JP2002541825A - ユニバーサル及び／又は同義性塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、一つ又はそれ以上のユニバーサル及び／又は同義性塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド組成物、並びにこれらのオリゴヌクレオチドを標的RNA分子に使用するための方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、一つ又はそれ以上のユニバーサル及び／又は同義性塩基を含むアン
チセンスオリゴヌクレオチド組成物、並びにRNA分子を標的化するためにこれら
のオリゴヌクレオチドを使用する方法に関する。

【０００２】

【関連技術の説明】

アンチセンス技術は、標的RNAに結合するオリゴヌクレオチドを用いて遺伝子
発現を調節することができるとの知見に基づく。ワトソン−クリック塩基対形成
を活用すること及び特定のヌクレアーゼ、とりわけリボヌクレアーゼHを補充す
る能力を活用することにより、DNA/RNAハイブリッド中の標的RNAを特異的に切断
するために、標的核酸分子に対して極めて特異的なアンチセンス分子を設計する
ことが可能である。しかしながら、こうした高度の特異性が有害であり得る遺伝
子ファミリーがある。例えば、遺伝子が共に不活性化されると相乗効果がある場
合には、これらの遺伝子の２又はそれ以上を標的とすることが望ましいであろう
。

【０００３】 典型的なアンチセンス化合物は修飾された核酸であり、これらはワトソン−ク
リック塩基対形成によって標的RNAに結合する。異なる構築物が標的RNAの切断を
仲介する各種のリボヌクレアーゼを補充することができる。最も一般的なリボヌ
クレアーゼはリボヌクレアーゼHであり、これはDNA/RNA二重鎖を認識し、次に標
的RNAを切断する。この目的のために最も一般的に用いられるオリゴヌクレオチ
ドには、非修飾の（天然の）塩基（A、T、G、C）及びオリゴヌクレオチドをヌクレ
アーゼ耐性にするホスホロチオエートと呼ばれる修飾されたバックボーンが含ま
れる。2'-O-アルキルのような他のバックボーン修飾により、オリゴヌクレオチ
ドは標的ＲＮＡのリボヌクレアーゼH切断を仲介できなくなる。単一アンチセン
スオリゴヌクレオチド内における非リボヌクレアーゼＨ基質部位とリボヌクレア
ーゼH基質部位の組み合わせについて多くの報告がある。これらの非リボヌクレ
アーゼH基質部位は、アンチセンスオリゴヌクレオチドについて結合および特異
性の両方を提供する。これらのバックボーンの例には、メチルホスホネート、モ
ルホリノ、MMI、ペプチド核酸（PNA）及び3'-アミデートが含まれる。アンチセ
ンスオリゴヌクレオチド結合およびヌクレアーゼ安定性を高める糖修飾には、2'
-O-アルキル、2'-O-アリル、2'-O-メトキシエチル、2'-O-アルキルアミノアルキ
ル、2'-フルオロ（2'-F）及び2'-アミノが含まれる。

【０００４】 ユニバーサルまたは同義性塩基は複素環式部分であり、分子全体が標的に結合
する能力を損ねることなく、DNA二重鎖中の１塩基以上と水素結合する能力をも
つ。非修飾バックボーンを有し且つ同義性又はユニバーサル塩基を含むオリゴヌ
クレオチドの使用は、PCRプライマーの文献において知られている（Bergstromら
, J. Am. Chem. Soc. 117: 1201-1209, 1995; Nicholsら, Nature 369: 492-493
, 1994; Loakes, Nucl. Acids Res. 22: 4039-4043, 1994; Brown, Nucl. Acids
Res. 20: 5149-5152, 1992）。しかしながら現在まで、これらのユニバーサル
および同義性塩基は、アンチセンス技術においては使用されたことがなく、修飾
されたバックボーン連鎖を含むオリゴヌクレオチドに組み込まれてこなかった。
本発明は、これらのアンチセンス組成物および方法を扱う。

【０００５】

【発明の要旨】

本発明の一態様は、少なくとも一つの非天然型バックボーン連鎖を有し且つ６
から約５０の間の塩基をもつアンチセンスオリゴヌクレオチドであり、ここで少
なくとも一つの塩基がユニバーサル及び／又は同義性塩基である。好ましくは、
該塩基の約５０％以下はユニバーサル及び／又は同義性塩基である。

【０００６】 本発明の別の実施態様は、３から約１５の間の塩基を有する第一の非リボヌク
レアーゼHリクルーティング領域、３から約１５の間の塩基を有するリボヌクレ
アーゼHリクルーティング領域、及び第二の非リボヌクレアーゼHリクルーティン
グ領域を含み、ここで該塩基のうち少なくとも一つはユニバーサル及び／又は同
義性塩基である、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。好ましくは、約５０
％以下の塩基はユニバーサル及び／又は同義性塩基である。

【０００７】 本発明はまた、非リボヌクレアーゼHリクルーティング部分及びリボヌクレア
ーゼHリクルーティング部分を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、
ここで該塩基のうち少なくとも一つはユニバーサル及び／又は同義性塩基である
。好ましくは、該塩基の約５０％以下はユニバーサル及び／又は同義性塩基であ
る。

【０００８】 本発明の別の実施態様は、2'-5'アデノシンオリゴマーを含むリボヌクレアー
ゼＬリクルーティング領域を含むオリゴヌクレオチドであり、ここで該オリゴヌ
クレオチドのRNA標的領域内の塩基のうち少なくとも一つはユニバーサル及び／
又は同義性塩基である。好ましくは、該RNA標的領域内の塩基の約５０％以下は
ユニバーサル及び／又は同義性塩基である。

【０００９】 本発明はまた、リボヌクレアーゼPをリクルートするよう設計されたオリゴヌ
クレオチドを提供し、該オリゴヌクレオチドのRNA標的領域内の塩基のうち少な
くとも一つはユニバーサル及び／又は同義性塩基である。好ましくは、該RNA標
的領域内の塩基の約５０％以下はユニバーサル及び／又は同義性塩基である。

【００１０】 本発明の別の実施態様は、少なくとも一つのユニバーサル及び／又は同義性塩
基をそのRNA標的領域に有するリボザイムである。好ましくは、該RNA標的領域内
の塩基の約５０％以下は同義性及び／又はユニバーサル塩基である。

【００１１】 本発明はまた、標的を切断することができるリボヌクレアーゼ活性の存在下で
RNA分子を上述したオリゴヌクレオチドのうちのいずれかと接触させる工程を含
む、標的RNA分子を切断するための方法を提供する。好ましくは、該リボヌクレ
アーゼはリボヌクレアーゼH、リボヌクレアーゼL或いはリボヌクレアーゼPであ
る。

【００１２】 本発明はまた、RNA分子を上述したリボザイムと接触させる工程を含む、標的R
NA分子を切断するための方法を提供する。

【００１３】 本発明はまた、前記RNA分子を上述したリボザイムと接触させる工程を含む、
標的RNA分子を切断するための方法を提供する。

【００１４】 本発明の別の実施態様は、RNA分子を６から約５０の間の塩基を有するオリゴ
ヌクレオチドと接触させる工程を含む標的RNA分子を切断するための方法であり
、ここで該オリゴヌクレオチドは少なくとも一つのユニバーサル及び／又は同義
性塩基を含む。

【００１５】 本発明はまた、１又はそれ以上の配列モチーフ内の１又はそれ以上の塩基を１
又はそれ以上のユニバーサル及び／又は同義性塩基で置換することを含む、１又
はそれ以上の配列モチーフを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの悪影響を軽
減する方法を提供する。好ましくは、該配列モチーフはCGジヌクレオチドである
。本好適実施態様の別の側面においては、該配列モチーフはポリG配列である。

【００１６】

【発明の実施の形態】

本発明は、１又はそれ以上のユニバーサル及び／又は同義性塩基を含むアンチ
センスオリゴヌクレオチド及び該アンチセンスオリゴヌクレオチドと相補的或い
はほぼ相補的な領域を含むRNAを標的とするための方法を提供する。天然のヌク
レオチド塩基（A, T, G, C, 及びU）のみを含む従来のアンチセンスオリゴヌク
レオチドは、その標的配列と完全に相補的である場合のみ有効である。換言すれ
ば、該オリゴヌクレオチドは、ミスマッチオリゴヌクレオチドとは充分な親和性
をもって結合できない。このことによって、従来のオリゴヌクレオチドの１塩基
変異多型（single nucleotide polymorphisms: SNPs）への結合能力は損なわれ
ており、単一アンチセンスオリゴヌクレオチドについて１又はそれ以上のミスマ
ッチを含む２又はそれ以上の相同遺伝子を標的とすることを不可能にしている。
本発明は、１又はそれ以上のユニバーサル及び／又は同義性塩基（以下に定義す
る）をアンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込むことにより、この問題を解決
する。これらのユニバーサル及び／又は同義性塩基はヌクレオチドのミスマッチ
を許容することができ、ヌクレアーゼのリクルートを許すのに充分な親和性をも
って結合するため、このミスマッチの問題を解決する。

【００１７】 アンチセンスオリゴヌクレオチドへの少なくとも１つのユニバーサル及び／又
は同義性塩基の組み込みは、一連の又は一団の天然塩基により生じる悪影響を軽
減或いは除くのに利用できる。オリゴヌクレオチド内の種々の短い塩基配列は、
アンチセンス特異的でない著しい配列依存性生物学的効果を引き起こす。例えば
、非メチル化“CG”ジヌクレオチドを含むほぼ全てのヌクレオチドは、動物に注
射された場合、或いは単離された骨髄細胞とインキュベートされた場合に、種々
の免疫活性化効果を生む。最も一般的なな免疫活性化効果は、B細胞増殖及びイ
ンターロイキン2のような炎症性サイトカインを含むサイトカイン産生の亢進で
ある。こうした免疫活性化現象の原因は、多くの治療用アンチセンスオリゴヌク
レオチド候補の何らかの有害な副作用によるものと信じられている。本発明は、
これらの“CG”反復中のC又はGの替わりに同義性又はユニバーサル塩基を置換す
ることにより、この問題に取り組む。このことが、有効で特異的なアンチセンス
活性を維持しながらも、望ましくない免疫活性化効果をなくすと考えられる。

【００１８】 加えて、“GGGG”及び他のポリGモチーフは、細胞培養での成長阻害や動物に
おける高い全身性毒性のような非アンチセンス効果を産むことが繰り返し示され
てきた。テトラG又は他のポリGモチーフ内でのユニバーサル及び／又は同義性塩
基の置換は、これらの配列を“解体”し、結果として、動物及び細胞培養の両方
において重要な研究的・治療的有効性を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド
を生じる。

【００１９】 ここで用いられる“アンチセンス”なる語は、遺伝子発現を妨害するようデザ
インされ、特定の所望の標的ポリヌクレオチド配列を認識或いはこれに結合でき
る分子を指す。アンチセンス分子は、（必然的ではないが）典型的には、RNA分
子上に存在する標的配列に特異的に結合できるオリゴヌクレオチド又はオリゴヌ
クレオチドアナログを含む。そのような結合は、ポリメラーゼ作用の妨害、RNA
プロセシング、及びリボヌクレアーゼH、リボヌクレアーゼL及びリボヌクレアー
ゼP等のヌクレアーゼのリクルーティング及び／又は活性化を含め、種々の手段
で翻訳に干渉する。

【００２０】 ここで用いられる“リボザイム”なる語は、ポリヌクレオチドを触媒的に切断
できるオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドアナログを指す。

【００２１】 “オリゴヌクレオチド”なる語は、DNA、RNA又はDNA/RNAハイブリッドからな
る分子を指す。

【００２２】 “オリゴヌクレオチドアナログ”なる語は、例えばバックボーン及び一連の塩
基を有し、ここで該バックボーン及び／又は１又はそれ以上の塩基は天然型DNA
又はRNAに見られる構造以外であり得るような、オリゴヌクレオチド様構造を含
む分子を指す。“非天然”オリゴヌクレオチドアナログは、天然DNA及びRNAには
見られない少なくとも１つの塩基又はバックボーン構造を含む。例示的オリゴヌ
クレオチドアナログには、限定されないが、DNA、RNA、ホスホロチオエートオリ
ゴヌクレオチド、ペプチド核酸（peptide nucleic acids: PNA）、メトキシエチ
ルホスホロチオエート、デオキシイノシン又はデオキシ5-ニトロインドールを含
むオリゴヌクレオチド、等が含まれる。

【００２３】 ここで用いられる“バックボーン”なる語は、規定の間隔で結合した複数の塩
基を支持することのできる、一般に直線状の分子を指す。好ましくは、該バック
ボーンは、標的ポリヌクレオチドの支持された塩基間でのハイブリダイゼーショ
ンに役立つ幾何学的条件で塩基を支持する。

【００２４】 “非天然型塩基”なる語は、A、C、G、T及びU以外の塩基を指し、同義性及び
ユニバーサル塩基並びに天然型塩基に或いは非天然型塩基に特異的に結合可能な
部分を含む。非天然型塩基には、限定されないが、プロピニルシトシン、プロピ
ニルウリジン、ジアミノプリン、5-メチルシトシン、7-デアザアデノシン、及び
7-デアザグアニンが含まれる。

【００２５】 “ユニバーサル塩基”なる語は、何らかの塩基で置換されていてもよい部分を
指す。ユニバーサル塩基はハイブリダイゼーションに寄与する必要はないが、ハ
イブリダイゼーションの著しい妨げとなってはいけない。ユニバーサル塩基の例
には、限定されないが、イノシン、5-ニトロインドール、及び4-ニトロベンズイ
ミダゾールが含まれる。

【００２６】 “同義性塩基”なる語は、プリンとピリミジンの両方とではないが、いかなる
プリン、又はいかなるピリミジンのいずれかと塩基対を形成できる部分を指す。
同義性塩基の例には、限定されないが、6H,8H-3,4-ジヒドロピリミド[4,5-c][1,
2]オキサジン-7-オン（“P”、ピリミジン模倣体）及び2-アミノ-6-メトキシア
ミノプリン（“K”、プリン模倣体）が含まれる。

【００２７】 “標的ポリヌクレオチド“なる語は、例えば生細胞に見られるような、アンチ
センス分子が結合或いは反応するよう意図されたDNAを指す。

【００２８】 “活性”なる語は、標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズした場合に、本発
明のアンチセンス分子が、標的ポリヌクレオチドの転写及び／又は翻訳を干渉す
る能力を指す。好ましくは、該干渉は、アンチセンス分子がハイブリダイズした
とき、ヌクレアーゼをリクルートすることから、及び／又はヌクレアーゼ基質と
して働くことから生じる。“干渉”なる語は、いかなる検出可能な程度の阻害を
も含む。

【００２９】 “リボヌクレアーゼHリクルーティング”なる語は、少なくとも１つのホスホ
ロチオエート及び／又はホスホジエステルバックボーンを有するオリゴヌクレオ
チドを指す。このタイプのバックボーンは、いったんRNA／DNAハイブリッドが形
成されるとリボヌクレアーゼHにより認識され、リボヌクレアーゼHが標的RNAを
切断するのを可能にする。

【００３０】 “非リボヌクレアーゼHリクルーティング”なる語は、デオキシホスホジエス
テル又はデオキシホスホロチオエート結合以外の結合を有するオリゴヌクレオチ
ドを指し、限定されないが、2'-O-アルキル、PNA、メチルホスホネート、3'-ア
ミデート、2'-F、モルホリノ、2'-O-アルキルアミノアルキル及び2'-アルコキシ
アルキルを含む。このタイプのオリゴヌクレオチドは、DNA／RNAハイブリッド形
成後リボヌクレアーゼHによって認識されない。

【００３１】 “リボヌクレアーゼLリクルーティング”なる語は、2',5'-結合してオリゴマ
ーを形成した４つの連続的アデノシン塩基を含むオリゴヌクレオチドを指す。こ
のオリゴマーは、いったんDNA／RNAハイブリッドが形成されるとリボヌクレアー
ゼLにより認識される（米国特許第5,583,032号参照）。

【００３２】 “リボヌクレアーゼPリクルーティング”なる語は、通常はtRNA前駆体分子の
部分切断による成熟tRNAの生成に関わる酵素である、リボヌクレアーゼPにより
認識されるステムループ構造を形成することが可能なオリゴヌクレオチドを指す
。このステムループ構造は、天然tRNA基質に似ており、Maらにより（Antisense
Nucl. Acid Drug Dev. 8: 415-426, 1998）或いは米国特許第5,877,162号におい
て説明されている。

【００３３】 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドアナログは
、好ましくは６から約５０の間の塩基長であり、より好ましくは約１０から３０
塩基長、最も好ましくは約１５から２５の間の塩基長である。１８塩基対を有す
るオリゴヌクレオチドは特に好ましい。

【００３４】 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドアナログは
、典型的には少なくとも１つのユニバーサル又は同義性塩基、および少なくとも
１つの修飾されたバックボーン結合を含む。一般には、これらのオリゴヌクレオ
チドは、約５０％を越えるユニバーサル及び／又は同義性塩基を含まない。

【００３５】 本発明のオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドアナログは、標準的なオ
リゴヌクレオチド合成方法を用いて合成できる（実施例１参照）。

【００３６】 結合ドメイン中に用いられたオリゴヌクレオチドは、天然DNA及び／又はRNAに
ハイブリダイズする分子を結果的に生じることのできるいかなるバックボーン及
びいかなる配列をも用いることができる。適当なバックボーンの例には、限定さ
れないが、ホスホジエステル及びデオキシホスホジエステル、ホスホロチオエー
ト及びデオキシホスホロチオエート、2'-O-置換ホスホジエステル及びデオキシ
アナログ、2'-O-置換ホスホロチオエート及びデオキシアナログ、モルホリノ、P
NA（米国特許第5,539,082号）、2'-O-アルキルメチルホスホネート、3'-アミデ
ート、MMI、アルキルエーテル（米国特許第5,223,618号）及び米国特許第5,378,
825号、5,489,677号、5,541,307号で示された他のもの、等が含まれる。リボヌ
クレアーゼ活性が望まれる場合には、リボヌクレアーゼ基質として働くことので
きるバックボーンは、少なくともオリゴヌクレオチドの一部に用いられる。

【００３７】 本発明における使用に適したユニバーサル塩基には、限定されないが、デオキ
シ5-ニトロインドール、デオキシ3-ニトロピロール、デオキシ4-ニトロベンズイ
ミダゾール、デオキシネブラリン、デオキシイノシン、2'-OMeイノシン、2'-OMe
5-ニトロインドール、2'-OMe 3-ニトロピロール、2'-Fイノシン、2'-Fネブラリ
ン、2'-F 5-ニトロインドール、2'-F 4-ニトロベンズイミダゾール、2'-F 3-ニ
トロピロール、PNA-5-イントロインドール(PNA-5-introindole)、PNA-ネブラリ
ン、PNA-イノシン、PNA-4-ニトロベンズイミダゾール、PNA-3-ニトロピロール、
モルホリノ-5-ニトロインドール、モルホリノ-ネブラリン、モルホリノ-イノシ
ン、モルホリノ-4-ニトロベンズイミダゾール、モルホリノ-3-ニトロピロール、
ホスホルアミデート-5-ニトロインドール、ホスホルアミデート-ネブラリン、ホ
スホルアミデート-イノシン、ホスホルアミデート-4-ニトロベンズイミダゾール
、ホスホルアミデート-3-ニトロピロール、2'-O-メトキシエチルイノシン、2'-O
-メトキシエチルネブラリン、2'-O-メトキシエチル5-ニトロインドール、2'-O-
メトキシエチル4-ニトロ-ベンズイミダゾール、2'-O-メトキシエチル3-ニトロピ
ロール、デオキシR_pMP-5-ニトロインドールダイマー、2'-OMeR_pMP-5-ニトロイン
ドールダイマー等が含まれる。

【００３８】 本発明における使用に適した同義性塩基には、限定されないが、デオキシP（A
&G）、デオキシK（U&C）、2'-OMe 2-アミノプリン（U&C）、2'-OMe P（G&A）、2
'-OMe K（U&C）、2'-F-2-アミノプリン（U&C）、2'-F P（G&A）、2'-F K（U&C）
、PNA-2-アミノプリン（U&C）、PNA-P（G&A）、PNA-K（U&C）、モルホリノ-2-ア
ミノプリン（U&C）、モルホリノ-P（G&A）、モルホリノ-K（U&C）、ホスホルア
ミデート-2-アミノプリン（C&U）、ホスホルアミデート-P（G&A）、ホスホルア
ミデート-K（U&C）、2'-O-メトキシエチル2-アミノプリン（U&C）、2'-O-メトキ
シエチルP（G&A）、2'-O-メトキシエチルK（U&C）、デオキシR_pMP-KPダイマー、
デオキシR_pMP-PKダイマー、デオキシR_pMP-Kkダイマー、デオキシR_pMP-PPダイマ
ー、2'-OMeR_pMP-KPダイマー、2'-OMeR_pMP-PKダイマー、2'-OMeR_pMP-KKダイマー
、2'-OMeR_pMP-PPダイマー等が含まれる。

【００３９】 本発明は、１遺伝子以上を標的とする単一アンチセンス分子を提供するための
アンチセンスオリゴヌクレオチドにおけるユニバーサル及び／又は同義性塩基使
用のための方法を提供する。これらのユニバーサル及び／又は同義性塩基は、ア
ンチセンス分子のリボヌクレアーゼH部分或いは非リボヌクレアーゼH部分のいず
れかにおいて用いられ得る。標的上の１以上の塩基と結合する能力は、１以上の
RNA配列を標的とする１つのアンチセンス分子を作製する柔軟性を与える。

【００４０】 オリゴヌクレオチド合成は、修飾塩基及びバックボーン結合を含むオリゴヌク
レオチド合成として、当該技術分野においてよく知られている。本発明の１つの
実施態様においては、６から約５０の間の塩基を有し、これら塩基のうち少なく
とも１つがユニバーサル及び／又は同義性塩基で置換された、アンチセンスホス
ホロチオエートオリゴヌクレオチドが提供される。好適な実施態様では、該塩基
の多くておよそ５０％がユニバーサル及び／又は同義性塩基である。本発明にお
ける使用のための別のオリゴヌクレオチドは、３から約１５塩基の間の非リボヌ
クレアーゼリクルーティング部分、次に３から約１５塩基の間のリボヌクレアー
ゼリクルーティング部分、次に３から約１５塩基の第二の非リボヌクレアーゼH
リクルーティング部分を含み、ここで該オリゴヌクレオチド中の少なくとも１つ
の塩基は同義性及び／又はユニバーサル塩基である。好適な実施態様では、該塩
基の多くておよそ５０％がユニバーサル及び／又は同義性塩基である。本発明に
おける使用が意図される他のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、非リボヌクレ
アーゼHリクルーティング部分に引き続き非リボヌクレアーゼHリクルーティング
部分を含み、その塩基の少なくとも１つはユニバーサル及び／又は同義性塩基で
置換される。好ましい実施態様においては、該塩基の多くておよそ５０％がユニ
バーサル及び／又は同義性塩基である。リボヌクレアーゼHリクルーティング部
分に続き非リボヌクレアーゼHリクルーティング部分を含みこれら塩基のうち少
なくとも１つが同義性及び／又はユニバーサル塩基で置換されたアンチセンスオ
リゴヌクレオチドもまた、本発明の範囲内にある。好適な実施態様では、該塩基
の多くておよそ５０％がユニバーサル及び／又は同義性塩基である。

【００４１】 本発明における使用のために意図される他のアンチセンスオリゴヌクレオチド
には次のものが含まれる：リボヌクレアーゼLリクルーティングリゴヌクレオチ
ド2'-5'アデノシン部分を含むオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオ
チドは少なくとも１つの同義性及び／又はユニバーサル塩基を含む；及びリボヌ
クレアーゼPをリクルートするようデザインされたオリゴヌクレオチドであって
、該オリゴヌクレオチドは少なくとも１つの同義性及び／又はユニバーサル塩基
を含む。好適な実施態様では、該塩基の多くておよそ５０％がユニバーサル及び
／又は同義性塩基である。

【００４２】 本発明の別の実施態様は、RNA標的配列内の少なくとも１つの塩基が同義性及
び／又はユニバーサル塩基であるリボザイムである。好適な実施態様では、該塩
基の多くておよそ５０％がユニバーサル及び／又は同義性塩基である。リボザイ
ム活性のため最低限必要な配列は、Benselerらによって示されている（J. Am. C
hem. Soc. 115: 8483-8484, 1993）。ハンマーヘッドリボザイム分子は、基質ポ
リヌクレオチドとハイブリダイズする末端ドメイン（“I”及び“III”）、触媒
部位、及び該分子をまとめることができる種々の他構造と置換され得るステムル
ープ構造（“II”）を含む。

【００４３】 本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、後に示す実施例において説明す
るように、１又はそれ以上の遺伝子、より好ましくは治療用遺伝子、最も好まし
くは抗アポトーシス又は化学療法抵抗性遺伝子を標的とするために用いることが
できる。

【００４４】 本発明における使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの代表的分類を
以下に示す。本図には十八量体が示されているが、これは限定的なものでなく具
体例であると見なされるべきである。

【００４５】

【化１】

【００４６】 これらの配列中、Bはユニバーサル塩基又は同義性塩基である；Nは、限定され
ないがA、C、G、T、U、プロピニルC、プロピニルU、ジアモプリン、5-MeC、7-デ
アザA及び7-デアザGを含むRNA標的塩基の特異的認識が可能である天然型又は非
天然型塩基である。下線は非リボヌクレアーゼHリクルーティング部分を表わし
、限定されないが、2'-O-アルキル、PNA、メチルホスホネート、3'-アミデート
、2'-F、モルホリノ、2'-O-アルキルアミノアルキル及び2'-アルコキシアルキル
を含む。“・・・・”は、限定されないが米国特許第5,583,032号に開示されたもの
を含めたリンカーを表わす。“#”は、リボザイムオリゴヌクレオチドのリボザ
イム切断部分を表わす；“&”は、リボヌクレアーゼPをリクルートするステムル
ープ構造を表わす；a・a・a・a・は、オリゴマー性2'-5'アデノシンの四量体を表わ
す。配列番号11もまた、リボヌクレアーゼPの基質である標的RNA上のループ構造
形成を誘導することによりリボヌクレアーゼPをリクルートするようデザインさ
れる（米国特許第5,877,162号参照）。

【００４７】 上記アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムは、１又はそれ以上の標
的RNA分子をin vitro或いはin vivoで切断するために用いられる。

【００４８】

【実施例】

実施例１ オリゴヌクレオチド合成 試薬は全て乾燥した状態で使用する（＜30ppm水）。オリゴヌクレオチド合成
試薬をグレン・リサーチ社より入手する。溶液のアミダイトをTrap-paks（パー
キンエルマー・アプライドバイオシステムズ、ノーウォーク、コネチカット州）
上で乾燥させる。ジメトキシトリチル（DMT）基で保護されたプロピルリンカー
で予め誘導体化された固体支持体を、パーキンエルマー・アプライドバイオシス
テムズのExpediteシンセサイザーと互換性のあるDNAシンセサイザーのカラム内
に置く（1mmolの出発プロピルリンカー）。該DMT基を脱保護剤（ジクロロメタン
中2.5%のジクロロ酢酸）で除去する。RNA及びDNA合成のための標準プロトコルを
アミダイトに応用する（乾燥アセトニトリル中0.1M）。該アミダイトをテトラゾ
ールにより活性化する（乾燥アセトニトリル中0.45M）。カップリング時間は典
型的にはアミダイト次第で15分までである。ホスホナイト中間体を酸化Beaucage
硫化剤で処理する。酸化ステップの後ごとに、カップリングしていない残存する
5'-OH基上にアセチル基を配置するキャッピングステップを、キャッピング剤２
種の混合物での処理によって行う：CAP A（無水酢酸）及びCAP B（n-メチルイミ
ダゾールのTHF溶液）。該サイクルを、所望の配列を得るよう種々のアミダイト
で充分な回数繰り返す。所望の配列が得られた後、該支持体を濃アンモニア水中
55℃で16時間処理する。該溶液をspeed vacで濃縮し、残渣を100mlの0.1Mトリエ
チルアンモニウムアセテート溶液に溶解する。これをHPLCカラム（C-18、クロマ
シル、5mm、直径4.3mm、長さ250mm）にアプライし、アセトニトリルグラジエン
ト（溶媒A、0.1M TEAA；溶媒B、0.1M TEAA及び50%アセトニトリル）を流速1ml/
分で30分間溶出する。80%以上の純度の生成物を含むフラクションを集めて濃縮
する。得られた残渣を80%酢酸水溶液に溶解してトリチル基を除去し、再び逆層
カラムにアプライして、上述した通り精製する。90%以上の純度を含むフラクシ
ョンを集めて濃縮する。

【００４９】 本発明のオリゴヌクレオチドのアンチセンス活性は、例えば実施例2-4に示す
ような標準アッセイ法によって測定できる。通常、既知の配列を有する標的ポリ
ヌクレオチドを調製し、標的配列に結合して複合体を形成するよう選ばれた本発
明のオリゴマーを該標的に接触させ、該複合体を所望の標的ヌクレアーゼによる
切断に供し、該生成物を分析して切断が起こったかどうかを判定することができ
る。活性は、切断された標的ポリヌクレオチドを直接検出することにより（例え
ば標識プローブへのハイブリダイゼーション、PCRによる増幅、ゲル上での可視
化等により）、或いは宿主細胞の表現型への影響により（例えば、選択されたタ
ンパクの発現又は発現の欠如）測定できる。リボヌクレアーゼH切断アッセイに
ついては後述する。

【００５０】 実施例２ リボヌクレアーゼH切断アッセイ 分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP）の一部をコードするdsDNAフラグメン
トを調製するため、以下のプライマーを用いてPCRを行う：

【００５１】

【化２】

【００５２】 これらのプライマーは次の配列を有するSEAP RNAフラグメント（1から102）に
基づく：

【００５３】

【化３】

【００５４】 PCR増幅は製造業者（ライフテクノロジー社）の推奨反応条件下で行う。プラ
イマーP3.1及びP5を10nMで用いる一方、プライマーP3及びP4を0.50μMで用いる
。PCRプログラムは94℃で5分間、52℃で30秒間、72℃で1分、94℃で45秒および7
2℃で10分間で35サイクルである。

【００５５】 次にSEAP dsDNAをRiboMax（商標）ラージスケールRNAキット（プロメガ社、マ
ジソン、ウィスコンシン州）を用いてssRNAに転写する。SEAP DNA濃度は30μg/m
lである。デオキシリボヌクレアーゼIを添加して37℃で15分間インキュベートす
ることにより転写反応を終結する。DNAフラグメント及び遊離のヌクレオチドを
、エタノール／酢酸ナトリウム中での沈殿及び70％エタノールでの洗浄によって
除去する。リボヌクレアーゼH活性アッセイでの使用のため、該RNAを懸濁してお
よそ2μMまで希釈する。

【００５６】 SEAP RNAの一部と相補的な本発明のオリゴヌクレオチド（各20μM）、SEAP RN
A（2μM溶液の10μl）、及びTris/EDTAバッファー（10mM Tris-HCl、pH7.4、1mM
EDTA、“TE”、2μlとなるよう十分量）を500μlの薄肉反応管に加え、40℃で3
から5分間、熱平衡に達するまでインキュベートする。リボヌクレアーゼHバッフ
ァー（10X： 200mM Tris-HCl、pH7.4-7.5、1,000mM KCl、100mM MgCl₂・6H₂O、0.
5mMジチオスレイトール、25％w/vスクロース）、リボヌクレアーゼH（0.4から0.
6U、プロメガ社）及び水（20μlとなるよう十分量）を混合して反応混液を作り
、40℃で3から5分間インキュベートする。次に8μlの反応混液を各反応管に加え
、冷却を避けるため可能な限りすばやく混合する。反応液を、MJリサーチ（ウォ
ータータウン、マサチューセッツ州）PCT−100温度調節器にて40℃で30分間イン
キュベートする。20μlのFDEサンプルバッファー（90％v/vホルムアミド、10％v
/v 10X TBEバッファー、0.5％w/vブロムフェノールブルー、25mM EDTA）(1X TB
E：89mM Tris塩基、89mMホウ酸、2mM EDTA、pH8.0)を各反応液に加え、90℃で3
から5分間加熱して反応を止める。

【００５７】 各サンプル（8から10μl）を、200ボルトで約1時間、或いは染料の先端がゲル
の下部に達するまで、15％変性ゲル上でポリアクリルアミドゲル電気泳動に供す
る。該ゲルをCyber Gold（商標）（モレキュラープローブス社、ジャンクション
シティ、オレゴン州）の1X TBE中1:10,000希釈液に5-10分間浸し、更に5-10分間
1X TBEに浸し、短波UVトランスイルミネイター上で照射することにより、ゲル中
の核酸バンドを可視化する。CyberGREEN（商標）フィルター及びポラロイドType
667 3000 ASA白黒フィルムを備えたポラロイド（登録商標）MP-4カメラを用いて CyberGold（商標）蛍光を撮影することによって結果を記録する。

【００５８】 二重鎖DNAラダー（20bp及び100bp、GenSura社、サンディエゴ）をサイズスタ
ンダードとして用いる。スタンダードラダーはゲル上にロードするまで加熱せず
、未変性であり、二重鎖DNAフラグメントとして変性及び非変性両方のゲルに流
す。 実施例３タンパク質キナーゼCアルファ（PKCα）に対する細胞内アンチセンス活性 タンパク質キナーゼCアルファ（PKCα）を遺伝子標的として用いて、本発明の
同義性及び／又はユニバーサル塩基を含むオリゴヌクレオチドのアンチセンス活
性を実証する。PKCαは正常ヒト遺伝子であり、ヒトのガンタイプの大多数にお
いて過剰発現され、全てのアンチセンス標的遺伝子の中で最もよく公表されてい
るものの一つである。

【００５９】 PKCαを過剰発現することが知られる細胞系であるヒト膀胱ガン細胞系（T-24
、ATCC HTB-4）を、標準方法を用いて培養する：37℃、10％ウシ胎児血清及びペ
ニシリン−ストレプトマイシンを含むMcCoy's 5A培地（メディアテック社、ハー
ンドン、バージニア州）の75cm²フラスコ中5％CO₂。アンチセンス実験のため、T
-24細胞を12ウェルプレートに75,000細胞／ウェルで植付け、トランスフェクシ
ョン前に一晩付着させて回復させる。X残基が（同じ又は異なって）ユニバーサ
ル及び／又は同義性塩基であり残りの残基がホスホロチオエート結合以外の修飾
バックボーン結合でつながるオリゴヌクレオチド5'-GTTCTCXXXXXXGAGTTT-3'（配
列番号17）とコントロールのオリゴヌクレオチドを、T-24中の蛍光標識された本
発明オリゴヌクレオチドの効率的な核移送を提供するカチオン性脂質含有細胞移
入剤（LipofectACE（商標））（ギブコBRL社、ゲイザーズバーグ、メリーランド
州）を用いてT-24細胞にトランスフェクトする。これが5'-GTTCTCGCTGGTGAGTTTC
A-3'（配列番号18）のアナログであり公知のPKCαアンチセンス分子である。

【００６０】 本発明のオリゴヌクレオチド及び従来の全ホスホロチオエートオリゴヌクレオ
チドを1.5mlの低血清培地Opti-MEM（登録商標）I（ギブコBRL社）に400nM濃度ま
で希釈する。次にオリゴヌクレオチド含有溶液を、最終的に脂質対オリゴヌクレ
オチド比が重量で5対1となるのに十分なLipofectACEを含む、等量のOPti-MEM I
と混合する。オリゴヌクレオチドの最終濃度は200nMである。該オリゴヌクレオ
チド／脂質複合物を室温で20分間インキュベートしたのち、組織培養細胞に添加
する。

【００６１】 細胞を一度リン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄して血清含有培地を洗い流し、次
に1mlのトランスフェクション混合物を12ウェルプレートの各ウェルに添加する
。トランスフェクションは全て３重(triplicate)で行う。全部の細胞RNAを収集
するに先立ち、該細胞をオリゴヌクレオチド／脂質複合物を22時間吸収させる。
擬似トランスフェクションはOpti-MEM Iのみで処理された細胞から成る。

【００６２】 22時間のアンチセンス処理後、全RNAを細胞より収集する。該細胞を標準方法
に従ってトリプシン／EDTA処理によりプレートから外す。三つ組みグループの細
胞を集め、全細胞質RNAをRNeasyキット（キアゲン社）を用い製造業者のプロト
コルに従って単離する。標準方法に従って該RNAをデオキシリボヌクレアーゼIで
処理しUV定量化する。

【００６３】 ギブコBRLからのスーパースクリプト・ワンステップRT-PCRキットの方法及び
材料で逆転写酵素／ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）を行う。PKCαを検出する
ためのRT-PCR反応は、オックスフォード・バイオメディカルリサーチからのPKC
α特異的プライマー及び100ngの投入全RNAを用いて２つの独立したランにおいて
行われる。

【００６４】 コントロールのマルチプレックスRT-PCRs（MP RT-PCRs）を行い、各PKCα RT-
PCRへの投入RNAの等含量を確実にする。プライマー、試薬及びプロトコルはマキ
シム・バイオテック社からである。コントロールMP RT-PCRsは、BAX及びLICE遺
伝子を全サンプルにおいて等しく増幅し、PKCα RT-PCRsへの等量無傷のRNAの添
加を確実にする。

【００６５】 RT-PCR反応は全て以下のPTC-1000サーモサイクラー（MJリサーチ社）のプログ
ラムに従って行う：ステップ１、50℃で35分；ステップ２、94℃で2分；ステッ
プ３、55℃で30秒；ステップ４、72℃で1分；ステップ５、94℃で30秒；ステッ
プ６、ステップ３を更に33回；ステップ７、72℃で10分間；ステップ８、終了。
RT-PCR生成物は全て4％スーパーレゾルーションアガロースTBEゲル（Apex社）で
分離し、製造業者の説明書に従いCyberGold（商標）で染色する。ゲルをポラロ
イドType667フィルムで撮影する。 実施例４ 組織培養細胞中のヒトBcl2遺伝子に対するアンチセンス活性 B細胞リンパ腫関連遺伝子２（Bcl2）は、ヒトのガンタイプの大多数において
過剰発現される“正常な”ヒト遺伝子である。Bcl2タンパクは細胞死を制御し、
BCl過剰発現は細胞が化学療法及び放射線耐性となる原因であることが知られて
いる。以下のBcl2標的アンチセンス分子を合成する： 5'-TCTXCCXXCXTXCXCCXT-3'（配列番号19）、ここでXは同じ又は異なったユニバ
ーサル及び／又は同義性塩基であり、最初の９残基は非リボヌクレアーゼHリク
ルーティング領域である（すなわち、ホスホロチオエート結合以外の修飾バック
ボーン結合を含む）。これがオリゴヌクレオチド5'-TCTCCCAGCGTGCGCCAT-3'（配
列番号20）のアナログである。

【００６６】 T-24細胞を75,000細胞／ウェルで植付け、オリゴヌクレオチドトランスフェク
ション前に一晩付着させて回復させる。試験／コントロールのオリゴヌクレオチ
ドをLipofectACE（商標）を用いてT-24細胞にトランスフェクトする。オリゴヌ
クレオチドを1.5mlの低血清培地（Opti-MEM（登録商標）、ギブコBRL社）に400n
M濃度まで希釈する。次にオリゴヌクレオチド含有溶液を、最終的に脂質対オリ
ゴヌクレオチド比が重量で5対1となるのに十分なLipofectACEを含む、等量のOpt
i-MEM Iと混合する。オリゴヌクレオチドの最終濃度は200nMである。該オリゴヌ
クレオチド／脂質複合物を室温で20分間インキュベートしたのち、組織培養細胞
に添加する。細胞を一度PBSで洗浄し、次に1mlのトランスフェクション混合物を
12ウェルプレートの各ウェルに添加する。トランスフェクションは全て３重で行
う。全部の細胞RNAを収集するに先立ち、該細胞にオリゴヌクレオチド／脂質複
合物を24時間吸収させる。擬似トランスフェクションはOpti-MEM Iのみで処理さ
れた細胞から成る。全細胞質RNAを単離し、実施例３に示すように定量化する。

【００６７】 実施例３で説明した通りにRT-PCRを行う。bcl-2を検出するためのRT-PCRは次
のプライマー：5'-GGTGCCACCTGTGGTCCACCTG-3'（配列番号21）及び5'-CTTCACTTG
TGGCCCAGATAGG-3'（配列番号22）及び1μgの投入全RNAを用いて行う。βアクチ
ンに対するコントロールのRT−PCR反応もまた、プライマー5'-GAGCTGCGTGTGGCTC
CCGAGG-3'（配列番号23）及び5'-CGCAGGATGGCATGGGGGGCATACCCC-3'（配列番号24
）及び0.1μgの投入全RNAを用いて行う。

【００６８】 bcl-2及びβ-アクチンRT-PCR反応は全て以下のPTC-100サーモサイクラー（MJ
リサーチ社）のプログラムに従って行う：ステップ１、50℃で35分；ステップ２
、94℃で2分；ステップ３、60℃で30秒；ステップ４、72℃で1分；ステップ５、
94℃で30秒；ステップ６、ステップ３を更に35回；ステップ７、72℃で10分間；
ステップ８、終了。RT-PCR生成物は全て4％スーパーレゾルーションアガロースT
BEゲルで分離し、製造業者の説明書に従いCyberGold（商標）で染色する。ゲル
をポラロイドType667フィルムで撮影する。 実施例５ Bcl-2A及びbcl-xLのアンチセンスターゲッティング 多くの腫瘍は複合化学療法耐性遺伝子を同時に過剰発現し、それゆえ一度にた
だ一つの特異的化学療法耐性遺伝子に対する、アンチセンスに基づく治療に応答
する見込みはない。単一アンチセンスオリゴヌクレオチドによる複合耐性遺伝子
のノックアウトにより、耐性腫瘍の化学感受性化を高めることができる。そのよ
うな化学療法耐性遺伝子の同時発現の公知の例は、bcl-2A及びbcl-xLであり、こ
れらは異なるが関連した、ヒトのガンの多くにおいて過剰発現する形質転換オン
コジーンである。最も重要には、該bcl-2ファミリーメンバーの両方の過剰発現
は、細胞に化学療法耐性を与えることが示された。

【００６９】 両遺伝子を同時にノックアウトしようとする先に報告された試みは、両方では
なく一方の遺伝子又は他方と完全に相補的な従来のオリゴヌクレオチドに基づい
ていたため、幾つかのミスマッチや標的遺伝子の一つに対して低い活性を有する
。従って、これらの試みは、長鎖オリゴヌクレオチドの非特異的リボヌクレアー
ゼH依存活性に依っている。対照的に、各遺伝子に対し標的とされた２又はそれ
以上のオリゴヌクレオチドの使用は、はるかに毒性を生じ非特異的アンチセンス
活性を産む見込みがある。

【００７０】 本発明は２又はそれ以上の遺伝子の同時ノックアウトのための単一アンチセン
スオリゴヌクレオチドを提供する。例えば、図１に示すヌクレオチドホモロジー
の高い小領域を標的とする１又はそれ以上のユニバーサル及び／又は同義性塩基
を含む単一オリゴヌクレオチドにより、bcl-2及びbcl-xLを同時に標的とする。
１又はそれ以上のユニバーサル及び／又は同義性塩基を含む６つの代表的アンチ
センスオリゴヌクレオチド、及びそれらがハイブリダイズする領域を図１に示す
（ヒトbcl-2 mRNA（HUMBCL2A）・ジーンバンク#M13994；bcl-xL mRNA（HSBCLXL
）・ジーンバンク#Z23115）。星印はヌクレオチド類似性領域におけるミスマッ
チを示す。塩基番号はジーンバンクで定義される通りである。 実施例６ ２又はそれ以上の関連遺伝子のターゲッティング タンパク質キナーゼC（PKC）遺伝子ファミリーは、細胞外シグナルに応答して
他のタンパクをリン酸化することにより、細胞増殖を制御する遺伝子産物を含む
。PKC遺伝子の過剰発現はヒトのガンタイプの幾つかにおいて発見されてきてお
り、PKC遺伝子はガン治療の標的である可能性があると考えられている。PKCファ
ミリーメンバーのタンパク質レベルでの類似性にもかかわらず、そのヌクレオチ
ド配列は著しく異なるということがあり得る。１又はそれ以上のユニバーサル又
は多義性の塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、２又はそれ以上のPK
Cファミリーメンバーをヌクレオチドレベルで標的とする。図２は、ヒトPKCα m
RNA（HSPKCA1；ジーンバンク#X52479）、ヒトPKCθ mRNA（HUMPKCTH；ジーンバ
ンク#L07860）、及びヒトPKCδ mRNA（HUMPKCD13X；ジーンバンク#L07860）のホ
モロジー領域１及び２の配列アラインメントを示す。これらPKCファミリーメン
バーの２又は３つを標的とするための代表的なオリゴヌクレオチドを図２に示す
。 実施例７ 同一遺伝子の２つのアレルのターゲッティング 重要なヒトオンコジーンであるbcl-2のアレル変異の比較により、一般的なヒ
ト個体群内で幾つかの一塩基変異多型（SNPs）が明らかとなった。bcl-2の公知
アレルのいずれかの過剰発現は、ヒト腫瘍において化学療法耐性を与えることが
示されており、悪い予後を暗示するものと見なされている。bcl-2遺伝子の２又
はそれ以上のアレルは、SNPsの発生によって制限されずに、１又はそれ以上のユ
ニバーサル又は同義性塩基を含む単一オリゴヌクレオチドにより標的とされ得る
。ヒトbcl-2B（HUMBCL2B；ジーンバンク#M13995）及びヒトbcl-2C（HUMBCL2C；
ジーンバンク#M14745）の２つの領域を、両アレルの領域を標的とする代表的オ
リゴヌクレオチドとして図３に示す。

【００７１】 これによって、遺伝子アレル間の重複部分全長に渡り分布した一連のアンチセ
ンスオリゴヌクレオチドの評価であるアンチセンスオリゴヌクレオチド遺伝子歩
行を、SNPsの発生に制限されずに行うことができる。アンチセンスオリゴヌクレ
オチドにより標的とされた領域にSNPsがもし含まれていないとすれば、遺伝子発
現の充分な阻害をもたらす有効なアンチセンス標的部位を同定するには遺伝子歩
行ははるかに有効性をもたないであろう。 実施例８ 問題のあるアンチセンス塩基配列モチーフの除去 側面が“###”である図３のオリゴヌクレオチドは、ユニバーサル及び／又は
同義性塩基のアンチセンスオリゴヌクレオチドへの組み込み、即ち、先に検討し
たように悪影響を持ち得る“CG”ジヌクレオチド及びテトラ-G配列を除去するこ
との別の利点を表わす。従って、ユニバーサル及び／又は同義性塩基の使用によ
り、ユニバーサル及び／又は多義性塩基を問題のある配列モチーフへ置換するこ
とによる配列依存性の非アンチセンス効果を除去する。このことはまた以下に示
される： アンチ-bcl-2： 3'-GGGCCCGTGTGCGGGGTA（配列番号25）（テトラ-G） は次のようになる： 3'-GGGCCPGTGTGPGKGGTA（配列番号26） アンチ-bcl-2： 3'-CGTCTGGGGCCGACGGGGG（配列番号27）（ダブルテトラ-G） は次のようになる： 3'-CGTCTGKGGCCGACGGKGG（配列番号28） アンチ-bcl-2： 3'-GGCCGCGGCGGCGCCCCG（配列番号29）（高CG） は次のようになる： 3'-GGCPGPGGPGGPGCCCPG（配列番号30） 本発明の特定の実施態様を詳細に示したが、これらの実施態様が限定的でなく
むしろ例示的であることは当業者にとって明らかであり、本発明の真の範囲は以
下のクレームに定義されるものである。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】ヒトbcl-2Aとヒトbcl-xL遺伝子間の高いホモロジー領域の配列アライ
ンメントを示す。整列した配列領域と相補的であり、１又はそれ以上のユニバー
サル及び／又は同義性塩基を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを、配列アラ
インメントの下に示す。塩基ミスマッチを星印で表示する。Bはユニバーサル塩
基を表わす。P及びKは、各々いずれのピリミジン及びいずれのプリンとも対合す
る同義性塩基である。

【図２】３つのヒトタンパク質キナーゼC（PKC）ファミリーメンバーの３つの
ホモロジー領域の配列アラインメントを示す。整列した該配列領域と相補的であ
り、１又はそれ以上のユニバーサル及び／又は同義性塩基を含むアンチセンスオ
リゴヌクレオチドを配列アラインメントの下に示す。これらのアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドは同時に２又はそれ以上のPKCファミリーメンバーを標的とする
。

【図３】bcl-2遺伝子の２つのアレル、bcl-2B及びbcl-2C間のホモロジー領域
の配列アラインメントを示す。１又はそれ以上のユニバーサル及び／又は同義性
塩基を含む代表的アンチセンスオリゴヌクレオチドを配列アラインメントの下に
示す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年５月４日（２００１．５．４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ， ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ， ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，Ｓ Ｇ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ライリー ティモシー エー． アメリカ合衆国 92129 カリフォルニア サン ディエゴ ウォー ホース スト リート 12894 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 CA01 HA14 HA17 4B050 CC10 DD11 LL01 LL05

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくとも１つの非天然型バックボーン結合を有し、且つ６
   から約５０の間の塩基を有し、ここで該塩基の少なくとも１つがユニバーサル及
   び／又は同義性塩基であるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
2. 【請求項２】 該塩基の約５０％以下がユニバーサル及び／又は同義性塩基
   である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
3. 【請求項３】 ３から約１５の間の塩基を有する第一の非リボヌクレアーゼ
   Hリクルーティング領域、３から約１５の間の塩基を有するリボヌクレアーゼHリ
   クルーティング領域、及び第二の非リボヌクレアーゼHリクルーティング領域を
   含み、ここで該塩基のうち少なくとも１つはユニバーサル及び／又は同義性塩基
   であるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
4. 【請求項４】 該塩基の約５０％以下がユニバーサル及び／又は同義性塩基
   である、請求項３に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
5. 【請求項５】 非リボヌクレアーゼHリクルーティング部分及びリボヌクレ
   アーゼHリクルーティング部分を含み、ここで該塩基のうち少なくとも１つはユ
   ニバーサル及び／又は同義性塩基であるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
6. 【請求項６】 該塩基の約５０％以下がユニバーサル及び／又は同義性塩基
   である、請求項５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
7. 【請求項７】 2'-5'アデノシンオリゴマーを含むリボヌクレアーゼLリクル
   ーティング領域を含むオリゴヌクレオチドであって、該オリゴヌクレオチドのRN
   A標的領域は少なくとも１つはユニバーサル及び／又は同義性塩基を含む、オリ
   ゴヌクレオチド。
8. 【請求項８】 該RNA標的領域が約５０％以下のユニバーサル及び／又は同
   義性塩基を含む、請求項７に記載のオリゴヌクレオチド。
9. 【請求項９】 該オリゴヌクレオチドのRNA標的領域が少なくとも１つのユ
   ニバーサル及び／又は同義性塩基を含む、リボヌクレアーゼPをリクルートする
   よう設計されたオリゴヌクレオチド。
10. 【請求項１０】 該RNA標的領域が約５０％以下のユニバーサル及び／又は
    同義性塩基を含む、請求項９に記載のオリゴヌクレオチド。
11. 【請求項１１】 少なくとも１つのユニバーサル及び／又は同義性塩基を含
    むRNA標的領域を有するリボザイム。
12. 【請求項１２】 該RNA標的領域が約５０％以下のユニバーサル及び／又は
    同義性塩基を含む、請求項１１に記載のリボザイム。
13. 【請求項１３】 標的を切断可能なリボヌクレアーゼの存在下で、請求項１
    から１０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドにRNA分子を接触させる工程を
    含む、標的RNA分子を切断する方法。
14. 【請求項１４】 該リボヌクレアーゼがリボヌクレアーゼH、リボヌクレア
    ーゼL及びリボヌクレアーゼPからなる群より選択される、請求項１３に記載の方
    法。
15. 【請求項１５】 RNA分子を請求項１１又は１２に記載のリボザイムと接触
    させる工程を含む、標的RNA分子を切断する方法。
16. 【請求項１６】 RNA分子を６から約５０の間の塩基を有するオリゴヌクレ
    オチドと接触させる工程を含み、ここで該オリゴヌクレオチドは少なくとも１つ
    のユニバーサル及び／又は同義性塩基を含む、１又はそれ以上の標的RNA分子を
    切断する方法。
17. 【請求項１７】 １又はそれ以上の配列モチーフ内の１又はそれ以上の塩基
    を１又はそれ以上のユニバーサル及び／又は同義性塩基で置換することを含む、
    １又はそれ以上の配列モチーフを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドの悪影響
    を軽減する方法。
18. 【請求項１８】 該配列モチーフがCGジヌクレオチドである請求項１７に記
    載の方法。
19. 【請求項１９】 該配列モチーフがポリG配列である請求項１７に記載の方
    法。