JP2711180B2 - 主鎖修飾されたオリゴヌクレオチド類似体 - Google Patents

主鎖修飾されたオリゴヌクレオチド類似体

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Description

【発明の詳細な説明】 関連特許出願 本特許出願は、1991年５月21日提出の米国特許出願第
703,619号の一部継続出願であり、米国特許出願第703,6
19号は、1990年８月13日提出の米国特許出願第566,836
号および1990年７月27日提出の米国特許出願第558,663
号の一部継続出願である。これらの特許出願はいずれも
本特許出願の譲受人に譲渡されており、参照文献として
ここに引用する。
発明の分野 本発明は、治療や診断用に適した、また学術研究用の
試薬として適した耐ヌクレアーゼ性のオリゴヌクレオチ
ド類似体の設計、合成、及び応用に関する。野生型の核
酸における糖間結合（inter−sugar linkage）として通
常作用するホスホロジエステル結合（phosphorodiester
bond）の代わりに修飾された結合を有するオリゴヌクレ
オチド類似体が提供される。このようなオリゴヌクレオ
チド類似体は、ヌクレアーゼ分解に対して抵抗性があ
り、DNAとRNAの活性を調節することができる。さらに、
これらのオリゴヌクレオチド類似体を合成するための方
法、および本発明のオリゴヌクレオチド類似体を使用し
て蛋白質の生成を調節する方法、ならびに中間体組成物
および方法が提供される。
発明の背景 よく知られているように、哺乳動物における肉体状態
（疾病状態も含めて）の殆どは蛋白質によって作用を受
ける。こうした蛋白質は、直接作用する場合でも、ある
いは酵素機能を介して作用する場合でも、動物や人間に
種々の疾病を引き起こす一因となることが多い。
従来からの治療学は一般に、疾病を引き起こす作用ま
たは疾病を重くする作用を和らげるよう検討を進めてい
く上で、蛋白質との相互作用を調べることに重点を置い
ている。しかしながら最近では、蛋白質の合成を方向づ
ける分子（すてわち細胞内RNA）との相互作用によっ
て、こうした蛋白質の実際の生成を和らげようとする検
討がなされている。これらの相互作用には、相補的“ア
ンチセンス”オリゴヌクレオチドまたはそれらの特定の
類似体の、RNAに対するハイブリッド形成が含まれてい
る。ハイブリッド形成は、オリゴヌクレオチドまたはオ
リゴヌクレオチド類似体の、RNAまたは一重鎖DNAに対す
る配列特異的水素結合である。蛋白質の生成を妨げるこ
とによって、できるだけ高い効能とできるだけ少ない副
作用を示す治療学的結果が得られるものと期待される。
同様に、オリゴヌクレオチド類似体は、生物による蛋白
質の生成を調節することができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびアンチセンス
オリゴヌクレオチド類似体の薬理学的活性は、他の治療
の場合と同様、特定の細胞内標的においてこれらの薬剤
の有効濃度に影響を及ぼす種々の因子に依存する。オリ
ゴヌクレオチドに関する１つの重要な因子は、ヌクレア
ーゼの存在下における安定性である。未修飾のオリゴヌ
クレオチドが有用な治療用薬剤になるとは考えられな
い。なぜなら、未修飾のオリゴヌクレオチドはヌクレア
ーゼによって速やかに分解されるからである。したがっ
て、オリゴヌクレオチドを耐ヌクレアーゼ性にするよう
これに修飾を施すことが必要となる。
耐ヌクレアーゼ性を高めるためのオリゴヌクレオチド
の修飾は、一般には糖−リン酸主鎖のリン原子上で行わ
れる。ホスホロチオエート、メチルホスホネート、ホス
ホルアミデート、およびホスホトリエステルが、種々の
レベルの耐ヌクレアーゼ性を付与することが報告されて
いる。しかしながら、一般にこのタイプのリン酸修飾オ
リゴヌクレオチドはハイブリッド形成特性がよくない
［Cohen,J.S.,ed.Oligonucleotides:Antisense Inhibit
ors of Gene Expression,（CRC Press,Inc.,Boca Raton
FL,1989）］。
他の重要な因子は、疾病プロセスに関与している特定
の細胞の形質膜をアンチセンス化合物が横切る能力であ
る。細胞膜は、脂質−蛋白質二層体からなり、小さな非
イオン性の親油性化合物は自由に透過できるが、殆どの
天然代謝産物や治療用薬剤にとっては不透過性である
〔Wilson,D.B.Ann.Rev.Biochem.47:933−965（197
8）〕。培養した哺乳類細胞における天然オリゴヌクレ
オチドおよび修飾オリゴヌクレオチドの生物学的効果と
抗ウイルス効果が、文献により立証されている。したが
って、これらの薬剤は膜を透過して細胞内の標的に達す
ることができると考えられる。天然オリゴヌクレオチド
およびある特定の耐ヌクレアーゼ性類似体（例えばアル
キルトリエステル類）を使用して、種々の哺乳類細胞
（HL−60、ゴールデンハムスターの繊維芽細胞、U937、
L929、CV−１、およびATH8等の細胞）によるアンチセン
ス化合物の取り込みが研究されている［Miller,P.S.,Br
aiterman,L.T.およびTs′O,P.O.P.,Biochemistry16:198
8−1996（1997）；メチルホスホネート,Marcus−Sekur
a,C.H.,Woerner,A.M.,Shinozuka,K.,Zon,G.,およびQuin
man,G.V.,Nuc.Acid Res.15:5749−5763（1987）;Mille
r,P.S.,McParland,K.B.,Hayerman,K.およびTs′O,P.O.
P.,Biochemistry16:1988−1996（1977）；ならびにLok
e,S.K.,Stein,C.,Zhang,X.H.Avigan,M.,Cohen,J.および
Neckers,L.M.Top.Microbiol.Immunol.141:282:289（198
8）］。
修飾オリゴヌクレオチドおよび修飾オリゴヌクレオチ
ド類似体は、対応する天然オリゴヌクレオチドに比べて
簡単には取り込まれにくい場合が多い。このため、従来
より使用されている多くのアンチセンスオリゴヌクレオ
チドの活性は、実際の治療目的、学術研究目的、または
診断目的に対して充分であるとは言えない。アンチセン
ス治療学用に設計された従来技術のオリゴヌクレオチド
が有する他の２つの大きな欠点は、細胞内RNAに対する
ハイブリッド形成がよくないこと、およびRNAの基本的
な機能を停止させるための、明確な化学的または酵素仲
介による事象が欠如していることである。
アンチセンスオリゴヌクレオチドの有効性を高め、か
つ上記の問題点を解消するための修飾は、これまで多く
の形態をとってきている。これらの修飾としては、塩基
環の修飾、糖部分の修飾、および糖−リン酸主鎖の修飾
などがある。従来の糖−リン酸主鎖修飾（特にリン原子
上での）によれば、種々のレベルの耐ヌリレアーゼ性が
達成されている。しかしながら、アンチセンス方法論に
とっては、アンチセンスオリゴヌクレオチドが特定のDN
AまたはRNAと正確に結合する能力が基本となるが、修飾
リンオリゴヌクレオチドは一般にハイブリッド形成特性
が劣っている。
リン原子の置換は、プロキラルのリン酸部分の修飾に
伴う問題点を避けようとする代替アプローチである。リ
ン原子の置換が達成されたいくつかの修飾が、以下に記
載の文献に開示されている:Matteucci,M.Tetrahedron L
etters31:2385−2388（1990），本文献によれば、利用
可能な方法論によっては、主鎖全体にわたってホルムア
セタール結合の均一な挿入を与えることができないた
め、リン原子のメチレン基による置換が制約を受けてお
り、またその不安定性のため、研究用としては不適切な
ものとなっている;Cormierら，Nucleic Acids Research
16:4583−4594（1988），本文献によれば、ジイソプロ
ピルシリル部分によるリン部分の置換が、方法論、ホモ
ポリマーの溶解性、およびハイブリッド形成特性によっ
て制約を受けている;Stirchakら，Journal of Organic
Chemistry52:4202−4206（1987），本文献によれば、カ
ルバメート結合またはモルホリノ結合を含む短いホモポ
リマーによるリン結合の置換が、方法論、生成する分子
の溶解性、およびハイブリッド形成特性によって制約を
受けている;Mazurら，Tetrahedron40:3949−3956（198
4），本文献によれば、ホスホニック結合によるリン結
合の置換は、ホモトリマー分子の合成以上には実現され
ていない；およびGoodchild,J.,Bioconjugate Chemistr
y1:165−187（1990），本文献によれば、エステル結合
がエステラーゼによって酵素作用的に分解され、したが
ってアンチセンスの適用においてリン酸結合を置き換え
るには不適切である。
リン主鎖に修飾を施すための有効な方法が限定されて
いることから、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる
診断、治療、および学術研究を進めることができるよ
う、耐ヌクレアーゼ性と満足できるハイブリッド形成特
性を付与する他の修飾法の開発が長年にわたって強く要
望されている。
発明の目的 本発明の目的は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに
よる診断、学術研究用試薬、および治療に使用するため
のオリゴヌクレオチド類似体を提供することにある。
本発明の他の目的は、細胞内取り込みを高めたオリゴ
ヌクレオチド類似体を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、未修飾のアンチセンスオ
リゴヌクレオチドより高い有効性を有するオリゴヌクレ
オチド類似体を提供することにある。
本発明のさらに他の目的は、このようなオリゴヌクレ
オチド類似体の合成法および使用法を提供することにあ
る。
当業者にとっては、上記の目的および他の目的は、本
明細書および特許請求の範囲から明らかとなろう。
発明の要約 本発明にしたがってRNA分子またはDNA分子の活性を調
節するのに有用な組成物は一般に、修飾された主鎖結合
を少なくとも一部有するオリゴヌクレオチド類似体を含
む。これらの修飾においては、野生型の核酸にみられる
糖−リン酸主鎖のホスホロジエステル結合が、種々の四
原子結合基（four atom linkinggroup）で置き換えられ
る。このような四原子結合基は、ある糖または糖類似体
の３′−炭素とその隣接した糖または糖類似体の４′−
炭素との間に、所望の四原子空間配置を保持している。
本発明の教示にしたがって製造されるオリゴヌクレオチ
ド類似体は、一重鎖または二重鎖のDNAもしくはRNAの、
あらかじめ選定されたヌクレオチド配列と特異的にハイ
ブリッド形成することが可能な選定された配列を含む。
本発明のオリゴヌクレオチド類似体は、公知の固相合成
法により合成されるのが適切であり、RNAまたはDNAのあ
らかじめ選定されたヌクレオチド配列に対して相補的で
あるか、あるいは少なくともその配列と特異的にハイブ
リッド形成が可能である。核酸合成器は市販されてお
り、それらを使用することは、必要とされる妥当な長さ
をもった殆どすべてのオリゴヌクレオチドまたはオリゴ
ヌクレオチド類似体を生成させる上で有効であること
が、当業者によって一般的に認識されている。
本明細書において使用している“ヌクレオシド”と
は、複素環塩基とその糖で構成された単位を表してい
る。“ヌクレオシド”とは、その３′または５′位の糖
ヒドロキシル基上にリン酸基を有するヌクレオチドを表
している。したがってヌクレオシドは、ヌクレオチドと
異なってリン酸基をもたない。“オリゴヌクレオチド”
とは、天然に産する塩基と活性ホスホジエステル結合に
よって糖基を介して結合したペントフラノシル基から、
特定の配列にて形成された複数の連結ヌクレオチド単位
を意味している。これらのヌクレオチド単位は、グアニ
ン、アデニン、シトシン、チミン、またはウラシル等の
核酸塩基であってもよい。糖基は、デオキシリボースま
たはリボースのいずれであってもよい。この用語は、天
然産出化学種と天然に産するサブユニットから形成され
る合成化学種の両方を表している。
本発明に関して使用されている“オリゴヌクレオチド
類似体”とは、オリゴヌクレオチドと類似的に機能する
が、天然には産しない部分を有する化合物を意味してい
る。オリゴヌクレオチド類似体は、変化させた糖部分、
変化させた塩基部分、あるいは変化させた糖間結合を有
することができる。あるいはまた、本発明の目的のため
には、非ホスホジエステル結合（すなわち、変化させた
糖間結合）を有するオリゴヌクレオチド類似体は“オリ
ゴヌクレオシド”とみなすことができる。したがってこ
のようなオリゴヌクレオシドは、天然のホスホジエステ
ル結合基以外の結合基によって連結された、複数の連結
ヌクレオシド単位を意味している。さらに、本発明の目
的のためには、“オリゴマー”は、オリゴヌクレオチ
ド、オリゴヌクレオチド類似体、またはオリゴヌクレオ
シドを包含していると考えることができる。したがって
“オリゴマー”について説明する際には、天然ホスホジ
エステル結合を介して、または本発明の四原子結合基も
含めた他の結合を介して一緒に連結されている一連のヌ
クレオシドまたはヌクレオシド類似体に対しても言及が
なされているものとする。一般には、結合はある１つの
ヌクレオシドの３′炭素から別のヌクレオシドの５′炭
素までであるが、“オリゴマー”は他の結合（例えば
２′−５′結合）も含むことができる。
オリゴヌクレオチド類似体はさらに、本発明の精神と
矛盾しない他の修飾、特に、ある特定のオリゴヌクレオ
チドをアンチセンスの治療用、診断用、または学術研究
試薬用として使用するのを容易にするために、オリゴヌ
クレオチド組成物の耐ヌクレアーゼ性を増大させるよう
な修飾も含むことができる。例えば、ヌクレオシドまた
はヌクレオチドの糖部分が炭素環式化合物や他の化合物
で置き換えられると、もはや糖ではない。さらに、他の
置換（例えば、糖間ホスホジエステル結合に対する置
換）がなされると、得られる物質はもはや真の核酸化学
種ではない。このような置換から得られる化合物もすべ
て類似体とみなす。本明細書の全体にわたって、核酸化
学種の糖部分に言及しているときは、真の糖または天然
核酸の糖の従来の空間配列をもった化学種のいずれかに
言及しているものとする。さらに、糖間結合への言及で
は、糖部分または糖類似体部分を天然核酸の態様におい
て一緒に連結するよう作用する化合物も含んでいるもの
とする。
本発明によれば、細胞内への取り込み、耐ヌクレアー
ゼ性、およびハイブリッド形成特性を高めるように、か
つRNAの基本的な機能を停止させるための明確な化学的
または酵素仲介による事象を与えるように修飾された、
新規タイプのアンチセンスオリゴヌクレオチド類似体お
よびオリゴヌクレオシドが提供される。
ある種類のオリゴヌクレオチド類似体組成物が、治療
にとって有用であり、かつ本発明の他の目的に対して有
用であることが見いだされた。このようなオリゴヌクレ
オチド類似体は、少なくとも一部が以下のような構造式
を有するサブユニットから形成される。
上記の構造式において、Bxは可変の塩基部分であり:Q
はO,CH2,CHF,またはCF2であり;XはH,OH,C1〜C10低級ア
ルキル，置換低級アルキル，アルカリール，アラルキ
ル,F,Cl,Br,CN,CF3，OCF3,OCN,O−アルキル,S−アルキ
ル,NH−アルキル,O−アルケニル,S−アルケニル,NH−ア
ルケニル，SOCH3，SO2CH3，ONO2，NO2，N3，NH2，ヘテ
ロシクロアルキル，ヘテロシクロアルカリール，アミノ
アルキルアミノ，ポリアルキルアミノ，または置換シリ
ルである。さらに、Ｘは、RNA開裂基、オリゴヌクレオ
チドの薬物動態学的特性を改良するための基、またはオ
リゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するための基で
あってもよい。
L1およびL4は互いに独立的に、CR1R2,C＝O,C＝S,CH−
NH2,CH−NHR3,CH−OH,CH−SH,CH−Ｏ−R1，またはCH−
Ｓ−R1である。L2およびL3は互いに独立的に、CR1R2,C
＝CR1R2,C＝NR3,P（Ｏ）R4,P（Ｓ）R4,C＝O,C＝S,O,S,S
O,SO2，NR3，もしくはSiR5R6であるか、あるいは一緒に
なってアルケン、アルキン、芳香環、炭素環、もしくは
複素環の一部を形成する。L1，L2，L3，およびL4は、L1
がＣ＝ＯまたはＣ＝Ｓであるときは、L2はNR3ではな
く、またL4がＣ＝ＯまたはＣ＝Ｓであるときは、L3はNR
3ではないという条件の下にある。さらに、L1，L2，
L3，およびL4は、一緒になって−CH＝Ｎ−NH−CH2−部
分，または−CH2−Ｏ−Ｎ＝CH−部分を構成してもよ
い。
R1およびR2は互いに独立的に、H,OH,SH,NH2，C1〜C10
アルキル，置換アルキル，アルケニル，アルカリール，
アラルキル，アルコキシ，チオアルコキシ，アルキルア
ミノ，アラルキルアミノ，置換アルキルアミノ，ヘテロ
シクロアルキル，ヘテロシクロアルキルアミノ，アミノ
アルキルアミノ，ポリアルキルアミノ，ハロ，ホルミ
ル，ケト，ベンゾキシ，カルボキサミド，チオカルボキ
サミド，エステル，チオエステル，カルボキサミジン，
カルバミル，ウレイド，またはグアニジノである。さら
にR1およびR2は互いに独立的に、RNA開裂基、オリゴヌ
クレオチドの薬物動態学的特性を改良するための基、ま
たはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するため
の基を構成してもよい。
R3は、H,OH,NH2，低級アルキル，置換低級アルキル，
アルコキシ，低級アルケニル，アラルキル，アルキルア
ミノ，アラルキルアミノ，置換アルキルアミノ，ヘテロ
シクロアルキル，ヘテロシクロアルキルアミノ，アミノ
アルキルアミノ，ポリアルキルアミノ,RNA開裂基、オリ
ゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良するための
基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良す
るための基である。R4は、OH,SH,NH2,O−アルキル,S−
アルキル,NH−アルキル,O−アルキル複素環,S−アルキ
ル複素環,NH−アルキル複素環、または窒素含有複素環
である。
R5およびR6は、それぞれ独立的にC1〜C6アルキルまた
はC1〜C6アルコキシである。ただし、L2がＰ（Ｏ）R4で
あり、R4がOHであり、ＸがOHであり、かつ、Bxがウラシ
ルまたはアデニンであるときは、L3はＯではなく；また
L1，L2，およびL4がCH2であり、ＸがＨまたはOHであ
り、かつ、ＱがＯであるときは、L3はS,SO,またはSO2で
はない。
好ましい態様によれば、本発明のオリゴヌクレオチド
類似体は糖部分を含んでもよい（ＱがＯである場合のよ
うに）。他の態様によれば、L1およびL4のそれぞれはCR
1R2である。L2およびL3は互いに独立的に、CR1R2,O,P
（Ｏ）R4,P（Ｓ）R4，またはNR3であるのが好ましく、L
2とL3の一方がCR1R2であり、L2とL3の他方がＰ（Ｏ）R4
またはＰ（Ｓ）R4であるのが特に好ましい。L2がＯであ
って、L3がＰ（Ｏ）R4またはＰ（Ｓ）R4であるような組
み合わせも好ましい。
他の態様によれば、本発明のオリゴヌクレオチド類似
体は、L2およびL3のそれぞれがNR3であり、ここでR3が
Ｈであるのが好ましい。
あるいはまた、本発明のオリゴヌクレオチド類似体
は、L2とL3が一緒になって、シクロプロピル、シクロブ
チル、エチレンオキシ、エチルアジリジン、または置換
エチルアジリジン環の一部を形成しているものでもよ
い。さらに、L2とL3が一緒になって、C3〜C6炭素環、ま
たは4,5,もしくは６員構成の窒素複素環を形成してもよ
い。
オリゴヌクレオチド類似体は、ＸがＨもしくはOH、あ
るいはまたＦ、Ｏ−アルキル、またはＯ−アルケニルで
あって、そして特にＱがＯであるようなものが好まし
い。基Bxは、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、
シトシン、２−アミノアデノシン、または５−メチルシ
トシンであるのが好ましいが、天然に存在しない他の化
学種も使用することができる。
他の好ましい実施態様は、L2およびL4がそれぞれCH2
であって、特にL2およびL3がそれぞれNHであるようなオ
リゴヌクレオチド類似体である。あるいはまた、L2とL3
の一方（好ましくはL3）がＯであって、L2とL3の他方が
NHであるようなオリゴヌクレオチド類似体も好ましい。
本発明のオリゴヌクレオチド類似体は、与えられた構
造を有するサブユニットを約５〜50個含むのが好まし
い。オリゴヌクレオチド類似体の実質的にそれぞれのサ
ブユニットが前記構造を有することができるが、実質的
に交互のサブユニットが前記構造を有することも望まし
い。
本発明のオリゴヌクレオチド類似体は、患者への治療
投与ができるよう、医薬用として許容しうるキャリヤー
中に製剤するのが好ましい。本発明のオリゴヌクレオチ
ド類似体は、対応する天然のオリゴヌクレオチドに比べ
て、改良された耐ヌクレアーゼ性を示すと考えられる。
本発明はさらに、生物中における蛋白質の生成と活性
を調節する方法に関する。この方法は、該蛋白質をコー
ドする核酸配列の少なくとも一部と特異的にハイブリッ
ド形成することが可能なオリゴヌクレオチド類似体と該
生物とを接触させることを含み、ここで前記類似体のサ
ブユニットの少なくともいくつかが前記の構造を有す
る。
本発明はさらに、蛋白質の望ましくない生成を特徴と
する疾患を有する生物を処置する方法に関する。この方
法は、該蛋白質をコードする核酸配列の少なくとも一部
とハイブリッド形成することが可能なオリゴヌクレオチ
ド類似体と該生物とを、単独もしくは医薬用として許容
しうるキャリヤー中に製剤した形で接触させることを含
み、ここで前記類似体のサブユニットの少なくともいく
つかが前記の構造を有する。
本発明はさらに、本発明の治療法の実施に有用なオリ
ゴヌクレオチド類似体も含めた、オリゴヌクレオチド類
似体の合成法を提供する。これらの方法のうちのある特
定の方法は、次の構造： を含む第１の部分と、次の構造： を含む第２の部分（ここでBxは可変の塩基部分であり、
ＱはO,CH2,CHF,またはCF2であり、そしてE1およびE2は
同一または異なり、求電子反応基である）を用意するこ
と；および前記第１と第２の部分を、前記求電子反応基
を介して結合基とカップリングして、前記オリゴヌクレ
オチド類似体を形成させること；を含む。好ましい方法
によれば、第１の部分の求電子反応基は、ハロメチル、
トリフルオロメチル、スルホニルメチル、ｐ−メチル−
ベンゼンスルホニルメチル、または３′−Ｃ−ホルミル
を含み、そして第２の部分の求電子反応基は、ハロゲ
ン、スルホニルメチル、ｐ−メチル−ベンゼンスルホニ
ルメチル、またはアルデヒドを含む。結合基は、ヒドラ
ジンまたはヒドロキシルアミンであるのが好ましい。
本発明はさらに、上記オリゴヌクレオチド類似体のL2
またはL3の窒素部分を保護する方法を提供し、ここでL2
とL3の一方はNR3であり、R3はＨである。この方法は、
窒素部分をフェノキシアセチルクロライドでブロックす
ること；オリゴヌクレオチド類似体をさらに反応させて
該オリゴヌクレオチドを修飾すること；および水酸化ア
ンモニウムで窒素部分を脱ブロックすること；を含む。
本発明はさらに、二官能のヌクレオシドまたはオリゴ
ヌクレオチド類似体を保護する方法を提供し、ここで二
官能価のうちの一つはアルデヒドである。この方法は、
アルデヒドとメトキシアミンとを反応させてアルデヒド
のオキシム誘導体を形成させること；ヌクレオシドまた
はオリゴヌクレオチド類似体をさらに反応させて該ヌク
レオシドまたはオリゴヌクレオチド類似体を修飾するこ
と；および該オキシムをアセトアルデヒドと反応させて
アルデヒドを再生させること；を含む。
本発明はさらに、上記のオリゴヌクレオチド類似体を
合成する方法を提供し、この方法は、ペントフラノシル
ヌクレオシドの３′炭素原子においてラジカルを生成さ
せること；および別のペントフラノシルヌクレオシドの
５′位にペンダント状態になっているオキシム部分と該
ラジカルとを反応させること；を含む。前記オリゴヌク
レオチド類似体の少なくとも一部を、別のオリゴヌクレ
オチド化学種に組み込んで、天然のホスホジエステル結
合とそのようにカップリングされた区域が実質的に交互
に存在する状態の前記別のオリゴヌクレオチド類似体を
得る、という形で治療用組成物を調製するのが有用であ
る。組み込み（incorporation）は、所望の配列を有す
るジヌクレオチドのホスホジエステル結合によって達成
するのが好ましく、このとき前記ジヌクレオチドはあら
かじめそのようにカップリングされている。
次の構造： を有するヌクレオシド前駆体も本発明によって意図され
ており、ここでBxは可変の塩基部分であり;QはO,CH2,CH
F,またはCF2であり；そしてＸはH,OH,C1〜C10低級アル
キル，置換低級アルキル，アルカリール，アラルキル,
F,Cl,Br,CN,CF3，OCF3,OCN,O−アルキル,S−アルキル,N
H−アルキル,O−アルケニル,S−アニケニル,NH−アルケ
ニル，SOCH3，SO2CH3，ONO2，NO2，N3，NH2，ヘテロシ
クロアルキル，ヘテロシクロアルカリール，アミノアル
キルアミノ，ポリアルキルアミノ，置換シリル,RNA開裂
基，オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良する
ための基，またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を
改良するための基である。
このような化学種においては、Ｙはヒドロキシ、アミ
ノメチル、ヒドラジノメチル、ヒドロキシメチル、Ｃ−
ホルミル、フタルイミドヒドロキシメチル、アリール置
換イミダゾリジノ、アミノヒドロキシメチル、オルト−
メチルアミノベンゼンチオ、メチルホスホネート、また
はメチルアルキルホスホネートである。ＺはＨ、ヒドロ
キシル、アミノメチル、ヒドラジノメチル、ヒドロキシ
メチル、Ｃ−ホルミル、フタルイドヒドロキシメチル、
アリール置換イミダゾリジノ、アミノヒドロキシメチ
ル、オルト−メチルアミノベンゼンチオ、メチルホスホ
ネート、またはメチルアルキルホスホネートである。
上記のものはいずれも、ＱがＯであり、Ｙがヒドロキ
シメチルであり、かつＸがＨまたはOHであるときは、Ｚ
はＨまたはＣ−ホルミルではないという条件の下にあ
り；またＱがＯであり、ＸがＨまたはOHであり、かつＺ
がヒドロキシルであるときは、Ｙはアミノヒドロキシメ
チル、ヒドラジノメチル、またはアリール置換イミダゾ
リジノではないという条件の下にある。ＸがＨまたはOH
であって、ＱがＯであるのが好ましい。
修飾された糖結合を有するオリゴヌクレオチド類似体
は、本発明の目的を達成するのに有効であることが見い
だされている。オリゴヌクレオチド類似体は、約５〜50
個の長さの核酸塩基サブユニットを有するのが好まし
い。本発明によるオリゴヌクレオチド類似体は、一重鎖
もしくは二重鎖のDNAおよびRNAの、あらかじめ選定され
たヌクレオチド配列とハイブリッド形成が可能である。
本発明を構成している核酸塩基は、ピリミジン類（例え
ば、チミン、ウラシル、またはシトシン）でも、プリン
類（例えば、グアニンやアデニン）でも、あるいはこれ
らの修飾物（例えば５−メチルシトシン）でもよく、い
ずれも選定された配列中に配置されている。糖部分は、
リボースタイプでも、デオキシリボースタイプでも、あ
るいは糖模倣体（sugar mimic）（例えば炭素環）でも
よい。本発明の１つの好ましい実施態様によれば、オリ
ゴヌクレオチド類似体又はオリゴヌクレオシドは、tat
蛋白質をコードするHIV mRNA、またはHIV mRNAのTAR領
域に対してハイブリダイズする。他の好ましい実施態様
においては、オリゴヌクレオチド類似体またはオリゴヌ
クレオシドは、HIV mRNAのTAR領域の二次構造を模倣し
て、tat蛋白質に結合することができる。他の好ましい
アンチセンスオリゴヌクレオチド類似体またはオリゴヌ
クレオシド配列は、ヘルペスウイルス、乳頭種ウイルス
および他のウイルスに対する相補的配列を含む。
本発明の修飾された結合は、天然に存在するホスホジ
エステル−５′−メチレン結合を置き換えるために四原
子結合基を使用することが好ましい。天然に存在する結
合を本発明の四原子結合体（four atom linker）で置き
換えると、こうして得られたオリゴヌクレオチド類似体
には、耐ヌクレアーゼ性および細胞内取り込みの増大が
与えられる。結合した糖の１つの３′−デオキシ機能を
四原子結合体内に含ませるのが好ましい。この四原子結
合体は−L1−L2−L3−L4−という構造を有し、ここでL1
およびL4はメチレン炭素原子または置換炭素原子であ
り、L2およびL3はメチレン炭素原子、置換炭素原子、酸
素原子、窒素原子、置換置換原子、置換リン原子、イオ
ウ原子、置換イオウ原子、また置換ケイ素原子である。
修飾結合は、実質的にそれぞれの結合場所において施さ
れるのが好ましい。あるいはまた、修飾結合は、すべて
の結合場所より少ない形で（例えば、交互の結合場所に
おいて）施してもよい。結合は、中性であっても、ある
いは正もしくは負に帯電していてもよい。
本発明はさらに、このようなオリゴヌクレオシドを合
成する方法に関する。本発明は、二原子フラグメントま
たは置換二原子フラグメントの付加による、３′−デオ
キシ−３′−置換（特にメチル置換）ヌクレオシドと
５′−デオキシ−５′−置換ヌクレオシドとのカップリ
ングを提供する。この付加反応は、種々の適切な求電子
性化合物に対して個々のヌクレオシドの３′位置および
５′位置を活性化させること、次いで適切な結合基を加
えて求電子剤と反応させることを含む逐次手順により行
われる。あるいはまた、この手順は並行操作的に行うこ
ともできる。このような方法では、支持体を手操作する
ことまたは他の方法により、DNA合成器を介して固体支
持体を使用することができる。
本発明はさらに、生物による蛋白質の生成を調節する
方法に関する。この方法は、これまでに説明したきた開
示内容にしたがって配合した組成物と該生物とを接触さ
せることを含む。調節されるべきRNA部分またはDNA部分
は、その形成または活性が調節されるべき蛋白質をコー
ドするDNAもしくはRNA部分を含むようあらかじめ選定す
るのが好ましい。したがって、使用される組成物の標的
部分は、DNAもしくはRNAのあらかじめ選定された部分に
対して相補的であるよう（すなわち、当該部分に対して
アンチセンスのオリゴヌクレオチドであるよう）選定さ
れる。
本発明はさらに、蛋白質の望ましくない生成を特徴と
する疾患を有する生物を治療する方法に関する。この方
法は、これまでに説明してきた開示内容にしたがう組成
物と該生物とを接触させることを含む。本組成物は、そ
の生成または活性が調節されるべき蛋白質をコードする
メッセンジャーRNAと特異的に結合するよう設計された
ものであるのが好ましい。本発明はさらに、生物または
細胞中における異常なRNA分子の有無、あるいは正常なR
NA分子の異常なもしくは不適切な発現を検出するための
診断法に関する。
本発明はさらに、学術研究用および診断用としてRNA
を選択的に結合するための方法に関する。こうした選択
的かつ強力な結合は、分解を引き起こすヌクレアーゼに
対して抵抗性があり、そして公知のオリゴヌクレオチド
またはオリゴヌクレオチド類似体より強力かつ正確にハ
イブリッド形成する本発明の組成物と、このようなRNA
またはDNAと相互作用させることによって達成される。
図面の簡単な説明 図１は本発明のある特定の実施態様にしたがった概略
の合成スキームであり； 図２は本発明の他の実施態様にしたがった概略の合成
スキームである。
好ましい実施態様の詳細な説明 従来使用されているアンチセンスオリゴヌクレオチド
の生物学的活性は、一般には、実際上の治療研究や診断
での使用に対して充分であるとは言えない。本発明は、
修飾されたオリゴヌクレオチド（すなわち、オリゴヌク
レオチド類似体やオリゴヌクレオシド）およびこのよう
な修飾を達成するための方法に関する。これらの修飾オ
リゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド類似体は、
天然に存在する対応物質に比べて高い安定性を示す。細
胞外ヌクレアーゼおよび細胞内ヌクレアーゼは一般に、
本発明の主鎖修飾オリゴヌクレオチド類似体やオリゴヌ
クレオシドを認識せず、したがってこれらには結合しな
い。感受性のリン−酸素結合の欠如のため、ヌクレアー
ゼによる主鎖へのいかなる結合も、ヌクレオシド結合の
開裂を起こすことはない。さらに、こうして得られる本
発明の新規な中性または正に帯電した主鎖は、蛋白質仲
介による複雑なプロセスを必要とするよりむしろ、単純
な受動輸送によって細胞中に取り込まれることができ
る。本発明の他の利点は、負に帯電した主鎖がないこと
により、標的RNA（負に帯電した主鎖を有し、したがっ
て入ってくる同帯電のオリゴヌクレオチドに反発する）
に対するオリゴヌクレオチド類似体またはオリゴヌクレ
オシドの配列特異的な結合が容易になる、という点であ
る。本発明のさらに他の利点は、標的RNAの触媒作用開
裂を開始させることのできる官能基を結び付けるための
部位がこれらの構造タイプ中に見いだされる、という欠
点である。
好ましい実施態様によれば、本発明は、糖間リン酸基
を置き換えて、下記構造にみられるような結合を有する
オリゴヌクレオチドを生成させることに関する。
上記構造において、 Bxは可変の塩基部分であり； ＱはO,CH2,CHF,またはCF2であり； ＸはH,OH,C1〜C10低級アルキル，置換低級アルキル，
アルカリール，アラルキル,F,Cl,Br,CN,CF3，OCF3,OCN,
O−アルキル,S−アルキル,NH−アルキル,O−アルケニ
ル,S−アニケニル,NH−アルケニル，SOCH3，SO2CH3，ON
O2，NO2，N3，NH2，ヘテロシクロアルキル，ヘテロシク
ロアルカリール，アミノアルキルアミノ，ポリアルキル
アミノ，置換シリル,RNA開裂基，オリゴヌクレオチドの
薬物動態学的特性を改良するための基，またはオリゴヌ
クレオチドの薬力学的特性を改良するための基であり； L1およびL4は、互いに独立的にCR1R2,C＝O,C＝S,CH−
NH2,CH−NHR3,CH−OH,CH−SH,CH−Ｏ−R1，またはCH−
Ｓ−R1であり； L2およびL3は、互いに独立的にCR1R2,C＝CR1R2,C＝NR3,
P（Ｏ）R4,P（Ｓ）R4,C＝O,C＝S,O,S,SO,SO2，NR3，ま
たはSiR5R6であるか、あるいは一緒になってアルケン，
アルキン，芳香環，炭素環，または複素環を形成し； L1，L2，L3，およびL4は、一緒になって−CH＝Ｎ−NH
−CH2−部分，または−CH2−Ｏ−Ｎ＝CH−部分を構成
し； R1およびR2は、互いに独立的にH,OH,SH,NH2，C1〜C10
アルキル，置換アルキル，アルケニル，アルカリール，
アラルキル，アルコキシ，チオアルコキシ，アルキルア
ミノ，アラルキルアミノ，置換アルキルアミノ，ヘテロ
シクロアルキル，ヘテロシクロアルキルアミノ，アミノ
アルキルアミノ，ポリアルキルアミノ，ハロ，ホルミ
ル，ケト，ベンゾキシ，カルボキサミド，チオカルボキ
サミド，エステル，チオエステル，カルボキサミジン，
カルバミル，ウレイド，グアニジノ,RNA開裂基，オリゴ
ヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良するための基，
またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良するた
めの基であり； R3は,H,OH,NH2，低級アルキル，置換低級アルキル，
アルコキシ，低級アルケニル，アラルキル，アルキルア
ミノ，アラルキルアミノ，置換アルキルアミノ，ヘテロ
シクロアルキル，ヘテロシクロアルキルアミノ，アミノ
アルキルアミノ，ポリアルキルアミノ,RNA開裂基，オリ
ゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良するための
基，またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良す
るための基であり； R4は、OH,SH,NH2,O−アルキル,S−アルキル,NH−アル
キル,O−アルキル複素環,S−アルキル複素環,NH−アル
キル複素環，または窒素含有複素環であり；そして R5およびR6は，互いに独立的にC1〜C6アルキルまたは
C1〜C6アルコキシである； ただし、L1がＣ＝ＯまたはＣ＝Ｓであるときは、L2は
NR3ではなく；L4がＣ＝ＯまたはＣ＝Ｓであるときは、L
3はNR3ではなく；L2またはL3の一方がＣ＝ＯまたはＣ＝
Ｓであるときは、L2またはL3の他方はNR3ではなく；L2
がＰ（Ｏ）R4であり，R4がOHであり,XがOHであり，か
つ、Bxがウラシルまたはアデニンであるときは，L3はＯ
ではなく；またL1，L2，およびL4がCH2であり,XがＨま
たはOHであり，かつ、ＱがＯであるときは，L3はS,SO,
またはSO2ではない。
本発明の好ましい実施態様によれば、L1およびL4はメ
チレン基である。このような好ましい実施態様において
は、L2とL3の一方がアミノ基を含んでもよく、また他方
がアミノ基または酸素を含んでもよい。したがって特定
の好ましい実施態様においては、L2とL3は一緒になって
ヒドラジノ、アミノヒドロキシ、またはヒドロキシアミ
ノである。他の好ましい実施態様では、L1またはL4の一
方が、L2またはL3の一方と一緒になってCH＝Ｎ基とな
り、そしてL2またはL3の他方が酸素原子または窒素原子
であり、したがってリンカーはオキシム基とヒドラゾン
基を含む。このようなオキシム結合基またはヒドラゾン
結合基は、上述のアミノヒドロキシ基またはヒドラジン
基に還元することができる。
本発明の他の好ましい実施態様においては、L2および
L3は置換炭素、アミノ、置換アミン、酸素、イオウ、イ
オウ酸化物、リン酸化物、またはケイ素酸化物である。
炭素上の置換基としては、水素、ヒドロキシ、チオ、ア
ミノ、低級アルキル、置換低級アルキル、アルコキシ、
チオアルコキシ、低級アルケニル、アラルキル、アルキ
ルアミノ、アラルキルアミノ、置換アルキルアミノ、ヘ
テロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキルアミノ、ア
ミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、ハロゲン、
ホルミル、ケト、ベンゾキシ、エステル、チオエステ
ル、カルボキサミジン、グアニジノ、RNA開裂基，オリ
ゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改良するための
基，またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改良す
るための基などがある。さらに他の好ましい実施態様で
は、L2とL3が一緒になってＣ＝Ｃを形成している。さら
に他の好ましい実施態様では、L2とL3が一緒になって、
炭素環、芳香環、複素芳香環または複素環を含む環構造
の、Ｃ−C,C＝C,C−N,またはＮ−Ｃ二原子対を形成して
いる。本発明のさらに他の好ましい実施態様では、L1お
よびL4は、互いに独立にカルボキシ、チオカルボキシ、
メチルアミノ、メチルヒドロキシ、メチルチオ、エーテ
ル、またはチオエーテルである。
本発明はまた、修飾された糖間結合をもつオリゴヌク
レオシドの製造方法をも目的としている。これらの修飾
は、固体支持体を用いて、手で操作することができるか
または、DNA合成装置技術に習熟した人々には一般的に
公知の方法論を用いてDNA合成装置を用いて実施するこ
とができる。一般に、この手順には、選択された配列中
でお互いに隣接するであろう２つのヌクレオシドの糖部
分を官能化することが含まれる。５′から３′へという
意味において、“上流”ヌクレオシドは、一般に３′糖
部位で修飾され、本明細書中でこの後“シンソン（synt
hon）1"と呼ばれる。本発明の一方法では、アデニン、
グアニン、シトシン、ウラシル、チミンのリボーおよび
２′−デオキシ−リボヌクレオシドおよびこれらの類似
体を修飾してその３′−デオキシ−３−ヒドロキシメチ
ル類似体とする。次にこれらの３′−ヒドロキシメチル
基を種々の型の求電子中心に変換する。これは下記の好
ましい反応工程のような種々の方法で達成することがで
きる。
出発物質の一つである３′−デオキシ−３′−ヒドロ
キシメチルリボヌクレオシドは、タウンセンド（Townse
nd）外，テトラヘドロン・レターズ（Tetrahedron Lett
ers）,31:3101−3104（1990），サマノ・ブイ（Samano,
V.）およびエム・ジェイ・モリス（M.J.Morris），ジャ
ーナル・オブ・オーガニック・ケミストリィ（Journal
of Organic Chemistry）,55:5186−5188（1990）および
バーグストロム、ディー・イー（Bergstrom,D.E.），ヌ
クレオサイズ・アンド・ヌクレオタイズ（Nucleosides
and Nucleotides）８（８）:1529−1535（1989）によっ
て開示されたようにして製造することができる。これら
のヌクレオシドの適当な公知の選択的糖ヒドロキシル保
護とそれに続く標準的な２′−脱酸素化手順により、
２′,3′−ジデオキシ−３′−ヒドロキシメチル−リボ
ヌクレオシドが得られるであろう。この型のヌクレオシ
ドは選択的に保護して、３′−ヒドロキシメチル成分を
官能化して種々の適当な求電子部分にすることができ
る。本発明の好ましい具体化に従えば、このような求電
子部分にはハロメチル、トリフルオロメチル、スルホニ
ルメチル、ｐ−メチルベンゼンスルホニルメチル、ヒド
ラジノメチルまたは３′−Ｃ−ホルミルがある。
“下流”ヌクレオシドは一般に５′糖部位で修飾さ
れ、本明細書中でこの後“シンソン（synthon）2"と呼
ばれる。種々の型の求電子中心に変換されたそれらの
５′−ヒドロキシメチレン基をもつ、アデニン、グアニ
ン、シトシン、ウラシル、チミンのリボおよび２′−デ
オキシリボヌクレオシドおよびこれらの類似体を生成す
るための修飾は、商業的に入手できるヌクレオシドを用
いて種々の手順によって達成することができる。例え
ば、５′−デオキシ−５′−ハロヌクレオシド、５′−
デオキシ−５′−トシルヌクレオシド、および５′−ア
ルデヒド性ヌクレオシドは、ジョーンズ，ジー・エイチ
（Jones,G.H.）およびジェイ・ジー・モファット（J.G.
Hoffatt）によりジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・
ソサエティ（Journal of the American Chemical Socie
ty）90:5337−5388（1968）において製造された。
一般に、シンソン１は、製造： より成るものとして表わすことができ、一方シンソン２
は一般に構造： （式中Bx可変の塩基成分であり;QはO,CH2,CHFまたはCF2
であり；そしてE1およびE2は同一または異なり、求電子
反応基である） より成る。
２つのシンソンは、求電子反応基と反応性の結合基に
よるかまたは別の方法で結合される。シンソン１とシン
ソン２との間の結合は段階的に、あるいは一致して起こ
ることができ、本発明の修飾された結合により結合した
ジヌクレオシドを生ずることができるかまたはヌクレオ
シドの鎖を生ずることができ、これらは各々上記の修飾
された結合によって次のものに結合させることができ
る。
一致した作用による結合は、アンモニアまたはアンモ
ニア誘導体の存在におけるようなシンソン１およびシン
ソン２の求電子中心の間で起こって、ジヌクレオシドを
生成することができる。本発明の好ましい具体化は、ヒ
ドラジンの付加により公知のブロモメチル型シンソンを
結合させて、−CH2NHNHCH2に等しい−L1−L2−L3−L4−
を有する好ましい結合を生成させるものである。本発明
のもう一つの好ましい具体化はヒドロキシルアミンの付
加によりブロモメチル型シンソンを結合させて、−CH2N
HOCH2−または−CH2ONHCH2−に等しい−L1−L2−L3−L4
−を有する結合を生成させるものである。
糖間結合を修飾して本明細書中に記載されているジヌ
クレオシド構造を与えることができるもう一つの方法
は、ウィッティヒ反応によるものである。好ましくは、
このような反応の出発物質は、タウンセンド（Townsen
d）外［テトラヘドロン・レターズ（Tetrdhearon Lette
rs）31:3101−3104（1990）］；サマノ・ヴィ（Samano,
V.）およびエム・ジェイ・モリス（M.J.Morris）［ジャ
ーナル・オブ・オーガニック・ケミストリィ（Journal
of Organic Chemistry）55:5186−5188（1990）；およ
びバーグストロム・ディー・イー（Bergstrom,D.E.）外
［ヌクレオサイズ・アンド・ヌクオレタイズ（Nucleosi
des and Nucleotides）８（８）:1529−1535（1989）］
により開示されたような３′−ケトヌクレオシド；また
は、ジョーンズ・ジー・エイチ（Jones,G.H）およびジ
ェイ・ジー・モファット（J.G.Moffatt）［ジャーナル
・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（Jour
nal of the Americaan Chemical Society）90:5337−53
38（1968）］によって開示されたような５′−アルデヒ
ド性ヌクレオシドである。出発物質は好ましくは、ベン
ジルまたはその他の保護基を有するリンイリドと反応さ
せる。本発明に有用な一つの好ましいイリドはトリフェ
ニルホスホラン−ベンジルオキシメチリジンである。本
発明用に好ましく使用されるもう一つのイリドは、トリ
フェニルホスホラン−ベンジルオキシエチリジンであ
る。ビニル基の還元およびベンジル保護基の水添分解
は、グアニン、アデニン、シトシン、チミン、ウラシル
の所望のヌクレオシドまたはこれらのヌクレオシドの類
似体の５′または３′位に各々ヒドロキシメチルおよび
ヒドロキシエチル部分を与える。さらにウィッティヒ反
応を使用して炭素環ヌクレオシドの５′および３′ヒド
ロキシアルキル部分を得ることができる。
求電子中心を与えるためのヒドロキシル基の変換およ
びそれに続く３′求電子中心の５′求核中心との結合に
より、本発明のジヌクレオシドが得られるであろう。本
発明の一具体化においては、ヒドロキシル基を変換して
ブロマイド、トリフレート、およびトシレートのような
求電子中心を与える。結合により、１または２個のヘテ
ロ原子を有する炭素鎖によって連結させられたジヌクレ
オシドが得られる。好ましくはこのようなヘテロ原子
は、先に示した一般式に示されるようにO,NH,NR3,S,SO,
SO2,P（Ｏ）R4,P（Ｓ）R4またはSiR5R6である。
３′または５′カルボニルヌクレオシドおよびトリフ
ェニルホスホリンメチリジンジフェニルホスホネートを
包含するウィッティヒ反応から誘導することができると
思われるその他の有用なジヌクレオシドは、ホスホネー
トジヌクレオシドである。この反応は、相当する５′−
または３′ヒドロキシ基と縮合して３′−または５′−
ホスホネート結合したオリゴヌクレオシドを与えること
ができるホスホン酸メチルまたはエチルを与える。この
型の化学はモファット，ジェイ・ジー（Moffatt J.G.）
外，ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエ
ティ（Journal of American Chemical Society）92:551
0−5513（1970）およびマズール，エイ（Mazur,A.），
ビー・イー・トロップ（B.E.Tropp），およびアール・
エンゲン（R.Enrel）、テトラヘドロン（Tetrahedron）
40:3949−3956（1984）の生化学的方法の研究のための
ジヌクレオシドのホスホネートの製法中に開示された。
このタイプの結合を使用して、対称なビス（メチルトリ
フェニルホスファン）フェニルホスフェートを用いて
３′−ケトヌクレオシドを５′−ヌクレオシドに結合さ
せて、３′,5′−ジメチルホスホネート結合したオリゴ
ヌクレオチドとすることによって、好ましい具体化が製
造される。
ウィッティヒ反応に加えて、３′−ヒドロキシメチル
ヌクレオシドはまた、アルファ炭素環ヌクレオシドの転
化によって製造することもできる。これにより“下”ま
たはアルファ面上に所望の３′ヒドロキシメチル基が得
られるであろう。この基は、保護することができる。
３″−ヒドロキシル基（糖３′位に結合した環外メチル
を３″メチルと認定する）は、ヒドロキシメチル基また
はより長いアルキル基に変換することができる。３″基
を変換する一方法には、ケト基への酸化とそれに続くト
リフェニルホスホリンメチリジンジフェニルホスホネー
トを用いるウィッティヒ反応および還元が包含される。
より長いヒドロキシアルキル基は、こうして３″−位に
配置することができる。この具体化はまた、４′−デス
メチル−３′−ヒドロキシメチルヌクレオシドシンソン
をも与える。２原子結合剤を用いるこの４′−デスメチ
ルヌクレオシドおよび普通の３′−ヒドロキシ−ヌクレ
オシドの間の結合により、先に出願中の1990年８月13日
出願の出願No.566,836（この出願は、本出願の譲受人に
譲渡されている）中に開示されたようなジヌクレオシド
シンソンが得られるであろう。４′−デスメチルヒドロ
キシル基を適当な上記の３′−シンソンと結合させる
と、数多くの他の型の新規ジヌクレオシドシンソンが得
られるであろう。
さらにもう一つの３′−デオキシ−３′−メチルヌク
レオシドのメチル基を官能化するための方法は、３′−
デオキシ−３′−シアノヌクレオシドから作り出すこと
ができる。、パークス・ケイ・イー・ビー（Parkes,K.
E.B.）、およびケイ・ティラー（K.Taylor），テトラヘ
ドロン・レターズ（Tetrahedron Letters）29:2995−29
96（1988）には、３′−シアノヌクレオシド類の一般的
な合成法が記載されている。この方法では、５′−トリ
チル保護された２′−デオキシヌクレオシドをヨウ化メ
チルトリフェニルホスホニウムで３′−ヨウ素化する。
次にこの物質をヘキサメチル二スズ、ｔ−ブチル−イソ
ニトリル、および2,2′−アゾ−ビスイソブチロニトリ
ル（AIBN）で処理して、３′−位にシアノ基のラジカル
付加を起こさせる。シアノ基のアルデヒドの変換は、高
収率で達成される。続いて、この中間体をヒドロキシメ
チル官能基に変換するが、これは求電子シンソン１への
有用な前駆体である。
糖間結合を修飾してジヌクレオシドを与えることがで
きる別の方法は、シンソン１としての３′−Ｃ−ホルミ
ル誘導されたヌクレオシドおよびシンソン２としての
５′−アミノヒドロキシ誘導されたヌクレオシドを使用
する。シンソン１および２を直接結合させると、オキシ
ム結合によって結合したジヌクレオシドが得られる。こ
の場合には、オキシムはE/Z異性体として存在する。こ
れらの異性体化合物は、HPLCを用いて分離される。さら
にこの場合に、オキシム窒素原子は、上流ヌクレオシド
の３′−末端の炭素原子に隣接している。５′または下
流ヌクレオシドの炭素原子に隣接するオキシム窒素を有
するジヌクレオシドは、シンソン２としての炭素原子に
隣接するオキシム窒素を有するジヌクレオシドは、シン
ソン２としての５′−Ｃ−ホルミル誘導ヌクレオシドお
よびシンソン１としての３′−デオキシ−３′−アミノ
ヒドロキシメチル誘導ヌクレオシドを使用して合成され
る。この場合には、オキシムE/Z異性体も得られる。両
方の場合に、オキシム結合した二量体は、オリゴマーへ
の直接組み入れに有用であるかまたは、次に還元して相
当するヒドロキシアミノ結合ジヌクレオシドとすること
ができる。オリゴマー中のジヌクレオシドとしてのまた
はジヌクレオシド部分としてのオキシム結合ジヌクレオ
シドの、水素化シアノホウ素ナトリウム（sodium cyano
borohydride）を用いる還元により、相当するアミノヒ
ドロキシル結合化合物が得られる。ヒドロキシアミノ結
合ジヌクレオシドまたは大オリゴマーは、アミノヒドロ
キシル結合のアミノ部分でアルキル化して、相当するＮ
−アルキルアミノ結合を得ることができるであろう。
３′−Ｃ−ホルミル誘導されたシンソン１は、いくつ
かの合成法によって形成することができる。現行の好ま
しい方法では、相当する３′−デオキシ−３′−ヨード
ヌクレオシドのラジカルカルボニル化を使用する。この
ヨード化合物をCO,AIBN,すなわち2,2′−アゾビスイソ
ブトリロニトリル、およびTTMS,すなわちトリス（トリ
メチルシリル）シランで処理する。別法として、このも
のは３′−デオキシ−３′−シアノ糖またはヌクレオシ
ドから合成することができる。５′−Ｃ−ホルミル（ま
たは５′−アルデヒドとしても認定される）および３′
−Ｃ−ホルミル基の両方を、ブロック基としてｏ−メチ
ルアミノベンゼンチオールを使用して容易にブロックす
ることができる。この５′および３′−Ｃ−ホルミル基
の両者は、硝酸銀酸化により脱ブロックすることができ
る。
３′−Ｃ−ホルミルヌクレオシド合成の別法において
は、その製造のために１−Ｏ−メチル−３′−デオキシ
−３′−Ｏ−メチルアミノベンゼンチオール−５′−Ｏ
−トリチル−β−Ｄ−エリトロ−ペントフラノシドを使
用することができる。このとき、この化合物はすべての
３′−デオキシ−３′−Ｃ−ホルミルヌクレオシドのた
めの前駆体としてはたらく。この１−Ｏ−メチル−３′
−デオキシ−３′−Ｏ−メチルアミノベンゼンチオール
−５′−Ｏ−トリチル−β−Ｄ−エリトロ−ペントフラ
ノシドを標準的なグリコシル化条件を用いて適当な塩基
と反応させ、続いて脱ブロックしてヌクレオシドを得
る。さらにもう一つの別法においても、３′−デオキシ
−３′−シアノヌクレオシドは相当する３′−デオキシ
−３′−ヨードヌクレオシドからか、または１−Ｏ−メ
チル−３′−デオキシ−３′−Ｏ−シアノ−５′−Ｏ−
トリチル−β−Ｄ−エリトロ−ペントフラノシドとのグ
リコシル化反応によって製造される。
３″−Ｏ−アミノ−３″−ヒドロキシメチルヌクレオ
シドおよび相当する５′−Ｏ−アミノヌクレオシドは、
好都合には、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、トリフェニ
ルホスフィンおよびジイソプロピルアゾジカルボキシレ
ートを用いるミツノブ（Mitsunobu）条件により、保護
されたフタルイミド中間体を経て製造することができ
る。この中間体は、ヌクレオシドの未保護ヒドロキシル
基のミツノブ反応によって製造される。３″−Ｏ−アミ
ノ−３″−ヒドロキシメチルヌクレオシドを形成する際
には、トリチルは、ヌクレオシドの５′−ヒドロキシル
基のためのブロック基としてはたらく。プリンおよびピ
リミジンヌクレオシドの両方について、Ｎ−ヒドロキシ
フタルイミドと反応させる前に３′−ヒドロキシ基をTB
DPSで保護する。ピリミジン塩基については５′−Ｏ−
アミノヌクレオシドを形成する際に、５′位へのフタル
イミドの導入後に、３′−ヒドロキシルをTBDPSブロッ
ク基で保護することができる。
糖間結合を修飾してホスホネート結合したジヌクレオ
チドを与えるための別の方法は、３′−Ｃ−ホスホネー
ト二量体の形成のためのマズール（Mazur）外，テトラ
ヘドロン（Tetrahedron）,20:3949（1984）のミカエリ
ス−アルブゾフ（Michaelis−Arbuzov）法を使用する。
この方法は、シンソン１として３′−ヒドロキシメチル
ヌクレオシドを使用するであろう。これをＮ−ブロモス
クシンイミドで処理して相当する３″−ブロモメチル誘
導体を得る。シンソン２は５′−ホスファイトとして選
択される。シンソン１および２の結合により、３′−Ｃ
−ホスホネート結合により結合したジヌクレオシドが得
られる。相当する５′−Ｃ−ホスホネート二量体は、最
初に適当なブロックされたホスァィポトをシンソン１と
反応させ、次に脱ブロックして３′−CH2−ホスファイ
ト中間体を得ることによって得ることができる。シンソ
ン２は、５′−ブロモヌクレオシドとして選択される。
次に３′−CH2−ホスファイト中間体をシンソン２と反
応させて５′−Ｃ−ホスフェート二量体を得る。シンソ
ン１への結合後にブロックされた亜リン酸エステルとし
て亜リン酸トリベンジルを選択することにより、ベンジ
ル基を水添分解により除去することができる。別法とし
て５′−デオキシ−５′−ブロモヌクレオシドを亜リン
酸エステルと反応させて５′−ホスホネートとする。こ
のものを次に、３′−ヒドロキシメチルヌクレオシドと
反応させて、５′−Ｃ−ホスホネート結合した二量体を
得る。
ヒドラジン、ヒドロキシルアミンおよび本発明のその
他の結合基によって結合した上記の方法のいずれかから
得られるジヌクレオシドは、５′−ヒドロキシルでジメ
トキシトリチル基によって保護され、３′−ヒドロキシ
ルでシアノエチルジイソプロピルホスファイト部分と結
合させるために活性化されることができる。これらの二
量体は、ホスホアミダイト結合化学を用いる標準的な固
相自動DNA合成によって、あらむる所望の配列内に挿入
されることができる。このため、保護されたジヌクレオ
シドは、通常のホスホジエステル結合を用いて特定のDN
A配列の単位と結合される。得られるオリゴヌクレオチ
ド類似体またはオリゴマーは、混合主鎖（一部分は普通
のホスホジエステル結合であり、一部分は本発明の新規
四原子結合）を有している。このようにして、７つのヒ
ドロキシルアミン、ヒドラジンまたはその他の型の結合
を有するジヌクレオシドを含むような15量体の配列特異
的オリゴヌクレオチドを容易に合成することができる。
このような構造は、天然のホスホジエステル結合したオ
リゴヌクレオチドに比べて増大した水溶性を与えるであ
ろう。
均一な主鎖結合を含むオリゴヌクレオチドは、CPG−
固体支持体および標準的な核酸合成装置、すなわちアプ
ライド・バイオシステムズ社（Applied Biosystems In
e.）380Bおよび394およびミリゲン／バイオサーチ（Mil
ligen/Biosearch）7500および8800,の使用によって合成
することができる。最初のヌクレオシド（３′−末端の
１番）を制御された細孔ガラス（controlled pore glas
s）のような固体支持体にとりつけ、各々の新規なヌク
レオシドを、配列特異性順序に手操作または自動合成装
置システムによって結合させる。メチレンヒドラジン結
合の場合には、反復ヌクレオシド単位は２つの一般的な
型のもの、例えば、５′−保護されたアルデヒド官能基
および３′−デオキシ−３′−Ｃ−ヒドラジノメチル基
をもつヌクレオシド、または酸不安定性基によって保護
された５′−デオキシ−５′−ヒドラジノ基および３′
−デオキシ−３′−Ｃ−ホルミル基を有するヌクレオシ
ドであることができる。各々の場合に、次に続く配列が
必要とする塩基を加えるために各サイクルについてくり
返される条件には次のものがある:5′−アルデヒド保護
基を除去するための酸洗浄；各々のヒドラゾン連結を形
成するための３′−メチレンヒドラジノ基をもつ次のヌ
クレオシドの付加；および所望のメチレンヒドラジン結
合したCPG−結合オリゴヌクレオシドを得るための種々
の薬剤のいずれかを用いる還元。このような有用な還元
剤の一つは、水素化シアノホウ素ナトリウムである。
好ましい方法は図１に示されている。この方法には、
保護された５′部位をもつシンソン２が結合している固
体支持体を用いる。好ましくは、上記のシンソンの５′
部位はDMTで保護することができる。その後、シンソン
２の５′部位を緩酸で遊離させ、洗浄し、そして酸化し
て中間体生成物を生成する。一つの好ましい方法では、
アルデヒド誘導体をN,N−ジフェニルエチレンジアミン
と反応させて、中間体生成物５′−ジフェニルイミダゾ
リジノ保護されたシンソン２を生成する。より好ましい
方法では、５′−ジフェニルイミダゾリジノ保護された
シンソン２を直接支持体上に載せる。どちらの方法につ
いても、中間生成物は次に脱ブロックされて、求核性の
５′位をもつシンソン２を与える。次に５′−ジフェニ
ルイミダゾリジノ保護された３′−デオキシ−３′−Ｃ
−ヒドラジン塩基のような保護された５′−アルデヒド
基をもつシンソン１を添加して、水素化シアノホウ素ナ
トリウムの添加等によって、結合したシンソン２と反応
させることができる。洗浄した後で、ヒドラジノ部分に
より結合したジヌクレオシドが形成される。その後で、
このサイクルを所望に応じて、シンソン１の化学種の付
加とそれに続く酸／塩基脱保護によりくり返して、修飾
された糖間結合により結合したポリシンソン（結果とし
て得られる所望の配列のオリゴマー）を生成することが
できる。本発明のいくつかの好ましい具体化において
は、シンソン１の化学種は５′−DMT保護された３′−
Ｃ−ヒドラジン塩基であることができる。
この段階法の一つの好ましい具体化では、固体支持体
への結合中、シンソン２の求電子中心を保護するために
ジフェニルエチルジアミン付加物（1,3−ジ置換イミダ
ゾリジノ）を使用する［モファット・ジェイ・ジー（Mo
ffatt,J.G.）外，ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミ
カル・ソサエティ（Journsl of American Chemical Soc
iety）90:5337−5338（1968）］。シンソン２は好まし
くは、制御された細孔ガラス支持体または当技術分野に
習熟した人々には公知のその他の適当な支持体のような
固体支持体に結合させることができる。結合は標準法に
よって行うことができる［ガイド・エム・ジェイ（Gai
t,M.J.）著、オリゴヌクレオタイド・シンセシス，ア・
プラクティカル・アプローチ（Oligonucleotide Synthe
sis,A Practical Approach），アイ・アール・エル・プ
レス（IRL Press）1984］。別法として、製造は、保護
された結合ヌクレオシドを種々の標準的な酸化法で直接
酸化することによって行うことができる。結合シンソン
２は、好ましくは、ヒドラジンと反応させて、シッフ
（Schiff's）塩基を生成させ、これを続いて還元するこ
とができる。ヒドロキシルアミンもまたこの方法に有用
な好ましい反応体である。
均一な主鎖結合オリゴヌクレオシドを合成する別の方
法が図２に示されている。この方法もまた、保護された
５′部位をもつシンソン２が結合されている固体支持体
を使用する。この場合には、シンソンの５′部位はフタ
ルイミド基で保護される。その後、シンソン２の５′部
位をDCM中のメチルヒドラジンで遊離させて、DCM:メタ
ノールで洗浄する。シンソン１の５′位のアミノヒドロ
キシル基もまた、フタルイミド基で保護される。このよ
うなシンソン１は５′−フタルイミド保護された３′−
デオキシ−３′−Ｃ−ホルミルヌクレオシドである。シ
ンソン１をシンソン２を反応させ、続いて５′位を脱保
護し、洗浄して次の５′−アミノヒドロキシ反応部位を
遊離させる。このサイクルを、シンソン１の別の付加に
ついて所望の配列が構成されるまで十分な回数くり返
す。この配列の各ヌクレオシドをオキシム結合で結合さ
せる。所望のオリゴヌクレオシドの末端ヌクレオシド
を、５′−DMTブロックされた３′−デオキシ−３′−
Ｃ−ホルミルヌクレオシドとして配列に加える。オキシ
ム結合したオリゴヌクレオシドは、支持体から除去する
ことができる。もしアミノヒドロキシル結合したオリゴ
ヌクレオシドが望ましいならば、オキシム結合を水素化
シアノホウ素ナトリウムで還元する。別法として、オキ
シム結合したオリゴヌクレオシドがまだ支持体に結合し
ている間に還元を行なうことができる。
また、本発明に従えば、構造： （式中、Bxは、可変の塩基成分であり;QはO,CH2,CHFま
たはCF2であり;XはH;OH;C1〜C10低級アルキル，置換低
級アルキル，アルカリールまたはアラルキル;F;Cl;Br;C
N;CF3；OCF3;OCN;O−アルキル,S−アルキル，またはNH
−アルキル;O−アルケニル,S−アルケニル、またはNH−
アルケニル；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；ヘ
テロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミ
ノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル;R
NA開裂基；オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改
良するための基；またはオリゴヌクレオチドの薬力学特
性を改良するための基；である） を有するヌクレオシドが提供される。
このような種では、Ｙはヒドロキシル、アミノメチ
ル、ヒドラジノメチル、ヒドロキシメチル、Ｃ−ホルミ
ル、フタルイミドヒドロキシメチル、アリール置換イミ
ダゾリジノ、アミノヒドロキシメチル、メチルアミノベ
ンゼンチオ、メチルホスホネートおよびメチルアルキル
ホスホネートであり；そしてＺはH,ヒドロキシル、アミ
ノメチル、ヒドラジノメチル、ヒドロキシルメチル、Ｃ
−ホルミル、フタルイミドヒドロキシメチル、アリール
置換イミダゾリジノ、アミノヒドロキシメチル、オルト
−メチルアミノベンゼンチオ、メチルホスホネートまた
はメチルアルキルホスホネート；である。
上述の基はすべて、ＱがＯであり、Ｙがヒドロキシメ
チルであり、かつ、ＸがＨまたはOHであるときは、Ｚは
ＨまたはＣ−ホルミルではなく；またＱがＯであり、Ｘ
がＨまたはOHであり、かつ、Ｚがヒドロキシルであると
きは、Ｙはアミノヒドロキシメチル、ヒドラジノメチル
またはアリール置換イミダゾリジノではないという条件
付きである。
本発明のオリゴヌクレオチド類似体は、診断、治療
に、そして研究試薬およびキットとして使用することが
できる。治療用には、このオリゴヌクレオチド類似体
を、何らかの蛋白質によって調節される疾患を有する動
物に投与される。このような疾患を有すると思われる患
者に、その病気の症状を弱めるために有効である量のオ
リゴヌクレオチド類似体を投与するのが好ましい。当技
術分野に習熟した人は、このような治療養生のための最
適用量および治療スケジュールを決定することができ
る。
本発明に従う治療薬を経口、静脈内、または筋肉内の
ように内部に投与するのが一般に好ましい。経皮、局
所、または病変内のようなその他の投与形も有用であ
る。坐薬内の封入も有用である。薬理学的に受容できる
キャリヤーの使用も、いくつかの具体化のためには有用
である。
実施例 下記の実施例は、本発明を具体的に説明するものであ
るが、制限するものではない。これらの実施例において
は、二量体およびその他のより高級なオリゴヌクレオシ
ドのNMRのために、二量体およびその他の高級オリゴヌ
クレオシドの単量体単位に番号をつける。すなわち、
５′末端ヌクレオシドから３′末端ヌクレオシドに向か
って、T1，T2−したがってＴ−Ｔ二量体の５′ヌクレオ
シドはT1であり、３′ヌクレオシドはT2である。
実施例１ メチレンヒドラジン、すなわち（３′−CH2
−NH−NH−CH2−５′）結合したオリゴヌクレオシドの
ためのCPG、結合ヌクレオシドの合成ジフェニルイミダ
ゾリジン保護された５′−アルデヒド性チミジン CPG−結合したヌクレオシド；ジフェニルイミダゾリ
ジノ保護された５′−アルデヒド性チミジンおよび５′
−デオキシ−５′−ヒドラジノ−チミジンの合成 CPG
−結合したチミジン［カリホルニア州，フォスター（Fo
ster）市,ABI,CPG支持体１グラム上のチミジン30マイク
ログラム）を、周囲温度で、DMSO,ベンゼン,DCC,ピリジ
ン，およびトリフルオロ酢酸［15ml/15ml/2.48g/0.4ml/
0.2ml）の混合物で、フィッツアー・ケイ・イー（Pfitz
er,K.E.）およびジェイ・ジー・モファット（J.G.Moffa
tt），ジャーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサ
エティ（Journal of American Chemical Society）85:3
027（1963）の酸化手順と同様に処理して、５′−アル
デヒド性ヌクレオシドを得る。混合物を一晩貯蔵した
後、濾過する。支持体を蓚酸（ベンゼン/DMSO,1対1.5ml
中1.3g）で洗浄して、1,2−ジアニリノエチレン（3.0
g）で１時間処理し、濾過し、そしてアセトニトリルで
洗浄して、５′−ジフェニルイミダゾリジノ保護された
５′−アルデヒド性チミジンを得る。
５′−デオキシ−５′−ヒドラジノ−チミジン 支持体と結合した５′−アルデヒドチミジンの、アセ
トニトリル中のヒドラジン水和物／水素化シアノホウ素
ナトリウムの溶液による処理により、CPG−３′−結合
した５′−デオキシ−５′−ヒドラジノチミジンが得ら
れ、このものをその塩酸塩として貯蔵する。
５′−ジフェニルイミダゾリジノ保護された３′−デオ
キシ−３′−Ｃ−ヒドラジノメチルチミジン 商業的に入手可能な３′−Ｏ−アセチルチミジンを酸
化して、次にそのN,N−ジフェニルエチレンジアミン誘
導体（1,3−ジフェニルイミダゾリジノ）として保護し
た。これにより、公知の５′−デオキシ−５′−ジフェ
ニルイミダゾリジノ−３′−Ｏ−アセチルチミジンが得
られる。フィッツアー，ケイ・イー（Pfitzer,K.E.）お
よびジェイ・ジー・モファット（J.G.Moffatt），ジャ
ーナル・オブ・アメリカン・ケミカル・ソサエティ（Jo
urnal of American Chemica Society）85:3027（196
3）。この物質の加水分解を、周囲温度で15時間、メタ
ノール性アンモニア処理をすることによって達成した。
５′−デオキシ−５′−ジフェニルイミダゾリジノチミ
ジン（4.5g）をDMF（100ml）に溶解させ、室温で15時
間、沃化トリフェニルメチルホスホニウムで処理した。
溶媒を減圧下で除去し、得られる残留物をメタノールか
ら再結晶させて３′−デオキシ−３′−ヨード誘導体を
得た。３′−デオキシ−３′−ヨード−５′−ジフェニ
ルイミダゾリジノチミジンをトルエンに溶解させて、ヘ
キサメチル二スズ,t−ブチルイソニトリル，およびAIBN
で処理した。このラジカル反応により、３′−デオキシ
−３′−シアノ誘導体を得て、次にこのものを０℃でト
ルエン/THF中の水素化ジイソブチルアルミニウム（DIBA
L−Ｈ）で還元して、３′−デオキシ−３′−Ｃ−ホル
ミル−５′−ジフェニルイミダゾリジノチミジンを得
た。この物質を、アセトニトリル中のヒドラジン水和物
及び水素化シアノホウ素ナトリウムで処理して、５′−
ジフェニルイミダゾリジノ保護された３′−デオキシ−
３′−Ｃ−ヒドラジノメチルチミジンを得た。この物質
は酢酸塩として都合よく貯蔵される。
実施例２ DNA合成装置上での均一な（３′−CH2−NH−
NH−CH2−５′）、すなわち、メチレンヒドラジン結合
したオリゴヌクレオシドの合成 ３′−末端ヌクレオシドになるであろう実施例１から
のジフェニルイミダゾリジノ保護された５′−アルデヒ
ドをもつCPG−結合したチミジンを、アプライド・バイ
オシステムズ社（Applied Biosystems,Inc）（ABI）の
カラムに入れ（250mg,10マイクロモルの結合ヌクレオシ
ド）ABI 380B自動DNA合成装置にとりつける。デスメチ
ルヌクレオシド単位を成長する鎖に結合させるために必
要とされるサイクルの自動化（コンピューターへ制御さ
れた）段階は、下記の通りである。
この手順で、その生成物ヌクレオシドとして５′−ジメ
チルオキシトリチル置換されたヌクレオシド単位を得
る。
合成が完了したら、標準法（Oligonucleotide Synthe
sis:a practical approach,M.J.Gait,IRL Press,1984）
により、塩基脱保護および支持体からのオリゴマーの除
去を行う。HPLC上のトリチル精製に続く酢酸脱保護およ
び沈殿により、オリゴヌクレオシドが酢酸塩として得ら
れる。
実施例３ ５′−デオキシ−５′−ヒドラジノヌクレオ
シドの合成 ５′−デオキシ−５′−ヒドラジノチミジン塩酸塩 ５′−ベンジルカルバジル−５′−デオキシチミジン
を得るために、５′−ｏ−トシルチミジン（Nucleoside
s＆Nucleotides 9:98（1990）,1.98g,5mmol）、ベンジ
ルカルバジド（4.15g,25mmol）、活性分子ふるい（3A,2
g）、および無水ジメチルアセトアミド（100ml）を、11
0℃（浴温）で16時間、水分を排除しながら一緒に撹拌
した。生成物を冷却し、減圧下で濃縮した（浴温＜50
℃）。残留物を、溶媒としてCH2Cl2/MeOH（9:1,v/v）を
用いてシリカゲルカラム（５×45cm）上で精製した。均
質な分画をプールして、蒸発乾燥させ、泡抹をEtOHから
再結晶させて、0.7g（36％）の５′−ベンジルカルバジ
ル−５′−デオキシチミジンを得た。
融点201℃； 1H NMR（Me2SO−d6）δ 1.79（s,3,CH 3）,2.00−2.1
8（m,2,C2 CH 2）,2.95（t,2,C5 CH 2）,3.75（m,1,C4
H）,4.18（m,1,C3 H）,4.7（brs,1,O2NH）,5.03（s,
2,PhCH 2）,5.2（d,1,C3 H）,6.16（t,1,C1 H）,7.2−
7.4（m,5,C6 H 5）,7.6（s,1,C6 H）,8.7（brs,1,CH2NH）,
11.2（brs,1,C3NH）。
吸湿性粉末としての５′−デオキシ−５′−ヒドラジ
ノチミジンの塩酸塩を得るために、無水MeOH/HCl（30m
l,重量で２％HCl）中の上記カルバゼート（carbazate）
（0.78g,2ミリモル）および木炭上のパラジウム（10％,
150mg）の混合物を、水素雰囲気下で室温で1.5時間撹拌
した。メタノール溶液をセライト（Celite）を通して濾
過して、触媒を除去した。フィルターケーキをEtOH（２
×25ml）で洗浄した。濾液を真空下で濃縮して、残留物
を一晩乾燥させて痕跡のHClを除去した。黄色残留物を
メタノール（3ml）に溶解させて迅速に撹拌している酢
酸エチルの溶液（150ml）に滴加した。濾過した沈殿を
酢酸エチル（３×100ml）で洗浄し、淡黄色の固体を真
空乾燥させて、0.51g（88％）の５′−デオキシ−５′
−ヒドラジノチミジン塩酸塩（吸湿性粉末）を得た； 1H NMR（Me2SO−d6）δ 1.81（s,3,CH 3）,2.02−2.2
2（m,2,C2 CH 2）,3.2（m,2,C5 CH 2）,3.8（m,1,C4
H）,4.2（m,1,C3 H）,6.17（t,1,C1 H）,7.54（s,1,C
6 H）,11.18（brs,1,C3NH）。
ヒドラジノおよび３′−OHは、H2Oによってマスクされ
た。
実施例４ ５′−トリチル−１−［2,3−ジデオキシ−
３−Ｃ−（ホルミル）−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラ
ノシル］−チミンおよび−ウラシルの合成 方法Ａ ３′−Ｃ−シアノ−３′−デオキシ−５′−Ｏ−トリチ
ルチミジン 「以下の調製はフードの中で行い、試薬の蒸気を吸入
しないように注意しなさい。」３′−デオキシ−３′−
ヨード−５′−O−トリチルチミジン（フェルハイデン,
J.P.H.（Verheyden,J.P.H.）；モファット,J.G.（Moffa
tt,J.G.）,J.Org.Chem.35:2868（1979））（60g,0.1モ
ル）、ヘキサメチルジチン（36g,22.7ml,0.11モル）,t
−ブチルイソシアニド（166g,225ml,2モル）、および
（Na/ベンゾフェニン上で蒸留したばかりの、２リット
ルの）トルエンに溶かした（AIBN（1.6g,10ミリモル）
の懸濁液に30分間アルゴンを送り込むことによって徹底
的に酸素を除去して、次に38℃で13時間加熱した。この
反応混合物を60℃に冷却して、AIBN（1.6g,10ミリモ
ル）を加えて、そして24時間加熱を続けた。この期間に
３回同じ方法でAIBNの添加を繰り返した。反応混合物を
室温にまで冷却して、プレパックのシリカゲルカラムの
上に移し（1.5kg,ヘキサンに懸濁してある）、ヘキサン
類：Et2Oを用いて溶出した（各回ごとに１リットルの溶
出液を用いて10％の勾配の変化を作り、100％ヘキサン
類→100％Et2O）。不純物の大部分は非極性化合物とし
て勾配をかけた溶出の間に除去した。Et2O（２リット
ル）を用いて最後に溶出させて、適当なフラクションを
合わせて蒸発させて、集めた順に２つの化合物を得た。
（ｉ）３′−Ｃ−シアノ−３′−デオキシ−５′−O−
トリチルチミジン12.93g（25％）、白色粉末（トルエン
／Et2Oから結晶化させた、mp153−157℃）； 1H NMR（CDCl3）δ 8.83（s,1,NH）,7.04−7.4（m,1
8.5,トルエン由来のTrH，C6 H，および0.5ArH）,6.10（d
d,1,H １′,J１′,2′＝4.1Hz,J１′,2″＝7.1Hz）,4.20
（m,1,H ４″Ｊ３′,4′＝8.4Hz,J４′,5′＝2.8Hz）,3.
33−3.60（m,3,H５′,5″,3′）,2.68（m,1,H２″Ｊ
２′,2″＝13.8Hz）,2.52（m,1,Ｈ ２″）,2.28（s,1.5,
0.5トルエン由来のCH 3），および1.50（s,3,CH 3）。
C30H27N3O40・5 C7H8（トルエンから結晶化させた）に
対する計算値:C,74.56;H,5.79;N,7.78。実測値:C,74.2
7;H,5.78;N,7.66。
この反応混合物からは１−（３′−Ｃ−シアノ−２′,
3′−ジデオキシ−５′−Ｏ−トリチル−β−Ｄ−スレ
オ−ペントフラノシル）−チミン4.82g（10％）も得ら
れた； 1H NMR（CDCl3）δ 8.72（s,1,NH）,7.03−7.44（m,
18.5,TrH，C6 H，およびトルエン由来の0.5ArH）,6.13
（擬似のt,1,H１″Ｊ１′,2′＝6.7Hz,J１′,2″＝5.7H
z）,4.09（m,1,H４″Ｊ３′,4′＝6.7Hz,J４′,5′＝4.
9Hz）,3.56（m,2,H５′,5″,3.28（m,1,H３″Ｊ
３′,2′＝8.2Hz,J３′,2″＝5.2Hz）,2.70（m,1,Ｈ
２″Ｊ２′,2″＝14Hz）,2.28（s,1.5,トルエン由来のC
H 3）および1.60（s,3,CH 3）。
C30H27N3O40.5 C7H8に対する計算値（トルエンから結
晶化させた）:C,74.56;H,5.79;N,7.78。実測値:C,74.1
0;H,5.74;N,7.52。
エピマー化：メタノール（20ml）に懸濁させた１−
（３′−C−シアノ−２′,3′−ジデオキシ−５′−O−
トリチル−β−D−スレオ−ペントフラノシル）チミン
（0.30g,0.61ミリモル）の懸濁液に、溶液のpHがおよそ
９に到達するまで1NのNaOMeの溶液を１滴づつ加えた。
得られた混合物を加熱して20時間還流した。その溶液を
（０℃に）冷却して、1N HCl/MeOHを用いて中和して、
減圧下で蒸発させた。残渣を上述のように精製して、
３′−C−シアノ−３′−デオキシ−５′−O−トリチル
チミジン0.185g（62％）を得た。（３′−デオキシ−
３′−C−シアノ−５′−O−トリチルチミンの合成はTe
trahedron Letters 29:2995（1988）に報告されてい
た。この報告は、３′−デオキシ−３′−C−シアノ−
５′−O−トリチルチミンは唯一の生成物として形成さ
れることを示唆したが、しかし、私達は混合物が生成す
ることを見い出した。上のエピマー化によって、この混
合物のキシロの成分を、興味のある３′−デオキシ−
３′−C−シアノ−５′−O−トリチルチミンの化合物へ
変換する。） ３′−デオキシ−３′−Ｃ−ホルミル−５′−Ｏ−トリ
チルチミン DIBAL−Ｈ（トルエン中で1M,50ml、５時間の期間に５
回に分けて）を、乾燥THF（10ml）中の３′−C−シアノ
−３′−デオキシ−５′−Ｏ−トリチルチミジン（9.92
g,20ミリモル）の撹拌した溶液ヘアルゴン下で０℃で加
えた。この溶液を室温で１時間撹拌して、再び０℃に冷
却した。撹拌中にMeOH（25ml）を１滴づつ冷却した溶液
に加えて、完全に添加が終わってから溶液を室温にす
る。飽和させた水性のNa2SO4溶液（11ml）を反応混合物
へ加えて、12時間撹拌した。粉末の無水Na2SO4（30g）
を反応混合物へ加えて、懸濁液を30分間撹拌した。懸濁
液を濾過して、全ての生成物を洗浄するまで残渣を徹底
的にMeOH:CH2Cl2（1:9v/v）を用いて洗浄した。濾液を
合わせて真空下で濃縮して、粘着性の残渣を得た。残渣
を溶出のためにCH2Cl2:MeOH（100％CH2Cl2→9:1,v/v）
を用いたシリカゲルクロマトグラフィーによって精製し
て、5.45g（55％）の３′−デオキシ−３′−C−ホルミ
ル−５′−O−トリチルチミンを白色の泡として得た。
1H NMR（CDCl3）δ 9.61（d,1,CHO,J３′,3″＝1.5H
z）,8.44（s,1,NH）,7.46（s,1,C6 H）,7.17−7.45（m,1
5,TrH）,6.04（擬似t,1,H １″Ｊ１′,2′＝5.3Hz,J
１′,2″＝6.6Hz）,4.31（m,1,Ｈ ４″Ｊ４′,5′＝3.3H
z,J３′,4′＝7Hz）,3.28−3.55（m,3,
H ５′,5″,3′）,2.69（m,1,H ２′）,2.28（m,1,
H ２″）,1.48（s,3,CH 3）。
C30H28N2O5・H2Oに対する計算値:C,70.03;H,5.88;N,5.4
4。実測値:C,70.40;H,6.00;N,5.33。
１−［３−デオキシ−３−Ｃ−（ホルミル）−５−Ｏ−
トリチル−β−Ｄ−エリスローペントフラノシル］ウラ
シル 乾燥THF（20ml）中の３′−シアノ−２′,3′−ジデ
オキシ−５′−O−トリチルウリジン（0.96g,2ミリモ
ル）（上記のチアジンのアナログの調製と同じ方法で調
製する）撹拌した溶液へアルゴン下で−10℃で10分間以
上の時間をかけてトルエン（アルドリッチ（Aldric
h））中のDIBAL−Ｈの溶液を加えた。30分後に−10℃の
MeOH（5ml）を用いて反応を停止させた。さらにこの混
合物を周囲の温度で30分間撹拌して、真空で濃縮する前
にCH2Cl2（25ml）を用いて希釈した。残っているTHFを
除去するためにCH2Cl2（３×25ml）を用いてこの過程を
繰り返した。残渣をシリカゲル（25g）のフラッシュク
ロマトグラフィーによつて精製した。CH2Cl2（9:1,v/
v）を用いた溶出およびCH2Cl2/MeOHからの結晶によって
５′−O−トリチル−３′−C−ホルミル−２′,3′−ジ
デオキシウリジル（0.53g,53％）を得た;mp100℃； 1H NMR（CDCl3）δ 2.25−2.8（m,2,CH 2）,3.4（m,
1,C3，H）,3.45−3.6（m,2,C5，CH 2）,4.37（m,1,C4，
H）,5.4（d,1,C3 H）,6.1（m,1,C1，H）,7.2−7.4（m,1
5,C6 H 5）,7.81（d,1,C6 H）,7.95（br s,1,NH）,9.61
（s,1,HC＝Ｏ）。
方法Ｂ １［３−デオキシ−３−Ｃ−（ホルミル−５−Ｏ−トリ
チル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル］チミン １メチル−５−O−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）
−2,3−ジデオキシ−３−C−（ホルミル）−D−エリス
ロ−ペントフラノースは、Tetrahedron,44:625（1988）
に記述したように１−メチル−５−（ｔ−ブチルジフェ
ニルシリル）−2,3−ジデオキシ−３−C−シアノ−D−
エリスロペントフラノースのDIBAL−Ｈ還元を用いて90
％の収量でオイルとして得た。３−C−ホルミル基はメ
トキシアミンを用いてオキシムへ誘導する。オキシムで
保護した中間体はシリル化したチミンを用いて配糖化し
て、標題の化合物のαおよびβの混合物を得た。保護基
をはずした後に、βアノマーを方法Ａで調製したそれと
比較する。
方法Ｃ １−［３−デオキシ−３−Ｃ−（ホルミル）−５−Ｏ−
トリチル−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル］−ウ
ラシルおよび−チミン ３′−デオキシ−３′−ヨード−５′−Ｏ−トリチル
チミジン（0.59g,4ミリモル），トリス（トリメチルシ
リル）シラン（2.87g,1.2ミリモル）,AIBN（12mg,0.072
ミリモル）、およびトルエン（20ml）の混合物をガラス
の容器の中で混合して、（室温で送り込んで）アルゴン
で飽和させた。ガラスの容器をステンレススチールの圧
力反応器の中へ挿入して、一酸化炭素を用いて圧力をか
けて（80psi）、閉じてそして26時間加熱した（90℃，
熱浴）。この反応混合物を冷却して（０℃）、COを注意
深く逃がした（有ガス用フードの中で）。生成物はシリ
カゲル（20g）上のフラッシュカラムクロマトグラフィ
ーによって精製した。EtOAc:ヘキサン類（2:1,v/v）を
用いて溶出させて適当なフラクションを混合して、泡沫
として標題の化合物を0.30g（61％）を得た。
２′,3′−ジデオキシ−３−ヨード−５′−トリチル
ウリジンに同様な方法でラジカルによりカルボニル基を
導入して３′−Ｃ−ホルミルウリジン誘導体を得る。
実施例５ メチレンヒドラゾンが連結する（３′−CH＝
Ｎ−NH−CH2−５′）、メチレンヒドラジンが連結する
（３′−CH2−NH−NH−CH2−５′）およびメチレン（ジ
メチルヒドラゾ）が連結する（３′−CH2−Ｎ（CH3）−
Ｎ（CH3）−CH2−５′）ジヌクレオチド類 ３′−デ（オキシホスフィニコ）−３′−［メチレン
（ヒドラゾン）］−５′−Ｏ−トリチルチミジリル−
（３′→５′）−５′−デオキシチミジン 乾燥CH2Cl2/MeOH/AcOH（20ml/10ml/0.5ml）中の３′
−デオキシ−３′−C−ホルミル−５′−O−トリチルチ
ミジン（0.645g,1.30ミリモル）、５′−デオキシ−
５′−ヒドラジノチミジン塩酸塩（0.397g,1.36ミリモ
ル）の混合物を30分間室温で撹拌した。溶媒を真空下で
蒸発させて、ヒドラゾン中間体を1H−NMRによって分析
した。
1H NMR（DMSO−d6）δ 1.1（br s,2,NH）,8.3（s,1,
C＝Ｎ−NH）,7.5−7.74（m,17,TrH，2C6 H）,6.8（1d,1
t,1,HC＝N,2つの異性体）,6.0−6.1（2m,2,H １′）,5.3
0（br t,1,OH）,3.8−4.2（3m,3,H ３′，2H ４′）,3.0
−3.3（m,5,2H ５′,5″，H ３′）,2.0−2.4（m,4,2H
２′,2）,1.5および1.7（2s,6.2 CH 3）。
３′−デ（オキシホスフィニコ）−３′−［メチレン
（ジメチルヒドラゾ）］−５′−Ｏ−トリチルチミジリ
ル−（３′→５′）−５′−デオキシチミジン 上のヒドラゾンの二量体をAcOH（10ml）へ溶解させ
て、これへ室温で30分間撹拌しながら少量のNaBH3CN
（４×0.12g,7.74ミリモル）を加えた。水性HCHO（20
％,3.9ml,26ミリモル）、NaBH3CN（3.9ミリモル）、お
よびAcOH（10ml）を添加する前に、この溶液をさらに15
分間撹拌した。懸濁液をさらに15分間撹拌して、溶液を
真空下で蒸発させた。残渣をMeOH（３×25ml）と一緒に
蒸発させてメチレンヒドラゾの二量体を得た； 1H NMR（CDCl3）δ 6.8−7.8（m,15,TrH,2 C6 H）,6.
12（m,2,2H １′）,4.20（m,1,T2 H ３′）,4.05（m,1,T2
H ４′）,3.89（m,1,T1 H ４′）3.80（s,6,2 OCH 3）,3.
21−3.53（m,2,T1 H５′,5″）,2.11−2.75（m,10,T2 H
５′,5″ H,T1 H ３″，T1H ３′,T1 T2 H ２′２″）,2.26
（s,6,2N−CH 3）,1.88および1.49（2s,6,2 CH 3），およ
び他のプロトン。
３′−デ（オキシホスフィニコ）−３′−［メチレン
（ジメチルヒドラゾ）］−チミジリル−（３′→５′）
−５′−デオキシチミジン 次に上のヒドラジンの二量体をMeOH（25ml）中の37％
水性HCl（1ml）とともに室温で24時間撹拌した。得られ
た混合物をNH4OHを用いて中和して（pH８）乾燥する
まで蒸発させた。残渣は逆相HPLC（スペルコシルLC18,5
ml,H2O：CH3CN勾配）によって精製して、標題のメチレ
ン（ジメチルヒドラジン）が連結するダイマー0.61g（8
9％）を得た。
1H NMR（90° C,DMSO−d6＋１滴のD2O）δ 7.66お
よび7.43（2s,2,2 C6 H）,6.02（擬似t,1,T2 H１,,J
１′,2′＝7.2Hz,J１′,2″＝7.7Hz）,5.96（疑似t,1,T
1 H１′,J１′,2′＝5.6Hz,J１′,2″＝6.2Hz）,4.12
（m,1,T2 H ３′）,3.90（m,1,T2 H ４′）,3.71（m,1,T1
H ４′）,3.61（m,2,T2 H ５′,5″）,2.4−2.8（m,5,T2
H ５′,5″,T1 H ３″,T1 H ３′）,2.29（2s,6.2 N−C
H 3）,2.12（m,4,2H２′,2″）,1.76および1.74（2s,6,2
CH 3）。
C23H34N6O8・H2Oに対する計算値:C,51.10,H,6.71;N,15.
54。実測値:C,51.05;H,6.68;N,15.54。MSFAB m/z523(M+
H)+。
実施例６ メチレン（ジメチルヒドラジン）が結合する
（３′−CH2−Ｎ（CH3）−Ｎ（CH3）−CH2−５′）５′
−ジメトキシトリチル−３′−β−シアノ−エトキシジ
イソプロピルホスホラミジトジヌクレオシド ３′−デ（オキシホスフィニコ）−３′−［メチレン
（ジメチルヒドラゾ）］−チミジリル−５′−Ｏ−（ジ
メトキシトリフェニルメチル）−（３′→５′）−３′
−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ−ジイソプロピルアミノ
ホスフィリル）チミジン 実施例５のメチレン（ジメチルヒドラジン）二量体を、
オリゴヌクレオチドの合成：実用的な方法、M.J.ガイド
編集,IRL出版、1984年（Oligonucleotide Synthesis;a
practical approach,Ed.M.J.Gait,IRL Press,1984）に
したがってジメトキシトリチル化して、均一な泡沫を得
た。
1H NMR（CDCl3）δ 6.8−7.8（m,20,DMTr,2H 6）,6.1
2（m,2,2H １′）,4.20（m,1,T2 H ３′）,4.05（m,1,T2
H ４′）,3.89（m,1,T1 H ４′）,3.80（s,6.2 DMTrのOCH
3）,3.21−3.53（m,2,T1 H ５′５″）,2.11−2.75（m,
9,T1 H ５′５″，H ３″,T1H ３′，2H ２′２″）,2.26
（2s,6, 2 N−CH 3）および1.88および1.49（2s,2, C5CH
3）。
これをオリゴヌクレオチド合成：実用的な方法、M.J.
ガイド編集,IRL出版、1984年（Oligonucleotide Synthe
sis;a practical approach,Ed.M.J.Gait,IRL Press,198
4）に記述された手順でホスフィチル化することによっ
て65％の収量で標題の化合物を得た。
1H NMR（CDCl3）δ 6.14（m,1,T2 H １′）,6.01（m,
1,T1 H １′）,3.80（s,6,2 O CH 3）,2.23（m,6,2 N−CH
3）,1.78および1.45（2s,6,2 CH 3），および他のプロト
ン31P NMR（CDCl3）δ 149.43および148.85ppm。
実施例７ 断続するメチレン（ジメチルヒドラジン）
（３′−CH2−NCH3−NCH3−CH2−５′）が連結するオリ
ゴヌクレオシドの合成 CPGに結合したチミジン（または３′末端の塩基にな
る任意の他のヌクレオシド）をアプライド バイオシス
テムズ社（Applied Biosystems,Inc.）（ABI）カラム
（250mg,結合したヌクレオシド10マイクロモル）の中に
置いて、ABI 380B自動DNA合成機に取り付けた。メチレ
ンヒドラジンチミジン二量体を任意の希望の位置で配列
へ導入するために、ホスホラミダイト化学を用いる標準
的な自動の（コンピューターが制御する）段階を使用す
る。
実施例８ （３′−CH2−NH−Ｓ−CH2−５′）の合成 ３′−デ（オキシホスフィニコ）−３′−［メチレン
（メチルサルフェニル）］−チミジリル−（３′→
５′）−５′−デオキシチミジン ２つの中間体のヌクレオシドから標題の化合物は調製
されるだろう。最初のヌクレオシドである３′−O−ベ
ンジル−５′−デオキシ−５′−メルカプトチミジン
は、J.H.マリオット（J.H.Marriott）ら,Tet.Letts.,3
1:7385（1980）の手順に従って３段階で３′−O−ベン
ゾイルチミジンから、５′−S−［９−（４−メトキシ
フェニル）キサンテン−９−イル］基の形成およびその
後の保護基の除去による５′−SH基の生成を介して調製
されるだろう。２つ目のヌクレオシドである３′−C−
メチルアミノ−５′−O−トリチルチミジンは、上記の
実施例４に記述した３′−C−ホルミル−５′−O−トリ
チルチミジンから３段階で調製されるだろう。３段階に
は、ホルミル基のNaBH4還元、その後のLiN3/DMFを用い
たアジド基への変換および３′−C−CH2NH2基を得るた
めのTBTH/トルエンを用いたその後の還元が含まれる。
３′−C−メチルアミノ−５′−O−トリチルチミジンヌ
クレオシド（１ミリモル）を水性次亜塩素酸（４ミリモ
ル）溶液へ加えてクロルアミド中間体を生成し、これを
冷却して（０℃）、３′−O−ベンジル、５′−デオキ
シ−５′−メルカプトチミジンヌクレオシド（0.9ミリ
モル）と15分間反応させて、その後に通常の操作および
クロマトグラフィーによる精製を行い、標題の化合物を
得るだろう。
実施例９ ５′−Ｏ−フタルイミドヌクレオシドの合成 ５′−Ｏ−フタルイミドチミジン 乾燥DMF（400ml）中のチミジン（24.22g,0.1モル）、
Ｎ−ヒドロキシフタルイミド（21.75g,0.13モル）、ト
リフェニルホスフィン（34g,0.13モル）の撹拌した溶液
に３時間以上の時間をかけて０℃でアゾニカルボン酸二
イソプロピル（30ml,0.15モル）を加えた。完全に加え
た後で反応混合物を室温まで温めて、12時間撹拌した。
溶液を真空下で濃縮して（0.1mm,＜40℃）、オレンジ−
赤の残渣を得た。ゴム性の残渣をEt2Oで数回洗浄して、
洗浄液を捨てた。半固体の残渣をEtOH（500ml）に懸濁
して、加熱して（90℃）、生成物を溶解させた。冷却し
て30.98g（80％）の５′−O−フタルイミドチミジンをm
p233−235℃（分解）の白色の結晶性の物質として３つ
に集めた； 1H NMR（DMSO−d6）δ 11.29（s,1,NH）,7.85（m,4,
ArH）,7.58（s,1,C6 H）,6.20（t,1,H １′,J１′,2″＝
7.8Hz,J１′,2″＝6.5Hz）,5.48（d,1,OH ３′）,4.36
（m,3,H ４′,5′,5″）,4.08（m,1,H ３′）,2.09−2.13
（m,2,H ２′,2″），および1.79（s,3,CH 3）。
C18H17O7N3 0.7 H2Oに対する計算値:C,54.05,H,4.64;N,
10.51。実測値:C,53.81;H,4.25;N,10.39。
２′−デオキシ−５′−Ｏ−フタルイミドウリジン ２′−デオキシウリジンを用いて類似の反応を行っ
て、対応する２′−デオキシ、５′−O−フタルイミド
ウリジンを得た;mp241−242℃。
実施例10 ５′−O−フタルイミド−３′−O−（ｔ−ブ
チルジフェニルシリル）チミジンおよび２′−デオキシ
−５′−O−フタルイミド−３′−O−（ｔ−ブチルジフ
ェニルシリル）ウリジンの合成 ３′−Ｏ−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）−５′−Ｏ
−フタルイミドチミジン ５′−O−フタルイミドチミジン（8.54g,22ミリモ
ル）、塩化ｔ−ブチルジフェニルシリル（6.9ml,26.5ミ
リモル）、イミダゾール（3.9g,57.3ミリモル）および
乾燥DMF（130ml）の混合物を室温で16時間アルゴン下で
撹拌した。反応混合物を氷水（600ml）中に注ぎ、溶液
をCH2Cl2（２×400ml）を用いて抽出した。有機層を水
（２×250ml）で洗浄して乾燥した（MgSO4）。CH2Cl2層
を濃縮してゴム性の残渣を得て、これをシリカゲルカラ
ムクロマトグラフィー（EtOAc:ヘキサン類;1:1,v/vを用
いて溶出させた）によって精製して12.65g（92％）の
３′−O−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）−５′−O−
フタルイミドチミジンを結晶性の物質（mp172−173.5
℃）として得た。
1HNMR（DMSO−d6）δ 11.31（s,1,NH）,7.83（m,4,A
rH）,7.59（m,4,TBDPhH）,7.51（s,1,C6 H）,7.37−7.45
（m,6,TBDPhH）,6.30（dd,1,H １′）,J１′,2′＝8.8H
z,J１′,2″＝5.6Hz）,4.55（m,1,H ４′）,4.15（m,1,H
３′）,3.94−4.04（m,2,H ５′,5″）,2.06−2.13（m,
2,H ２′,2″）,1.97（s,3,CH 3）,1.03（s,9,C(C
H 3)3）。
C34H35O7N3Siに対する計算値:C,65.26;H,5.64;N,6.71。
実測値:C,65.00;H,5.60;N,6.42。
３′−Ｏ−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）−２′−デ
オキシ−５′−Ｏ−フタルイミド−ウリジン ２′−デオキシ−５′−O−フタルイミド−ウリジン
を用いた類似の反応を行って、対応する３′−O−（ｔ
−ブチルジフェニルシリル）−２′−デオキシ−５′−
O−フタルイミド−ウリジンを得るだろう。
実施例11 ５′−Ｏ−アミノヌクレオシドの合成 ５′−Ｏ−アミノ−３′−Ｏ−（ｔ−ブチルジフェニル
シリル）チミジン 乾燥CH2Cl2（100ml）中の３′−O−（ｔ−ブチルジフ
ェニルシリル）−５′−O−フタルイミドチミジン（10
g,16ミリモル）の撹拌した溶液へアルゴン下で室温でメ
チルヒドラジン（1.3ml,24ミリモル）を加えて、溶液を
12時間撹拌した。溶液を冷却して（０℃），濾過した。
白色の残渣をCH2Cl2（２×25ml）を用いて洗浄して、濾
液を合わせて蒸発させてゴム性の残渣を得た。シリカゲ
ルカラムクロマトグラフィー（CH2Cl2:MeOH,98:2,v/vを
用いて溶出）による精製から得た残渣から7.03g（89
％）のCH2Cl2/MeOHから結晶化させた、５′−O−アミノ
−３′−O−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）チミジ
ン、mp141−143℃を得た。
1HNMR（DMSO−d6）δ 11.29（s,1,NH）,7.42−7.62
（m,11,TBDPhH，C6 H）,6.25（dd,1,H １′,J１′,2′＝
8.4 Hz,J１′,2″＝6.3Hz）,6.02（s,2,NH 2）,4.35（m,
1,H ４′）,4.04（m,1,H ３′）,3.34−3.51（m,2,H
５′,5″）,2.04（m,2,H ２′,2″）,1.73（s,3,CH 3）,
1.03（s,9,C(CH 3)3）。
C26H33O5N3Siに対する計算値:C,63.00;H,6.71;N,8.48。
実測値C,62.85;H,6.67;N,8.32。
実施例12 （３′−CH＝Ｎ−Ｏ−CH2−５′）が連結す
るオリゴヌクレオシド（オキシムが連結する二量体） ３′−デ（オキシホスフィニコ）−３′−（メチルイジ
ンニトリロ）チミジリル−（３′→５′）−チミジン 乾燥CH2Cl2（20ml）の中の３′−デオキシ−３′−C
−ホルミル−５′−O−トリチルチミン（0.99g,2ミリモ
ル）、５′−アミノ−３′−O−（ｔ−ブチルジフェニ
ルシリル）チミジン（0.99g,2ミリモル）およびAcOH
（0.3ml）の混合物を１時間室温で撹拌した。溶媒を真
空下で蒸発させて、粗製の保護基をつけた３′−デ（オ
キシホスフィニコ）−３′−（メチルイジンニトリロ）
チミジリル−（３′→５′）−３′−（ｔ−ブチルジフ
ェニルシリル）チミジンの生成物をTHF（20ml）に溶解
した。nBu4NF（1M,5ml）のTHF溶液を撹拌したこの反応
混合物に室温で加えた。１時間後に溶液をシリカゲルカ
ラムクロマトグラフィー（CH2Cl2:MeOH;99:4v/vを用い
た溶出）で精製して、３′の保護基のはずれた二量体を
得た。この二量体を無水MeOH（50ml）に溶解して、これ
にMeOH/HCl溶液（0.14M,2.5ml）を加えた。この反応混
合物を室温で15時間撹拌した。無水ピリジン（10ml）を
上の溶液へ加えて、溶媒を蒸発させて乾燥させて、粗製
のオキシムの二量体を得た。粗製の生成物をシリカゲル
カラムクロマトグラフィー（CH2Cl2:MeOH;92:8,v/v）に
よって精製して、標題の化合物である、３′−デ（オキ
シホスフィニコ）−３′−（メチルイジンニトリロ）チ
ミジリル−（３′→５′）−チミジン（0.87g,89％）を
E/Z異性体の混合物として得た。２つの幾何異性体は逆
層HPLC（スペルコシルLC18（Supelicosil LC18）,5μ
H2O：CH3勾配）によって分離した。（標題の化合物のＺ
−異性体） 1HNMR（DMSO−d6）δ 11.28（br s,2,2NH）,7,39お
よび7.78（2s,2,2C6H）,6.92（d,1,T1 H3″,J３′,3″
＝6.7Hz）,6.15（擬似t,1,T2 H１′,J１′,2′＝7.78H
z,J１′,2″＝6.3Hz）,6.04（dd,1,T1 H１′,J１′,2′
＝7.1Hz,J１′,2″＝6.3Hz）,5.34（d,1,T2 OH）,5.12
（t,1,T1 OH）,4.11−4.25（m,3,T2 H５′,5″,T2 H
３′）,3.96（m,1,T2 H ４′）,3.90（m,1,T1 H４′）,
3.49−3.69（m,3,T1 Ｈ ５′,5″,T1 Ｈ ３′）,2.06−2.
31（m,4,T1 H ２′,2″,T2 H２′,2″）,1.73（s,6,2C
H3）。
C21H27N5O9・H2Oに対する計算値:C,49.31;H,5.72;N,13.
69。実測値:C,49.32;H,5.57;N,13.59。（標題の化合物
のＥ−異性体） 1HNMR（DMSO−d6）δ 11.3（2 br s,2,2NH）,7.81
（s,1,C6 H）,7.52（d,1,T1 H ３″,J３′,3″＝6.7Hz）,
7.45（s,1,C6 H）,6.10（擬似t,1,T2 H １′,J１′,2′＝
7.6Hz,J１′,2″＝6.4Hz）,6.04（dd,1,T1 H １′,J
１′,2′＝7.3Hz,J１′,2″＝3.4Hz）,5.36（d,1,T2 O
H）,5.16（t,1,T1 OH）,4.07−4.22（m,3,T2 H
３′,5′,5″）,3.91（m,2,T1H ４′）,3.50−3.73（m,
2,T1 H ５′,5″）,3.12（m,1,T1 H ３′）,2.05−2.44
（n,4,T1 T2 H ２′,2″），および1.76（s,6,2CH 3）。
MS FAB:M/Z 494(M+H)+。
実施例13 （３′−CH＝Ｎ−Ｏ−CH2−５′）を含むホ
スホラミディトが連結するオリゴヌクレオシドの合成 ３′−デ（オキシホスフィニコ）−３′−（メチルイジ
ンニトリロ）−５′−Ｏ−（ジメトキシトリフェニルメ
チル）−チミジリル−（３′→５′）−３′−Ｏ−（β
−シアノエチルジイソプロピルアミノホスフィリル）チ
ミジン オリゴヌクレオシドの合成：実用的な方法、M.J.Gait
編集、IRL出版、1984年（Oligonucleotide Synthesis:a
practical approach,Ed.M.J.Gait,IRL Press,1984）に
記述された手順にしたがって実施例12の異性体の二量体
を５′末端ヌクレオシドの水酸基においてさらにジメト
キシトリチル化して、その後に二量体の３′末端のヌク
レオシドの水酸基において３′−O−β−シアノエチル
ジイソプロピルホスホラミダイト誘導体へ変換して、標
題の化合物を得た。
1HNMR（CDCl3）δ 8.77（br s,2,2NH）,7.69（s,0.7
7,T1 C6 H E−異性体）,7.59（s,0.23,T1 C6 H E−異性
体）,6.3（ps t,1,T2 CH １′）,6.14（m,0.77,T1 CH
１′,E−異性体）,6.08（m,0.23,T1 CH １′,Z−異性
体）,1.80および1.50（2s,6.2 CH 3），および他のプロ
トン。
31P NMR（CDCl3）150.77および150.38（Ｚ−異性
体）,150.57および150.38（Ｅ−異性体）。
保護基を付けた二量体は便利に保管できて、治療上の
価値のあるオリゴマーの中へ特異的に導入する要求があ
るかぎり、自動DNA合成機（ABI 380B）を使用して結合
させるために使用できる。さらに明細書の後の実施例に
より、オキシムが連結する二量体を対応するヒドロキシ
ルアミンの結合をもつ二量体へ還元してこれを次にアル
キル化してヒドロキシメチルアミンまたは他のヒドロキ
シアルキルアミンの結合にすることができる。
実施例14 （３′−CH2−NH−Ｏ−CH2−５′）が連結す
るオリゴヌクレオシドの合成 ３′−デ（オキシホフィニコ）−３′−（メチレンイミ
ノ）チミジリル−（３′→５′）−チミジン 氷AcOH（5ml）中の保護基をつけた二量体３′−デ
（オキシホスフィニコ）−３′−（メチルイジンニトリ
ロ）チミジリル−（３′→５′）−３′−O−（ｔ−ブ
チルジフェニルシリル）チミジン（0.49g,1ミリモル）
の撹拌した溶液へ３回に分けてNaBH3CN（0.19g,3ミリモ
ル）をアルゴン下で室温で加えた。溶液の泡立ちが終わ
るまで、懸濁液を１時間撹拌した。同様な方法で追加の
NaBH3CN（0.19g,3ミリモル）を加えて、撹拌を１時間続
けた。減圧下でAcOHを除去して、３′−デ（オキシホス
フィニコ）−３′（メチレンイミノ）チミジリル−
（３′→５′）−３′−O−（ｔ−ブチルジフェニルシ
リル）チミジンを得た。以前に記述したようにnBu4NF/T
HFおらびHCl/MeOHを用いてこの二量体の保護基を除去し
て、標題の化合物である、３′−デ（オキシホスフィニ
コ）−３′（メチレンイミノ）−チミジリル−（３′→
５′）−チミジン、（0.44g,90％）を白色の粉末として
得た。分析的に純粋なサンプルを得るために（実施例12
の３′−デ（オキシホスフィニコ）−３′−（メチルイ
ジンニトリロ）チミジリル−（３′→５′）−チミジン
二量体について記述したように）この二量体をさらにHP
LCで精製した。
1HNMR（DMSO−d6）δ 11.23（br s,2,2NH）,7.83お
よび7.49（2s,2,2C6 H）,6.82（t,1,NHO）,6.14（擬似t,
1,T2 H １′,J１′,2′＝6.7Hz,J１′,2″＝6.5Hz）,5.9
6（dd,1,T1 H １′,J１′,2′＝6.9Hz,J１′,2″＝4.3H
z）,5.28（s,1,T2 OH）,5.08（s,1,T1 OH）,4.18（m,1,
T2 H ３′）,3.89（m,1,T1 H ４′）,3.54−3.78（m,5,T1
H ５′,5″,T2 H ４′）,2.76、2.96（m,2,T1 H ３″）,
2.42（m,1,T1 H ３′）,2.0−2.17（m,4,T1,T2 H
２′,2″）,1.77および1.74（2s,6,2 CH 3）。
MS FAB:M/Z 496(M+N)+。
C21H29N5O9・H2Oに対する計算値:C,49.12;H,6.09;N,13.
64。実測値:C,48.99;H,5.96;N,13.49。
実施例15 メチル化した［３′−CH2−Ｎ（CH3）−Ｏ−
CH2−５′］が連結するオリゴヌクレオシドの合成 ３′−デ（オキシホスフィニコ）−３′−［メチレン
（メチルイミノ）］チミジリル−（３′→５′）チミジ
ン 氷AcOH（10ml）中の３′−デ（オキシホスフィニコ）
−３′−（メチレンイミノ）チミジリル−（３′→
５′）−３′−O−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）−
チミジンの二量体（0.99g,1ミリモル）の撹拌した溶液
へ水性HCHO（20％,3ml）を加えた。溶液を室温で５分間
撹拌して、これにアルゴン下で室温で３回に分けてNaBH
3CN（0.19g,3ミリモル）を加えた。NaBH3CN（0.19g）の
添加をもう一度繰り返して、溶液をさらに１時間撹拌し
た。反応混合物を濃縮して粗製の３′−デ（オキシホス
フィニコ）−３′−［メチレン（メチルイミノ）］チミ
ジリル−（３′→５′）−３′−O−（ｔ−ブチルジフ
ェニルシリル）チミジンの二量体を得て、これの保護基
を除去して（nBu4NF/THF,HCl/MeOH）、標題の化合物で
ある、３′−デ（オキシホスフィニコ）−３′［メチレ
ン（メチルイミノ）］チミジリル−（３′→５′）チミ
ジン、（0.44g,87％）を白色の固体として得た。分取用
HPLCによって、３′−デ（オキシホスフィニコ）−３′
−［メチレン（メチルイミノ）］チミジリル−（３′→
５′）チミジンの二量体をさらに精製して、分析的に純
粋なサンプルを得た。
1HNMR（DMSO−d6）δ 11.30および11.24（2s,2,2N
H）,7.82および7.50（2s,2,2C6 H）,6.15（擬似t,1,T2 H
１′,J１′,2′＝6.3Hz,J１′,2″＝7.3Hz）,6.00（擬
似t,1,T1 H １′,J１′,2′＝4.2Hz,J１′,2″＝6.1H
z）,5.31（m,1,T2 OH）,5.08（m,1,T1OH）,4.17（m,1,T
2 H ３′）,3.88（m,1,T2 H ４′）,3.57−3.83（m,5,T1
T2 H ５′,5″,T1 H ４′）,2.69（m,2,T1 H ３″）,2.57
（s,3,N−CH 3）,2.50（m,1,T1 H ３′）,2.05−2.14（m,
4,T1 T2 H ２′,2″）,1.79および1.76（2s,6,2 CH 3）。
MS FAB:M/Z 510(M+H)+）。
C23H31N5O9 H2Oに対する計算値:C,50.09;H,6.31;N,13.
28。実測値:C,50.05;H,6.21;N,13.08。
実施例16 ［３′−CH2−Ｎ（CH3）−Ｏ−CH2−５′］
を含むホスホラミデイトが連結するオリゴヌクレオシド
の合成 ３′−デ（オキシホスフィニコ）−３′−［メチレン
（メチルイミノ）］−５′−Ｏ−（ジメトキシトリフェ
ニルメチル）チミジリル−（３′→５′）−３′−Ｏ−
（β−シアノエチルジイソプロピルアミノホスフィリ
ル）チミジン オリゴヌクレオシドの合成：実用的な方法、M.J.ガイ
ド編集、IRL出版、1984年（Oligonucleotide Synthesi
s:a practical approach,Ed.M.J.Gait,IRL Press,198
4）に記述されているように、実施例15の３′−デ（オ
キシホスフィニコ）−３′−（メチレン（メチルイミ
ノ）］−チミジリル−（３′→５′）チミジンの二量体
のトリチル化およびホスフィル化を全体の収量82％で行
った。保護基をつけた二量体をシリカゲルカラムクロマ
トグラフィー（CH2Cl2:MeOH:Et3N;9:1:0.1,v/v）によっ
て精製して、均一なフラクションを合わせて蒸発させ
て、純粋な３′−デ（オキシホスフィニコ）−３′−
［メチレン（メチルイミノ）］−チミジリル−５′−O
−（ジメトキシトリフェニルメチル）−（３′→５′）
−３′−O−（β−シアノエチルジイソプロピルアミノ
ホスフィリル）チミジンを白色の泡沫として得た（DNA
合成のようなものに使用する）。生成物はジアステレオ
マーの混合物として単離した。
31P NMR（CDCl3）δ 149.62および149.00 ppm; 1H NMR（CDCl3）δ 6.22（擬似t,1,T2 H １′,J
１′,2′＝Ｊ１′２″＝6.7Hz）,6.16（擬似t,1,T1 H
１′,J＝１′,2′＝5.8Hz）,2.58,2.56（2s,3,N−C
H 3）,1.82,1.49（2s,6,2 CH 3），及び他のプロトン。
上記の保護基をつけたホスホラミデイトをもつ二量体
は便利に保管することができて、治療上の価値あるオリ
ゴマーの中へ特異的に導入する要求があるかぎり、自動
DNA合成機（ABI 380B）を使用して結合させるために使
用できる。上で言及したメチルイジンニトリロ、すなわ
ちオキシム、およびメチレンイミノ、すなわちアミノヒ
ドロキシは本発明の他の二量体の例として挙げたもので
あって、これらに限定するわけではないが、これらの二
量体をこの実施例と同じ方法で対応するホスホラミデイ
トの誘導体へ変換して、以下に言及するような標準的な
方法でオリゴヌクレオシドの中へ導入する。ヌクレオシ
ドの二量体を連結するオキシムをもつオリゴマーを還元
して、ヌクレオシドの二量体を連結する対応するヒドロ
キシアミンをもつオリゴマーへ変換する。他の実施例で
言及したように、CPGに結合したオリゴマーへの変換を
伴って、またはCPGからの除去の後に還元が行われる。
実施例17 断続する（３′−CH＝Ｎ−Ｏ−CH2−
５′）、すなわちオキシム；（３′−CH2−NH−Ｏ−CH2
−５′）、すなわちアミノヒドロキシ；（３′−CH2−
Ｎ（CH3）−Ｏ−CH2−５′）、すなわちＮ−メチル−ア
ミノヒドロキシ；（３′−CH2−Ｏ−Ｎ（CH3）−CH2−
５′）、すなわちＮ−メチル−ヒドロキシアミノ；また
は（３′−CH2−Ｎ（CH3）−Ｎ（CH3）−CH2−５′）、
N,N−ジメチル−ヒドラジノが連結するオリゴヌクレオ
シドの合成 オリゴヌクレオシドの３′−末端のヌクレオシドにす
るつもりの適当な２′−デオキシヌクレオシドを、ABI
380B自動DNA合成機を使用するためにCPGカラムに結合さ
せる。（３′−CH＝Ｎ−Ｏ−CH2−５′）、すなわちオ
キシム；（３′−CH2−NH−Ｏ−CH2−５′）、すなわち
アミノヒドロキシ；（３′−CH2Ｎ（CH3）−Ｏ−CH2−
５′）、すなわち、Ｎ−メチル−アミノヒドロキシ；
（３′−CH2−Ｏ−Ｎ（CH3）−CH2−５′）、すなわち
Ｎ−メチル−ヒドロキシアミノ；または（３′−CH2−
Ｎ（CH3）−Ｎ（CH3）−CH2−５′）、すなわちN,N′−
ジメチルヒドラジノ結合をもつ二量体を配列中の希望し
た位置または選択した位置へ導入するために、標準的な
ホスホラミダイト化学のプログラムの段階を用いた。
実施例18 ３つのヌクレオシドのサブユニットを使用し
た、ABI 380B DNA合成機による、同一の（３′−CH＝Ｎ
−Ｏ−CH2−５′）または（３′−CH2−NH−Ｏ−CH2−
５′）が連結するオリゴヌクレオシドの合成 サブユニット1: Nucleic Acids Research,18:3813
（1990）の手順にしたがって調製して、オリゴヌクレオ
シドの合成のために３′−末端の単位として使用した、
CPGに結合した５′−O−フタルイミドチミジン。
サブユット2: 適当な塩基を用いた、メチル−３−デ
オキシ−３−C−シアノ−５−O−（フタルイミド）−β
−D−エリスロ−ペントフラノシドの標準的な配糖化お
よびヌクレオシド生成物のDIBAL−Ｈ還元によって誘導
した、２つの官能基をもつ（３′−C−ホルミルおよび
５′−O−フタルイミドデオキシリボヌクレオシド）。
サブユニット3: ５′−O−DMT−３′−C−ホルミル
チミジン、これは最後の（オリゴヌクレオシドの５′−
末端）のヌクレオシドの導入のために使用した。
同一の結合（10μＭスケールで:CPG上のユニット１を
ロードする）を合成するために必要なサイクルの自動化
した段階は以下の通りである： 実施例19 （３′−CH＝Ｎ−Ｏ−CH2−５′）の結合
（３′−CH2−Ｎ−Ｈ−Ｏ−CH2−５′）への変換のため
の一般的なおよび特異的なNaBH3CN還元 二量体の還元 氷酢酸（AcOH）（5ml）中の二量体（0.49g,1ミリモ
ル）の溶液へ、AcOH（1ml）中のシアノボロハイドライ
ドナトリウム（0.19g,3ミリモル）をアルゴンのガスの
下で、室温で加えた。懸濁液を１時間撹拌して、AcOH
（1ml）中のNaBH3CNを追加して、撹拌を１時間続けた。
過剰のAcOHを減圧下で室温で除去した。残渣をトルエン
（２×50ml）とともに蒸発させて、シリカゲル（25g）
カラムクロマトグラフィーによって精製した。CH2lCl2:
MeOH（9:1,v/v）を用いて溶出させて、適当なフラクシ
ョンを合わせて、その後に蒸発させて0.36g（75％）の
固体の二量体を得た。
オリゴヌクレオシドの還元 CPGに結合したオリゴヌクレオシド（１μＭ）は１つ
（またはそれ以上の）の修飾された結合の骨格をもって
おり、これを合成のサイクルの完了後にDNA合成機から
取りはずす。THF:AcOH（10ml,1:1v/v）中の1.0M NaBH3C
Nの溶液をCPGに結合した物質から、30分間で注射器の技
術を用いた標準的な方法を汲み出す。THF（50ml）を用
いてカラムを洗浄して、還元したオリゴヌクレオシドを
標準的な方法で支持体のカラムから放出させる。
オリゴヌクレオシドの他の方法による還元 上記の還元に代わるものとして、CPGの支持体から除
去した後に還元を行うこともできる。合成が完了したと
きに、オリゴヌクレオシドを標準的な手順でCPGの支持
体から除去する。５′−O−トリチル−オン オリゴヌ
クレオシドをHPLCによって精製して、次に上に記述した
ようにNaBH3CN/AcOH/THFの方法によって還元する。
実施例20 ５′末端のヌクレオシドとして２′,3′−ジ
デヒドロヌクレオシドをもち、（３′−CH2−Ｎ（CH3）
−Ｏ−CH2−５′）が連結するオリゴヌクレオシドの合
成 ３′−デ（オキシホスフィニコ）−２′,3′−ジデヒド
ロ−３′−［メチレン（メチルイミノ）］チミジリル−
（３′→５′）チミジン １［５′−O−（MMTr）−β−D−グリセロペントフラ
ン−３′−ウロシル］チミン（0.13ミリモル;T.−C.ウ
ー（T.−C.Wu）ら,Tetrahedron,45:855（1989）の手順
にしたがって調製した）、５′−O−（メチレンアミ
ノ）−３′−O−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）チミ
ジン（0.13ミリモル;F.デバート（F.Debart）ら,Tet.Le
tters,33,印刷中，（1992）の手順にしたがって調製し
た）、エチレングリコール（0.5ミリモル）、およびHMP
A（0.5ml）の撹拌した溶液へTHF（0.1モル,3ml,3ミリモ
ル）中のSmI2を室温で加えた。反応が進行するにつれ
て、SmI2の色が消えて、希望する付加物を生成する。出
発原料が完全になくなった後に、反応混合物を通常の方
法で後処理する。（生成物は同定のためにシリカカラム
クロマトグラフィーによって精製することができるだろ
う）。これらの実施例の他の所で記述したように、３′
−エピマーの付加物の粗製の混合物を次にアルキル化し
た（HCHO/NaCNBH3/AcOH）。次にメチル化した生成物を
ピリジン中の塩化メチルスルホニルで処理して、３′−
エピマーのメシレートを得て、これを塩基で処理すると
標題の化合物を得るだろう。
実施例21 （３′−CH2−CH2−NH−CH2−５′）が連結
するオリゴヌクレオシドの合成 ３′−デ（オキシホスフィニコ）−３′−（1,2、エタ
ンジイルイミノ）−チミジリル−５′−Ｏ−（ｔ−ブチ
ルジメチルシリル）−（３′→５′）−３′−Ｏ−（ｔ
−ブチルジフェニルシリル）−５′−デオキシチミジン アルデビト［2.5g,6.5ミリモル，フィアンダー,J.（F
iandor,J.）およびタム,S.Y.（Tam,S.Y.）,Tetrahedron
Letts.,33:597（1990）に記述されている手順にしたが
って新しく調製した］、５′−アミノ−３′−O−（ｔ
−ブチルジフェニルシリル）−５′−デオキシチミジン
［3.13g,6.5ミリモル，はた（Hata）ら,J.Chem.Soc.Per
kin I,p.306（1980）の方法による５′−アジド−５′
−デオキシチミジンの３′−Ｏ−シリル化および、プー
パイコ（Poopeiko）ら,Syn.Lett.,p342（1991）の方法
による、生成物の後の還元を介した２段階で調製した］
の撹拌した溶液に、ジクロロエタン（65ml）中のAcOH
（0.39g,および6.5ミリモル）を加えて、その後にアル
ゴン下でNaBH(OAc)3（2.759g,13.08ミリモル）を加え
た。懸濁液を３時間室温で撹拌した。この反応混合物を
CH2Cl2（250ml）で希釈して、水（２×100ml）で洗浄し
た。有機層を乾燥させて（MgSO4）、濃縮して、シロッ
プとして粗製の生成物を得た。生成物をシリカゲルカラ
ムクロマトグラフィーで精製して、白色の泡沫として標
題の化合物を得た（3.5g,64％）。
1H NMR（CDCl3）δ 0.1［s,6,Si(CH 3)2］,0.9および
1.1［2s,18,2Si（CH 3)3］,1.85および1.95（2s,6,2 C
H 3）、2.5（m,2,3″CH 2）,3.7（m,2,5′CH 2）,4.0（m,
2,3′,4′CH）,4.2（m,1,3′CH）,6.05（m,1,1′H）,6.
28（t,1,1′H）,7.1および7.57（2s,2,C6 H）,7.35−7.7
［2m,12,Si ArH)2］，および他の糖のプロトン。
３′−デ（オキシホスフィニコ）−３′−（1,2−エタ
ンジイルイミノ）チミジリル（３′→５′）−５′−デ
オキシチミジン THF中の(Bu)4NFを用いた標準的な手順にしたがって、
保護基をつけた二量体から81％の収量で保護基をはずし
た。分析のために保護基をはずした二量体をHPLCによっ
て精製した。
1H NMR（DMSO−d6）δ 1.76および1.78（2s,6,C
H 3）,2.0−2.2（3m,4,2′CH 2）,3.15（m,2,NCH 2）,3.56
（m,2,4′H,5′CH 2）,4.18（br s,1,3′H）,5.17および
5.22（2 br s,2,2 OH）,5.95（t,1,1′H）、6.1（t,1,
1′H）,7.6および7.85（2s,2,2 （C6 H）、11.25（br s,
2 2NH）および他のプロトン。
実施例22 ２つの官能基をもつヌクレオシドの合成 実施例18のサブユニット２の方法に代わる方法 ３′−デオキシ−３′−Ｃ−［（メトキシイミノ）メチ
ル］−チミジン ３′−デオキシ−３′−C−ホルミル−５′−O−トリ
チルチミジン（0.59g,1ミリモル、実施例４により、CH2
Cl2:MeOH（2:2、30体積）中で調製した）の撹拌した溶
液へAcOH（0.5ml）およびメトキシアミン塩酸塩（0.189
g,2.2ml）を室温で加えた。混合物を30分間撹拌して、
真空下で濃縮して、残渣をMeOH（20ml）に溶解した。こ
の溶液へ濃縮したHCl（0.1ml）を加えて１時間撹拌し
た。この溶液をNH4OH（2ml）で中和して、真空下で濃
縮して、チミジンの３′−C−［（メトキシイミド）メ
チル］誘導体を得た。
1H NMR（CDCl3）δ 9.67（s,1,NH）,7.67（s,1,H−
６）,7.33（d,0.70,H−３″Ｅ−異性体）,6.65（d,0.3
0,H−3,Z−異性体）,6.15（m,1,H−１′）,3.60−4.12
（m,3.3,H−４′，H−５′,5″，H−３′Ｚ−異性体）,
3.91（s,0.9,OCH 3 Z−異性体）,3.82（s,2.1,OCH 3，オ
キシムＥ−異性体）,3.26（m,0.7,H−３′Ｅ−異性
体）,2.27−2.60（m,2,H−２′,2″）,1.91（2s,3,C6CH
3）。
３′−デオキシ−３′−Ｃ−［（メトキシイミノ）メチ
ル］−５−メチルシチジン 上記のチミジンと同様の方法で５−メチルシチジンのア
ナログを調製した。
1H NMR（CDCl3）δ 7.82（s,0.34,H−6 Z異性体）,
7.75（s,0.66,H−6 E 異性体）,7.32（d,0.66,H−３″
E 異性体,J３′,3″＝6.63Hz）,6.64（d,0.34,H−
３″ Z異性体,J３′,3″＝6.8Hz）,6.12（m,1,H−１）,
3.50−4.15（m,3.34,H−４′，H−５′５″，H−３′Ｚ
異性体）,3.91（s,1.02,OHH 3，オキシム Ｚ異性
体）,3.83（s,1.98,OCH 3，オキシム Ｅ異性体）,3.20
（m,0.66,H−３′ Ｅ異性体）,2.3−2.6（m,2,H−
２′,2″）,1.92および1.94（2s,3,C5CH 3 EおよびＺ異
性体）。
３′−デオキシ、３′−Ｃ−［（メトキシイミノ）メチ
ル］−５′−Ｏ−フタルイミドチミジン Ph3P,N−ヒドロキシフタルイミドおよびDEAD（光延条
件）を用いて３−デオキシ−３′−C−［（メトキシイ
ミノ）メチル］−チミジンを処理して、５′−O−フタ
ルイミドチミジンの誘導体を得た。
1H NMR（CDCl3）δ 8.45（br s,1,NH,7.4−８（m,
5.64,芳香族H，H−6,C３″ H−N E異性体）,6.72（d,0.3
6,H−３″ Z異性体）,6.15（m,1,H−１′）,4.4−4.65
（m,3,H−４′，H−５′,5″）,4.25（m,0.36,H−３′
Z異性体）,3.92（s,1.08,OCH 3オキシムＺ 異性体）,3.
85（s,1.92,OCH 3オキシム Ｅ異性体）,3.46（m,0.64,H
−３′ Z異性体）,2.30−2.60（m,2,H−２′,2″）,1.9
7（2s,3,C5CH 3）。
３′−デオキシ−３′−Ｃ−（ホルメルメチルオキシ
ム）−５′−フタルイミド−５−メチルシチジン 上記のチミジンと同様の方法で５−メチルシチジンのオ
ナログを調製した。
1H NMR（CDCl3）δ 7.7−7.95（m,5,芳香族H，H−
６）,7.40（d,0.65,H−３″ E異性体,J３′,3″＝5.87H
z）,6.69（d,0.35,H−３″ Z異性体,J３′,3″＝6.3H
z）,6.16（m,1,H−１′）,4.35−4.70（m,3,H−４′，H
−５′,5″）,4.30（m,0.35,H−３′ Z異性体）,3.88
（s,1.0.5,OCH 3 Ｚ異性体）,3.81（s,1.95,OCH 3Ｅ異性
体）,3.26（m,0.65,H−３′ E異性体）,2.30−2.65（m,
2,H−２′,2″）,2および1.98（2s,C5 H 3 ZおよびＥ 異
性体）。
３′−デオキシ−３′−Ｃ−ホルミル−５′−Ｏ−フタ
ルイミドチミジン ３′−デオキシ−３′−C−［（メトキシイミノ）メ
チル］−５′−O−フタルイミドチミジンをMeOH中のCH3
CHOで処理して、３′−C−ホルミル基を再生した。シノ
カゲルカラムクロマトグラフィーによって精製して生成
物から、３段階の全体の収量81％で、均一な物質として
標題の化合物を得た。
1H NMR（CDCl3）δ 9.95（s,1,CH＝Ｏ）,8.62（br
s,1,NH）,7.71−7.90（m,5,芳香族H，H−６）,6.06（t,
1,H−１′,J１′,2′＝6.61Hz,J１′,2′＝6.6Hz）,4.3
6−4.73（m,3,H−４′，H−５′,5″）,3.78（m,1,H−
３′）,2.20−2.90（m,2,H−２′,2″）,1.98（s,3,C5C
H 3）。
実施例23 溶液相化学を用いた、同一の３′−CH＝Ｎ−
Ｏ−CH2−５′または３′−（CH2−NH−Ｏ−CH2−５′
または３′−CH2−Ｎ（CH3）−Ｏ−CH2−５′が連結す
る四量体の合成 ３′→５′伸長 ３′−デオキシ−３′−C−ホルミル−５′−Oフタル
イミドチミジンの５′−O−アミノ−３′−O−（ｔ−ブ
チルジフェニルシリル）チミジンとの（実施例12に記述
したような）標準的な結合によって、３′−デ（オキシ
ホスフィニコ）−３′−（メチルイジンニトリロ）−チ
ミジリル−５′−O−フタルイミド−（３′→５′）−
３′−O−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）チミジンを
得た。メチルヒドラジンで処理したときの後半の生成物
から（実施例11で記述したように）、５′−O−NH2−Ｔ
−３′−CH＝Ｎ−Ｏ−CH2−５′−Ｔ−３′−O−TBDPSI
を得て、これを５′−O−Phth−Ｔ−３′−CHOとさらに
結合させて、全体で83％の収量で三量体５′−O−Phth
−Ｔ−３′−CH＝Ｎ−Ｏ−CH2−５′−Ｔ−３′−CH＝
Ｎ−Ｏ−CH2−５′−Ｔ−３′−O−TBDPSiを得た。NaBH
3CN/AcOHを用いた実施例14にしたがってこの四量体を還
元して、５′−O−Tr−Ｔ−３′−CH2NH−Ｏ−CH2−
５′−Ｔ−３′−CH2−NH−Ｏ−CH2−５′−Ｔ−３′−
CH2−NH−Ｏ−CH2−５′−Ｔ−O−３′−TBDPSiを得
た。HCHO/NaBH3CN/AcOHを用いて、還元した四量体をさ
らに還元的にアルキル化して、５′−O−Tr−Ｔ−３′
−CH2−Ｎ（CH3）−Ｏ−CH2−５′−Ｔ−３′−CH2−Ｎ
（CH3）−Ｏ−CH2−５′Ｔ−３′−CH2−Ｎ（CH3）−Ｏ
−CH2−５′−Ｔ−３′−O−TBDPSiを得た。メチル化し
た四量体から、HClを用いて最後に保護基を除去して、n
(Bu)4NF処理を行って全体の収量79％でフリーの四量体
である５′−OH−Ｔ−３′−CH2−Ｎ（CH3）−Ｏ−CH2
−５′−Ｔ−３′−CH2−Ｎ（CH3）−Ｏ−CH2−５′−
Ｔ−３′−CH2−Ｎ（CH3）−Ｏ−CH2−５′−Ｔ−３′
−OHを得た。逆層カラム（スペルコシルLC18 5μ（Supe
lcosil LC18 5μ）、15cm×4.5cm）およびH2O→CH3CN
（H2：CH3CN,95:5、１分;8:2,20分;7:3,30分;2:8;40分/
ml）勾配を用いた溶出を使用したHPLCによって四量体を
精製した。溶出した全体の生成物の86％に相当する唯一
の分離したピークとして、四量体は26、96分後に溶出し
た。26−27.5分のフラクションをまとめて、凍結乾燥し
て、白色の粉末を得た。四量体の正確な分子量をMS FAB
によって決定した:m/z 1045(M+H)+。上で言及したよう
に、NMRデータに関しては５′末端から３′末端へ環の
番号をつけた。1 H NMR（D2O,40℃）TOSEY（30,100M秒混合） ユニットT4 H−１′ 6.36 H−２′,2″ 2.53 H−３′ 4.55 H−４′ 4.22 H−５′,5″ 4.04,4.18 H−６ 7.05 ユニットT3 H−１′ 6.22 H−２′ 2.52 H−２″ 2.71 H−３′ 2.90 H−３″ 2.91,2.97 H−４′ 4.12 H−５′,5″ 4.04,4.23 H−６ 7.18 C5CH 3 1.88 ユニットT2 H−１′ 6.23 H−２′ 2.52 H−２″ 2.71 H−３′ 2.91 H−３″ 2.91,2.97 H−４′ 4.12 H−５′,5″ 4.04,4.23 H−６ 7.14 C5CH 3 1.88 ユニットT1 H−１′ 6.26 H−２′ 2.54 H−２″ 2.73 H−３′ 3.03 H−３″ 3.03,2.93 H−４′ 4.06 H−５′,5″ 4.05,3.90 H−６ 7.26 C5CH 3 1.90 Ｎ−CH 3 骨格 幅の広い 2.83 上記の溶液相の反応物を容易にABI 380B DNA合成機に移
して、上述のように３−ヌクレオシドのサブユニニット
を使用することができる。
実施例24 （３′−CH2−Ｏ−Ｎ＝CH−５′）、（３′
−CH2−Ｏ−NH−CH2−５′）および（３′−CH2−Ｏ−
Ｎ（CH3）−CH2−５′）結合のための単量体のユニット
の合成 １−［３′−デオキシ−３′−Ｃ−（ヒドロキシメチ
ル）５′−Ｏ−（トリチル）−β−Ｄ−エリスロ−ペン
トフラノシル］−チミン NaBH4（1.36g,9.6ミリモル）の懸濁液を、EtOH:H2O
（22ml,3:1,v/v）混合液中の３′−C−ホルミル−５′
−O−トリチルチミジンの撹拌した溶液へ１滴づつ室温
で加えた。３時間後に、EtOAc（300ml）を加えて、有機
層をH2O（２×150ml）で洗浄した。乾燥した（MgSO4）E
tOAc抽出物を減圧下で蒸発して、残渣をシリカゲルカラ
ムクロマトグラフィーによって精製した。CH2Cl2:MeOH
（9:1,v/v）を用いて溶出させて、適当なフラクション
を合わせて濃縮して、標題の化合物（1.13g,83％）を得
た。
1H NMR（CDCl3）δ 8.29（br s,1,NH）,7.59（s,1,C
6 H）,7.47−7.22（m,15,TrH）,6.13（dd,1,H １′,J
１′,2′＝6.5Hz）,3.98（m,1,H ４′）,3.62（m,2,H
３″,3.56−3.33（m,2,H ５′，H ５″）,2.60（m,1,H
３′）,2.33−2.20（m,2,H ２′，H 2′）,1.91（br s,1,
OH）,1.53（s,3,CH 3）。
１−［３′−デオキシ−３′−Ｃ−［Ｏ−（フタルイミ
ドヒドロキシメチル）］−５′−Ｏ−トリチル−β−Ｄ
−エリスロ−ペントフラノシル］−チミン アゾ二カルボン酸二イソプロピル（0.47ml,2.41ミリ
モル）を、乾燥THF（10ml）中の３′−デオキシ−３′
−C−（ヒドロキシメチル）５′−O−トリチル−チミジ
ン（0.8g,1.62ミリモル）、Ｎ−ヒドロキシフタルイミ
ド（0.35g、2.15ミリモル）、トリフェニルホスフィン
（0.56g,2.15ミリモル）の撹拌した溶液へ室温で加え
た。48時間後に、生成物を濃縮して残渣をCH2Cl2（２×
100ml）で抽出した。CH2Cl2抽出物をNaHCO3（５％,100m
l）で、次に水（100ml）で洗浄した。乾燥した（MgS
O4）抽出物を減圧下で蒸発させて、残渣を短いシリカゲ
ルカラムクロマトグラフィーによって精製した。EtOAc:
ヘキサン類（1:1,v/v）で溶出して、適当なフラクショ
ンを合わせて濃縮して、白色の泡沫として標題の化合物
を得た。
1H NMR（CDCl3）δ 8.24（s,1,NH）,7.85−7.20（m,
20,TrH，ArH，C6 H）,6.20（m,,1,H １′）,4.22−4.16
（m,3,H ４′，H ３″）,3.63−3.40（m,2,H ５′，
H ５″）,3.02（m,1,H ３′）,2.50−2.43（m,2,H ２′，H
２″）,1.51（s,3,CH 3）。
C33H33N3O7・0.5 EtOAcに対する計算値:C,69.86;H,5.4
2;N,6.11。実測値C,70.19;H,5.27;N,5.75。
１−｛３′−デオキシ−３′−Ｃ−［Ｏ−（アミノヒド
ロキシメチル）］−５′−Ｏ−トリチル−β−Ｄ−エリ
スロ−ペントフラノシル｝−チミンメチルヒドラジン
（0.12ml,2.25ミリモル）を、乾燥CH2Cl2（9ml）中の
３′−デオキシ−３′−C−［Ｏ−（フタルイミドヒド
ロキシメチル）］−５′−O−トリチルチミジン（0.77
g,1.2ミリモル）の撹拌した溶液へ室温で加えた。１時
間後に、沈殿を濾過して、残渣をCH2Cl2（２×10ml）で
洗浄した。まとめた濾液を濃縮して、残渣をシリカゲル
カラムクロマトグラフィーによって精製した。CH2Cl2:M
eOH（97:3,v/v）を用いて溶出して、適当なフラクショ
ンを合わせて蒸発させて、白色の粉末として標題の化合
物を得た（0.43g,70％）。
1H NMR（CDCl3）δ 8.59（br s,1,NH）,7.66（m,1,C
6 H）,7.40−7.15（m,15,TrH）,6.06（擬似t,1,H １′）,
5.22（br s,2,NH 2）,3.89（m,1,H ４′）,3.65−3.20
（m,4,H ５′，H ５″，H ３″）,2.81（m,1,H ３′）,2.21
−2.13（m,2,H ２′，H ２″）,1.37（s,3,CH 3）。
実施例25 （３′−CH2−Ｏ−Ｎ＝CH−５′）、（３′
−CH2−Ｏ−NH−CH2−５′）および（３′−CH2−Ｏ−
Ｎ（CH3）−CH2−５′）が連結するオリゴヌクレオチド
の合成 ３′−デ（オキシホスフィニコ）−３′−［メチレンオ
キシ（メチルイミノ）］チミジリル−（３′→５′）−
５′−デオキシチミジン １−［４−C−ホルミル−３−O−（ｔ−ブチルジフェ
ニルシリル）−β−Ｄ−エリスロ−ペントフラノシル］
チミン［１ミリモル,Nucleosides and Nucleotides,9:5
33（1990）の手順にしたがって調整した］、３′−デオ
キシ−３′−C−［（Ｏ−（アミノヒドロキシメチ
ル）］−５′−O−トリチルチミジン（１ミリモル）、A
cOH（0.1ml）、および乾燥CH2Cl2（25ml）の混合物を室
温で１時間撹拌した。溶媒を蒸発させて、残渣を氷AcOH
（5ml）に溶解した。NaBH3CN（３ミリモル）を撹拌した
AcOHの反応混合物へ加えた。１時間後に、NaBH3CN（３
ミリモル）を追加して、混合物を１時間撹拌した。反応
物を真空下で濃縮して、残渣をシリカゲルカラムクロマ
トグラフィーによって精製して、５′−O−Tr−Ｔ−
３′−CH2−Ｏ−NH−CH2−５′−Ｔ−３′−O−TBDPSi
の二量体を得た。
1H NMR（CDCl3）δ 8.73（br,s,2,2NH）,7.67（s,1,
C6 H）,7.674−7.23（m,20,TrH，TBDPhH、6.96（s,1,C
6 H）,6.23（擬似t,1,T2 H １′）,6.11（擬似t,1,T1,H
１′）,5.51（br s,1,NH）,4.16（m,1,T2 H ３′）,4.02
（m,1,T2 H ４′）,3.87（m,1,T1 H ４′）,3.52（m,3,T1
CH 23″,T1 H ５″）,3.23（m,1,T1 H５′）,2.55−2.76
（m,3,T1 H ３′,T2 H ５′，H ５″）,2.33−2.27（m,1,T
2 H ２′）,2.23−2.12（m,2,T2 H 2 H ２″）,1.95−1.8
5（m,1,T2 H ２″）,1.83（s,3,CH 3）,1.45（s,3,CH 3）,
1.06（s,9,(CH 3)3CSi）。
HCHO/NaBH3CN/AcOHを用いて最後の二量体をメチル化
して、最後に２段階でnBu4NF/THFおよびHF/CH3CNを用い
て保護基を除去して、標題の化合物を得た（収量65
％）。
1H NMR（DMSO−d6）δ 11.27（br s,2,NH）,7.85
（s,1,T1 C6 H）,7.51（s,1,T2 C6 H）,6.15（擬似t,1,T2
H １′,J１′−２′＝7.8Hz,J１′−２′＝6.3Hz）,6.0
0（擬似t,1,T1 H １′,J１′−２″＝6.9Hz,J１′−２″
＝4.5Hz）,5.32（br s,1,OH ３′）,5.09（br s,1,OH
５′）,4.17（m,1,T2 H ３′）,3.90（m,1,T2 H 4）,3.76
−3.66（m,4,T1 H ４′,T1 H ５′，CH2 ３″）,3.60−3.5
2（m,1,T1 H ５″）,2.82（m,2,T2 H ５′，H ５″）,2.57
（s,3,N−CH3）,2.47（m,1,T1 H ３′）,2.23−2.02（m,
4,H ２′ H ２″）,1.81（s,3,C5CH 3）,1.78（s,3,C5 C
H 3）。
C22H31N5O9・0.5 H2Oに対する計算値:C,5096;H,6.22;N,
13.50。実測値:C,51.01;H,6.22;N,13.19。MS（FAB＋，
グリセロール）Ｍ＋H+m/z＝510。
実施例26 （３′−CH2−Ｏ−Ｎ（CH3）−CH2−５′）
を含むホスホラミデイトが連結するオリゴヌクレオシド
の合成 ３′−デ（オキシホスフィニコ）−３′−［メチレンオ
キシ（メチルイミノ）］−チミジリル−５′−Ｏ−（ジ
メトキシトリフェニルメチル）−（３′→５′）−３′
−（Ｏ−β−シアノエチルジイソプスピルアミノホスフ
ィリル）チミン オリゴヌクレオチドの合成：実用的な方法、M.J.ガイ
ド編集、IRL出版,1984年（Oligonucleotide Synthesis:
a practical approach,Ed.M.J.Gait,IRL Press,1984）
に記述された手順にしたがって、二量体の５′−OH−Ｔ
−３′−CH2−Ｏ−NCH3−CH2−５′−Ｔ−３′−OHをジ
メトキシトリチル化して、５′−O−DMTrで保護した二
量体を白色の泡沫として得た。
1H NMR（CDCl3）δ 7.67（s,1,H 6）,7.44−6.82（m,
14,H 6，DMTrH）,6.20（擬似t,2,H １′）,4.3（m,1,T2 H
３′）,4.15（m,1,T2 H ４′）,4.00（m,1,T1 H ４′）,
3.80（s,6,OCH 3）,3.77−3.23（m,4,T1 H ５′ H ５″，CH
2 ３″）,2.89−2.50（m,3,T2 H ５′ H ５″,T1 H ３′）,
2.62（s,3,N−CH 3）,2.48−2.08（m,4, H ２′ H ２″）,
1.9（s,3,C5CH 3）,1.48（s,3,C5CH 3）。
オリゴヌクレオチドの合成：実用的な方法、M.J.ガイ
ド編集、IRL出版,1984年（Oligonucleotide Synthesis:
a practical approach,Ed.M.J.Gait,IRL Press,1984）
に記述された手順にしたがって、上記の化合物をホスフ
ィチル化して、２段階に関しては70％の収量で標題の化
合物を白色の粉末として得た。
1H NMR（CDCl3）δ 8.25（br s,2,NH）,7.66（s,1,C
6 H）,7.15−7.45（m,10ArH，C6 H）,6.8−6.9（m,4,Ar
H）,6.12（m,2,2C１′，H）,3.79（s,6,ArOCH 3）,2.56
（s,3,N−CH 3）,1.88,1.44（2s,6,2 C5 CH 3），および
他のプロトン。
31P NMR（CDCl3）149.42および148.75ppm。
実施例27 その中に位置して薬物動態学および薬力学の
性質を含む結合をもつオリゴヌクレオチドの合成 ３′−デ（オキシホスフィニコ）−３′−［メチレン
（ベンジルイミノ）］−チミジリル−５′−Ｏ（ジメト
キシフェニルメチル）−（３′→５′）−３′−Ｏ−β
−（シアノエチルジイソプロピルアミノホスフィリル）
チミジン 実施例12に記述したように３′−デオキシ−３′−C
−ホルミル−５′−O−トリチルチミジン（1.5ミリモ
ル）を５′−O−アミノ−３′−O−（ｔ−ブチルジフェ
ニルシリル）チミジン（1.5ミリモル）と還元的に結合
して、５′−O−Tr−Ｔ−３′−CH2−NH−Ｏ−CH2−
５′−Ｔ−３′−O−TBDPSiの二量体を得た。上述のメ
チル化と同じ方法でC6H5CHO／NaBH3CN/AcOHを用いて二
量体をベンジル化して、Ｎ−ベンジル化二量体である、
５′−O−Tr−Ｔ−３′−CH2−NBz−Ｏ−CH2−５′−Ｔ
−３′−O−TBDPSiを得た。上記の実施例で記述したよ
うにnBu4NF/THFおよびHCl/MeOHの方法論を用いて、最後
の二量体から保護基を除去して、保護基のはずれた二量
体である、５′−OH−Ｔ−３′−CH2−NBn−Ｏ−CH2−
５′−Ｔ−３′−OHを得て、オリゴヌクレオチドの合
成：実用的な方法、M.J.ガイド編集、IRL出版,1984年
（Oligonucleotide Synthesis:a practical approach,E
d.M.J.Gait,IRL Press,1984）に記述された手順にした
がって、これをジメトキシトリチル化して、その後にホ
スフィチル化して、標題の化合物を得た（全体の収量45
％）。
1H NMR（CDCl3）δ 6.15（擬似t,1,T2 C１′ H）,
6.09（m,1,T1 C１′ H）,3.76（s,6,2OCH 3）,1.7およ
び1.48（2s,6,2−CH 3）および他のプロトン。
31P NMR（CDCl3） 149.59および149.23ppm。
オリゴヌクレオチドのDNA合成の前に、様々な薬物動
態学および薬力学の性質のある修飾基を骨格の結合中へ
取り込ませる能力を説明した実施例８の方法で、自動DN
A合成機を用いてホスフィチル化した二量体をオリゴマ
ーの中へうまく導入した。
実施例28 （３′−CH2−NH−CH2−５′）、（３′−CH
2−Ｎ（CH2）−CH2−CH2−５′）、およびホスホラミデ
イト誘導体 ３′−デ（オキシホスフィニコ）−３′−［（メチレン
イミノ）］−５′−Ｏ−（ジメトキシトリチル）チミジ
リル−（３′→５′）−チミジン AcOHの存在下で１［６′−アミノ−２′,5′,6′−ト
リデオキシ−３′−O−（ｔ−ブチルフェニルシリル）
−β−D−エリスロ−ヘキソフラノシル］チミン［1.2ミ
リモル、G.エト ゾルド（G.Et Zold）ら,J.C.S.Chem.C
omms.,422（1968）の手順にしたがって調製した］を用
いて３′−デオキシ−３′−C−ホルミル−５′−O−ト
リチルチミジン（１ミリモル）を還元的にアミノ化して
［A.F.アドベル−マジッド（A.F.Adbel−Magid）ら,Tet
rahedron Letts.31:5595（1990）の手順にしたがっ
た］、保護基のついた二量体である、５′−O−Tr−Ｔ
−３′−CH2NH−CH2−CH2−５′−Ｔ−３′−O−TBDPSi
を得て、上記の実施例の中で記述したようにこれの保護
基を除去して５′−OH−Ｔ−３′−CH2−NH−CH2−CH2
−５′−Ｔ−３′−OHの二量体を白色の粉末として得た
（収量70％）。
1H NMR（D2O,pH5.6,20℃）δ T1チミジン単位:7.78
（s,1,C6 H）,6.17（t,1,C1 H）,4.45（m,1,C３′ H）,
4.08（m,1,C４′ H）,4.00,3.72（m,2,C５′,5″
H）,2.9（m,2C６′,6″ H）,2.34（m,2,C２′,2
H）、1.77（s,3,CH 3）,T2チミジン単位:7.47（s,1,C
6 H）,6.07（t,1,C１′ H）,3.89（m,2,C５′５″）,3.
79（m,1,C４′ H）,2.89（m,1,C３″ H）,2.38（m,1,
C２′ H）,2.32（m,1,C３′ H）,1.72（s,3,CH 3），
および2.68（s,N−CH 3）。
pKaの決定 骨格のアミンのpKaの指標として、前記二量体のＮ−M
e基のプロトンのケミカルシフトの、pHの変化に応答し
た変化への反応性をNMRによって測定した。アミノ基に
プロトンが結合するにつれて、ケミカルシフトは低磁場
へ移動した。５′−OH−Ｔ−３′−CH2−NCH3−CH2−CH
2−５′−Ｔ−３′−OHの二量体のサンプル4mgを30mMの
重炭酸塩の緩衝液0.6mlに溶解した。0.1N NaOHを用いて
６段階でpHを5.1から10.0の間で変動させた。Ｎ−メチ
ルのプロトンのケミカルシフトは2.26ppmから2.93ppmの
間で変動し、pKaは7.8±0.1であると決定した。私達は
理論に縛られたくないのだが、したがって生理学的なpH
ではこの骨格にはプロトンが結合していると信じる。
３′−デ（オキシホスフィニコ）−３′−［メチレン
（メチルイミノ）メチレン］−５′−Ｏ−（ジメトキシ
トリチル）−チミジリル−（３′→５′）−３′−Ｏ−
（β−シアノエチルジイソプロピルアミノホスフィリ
ル）チミジン AcOH中のHCHO/NaBH3CNを用いて前述の二量体をメチル
化して、５′−OH−Ｔ−３′−CH2−Ｎ（CH3）−CH2−C
H2−５′−Ｔ−３′−OHを得て、オリゴヌクレオチドの
合成：実用的な方法、M.J.ガイド編集、IRL出版,1984年
（Oligonucleotide Synthesis:a practical approach,E
d.M.J.Gait,IRL Press,1984）に記述された手順にした
がって、これをジメトキシトリチル化およびホスフィチ
ル化して、泡沫として標題の化合物を得た（68％）。
1H NMR（CDCl3δ 6.12（m,2,2C１′ H）,2.15,2.14
（2s,3,N−CH 3）,1.88,1.45（2s,6,2 C5CH 3）および他
のプロトン。
31P NMR（CDCl3） 149.49および148.96ppm。
実施例29 （３′−CH2−NH−Ｏ−CH2−５′）結合の再
生のための不安定なＮ−保護基をもつ３′−デ（オキシ
ホスフィニコ）−３′−（メチレンイミノ）−（３′→
５′）結合を含んだ、（３′−CH2−Ｎ（不安定な保護
基）−Ｏ−CH2−５′）の二量体およびホスホラミディ
ト誘導体−二量体 ３′−デ（オキシホスフィニコ）−３′−［メチレン
（フェノキシアセチルイミノ）］チミジリル）−（３′
→５′）−チミジン 乾燥ピリジン（10ml）の中の５′−O−Tr−Ｔ−３′
−CH2−NH−Ｏ−CH2−５′−Ｔ−３′−O−TBDPSi（１
ミリモル,F.デバート（F.Debart）ら,Tetrahedron Lett
s.,33:印刷中、1992年の手順にしたがって調製した）撹
拌した溶液へ塩化フェノキシアセチル（1.2ミリモル）
を加えた。12時間後に、生成物をCH2Cl2（20ml）で希釈
して、飽和NaHCO3（２×500ml）、水（２×50ml）で洗
浄して、乾燥させた（MgSO4）。CH2Cl2抽出物を濃縮し
て、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによっ
て精製した。CH2Cl2:MeOH（9:1,v/v）を用いて溶出し
て、適当なフラクションを合わせて蒸発させて、白色の
泡沫として５′−O−Tr−Ｔ−３′−CH2−Ｎ（COCH2OP
h）−Ｏ−CH2−５′−Ｔ−３′−O−TBDPSiの二量体を
得た。
1H NMR（DMSO−d6）δ 11.35（br s,2,NH）,7.6−6.
65（m,32,Tr,TBDPS,フェノキシアセチル，C6 H）,6.3
（擬似t,1,H １′）,6.03（擬似t,1,H １′）,4.5（m,2,C
H 2）,4.3（m,1,T2 H 3）,3.9−3.3（m,6,T1 H ４′,T2 H
４′,T2 H ５′ H ５″，CH ２ ３″）,3.10（m,2,T,H
５′ H ５″）,2.65（m,1,T1 H ３′）,2.2−2.05（m,4,
H ２′ H ２″）,1.58（s,3,CH 3）,1.4（s,3,CH 3）,1.02
（s,9,(CH 3)3CSi）。
トリチル基を除去するためにHF（48％）／CH3CN（5:9
5,v/v）処理によって前記の二量体から連続して保護基
を除き、nBu4NF/THFを用いた処理の生成物からシリル基
を除去して、白色の粉末として標題の化合物を得た（３
段階で70％）。
1H NMR（DMSO−d6）δ 11.35（br s,1,NH）,11.25
（br s,1,NH）,7.92（s,1,C6 H）,7.5（s,1,C6 H）,7.2−
6.8（m,5,ArH）,6.23（擬似t,1,H １′）,5.98（dd,1,H
１′）,5.45（d,1,OH ３′）,5.15（t,1,OH ５′）,4.9
（m,2,CH 2）,4.3−3.5（m,9,T2 H ３′，H ４′，H ５′
H ５″，CH 23″）,2.6（m,1,T1 H ３′）,2.25−2.00（m,
4,H 2′ H ２″）,1.75（s,3,CH 3）,1.65（s,3,CH 2）。
オリゴヌクレオチドの合成：実用的な方法、M.J.ガイ
ド編集、IRL出版， 1984年（Oligonucleotide Synthesis:a practical appr
oach,Ed.M.J.Gait,IRL Press,1984）に記述された手順
によって、最後の二量体をジメトキシトリチル化して、
薄い黄色く色のついた泡沫として５′−O−DMT−３′−
CH2−Ｎ−（COCH2OPh）−Ｏ−CH2−５′−Ｔ−３′−OH
を得た。
1H NMR（DMSO−d6）δ 11.3（br s,2,NH）,7.55（s,
1,C6 H）,7.45（s,1,C6 H）,7.38−6.75（m,18,DMTrH，フ
ェノキシアセチル）,6.22（擬似t,1,T2 H １′）,6.05
（擬似t,1,T1 H １′）,4.75−4.60（m,2,CH 2）,4.25
（m,1,T2 H ５′）,4.18（m,1,T2 H ３′）,4.05（m,1,T2
H ５″）,3.9（m,2,H ４′）,3.8−3.6（m,2,CH 2 3″）,
3.65（s,6,2OCH 3）,3.2（m,2,T1,H ５′ H ５″）,2.82
（m,1,T1 H ３′）,2.3−2.05（m,4,H ２′ H ２″）,1.6
（s,3,T2 CHCH3）,1.38（s,3,T1 CH 3）。
オリゴヌクレオチドの合成：実用的な方法、M.J.ガイ
ド編集、IRL出版,1984年（Oligonucleotide Synthesis:
a practical approach,Ed.M.J.Gait,IRL Press,1984）
に記述されている手順にしたがって上記の二量体をホス
フィチル化してホスホラミディトの誘導体の二量体（DN
A合成機の使用に適当である）を泡沫として得た（２段
階で75％）。
1H NMR（CDCl3）δ 7.62（s,1,C6 H）,7.2−7.45（2m,
12,ArH）,6.77−7.05（3m,7,ArH，C6 H）,6.15（擬似t,
1,C１′ H）,6.05（t,1,C１′ H）,4.7（m,2,2C４′
H）,3.74（2s,6,2ArOCH 3）,2.95（m,1,C１′ H）,1.
78,1.77（2s,3,C5CH 3）,1.41（s,3,C5CH 3），および他
のプロトン 31P NMR（CDCl3）149.76および149.56ppm。
実施例30 オリゴヌクレオチド中の（３′−CH2−Ｎ
（不安定な保護基）−CH2−CH2−５′）結合からの
（３′−CH2−NH−Ｏ−CH2−５′）の結合の再生 実施例29のホスフィチル化した二量体を実施例８の手
順によってオリゴヌクレオチド中に導入するだろう。支
持体上のオリゴヌクレオチドが完成した後に、標準的な
水酸化アンモニウムの条件を使用してオリゴヌクレオチ
ドを支持体から切断する。水酸化アンモニウム処理によ
って、支持体からの切断とともにさらに、導入された
（３′−CH2−Ｎ（COCH2OPh）−Ｏ−CH2−５′）オリゴ
ヌクレオチドの二量体のイミノ窒素からフェノキシアセ
チル保護基も切断されて、オリゴヌクレオチドの構造中
で（３′−CH2−NH−Ｏ−CH2−５′）が連結するオリゴ
ヌクレオチドの二量体を得るだろう。
実施例31 （３′−C2−Ｐ（Ｏ）2−Ｏ−CH2−５′）お
よび（３′−C2−Ｐ（OH）2−Ｏ−CH2−５′）が連結す
るオリゴヌクレオシドの合成３′−Ｃ−ホスホネート二
量体の合成 ３′−ヒドロキシメチル−５′−O−（ｔ−ブチルジ
フェニルシリル）チミジンをNBSを用いた処理によって
それの臭化物へ変換するだろう。この臭化物でアルブゾ
フ反応（Arbuzov reaction）を行い、ホスホネートジエ
ステルを得る。トリメチルブロモシランを用いたホスホ
ネートジエステルの切断によってフリーの酸を得て、ピ
リジン中の３′−O−（ｔ−ブチルジフェニルシリル）
チミジンおよびDCCを用いてこれを処理してその二量体
を得る。
３′−Ｃ−ホスホネートが連結するオリゴヌクレオシド
の合成 標準的なDNA合成機の化学によってオリゴヌクレオシ
ド中の希望する位置へ挿入するための５′−O−DMTおよ
び３′−O−ホスホラマイドの誘導体として、二量体に
適当に保護基をつけてそれを活性化することによって、
上記の二量体をオリゴヌクレオシドの中へ導入するだろ
う。
５′−Ｃ−ホスホネートが連結するオリゴヌクレオシド
の合成 ５′−デオキシ−５′−ブロモヌクレオシドを亜リン
酸エステルと反応させて５−ホスホネートが得られるの
で、対応する５′−C−ホスホネートの二量体を得るだ
ろう。これを順に３′−ヒドロキシメチルヌクレオシド
と反応させて、５′−C−ホスホネートで結合した二量
体を得る。
評価 方法１ オリゴヌクレオチドの構造および完全性 A.オリゴヌクレオチドの消化 オリゴヌクレオチドの酸素的消化 種々のアンチセンス・オリゴヌクレオチドにおける主
鎖修飾の取り込みを、以下の方法を用いて酵素的加水分
解により確認した。この方法の配列リストにおいては、
「＊」は配列中の本発明の結合の位置を示すために用
い、同様に「ｐ」は正常なホスホジエステル結合の位置
を示すために用いている。
修飾オリゴヌクレオチド （５′−GpCpGpTpTpTpTpT＊TpTpTpTpTpGpCpG−３′） （0.2 OD、A260nm）を、0.1Mtris−HCl緩衝液（pH8.3、
200μｌ）に溶解し、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（0.4
μｇ）、アルカリホスファターゼ（0.4μｇ）、および
子ウシ脾臓ホスホジエステラーゼ（0.4μｇ）で37℃に
おいて24−60時間処理した。得られた混合物を希釈し、
HPLCで分析した。カラム:C−18 ヌクレオシル（Nucleo
sil）（５μ），流速:1ml/min、溶液A:10mM酢酸トリエ
チルアンモニウム、溶液B:アセトニトリル／水（1:
1）、０％Ｂから50％Ｂまで20分間の直線勾配。ヌクレ
オシド成分の吸光係数に従い、ピーク面積に基づいてこ
の物質を定量化した。ダイマーを含むそれぞれの修飾主
鎖の同一性は、合成試料を完全に消化されたオリゴヌク
レオチドと同時に注入することにより確認した。すべて
の場合において、HPLC分析のピークの積分は、消化され
たオリゴヌクレオチドの組成が正しいことを示した。
B.主鎖結合の完全性 さらに、それぞれ修飾主鎖の取り込みの完全性は、同
一のDNA合成器（ABI 380B）で製造されたCpT＊TpGテト
ラマーの1Hおよび31P NMR分析によっても支持された。
これは、合成器のコンピュータ・プログラムの間接的な
確認である。
方法２ ハイブリダイゼーション分析 本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類
似体、またはオリゴヌクレオシドの、相補的核酸に結合
する相対的能力は、特定のハイブリダイゼーション複合
体の融点を決定することにより比較することができる。
融点（Tm）は、互いに相補的な核酸の物理的性質であ
り、50％の２本鎖ヘリックス形対コイル（ハイブリダイ
ゼーションしていない）形が存在する温度を０℃で表わ
したものである。Tmは、UVスペクトルを用いて、ハイブ
リダイゼーションの形成と分解（溶融）を決定すること
により測定する。ハイブリダイゼーションの間に生ずる
ベーススタッキングは、UV吸収の減少を伴う（淡色性
（hypochromicity））。したがって、UV吸収の減少は、
より高いTmを示す。Tmが高いほど、鎖の結合強度が大き
くなる。非ワトソン・クリック塩基対は、Tmに対して強
い不安定化効果を有している。したがって、標的RNAに
対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドまたはオリゴ
ヌクレオシドの最適な結合を得るためには、塩基対の絶
対的正確性が必要である。
A.オリゴヌクレオチド類似体のハイブリダイゼーション
の熱力学の評価 本発明の選択されたオリゴヌクレオチド類似体が、こ
れらに相補的なRNAまたはDNA配列にハイブリダイズする
能力を、熱溶融分析により決定した。RNA相補鎖は、T7R
NAポリメラーゼおよび、核酸合成器（Applied Biosyste
ms,Inc.）により合成されたテンプレート・プロモータD
NAから合成した。RNA種は、FPLC（LKB Pharmacia,Inc）
を用いてイオン交換により精製する。アンチセンス・オ
リゴヌクレオチド類似体を化学量論的濃度でRNAまたはD
NA相補鎖に加え、２本鎖からランダムコイルへの転移に
おける吸収（260nm）深色性（hyperchromicity）を、分
光光度計（Gilford Response II）を用いてモニターす
る。これらの測定は、10mMリン酸ナトリウム（pH7.
4）、0.1mM EDTA、および0.1Mまたは0.1Mのイオン強度
を得るためのNaClの緩衝液中で実施する。データは、1/
Tm対1n［Ct］（ここでCtは全オリゴヌクレオチド濃度）
を表すグラフにより分析することができる。
本発明の選択されたオリゴヌクレオチド類似体のハイ
ブリダイゼーションの熱力学的分析の結果を表１に示
す。この表の配列リストにおいては、「＊」は配列中の
本発明の結合の位置を示すために用い、同様「ｐ」は正
常なホスホジエステル結合の位置を示すために用いてい
る。さらに、この表および後述の表においては、本発明
の種々の主鎖結合についての一般化学名と構造の略記の
間の相互参照は以下のとおりである。オキシム：（３′
−CH＝Ｎ−Ｏ−CH2−５′）、アミノヒドロキシ：
（３′−CH2−NH−Ｏ−CH2−５′）、Ｎ−メチル−アミ
ノヒドロキシ：（３′−CH2−Ｎ（CH3）−Ｏ−CH2−
５′）、Ｎ−メチル−ヒドロキシアミノ：（３′−CH2
−Ｏ−Ｎ（CH3）−CH2−５′）、およびN,N′−ジメチ
ルヒドラジノ：（３′−CH2−Ｎ（CH3）−Ｎ（CH3）−C
H2−５′）。
さらに、本発明の修飾結合を有するオリゴヌクレオチ
ドの塩基対特異性について調べた。この研究において
は、配列（５′−CpTpCpGpTpApCpCpT＊TpTpCpCpGpGpTpC
pC−３′）中のＴ＊Ｔダイマーの５′−Ｔの、RNA相補
鎖のＡにマッチした時の結合（T:rA対）を、Ｃ、Ｇまた
はＵとのミスマッチと比較して測定した。すべての塩基
対のミスマッチの平均を表２に示す。表２は、本発明の
主鎖結合の，相補鎖に対する本質的にワトソン−クリッ
ク塩基対特異性が弱められていないことを示している。
B.オリゴヌクレオチド類似体のハイブリダイゼーション
の正確性 本発明のアンチセンス・オリゴヌクレオチド類似体
の、絶対的特異性をもって標的nRNAとハイブリダイズす
る能力は、全細胞RNAの存在下における精製標的mRNAの
ノーザンブロット分析により示すことができる。標的mR
NAは、T7RNAポリメラーゼプロモーターの下流に配置さ
れた標的mRNAのcDNAを含むベクターから合成する。合成
したmRNAをアガロースゲル中で電気泳動し、適当な支持
膜（ニトロセルロース等）に転移させる。この支持膜を
ブロッキングして、32P−標識したオリゴヌクレオチド
類似体をプローブとして用いる。ストリンジェンシー
は、ブロットを繰り返し、より高い温度において、また
はより低いイオン強度の洗浄緩衝液により洗浄すること
により決定する。ヘテロ２本鎖の形成の存在を評価する
ためにオートラジオグラフィーを行い、オートラジオグ
ラムをレーザー密度計（LKB Pharmacia,Inc.）により定
量化する。全細胞RNAを標準的方法により単離し、アガ
ロース電気泳動、膜転移、および標識したオリゴヌクレ
オチド類似体をプローブとして用いて分析することによ
り、ハリブリッド形成の特異性を決定する。ストリンジ
ェンシーは修飾していないアンチセンス・オリゴヌクレ
オチドについてあらかじめ決定し、特異的に標的とする
mRNAのみがオリゴヌクレオチド類似体とヘテロ２本鎖を
形成しうる条件を用いる。
方法３ ヌクレアーゼ耐性 A.血清および細胞質ヌクレアーゼに対するオリゴヌクレ
オチド類似体の耐性の評価 血清ヌクレアーゼに対する本発明のオリゴヌクレオチ
ド類似体の耐性は、このオリゴヌクレオチド類似体を種
々の濃度のウシ胎児血清を含む培養液中でインキュベー
トすることにより評価することができる。標識したオリ
ゴヌクレオチド類似体を種々の時間インキュベートし、
プロテアーゼＫで処理し、次に20％ポリアクリルアミド
尿素変性ゲルにおける電気泳動、およびそれに続くオー
トラジオグラフィーによって分析する。オートラジオグ
ラムをレーザー密度計で定量化する。修飾結合の位置お
よび既知のオリゴヌクレオチドの長さに基づいて、特性
の修飾がヌクレアーザ分解に及ぼす影響を決定すること
ができる。細胞質ヌクレアーゼについては、HL60細胞株
を用いることができる。ポスト・ミトコンドリア上清を
密度差遠心分離により調製し、標識したオリゴヌクレオ
チド類似体をこの上清中で種々の時間インキュベートす
る。インキュベートの後、血清核酸溶解分解について上
述したように、分解についてオリゴヌクレオチド類似体
を評価する。オートラジオグラフィーの結果を、未修飾
と本発明のオリゴヌクレオチド類似体との比較のために
定量化する。
表３は、本発明のある種の結合の、10％ウシ胎児血清
に対するヌクレアーゼ耐性を示す。表３から明らかなよ
うに、試験されたすべての結合は、天然のオリゴヌクレ
オチドと比べてウシ胎児血清のヌクレアーゼに対して高
い安定性を示した。表３は、ＮからＮ−１への転移およ
びＮ−１からＮ−２への転移のｔ1/2を示す。この表の
配列リストにおいては、「＊」は配列中の本発明の結合
の位置を示すために用い、同様に「ｐ」は正常なホスホ
ジエステル結合の位置を示すために用いている。
方法４ ５−リポキシゲナーゼ分析、治療およびアッセ
イ A.治療 治療に用いるためには、５−リポキシゲナーゼの過剰
なまたは異常な供給により特徴づけられる疾患を有する
と疑われる動物を、本発明に従ってオリゴヌクレオチド
類似体を投与することにより処置する。当業者は、最適
な投与量、投与方法および反復速度を容易に決定するこ
とができる。このような処置は一般に、治癒がなされる
かまたは疾患状態の減縮が達成されるまで続けられる。
いくつかの疾患については、同様に長期処置が行われ
る。
B.研究試験 本発明のオリゴヌクレオチド類似体はまた、粗細胞ラ
イセート中、または部分的まは完全に精製されたRNA調
製物中の、５−リポキシゲナーゼmRNAを切断あるいは調
節するために用いられる場合、研究試薬用としても有用
である。この本発明の応用は、例えば細胞を標準的方法
により溶解し、最適にRNAを抽出し、次にこれを緩衝液
（例えば50mMリン酸塩、pH約４〜約10）中の、例えば10
0〜約500ng/10mg全RNAの濃度の組成物を用いて、約30℃
〜約50℃の温度において処理することにより行うことが
できる。切断された５−リポキシゲナーゼRNAは、アガ
ロースゲル電気泳動および放射性標識されたDNAプロー
ブを用いるハイブリダイゼーション、あるいはその他の
標準的な方法により分析することができる。
C.診断 本発明のオリゴヌクレオチド類似体はまた、診断への
応用において、特に種々の組織における特定のmRNA種の
発現、あるいは異常または変異RNA種の発現の決定にも
有用である。この例においては、オリゴヌクレオチド類
似体は、異常な配列に相補的なように設計することによ
って、仮想の異常mRNAを標的とするが、正常mRNAにはハ
イブリダイズせずこれを切断しない。
組織標本をホモジナイズし、標準的な方法に従ってRN
Aを抽出することができる。粗ホモジネートまたは抽出
物を処理して、例えば標的RNAを切断することができ
る。次に、この生成物を、切断部位の５′側の領域に相
補的なオリゴヌクレオチドが結合されている固体支持体
にハイブリダイズさせることができる。正常および異常
のmRNAの５′領域はいずれも固体支持体に結合する。異
常RNAの３′領域は、本発明の化合物により切断され
て、支持体に結合しないため、正常RNAから分離され
る。
調節のための標的mRNA種は、５−リポキシゲナーゼに
関係するものである。しかし、当業者は、本発明がその
ように制限されるものではなく、一般的に適用しうるこ
とを理解するであろう。５−リポキシゲナーゼ酵素の生
成の阻害または調節は、疾患の治療において顕著な治療
の利益を有すると予想される。この組成物の有効性を評
価するために、１つまたは一連のアッセイが必要であ
る。
D.インビトロアッセイ ５−リポキシゲナーゼの細胞性アッセイは、好ましく
はヒト前骨髄性白血病細胞株HL−60を用いて行う。これ
らの細胞は、種々の既知の試薬により誘導して単球様細
胞または好中球様細胞に分化させることができる。細胞
を1.3％ジメチルスルホキシド（DMSO）で処理すること
は、細胞の好中球への分化を促進することが知られてい
る。現在、基底Ｈ−60細胞が検出可能なレベルの５−リ
ポキシゲナーゼ蛋白質を合成しないか、またはロイコト
リエン（５−リポキシゲナーゼの下流生成物）を分泌し
ないことが知られている。DMSOによる細胞の分化は、DM
SOの添加から48時間後に５−リポキシゲナーゼ蛋白質の
出現とロイコトリエン生合成を引き起こす。したがっ
て、５−リポキシゲナーゼ蛋白質合成の誘導は、これら
の細胞において５−リポキシゲナーゼ合成を阻害するア
ンチセンス・オリゴヌクレオチド類似体の分析のための
試験システムとして利用することができる。
アンチセンス・オリゴヌクレオチドの第２の試験シス
テムは、５−リポキシゲナーゼが「自殺」酵素である。
すなわち、酵素が基質と反応することによってそれ自身
を不活性化するという事実を利用するものである。分化
したHL−60または５−リポキシゲナーゼを発現するその
他の細胞を、10μＭのA23187（カルシウム・イオノフォ
ア）によって処理することは、５−リポキシゲナーゼの
サイドゾルから膜への移動およびそれに続く酵素の活性
化を促進する。活性化および何回かの触媒作用の後、酵
素は触媒的に不活性化する。したがって、カルシウム・
イオノフォアによる細胞の処理は、内因性５−リポキシ
ゲナーゼを不活性化する。ロイコトリエンB4の合成能力
により測定したところ、細胞がA23187処理から回復する
ためには約24時間を要する。５−リポキシゲナーゼに対
するオリゴヌクレオチド類似体は、以下の定量的なアッ
セイを用いて、２つのHL−60モデル系において活性を測
定することができる。これらのアッセイは、生きた細胞
における５−リポキシゲナーゼ活性の測定等の、より下
流の事象と比べて、生きた細胞における５−リポキシゲ
ナーゼ蛋白質合成の阻害の最も直接的な測定である。
生きた細胞においてオリゴヌクレオチド類似体が及ぼ
すことができ、容易に定量化しうる最も直接的な効果
は、５−リポキシゲナーゼ蛋白質合成の特異的な阻害で
ある。この方法を実施するためには、細胞を35S−メチ
オニン（50μCi/mL）で37℃において２時間標識し、新
たに合成された蛋白質を標識する。細胞を抽出して全細
胞蛋白質を可溶化し、５−リポキシゲナーゼ抗体で５−
リポキシゲナーゼを免疫沈降させ、次にプロテインＡセ
ファローズビーズから溶出する。免疫沈降した蛋白質を
SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、
オートラジオグラフィーのために感光を行う。免疫沈降
した５−リポキシゲナーゼの量を走査密度計で定量化す
る。
これらの実験の結果は次のとおりである。対照細胞か
ら免疫沈降された５−リポキシゲナーゼ蛋白質の量を10
0％として標準とする。細胞を１μＭ、10μＭおよび30
μＭの有効なオリゴヌクレオチド類似体によって48時間
処理すると、免疫沈降された５−リポキシゲナーゼはそ
れぞれ標準の５％、25％および75％減少する。
細胞ホモジネートにおける５−リポキシゲナーゼ酵素
活性の測定もまた、ロイコトリエンを合成しうる酵素の
存在量を定量化するために用いることができる。現在、
逆相HPLCを用いて細胞ホモジネート中の５−リポキシゲ
ナーゼ酵素を定量化するための放射測定法が開発されて
いる。細胞をプロテアーゼ阻害剤およびEDTAを含む緩衝
液中で超音波処理により破壊する。細胞ホモジネートを
10,000×ｇで30分間遠心分離し、上清を５−リポキシゲ
ナーゼ活性についてアッセイする。サイトゾル蛋白質を
10μＭの14C−アラキドン酸、2mM ATP、50μＭ遊離カル
シウム、100μg/mlホスファチジルコリン、および50mMb
is−Tris緩衝液（pH7.0）とともに37℃において５分間
インキュベートする。等量のアセトンを加えることによ
り反応を停止させ、酢酸エチルで脂肪酸を抽出する。基
質と反応生成物をノバパックC18カラム（Waters Inc.,M
illford,MA）を用いて逆相HPLCにより分離する。ラジオ
クロマトグラフィー検出機（Beckman model 171）によ
り、放射活性を有するピークを検出する。ジ−HETEおよ
びモノ−HETEに転換されたアラキドン酸の量を５−リポ
キシゲナーゼ活性の測定値として用いる。
DMSO分化HL−60細胞を、有効なオリゴヌクレオチド類
似体で１μＭ、10μＭおよび30μＭの濃度において処理
した結果は以下のとおりである。対照細胞は200pmol/5
分／細胞106個のアラキドン酸を酸化する。１μＭ、10
μＭおよび30μＭの有効なオリゴヌクレオチド類似体で
処理した細胞は、それぞれ195pmol、140pmolおよび60pm
ol/5分／細胞106個のアラキドン酸を酸化する。
細胞中の全５−リポキシゲナーゼ蛋白質の測定のため
の定量的競合酵素免疫アッセイ（ELISA）が開発されて
いる。大腸菌で発現させ、抽出、Ｑ−セファロース、ヒ
ドロキシアパタイトおよび逆相HPLCにより精製したヒト
５−リポキシゲナーゼを標準として、およびマイクロタ
イタープレートの被覆のための第１抗体として用いる。
25ngの精製５−リポキシナーゼを４℃で一晩マイクロタ
イタープレートに結合させる。ウエル20mMTris−HCl緩
衝液（pH7.4）および150mMNaCl（TBS）で希釈した５％
ヤギ血清で90分間被覆する。細胞抽出物（0.2％Triton
X−100、12,000×ｇ、30分間）または精製５−リポキシ
ゲナーゼを、全量100μＬの1:4000希釈抗５−リポキシ
ゲナーゼポリクロナール抗体とともに、マイクロタイタ
ーのウエル中で90分間インキューベートする。抗体は、
精製ヒト組み換え５−リポキシゲナーゼでウサギを免疫
して調製する。ウエルを0.05％tween20を含むTBS（TBS
T）で洗浄し、次に100μＬの1:1000希釈ペルオキシダー
ゼ結合抗ウサギIgG抗体（Cappel Laboratories,Malver
n,PA）とともに25℃において60分間インキュベートす
る。ウエルをTBSTで洗浄し、テトラメチルベンジジンで
発色させてペルオキシダーゼ標識第２抗体の量を決定す
る。
１μＭ、10μＭおよび30μＭの30塩基のオリゴヌクレ
オチド類似体を用いたそのようなアッセイの結果は、そ
れぞれ細胞106個につき５−リポキシゲナーゼが30ng、1
8ngおよび5ngであり、処理していない細胞は約34ngを５
−リポキシゲナーゼを含む。
５−リポキシゲナーゼ生合成の阻害の正味の効果は、
刺激された細胞から放出されたロイコトリエンの量の減
少である。DMSO分化HL−60細胞は、カルシウム・イオノ
フォアA23187による刺激によりロイコトリエンB4を放出
する。細胞培養液に放出されたロイコトリエンは、商業
的に入手可能な診断キャット（New England Nuclear,Bo
ston,MA）を用いて、ラジオイムノアッセイにより定量
することができる。HL−60細胞におけるロイコトリエン
B4の産生は、DMSOを添加して細胞を好中球様細胞に分化
させてから48時間後に検出することができる。細胞（２
×105個/mL）を1.3％のDMSOの存在下で、増加する濃度
のオリゴヌクレオチド類似体で48−72時間処理する。細
胞を洗浄し、１％脱脂ウシ血清アルブミンを含むダルベ
コリン酸緩衝液生理食塩水中に、２×106個/mLの濃度で
再懸濁する。細胞を10μＭカルシウム・イオノフォアA2
3187で15分間刺激し、５×105の細胞から産生されたLTB
4の量を、製造者の記述にしたがってラジオイムノアッ
セイにより決定する。
このアッセイを用いて、５−LOmRNAに対する、修飾さ
れた結合を含む15塩基のアンチセンス・オリゴヌクレオ
チド（GCAAGGTCACTGAAG）について得られる結果は以下
のとおりである。細胞を１μＭ、10μＭまたは30μＭの
オリゴヌクレオチド類似体とともに、1.3％DMSOの存在
下で72時間処理する。５×105細胞から産生されるLTB4
の量は、それぞれ約75pg、50pgおよび35pgであり、未処
理の分化細胞は75pgのLTB4を産生する。
E.インビボアッセイ マウスにおける５−リポキシゲナーゼ産生の阻害は、
以下の方法にしたがって示すことができる。アラキドン
酸を局所投与することにより、ロイコトリエンB4、ロイ
コトリエンC4およびプロスタグランジンE2が皮膚におい
て速やかに生成し、続いて浮腫および細胞性浸潤が生じ
る。５−リポキシゲナーゼのある種の阻害剤がこのアッ
セイにおいて活性を示すことが知られている。このアッ
セイのために、2mgのアラキドン酸をマウスの耳に適用
し、反対側の耳を対照とする。アラキドン酸投与から１
時間後の生検試料から得たホモジネート中のミエロペル
オキシダーゼ活性により、多形核細胞浸潤をアッセイす
る。浮腫性の反応は、耳の厚さおよびパンチした生検試
料の重量を測定することにより定量化する。組織中の５
−リポキシゲナーゼ活性の直接的測定として、生検試料
において産生されたロイコトリエンB4の測定を実施す
る。化合物の最適な活性を得るために、オリゴヌクレオ
チド類似体をアラキドン酸の投与の12〜24時間前に両方
に耳に局所的に適用する。アラキドン酸の投与の前に両
方の耳を、0.1μmol、0.3μmolまたは1.0μmolのオリゴ
ヌクレオチド類似体で24時間前処理する。値は、１つの
濃度につき３匹の動物の平均で表わす。0.1μmol、0.3
μmolおよび1.0μmolについての多形核細胞浸潤の阻害
は、それぞれ対照の活性の約10％、75％および92％であ
る。浮腫の阻害は、それぞれ約３％、58％および90％で
あり、これに対してロイコトリエンB4の生成の阻害はそ
れぞれ約15％、79％および99％である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｄ 473/00 Ｃ０７Ｄ 239/54 Ｚ (72)発明者 ヴァスエール，ジャン−ジャック アメリカ合衆国カリフォルニア州92069, カールズバッド，ウィンドリフト・ドラ イブ 901 (72)発明者 デュバル，フランソワ アメリカ合衆国カリフォルニア州92069, カールズバッド，ウィンドリフト・ドラ イブ 901

Claims (7)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】オリゴヌクレオチド類似体であって、該類
    似体の少なくとも一部のサブユニットが次の構造： ［式中、 Bxは可変の塩基部分であり； ＱはO,CH2,CHF,またはCF2であり； ＸはH,OH,C1〜C10低級アルキル，置換低級アルキル，ア
    ルカリール，アラルキル,F,Cl,Br,CN,CF3，OCF3,OCN,O
    −アルキル,S−アルキル,NH−アルキル,O−アルケニル,
    S−アルケニル,NH−アルケニル，SOCH3，SO2CH3，ON
    O2，NO2，N3，NH2，ヘテロシクロアルキル，ヘテロシク
    ロアルカリール，アミノアルキルアミノ，ポリアルキル
    アミノまたは置換シリルであり； L1およびL4は互いに独立的に、CR1R2,C＝O,C＝S,CH−NH
    2,CH−NHR3,CH−OH,CH−SH,CH−Ｏ−R1，またはCH−Ｓ
    −R1であり； L2およびL3は互いに独立的に、CR1R2,C＝CR1R2,C＝NR3,
    P（Ｏ）R4,P（Ｓ）R4,C＝O,C＝S,O,S,SO,SO2，NR3，も
    しくはSiR5R6であるか、あるいは一緒になってアルケ
    ン、アルキン、芳香環、炭素環、もしくは複素環の一部
    を形成するか、あるいは、 L1，L2，L3，およびL4は、一緒になって−CH＝Ｎ−NH−
    CH2−部分，または−CH2−Ｏ−Ｎ＝CH−部分を構成し； R1およびR2は互いに独立的に,H,OH,SH,NH2，C1〜C10ア
    ルキル，置換アルキル，アルケニル，アルカリール，ア
    ラルキル，アルコキシ，チオアルコキシ，アルキルアミ
    ノ，アラルキルアミノ，置換アルキルアミノ，ヘテロシ
    クロアルキル，ヘテロシクロアルキルアミノ，アミノア
    ルキルアミノ，ポリアルキルアミノ，ハロ，ホルミル，
    ケト，ベンゾキシ，カルボキサミド，チオカルボキサミ
    ド，カルバミル，ウレイドまたはグアニジノであり； R3は、H,OH,NH2，低級アルキル，置換低級アルキル，ア
    ルコキシ，低級アルケニル，アラルキル，アルキルアミ
    ノ，アラルキルアミノ，置換アルキルアミノ，ヘテロシ
    クロアルキル，ヘテロシクロアルキルアミノ，アミノア
    ルキルアミノまたはポリアルキルアミノであり； R4は、OH,SH,NH2,O−アルキル,S−アルキル,NH−アルキ
    ル,O−アルキル複素環,S−アルキル複素環,NH−アルキ
    ル複素環，または窒素含有複素環であり； R5およびR6は、それぞれ独立的にC1〜C6アルキルまたは
    C1〜C6アルコキシである； ただし、L1がＣ＝ＯまたはＣ＝Ｓであるときは、L2はNR
    3ではなく；L4がＣ＝ＯまたはＣ＝Ｓであるときは、L3
    はNR3ではなく；L2またはL3の一方がＣ＝ＯまたはＣ＝
    Ｓであるときは、L2またはL3の他方はNR3ではなく；L2
    がＰ（Ｏ）R4であり，R4がOHであり,XがOHであり，か
    つ，Bxがウラシルまたはアデニンであるときは，L3はＯ
    ではなく；またL1，L2，およびL4がCH2であり,XがＨま
    たはOHであり，かつ、ＱがＯであるときは，L3はS,SO,
    またはSO2ではない］ を有する、オリゴヌクレオチド類似体。
  2. 【請求項２】ヒトを除く生物中における蛋白質の生成と
    活性を調節する方法であって、該蛋白質をコードする核
    酸配列の少なくとも一部と特異的にハイブリッド形成す
    ることが可能なオリゴヌクレオチド類似体と該生物とを
    接触させることを含み、ここで類似体のサブユニットの
    少なくともいくつかが次の構造： ［式中、 Bxは可変の塩基部分であり； ＱはO,CH2,CHF,またはCF2であり； ＸはH,OH,C1〜C10低級アルキル，置換低級アルキル，ア
    ルカリール，アラルキル,F,Cl,Br,CN,CF3，OCF3,OCN,O
    −アルキル,S−アルキル,NH−アルキル,O−アルケニル,
    S−アルケニル,NH−アルケニル，SOCH3，SO2CH3，ON
    O2，NO2，N3，NH2，ヘテロシクロアルキル，ヘテロシク
    ロアルカリール，アミノアルキルアミノ，ポリアルキル
    アミノまたは置換シリルであり； L1およびL4は互いに独立的に、CR1R2,C＝O,C＝S,CH−NH
    2,CH−NHR3,CH−OH,CH−SH,CH−Ｏ−R1，またはCH−Ｓ
    −R1であり； L2およびL3は互いに独立的に、CR1R2,C＝CR1R2,C＝NR3,
    P（Ｏ）R4,P（Ｓ）R4,C＝O,C＝S,O,S,SO,SO2，NR3，も
    しくはSiR5R6であるか、あるいは一緒になってアルケ
    ン、アルキン、芳香環、炭素環、もしくは複素環の一部
    を形成するか、あるいは、 L1，L2，L3，およびL4は、一緒になって−CH＝Ｎ−NH−
    CH2−部分，または−CH2−Ｏ−Ｎ＝CH−部分を構成し； R1およびR2は互いに独立的に、H,OH,SH,NH2，C1〜C10ア
    ルキル，置換アルキル，アルケニル，アルカリール，ア
    ラルキル，アルコキシ，チオアルコキシ，アルキルアミ
    ノ，アラルキルアミノ，置換アルキルアミノ，ヘテロシ
    クロアルキル，ヘテロシクロアルキルアミノ，アミノア
    ルキルアミノ，ポリアルキルアミノ，ハロ，ホルミル，
    ケト，ベンゾキシ，カルボキサミド，チオカルボキサミ
    ド，カルバミル，ウレイドまたはグアニジノであり； R3は、H,OH,NH2，低級アルキル，置換低級アルキル，ア
    ルコキシ，低級アルケニル，アラルキル，アルキルアミ
    ノ，アラルキルアミノ，置換アルキルアミノ，ヘテロシ
    クロアルキル，ヘテロシクロアルキルアミノ，アミノア
    ルキルアミノまたはポリアルキルアミノであり； R4は、OH,SH,NH2,O−アルキル,S−アルキル,NH−アルキ
    ル,O−アルキル複素環,S−アルキル複素環,NH−アルキ
    ル複素環，または窒素含有複素環であり； R5およびR6は、それぞれ独立的にC1〜C6アルキルまたは
    C1〜C6アルコキシである； ただし、L1がＣ＝ＯまたはＣ＝Ｓであるときは、L2はNR
    3ではなく；L4がＣ＝ＯまたはＣ＝Ｓであるときは、L3
    はNR3ではなく；L2またはL3の一方がＣ＝ＯまたはＣ＝
    Ｓであるときは、L2またはL3の他方はNR3ではなく；L2
    がＰ（Ｏ）R4であり，R4がOHであり,XがOHであり，か
    つ，Bxがウラシルまたはアデニンであるときは，L3はＯ
    ではなく；またL1，L2，およびL4がCH2であり,XがＨま
    たはOHであり，かつ、ＱがＯであるときは，L3はS,SO,
    またはSO2ではない］ を有することを特徴とする方法。
  3. 【請求項３】蛋白質の望ましくない生成を特徴とする疾
    患を有するヒトを除く生物を処置する方法であって、該
    蛋白質をコードする核酸配列の少なくとも一部とハイブ
    リッド形成することが可能なオリゴヌクレオチド類似体
    と該生物とを、単独もしくは医薬用として許容しうるキ
    ャリヤー中に製剤した形で接触させることを含み、 ここで前記類似体のサブユニットの少なくともいくつか
    が次の構造： ［式中、 Bxは可変の塩基部分であり； ＱはO,CH2,CHF,またはCF2であり； ＸはH,OH,C1〜C10低級アルキル，置換低級アルキル，ア
    ルカリール，アラルキル,F,Cl,Br,CN,CF3，OCF3,OCN,O
    −アルキル,S−アルキル,NH−アルキル,O−アルケニル,
    S−アルケニル,NH−アルケニル，SOCH3，SO2CH3，ON
    O2，NO2，N3，NH2，ヘテロシクロアルキル，ヘテロシク
    ロアルカリール，アミノアルキルアミノ，ポリアルキル
    アミノまたは置換シリルであり； L1およびL4は互いに独立的に、CR1R2,C＝O,C＝S,CH−NH
    2,CH−NHR3,CH−OH,CH−SH,CH−Ｏ−R1，またはCH−Ｓ
    −R1であり； L2およびL3は互いに独立的に、CR1R2,C＝CR1R2,C＝NR3,
    P（Ｏ）R4,P（Ｓ）R4,C＝O,C＝S,O,S,SO,SO2，NR3，も
    しくはSiR5R6であるか、あるいは一緒になってアルケ
    ン、アルキン、芳香環、炭素環、もしくは複素環の一部
    を形成するか、あるいは、 L1，L2，L3，およびL4は、一緒になって−CH＝Ｎ−NH−
    CH2−部分，または−CH2−Ｏ−Ｎ＝CH−部分を構成し； R1およびR2は互いに独立的に、H,OH,SH,NH2，C1〜C10ア
    ルキル，置換アルキル，アルケニル，アルカリール，ア
    ラルキル，アルコキシ，チオアルコキシ，アルキルアミ
    ノ，アラルキルアミノ，置換アルキルアミノ，ヘテロシ
    クロアルキル，ヘテロシクロアルキルアミノ，アミノア
    ルキルアミノ，ポリアルキルアミノ，ハロ，ホルミル，
    ケト，ベンゾキシ，カルボキサミド，チオカルボキサミ
    ド，カルバミル，ウレイドまたはグアニジノであり； R3は、H,OH,NH2，低級アルキル，置換低級アルキル，ア
    ルコキシ，低級アルケニル，アラルキル，アルキルアミ
    ノ，アラルキルアミノ，置換アルキルアミノ，ヘテロシ
    クロアルキル，ヘテロシクロアルキルアミノ，アミノア
    ルキルアミノまたはポリアルキルアミノであり； R4は、OH,SH,NH2,O−アルキル,S−アルキル,NH−アルキ
    ル,O−アルキル複素環,S−アルキル複素環,NH−アルキ
    ル複素環，または窒素含有複素環であり； R5およびR6は、それぞれ独立的にC1〜C6アルキルまたは
    C1〜C6アルコキシである； ただし、L1がＣ＝ＯまたはＣ＝Ｓであるときは、L2はNR
    3ではなく；L4がＣ＝ＯまたはＣ＝Ｓであるときは、L3
    はNR3ではなく；L2またはL3の一方がＣ＝ＯまたはＣ＝
    Ｓであるときは、L2またはL3の他方はNR3ではなく；L2
    がＰ（Ｏ）R4であり，R4がOHであり,XがOHであり，か
    つ，Bxがウラシルまたはアデニンであるときは，L3はＯ
    ではなく；またL1，L2，およびL4がCH2であり,XがＨま
    たはOHであり，かつ、ＱがＯであるときは，L3はS,SO,
    またはSO2ではない］ を有することを特徴とする方法。
  4. 【請求項４】請求項１記載のオリゴヌクレオチド類似体
    を合成する方法であって、次の構造： を含む第１の部分と、次の構造： を含む第２の部分［式中、Bxは可変の塩基部分であり、
    ＱはO,CH2,CHF,またはCF2であり、そしてE1およびE2は
    同一または異なり、求電子反応基である］を用意するこ
    と；および 前記第１と第２の部分を、前記求電子反応基を介して結
    合基とカップリングして、前記オリゴヌクレオチド類似
    体を形成させること； を含む方法。
  5. 【請求項５】請求項１記載のオリゴヌクレオチド類似体
    を合成する方法であって、 ペントフラノシルヌクレオシドの３′炭素原子において
    ラジカルを生成させること；および 別のペントフラノシルヌクレオシドの５′位に存在する
    オキシム部分と該ラジカルとを反応させること； を含む方法。
  6. 【請求項６】請求項１記載のオリゴヌクレオチド類似体
    のL2またはL3の窒素部分を保護する方法であって、ここ
    でL2とL3の一方はNR3であり、R3はＨであり、窒素部分
    をフェノキシアセチルクロライドでブロックすること；
    および オリゴヌクレオチド類似体をさらに反応させて該オリゴ
    ヌクレオチドを修飾すること； を含む方法。
  7. 【請求項７】E1およびE2の少なくとも１つがアルデヒド
    であり、前記アルデヒドとメトキシアミン酸塩とを反応
    させて前記アルデヒドのオキシム誘導体を形成させるこ
    とにより前記アルデヒドを保護することをさらに含む、
    請求項４記載の方法。
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