et -CH=CH-CH2;

- un nucléotide dont la base est dérivée de l'adénine et comporte au moins sur la fonction aminée en position 6 du cycle pyrimidique, au moins une fonction réactive de covalence FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISA/EP

- - -------- - ----

9 nucléophile, non protégée, et n'influençant pas, de manière significative, le traitement enzymatique, caractérisé en ce que la fonction réactive de covalence est choisie parmi les fonctions NH2, CH2-O-NH2, SH, hydrazine et hydrazide ; la fonction réactive de covalence est liée à ladite fonction aminée par l'intermédiaire d'un bras de couplage choisi parmi (-CH2-)nl, (-O-CH2-)nl dans lequel nl représente un entier compris entre 1 et 12 ; (-CH2-O-CH2-)n2, (-CH2-CH2-O-CH2-CH2-)n2, (-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-)n2, (-CH2-O-CH2-CH2-)n2, dans lequel n2 est un entier compris entre 1 et 6 ; et NH -CH2-O-CH2-CH2.
Avantageusement, la fonction réactive de covalence est liée à
ladite fonction aminée par l'intermédiaire d'un bras de couplage choisi parmi -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2- -CH2-CH2-O-CH2-CH2-, -CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-, et NH-CH2-O-CH2-CH2 ; et de manière préférée le bras de couplage est -CH2-CH2-CH2-CH2-.

L'invention concerne aussi l'utilisation d'un nucléotide préfonctionnalisé tel que défini précédemment, dans un traitement enzymatique d'amplification.
L'analogue de nucléotide ou le nucléotide, préfonctionnalisé, a, vis-à-vis du traitement enzymatique, un comportement sensiblement identique à celui de l'analogue de nucléotide ou le nucléotide correspondant. En effet, la fonction introduite en un site de la base dudit analogue ou nucléotide, grâce à son inertie biologique et chimique vis-à-vis des enzymes, ne modifie pas significativement ni l'affinité, ni la spécificité de l'enzyme à l'égard de son substrat.
Enfin les derniers objets de l'invention consistent en des utilisations particulières de nucléotides tels qu'ils viennent d'être définis. De manière préférentielle, ils sont utilisés dans des techniques d'amplification, telles que celles décrites dans les documents suivants EP-0 721 988, WO-95/03426, US-5 409 818, US-5 399 491.

L'invention est maintenant décrite plus en détail par référence aux exemples et figures annexés qui vont suivre et dans lesquels:
La figure 1 représente un schéma général de synthèse 5 de nucléotides cytidines portant un bras aminé en position 4;
La figure 2 représente un schéma de synthèse du nucléotide cytidine portant un bras alkyloxyaminé en position 4;
La figure 3 représente un schéma de synthèse par transamination de nucléotides; et

10 La figure 4 met en évidence l'effet de l'incorporation de la CTP- (N4) -C602-NHz (27a) sur la sensibilité de la TMA;
La figure 5 met en évidence l'effet de l'incorporation de la CTP-(N4)-C4-NH2 (27b) sur la sensibilité de la TMA.

Dans les figures 4 à 5 précitées sont représentés en abscisse le nombre de copies de la cible par réaction et en ordonnée le nombre d'amplicons obtenus par microlitre de réaction (volume final réactionnel= 100 microlitres). Aux courbes des figures 4 et 5 sont affectés des symboles particuliers, par exemple ^, 12, A, ), =, et un pourcentage. Ce pourcentage correspond au pourcentage du ou des nucléotides préfonctionnalisés par rapport aux nucléotides naturels dans la réaction d'amplification TMA. Les figures 4 et 5 montrent respectivement les résultats de la semi-quantification par la technique ELOSA (décrite dans la demande de brevet PCT WO
92/19812) du nombre d'amplicons produits à partir d'une gamme cible d'ARN 16S de Mycobacterium tuberculosis en présence de différents rapports des nucléotides 27a et 27b par rapport à
leurs nucléotides naturels respectifs.
Dans les exemples qui suivent et qui permettent d'illustrer quelques avantages de l'invention, il est fait référence à un réactif comprenant un groupe fonctionnel de marquage mais la portée de l'invention n'est bien entendu pas limitée à de telles propriétés du groupe fonctionnel.

11 SYNTHESE DE NUCLEOTIDES ET MARQUEURS PREFONCTIONNALISES.

Pour préfonctionnaliser les nucléotides sur la base nucléique, la stratégie généralement utilisée consiste en la synthèse des nucléosides protégés portant une fonction réactive également protégée. La déprotection de la fonction hydroxyle en position 5' libère le nucléoside modifié, lequel est finalement triphosphorylé sur cette position selon la méthode de Ludwig-Eckstein (J. Ludwig, F. Eckstein, J. Org. Chem., 1989, 54, 631-635).

L'hydrolyse des groupements protecteurs des fonctions hydroxyles en 2' et 3' et de celui de la fonction réactive de la chaîne introduite sur la base, conduit aux nucléotides triphosphates préfonctionnalisés.

1-Série adénosine:

EXEMPLE 1 : Synthèse du nucléoside à chaîne amine 4.

Voie de synthèse

12 N-N
NH2 NH2 NJ\~N N

N -N ~ APTTS / I N~ \'N J N N
> NL ~ N
HO
O J HC(OEt~ HO O J 100 C, 48 h >HO OJ

HO OH O O
O O
1 \

HzN,_,,-~
NH-Boc 50 C
3 2 jours r H.N^^,NH-Boc N N
N~- N

O H
O
/\
Protection et fonctionnalisation de l'adénosine Isopropylidène (1) : (Nucleic Acid Chemistry, part 2, Townsend, Tipson, p. 768, Wiley Interscience) N N
HOMO) Oyo A une suspension d'adénosine (5g, 18,7 mmol, Aldrich 14659-5) dans de l'acétone (10 ml) contenant de l'APTS (3,9 g, 20,6 mmol), on ajoute goutte à goutte sous argon de

13 l'orthoformate d'éthyle (12,44 ml, 74,8 mmol). Après une nuit de réaction, on ajoute 110 ml d'eau contenant 1,86 ml d'ammoniaque à 27 %. Après 30 minutes d'agitation, le milieu réactionnel est évaporé jusqu'à apparition de cristaux blancs. Après 12 h au frigo, on obtient un précipité blanc que l'on recristallise dans l'eau. On obtient 4,175 g (13,5 mmol, 72 %) de produit (1) sous forme d'un poudre blanche. Ce produit a été caractérisé par RMN
du proton.

Triazolo (2) : (Samano, Miles, Robins, J. Am. Chem. Soc., 1994, ....................................
116, 9331-9332) ,,1 N
N N\\
j L
N N

O O
>'_1 L'adénosine-isopropylidène (1) (1g, 3,2 mmol) et l'amidine (1,4 g, 6,5 mmol) sont agitées dans de la pyridine (15 ml) à 100 C sous argon pendant 48 h. La pyridine est alors évaporée et co-évaporée avec du toluène. L'huile obtenue est ensuite reprise par de l'acétate d'éthyle et cette phase organique est lavée avec de l'eau saturée en NaCl. Après séchage sur Na2SO4 et évaporation, on obtient le produit (2) sous forme d'une poudre blanche avec un rendement de 60 % (700 mg, 1,9 mmol). Le produit 2 a été caractérisé par spectrométrie de masse et RMN du proton.

Synthèse de l'amidine: (Bartlett et Humphreg, J. Chem. Soc., 1967, 1664-1666)

14 N-OHC-NH-NH-CHO + SOCk DMF 2HCI

Le chlorure de thionyle (39,96 g, 24,5 ml, 0,338 mol) est ajouté goutte à goutte au N-N'-diformylhydrazine (12 g, 0,136 mol) dans le DMF (270 ml) à 10 C. Le mélange devient jaune. On maintient l'agitation pendant 2 jours. Le précipité
obtenu est filtré et lavé par du DMF puis par de l'éther. Après séchage sous vide, on obtient l'amidine avec un rendement de 95 (28 g, 0,130 mol).

Substitution du triazolo par le diaminobutane monoprotégé
Monoprotection du 1,4-diaminobutane : synthèse de (3) (Hassen, .............
Nielsen, Ehrbar, Buchardt, Synthesis, 1982, 404-405) H2N~~ NH-Boc La solution de 1,4-diaminobutane (0,113 mol., 9,94 g 11,4 ml) dans le chloroforme (250 ml) est refroidie à 0 C. On ajoute alors goutte à goutte sous argon, une solution de ditertbutyldicarbonate (0,022 mol, 4,95 g, 5,22ml) dans du chloroforme (250 ml). Le mélange est agité pendant une nuit à
température ambiante. Le précipité formé est filtré et le filtrat est évaporé. L'huile résiduelle est reprise par une solution aqueuse saturée en NaCl (40 ml) . on élimine ainsi le produit bisprotégé par filtration. On extrait alors la phase aqueuse avec de l'éther ( 5 x 50 ml). Les phases organiques sont réunies, séchées sur Na2SO4 et évaporées. On obtient ainsi le produit (3) sous forme d'huile avec un rendement de 99 % (3,8 g, 0,0218 mol). Le produit (3) a été caractérisé par spectrométrie de masse et par RMN du proton.

Substitution du triazolo par le diaminobutane-monoboc = synthèse de (4) H, N -,,,~,NH-Boc N N
i L N N

O O

On solubilise le produit (2) (500 mg, 1,4 mmol) dans ml d'acétonitrile. On ajoute alors le composé (3) (1,31 g, 7 mmol). Le milieu réactionnel est mis à chauffer à 50 C pendant 2 jours et analysé par CLHP.

10 Après évaporation de l'acétonitrile, on reprend le résidu par de l'acétate d'éthyle et on lave cette phase organique avec de l'eau saturée en NaCl. Après séchage et évaporation de l'acétate d'éthyle, le résidu est chromatographié
sur gel de silice (éluant : CH2C12, puis CH2C12/MeOH, 98/2, 95/5

15 (v/v)). Après évaporation et précipitation dans l'hexane, on obtient le produit (4) sous forme d'une poudre blanche avec un rendement de 80 % (563 mg, 1,12 mmol) . Le nucléoside (4) a été
caractérisé par spectrométrie de masse et par RMN du proton.

20 Phosphorylation par la méthode de Eckstein (Ludwig, Eckstein, J.
Org. Chem., 1989, 54, 631-635)

16 H, N -,,_~,NH-Boc N N
`.NJ N\\
ii O O
PPP = triphosphate Le nucléoside (4) (48 mg, 100 mmol) est dissous dans de la pyridine anhydre et est évaporé 2 fois. On ajoute alors sous argon 100 ml de pyridine, 300 ml de dioxane et une solution fraichement préparée de 2-chloro-4H- 1, 2, 3 -dioxaphosphorin-4 -one dans du dioxane (130 ml, 130 mmol). On laisse l'agitation pendant 20 minutes puis on ajoute une solution 0,5 M de pyrophosphate de tributylammonium dans du DMF anhydre (320 ml) et simultanément 130 ml de tributylamine.

Après 30 minutes d'agitation, on ajoute 2 ml d'une solution d'iode à 1 % dans un mélange pyridine/eau (98/2, v/v).
Après 20 minutes d'agitation, on détruit l'excès d'iode avec une solution aqueuse de NaHSO3 à 5 % et on maintient l'agitation pendant 10 minutes. On évapore à sec puis on effectue une, extraction eau/dichlorométhane. On vérifie la formation du triphosphate 5 par HPLC (gradient 0 à 35 % de B en 40 minutes ; A = Tris HC1 20 mM, pH 7,6 ; B = Tris HCl 20 mM, pH 7,6 + 0,5 M NaCl). Temps de rétention = 35 minutes.

Après évaporation, on reprend le résidu dans de l'eau (10 ml) puis on ajoute 10 ml d'une solution aqueuse de TFA à 50 pour effectuer la déprotection des groupements Boc et isopropylidène. Après 30 minutes, le TFA est évaporé et coévaporé avec de l'eau. On observe ainsi la formation d'un nouveau produit avec un temps de rétention de 19 minutes.

17 EXEMPLE 2 : Synthèse du nucléotide adénosine à chaîne oxyamine.

Voie de synthèse de la chaîne N=C-(CH2) 3 - Br + HO-N-Pht N=C-(CH2) 3 - O-N-Pht 6 r LiAIH4 (Boc)20 H2N-(CH2) 4 - O-NH-Boc N=C-(CH2) 3- O-NH-Boc- N=C-(CH2) 3- O-NH2 Synthèse du produit (6) N=C-(CH2) 3 - O-N-Pht 6 On dissout l'hydroxyphtalimide (10 g, 0,061 mole) dans du DMF (300 ml) . On ajoute alors du K2CO3 (1, 05 eq. , 9 g) . On observe la formation d'un précipité. Après 1 h d'agitation à
50 C, on ajoute le dérivé bromé (1 eq., 9,03 g) et on maintient l'agitation à 50 C pendant 2 h. Après filtration sur coton et évaporation du DMF, on reprend le résidu par de l'acétate d'éthyle puis on lave la phase organique avec HC1 1N puis avec une solution de NaHCO3 à 10 % et enfin avec une solution aqueuse saturée en NaCl. Après séchage et évaporation, on obtient le produit (6) avec un rendement de 69 % (9,66 g) Il a été
caractérisé par RMN du proton, du carbone 13 et par spectrométrie de masse.

18 Hydrazinolyse : préparation de la chaîne (7) N=C-(CH2) 3- O-NH2 Le produit (6) (9,51 g, 0,041 mole) est mis dans 150 ml d'éthanol à 95 L'addition d'hydrazine (2 eq., 4 ml) entraîne une solubilisation immédiate du précipité de départ. On observe ensuite la formation d'un précipité blanc de phtalhydrazide. Après 3 heures de réaction à 50 C, on filtre et on lave le précipité avec de l'éthanol. Après évaporation, la pâte obtenue est chromatographiée sur gel de silice (CH2C12/CH3CN 9/1, v/v). Après évaporation des fractions contenant l'oxyamine libre (7) , on ajoute de l'éther puis de l'acide chlorhydrique concentré. On obtient ainsi le produit (7) sous forme d'une poudre blanche avec un rendement de 40 % (2,30 g). Il a été caractérisé par RMN du proton et du carbone 13.
Protection sous forme de Boc de l'oxyamine N=C- (CH2) 3 - O-NH-Boc 8a On dissout 2,3 g (0,016 mole) de produit (7) dans 10 ml de dioxane. On ajoute alors une solution aqueuse de soude 1N
(2 eq. : 0,032 mole, 32 ml).

On additionne ensuite goutte à goutte, dans la glace, sous argon, le ditertbutyldicarbonate (1,2 eq., 0,019 mole, 4,18 g) dissous dans 20 ml de dioxane. Après 3 h de réaction à 0 C on évapore le dioxane puis on ramène le pH à 3 avec une solution aqueuse d'HC1 iN et on extrait à l'éther (3x50 ml). On lave ensuite les phases organiques avec une solution aqueuse d'HC1 1N

19 puis avec une solution aqueuse saturée en NaCl. Après séchage sur Na2SO4 et évaporation on obtient le produit (8a) sous forme d'une huile jaune (2,56 g, 0,013 mol, 80 %). Il a été
caractérisé par RMN du proton et du carbone 13.

Réduction du nitrile par LiAlH4 H2N-(CH2) 4 - O-NH-Boc 8b Le composé (8a) (2,56 g, 0,013 mol) est solubilisé
dans de l'éther éthylique anhydre (50 ml). Le mélange est refroidi dans un bain de glace. On ajoute alors LiAlH4 (3 g, 0,079 mol) en trois fois. L'agitation est maintenue pendant une nuit puis on ajoute de l'eau (10 ml) et une solution aqueuse de soude à 15 %. Après filtration du précipité blanc ainsi formé on lave la phase organique avec une solution aqueuse saturée en NaCl. Après séchage sur Na2SO4 et évaporation on obtient le produit 9 sous forme d'huile (769 mg, 0,0037 mol, 29 %). Il a été caractérisé par RMN du proton et du carbone 13. La chaîne (8b) a été caractérisée par RMN du proton et du carbone 13 Substitution du triazolo par la chaîne oxyamine N-N
N HN '-"~~ O NH-Boc N = N N . N
I HZN~`~ O-NH-Boc ~N
HO O 8b + HO O

oo o~o Le produit (2) (246 mg, 0,68 mmol) est dissous dans 20 ml d'acétonitrile. On ajoute alors la chaîne (8b) (700 mg, 3,43 mmol) Le mélange est porté à 50 C. La réaction est suivie par 5 HPLC : elle évolue très lentement. Après une semaine, le solvant est évaporé. Le résidu obtenu est dissous dans de l'acétate d'éthyle et la phase organique est lavée avec de l'eau saturée en NaCl. Après séchage sur Na2SO4 et évaporation on obtient une huile jaune que l'on chromatographie sur gel de silice (éluant :
10 CH2C12/MeOH 97/3, v/v). Après évaporation du solvant on obtient le produit (9) sous forme d'une poudre blanche (120 mg, 0,24 mmol,35 %) . Le produit (9) est caractérisé par RMN du proton et par spectrométrie de masse.

15 Phosphorylation du nucléoside (9).:

La phosphorylation du nucléoside (9) en nucléotide (10) est réalisée selon le protocole décrit dans l'exemple I
(préparation du nucléotide 5).

N I N

N
PPP-O O

OH OH

II- Série uridine:

EXEMPLE 3 : synthèse de l'uridine à chaîne amine (15).
Voie de synthèse O

HN Heck NHBoc HNJL' O~ N
1(O OH - ' NH-Boc O N O OH
r 11 I

HO OH

O
APIS
HC(OEt)3 o O
HNJt'- NHZ HN NH-Boc OLNJ 1/ Eckstein O,il N/
U0 O-PPP r--- O OH
15 2/ H+
HO oH ô 0 13 Synthèse de la chaîne -~NH-Boc ml de propargylamine (73 mmol) sont dissous dans un 5 mélange NaOH 1N/dioxane (146 ml/50m1). On ajoute alors goutte à
goutte, à 0 C, sous argon, 20 ml de Boc,O dissous dans 50 ml de dioxane. On observe la formation d'un précipité. Après 8 h, le précipité de carbonate est filtré puis on ramène le pH à 3 avec une solution aqueuse d'HCl 1N et on extrait avec du dichlorométhane. La phase organique est ensuite lavée avec une solution aqueuse saturée en NaCl puis séchée sur Na2SO4 et enfin évaporée. Par addition d'hexane le produit (11) précipite. On récupère ainsi 8, 92 g (0, 057 mmol, 79 %) . Le produit (il) a été
caractérisé par RMN du proton et par spectrométrie de masse.

Introduction de la chaîne sur la base Couplage de Heck (Hobbs, J. Org. Chem., 1989, 54, 3420-3422).

O
HN NHBoc ON
I.,0~-OH
~--~ 12 HO OH

ml de DMF sont dégazés et placés sous argon. On ajoute alors de la iodouridine (1 g, 2,56 mmol, Aldrich, 85529-5 7) et de l'iodure de cuivre (97,5 mg, 0,512 mmol) . La réaction est placée à l'obscurité puis on ajoute, toujours sous argon, de la triéthylamine (713 ml, 518 mg, 5,12 mmol) et la chaine-Boc (11) (1,2 g, 7,68 mmol) . Le mélange est laissé sous argon pendant 10 minutes. Le démarrage de la réaction est réalisé par 10 addition du catalyseur tétrakistriphénylphosphine palladium (296 mg, 0,256 mmol) . La réaction est suivie par HPLC. Après une nuit, le DMF est évaporé et coévaporé avec de l'acétonitrile. Le résidu obtenu est chromatographié sur gel de silice (dépot solide, éluant : CHZCl2, CHZC1z /MeOH : 98/2, 95/5, 90/10, 85/15-v/v). Après évaporation on obtient 528 mg de produit (12) (1,3 mmol, 52 %). Le produit (12) a été caractérisé par RMN du proton et par spectrométrie de masse.

Protection sous forme d'isopropylidène (Townsend, Tipson, Nucleic acid chemistry, part 2, p. 765, Wiley-interscience).

O
HN-1~,, NH-Boc OJIN "
LO /-OH

On ajoute, sous argon à température ambiante, l'orthoformate d'éthyle (166 ml, 148 mg, 1 mmol) à une suspension de produit (12) (200 mg, 0,5 mmol) dans l'acétone (2 ml) contenant de l'APTS (9,5 mg, 0,05 mmol). La réaction est suivie par CCM (CH2C12 /MeOH 90/10). Après 2 heures on ajoute du dichlorométhane et on lave la phase organique avec une solution aqueuse de NaHCO3 à 10 % puis avec une solution aqueuse saturée en NaCl. Après séchage et évaporation on obtient le produit (13) sous forme d'une poudre jaune (167 mg, 0,38 mmol, 76 %).
Phosphorylation par la méthode de Eckstein et déprotection (Ludwig, Eckstein, J. Org. Chem., 1989, 54, 631-635) O

O~N
LO~,'-O-PPP
M
HO OH

Le nucléoside 13 (44 mg, 100 mmol) est dissous dans de la pyridine anhydre et est évaporé 2 fois. On ajoute alors 15 sous argon 100 ml de pyridine, 300 ml de dioxane et une solution fraichement préparée de 2-chloro-4H-1,2,3-dioxaphosphorin-4-one dans du dioxane (130 ml, 130 mmol). On laisse l'agitation pendant 20 minutes puis on ajoute une solution 0,5 M de pyrophosphate de tributylammonium dans du DMF
anhydre (320 ml) et simultanément 130 ml de tributylamine.

Après 30 minutes d'agitation, on ajoute 2 ml d'une solution d'iode à 1 % dans un mélange pyridine/eau (98/2, v/v).
Après 20 minutes d'agitation, on détruit l'excès d'iode avec une solution aqueuse de NaHSO3 à 5 % et on maintient l'agitation pendant 10 minutes. On évapore à sec puis on effectue une extraction eau/dichlorométhane. On vérifie la formation du triphosphate par CLHP (gradient : 0 à 35 % de B en 40 minutes ;
A = Tris HC1 20 mM, pH 7,6 ; B = Tris HC1 20 mM, pH 7,6 + 0,5 M
NaCl). Temps de rétention = 36 minutes.

Après évaporation, on reprend le résidu dans de l'eau (10 ml) puis on ajoute 10 ml d'une solution aqueuse de TFA à 50 % pour effectuer la déprotection des groupements Boc et isopropylidène. Après 30 minutes, le TFA est évaporé et 5 coévaporé avec de l'eau. On observe ainsi la formation d'un nouveau produit (15) avec un temps de rétention de 20 minutes.
EXEMPLE 4 : Synthèse de l'uridine à chaîne alcoxyamine 21.

10 Voie de synthèse O O
H YI O Pd(PPh3)4 HN j H O NH-Boc O~ Il OH 1 ÇONHBoc Cul HO---,.OJ N Et3N
\ / H 17 DMF HO~.0 18 HO OH HO" "OH
~O
APTS
HC(OEt)3 O
HN O , H%~O-NH2 HN O , H~O-NH-Boc l/ Eckstein O N O NI
PPPO-N'OJ 21 2/ H' HO , o ;I 19 HpH O

Synthèse de la carboxyméthoxyamine-boc 16 (Kurth et al, J. Med.
Chem. , 1993, 1255-1261.) O O
HOx `.ONH2 + Boc2O - HO%~\0ONHBOC

Le chlorhydrate de carboxyméthoxylamine (6,6 g, 60,4 mmol) est dissous dans 132 ml d'eau en présence de soude (2 g, 50 mmol) et de dioxane (66 ml). La solution est refroidie dans un bain de glace. On ajoute goutte à goutte du di-tert-butyldicarbonate (13,97 g, 64,1 mmol) dissous dans le dioxane (66 ml). L'agitation est maintenue pendant une nuit à
température ambiante. On évapore à sec le mélange réactionnel.
Au précipité obtenu, on additionne 250 ml d'eau puis on extrait à l'éther (2x250 ml). On acidifie la phase aqueuse par HC1 1N
jusqu'à pH 3. Ensuite, on extrait cette phase par de l'éther éthylique (3x50 ml) et par de l'acétate d'éthyle (3x250 ml). Les phases organiques sont réunies et séchées sur sulfate de sodium.
Après évaporation on obtient le produit (16) sous forme d'une poudre blanche (10 g, 52 mmol, 86 %). Le produit (16) a été
caractérisé par RMN du proton.

Synthèse de la chaîne par couplage peptidigue (Costa, Dominguez, Cutts, Williams, Bowen, J. Med. Chem., 1994, 3'7, 314-321.

DCC O
HOOC-CH2-ONHBoc + = - =- -~ i~JNHBoc N

On dissout le produit (16) (2 g, 10,4 mmol) dans du THF fraichement distillé. Après refroidissement du milieu dans la glace, on ajoute (2,15 g, 10,4 mmol) de DCC. Le mélange est agité à froid pendant 15 minutes. On ajoute alors l'amine propargylique.(714 ml, 10,4 mmol) L'agitation est maintenue à
température ambiante sous argon pendant 2 heures. Après filtration, le solvant est évaporé. Le résidu ainsi obtenu est repris dans du dichlorométhane et est lavé avec une solution aqueuse de HCl 1N, puis avec une solution de NaHCO3 à 5 % et enfin avec une solution aqueuse saturée en NaCl. Après séchage sur Na2SO91 le dichlorométhane est évaporé et le résidu est chromatographié sur gel de silice (éluant acétate d'éthyle/hexane 60/40, v/v) . On obtient ainsi le produit (17) sous forme d'une poudre blanche (1,23 g, 5,4 mmol, 52 %). Le produit (17) a été caractérisé par RMN du proton et par spectrométrie de masse.

Couplage de Heck: Hobbs, J. Org. Chem., 1989,54,3420-3422.

O
O N11L,~-O-NH-Boc O N
HO-N,OJ
~4 18 HO OH

ml de DMF sont dégazés et placés sous argon. On ajoute alors de la iodouridine (1g, 2,56 mmol ) et de l'iodure de cuivre (97,5 mg, 0,512 mmol) . La réaction est placée à
10 l'obscurité puis on ajoute, toujours sous argon, de la triéthylamine (713 ml, 518 mg, 5,12 mmol) et la chaine (17) (1,75 g, 7,68 mmol). Le mélange est laissé sous argon pendant 10 minutes. Le démarrage de la réaction est réalisé par addition du catalyseur tétrakistriphénylphosphine palladium (296 mg, 0,256 mmol). La réaction est suivie par HPLC. Après une nuit, le DMF
est évaporé et co-évaporé avec de l'acétonitrile. On reprend le résidu obtenu par de l'acétate d'éthyle et on lave cette phase organique avec une solution aqueuse saturée en NaCl. Après évaporation de l'acétate d'éthyle le résidu est chromatographié
sur gel de silice (éluant : CH2C12 /MeOH : 90/10, 85/15, 80/20, v/v) . Après évaporation on obtient 747 mg de produit (18) (1,6 mmol, 62 %). Le nucléoside (18) a été caractérisé par RMN du proton et par spectrométrie de masse.

Protection sous forme d'isopropylidène (Townsend, Tipson, Nucleic acid chemistry, part 2, p765, Wiley-Interscience) O
O ~-1_ NO-NH-Boc HN J H
OIL N"
HO oJ 19 o0 On ajoute, sous argon à température ambiante, l'orthoformate d'éthyle (355 ml, 316 mg, 2,13 mmol) à une suspension de produit (18) (500 mg, 1,06 mmol) dans l'acétone (3 ml) contenant de l'APTS (20,2 mg, 0,10 mmol). La réaction est suivie par CCM (CH2C12 /MeOH 90/10). Après 3 heures on ajoute du dichlorométhane et on lave la phase organique avec une solution aqueuse de NaHCO3 à 10 puis avec une solution aqueuse saturée en NaCl. Après séchage et évaporation on obtient le produit (19) sous forme d'une poudre jaune (395 mg, 0,77 mmol, 73 %). Le nucléoside protégé 19 a été caractérisé par RMN du proton du carbone 13 et par spectrométrie de masse.

Phosphorylation par la méthode de Eckstein et déprotection (Ludwig, Eckstein, J. Org. Chem., 1989, 54, 631-635) H H

O N
PPPO\\.OJ/ 21 HO OH

Le nucléoside (19) (102 mg, 200 mmol) est dissous dans de la pyridine anhydre et est évaporé 2 fois. On ajoute alors sous argon 200 ml de pyridine, 600 ml de dioxane et une solution fraichement préparée de 2-chloro-4H-1,2,3-dioxaphosphorin-4-one dans du dioxane (260 ml, 260 mmol). On laisse l'agitation pendant 20 minutes puis on ajoute une solution 0,5 M de pyrophosphate de tributylammonium dans du DMF
anhydre (640 ml) et simultanément 260 ml de tributylamine.

Après 30 minutes d'agitation, on ajoute une solution d'iode à 1 % dans un mélange pyridine/eau (98/2, v/v) (4 ml, 314 mmol). Après 20 minutes d'agitation, on détruit l'excès d'iode avec une solution aqueuse de NaHSO3 à 5 % et on maintient l'agitation pendant 10 minutes. On évapore à sec puis on effectue une extraction eau/dichlorométhane. On vérifie la formation du triphosphate par CLHP (gradient : 0 à 35 % de B en 40 minutes ; A = Tris HCl 20 mM, pH 7,6 ; B = Tris HCl 20 mM, pH
7,6 + 0,5 M NaCl ; colonne DEAE Waters Protein-Pak 8HR
10xlOOmm). Temps de rétention = 35 minutes.

Après évaporation, on reprend le résidu dans de l'eau (5 ml) puis on ajoute 5 ml d'une solution aqueuse de TFA à 50 %
pour effectuer la déprotection des groupements Boc et isopropylidène. Après 30 minutes, le TFA est évaporé et co-évaporé avec de l'eau. On observe ainsi par HPLC la formation d'un nouveau produit (21) avec un temps de rétention de 30 minutes. Ce produit est purifié par HPLC dans les conditions décrites précédemment, puis dessalé (Eau milliQ en isocratic, Colonne Macherey Nagel C18 nucleosil).

III- Série cytidine:

I- Synthèse des nucléotides triophosphates modifiés en position 4 par la présence d'une chaîne alkylaminée Afin d'introduire une chaîne alkyl aminée en position 4 de la base, cette dernière a été activée par l'introduction du groupe tosyle selon la méthode de Czernecki et coll. ( S.

Czernecki, T. Lediguarher, J.M. Valéry, Nucleosides &
Nucleotides, 1989, 54, 631-635) à partir de la [2',3'-O-isopropylidène, 5'-O- butyldiméthylsilyl]-uridine.

La substitution nucléophile du groupe tosyle par une 5 chaîne alkyl diaminée suivie de la protection par le trifluoroacétate d'éthyle de la fonction amino libre de la chaîne introduite, est réalisée en une étape.

La déprotection de la fonction hydroxyle en position 5' libère le nucléoside modifié, lequel est finalement 10 triphosphorylé sur cette position selon la méthode de Ludwig-Eckstein (J. Ludwig, F. Eckstein, J. Org. Chem., 1989, 54, 631-635) décrite dans les exemples précédents.

L'hydrolyse des groupes protecteurs des fonctions hydroxyles en 2' et 3' ainsi que de celui de la fonction amino 15 de la chaîne introduite en 4, conduit aux nucléotides triphosphates désirés (Figure 1).

Une autre stratégie qui consiste en l'introduction directe de la chaîne aminée en position 4 du nucléotide par transamination a été utilisée pour préparer les nucléotides (33)

20 et (34) (Figure 3).

EXEMPLE 5: Synthèse de la [2',3' -O-isopropylidène, 5' -O-butyldiméthylsilyl]-uridine (22).

La solution de la 2',3' -O-isopropylidène-uridine 25 (immole, Sigma, I-5127) dans la pyridine (5 ml) est traitée par le chlorure de t-butyldimétylsilyl pendant une nuit sous argon à
température ambiante. La réaction est ensuite arrêtée par l'addition de l'éthanol absolu (2 ml) évaporée puis co-évaporée avec le toluène. Le produit (22) est purifié par chromatographie 30 sur gel de silice (éluant : acétate d'éthylehexane 1 :1, v :v, Rf = 0.3).

FEUILLE RECTIFIEE (REGLE 91) ISA/EP

EXEMPLE 6: Synthèse de la [2',3' -0-isopropylidène, 5'-O-t-butyldiméthylsilyl-4-p-toluène sulfonyl]-uridine (23).

Le composé (22) (immole) dans l'acétonitrile (17 ml) est porté au reflux en présence du carbonate de potassium (1.3 mmoles, 1.3 éq.) et du chlorure de p-toluène sulfonyle (1.2 mmoles, 1.2 éq.) pendant 3 heures. Après disparition totale du produit de départ, la réaction est hydrolysée à température ambiante par addition de l'eau (2 ml) puis évaporée à sec. Le résidu obtenu est traité par une partition acétate d'éthyle-eau et est utilisé tel quel pour l'étape suivante.

CCM : Rf = 0.7 (éluant : acétate d'éthyle-hexane 1:1, v:v) . Le nucléoside 23 a été caractérisé par RMN du proton (200MHz, CDC13) d = 8,3 ppm (1H, d, H-6);
6,8(2H, d, H-aroma); 7,3(2H, d, H aroma) ; 6,1(1H, d, H-5);
5,8(1 H, s, H-1') ; 4,7 (2H, s, H-2', H-3') ; 4,4 (1 H, m, H-4'); 4,0-3,7(2H, m, H-5'a, H-5'b); 2,4 (3 H, s, CH3); 1,6 -1, 3 (2 x 3H, 2 x s, 2xCH3-isoprop) ; 0, 8 (9H, s, 3xCH3) , 0, 1 (6 H, s, 2x CH3) .

EXEMPLE 7: Synthèse de la [4-N-alkyl trifluoroacétyl amino-2',3'-0-isopropylidène, 5'-O-t-butyldiméthylsilyl]-cytidine (24).

A une solution de (23) (1 mmole) dans le dichlorométhane (5 ml) est ajouté à température ambiante et sous argon, le réactif alkyl diaminé (5 mmoles, 5 éq) . Après 5 min d'agitation, un excès de trifluoroacétate d'éthyle (15 mmoles, 15 éq.) est additionné au milieu réactionnel et l'agitation maintenue durant 15 min. Le nucléoside désiré (24) est purifié
par chromatographie sur gel de silice (éluant : acétone-hexane 1:2, v:v, Rf = 0.2). La structure des nucléosides intermédiaires (24) complètement protégés est confirmée par RMN du proton.
Exemple du nucléoside (24a) : RMN (200MHz, CDC13), d =7,7 - 7,5 ppm (2H, m, H-6, NH); 5,9(1 H, s, H-l') ; 5,7 (1H, sl, NH); 5,6 (1H, d, H-5) ; 4,7 (2H, 1 , H-2' , H - 3 ' ) ; 4, 3 (1 H, m, H-4') ; 4, 0 -3, 7 (2H, m, H-5' a, H-5'b) ; 3, 7 - 3, 5 (m, 12 H, 6 x CH9) ; 1, 6 -1,3 (2 x 3 H, 2 x 1, 2 x CH 3 isoprop) ; 0,8 (9H, 1, 3xCH3) 0, 1 (1, 6H, 2xCH 3) EXEMPLE 8: Synthèse de la [4-N-alkyl trifluoroacétyl amino-2',3' -0-isopropylidène]- cytidine (25) .

Le composé (24) (1 mmole) dessous dans le THF (5 ml) est traité par une solution molaire de fluorure de tétrabutylammonium (1,2 mmoles, 1,2 éq) dans le THF. Après 3 à 4 heures d'agitation à température ambiante et sous argon, la réaction est neutralisée par l'acide acétique (1 éq.) puis évaporée à sec. Le composé (25) est purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant acétone-hexane 1 :1, v :v, Rf = 0.3).

EXEMPLE 9: Synthèse de la [4-N-alkyl trifluoroacétyl amino-2',3'-O-isopropylidène-5'-O-triphosphate] -cytidine (26).

Le composé (25) (0.2 mmoles) est co-évaporé avec la pyridine (2 x 1 ml) puis mis en solution dans 400 ml d'un mélange pyridine-dioxane (1:3, v :v). Une solution de chlorure de dioxaphosphorinone (260 l) est ajoutée à la réaction. Un précipé blanc se forme au bout de 5 à 10 min et après 20 min d'agitation une solution de pyrophosphate de butylammonium dans le DMF (0,5 M, 640 l, 1,6 éq.) suivie de la tributylamine (230 ml) est ajoutée à la réaction. Après 30 min d'agitation, la réaction est oxydée par une solution d'iode à 1 % dans le mélange pyridine-eau (98 :2, v :v) (4 ml) et l'agitation maintenue pendant 30 min. L'excès d'iode est ensuite détruit par une solution aqueuse de bisulfite de sodium à 5 % et le milieu réactionnel évaporé à sec. Le résidu obtenu est dissout dans l'eau (20 ml) et traité par un lavage au dichlorométhane. La phase aqueuse est récupérée et analysée en HPLC (colonne DEAE 8 HR Millipore 5x100 mm, tampon A : Tris HC1 20 mM pH 7.6, tampon B : Tris HC1 20 mM, 0.5 M NaCl pH 7.6, débit : 0.5 ml/min, gradient : 0 à 35 % B en 40 min). Temps de rétention : 24 à 29 min. CCM : Rf = 0.5, éluant : propanol : eau : NH4OH (6:3 :1, v :v :v) EXEMPLE 10: Synthèse de la [4-N-alkyl amino-5'-O-triphosphate]-cytidine (27).

A la solution de (26) (0.2 mmole) dans l'eau (20 ml) est ajouté de l'ammoniac aqueux (10 ml) et l'agitation maintenue durant 1 heure. Le milieu réactionnel est évaporé à sec, puis repris dans l'eau (20 ml) suivi de l'acide trifluoroacétique aqueux à 50 % (10 ml) et l'agitation maintenue pendant 30 min.
Le milieu réactionnel est de nouveau évaporé puis co-évaporé à
sec avec l'eau. Le composé désiré est purifié et dessalé par HPLC. HPLC analytique : temps de rétention : 17 à 20 min.
Purification : colonne préparative Protein Pack 8 HR DEAE 10 x 100 mm, mêmes tampons et gradient utilisés dans l'exemple 9, débit 2 ml/min. Dessalage : colonne RP 18, tampon A : eau, tampon B : méthanol. CCM : Rf = 0 .2, éluant : propanol : eau NH40H (4 : 5 :1, v :v :v) II- Synthèse des nucléotides triphosphates modifiés en position 4 par la présence d'une chaîne alkyloxyaminée Dans un premier temps, on a introduit une chaîne alkyle, hydroxylée à son extrémité, par substitution nucléophile du groupe tosyle en position 4 de la cytidine. Ensuite, nous avons réalisé la réaction de Mitsunobu entre la fonction hydroxyle de la chaîne introduite et la N-phtalamido-hydroxylamine.

L'obtention du nucléotide triphosphate alkyloxyaminé
correspondant suit les mêmes étapes de synthèse que celles des nucléotides triphosphates alkylaminés (Figure 2).

EXEMPLE 11: Synthèse de la [4-N-hexanyl-6-ol-2',3'-O-isopropylidène-5'-t-butyldiméthylsilyl-cytidine (28).

A une solution de (23) (1 mmole) dans le dichlorométhane (5 ml) est ajouté à température ambiante et sous argon, le 6-amino-hexanol (5mmoles, 5 éq.) . Après 30 min de réaction le solvant est évaporé à sec, et le composé (28) est purifié par chromatographie sur gel de silice.

EXEMPLE 12: Synthèse de la [4-N-hexanyl-6-N-phtalamido-oxyamino-2',3'-O-isopropylidène-5'-t-butyldiméthylsilyl]-cytidine (29).

A la solution de (28) (1 mmole) en présence de la triphénylphosphine (3 mmoles, 3 éq.) et de la N-phtalamido-hydroxylamine (3 mmoles, 3 éq.) dans le THF (10 ml) est ajouté
le diéthyle azodicarboxylate (le DEAD, 3 mmoles, 3 mmoles, 3 éq.) à température ambiante et sous argon. Après une heure d'agitation, le solvant est évaporé à sec et le composé (29) est purifié par chromatographie sur gel de silice.

EXEMPLE 13: Synthèse de la [4-N-hexanyl-6-N-phtalamido-oxyamino-2',3'-O-isopropylidène]-cytidine (30).

Le composé (30) a été synthétisé selon le protocole décrit dans l'exemple 8.

EXEMPLE 14: Synthèse de la [4-N-hexanyl-6-N-phtalamido-oxyamino-2',3'-O-isopropylidène-5'-0-triphosphate]-cytidine (31).

Le composé (31) a été synthétisé selon le protocole 5 décrit dans l'exemple 9. HPLC analytique (conditions dans l'exemple 10) : temps de rétention : 44 min. CCM . Rf = 0.5, éluant : propanol : eau : NH40H ( 6 :3 :1, v :v :v) EXEMPLE 15: Synthèse de la [4-N-hexanyl-6-oxyamine-5'-10 O-triphosphate]-cytidine (32).

Le nucléotide totalement protégé (32) totalement protégé est déprotégé en 2',3' par l'acide trifluoroacétique selon le protocole décrit dans l'exemple 10. La déprotection de la fonction alkoxyamine est réalisée dans une solution aqueuse 15 de l'hydrazine pendant une nuit à température ambiante. Le nucléotide (32) est ensuite purifié par HPLC dans les mêmes conditions que celles décrites dans l'exemple 10.

EXEMPLE 16: Synthèse de la [4-N-(2,2-oxy-bis-20 éthylamine)-5'-O-triphosphate] -cytidine (33) par transamination.

La cytidine triphosphate (0.1 mmole) est ajoutée à la solution composée du bisulfite de sodium (12 mmoles, 120 éq.) et du chlorhydrate de la 2-2' oxy-bis-éthylamine (7.5 mmoles, 75 25 éq.) dans l'eau (2.5 ml) dont le pH a été préalablement ajusté à
7.0 par une solution de soude à 10 M, l'agitation étant maintenue à 37 C pendant 3 jours. Le composé (33) est purifié et dessalé par HPLC (voir conditions HPLC dans l'exemple 10).

30 EXEMPLE 17: Synthèse de la [4-N-(acide adipique-hydraz ide) -5'-O-triphosphate] -cytidine (34) par transamination.

Le nucléotide (34) a été préparé par transamination selon le protocole décrit dans l'exemple 16, en utilisant l'acide adipique dihydrazide (83mg, 0,44moles) pour l'introduction de la fonction hydrazide. Sa purification et son dessalage ont été aussi réalisés selon l'exemple 10, sa structure a été confirmée par RMN du proton.

IV- Fluorophore fonctionnalisé:

EXEMPLE 18 : Synthèse de fluorescéine-aldéhyde (36).
Voie de synthèse HO O O

+ H2N 0,-/
i I COOH 0\/
NCS
DMF
HO O O
COOH

HN O_../
O
CH3COOH 30%
HO O O

COOH

O H
Couplage du FITC avec l'aldéhyde protégé

HO O O
COOH
HN O-Y
O O,-.-L'isothiocyanate de fluorescéine (913 mg, 2,35 mmol, Aldrich, F 250-2) est dissous dans du DMF anhydre (10 ml), sous argon. On ajoute alors l' aminobutylaldéhyde diéthylacétal (421 5 mg, 392 ml, 235 mmol). Au bout d'une heure le DMF est évaporé et le résidu est chromatographié sur gel de silice (éluant : CH2C12 /MeOH : 90/10, v/v). Après évaporation du solvant on obtient le produit (35) sous forme d'une poudre orange (1,21 g, 2,2 mmol, 94 %). Il a été caractérisé par RMN du proton et par 10 spectrométrie de masse.

Déprotection de l'aldéhyde HO O O c 1 COOH

O H

Le produit protégé (35) (342 mg, 0,62 mmol) est placé
15 dans 20 ml d'une solution aqueuse d'acide acétique à 30 01. Après une heure de réaction on évapore le solvant et on co-évapore avec de l'acétonitrile. Le résidu obtenu est chromatographié sur gel de silice (éluant CH2C1-. /MeOH - 90/10, v/v) . Après évaporation du solvant on obtient le produit (36) sous forme 20 d'une poudre orange (145 mg, 0,30 mmol, 48 9.). Il a été
caractérisé par RMN du proton et par spectrométrie de masse.

EXEMPLE 19 Synthèse chimique d'un polynucléotide préfonctionnalisé.

Synthèse du nucléoside de départ 2'-désoxy-8-(pentényl)-thioadénosine (38):
La synthèse du nucléoside de départ a été réalisée en utilisant le précurseur 2'-désoxy-8-mercaptoadénosine (37) obtenu selon la stratégie décrite par A. LAAYOUN, J.-L. DECOUT
et J. LHOMME dans Tetrahedron Lett., 1994, 35, 4989-4990.

N N
SH S

N N
Br O
HO O HO--~
K2CO3, DMF

OH OH
Le 2'-désoxy-8-mercaptoadénosine (16,68 mmol) est dissous dans du DMF (Diméthyl formamide) anhydre en présence d'un excès de carbonate de potassium (33,00 mmol). Après addition sous argon de 1-bromopent-4-ène (18,37 mmol) et une incubation de trois heures sous agitation à température ambiante, les sels minéraux sont filtrés sur célite et la DMF
est évaporée. Un résidu marron est obtenu et lavé à l'hexane puis à l'éther éthylique. Le produit est ensuite purifié par chromatographie sur colonne de silice (éluant: CH2C12/CH3OH -95/5(v/v) puis 90/10(v/v)). Le nucléotide de départ ainsi obtenu est caractérisé par les méthodes spectroscopiques usuelles.
Synthèse chimique d'un polynucléotide préfonctionnalisé:
Dans un premier temps, le nucléoside synthétisé
précédemment est incorporé dans un oligonucléotide. A cet effet, un synthon phosphoramidite (39) correspondant au nucléoside de départ, protégé, a été préparé selon la stratégie décrite par A.

J. ROGERS dans "Oligonucleotide synthesis" (1984), p23-34, M.J.
GAIT Ed., IRL Press, Oxford.

NH.Bz N N
N N

O
DMT-0--~

NC- O-PlN_iPr iPr 5 Bz = Benzoyl DMT = diméthoxytrityl L'amine exocyclique de l'adénine est protégée par un groupement benzoyle, l'hydroxyle en 5' est protégé par le 10 diméthoxytrityle et l'hydroxyle en 3' par le groupement N,N-diisopropyl-2-cyanoéthylphosphoramidite.

Le polynucléotide 5'CGCACLCACGC 3', dans lequel L est la 2'-désoxy-8-(pentényl)-thioadénosine, a été synthétisé sur un 15 appareil Milligen/Biosearch 8700 selon la méthode au phosphoramidite par voie automatique conformément au protocole proposé par le constructeur.
La purification du polynucléotide synthétisé est réalisée par HPLC en phase inverse (colonne semi-préparative 20 Macherey Nagel 10 mm x 25 cm; C18; 5 )um de porosité; éluant:
gradient de 20 min de 0 à 30% d'acétonitrile en mélange avec une solution aqueuse d'acétate d'ammonium 0,1 M à pH 6) . Les fractions contenant le polynucléotide sont collectées et lyophilisées.
25 Après traitement de l'oligonucléotide par de l'acide acétique (80% dans l'eau) pendant 10min à température ambiante, la position 5' du polynucléotide est détritylée puis isolé après extraction à l'éther.

Dans un second temps, le nucléotide L incorporé à
l'étape précédente est activé de façon à obtenir le polynucléotide diol 5'CGCACMCACGC 3', dans lequel N N
~--5 OH
N N OH
M = 0-340 nmol de polynucléotide 5'CGCACLCACGC 3' sont traités avec une solution composée de 170 l de tétroxyde d'osmium 0,02%, 2 l de N-méthylmorpholine-N-oxyde et de 2 l de H202 3%. Après une incubation d'une nuit à température ambiante, le polynucléotide 5'CGCACMCACGC 3' est purifié par HPLC selon les conditions décrites précédemment.
Enfin, le polynucléotide aldéhyde 5'CGCACNCACGC 3' dans lequel N N
S
N N O
N= 0 est obtenu en ajoutant à l'obscurité 200 pl du métapériodate de sodium 54 M à 200 l d'une solution aqueuse 110 nM d'oligonucléotide diol 5'CGCACMCACGC 3'. Après 15 min, le polynucléotide aldéhyde 5'CGCACNCACGC 3' est purifié par HPLC
(colonne semi-préparative Macherey Nagel 10 mm x 25 cm; C18; 7 m de porosité; éluant: gradient de 20 min de 0 à 30'-~; de méthanol en mélange avec une solution aqueuse de dihydrogénophosphate de sodium 20mM à pH6).

EXEMPLE 20 Marquage du polynucléotide préfonctionnalisé obtenu a l'exemple 19 :

La réaction de marquage est réalisée à l'aide du réactif (40) consistant en un noyau dansyle comme groupement fonctionnel fluorescent lié par l'intermédiaire d'une chaîne diéthylène glycol à une fonction oxyamine (nucléophile) . Ce réactif a été préparé selon la méthode décrite D. BOUTURYN et al. Dans Tetrahedron, 1997, 53, 5485-5492.

O= S= O

40 HN' O O 0 NH2 La réaction de marquage est réalisée dans l'eau en présence d'un léger excès de réactif (40) (1,5 équivalent) par rapport à l'oligonucléotide. Le suivi de la réaction par HPLC
indique une disparition rapide des produits de départ et la formation d'un nouveau produit correspondant au polynucléotide fonctionnalisé (41). L'analyse du spectre de RMN du proton confirme par ailleurs l'accrochage du marqueur dansyle.

N N SN-O

N N O

O
NH
0 41 0= i=0 --J~ Ç)~ :D
N
EXEMPLE 21 : Synthèse enzymatique d'un polynucléotide préfonctionnalisé par transcription.
Synthèse du nucléotide préfonctionnalisé: 21-désoxy-8-(butanal)-thioadénosine-5' triphosphate (43):
Cette synthèse est réalisée en utilisant le 2'-désoxy-8-(pentényl)-thioadénosine (38) (voir Exemple 19). Le nucléotide de départ (42) est obtenu selon la méthode décrite par J. LUDWIG
et F. ECKSTEIN dans J. Org. Chem., 1989, 54, 631-635.

IN N
N N
O Q O
HO-P-O-P-O-P-O

3Na+ 42 OH
Les étapes d'oxydation nécessaires à l'obtention du nucléotide préfonctionnalisé 43 sont réalisées comme indiqué
dans l'Exemple 19 :

Incorporation enzymatique du nucléotide préfonctionnalisé (43):

a) Préparation de la matrice ADN portant un promoteur Une PCR est réalisée sur le gène HIVgag porté dans un plasmide pGEM linéarisé, en utilisant un primer classique, et une amorce portant la séquence sens d'un promoteur pour l'ARN
polymérase du phage T7 en amont d'une séquence d'amorce classique.
Séquence des amorces Amorce classique (n 4014) .
5'- AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAA 3' Amorce promoteur(n 4003):
5'AATTCTAATACGACTCACTATAGGGTGCTATGTCACTTCCCCTTGGTTCTCTCA- 3' On obtient un produit de 158 paires de bases, qui est purifié par extraction phénol/chloroforme et passage sur microcon 30.

b) Réaction de transcription :
Les réactions de transcription sont réalisées en tubes Eppendorf dans un volume final de 25 l, dans un tampon 40 mM de Tris/HC1, pH 8,1, 20 mM de MgCl2, 5 mM de Dithiotreitol, 1 mM de spermidine, 8% de polyéthylène glycol, 0,01% de Triton X 100, 50 gg/ml de d'albumine de sérum bovin. Le nucléotide préfonctionnalisé (43) et les quatre ribonucléotides (CTP, GTP, ATP, UTP) sont ajoutés respectivement à la concentration de 1,33 mM et 4 mM chacun. La matrice PCR est ajoutée à la concentration de 109 copies/ l, et l'ARN polymérase du phage T7 (Demande de brevet FR 97 04166) à la concentration de 1 u/ l. La réaction est incubée durant 60 min à 37 C. 0,5 u/pl de DNAse 1 sont ajoutés au milieu afin de détruire la matrice ADN.
L'échantillon est incubé à 37 C continue pendant 15 min. Les ARN
obtenus sont purifiés par un passage sur Sephadex G50.
En parallèle, un premier contrôle est effectué avec une réaction sans addition de T7 ARN polymérase. Un second contrôle est réalisé sans nucléotide activé, comme témoin de la transcription.

Les produits de transcription purifiés sont marqués selon le mode expérimental décrit à l'Exemple 2 et visualisés sous lampe ultra violette après migration électrophorétique en gel d'agarose.

EXEMPLE 22 Synthèse d'un polynucléotide préfonctionnalisé au cours d'une réaction d'amplification TMA.
Pour permettre le marquage intense des produits 10 d'amplification TMA, on incorpore des nucléotides préfonctionnalisés 27a (CTP-(N4)-C602-NH2), 27b (CTP-(N4)-C4-NH2), 32 (CTP- (N4) -C6-ONH2) , dans les amplicons. Des réactions d'amplification sont menées en parallèle en présence d'un nucléotide marqué portant une fluorescéine, l'UTP-12-15 fluorescéine (Boerhinger, ref 1 427 857.

Les nucléotides préfonctionnalisés 27a, 27b, 32, et à titre de comparaison, le nucléotide marqué de Boerhinger, ref 1 427 857, sont testés pour leur incorporation dans les produits de la réaction d'amplification TMA, selon les kits 20 Gen-Probe amplified TM MTD2 (amplified Mycobacterium tuberculosis direct test). Cette réaction permet l'amplification d'un fragment de 136 bases de l'ARN 16S des mycobactéries. Elle utilise quatre activités enzymatiques (ARN
polymérase ADN dépendante, ADN polymérase ADN dépendante, ADN
25 polymérase ARN dépendante, et ribonucléaseH) et deux enzymes, la T7 ARN polymérase, et la transcriptase inverse AMV. Par des réactions récurrentes impliquant des étapes de transcription, de reverse transcription, et de digestion de l'ARN contenu dans les double brin ADN:ARN, qui ressemblent à un cycle de 30 réplication des virus à ARN, cette réaction permet l'amplification spécifique d'une séquence d'acide nucléique reconnue par deux amorces (une amorce simple et une amorce contenant le promoteur de la T7 ARN polymérase) . Le facteur d'amplification est très important (109) et la sensibilité
très bonne (1 à 10 copies). Les produits obtenus sont pour 90%
des ARN simple brin, et pour 10% des ADN double brin.

On réalise les réactions d'amplification à partir de 106 copies d'ARN 16S de Mycobacterium tuberculoses. Cet ARN
cible est préalablement obtenu et quantifié selon la méthode suivante: le gène de l'ARN 16S est cloné dans un plasmide, sous le contrôle d'un promoteur. Par transcription in vitro, on obtient l'ARN 165. Celui ci est purifié par extraction au phenol-chlorof orme, et filtration sur microcon 30 TM (Amicon).
Il est dosé par son absorption à 260 nm.

Les réactions TMA classiques contiennent 4 mM de chacun des rNTP naturels (ATP, CTP, GTP et UTP). Pour l'incorporation des nucléotides préfonctionnalisés dans les produits d'amplification, la réaction est effectuée en incluant un de ces nucléotides modifiés dans le tampon réactionnel. On étudie la réaction en présence de différents rapports de concentrations entre le nucléotide modifié et le nucléotide naturel, tout en gardant à 4 mM la concentration totale de chaque nucléotide de la même série, modifié ou naturel. Les rapports étudiés sont 0 %, 10 %, 30 %, 50 % et 70 % (sauf pour l'UTP-fluorescéine, pour lequel on n'a pas pu tester 70 %) . On effectue un contrôle négatif, consistant en une réaction comportant tous les réactifs, dont le plus haut rapport de nucléotides modifiés utilisé (70 ou 50 %), sauf les enzymes (remplacées par le tampon de reprise des enzymes lyophilisées).

Les réactions d'amplification sont analysées par électrophorèse de 5 l de réaction sur gel de polyacrylamide dénaturant (6% acrylamide, 7M urée, iX TBE, appareil d'électrophorèse bioRad, 170 volts, 45 minutes) et coloration au bromure d'ethidium, puis par Northern. Les acides nucléiques sont transferés sur membrane (Nylon N, appareil de transfert semi-sec de bioRad, 0,5 X TBE, 25V, 15 minutes) et hybridés avec des sondes nucléiques spécifiques de Mycobactérium tuberculoses:

(séquence : 5'-CGGGATGCATGTCTTGTGGT) marquées à la péroxydase (préincubation à 37 C durant 30 minutes en PEG, puis incubation à 37 C durant lheure en présence de PEG contenant 0,1 ng/ l de sonde péroxydase). La révélation est colorimétrique (substrat Diaminobenzidine, sigma).

Pour les réactions contenant le nucléotide fluorescent (UTP-12-fluorescéine), on visualise aussi les produits d'amplification sur gel avant coloration au bromure d'ethidium par excitation de la fluorescéine sur une table ultraviolet.

Pour toutes les réactions, y compris celles incluant les nucléotides préfonctionnalisés, on visualise après coloration au bromure d'éthidium les produits d'amplification attendus, en grande quantité. Après Northern, ces produits s'hybrident avec la sonde spécifique.

EXEMPLE 23 : Analyse des rendements d'incorporation dans les produits d'amplification TMA.

Pour évaluer la préfonctionnalisation des amplicons obtenus en présence des nucléotides préfonctionnalisés 27a (CTP- (N4) -C602-NH2) , 27b (CTP- (N4) -C9-NH2) , et à titre de comparaison, du nucléotide marqué UTP-12-fluorescéine (Boerhinger, ref 1 427 857), on détermine le rapport entre le nucléotide préfonctionnalisé incorporé, et le nucléotide naturel analogue.

Les produits d'amplification obtenus lors de la réalisation de l'exemple 22 sont séparés des nucléotides en excès dans la réaction par filtration sur Microcon 30 TM (de chez Amicon), et repris dans 50 l d'eau. Pour l'amplification en présence d'UTP-12-fluorescéine, la purification est effectuée sur sephadex G50 (absorption de la fluorescéine sur Microcon).

Ils sont ensuite dosés pour leur absorption à 260 nm (le contrôle sans enzyme doit avoir une concentration très faible).

Pour les réactions d'amplification incluant les nucléotides préfonctionalisés (et leurs contrôles), on procède ensuite à une étape de digestion des acides nucléiques jusqu'au stade nucléoside :

5 1014 copies de produits d'amplification (environ 35 g) sont dilués dans un volume final de 86 l d'eau (pour le contrôle sans enzyme, un volume égal au volume d'échantillon le plus important est utilisé). On rajoute 10 l de tampon 10X
pour la nucléase Pl (tampon CH3COONa pH 5,3, 300mM, 1 mM
ZnSO4) et 4 l de nucléase Pl (Boerhinger, ref 236225, l g/ l, 0,3u/ l). La réaction est incubée à 37 C durant 30 minutes.
On ajoute ensuite 12 l de tampon 10X pour la phosphatase alcaline (Boerhinger, ref 1246283) et 1 l de phosphatase alcaline (Boerhinger, ref 713023, 1U/ l), et l'incubation à
37 C est continuée durant 15 minutes. La réaction est arrêtée dans la glace.

La composition en nucléosides est alors déterminée par analyse sur chromatographie liquide haute pression (HPLC, Beckman, système Gold), et par comparaison à des standards nucléosides (injection de 50 ng de chaque nucléoside) . On injecte 20 l de la digestion sur colonne C18 (Ultrasphere), chauffée à 45 C. La séparation est effectuée en tampon sodium phosphate 50 mM pH 7, comportant un gradient de méthanol (au bout de 10 minutes, passage en 15 minutes de 0% à 30% de méthanol à 95%). Les pics sont visualisés par absorption à 254 nm, et les aires des pics sont calculées par intégration.

Le rapport entre l'aire du pic du nucléotide préfonctionnalisé, et celui de son analogue naturel permet de déterminer le rendement d'incorporation, c'est à dire le rapport entre la quantité de nucléotide préfonctionnalisé

incorporé et la quantité totale de nucléotide de la même série incorporée.

Le contrôle sans enzyme ne doit pas donner lieu à
l'apparition de pic. Ce contrôle témoigne de la bonne efficacité de l'étape d'élimination des nucléotides en excès.

Pour les réactions d'amplification incluant l'UTP-fluorescéine, la quantité de nucléotide fluorescéine incorporé
est mesurée par l'intensité de fluorescence : la lecture de l'intensité de fluorescence d'une gamme étalon de fluorescéine est effectuée sur un spectrofluorimètre Perkin LS 50.

L'intensité de fluorescence des différentes réactions d'amplification est mesurée. Par comparaison avec la courbe d'étalonnage, on détermine la quantité de fluorescéine incorporée. On calcule le rendement d'incorporation par rapport à la concentration en amplicons mesurée par absorption à 260 nm.

L'analyse HPLC permet de séparer les huit nucléosides naturels, ainsi que les trois nucléosides analogues aux trois nucléotides préfonctionnalisés testés.

Les résultats, présentés dans le tableau ci-dessous 5 montrent que tous les nucléotides CTP préfonctionnalisés étudiés ont un meilleur rendement d'incorporation dans les produits d'amplification TMA que l'UTP-12-fluorescéine, nucléotide marqué classiquement utilisé.

% [nucl.préfonctionnalisé] / 70 50 30 10 0 [nucl. naturel]

27a (CTP-(N4)-C602-NH2)/CTP naturel 1/3 1/5 1/9 1/33 0 27b (CTP-(N4)-C4-NH2)/CTP naturel 1/6 1/15 1/48 ND 0 Boerhinger, ref 1 427 857 ND 1/30 1/45 1/200 0 (UTP-12-fluorescéine)/ CTP naturel 10 ND : non déterminé. Nucl. : nucléotide Ces résultats montrent que la préfonctionnalisation du nucléotide CTP permet une meilleure incorporation que le marquage avec une fluorescéine. La très bonne préfonctionnalisation des amplicons permet d'obtenir, après 15 fonctionnalisation, un marquage plus intense qu'avec le nucléotide fluorescéine.

De même, d'autres fonctions réactives intoduites sur la position N4 de la cytidine, telle que la fonction oxyamine du nucléotide 32, permettent un meilleur rendement 20 d'incorporation.

EXEMPLE 24: Analyse de l'impact de l'incorporation des nucléotides préfonctionnalisés sur la sensibilité TMA.
Pour étudier la sensibilité de la TMA incluant l'incorporation de nucléotides préfonctionnalisés, on a effectué la TMA à partir de quantités décroissantes de cible (ARN 16 S de Mycobacterium tuberculosis, décrit dans l'exemple 22) (10 000, 1 000, 100, 10 et 0 copies) , en présence de différents rapports entre le nucléotide préfonctionnalisé et son analogue naturel (100%, 70%, 50% 30% 10% 0%) . Les mêmes nucléotides préfonctionnalisés sont testés, 27a (CTP-(N4)-C602-NH2) , 27b (CTP- (N4) -C4-NH2) .

Les produits réactionnels sont étudiés entre autre par la méthode décrite dans l'exemple 22.

Les produits réactionnels sont aussi analysés de façon semi-quantitative par ELOSA (PCT WO 92/19812), et comparaison de l'intensité des signaux avec ceux de gammes étalons.

Les réactions effectuées en présence de nucléotide(s) préfonctionnalisé(s) sont analysés par électrophorèse et coloration, Northern, et ELOSA. Les résultats obtenus en ELOSA, qui sont représentatifs des différentes méthodes analytiques utilisées, sont représentés aux figures 4 et 5. Quelque soit le nucléotide préfonctionnalisé utilisé (27a, 27b) on peut déterminer une concentration en nucléotide(s) préfonctionnalisé(s) telle que la sensibilité de la réaction TMA ne soit pas affectée de manière significative, même avec un très faible nombre de copies de cible initiale. Comme cela ressort plus spécifiquement de la figure 5 annexée le nucléotide 27b peut remplacer le nucléotide naturel.

EXEMPLE 25 : Marquage des amplicons préfonctionnalisés :

Les amplicons préfonctionnalisés obtenus par la méthode utilisée lors de la réalisation de l'exemple 22 , en présence du nucléotide préfonctionalisé, 27b (CTP-(N4)-C4-NH2), sont marqués par une réaction chimique de couplage entre la fonction nucléophile portée par les amplicons et amenée par les nucléotides préfonctionnalisés incorporés, et une fonction anti-réactive électrophile préalablement couplée à la fluorescéine. Le marquage ainsi obtenu est comparé à celui obtenu en présence du nucléotide marqué UTP-12-fluoresceine (Boerhinger, ref 1 427 857).

Les amplicons sont obtenus par la méthode décrite dans l'exemple 22 à partir de 106 copies de cible ARN 16S de Mycobacterium tuberculosis, et en présence de 50% de nucléotide préfonctionalisé 27b.

Les amplicons obtenus sont couplés à la fluorescéine-NHS (Boerhinger 8370042128), selon la méthode suivante : 30 i de produits d'amplification TMA sont mélangés avec 30 l de tampon carbonate 0,2M, NaCl 0,15 M, à pH8,8, et 40 l (environ 200 équivalents) de fluorescéine NHS (3,5 mg/ml en DMSO). Après agitation durant une heure à température ambiante, le marquage est analysé.

Les amplicons marqués (15 .il) sont analysés par électrophorèse sur gel comme décrit dans l'exemple 22, et visualisés sous ultraviolet, avant et après coloration au bromure d'ethidium. Les profils sont comparés avec ceux obtenus par marquage en présence de 50 % d'UTP-12-fluorescéine.

Les signaux obtenus sans coloration sont plus intenses que ceux obtenus par marquage direct à la fluorescéine. En utilisant la fonction oxyamine telle que portée par le nucléotide 32, un résultat aussi bon sera possible après couplage avec le fluorophore 36. La réactivité
du couple oxyamine aldéhyde permet des temps de couplage réduits comme montré dans l'exemple 20.

53a LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:

(i) DEPOSANT:
(A) NOM: BIO MERIEUX
(B) RUE: CHEMIN DE L'ORME
(C) VILLE: MARCY L'ETOILE
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 69280 (ii) TITRE DE L' INVENTION: Procédé d'amplification d'une séquence d'un acide nucléique cible (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 3 (iv) ADRESSE DE CORRESPONDANCE:
(A) NOM: Swabey Ogilvy Renault (B) ADRESSE: 1981 McGill College, Suite 1600 (C) VILLE: Montréal (D) ÉTAT: Québec (E) PAYS: Canada (F) CODE POSTAL: H3A 2Y3 (v) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Disquette (B) ORDINATEUR: Compatible IBM
(C) SYSTEME D'EXPLOITATION: Windows 95 (D) LOGICIEL: WORD 97 (vi) DONNEES DE LA DEMANDE ACTUELLE:
(A) NUMERO DE LA DEMANDE: 2,262,019 (B) DATE DE DEPOT: 1-AOUT-1997 (vii) DONNEES DE LA DEMANDE ANTERIEURE:
(A) NUMERO DE LA DEMANDE: PCT/FR97/01445 (B) DATE DE DEPOT: 1-AOUT-1997 (vii) DONNEES DE LA DEMANDE ANTERIEURE:
(A) NUMERO DE LA DEMANDE: FR 96/09977 (B) DATE DE DEPOT: 2-AOUT-1996 (viii) INFORMATIONS CONCERNANT L'AGENT:
(A) NOM: COTÉ, France (B) NUMÉRO D'INSCRIPTION: 4166 (C) NUMÉRO DE RÉFÉRENCE: 8708-217 FC/ntb (ix) INFORMATION DE TÉLÉCOMMUNICATION:
(A) TÉLÉPHONE: (514) 845-7126 (B) TÉLÉCOPIE: (514) 288-8389 (C) TÉLEX:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:

53b (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 11 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN

(ix) CARACTERISTIQUE/
(A) NOM/CLE : caractéristique particulière (B) EMPLACEMENT : 6 (D) AUTRES INFORMATIONS : A représente 2'-désoxy-8-(pentényl)-thioadénosine (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 11 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN

(ix) CARACTERISTIQUE/
(A) NOM/CLE : caractéristique particulière (B) EMPLACEMENT : 6 (D) AUTRES INFORMATIONS : A représente M défini dans la description page 41 lignes 7-9 (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 29 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 54 paires de bases 53c (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 20 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADN

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5:

Claims (16)

REVENDICATIONS

1. Procédé d'amplification et de détection d'une séquence d'un acide nucléique cible présent dans un échantillon, selon lequel - on dispose au moins : de la séquence d'un acide nucléique cible, d'au moins une amorce oligonucléotidique spécifique de la séquence cible, d'une ou plusieurs activités enzymatiques et de nucléotides, et - on amplifie, dans des conditions adaptées à
l'activité ou les activités enzymatiques, la séquence cible, caractérisé en ce que, parmi les nucléotides dont on dispose, au moins un nucléotide est un nucléotide préfonctionnalisé, différant des autres nucléotides au moins par la présence d'au moins une fonction réactive de covalence non protégée, greffée en au moins un site prédéterminé de la base dudit nucléotide, et choisie parmi les fonctions amine et oxyamine, et en ce qu'en outre, on fait réagir, directement, le produit d'amplification préfonctionnalisé ainsi obtenu, avec un réactif comprenant une fonction anti-réactive de covalence consistant en la fonction aldehyde, et un groupe fonctionnel de marquage choisi parmi les groupements fluorescents et luminescents, pour obtenir un produit d'amplification fonctionnalisé, et on détecte ledit produit d'amplification fonc-tionnalisé et marqué.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le groupe fonctionnel de marquage du réactif est une molécule chimique fluorescente.

3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé
en ce que le groupe fonctionnel de marquage du réactif est choisi parmi la fluorescéine et le dansyle.

4. Procédé selon l'une des quelconques revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la fonction anti-réactive du réactif est greffée sur le groupe fonctionnel par l'intermédiaire d'un bras de couplage.

5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le bras de couplage est une chaîne hydrocarbonée, saturée ou insaturée, interrompue ou non par des fonctions amine, amide ou oxy.

6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, caractérisé
en ce que la fonction aldéhyde est liée au groupe fonctionnel par le bras de couplage -NH-CS-NH(CH2)3- et en ce que le groupe fonctionnel du réactif est la fluorescéine.

7. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence d'acide nucléique cible est une séquence d'ADN ou d'ARN et en ce que les activités enzymatiques comprennent les activités ADN polymérase ARN ou ADN-dépendantes.

8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que les activités enzymatiques comprennent l'activité
ribonucléase H et l'activité ARN polymérase ADN-dépendante.

9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que les activités enzymatiques ribonucléase H et ADN polymérase sont apportées par une seule enzyme.

10. Procédé selon la revendication 8, caractérisé
en ce que les activités enzymatiques ribonucléase H et ADN
polymérase sont apportées chacune par une enzyme différente.

11. Procédé selon la revendication 1, caractérisé
en ce que la base du nucléotide préfonctionnalisé est dérivé de la cytosine et en ce que la fonction réactive est greffée, par l'intermédiaire d'un bras de couplage, sur la fonction aminée en position 4 du cycle pyrimidique.

12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que le bras de couplage est choisi parmi :
(CH2)n1' (O-CH2-) n1, dans lequel n1 est un entier compris entre 1 et 12 [ - (CH2) 2-O- (CH2) 2-] ) n2, [ - (CH2) 2-O- (CH2) 2-O- (CH2) 2-] n2, [-CH2-O- (CH2) 2- ]) n2, dans lequel n2 est un entier compris entre 1 et 6, et -NH-CH2-O- (CH2) 2- .

13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le bras de couplage est choisi parmi :

-CH2- , ( - CH2 - ) 2 , ( - CH2 - ) 3 , ( - CH2 - ) 4 , E ; - (CH2) 2-O- (CH2) - (CH2) 2-O- (CH2) 2-O- (CH2) 2-, et NH-CH2-O- (CH2) 2-.

14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé
en ce que le bras de couplage est (OH2)2-O- (CH2) 2-O- (CH2) 2- .

15. Nucléotide préfonctionnalisé susceptible d'être soumis à un traitement enzymatique, dont la base est dérivée de la cytosine et comporte, au moins sur la fonction aminée en position 4 du cycle de la base pyrimidique, au moins une fonction réactive consistant en une fonction oxyamine liée par l'intermédiaire du bras de couplage -(CH2)6.

16. Nucléotide préfonctionnalisé susceptible d'être soumis à un traitement enzymatique, dont la base nucléique est dérivée de la cytosine et comporte, au moins sur la fonction aminée en position 4 du cycle de la base pyrimidique, au moins une fonction réactive consistant en une fonction amine liée par l'intermédiaire du bras de couplage consistant en (CH2) 2-O- (CH2) 2-O- (CH2) 2- .