EA037404B1 - Липиды и композиции для доставки лекарственных средств - Google Patents

Липиды и композиции для доставки лекарственных средств Download PDF

Info

Publication number
EA037404B1
EA037404B1 EA201170553A EA201170553A EA037404B1 EA 037404 B1 EA037404 B1 EA 037404B1 EA 201170553 A EA201170553 A EA 201170553A EA 201170553 A EA201170553 A EA 201170553A EA 037404 B1 EA037404 B1 EA 037404B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
lipid
gene
nucleic acid
lipids
peg
Prior art date
Application number
EA201170553A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201170553A1 (ru
Inventor
Мутиах Манохаран
Мутусами Джаяраман
Каллантоттатил Г. Раджив
Лаксман Элтепу
Стивен Энселл
Цзяньсинь Чэнь
Original Assignee
Арбутус Биофарма Корпорэйшн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Арбутус Биофарма Корпорэйшн filed Critical Арбутус Биофарма Корпорэйшн
Publication of EA201170553A1 publication Critical patent/EA201170553A1/ru
Publication of EA037404B1 publication Critical patent/EA037404B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/44—Oils, fats or waxes according to two or more groups of A61K47/02-A61K47/42; Natural or modified natural oils, fats or waxes, e.g. castor oil, polyethoxylated castor oil, montan wax, lignite, shellac, rosin, beeswax or lanolin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/20—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing sulfur, e.g. dimethyl sulfoxide [DMSO], docusate, sodium lauryl sulfate or aminosulfonic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/28—Steroids, e.g. cholesterol, bile acids or glycyrrhetinic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0033—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being non-polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C219/00—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C219/02—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having esterified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C219/04—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having esterified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C219/06—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having esterified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having the hydroxy groups esterified by carboxylic acids having the esterifying carboxyl groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C219/00—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C219/02—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having esterified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C219/20—Compounds containing amino and esterified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having esterified hydroxy groups and amino groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being unsaturated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/04—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C07C229/06—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton
    • C07C229/08—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated having only one amino and one carboxyl group bound to the carbon skeleton the nitrogen atom of the amino group being further bound to hydrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C229/00—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C229/02—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton
    • C07C229/30—Compounds containing amino and carboxyl groups bound to the same carbon skeleton having amino and carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms of the same carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and unsaturated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C237/00—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups
    • C07C237/02—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C237/16—Carboxylic acid amides, the carbon skeleton of the acid part being further substituted by amino groups having the carbon atoms of the carboxamide groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and unsaturated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C251/00—Compounds containing nitrogen atoms doubly-bound to a carbon skeleton
    • C07C251/32—Oximes
    • C07C251/34—Oximes with oxygen atoms of oxyimino groups bound to hydrogen atoms or to carbon atoms of unsubstituted hydrocarbon radicals
    • C07C251/36—Oximes with oxygen atoms of oxyimino groups bound to hydrogen atoms or to carbon atoms of unsubstituted hydrocarbon radicals with the carbon atoms of the oxyimino groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C251/38—Oximes with oxygen atoms of oxyimino groups bound to hydrogen atoms or to carbon atoms of unsubstituted hydrocarbon radicals with the carbon atoms of the oxyimino groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms to carbon atoms of a saturated carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C251/00—Compounds containing nitrogen atoms doubly-bound to a carbon skeleton
    • C07C251/72—Hydrazones
    • C07C251/74—Hydrazones having doubly-bound carbon atoms of hydrazone groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C251/78—Hydrazones having doubly-bound carbon atoms of hydrazone groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms to carbon atoms of an unsaturated carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C271/00—Derivatives of carbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C271/06—Esters of carbamic acids
    • C07C271/08—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C271/10—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C271/12—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms to hydrogen atoms or to carbon atoms of unsubstituted hydrocarbon radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C271/00—Derivatives of carbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C271/06—Esters of carbamic acids
    • C07C271/08—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C271/10—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C271/20—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atoms of the carbamate groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms to carbon atoms of hydrocarbon radicals substituted by nitrogen atoms not being part of nitro or nitroso groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C323/00—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups
    • C07C323/23—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the same carbon skeleton
    • C07C323/24—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton
    • C07C323/25—Thiols, sulfides, hydropolysulfides or polysulfides substituted by halogen, oxygen or nitrogen atoms, or by sulfur atoms not being part of thio groups containing thio groups and nitrogen atoms, not being part of nitro or nitroso groups, bound to the same carbon skeleton having the sulfur atoms of the thio groups bound to acyclic carbon atoms of the carbon skeleton the carbon skeleton being acyclic and saturated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D203/00—Heterocyclic compounds containing three-membered rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D203/04—Heterocyclic compounds containing three-membered rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D203/06—Heterocyclic compounds containing three-membered rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D203/08—Heterocyclic compounds containing three-membered rings with one nitrogen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D203/10—Radicals substituted by singly bound oxygen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D233/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings
    • C07D233/54—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D233/64—Heterocyclic compounds containing 1,3-diazole or hydrogenated 1,3-diazole rings, not condensed with other rings having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms, e.g. histidine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D317/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D317/08—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms having the hetero atoms in positions 1 and 3
    • C07D317/10—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms having the hetero atoms in positions 1 and 3 not condensed with other rings
    • C07D317/14—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms having the hetero atoms in positions 1 and 3 not condensed with other rings with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
    • C07D317/28—Radicals substituted by nitrogen atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D317/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D317/08—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms having the hetero atoms in positions 1 and 3
    • C07D317/44—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms having the hetero atoms in positions 1 and 3 ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D317/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D317/08—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms having the hetero atoms in positions 1 and 3
    • C07D317/44—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms having the hetero atoms in positions 1 and 3 ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D317/46—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms having the hetero atoms in positions 1 and 3 ortho- or peri-condensed with carbocyclic rings or ring systems condensed with one six-membered ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D317/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D317/08—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms having the hetero atoms in positions 1 and 3
    • C07D317/72—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms having the hetero atoms in positions 1 and 3 spiro-condensed with carbocyclic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D319/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D319/04—1,3-Dioxanes; Hydrogenated 1,3-dioxanes
    • C07D319/06—1,3-Dioxanes; Hydrogenated 1,3-dioxanes not condensed with other rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/02—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings
    • C07D405/12—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing two hetero rings linked by a chain containing hetero atoms as chain links
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D491/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00
    • C07D491/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D491/04—Ortho-condensed systems
    • C07D491/056—Ortho-condensed systems with two or more oxygen atoms as ring hetero atoms in the oxygen-containing ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D491/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00
    • C07D491/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D491/10—Spiro-condensed systems
    • C07D491/113—Spiro-condensed systems with two or more oxygen atoms as ring hetero atoms in the oxygen-containing ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/655—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms
    • C07F9/65515—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms the oxygen atom being part of a five-membered ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55561—CpG containing adjuvants; Oligonucleotide containing adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/351—Conjugate
    • C12N2310/3515—Lipophilic moiety, e.g. cholesterol
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к липидам, которые успешно используются в липидных частицах для доставки in vivo терапевтических средств в клетки. В частности, согласно настоящему изобретению обеспечены липиды, имеющие следующую формулу (XXXIII) или их соли или диастереомеры, где R1 и R2, каждый самостоятельно для каждого проявления, представляет собой С10-С30алкенил или С10-С30алкинил; R3 представляет собой -аминоС1-6 алкил или -(С1-6алкил)аминоС1-6алкил; и Е представляет собой С(О)О; при условии, что если R3 представляет собой 2-(диметиламино)этил, каждый из R1 и R2 не представляют собой линолеил.

Description

Правительственная поддержка
Описанная здесь работа осуществлялась, по крайней мере частично, за счет средств правительства
США по гранту № HHSN266200600012C, назначенному Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний. Поэтому правительство может иметь определенные права на изобретение.
Заявление об установлении приоритета
Данная заявка претендует на приоритет к US S.N. 61/113179, поданной 10 ноября 2008 г.; US S.N. 61/154350, поданной 20 февраля 2009 г.; US S.N. 61/171439, поданной 21 апреля 2009 г; US S.N. 61/185438, поданной 9 июня 2009 г.; US S.N. 61/225898, поданной 15 июля 2009 г.; и US S.N. 61/234098, поданной 14 августа 2009 г., содержание каждой из которых включено здесь в качестве ссылки в полном объеме.
Уровень техники Область техники
Настоящее изобретение относится к области доставки лекарственного средства с применением липидных частиц. В частности, согласно настоящему изобретению обеспечены катионные липиды и липидные частицы, составляющие эти липиды, которые обладают преимуществом для доставки нуклеиновых кислот in vivo, а также композиции, состоящие из нуклеиновой кислоты и липидных частиц, подходящие для терапевтического применения in vivo. Кроме того, согласно настоящему изобретению обеспечены способы изготовления указанных композиций, а также способы введения нуклеиновых кислот в клетки с помощью указанных композиций, например, для лечения различных болезненных состояний.
Описание существующего уровня техники в области изобретения
Терапевтические нуклеиновые кислоты включают, например, малые интерферирующие РНК (миРНК), микро-РНК (микроРНК), антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, плазмиды, иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты, антисмысловые, антагомир, антимир, имитаторы микроРНК, супермир, U1 адаптер и аптамер. Эти нуклеиновые кислоты действуют через различные механизмы. В случае миРНК или микроРНК данные нуклеиновые кислоты могут снижать внутриклеточные уровни специфических белков через процесс, который называется РНК-интерференция (РНК-и). После введения миРНК или микроРНК в цитоплазму клеток эти двухцепочечные РНК-конструкции могут связываться с белком, который называется РИСК (РНКиндуцированный сайленсинг комплекс). Основная цепочка миРНК или микроРНК вытесняется из комплекса РИСК, предоставляя шаблон внутри РИСК, который может распознавать и связывать мРНК с комплементарной последовательностью с такой же в связанных миРНК или микроРНК. Связав комплементарные мРНК, комплекс РИСК расщепляет мРНК и высвобождает расщепленные цепочки. РНК-и может обеспечить снижение уровня специфичных белков посредством прицельной специфической деструкции соответствующих мРНК, которые кодирует для синтеза белка.
Терапевтическое применение РНК-интерференции чрезвычайно широко, так как конструкции миРНК и микроРНК могут быть синтезированы с любой последовательностью нуклеотидов, направленной против целевого белка. На сегодняшний день конструкции миРНК продемонстрировали способность специфически подавлять уровень белков-мишеней как в моделях in vitro, так и in vivo. Кроме того, конструкции миРНК в настоящее время оцениваются в клинических исследованиях.
Однако в настоящее время миРНК или микроРНК конструкции сталкиваются с двумя проблемами: во-первых, это их восприимчивость к расщеплению нуклеазами в плазме и, во-вторых, их ограниченные возможности для получения доступа в отдел внутри клетки, где они могут связывать РИСК при системном введении в виде свободный миРНК или микроРНК. Эти двухцепочечные конструкции могут быть стабилизированы путем включения химически модифицированных нуклеотидных линкеров внутри молекулы, например фосфотиоатных групп. Несмотря на это, такие химические модификации обеспечивают лишь ограниченную защиту от расщепления нуклеазами и могут снижать активность конструкции. Внутриклеточной доставке миРНК или микроРНК может помочь использование систем носителей, таких как полимеры, катионные липосомы или использование химической модификации конструкций, например, путем ковалентного присоединения молекул холестерина. Однако для усовершенствованных систем доставки необходимо увеличить потенцию молекул миРНК и микроРНК и уменьшить или устранить потребность в химической модификации.
Антисмысловые олигонуклеотиды и рибозимы могут также ингибировать трансляцию мРНК в белок. В случае антисмысловых конструкций эти одноцепочечные дезоксинуклеиновые кислоты имеют такую же комплементарную последовательность, что и мРНК белка-мишени и могут связываться с мРНК на основе модели спаривания Уотсона-Крика. Это соединение также предотвращает трансляцию целевой мРНК и/или запускает деградацию копий мРНК посредством фермента РНКаза Н. Следовательно, антисмысловые олигонуклеотиды имеют огромный потенциал специфичности действия (т.е. снижение уровня белков, связанных с определенным заболеванием). На сегодняшний день эти соединения продемонстрировали перспективность в некоторых моделях in vitro и in vivo, в том числе в моделях воспалительных заболеваний, рака и ВИЧ (рассматривается в Agrawal, Trends in Biotech. 14:376-387 (1996)). Антисмысловые олигонуклеотиды также могут влиять на клеточную активность путем гибридизации непосредственно с хромосомной ДНК. В настоящее время проходит расширенное клиническое оценивание у людей некоторых антисмысловых лекарственных средств. Мишени этих лекарственных средств включают bcl 2
- 1 037404 и гены аполипопротеина В, а также продукты мРНК.
Иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты включают дезоксирибонуклеиновые кислоты и рибонуклеиновые кислоты. В случае дезоксирибонуклеиновых кислот определенные последовательности и мотивы продемонстрировали недопустимую иммунную стимуляцию у млекопитающих. Эти последовательности или мотивы включают CpG-мотивы, последовательности, богатые пиримидинами и повторяющиеся последовательности. Считается, что CpG мотив в дезоксирибонуклеиновых кислотах специфически распознается эндосомальным рецептором, толл-подобным рецептором 9 (ТПР-9), который затем запускает пути как врожденной, так и приобретенной иммунной стимуляции. Были зарегистрированы также определенные иммуностимулирующие последовательности рибонуклеиновой кислоты. Считается, что эти последовательности РНК запускают иммунную активацию путем связывания с толл-подобными рецепторами 6 и 7 (ТПР-6 и ТПР-7). Кроме того, также сообщается, что двухцепочечные РНК являются иммуностимулирующими и предположительно активизируются через связывание с ТПР-3.
Одна хорошо известная проблема, связанная с применением терапевтических нуклеиновых кислот, относится к устойчивости фосфодиэфирной межнуклеотидной связи и чувствительности этого линкера к нуклеазам. Присутствие экзонуклеаз и эндонуклеаз в сыворотке крови приводит к быстрому расщеплению нуклеиновых кислот, обладающих фосфодиэфирными линкерами и, следовательно, терапевтические нуклеиновые кислоты в присутствии сыворотки или внутри клеток могут иметь очень короткий период полувыведения (Zelphati, О., et al., Antisense. Res. Dev. 3:323-338 (1993); and Thierry, A.R., et al., pp. 147161 in Gene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA (Eds. Erickson, RP and Izant, JG; Raven Press, NY (1992)). Из-за этих и других известных проблем терапевтическая нуклеиновая кислота, которая находится в настоящее время в разработке, не содержит основных фосфодиэфирных химических веществ, обнаруженных в естественных нуклеиновых кислотах.
Эта проблема была частично преодолена химическими модификациями, которые снижают сывороточную или внутриклеточную деградацию. Были протестированы модификации межнуклеотидной фосфодиэфирной связи (например, с использованием фосфоротиоатных, метилфосфонатных или фосфорамидатных связей), на нуклеотидных основаниях (например, 5-пропинил-пиримидины), или на сахарах (например, 2'-модифицированные сахара) (Uhlmann E., et al. Antisense: Chemical Modifications. Encyclopedia of Cancer, Vol. X., pp. 64-81 Academic Press Inc. (1997)). Другие пытались улучшить стабильность с использованием 2'-5' связей сахара (см., например, патент США № 5532130). Осуществлялись попытки других изменений. Однако ни одно из этих решений не оказалось полностью удовлетворительными, и in vivo свободные терапевтические нуклеиновые кислоты по-прежнему обладают лишь ограниченной эффективностью.
Кроме того, как отмечалось выше в отношении миРНК и микроРНК, остаются проблемы, связанные с ограниченными возможностями терапевтических нуклеиновых кислот пересекать клеточные мембраны (см., Vlassov, et al., Biochim. Biophys. Acta 1197:95-1082 (1994)) и проблемы, связанные с системной токсичностью, такие как комплемент-опосредованная анафилаксия, нарушение коагуляционных свойств, и цитопении (Galbraith, et al., Antisense Nucl. Acid Drug Des. 4:201-206 (1994)).
Чтобы попытаться улучшить эффективность, исследователи также использовали транспортные системы на основе липидов для доставки химически модифицированных или немодифицированных терапевтических нуклеиновых кислот. В исследовании Zelphati, О. и Szoka, F.C., J. Contr. Rel. 41:99-119 (1996), авторы ссылаются на использование анионных (обычных) липосом, рН-чувствительных липосом, иммунолипосом, фузогенных липосом и катионных липидов/антисмысловых агрегатов. Подобным образом, миРНК была введена системно в катионных липосомах, и эти частицы нуклеиновых кислотлипидов, как сообщается, обеспечивают улучшение снижения уровня целевых белков в организме млекопитающих, в том числе нечеловеческих приматов (Zimmermann et al., Nature 441:111-114 (2006)).
Несмотря на этот прогресс, остается потребность в технологии для улучшения композиций липидно-терапевтических нуклеиновых кислот, которые подходят для общего терапевтического использования. Предпочтительно, чтобы эти композиции инкапсулировали нуклеиновые кислоты с высокой эффективностью, имели высокое соотношение лекарственное средство:липид, защищали инкапсулированную нуклеиновую кислоту от разрушения и клиренса в сыворотке крови, являлись подходящими для системной доставки и обеспечивали внутриклеточную доставку инкапсулированной нуклеиновой кислоты. Кроме того, частицы липидно-нуклеиновой кислоты должны хорошо переноситься пациентами и обеспечивать адекватный терапевтический индекс, такой же, как и при лечении пациентов эффективной дозой нуклеиновой кислоты, не сопровождающееся значительными проявлениями токсичности и/или риска для пациента. Согласно настоящему изобретению обеспечены такие композиции, способы создания композиций, а также способы использования композиций для введения нуклеиновых кислот в клетки, в том числе для лечения заболеваний.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к новым катионным липидам, а также составляющим их липидным частицам. Указанные липидные частицы могут дополнительно содержать активные вещества и применяться в соответствии со способами изобретения для доставки активных веществ в клетки.
В одном из аспектов настоящее изобретение относится к липидам, имеющим формулу
- 2 037404
XXXIII их солям и диастереомерам, где каждый из R1 и R2 независимо представляют собой в каждом случае С10-С30алкенил или С10С30алкинил;
R3 представляет собой ω-аминоС1-6алкил или ω-(С1-6алкиламино)С1-6алкил или ω-(ди(С1-6алкил)амино)С1-6алкил; и
Е представляет собой С(О)О;
при условии, что если R3 представляет собой 2-(диметиламино)этил, каждый из R1 и R2 не представляют собой линолеил.
В другом из аспектов изобретение относится к липидным частицам, содержащим в составе липиды согласно настоящему изобретению. В определенных вариантах липидные частицы дополнительно содержат нейтральные липиды и липиды, способные снижать агрегацию частиц. В одном из вариантов липидная частица состоит, по существу, из (i) по меньшей мере одного липида согласно настоящему изобретению; (ii) нейтрального липида; (iii) стерина, например холестерина, и (iv) ПЭГ-липида, в молярном соотношении около 20-70% катионного липида:5-45% нейтрального липида:20-55% стерина:0,5-15% ПЭГ-липида.
В дополнительных связанных вариантах настоящее изобретение включает липидные частицы по настоящему изобретению, которые дополнительно содержат терапевтическое средство. В одном из вариантов терапевтическим средством является мРНК. В одном из вариантов терапевтическим средством является нуклеиновая кислота. В одном из вариантов нуклеиновая кислота является антисмысловым олигонуклеотидом или миРНК.
В еще одном связанном варианте настоящее изобретение включает фармацевтическую композицию, содержащую липидные частицы согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый наполнитель, носитель или растворитель.
Настоящее изобретение в других соответствующих вариантах также включает способ модуляции экспрессии гена-мишени в клетке, включающий доставку в клетку липидной частицы согласно настоящему изобретению. В отдельном варианте липидная частица включает терапевтическое средство, выбранное из антисмыслового олигонуклеотида и миРНК.
В ещё одном варианте настоящее изобретение относится к способу лечения заболевания или нарушения у субъекта, характеризующегося черезмерной экспрессией полипептида, включающему обеспечение субъекта фармацевтической композицией согласно настоящему изобретению, в которой терапевтическое средство выбрано из миРНК и антисмыслового олигонуклеотида, где миРНК или антисмысловой олигонуклеотид содержат полинуклеотид, который специфически связывается с полинуклеотидом, кодирующим указанный полипептид.
Краткое описание некоторых изображений, представленных на фигурах
Фиг. 1 - схематическое изображение оптически чистого липида с коньюгироваными целевыми лигандами;
фиг. 2 - схематическое изображение характерных особенностей липидов данного изобретения;
фиг. 3 - таблица, отображающая значения ЕС50 и рКа образцовых липидов, определенных с помощью способа, описанного в примерах.
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение основано, в частности, на обнаружении катионных липидов, которые обеспечивают преимущества при использовании в липидных частицах для доставки терапевтического средства in vivo. В частности, как продемонстрировано сопутствующими примерами, настоящее изобретение обеспечивает композиции нуклеиновая кислота-липидная частица, содержащие катионный липид в соответствии с настоящим изобретением. В некоторых вариантах композиция, описанная здесь, обеспечивает повышенную активность нуклеиновой кислоты и/или улучшение переносимости композиции in vivo, что может привести к значительному увеличению терапевтического индекса по сравнению с композициями липид-частица нуклеиновой кислоты, описаными ранее. Кроме того, здесь раскрыты дополнительные композиции и способы использования, которые могут обеспечить уменьшение токсичности, наблюдаемой при применении определенных терапевтических частиц нуклеиновой кислоты-липидов.
В некоторых вариантах настоящее изобретение особым образом обеспечивает улучшение композиции для доставки молекул миРНК. В данной работе продемонстрировано, что эти композиции являются эффективными в снижении уровней белка и/или уровней мРНК белков-мишеней. Кроме того, продемонстрировано, что активность этих улучшенных композиций зависит от наличия определенных катионных липидов, и что молярное соотношение катионных липидов в формуле может влиять на активность.
Липидные частицы и композиции согласно настоящему изобретению могут быть использованы для различных целей, в том числе для доставки сопутствующих или инкапсулированных терапевтических средств в клетки как in vitro, так и in vivo. Соответственно, настоящее изобретение относится к способам
- 3 037404 лечения заболеваний или нарушений у субъектов, нуждающихся в лечении, путем контакта субъекта с липидной частицей согласно настоящему изобретению, объединенной с подходящим терапевтическим средством.
Как описано в настоящем документе, липидные частицы согласно настоящему изобретению особенно пригодны для доставки нуклеиновых кислот, в том числе, например, молекул миРНК и плазмид. Таким образом, липидные частицы и композиции согласно настоящему изобретению могут быть использованы для модуляции экспрессии генов-мишеней и белков как in vitro, так и in vivo, путем контактирования с клетками липидных частиц согласно настоящему изобретению, связанных с нуклеиновой кислотой, которая уменьшает экспрессию гена-мишени (например, миРНК) или нуклеиновой кислотой, которая может быть использована для увеличения экспрессии заданного белка (например, плазмиды, кодирующей заданный белок).
Различные типичные варианты катионных липидов согласно настоящему изобретению, а также липидных частиц и композиций с тем же содержанием и их использование для доставки терапевтических средств и модуляции экспрессии гена и белка описаны более подробно ниже.
Липиды.
Настоящее изобретение относится к новым липидам, имеющим определенные конструктивные особенности. Как показано на фиг. 2, особенности липидной модели включают по крайней мере одно из следующих веществ: главную группу с различной рКа, катионная, 1°, 2° и 3° моноамин, ди- и триамин, олигоамин/полиамин, главную группу с низким рКа - имидазолы и пиридин, гуанидин, анионные, цвиттерионные и гидрофобные хвосты могут включать в себя симметричные и/или несимметричные цепи, длинные и короткие, насыщенные и ненасыщенные магистральные цепи, включающие в себя основные глицериды и другие ациклические аналоги, циклические, спиро, бициклические и полициклические связи с эфирами, сложными эфирами, фосфаты и их аналоги, сульфанаты и аналоги, дисульфиды, рН чувствительные связи, сходные с ацеталями и кеталями, имины и гидразоны, и оксимы. Настоящее изобретение относится к новым липидам, которые успешно используются в липидных частицах изобретения для доставки in vivo терапевтических агентов в клетки, в том числе липидов, имеющих следующую формулу. В одном аспекте липиды представляют собой соединения формулы XXXIII
XXXIII их соли и диастереомеры, где каждый из Ri и R2 независимо в каждом случае С10-С30алкенил или С10-С30алкинил;
R3 - это ω-аминоалкилы, ω-(замещенные)аминоалкилы;
Е представляет собой С(О)О.
В другом варианте R3 это - алкиламино, ди(алкил)амино, аминоалкил, алкиламиноалкил, ди(алкил)аминоалкил.
В одном варианте, где липид является соединением формулы XXXIII, при условии, что I
Е представляет собой С(О)О и R3 является . оба, R1 и R2, не являются линолеилом.
В одном из вариантов липид является соединением формулы XXXIII, где, R3 - ω -аминоалкилы, ω (замещенные)аминоалкилы.
В еще одном варианте липид является соединением формулы XXXIII, где R1 и R2, каждый самостоятельно для каждого проявления, произвольно замещенный С10-С30алкил, произвольно замещенный С10-С30алкинил, произвольно замещенный С10-С30ацил или линкер-лиганд.
В некоторых случаях R3 это - ω -аминоалкил или ω -(замещенный)аминоалкил, каждый из которых является произвольно замещенным. Примеры ω-(замещенных)аминоалкил групп включают 2(диметиламино)этил, 3-(диизопропиламино)пропил, или 3-(N-этил-N-изопропиламино)-1-метилпропил.
Было установлено, что катионные липиды, содержащие ненасыщенные алкильные цепи, особенно пригодны для формирования частиц липид- нуклеиновой кислоты с повышенной текучестью мембраны. В одном из вариантов по крайней мере один из R1 или R2 включает минимум один, два или три участка ненасыщенности, например двойную связь или тройную связь.
В одном из вариантов только один из R1 или R2 включает минимум один, два или три участка ненасыщенности.
В одном из вариантов оба, как R1 так и R2 включают минимум один, два или три участка ненасыщенности.
В одном из вариантов R1 и R2 включают различное количество участков ненасыщенности, например один из R1 и R2 имеют один участок ненасыщенности, а другой имеет два или три участка ненасыщенности.
В одном из вариантов оба как R1, так и R2 включают одинаковое количество участков ненасыщен
- 4 037404 ности.
В одном из вариантов R1 и R2 включают различные типы ненасыщенности, например ненасыщенность в одном из R1 и R2 является двойной связью, а другие ненасыщенности представляют собой тройную связь.
В одном из вариантов R1 и R2 включают одинаковый тип ненасыщенности, например двойную связь или тройную связь.
В одном из вариантов по крайней мере один из R1 или R2 содержит минимум одну двойную связь и минимум одну тройную связь.
В одном из вариантов только один из R1 или R2 содержит по меньшей мере одну двойную связь и по меньшей мере одну тройную связь.
В одном из вариантов оба как R1, так и R2 содержат как минимум одну двойную и как минимум одну тройную связь.
В одном из вариантов оба, R1 и R2, одинаковые, например оба и R1 и R2 являются линолеилом (С18), или оба и R1 и R2 являются гептадека-9-енилом.
В одном из вариантов R1 и R2 отличаются друг от друга.
В одном из вариантов по крайней мере один из R1 и R2 является холестерином.
В одном из вариантов липид обогащен одним диастереомером, например липид имеет по меньшей мере 95%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 70% избытка диастереомера.
В одном из вариантов липид обогащен одним энантиомером, например липид имеет по меньшей мере 95%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 70% избытка энантиомера.
В одном из вариантов липид обогащен одним оптическим изомером.
Там, где имеется двойная связь (например, углерод-углеродная двойная связь или углерод-азотная двойная связь), в конфигурации около двойной связи не может быть изомерии (т.е. цис/транс или E/Z изомерии). В случаях, когда конфигурация двойной связи продемонстрирована в химической формуле, понятно, что также может присутствовать соответствующий изомер. Количество имеющихся изомеров может варьироваться в зависимости от относительной стабильности изомеров и энергии, необходимой для преобразования изомеров. Соответственно, некоторые двойные связи для практических целей имеются только в одной конфигурации, тогда как другие (например, те, в которых имеется схожая относительная стабильность и низкая энергия преобразования) могут присутствовать в качестве неотъемлемой равновесной смеси конфигураций.
Настоящее изобретение включает в себя синтез липидов, которые описаны здесь в рацемической, а также в оптически чистой форме.
В одном варианте катионоактивный липид выбирают из группы, состоящей из липидов, продемонстрированных ниже в табл. 1
Таблица 1
Некоторые катионоактивные липиды согласно настоящему изобретению
- 5 037404
Ί ( / ( ) С О ( ) ( У
( ) ( ) г -Г £ а: NH | Π^Γ'··^''·^''''''^^ u ,.,2-,//^-...1-. h7n n ο ν ν ν —/ 2 Η
\ ) \ ) ο ο >
N Ч/-/-/ '/ -//-. ' r°\ Λ
Μΐ,χχχχχχχ^ΛΧΧΧΧΛ^ Рацемические и оптически чистые Μ gg Ν — Рацемические и оптически чистые
О 1 । ίί
i ί ггаг J t? о ( ) ί ) () (/ с о=( £ У
( ) ( \ < о р п D
Ν—, -/-./ -./ -/ -/ -- / \-4-.0/\/-,.^^^ ζ'' 4 0 о А (
ί ) I ) : —ζ -Г- ΖΙ ч 5, г ( ) ( ) о^о 7 о Ζ I
о и Ζ2 С *г* = О..О С / I 0 Q является О
0 Q является О 0 _ ООЗгЗО Q является 0
- 6 037404
1 11 Τ' Q является О 1 0 Q является О
О Q является О О Q является О
Q является О о _ Q является О
1 A ---- Q является О 1 S v Q является О
ςΑ<1ΧΟΟ^Χ Q является О ςΛ<Χθ3/Χ/Χ Q является О
о ςΛ<Αθθθο^ Q является О Q является О
о 1 Q является О 1 Q является О
О __ ~-NZ^/ 1 Q является О 0 ι^γτι 1 Q является О
- 7 037404
0 1 Q является О —Ν X Q является О
0 -ЛхОООООСХ —Ν X Q является О —N X Q является О
у- J ( / ( X \
^CXZ-XIZ-^^ 0 X = О, S, NH, NMe; η = 06 X = О, S, NH, NMe; η = 06
^XUAOZCC / —г X ) X )
[~o/\— ГГ 1 Rfc—~ N%
^==^==- 1
1 ίΐ 1 I ^►L Χ-χ..---4·, Л Л Л Х./Ч> ο—ς^.^'····*''^····^'·'^····^^
- 8 037404
0 N /χ4+Νζ^Α=4χ^-/>^·
|| й ΐ ί 11 ί’ 'Τ’ .о τ 1 Ί ^^'YXOCO^
4^^^^4^/4//^=4//4 0 ^/·4/4/4/«4/β4/4^
/ —2 λ Q^° 0 π
1
0 '—‘ b—f —N '--''·.-·'·'/'=·-x=·'·.·-----s,.--./—..
1 0
i ί__ 0 Yy^O—/ __/^/^/ znY 4+^/4/4/^=/
Х - А .0 /\y\z\ Λ /V Λ А у Ψ X/ γ \ζ -/ \=/ 4»/ -.=/ 4/ 1 0 \/4/z=V=V^X
?-/-соосос^г 1 о ^ N. x^ ^о*^^ч/4///4/4,=/4=х//4/ Wn
—-—-./-../ 0 x~—v/~^x---^/ ---/__-/__xz/ x 1 V0·-/-./-./-./----------./-./
>. 0 ^N ,/< JI /4/X/4/4/=4/=4/4/\ X | ° 4z^Z4+^Ai^s=Zxx4Z X например, X = Me, OH, Cl и т.д.
11^4/ τ'Y 4=/ 4=/ -X 4/ 1 J 1 _______ /^ /4 .X/.-4 -x~^__x^--__X--^ /^ /
Me 1
Me2N—v JT 2/ \-^·ΟΖ ^0 /. χ. ΛΧ/4/\ζΖ\ζ/ Me^J—у Г - л.__/ν. z, \-^0Z -X/x//
-0 _. /н. X/x'L-0/ \____ 1 MejN ( z ( ) z/
.-0 /4'Χ/ΧΖ>^^νΖ=κΛ/4__ Me2N—\ 1 Y H2N NH I / X^v zX^. X^ X4 Λ Λ Λ / 40 4/4/4/-4/-4=/-4=/////
Несмотря на то, что продемонстрированы не все диастереомеры для липидов, в одном из аспектов настоящее изобретение относится к обеспечению всех возможных диастереомеров, и как таковые хи- 9 037404 рально чистые и диастереомерно обогащенные липиды также являются частью настоящего изобретения.
В особых вариантах липиды согласно настоящему изобретению являются катионными липидами. Используемый здесь термин катионный липид подразумевает использование этих липидов, имеющих одну или две жирные кислоты или жирные алкильные цепи и главную аминогруппу (в том числе алкиламино- или диалкиламиногруппу), которые могут быть протонированны для формирования катионных липидов при физиологических рН. В некоторых вариантах катионный липид называется аминолипид.
Другие катионные липиды будут включать те, которые имеют альтернативные группы жирных кислот и другие диалкиламиногруппы, в том числе те, в которых алкильные заместители различны (например, N-этил-N-метиламино-, N-пропил-N-этиламино и подобные). Для тех вариантов, в которых как RB так и R2 являются длинными цепями алкильных или ацильных групп, они могут быть одинаковыми или разными. В общем, липиды (например, катионные липиды), имеющие менее насыщенные ацильные цепи легче сортируются по размеру, особенно когда комплексы по размеру меньше примерно 0,3 мкм, для целей стерилизации фильтров. Катионные липиды, содержащие ненасыщенные жирные кислоты с длиной углеродной цепи в диапазоне от Сю и С20 являются типичными. Другие способы могут также использоваться для отделения аминогрупп (например, аминогруппа катионных липидов) и жирных кислот или жирных алкиловых частей катионных липидов. Подходящие способы известны для специалистов в данной области.
В некоторых вариантах катионные липиды согласно настоящему изобретению имеют по крайней мере одну протонную или депротонную группу, такую, что липид является положительно заряженным при уровне рН, равном или ниже уровня физиологических рН (например, рН 7,4), и нейтральным при другом рН, желательно соответствующем уровню, который равен или выше физиологического рН. Такие липиды также относятся к катионным липидам. Конечно, следует понимать, что добавление или удаление протонов в зависимости от рН является равновесным процессом, и что ссылка на заряженные или нейтральные липиды относится к природе преобладающего вида и не требует, чтобы все липиды находились в заряженной или нейтральной форме. Липиды, которые имеют больше чем одну протонную или депротонную группы, или те, которые являются цвиттерионными, не были исключены из использования в изобретении.
В некоторых вариантах протонные липиды (т.е. катионные липиды) в соответствии с изобретением имеют рКа протонной группы в диапазоне от 4 до 11. Обычно липиды будут иметь рКа приблизительно в диапазоне от 4 до 7, например приблизительно между 5 и 7, как, например, между приблизительно 5,5 и 6,8, при введении в липидные частицы. Такие липиды будут катионными при низшем уровне рН состава, пока частицы будут в значительной степени (хотя не полностью) поверхностно нейтрализованы в физиологическом рН, приблизительно при рН 7,4. Одним из преимуществ рКа, лежащего в диапазоне между приблизительно 4 и 7, является то, что, по меньшей мере, какая-нибудь нуклеиновая кислота, связанная с внешней поверхностью частицы, потеряет свое электростатическое взаимодействие в физиологическом рН и будет удалена простым диализом, таким образом значительно уменьшая восприимчивость частицы к клиренсу. Измерения рКа липидов в липидных частицах могут быть выполнены, например, с помощью флуоресцентного зонда 2-(р-толуидино)-6-нафталин сульфоновой кислоты (TNS), используя способы, описанные в работе Cullis et al., (1986) Chem Phys Lipids 40, 127-144.
В одном варианте технология изобретения охватывает по крайней мере 75%, по крайней мере 80%, или по крайней мере 90%.
В одном варианте формулировки изобретения дополнительно включают аполипопротеин. Используемый здесь термин аполипопротеин или липопротеин относится к аполипопротеинам, известным специалистам в данной области, к их вариантам и фрагментам, к агонистам аполипопротеина, их аналогам или фрагментам, описанным ниже. Подходящие аполипопротеины включают, не ограничиваясь, Апо А-I, Апо А-II, Апо A-IV, Апо А-V и Апо Е, и активные полиморфные формы, изоформы, варианты и мутанты, также как и их фрагменты или усеченные формы. В некоторых вариантах аполипопротеин является тиол-содержащим аполипопротеином. Тиол-содержащий аполипопротеин относится к аполипопротеину, варианту, фрагменту или изоформе, которые содержат хотя бы один остаток цистеина. Наиболее распространенными тиол-содержащими аполипопротеинами являются Апо А-I Milano (Апо А-IM) и Апо А-I Paris (Апо А-Ip), которые содержат один остаток цистеина (Jia et al., 2002, Biochem. Biophys. Res. Comm. 297: 206-13; Bielicki and Oda, 2002, Biochemistry 41: 2089-96). Апо А-II, Апо Е2 и Апо Е3 также являются тиол-содержащими аполипопротеинами. Изолированный Апо Е и/или его активные фрагменты и полипептидные аналоги, в том числе его формы, которые производятся рекомбинантно, описаны в патентах США №№ 5672685; 5525472; 5473039; 5182364; 5177189; 5168045; 5116739; раскрытие которых в настоящем документе включено в качестве ссылки. Апо Е3 раскрыт в работе Weisgraber, et al. Гетерогенность человеческого Е апопротеина: чередование цистеин-аргинина в аминокислотной последовательности изоформ апо-Е, J. Biol. Chem. (1981) 256: 9077-9083; and Rail, et al., Структурная основа гетерогенности связывания с рецептором аполипопротеина Е типа III у субъектов с гиперлипопротеинемией Proc. Nat. Acad. Sci. (1982) 79: 4696-4700. См. также GenBank регистрационный номер K00396.
В некоторых вариантах аполипопротеин может быть в своей зрелой форме, в форме своего препроаполипопротеина или в форме своего проаполипопротеина. Гомо- и гетеродимеры (где это возможно)
- 10 037404 про- и зрелых Апо А-I (Duverger et al., 1996, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16 (12):1424-29), Апо A-I Milano (Klon et al., 2000, Biophys. J. 79:(3)1679-87; Franceschini et al., 1985, J. Biol. Chem. 260: 1632-35), Апо A-I Paris (Daum et al., 1999, J. Mol. Med. 77:614-22), Апо A-II (Shelness et al., 1985, J. Biol. Chem. 260(14):8637-46; Shelness et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(15):9929-35), Апо A-IV (Duverger et al., 1991, Euro. J. Biochem. 201(2):373-83) и Апо E (McLean et al., 1983, J. Biol. Chem. 258(14):8993-9000) также могут быть использованы в рамках настоящего изобретения.
В некоторых вариантах аполипопротеин может быть фрагментом, вариантом или изоформом аполипопротеина. Термин фрагмент относится к любому аполипопротеину, у которого аминокислотная последовательность короче, чем у естественного аполипопротеина и фрагмент которого сохраняет активность естественного аполипопротеина, в том числе свойства связывания липида. Вариант означает замещения или изменения в аминокислотных последовательностях аполипопротеина, причем такие замещения или изменения, как, например, добавление и удаление аминокислотных остатков, не аннулирующих активность естественного аполипопротеина, в том числе свойства связывания липида. Таким образом, вариант может включать белок или пептид, имеющий практически одинаковые с естественным аполипопротеином аминокислотные последовательности при условии, если один или более аминокислотных остатков были консервативно заменены химически подобными аминокислотами. Примеры консервативных замен включают замещения по крайней мере одного гидрофобного остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин, на другой. Кроме того, настоящее изобретение предусматривает, например, замещение по крайней мере одного гидрофильного остатка, как, например, обмен между аргинином и лизином, между глутамином и аспарагином, а также между глицином и серином (см. патенты США №№ 6004925, 6037323 и 6046166). Термин изоформа относится к белку, обладающему такой же, большей или частичной функцией и аналогичной, идентичной или частичной последовательностью, который может быть или не быть продуктом того же гена и, как правило, является тканеспецифическим (см Weisgraber 1990, J. Lipid Res. 31(8):1503-11; Hixson and Powers 1991, J. Lipid Res. 32(9): 1529-35; Lackner et al., 1985, J. Bid. Chem. 260(2)703-6; Hoeg et al., 1986, J. Bid. Chem. 261(9):3911-4; Gordon et al., 1984, J. Bid. Chem. 259(1):468-74; Powell et al., 1987, Cell 50(6):831-40; Aviram et al., 1998, Arterioscler. Thromb. Vase. Bid. 18(10):1617-24; Aviram et al., 1998, J. Clin. Invest. 101 (8):1581-90; Billecke et al., 2000, Drug Metab. Dispos. 28(11):1335-42; Draganov et al., 2000, J. Bid. Chem. 275(43):33435-42; Steinmetz and Utermann 1985, J. Bid. Chem. 260(4):2258-64; Widler et al., 1980, J. Bid. Chem. 255(21): 10464-71; Dyer et al., 1995, J. Lipid Res. 36(1):80-8; Sacre et al., 2003, FEBS Lett. 540(1-3):181-7; Weers, et al., 2003, Biophys. Chem. 100(1-3):481-92; Gong et al., 2002, J. Bid. Chem. 277(33):29919-26; Ohta et al., 1984, J. Bid. Chem. 259(23): 14888-93 and U.S. Pat. No. 6372886). В некоторых вариантах способы и композиции согласно настоящему изобретению включают использование химерных конструкций аполипопротеина. Например, химерная конструкция аполипопротеина может состоять из домена аполипопротеина с высокой липидсвязывающей емкостью, соединенного с доменом аполипопротеина, обладающего защитными свойствами реперфузии ишемии. Химерной конструкцией аполипопротеина может быть конструкция, которая включает в себя отдельные области внутри одного аполипопротеина (т.е. гомологичная конструкция) или химерной конструкцией может быть конструкция, которая включает в себя отдельные области из различных аполипопротеинов (т.е. гетерологичные конструкции). Композиции, содержащие химерную конструкцию, также могут включать сегменты, которые являются вариантами аполипопротеина или сегменты, предназначенные для обладания определенными свойствами (например, липид-связывающие, рецептор-связывающие, ферментные, активирующие фермент, антиоксиданты или снижающие окислительные свойства) (см. Weisgraber 1990, J. Lipid Res. 31(8):1503-11; Hixson and Powers 1991, J. Lipid Res. 32(9): 1529-35; Lackner et al., 1985, J. Bid. Chem. 260(2)703-6; Hoeg et al, 1986, J. Bid. Chem. 261(9):3911-4; Gordon et al., 1984, J. Bid. Chem. 259(1):468-74; Powell et al., 1987, Cell 50(6):831-40; Aviram et al., 1998, Arterioscler. Thromb. Vase. Bid. 18(10):1617-24; Aviram et al., 1998, J. Clin. Invest. 101(8):1581-90; Billecke et al., 2000, Drug Metab. Dispos. 28(11): 1335-42; Draganov et al., 2000, J. Bid. Chem. 275(43):33435-42; Steinmetz and Utermann 1985, J. Bid. Chem. 260(4):2258-64; Widler et al., 1980, J. Bid. Chem. 255(21): 10464-71; Dyer et al., 1995, J. Lipid Res. 36(1):80-8; Sorenson et al., 1999, Arterioscler. Thromb. Vasc. Bid. 19(9):2214-25; Palgunachari 1996, Arterioscler. Throb. Vasc. Bid. 16(2):328-38: Thurberg et al., J. Bid. Chem. 271(11):6062-70; Dyer 1991, J. Bid. Chem. 266(23):150009-15; Hill 1998, J. Bid. Chem. 273(47):30979-84).
Аполипопротеины, используемые в изобретении, также включают рекомбинантные, синтетические, полусинтетические или очищенные аполипопротеины. Способы получения аполипопротеинов или их эквивалентов, используемые изобретением, хорошо известная область техники. Например, аполипопротеины могут быть отделены от плазмы или натуральных продуктов посредством центрифугирования в градиенте плотности или посредством иммуноаффинной хроматографии, или произведены синтетическим, полусинтетическим путем или с использованием методик, основанных на рекомбинантной ДНК, известных специалистам в этой области техники. (см, например., Mulugeta et al., 1998, J. Chromatogr. 798(1-2): 83-90; Chung et al., 1980, J. Lipid Res. 21(3):284-91; Cheung et al., 1987, J. Lipid Res. 28(8):913-29; Persson, et al., 1998, J. Chromatogr. 711:97-109; U.S. Pat. Nos. 5,059,528, 5,834,596, 5,876,968 and 5,721,114; and PCT Publications WO 86/04920 and WO 87/02062).
Аполипопротеины, используемые в изобретении, также включают агонисты аполипопротеина, та- 11 037404 кие как пептиды и пептидные аналоги, которые имитируют деятельность Апо A-I, Апо A-I Milano (Апо
A-IM), Апо A-I Paris (Апо-А-1р), Апо A-II, Апо A-IV и Апо Е. Например, аполипопротеином может быть любой из описанных в патентах США №№ 6004925, 6037323, 6046166, и 5840688, содержание которых включено здесь в качестве ссылки во всей их полноте.
Пептиды агониста аполипопротеина или аналоги пептида могут быть синтезированы или произведены с использованием любого способа для синтеза пептидов, известного в области техники, в том числе, например, способов, описанных в патентах США №№ 6004925, 6037323 и 6046166. Например, пептиды могут быть получены с использованием твердофазного синтетического способа, первоначально описанного Меррифилдом (1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154). Другие способы синтеза пептидов можно найти в работе Bodanszky et al., Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2d Ed., (1976) и других материалах доступных для специалистов в данной области. Обзор способов синтеза полипептидов можно найти в работе Stuart and Young, Solid Phase Peptide. Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford, III., (1984). Пептиды также могут быть синтезированы способами решения, как описано в работе The Proteins, Vol. II, 3d Ed., Neurath et. al., Eds., p. 105-237, Academic Press, New York, N.Y. (1976). Соответствующие защитные группы для использования в различных способах синтезирования пептида описаны в вышеупомянутых работах, а также в работе McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, N.Y. (1973). Пептиды согласно настоящему изобретению могут быть также получены путем химического или ферментативного расщепления от более крупных частей, например аполипопротеина A-I.
В некоторых вариантах аполипопротеин может быть смесью аполипопротеинов. В одном из вариантов аполипопротеин может быть гомогенной смесью, т.е. одним типом аполипопротеина. В другом варианте аполипопротеин может быть гетерогенной смесью аполипопротеинов, т.е. смесью двух или более различных аполипопротеинов. Варианты гетерогенных смесей аполипопротеинов могут содержать, например, смесь аполипопротеина животного происхождения и аполипопротеина полусинтетического происхождения. В некоторых вариантах гетерогенные смеси могут содержать, например, смесь Апо А-I и Апо А-I Milano. В некоторых вариантах гетерогенные смеси могут содержать, например, смесь Апо A-I Milano и Апо A-I Paris. Смеси, подходящие для использования в способах и композициях изобретения, будут очевидны для каждого из специалистов в данной области техники.
Если аполипопротеин добывается из природных источников, он может быть получен из растительного или животного источника. Если аполипопротеин добывается из источника животного происхождения, то аполипопротеин может быть получен от любого вида животного. В некоторых вариантах аполипопротеин может быть получен из источников животного происхождения. В некоторых вариантах аполипопротеин может быть получен из источников человеческого происхождения. В предпочтительных вариантах изобретения аполипопротеин получен от того же вида, что и индивид, которому вводится аполипопротеин.
Липидные частицы.
Настоящее изобретение также относится к липидным частицам, содержащим один или нескольких катионных липидов, описанных выше. Липидные частицы включают липосомы, но не ограничиваются ими. В данном использовании липосома является структурой, которая обладает липид-содержащими мембранами, включающими в себя водное внутреннее содержимое. Липосомы могут иметь одну или больше липидных мембран. В изобретении представлены как однослойные липосомы, которые называются униламеллярными, так и многослойные липосомы, которые называются мультиламеллярными. В комплексе с нуклеиновыми кислотами липидные частицы также могут являться липоплексами, которые состоят из бислоя катионных липидов, зажатого между слоями ДНК, как описано, например в работе Feigner, Scientific American.
Липидные частицы согласно настоящему изобретению могут дополнительно содержать один или несколько дополнительных липидов и/или другие компоненты, такие как холестерин. Другие липиды могут быть включены в липосомные композиции настоящего изобретения для различных целей, например, для предотвращения окисления липидов или для прикрепления лигандов на поверхности липосом. Любое количество липидов может находиться в липосомах согласно настоящему изобретению, в том числе амфипатические, нейтральные, катионные и анионные липиды. Такие липиды могут быть использованы одни или в комбинации. Конкретные примеры дополнительных липидных компонентов, которые могут присутствовать в липосомах, описаны ниже.
Дополнительные компоненты, которые могут присутствовать в липидной частице согласно настоящему изобретению, включают двухслойные стабилизирующие компоненты, такие как полиамидные олигомеры (см., например, патент США № 6320017), пептиды, белки, детергенты, производные липидов, такие как ПЭГ, спаренный с фосфатидилэтаноламином, и ПЭГ, соединенный с церамидами (см. патент США № 5885613).
В отдельных вариантах липидные частицы включают один или несколько второстепенных аминолипидов или катионных липидов, нейтральных липидов, стерола, и липидов, отобранных для снижения агрегации липидных частиц в процессе изготовления, которая может возникнуть в результате стерической стабилизации частиц, которые предотвращают заряд-индуцированную агрегацию в процессе создания.
- 12 037404
Примеры липидов, которые уменьшают агрегацию частиц в процессе изготовления включают полиэтиленгликоль (ПЭГ)-модифицированные липиды, моносиалоганглиозид Gm1, и полиамидные олигомеры (ПАО), такие как (описанные в патенте США № 6320017). Другие соединения с незаряженными, гидрофильными, стерически-барьерными половинами, которые препятствуют агрегации во время изготовления, подобными ПЭГ, Gm1 или Атта, также могут быть спарены с липидами для использования как в способах, так и в композициях изобретения. Атта-липиды, описаны, например, в патенте США № 6320017, и ПЭГ-липидные конъюгаты описаны, например, в патентах США №№ 5820873, 5534499 и 5885613. Как правило, концентрация липидных компонентов, отобранных для снижения агрегации, составляет от 1 до 15% (по мол.% липидов).
Конкретные образцы ПЭГ-модифицированных липидов (или липид-полиоксиэтилен конъюгатов), которые используются в настоящем изобретении, могут иметь разнообразные якорные части липидов для прикрепления ПЭГ-части к поверхности липидных везикул. Образцы подходящих ПЭГмодифицированных липидов включают ПЭГ-модифицированный фосфатидилэтаноламин и фосфатидную кислоту, ПЭГ-церамидные конъюгаты (например, ПЭГ ЦерК14 или ПЭГ ЦерК20), которые описаны в находящемся на рассмотрении USSN 08/486214, включеным здесь в виде ссылки, ПЭГмодифицированные диалкиламины и ПЭГ-модифицированные 1,2-диацилоксипропан-3-амины. Наиболее предпочтительными являются ПЭГ-модифицированные диацилглицерины и диалкилглицерины.
В вариантах, где пространственно-большая половина, такая как ПЭГ или Атта, является спаренной с липидным якорем, выбор липидного якоря зависит от типа соединения, которое конъюгируется с липидной частицей. Хорошо известно, что мПЭГ (мм2000)-диастеаролфосфатидилэтаноламин (ПЭГДСФЭ) останется связанным с липосомой до времени клиренса частиц из циркуляции, возможно, это вопрос нескольких дней. Другие конъюгаты, такие как ПЭГ-ЦерК20, имеют схожую неизменную емкость. ПЭГ-ЦерК14, однако, быстро обменивается за пределы состава при воздействии сыворотки, в некоторых химических анализах T1/2 составляет менее 60 мин. Как показано в заявке на патент США SN 08/486214, по крайней мере три характеристики влияют на скорость обмена: длина ацильных цепей, насыщенность ацильных цепей и размер стерического барьера главной группы. Соединения, имеющие подходящие варианты этих свойств могут быть пригодными для изобретения. Для некоторых видов терапевтических применений быстрая потеря ПЭГ-модифицированных липидов частицей нуклеиновая кислота-липид может быть предпочтительной in vivo и, следовательно, ПЭГ -модифицированный липид будет обладать сравнительно коротким липидным якорем. При других видах терапевтического применения для частицы нуклеиновая кислота-липид может быть предпочтительным проявлять большую продолжительность периода полужизни при циркуляции в плазме и, следовательно, ПЭГмодифицированный липид будет обладать сравнительно более длинными липидными якорями.
Следует отметить, что соединения предотвращающие агрегацию не обязательно требуют конъюгации липидов для того, чтобы функционировать должным образом. Наличие свободного ПЭГ или свободной Атта в растворе может быть достаточным для предотвращения агрегации. Если частицы стабильны после приготовления, ПЭГ или АттаТА могут быть удалены при помощи диализа до введения субъекту.
При наличии в липидных частицах нейтральных липидов последние могут быть представлены любым из множества видов липидов, которые существуют или в незаряженной или в нейтральной цвиттерионной форме при физиологическом рН. Такие липиды включают, например, диацилфосфатидилхолин, диацилфосфатидилэтаноламин, церамид, сфингомиелин, дигидросфингомиелин, кефалин, и цереброзиды. Выбор нейтральных липидов для использования в частицах, описанных в данном документе, как правило, проводится при рассмотрении, например, размера липосомы и стабильности липосом в кровотоке. Предпочтительно, чтобы нейтральный компонент липида являлся липидом с двумя ацильными группами (т.е. диацилфосфатидилхолин и диацилфосфатидилэтаноламин). Липиды, имеющие различные группы ацильных цепей различной длины цепи и степени насыщения, имеются в распоряжении или могут быть изолированны или синтезированны известными способами. В одной группе вариантов являются предпочтительными липиды, содержащие насыщенные жирные кислоты с длиной углеродной цепочки в диапазоне от С10 до С20. В другой группе вариантов используются липиды с моно- или диненасыщенными жирными кислотами с длиной углеродной цепочки в диапазоне от С10 до С20. Кроме того, могут быть использованы липиды, имеющие смеси насыщенных и ненасыщенных цепей жирных кислот. Предпочтительно используемые в настоящем изобретении нейтральные липиды - это ДОФЭ, ДСФХ, ПОФХ, ДПФХ или любой липид, родственный фосфатидилхолину. Нейтральные липиды, используемые в настоящем изобретении, могут также состоять из сфингомиелина, дигидросфингомиелина или фосфолипидов с другими главными группами, такие как серин и инозитол.
Стерольным компонентом липидной смеси, если он присутствует, может быть любой из стеролов, которые традиционно используются в сфере приготовления липосомы, липидной везикулы или липидной частицы. Предпочтительным стеролом является холестерин.
Другие катионные липиды, которые несут положительный заряд при показателях рН, приблизительно равных физиологическим, в дополнение к тем, которые описанные выше, могут быть также включены в липидные частицы согласно настоящему изобретению. Такие катионные липиды включают, но не ограничены, N,N-диолеил-N,N-диметиламмония хлорид (ДОДАХ); N-(2,3-диолеилокси)пропил
- 13 037404
Ν,Ν-Ν-триэтиламмония хлорид (ДОТМА); N,N-дистеарил-N,N-диметиламмония бромид (ДДАБ); N-(2,3диолеоилокси)пропил)-N,N,N-триметиламмония хлорид (ДОТАП); 1,2-диолеилокси-3-триметиламинопропана хлоридная соль (ДОТАП-Cl); 3-(N-(N',N'-диметиламиноэтан)карбамоил)холестерин (ДК-Хол), N-(1-(2,3-диолеилокси)пропил)-N-2-(сперминкарбоксамидо)этил)-N,N-диметиламмония трифторацетат (ДОСПА), диоктадециламидоглицил карбоксиспермин (ДОГС), 1,2-диолеоил-sn-3-фосфоэтаноламин (ДОФЭ), 1,2-диолеоил-3-диметиламмония пропан (ДОДАП), N,N-диметил-2,3-диолеоилокси)пропиламин (ДОДМА) и N-(1,2-димиристилоксипропил-3)-N,N-диметил-N-гидроксиэтил аммония бромид (ДМРИЭ). Кроме того, ряд коммерческих препаратов катионных липидов может быть использован как, например, ЛИПОФЕКТИН (содержащий ДОТМА и ДОФЭ, поставляется компанией GIBCO/BRL), и ЛИПОФЕКТАМИН (содержащий ДОСПА и ДОФЭ, поставляется компанией GIBCO/BRL). В отдельных вариантах катионные липиды являются аминолипидами.
Анионные липиды, подходящие для использования в липидных частицах согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничиваясь, фосфатидилглицерин, кардиолипин, диацилфосфатидилсерин, диацилфосфатидная кислота, N-додеканоил фосфатидилэтаноламина, N-сукцинил фосфатидилэтаноламина, N-глутарил фосфатидилэтаноламина, лизилфосфатидилглицерин и другие анионные модифицированные группы, объединенные с нейтральными липидами.
В многочисленных вариантах амфипатические липиды включены в липидные частицы согласно настоящему изобретению. Амфипатические липиды относятся к любому подходящему материалу, в котором гидрофобная часть липидного материала ориентирована в сторону гидрофобной фазы, в то время как гидрофильная часть ориентирована в направлении водной фазы. Такие соединения включают, но не ограничиваясь, фосфолипиды, аминолипиды и сфинголипиды. Представители фосфолипидов включают сфингомиелин, фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин, фосфатидилинозитол, фосфатидную кислоту, пальмитоил олеоил, фосфатдилхолин, лизофосфатидилхолин, лизофосфатидилэтаноламин, дипальмитоилфосфатидилхолин, диолеоилфосфатидилхолин, дистеароилфосфатидилхолин или дилинолеоилфосфатидилхолин. Также могут быть использованы другие бесфосфорные соединения, такие как семейства сфинголипидов, гликосфинголипидов, диацилглицерины и δ-ацилоксикислоты. Кроме того, такие амфипатические липиды легко смешиваются с другими липидами, такими как триглицериды и стерины.
Также подходящими для включения в липидные частицы согласно настоящему изобретению являются липиды с программируемым слиянием. Такие липидные частицы имеют незначительную тенденцию сливаться с клеточными мембранами и доставлять им полезный груз до проявления определенного сигнального события. Это позволяет липидным частицам до начала их слияния с клетками более равномерно распределяться после введения в виде инъекции в организм или область заболевания. Сигнальным событием может быть, например, изменение рН, температуры, ионной среды или времени. В последнем случае задерживающий слияние или маскирующий компонент, такой как АТТА-липидный коньюгат или ПЭГ-липидный коньюгат, могут просто высвобождаться из мембраны липидной частицы с течением времени. К тому времени липидная частица соответственно распределяется в организме, теряет достаточное количество маскирующего агента, чтобы стать сливающейся. Что касается другого сигнального события, желательно выбрать сигнал, связанный с локализацией болезни или клетки-мишени, такой как повышение температуры в месте воспаления.
В некоторых вариантах желательно сориентировать липидные частицы этого изобретения с использованием нацеливающих фрагментов, которые являются специфичными для типа клеток или тканей. Ориентация липидных частиц с использованием различных нацеливающх фрагментов, таких как лиганды, рецепторы клеточной поверхности, гликопротеины, витамины (например, рибофлавин) и моноклональные антитела, была описана ранее (см., например, патенты США №№ 4957773 и 4603044). Нацеливающие фрагменты могут содержать весь белок или его части. Механизмы ориентации обычно требуют, чтобы нацеливающие агенты были расположены на поверхности липидных частиц таким образом, чтобы нацеливающий фрагмент был доступен для взаимодействия с мишенью, например, рецептором клеточной поверхности. Множество различных нацеливающих агентов и способов известны и доступны в данной области техники, включая те, которые описаны, например, в работе Sapra, P. and Allen, T.M., Prog. Lipid Res. 42(5):439-62 (2003); and Abra, R.M. et al., J. Liposome Res. 12:1-3, (2002).
Использование липидных частиц, т.е. липосом, с покрытием поверхности гидрофильных полимерных цепей, таких как цепи полиэтиленгликоля (ПЭГ), для ориентации было предложено (Allen, et al., Biochimica et Biophysica Acta 1237: 99-108 (1995); DeFrees, et al., Journal of the American Chemistry Society 118: 6101-6104 (1996); Blume, et al., Biochimica et Biophysica Acta 1149: 180-184 (1993); Klibanov, et al., Journal of Liposome Research 2: 321-334 (1992); Патент США № 5013556; Zalipsky, Bioconjugate Chemistry 4: 296-299 (1993); Zalipsky, FEBS Letters 353: 71-74 (1994); Zalipsky, in Stealth Liposomes Chapter 9 (Lasic and Martin, Eds) CRC Press, Boca Raton FI (1995). В одном подходе лиганд, такой как антитело, для нацеливания липидных частиц является связанным с полярной главной группой липидов, формирующих липидную частицу. В другом подходе, нацеливающий лиганд прикреплен к дистальному концу цепей ПЭГ, формирующих гидрофильное полимерное покрытие (Klibanov, et al., Journal of Liposome Research 2: 321
- 14 037404
334 (1992); Kirpotin et al., FEBS Letters 388: 115-118 (1996)).
Для соединения нацеливающих агентов могут быть использованы стандартные способы. Например, может быть использован фосфатидилэтаноламин, который может быть активирован для прикрепления нацеливающих агентов, или производных липофильных соединений, таких как производное липида блеомицин. Антитело-ориентированные липосомы можно сконструировать, используя, например, липосомы, включающие в себя белок A (see, Renneisen, et al., J. Bio. Chem., 265:16337-16342 (1990) and Leonetti, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 87:2448-2451 (1990). Другие примеры конъюгации антител раскрыты в патенте США № 6027726, идеи которого включены здесь в виде ссылки. Примеры нацеливающих фрагментов могут также включать другие белки, характерные для клеточных компонентов, в том числе антигены, связанные с новообразованиями или опухолями. Белки, используемые как нацеливающие фрагменты, могут быть прикреплены к липосомам с помощью ковалентных связей (см., Heath, Covalent Attachment of Proteins to Liposomes, 149 Methods in Enzymology 111-119 (Academic Press, Inc. 1987)). Другие ориентационные способы включают систему биотин-авидин.
В одном типичном варианте липидная частица содержит смесь катионных липидов согласно настоящему изобретению, нейтральных липидов (кроме катионных липидов), стирола (например, холестерина) и ПЭГ-модифицированного липида (например, ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-ДМА). В некоторых вариантах липидная смесь состоит исключительно или в основном из катионного липида согласно настоящему изобретению, нейтрального липида, холестерина и PEG-модифицированного липида. В дальнейшем предпочтительны варианты, в которых липидная частица состоит исключительно или в основном из вышеупомянутой смеси липидов в молярном соотношении примерно 20-70% аминолипида:5-45% нейтрального липида:20-55% холестерина:0,5-15% ПЭГ-модифицированного липида.
В одном из вариантов липидная частица содержит по меньшей мере два липида, описанных в данном документе. Например, смесь катионных липидов может быть использована в липидной частице таким образом, чтобы смесь содержала 20-60% от общего содержания липидов на молярной основе.
В отдельном варианте липидная частица состоит из или состоит в основном из катионных липидов, выбранных из табл. 1, ДСФХ, холестерина и либо ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-ДМА, например, в молярном соотношении, равном примерно 20-60% катионных липидов:5-25% ДСФХ:25-55% холестерина:0,5-15% ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-ДМА. В отдельном варианте молярное липидное соотношение составляет приблизително 40/10/40/10 (моль.% катионный липид/ДСФХ/холестерин/ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-ДМА), 35/15/40/10 (моль.% катионный липид/ДСФХ/холестерин/ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-ДМА) или 52/13/30/5 (моль.% катионный липид/ДСФХ/холестерин/ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-ДМА). В другой группе вариантов нейтральный липид, ДСФХ, в этих композициях замещается на ПОФХ, ДПФХ, ДОФЭ или СМ.
Терапевтическая агент-липидная частица.
Композиции и составы.
Настоящее изобретение включает композиции, содержащие липидные частицы согласно настоящему изобретению и активное вещество, где активное вещество связано с липидной частицей. В отдельных вариантах активное вещество является терапевтическим веществом. В отдельных вариантах активное вещество инкапсулировано в водное содержимое липидной частицы. В других вариантах активное вещество присутствует в одном или нескольких липидных слоях липидной частицы. В других вариантах активное вещество связано с внешней или внутренней липидной поверхностью липидной частицы.
Обозначение полностью инкапсулированные, используемое здесь, означает, что нуклеиновые кислоты в частицах существенно не разрушились после тестирования воздействием сыворотки или нуклеазы, которые существенно разрушают свободные нуклеиновые кислоты. В полностью инкапсулированной системе, предпочтительно чтобы менее 25% частиц нуклеиновой кислоты разлагалось при процедурах, при которых обычно разлагается 100% свободных нуклеиновых кислот, более предпочтительно, если разрушаются меньше чем 10% и наиболее предпочтительно если разрушаются меньше 5% частиц нуклеиновой кислоты. Кроме того, полное инкапсулирование может быть определено с помощью анализов Oligreen®. Oligreen® является ультра-чувствительным флуоресцентным красителем нуклеиновой кислоты для количественного определения олигонуклеотидов и одноцепочечных ДНК в растворе (поставляется Invitrogen Corporation, Карлсбад, Калифорния). Полная инкапсуляция также предполагает, что частицы являются стабильными в сыворотке крови, т.е. что они быстро не распадаются на составляющие части при введении in vivo.
Активные вещества, используемые здесь, включают любую молекулу или соединение, способное оказывать желаемое воздействие на клетку, ткань, орган или субъект. Такие эффекты могут быть биологические, физиологические или косметические, например. Активными веществами могут быть любые типы молекулы или соединения, включая, например, нуклеиновые кислоты, пептиды и полипептиды, в том числе, например, антитела, такие как, например, поликлональные антитела, моноклональные антитела, фрагменты антител; гуманизированные антитела, рекомбинантные антитела, рекомбинантные человеческие антитела и приматизированные™ антитела, цитокины, факторы роста, факторы апоптоза, факторы, индуцирующие дифференциацию, рецепторы клеточной поверхности и их лиганды; гормоны и малые молекулы, в том числе малые органические молекулы или соединения.
- 15 037404
В одном из вариантов активное вещество является терапевтическим веществом, или его солью, или производным. Производные терапевтического вещества могут быть терапевтически активными сами или они могут быть пролекарствами, которые становятся активными при дальнейшей модификации. Таким образом, в одном варианте производное терапевтического вещества сохраняет все или некоторые виды терапевтической активности по сравнению с неизмененным веществом, в то время как в другом варианте производное терапевтического вещества теряет терапевтическую активность.
В различных вариантах терапевтические вещества включают любое терапевтически эффективное средство или лекарственное средство, такие как противовоспалительные соединения, антидепрессанты, стимуляторы, анальгетики, антибиотики, противозачаточные средства, жаропонижающие средства, вазодилятаторы, антиангинальные средства, цитоваскулярные средства, ингибиторы передачи сигнала, сердечно-сосудистые препараты, например антиаритмические средства, вазоконстрикторы, гормоны и стероиды.
В некоторых вариантах терапевтическое вещество является онкологическим лекарственным средством, которое может относится к противоопухолевому лекарственному средству, противораковому лекарственному средству, опухолевому лекарственному средству, антинеопластическому лекарственному средству или аналогичным. Примеры онкологических лекарственных средств, которые могут быть использованы в соответствии с изобретением, включают, не ограничиваясь, адриамицин, алкеран, аллопуринол, альтертамин, амифостин, анастрозол, Ara С, триоксид мышьяка, азатиоприн, бексаротен, БиКНУ, блеомицин, бусульфан для внутривенного введения, бусульфан для перорального введения, капецитабин (Кселода), карбоплатин, кармустин, ЦЦНУ, целекоксиб, хлорамбуцил, цисплатин, кладрибин, циклоспорин А, цитарабин, цитозинарабинозид, даунорубицин, цитоксан, даунорубицин, дексаметазон, дексразоксан, додетаксел, доксорубицин, доксорубицин, дакарбазин, эпирубицин, эстрамустин, этопозида фосфат, этопозид и VP-16, экземестан, FK506, флударабин, фторурацил, 5-ФУ, гемцитабин (Гемзар), гемтузумаб-озогамицин, госерелина ацетат, гидреа, гидроксимочевину, идарубицин, ифосфамид, иматиниба мезилат, интерферон, иринотекан (Камптостар, КПТ-111), летрозол, лейковорин, леустатин, лейпролид, левамизол, литретиноин, мегестрол, мелфалан, L-PAM, месну, метотрексат, метоксален, митрамицин, митомицин, митоксантрон, азотистый иприт, паклитаксел, памидронат, Пегадемаз, пентостатин, порфимер натрия, преднизолон, ритуксан, стрептозоцин, STI-571, тамоксифен, таксотер, темозоламид, тенипозид, VM-26, топотекан (Гикамтин), торемифен, третиноин, ATRA, вальрубицин, вельбан, винбластин, винкристин, VP16 и винорельбин. Другими примерами онкологических лекарственных средств, которые могут быть использованы в соответствии с изобретением, являются эллиптицин и аналоги или производные эллиптицина, эпотилоны, внутриклеточные ингибиторы киназы и камптотецины.
Частицы нуклеиновая кислота-липид.
В некоторых вариантах липидные частицы согласно настоящему изобретению являются связанными с нуклеиновой кислотой, в результате чего образуется частица нуклеиновая кислота-липид. В отдельных вариантах нуклеиновая кислота полностью инкапсулируется в липидную частицу. Используемый здесь термин нуклеиновая кислота означает включение любого олигонуклеотида или полинуклеотида. Фрагменты, содержащие до 50 нуклеотидов, как правило, называются олигонуклеотиды, более длинные фрагменты называются полинуклеотиды. В некоторых вариантах олигонуклеотиды согласно настоящему изобретению - это такие, длина которых составляет 15-50 нуклеотидов.
В контексте данного изобретения термины полинуклеотид и олигонуклеотид относятся к полимеру или олигомеру нуклеотидных или нуклеозидных мономеров, состоящему из основания естественного происхождения, сахаров и связей между сахарами (скелет). Термины полинуклеотид и олигонуклеотид также относятся к полимерам или олигомерам, содержащим мономеры не естественного происхождения или их части, которые функционируют аналогично. Такие модифицированные или замещенные олигонуклеотиды часто предпочтительнее, чем формы естественного происхождения, благодаря таким свойствам, как, например, усиленное клеточное поглощение и повышенная стабильность в присутствии нуклеаз.
Нуклеиновая кислота, которая присутствует в частице липид-нуклеиновая кислота в соответствии с настоящим изобретением, включает в себя любые известные формы нуклеиновых кислот. Используемые здесь нуклеиновые кислоты могут быть одноцепочечные ДНК или РНК, или двухцепочечные ДНК или РНК, или ДНК-РНК гибриды. Примеры двухцепочечной ДНК включают структурные гены, гены, включающие контрольные и терминальные области и самовоспроизводящиеся системы, такие как вирусная или плазмидная ДНК. Примеры двухцепочечной РНК включают миРНК и другие реагенты РНКинтерференции. Одноцепочечные нуклеиновые кислоты включают, например, антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, микроРНК и триплекс-олигонуклеотиды.
Нуклеиновая кислота, которая находится в частице липид-нуклеиновая кислота этого изобретения, может включать одну или несколько модификаций олигонуклеотида, описанных ниже.
Нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению могут быть различной длины, как правило, зависящей от конкретной формы нуклеиновых кислот. Например, в отдельных вариантах плазмида или гены могут быть длиной примерно от 1000 до 100000 нуклеотидных остатков. В отдельных вариантах олигонуклеотиды могут колебаться в пределах от 10 до 100 нуклеотидов в длину. В различных свя- 16 037404 занных вариантах одноцепочечные, двухцепочечные и трехцепочечные олигонуклеотиды могут варьировать в длину от приблизительно 10 до приблизительно 50 нуклеотидов, от приблизительно 20 до приблизительно 50 нуклеотидов, от приблизительно 15 до приблизительно 30 нуклеотидов, от приблизительно до приблизительно 30 нуклеотидов.
В отдельных вариантах олигонуклеотид (или его цепочка) согласно настоящему изобретению специфически гибридизируется с целевым полинуклеотидом или является комплементарным целевому полинуклеотиду. Специфически гибридизируемый и комплементарный - термины, которые используются для обозначения достаточной степени взаимодополняемости, такой, при которой происходит стабильное и специфическое связывания между ДНК или РНК-мишенями и олигонуклеотидами. Понятно, что олигонуклеотиду не нужно быть на 100% комплементарным к последовательности целевой нуклеиновой кислоты, чтобы быть специфически гибридизируемым. Олигонуклеотид является специфически гибридизируемым, когда связывание олигонуклеотида с мишенью мешает нормальной функции молекулы-мишени, что вызывает потерю ее свойств или экспрессии, и существует достаточная степень комплементарности, чтобы избежать неспецифического связывания олигонуклеотида с нецелевыми последовательностями в условиях, когда желательно специфическое связывание, т.е. в физиологических условиях в случае исследований in vivo, или при проведении лечения, или в случае исследований in vitro, в условиях, при которых эти исследования проводятся. Таким образом, в других вариантах, этот олигонуклеотид включает в себя 1, 2 или 3 базовые замены, например, несоответствие по сравнению с областью гена или последовательностью мРНК, которая является целевой или к которой олигонуклеотид специфически гибридизируется.
РНК-интерференция нуклеиновых кислот.
В отдельных вариантах частицы нуклеиновая кислота-липид согласно настоящему изобретению связаны с РНК-интерференцией (РНК-и) молекул. Способы РНК-интерференции с использованием молекулы РНК-и могут быть использованы для того, чтобы нарушить экспрессию интересующего гена или полинуклеотида. Малые интерферирующие РНК (миРНК), по сути заменили антисмысловые олигонуклеотиды (ОДН) и рибозимы, поскольку следующее поколение лекарственных средств целевого олигонуклеотида находится в стадии разработки.
миРНК являются РНК дуплексами, обычно длиной 16-30 нуклеотидов, которые могут связываться с цитоплазматическим мультибелковым комплексом, известным как комплекс сайленсинга, индуцированный РНК-и (РИСК). РИСК, наполненный миРНК, опосредует деградацию гомологичных копий мРНК, поэтому могут быть разработаны миРНК, чтобы разрушитьэкспрессию белков с высокой специфичностью. В отличие от других антисмысловых технологий миРНК функционирует через естественный механизм, развившийся для контроля экспрессии генов через некодирующие РНК. Это, как правило, считается причиной того, почему их активность in vitro и in vivo является более мощной, чем у любого антисмыслового ОДН или рибозимов. Многообразие различных реагентов РНК-интерференции, в том числе миРНК, нацеливающая на клинически значимые мишени, в настоящее время находится в стадии фармацевтического развития, как описано, например, в работе de Fougerolles, A. et al., Nature Reviews 6:443-453 (2007).
В то время как первые описанные молекулы РНК-и были РНК:РНК гибриды, включающие в себя как смысловые цепи РНК, так и антисмысловые цепи РНК, в настоящее время продемонстрировано, что смысловые ДНК:антисмысловые РНК гибриды, смысловые РНК:антисмысловые ДНК гибриды и ДНК: ДНК гибриды способны быть медиаторами РНК-и (Lamberton, J.S. and Christian, A.T., (2003) Molecular Biotechnology 24:111-119). Таким образом, изобретение включает использование молекул РНКинтерференции, содержащие любой из этих различных типов двухцепочечных молекул. Кроме того, подразумевается, что молекулы РНК-и могут быть использованы и введены в клетки в различных формах. Таким образом, используемые здесь молекулы РНК-и охватывают любые (и все) молекулы, способные вызывать реакции РНК-интерференции в клетках, включая, но не ограничиваясь, двухцепочечный олигонуклеотид, состоящий из двух отдельных цепей, т.е. из смысловой цепи и антисмысловой цепи, например, малые интерферирующие РНК (миРНК); двухцепочечный олигонуклеотид, состоящий из двух отдельных цепей, которые связаны друг с другом ненуклеотидным линкером; олигонуклеотиды, содержащие петлю комплементарных последовательностей шпильки, которые образуют двухцепочечную область, например малые РНК-и молекулы, образующие шпильки, и векторы экспрессии, которые экспрессируют один или несколько полинуклеотидов, которые способны образовывать двухцепочечный полинуклеотид отдельно или в сочетании с другим полинуклеотидом.
Одноцепочечное соединение миРНК, как используется здесь, является миРНК соединением, которое состоит из одной молекулы. Оно может включать дуплексную область, сформированную внутрицепочечным спариванием, например, это может быть или это может включать, шпильку или структуру ручка сковороды. Одноцепочечные соединения миРНК могут быть антисмысловыми в отношении молекулы-мишени.
Одноцепочечное соединение миРНК может быть достаточно длинным, так, что оно может проникать в РИСК и участвовать в РИСК-опосредованном расщеплении целевой мРНК. Длина одноцепочечного соединения миРН составляет по меньшей мере 14 нуклеотидов, а в других вариантах длина состав- 17 037404 ляет по меньшей мере 15, 20, 25, 29, 35, 40 или 50 нуклеотидов. В некоторых вариантах оно меньше, чем
200, 100 или 60 нуклеотидов в длину.
Шпилька соединений миРНК будет иметь дуплексную область, равную по длине или состоящую по крайней мере из 17, 18, 19, 29, 21, 22, 23, 24 или 25 пар нуклеотидов. Дуплексная область по длине может быть равна или меньше 200, 100 или 50 нуклеотидов. В некоторых вариантах диапазоны для дуплексной области равняются 15-30, 17-23, 19-23 и 19 21 парам нуклеотидов в длину. Шпилька может иметь одноцепочечный выступ или конечный неспаренный участок. В некоторых вариантах выступы составляют 23 нуклеотида в длину. В некоторых вариантах выступ находится на смысловой стороне шпильки, а в некоторых вариантах на антисмысловой стороне шпильки.
Двухцепочечное соединение миРНК, как используется здесь, является миРНК соединением, которое состоит из более чем одной и в некоторых случаях двух цепей в которых межцепочечная гибридизация может формировать область дуплексной структуры.
Антисмысловая цепочка двухцепочечного соединения миРНК может быть равна по длине или состоящей по крайней мере из 14, 15, 16 17, 18, 19, 25, 29, 40, или 60 нуклеотидов. По длине она может быть равна или быть меньше 200, 100 или 50 нуклеотидов. Диапазоны могут быть равными 17-25, 19-23, и 19-21 нуклеотидов в длину. Используемый здесь термин антисмысловая цепочка означает цепочку соединения миРНК, которая в достаточной мере комплементарна молекуле-мишени, например РНКмишени.
Смысловая цепочка двухцепочечного соединения миРНК может быть равна по длине или состоящей по крайней мере из 14, 15, 16 17, 18, 19, 25, 29, 40 или 60 нуклеотидов. По длине она может быть равна или быть меньше 200, 100 или 50 нуклеотидов. Диапазоны могут быть равными 17-25, 19-23 и 1921 нуклеотидов в длину.
Двухцепочечная часть двухцепочечного соединения миРНК может быть равна по длине или состоять по крайней мере из 14, 15, 16 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 29, 40 или 60 нуклеотидных пар. По длине она может быть равна или быть меньше 200, 100 или 50 нуклеотидных пар. Диапазоны могут быть равны 15-30, 17-23, 19-23 и 19-21 нуклеотидных пар в длину.
Во многих вариантах соединение миРНК достаточно велико, так, что оно может быть расщепленным на эндогенные молекулы, например, ферментом дайсером (Dicer), чтобы произвести меньшие соединения миРНК, например ми РНК агенты.
Смысловые и антисмысловые цепочки могут быть выбраны так, что соединения двухцепочечной миРНК включают в себя одну цепочку или непарную область на одном или обоих концах молекулы. Таким образом, соединение двухцепочечной миРНК может содержать смысловые и антисмысловые нити, спаренные, чтобы содержать выступ, например один или два 5' и 3' выступа, или 3' выступ из 1-3 нуклеотидов. Выступы могут быть результатом того, что одна нить является больше, чем другая, или результатом того, что две нити одинаковой длины смещены. Некоторые варианты будут иметь по крайней мере один 3' выступ. В одном из вариантов оба конца молекулы миРНК будут иметь 3' выступ. В некоторых вариантах выступ является 2 нуклеотидами.
В некоторых вариантах длина дуплексной области находится между 15 и 30 нуклеотидами или составляет 18, 19, 20, 21, 22 и 23 нуклеотидов в длину, например, о диапазоне длин в соединении клейкой миРНК (кмиРНК) говорилось выше. Соединения клейкой миРНК могут быть похожими по длине и структуре на естественные продукты, переработанные дайсером из длинных дмиРНК. Варианты, в которых две цепочки соединения кмиРНК связаны, например ковалентно связаны, также включены. Шпилька или другие одноцепочечные структуры, которые обеспечивают необходимую двухцепочечную область и 3' выступ также находятся в рамках изобретения.
Соединения миРНК, описанные в данном документе, в том числе двухцепочечные соединения миРНК и одноцепочечные соединения миРНК могут выступать медиаторами сайленсинга (молчания) РНК-мишени, например мРНК, например, транскрипта гена, который кодирует белок. Для удобства, такие мРНК также упоминаются в этом документе, как мРНК выключения. Такой ген, также упоминается в качестве гена-мишени. В общем, РНК выключения является эндогенным геном или патогенным геном. Кроме того, другие РНК, отличные от мРНК, например тРНК, и вирусные РНК, также могут быть нацелены.
Фраза выступать медиатором РНК-и относится к способности выключать специфическим образом в соотетствии с последовательностью РНК-мишени. Не углубляясь в теорию, считается, что сайленсинг использует механизм РНК-и или процесс и РНК-проводники, например клейкие миРНК соединения из 21-23 нуклеотидов.
В одном из вариантов соединение миРНК является достаточно комплементарным РНК-мишени, например целевой мРНК, таким образом, что соединения миРНК выключают производство белка, кодируемого целевой мРНК. В другом варианте соединение миРНК является точно комплементарным РНКмишени, например отжигу соединения миРНК и целевой мРНК, например, для формирования гибрида, сделанного исключительно из пар оснований Уотсона-Крика в области точной комплементарности. Достаточно комплементарная РНК-мишень может включать внутреннюю область (например, не менее 10 нуклеотидов), которая является точно комплементарной РНК-мишени. Кроме того, в некоторых вариан- 18 037404 тах соединение миРНК специфически различает однонуклеотидное различие. В этом случае соединение миРНК опосредует медиацию РНК-и только, если обнаруживается точная комплементарность в области (например, в рамках 7 нуклеотидов) однонуклеотидное различие.
МикроРНК.
Микро-РНК (микроРНК) являются высококонсервативным классом малых молекул РНК, которые воспроизводятся с ДНК в геномах растений и животных, но не транслируются в белок. Обработанные микроРНК являются одноцепочечными молекулами РНК, состоящими из ~17-25 нуклеотидов (нт), которые встраиваются в РНК-индуцированный комплекс сайленсинга (РИСК) и были определены в качестве ключевых регуляторов развития, пролиферации клеток, апоптоза и дифференциации. Полагают, что они играют роль в регуляции экспрессии генов, связываясь с 3'-нетранслируемой областью специфических мРНК. РИСК опосредует снижение экспрессии генов через трансляционное ингибирование, расщепления транскрипта или оба этих процесса. РИСК также участвует в транскрипционном сайленсинге в ядрах широкого спектра эукариотов.
Количество последовательностей миРНК, выявленное на сегодняшний день, является большим и растущим, наглядные примеры можно найти, например, в работе miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature Griffiths-Jones S., Grocock R.J., van Dongen S., Bateman A., Enright A.J. NAR, 2006, 34, Database Issue, D140-D144; The microRNA Registry Griffiths-Jones S. NAR, 2004, 32, Database Issue, D109-D111; а также на сайте http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/.
Антисмысловые олигонуклеотиды.
В одном варианте нуклеиновая кислота - это антисмысловой олигонуклеотид, направленный против полинуклеотида-мишени. Термин антисмысловой олигонуклеотид или просто антисмысловой предназначен для обозначения олигонуклеотидов, которые комплементарны к полинуклеотидной последовательности-мишени. Антисмысловые олигонуклеотиды являются одинарными цепочками ДНК или РНК, которые являются комплементарными к выбранной последовательности, например к гену-мишени мРНК. Принято считать, что антисмысловые олигонуклеотиды ингибируют экспрессию генов за счет связывания с комплементарной мРНК. Связывание с мРНК-мишенью может вести к угнетению экспрессии генов либо посредством предотвращения трансляции комплиментарных цепочек мРНК посредством связывания с ними, либо приводя к деградации мРНК-мишени. Антисмысловая ДНК может быть использована для того, чтобы достичь специфическую, комплементарную (кодирующую или некодирующую) РНК. Если происходит связывание, то данный ДНК/РНК гибрид может быть расщеплен ферментом РНКаза Н. В отдельных случаях антисмысловые олигонуклеотиды содержат приблизительно от 10 до 50 нуклеотидов, более предпочтительны приблизительно от 15 до 30 нуклеотидов. Этот термин охватывает также антисмысловые олигонуклеотиды, которые могут быть не точно комплементарны по отношению к желаемому гену-мишени. Таким образом, изобретение может быть использовано в тех случаях, когда антисмысловые демонстрируют не узко специфическую активность, либо когда антисмысловые последовательности, содержат одно или более несоответствий в отношении последовательностимишени, что является наиболее предпочтительным в практическом применении.
Антисмысловые олигонуклеотиды продемонстрировали эффективность и проявили себя как избирательные целевые ингибиторы синтеза белка, и, следовательно, могут быть использованы для избирательного ингибирования синтеза белка посредством воздействия на ген-мишень. Эффективность антисмысловых олигонуклеотидов в отношении ингибирования синтеза белка достоверно установлена. Например, синтез полигалактауроназы и мускариновых рецепторов к ацетилхолину 2-го типа подавляются антисмысловыми олигонуклеотидами, направленными на соответствующие им мРНК последовательности (патент США № 5739119 и патент США № 5759829). Кроме того, примеры антисмыслового ингибирования были продемонстрированы в отношении нуклеарного белка циклина, гена, определяющего полирезистентность к лекарственным средствам (MDG1), ICAM-1, Е-селектина, STK-1, стриального αрецептора ГАМК и человеческого EGF ((Jaskulski et al., Science. 1988 Jun 10; 240(4858):1544-6; Vasanthakumar and Ahmed, Cancer Commun. 1989; 1(4):225-32; Peris et al., Brain Res. Mol. Brain Res. 1998 Jun 15; 57(2):310-20; патент США № 5801154; патент США № 5789573; патент США № 5718709 и патент США № 5610288). Более того, описано, что антисмысловые конструкции ингибируют и могут быть использованы для лечения различных аномальных клеточных пролифераций, например рака (патент США № 5747470; патент США № 5591317 и патент США № 5783683).
Способы получения антисмысловых олигонуклеотидов известны в данной области техники и могут быть легко адаптированы для производства антисмысловых олигонуклеотидов, которые нацелены на любые последовательности полинуклеотида. Выбор антисмысловых олигонуклеотидных последовательностей, специфичных для данной последовательности-мишени, основан на анализе выбранной последовательности-мишени и определении вторичной структуры, Tm, связывающей энергии и относительной стабильности. Антисмысловые олигонуклеотиды могут быть выбраны на основе их относительной неспособности образовывать димеры, шпильки или другие вторичные структуры, которые могут уменьшать или не допускать специфическое связывание с мРНК-мишенью в клетке хозяина. Наиболее предпочтительные области-мишени мРНК включают соответствующие зоны в области или вблизи кодона, инициирующего AUG трасляции, и соответствующие последовательности, которые в значительной сте- 19 037404 пени комплиментарны 5' областям мРНК. Рекомендации относительно анализа вторичных структур и выбора целевой области могут подготавливаться, например, с помощью программного обеспечения
OLIGO primer analysis, v.4 (Molecular Biology Insights) и/или программного обеспечения BLASTN 2.0.5 алгоритма (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997, 25(17):3389-402).
Антагомиры.
Антагомиры это РНК-подобные олигонуклеотиды, которые включают различные модификации для защиты РНКазы и фармакологических эффектов, таких как тканевое разрастание и клеточное поглощение. Они отличаются от обычных РНК, например, полным 2'-О-метилированием сахара, фосфоротиоатным каркасом и, например, фрагментом холестерина на 3'-конце. Антагомиры могут быть использованы для эффективного выключения экспрессии генов (сайленсинга) эндогенных микроРНК путем формирования дуплексов, состоящих из антагомира и эндогенной микроРНК. Тем самым предотвращается микроРНК-индуцированный сайленсинг генов. Примером антагомир-опосредованного микроРНК сайленсинга является подавление экспрессии генов микроР-122, описанное в работе Krutzfeldt et al., Nature, 2005, 438: 685-689, которая включена здесь в качестве ссылки в полном объеме. Антагомир РНК может быть синтезирован с помощью стандартного протокола твердофазного способа синтеза олигонуклеотидов. См. заявку на патент США сер. №№ 11/502158 и 11/657341 (предоставленная информация включена в настоящий документ в качестве ссылки).
Антагомир может включать лиганд-коньюгированные мономерные субъединицы и мономеры для синтеза олигонуклеотидов. Типичные мономеры описаны в заявке США № 10/916185, поданной 10 августа 2004 г. Антагомир может иметь ZXY структуру, как описано в заявке РСТ № PCT/US 2004/07070, поданной 8 марта 2004 г. Антагомир может быть представлен в виде комплекса с амфипатическими частицами. Типичные амфипатические фрагменты для использования с олигонуклеотидами описаны в заявке РСТ № PCT/US 2004/07070, поданной 8 марта 2004 г.
Аптамеры.
Аптамеры являются молекулами нуклеиновой кислоты или пептидными молекулами, которые с высокой степенью сродства и специфичности связываются с определенной интересующей молекулой (Tuerk and Gold, Science 249:505 (1990); Ellington and Szostak, Nature 346:818 (1990)). Имеется успешный опыт получения ДНК или РНК аптамеров, которые способны связываться с различными веществами, от крупных белков до небольших органических молекул. См. работу Eaton, Curr. Opin. Chem. Biol. 1:10-16 (1997), Famulok, Curr. Opin. Struct. Biol. 9:324-9(1999), и Hermann and Patel, Science 287:820-5 (2000). Аптамеры могут основываться на структурах РНК или ДНК, а также могут включать рибосвич. Рибосвич это часть молекулы мРНК, которая может непосредственно связывать малые молекулы-мишени, и связанное состояние которых влияет на активность генов. Таким образом, мРНК, которая содержит рибосвич, принимает непосредственное участие в регулировании своей собственной деятельности, в зависимости от наличия или отсутствия ее молекулы-мишени. Как правило, аптамеры разработаны путем многократных туров селекции in vitro или, что эквивалентно, СЭЛЭО (систематическая эволюция лигандов экспоненциальным обогащением) для связывания с различными молекулами-мишенями, такими как малые молекулы, белки, нуклеиновые кислоты, и даже клетки, ткани и организмы. Аптамер может быть получен любым известным способом, в том числе синтетическим, рекомбинантным, а также методом очистки, и может быть использован самостоятельно или в сочетании с другими аптамерами, специфическими к той же мишени. Кроме того, как далее описано более полно в настоящем документе, термин аптамер включает, в частности вторичные аптамеры, содержащие консенсусную последовательность, производную от двух или более сравниваемых известных аптамеров к данной мишени.
Рибозимы.
Согласно другому варианту изобретения частицы нуклеиновая кислота-липид связаны с рибозимами. Рибозимы являются комплексами РНК молекул, которые имеют специфические каталитические домены, обладающие эндонуклеазной активностью (Kim и Cech, Proc Natl Acad Sci USA. 1987 Dec; 84(24):8788-92; Forster and Symons, Cell. 1987 Apr 24; 49(2):211-20). К примеру, многие рибозимы ускоряют реакции переноса фосфорных эфиров с высокой степенью специфичности, часто отщепляя только один из нескольких фосфорных эфиров в олигонуклеотидном субстрате (Cech et al., Cell. 1981 Dec; 27(3 Pt 2):487-96 ; Michel and Westhof, J. Mol. Biol. 1990 Dec 5;216(3):585-610; Reinhold-Hurek and Shub, Nature. 1992 May 14; 357(6374): 173-6). Эта специфичность отражает требования, согласно которым связанность субстрата через взаимодействия, основанные на принципе избирательного спаривании оснований, с внутренней ведущей последовательностью (IGS) рибозима является приоритетной в химической реакции.
В настоящее время известно по крайней мере шесть основных вариантов ферментативных РНК природного происхождения. Каждый вариант может катализировать гидролиз фосфодиэфирных связей РНК in trans (и таким образом могут расщеплять другие молекулы РНК) в физиологических условиях. Обычно ферментативные нуклеиновые кислоты действуют посредством первичного связывания с РНКмишенью. Такое связывание происходит через связывающие участки-мишени ферментативных нуклеиновых кислот, располагающихся в непосредственной близости к ферментативному участку молекулы, которая воздействует на РНК-мишень путем расщепления. Таким образом, ферментативная нуклеиновая
- 20 037404 кислота изначально распознает, а затем связывается с РНК-мишенью посредством комплементарного спаривания оснований, и в случае связывания с необходимым участком, воздействует ферментативно и вырезает РНК-мишени. Стратегическое расщепление таких РНК-мишеней разрушает их способность непосредственно к синтезу закодированного белка. После того как ферментативная нуклеиновая кислота связалась и расщепила свою РНК-мишень, она освобождается от данной РНК в поисках следующей мишени и может повторно связываться и расщеплять новую мишень.
Молекула ферментативной нуклеиновой кислоты может образовываться в мотивах головки молотка, шпильки, вируса гепатита δ группы I интрон или РН-аза Р РНК (в ассоциации с РНК ведущей последовательностью) или Нейроспоры ВС РНК, для примера. Конкретные примеры мотива головки молотка описываются в работе Rossi et al. Nucleic Acids Res. 1992 Sep 11; 20(17):4559-65. Примеры мотивов шпильки описываются вработе Hampel et al. (Eur. Pat. Appl. Publ. No. EP 0360257), Hampel and Tritz, Biochemistry 1989 Jun 13;28(12):4929-33; Hampel et al., Nucleic Acids Res. 1990 Jan 25; 18(2):299-304 и патенте США No 5631359. Пример мотива вируса гепатита Δ описывается в работе Perrotta and Been, Biochemistry. 1992 Dec 1; 31 (47):11843-52; пример мотива Рназы Р описан в работе Guerrier-Takada et al., Cell. 1983 Dec; 35(3 Pt 2):849-57; мотив Нейроспрора ВС РНК рибозима описывается в работе Collins (Saville and Collins, Cell. 1990 May 18;61(4):685-96; Saville and Collins, Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Oct 1;88(19):8826-30; Collins and Olive, Biochemistry. 1993 Mar 23; 32(11):2795-9); а пример Группы I-интрон описан в патенте США No 4987071. Важными характеристиками молекул ферментативной нуклеиновой кислоты, которые используются в данном изобретении, являются их избирательное связывание с участком субстрата, который является комплементарным к одному или нескольким участкам генов-мишеней ДНК или РНК, а также то, что они имеют нуклеотидные последовательности в пределах или рядом с участком, связывающим субстрат, за счет которых молекула приобретает способность расщеплять РНК. Таким образом использование рибозимных конструкций не должно быть ограничено конкретными мотивами, упомянутыми в данном документе.
Способы получения рибозимов, нацеленных на любую полинуклеотидную последовательность, известны в данной области техники. Рибозим может быть разработан, как описано в публикации международной заявки на патент № WO 93/23569 и в публикации международной заявки на патент № WO 94/02595, каждая из которых специально включена здесь в качестве ссылки, и синтезирован, чтобы быть протестированным in vitro и in vivo согласно указанным выше документам.
Активность рибозимов может быть оптимизирована за счет изменения длины связывающего плеча рибозима либо за счет химического синтеза рибозимов с модифицикациями, которые препятствуют их разрушению сывороточными рибонуклеазами (см., например, публикацию международной заявки на патент № WO 92/07065; публикацию международной заявки на патент № WO 93/15187; публикацию международной заявки на патент № WO 91/03162; публикацию европейской заявки на патент № 92110298.4; патент США № 5334711 и публикацию международной заявки на патент № WO 94/13688, которые описывают различные химические модификации, которые могут быть произведены в фрагментах сахара ферментативных РНК молекул); с модификациями, которые повышают их эффективность в клетках, и с удаленными стволовыми основаниями II, что сокращает время синтеза РНК и уменьшает химические требования.
Иммуностимулирующие олигонуклеотиды.
Нуклеиновые кислоты, связанные с липидными частицами согласно настоящему изобретению могут быть иммуностимулирующими, включающими иммуностимулирующие олигонуклеотиды (ИСЦ; одно- или двухцепочечные), способные вызывать иммунную реакцию при введении субъекту, который может быть млекопитающим или другим пациентом. ИСЦ включают, например, определенные палиндромы, ведущие к вторичным структурам шпильки (см. Yamamoto S., et al. (1992) J. Immunol. 148: 40724076)), или CpG мотивам, а также другие известные свойства ИСЦ (такие как мульти G-домены см. WO 96/11266).
Иммунный ответ может быть врожденным или адаптивным иммунным ответом. Иммунная система разделяется на большую - врожденную иммунную систему и приобретенную адаптивную иммунную систему позвоночных животных, последняя из которых делится на гуморальные и клеточные компоненты. В отдельных вариантах может иметься иммунный ответ слизистой оболочки.
В отдельных вариантах иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты являются иммуностимулирующими только при введении в сочетании с липидной частицей, и не являются иммуностимулирующими при введении в своей свободной форме. В соответствии с настоящим изобретением такой олигонуклеотид считается иммуностимулирующим.
Считается, что иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты не являются специфичными по последовательности, если не требуется, чтобы они специфически связывались с целевым полинуклеотидом и снижали его экспрессию, чтобы спровоцировать иммунный ответ. Таким образом, определенные иммуностимулирующие нуклеиновые кислоты могут включать последовательность, соответствующую области естественного нахождения в гене или мРНК, но они могут по-прежнему считаеться не специфичными по последовательности иммуностимулирующими нуклеиновыми кислотами.
- 21 037404
В одном из вариантов, иммуностимулирующая нуклеиновая кислота или олигонуклеотид содержит, по меньшей мере один CpG динуклеотид. Олигонуклеотид или CpG динуклеотид может быть неметилированным или метилированным. В другом варианте иммуностимулирующая нуклеиновая кислота содержит по меньшей мере один CpG динуклеотид с метилированным цитозином. В одном из вариантов нуклеиновая кислота содержит единственный динуклеотид CpG, где цитозин в вышеупомянутом CpG динуклеотиде является метилированным. В особом варианте нуклеиновая кислота состоит из последовательности 5' TAACGTTGAGGGGCAT 3'. В альтернативном варианте нуклеиновая кислота, содержит, по меньшей мере два CpG динуклеотида, где по меньшей мере один цитозин в динуклеотидах CpG является метилированным. В другом варианте, каждый цитозин в CpG динуклеотидах, присутствующий в последовательности, является метилированным. В другом варианте, нуклеиновая кислота содержит множество динуклеотидов CpG, где по меньшей мере один из указанных CpG динуклеотидов включает метилированный цитозин.
В одном особом варианте нуклеиновая кислота состоит из последовательности 5' TTCCATGACGTTCCTGACGT 3'. В другом конкретном варианте нуклеиновая кислота состоит из последовательности, 5' TCCATGACGTTCCTGACGT 3' в котором два цитозина, выделенные жирным шрифтом, метилированы. В отдельных вариантах, ОДН выбран из группы, состоящей из ОДНов ОДН № 1, ОДН № 2, ОДН № 3, ОДН № 4, ОДН № 5, ОДН № 6, ОдН № 7, ОДН № 8, и ОДН № 9, как продемонстрировано ниже.
Таблица 3
Примеры иммуностимулирующих олигонуклеотидов (ОДН)
ОДН Название Иденти фикато Р юследо вательн ости Последовательность ОДН (5'-3').
0ДН1 человеческий с-гпус 5'-TAACGTTGAGGGGCAT-3
*ОДН1m 5'-TAAZGTTGAGGGGCAT-3
ОДН 2 5'-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3
‘ ОДН 2m 5'-TCCATGAZGTTCCTGAZGTT-3
ОДНЗ 5'-TAAGCATACGGGGTGT-3
ОДН 5 5'-AACGTT-3
ОДН 6 5'-GATGCTGTGTCGGGGTCTCCGGGC-3'
ОДН 7 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT-3'
ОДН 7m 5'-TZGTZGTTTTGTZGTTTTGTZGTT-3'
ОДН 8 5'-TCCAGGACTTCTCTCAGGTT-3'
ОДН 9 5'-TCTCCCAGCGTGCGCCAT-3'
ОДН 10 мышиная молекула межклеточной адгезии -1 5'-TGCATCCCCCAGGCCACCAT-3
ОДН 11 человеческая молекула межклеточной адгезии -1 5'-GCCCAAGCTGGCATCCGTCA-3'
ОДН 12 человеческая молекула межклеточной адгезии -1 5'-GCCCAAGCTGGCATCCGTCA-3
- 22 037404
ОДН Название Иденти фикато Р последе вательн ости Последовательность ОДН (5'-3').
ОДН 13 человеческий erb-B-2 5'-GGT GCTCACTGC GGC-3'
ОДН 14 человеческий с-тус 5'-ААСС GTT GAG GGG САТ-3'
ОДН 15 человеческий с-тус 5'-ТАТ GCT GTG CCG GGG ТОТ TCG GGC-3'
ОДН 16 5'-GTGCCG GGGTCTTCGGGC-3'
ОДН 17 Рецептор человеческого инсулинового фактора роста 1 - 5'-GGACCCTCCTCCGGAGCC-3’
ОДН 18 Рецептор человеческого инсулинового фактора роста 1 5'-ТСС ТСС GGA GCC AGA СТТ-3'
ОДН 19 Рецептор человеческого эпидермального фактора зоста 5'-ААС GTT GAG GGG CAT-3'
ОДН 20 Рецептор эпидермального фактора зоста 5' CCGTGGTCA TGCTCC-3'
ОДН 21 человеческий Сосудистый эндотелиальный фактор роста 5'-CAG CCTGGCTCACCG CCTTGG-3'
ОДН 22 мышиный Фосфокиназа С - альфа 5'-CAG CCA TGG TTC CCC CCA AC-3'
ОДН 23 5'-GTT CTC GCT GGT GAG TTT CA-3'
ОДН 24 человеческий Bcl-2 5'-TCT CCCAGCGTGCGCCAT-3'
ОДН 25 человеческий C-Raf-s 5'-GTG CTC CAT TGA TGC-3'
ОДН № 26 человеческий Сосудистый эндотелиальный фактор роста Рецептор-1 5'-GAGUUCUGAUGAGGCCGAAAGGCCGAAAGUCUG-3'
ОДН № 27 5'-RRCGYY-3'
ОДН № 28 5'-AACGTTGAGGGGCAT-3'
ОДН № 29 5'-CAACGTTATGGGGAGA-3'
ОДН Название Иденти фикато Р последе вательн ости Последовательность ОДН (5'-3').
ОДН № 30 человеческий с-тус 5'-TAACGTTGAGGGGCAT-3'
Z представляет метилированный остаток цитозина. ОДН 14 является 15-mer олигонуклеотид и ОДН 1 совпадает с олигонуклеотидом, владеющим тимидином добавленным на 5'-конец, превращая ОДН 1 в 16-mer. Не было зарегистрировано различий в биологической активности между ОДН 14 и ОДН 1, и оба демонстрируют схожую иммуностимулирующую активность (Mui et al., 2001).
Дополнительные специфические последовательности нуклеиновых кислот олигонуклеотидов (ОДН), пригодные для использования в композиции, и способы изобретения описаны в работе Raney et al., Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 298:1185-1192 (2001). В некоторых вариантах ОДН использованные в композициях и способах согласно настоящему изобретению, имеют фосфодиэфирный (РО) скелет или фосфоротиоатный (PS) скелет и/или по крайней мере один метилированный остаток цитозина в CpG мотиве.
Олигонуклеотиды-ловушки.
Поскольку факторы транскрипции распознают свои относительно короткие связывающие последовательности, даже в отсутствие окружающей геномной ДНК, короткие олигонуклеотиды, переносящие согласованные связывающие последовательности специфического фактора транскрипции, могут быть использованы в качестве инструментов для управления экспрессией генов в живых клетках. Эта стратегия вовлекает во внутриклеточню доставку так называемые олигонуклеотиды ловушки, которые затем распознаются и связываются целевым фактором. Захват ловушкой транскрипционных факторов ДНКсвязывающего участка, делает фактор транскрипции неспособным последовательно связываться с регионами-промоутерами генов-мишеней. Ловушки могут быть использованы в качестве терапевтических средств, либо для подавления экспрессии генов, которые активизируются фактором транскрипции, или
- 23 037404 регулирующих генов, которые супрессированы связыванием транскрипционного фактора. Примеры использования олигонуклеотидов-ловушек могут быть найдены в работе Mann et al., J. Clin. Invest., 2000,
106: 1071-1075, которая в точности включена здесь в качестве ссылки, в полном объеме.
Супермир.
Супермир относится к одноцепочечному, двухцепочечному или частично двухцепочечному олигомеру или полимеру рибонуклеиновой кислоты (РНК) или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или к обоим или к их модификациям, который имеет нуклеотидную последовательность, практически идентичную микроРНК, и является антисмысловым по отношению к своим целям. Этот термин включает олигонуклеотиды, состоящие из природных нуклеиновых оснований, сахаров и ковалентных межнуклеозидных (скелетных) связей, которые содержат хотя бы одну часть не природного происхождения, которая функционирует подобным образом. Олигонуклеотиды, измененные или замещенные таким образом, предпочтительнее естественной формы, благодаря наличию желаемых свойств, таких как, например, увеличенное клеточное поглощение, повышение сродства к целевой нуклеиновой кислоте и повышенная стабильность в присутствии нуклеаз. В предпочтительном варианте супермир не включает смысловой нити, а в другом предпочтительном варианте супермир в значительной степени не самогибридизируется. Супермир характерный для изобретения, может иметь вторичную структуру, но, главным образом, в физиологических условиях он является одноцепочечным. Супермир, который является большей частью одноцепочечным, одноцепочечный в пределах менее 50% (например, менее 40%, 30%, 20%, 10%, или 5%) супермира, спаренного с собой (дуплексного). Супермир может включать сегмент шпильку, например, последовательность, преимущественно на конце 3', может самогибридизироваться и формировать дуплексную область, например дуплексную область по крайней мере из 1, 2, 3 или 4 и преимущественно менее чем из 8, 7, 6 или n нуклеотидов, например 5 нуклеотидов. Дуплексная область может быть связана линкером, например нуклеотидным линкером, например, 3, 4, 5, или 6 dTs, например, модифицированным dTs В другом варианте супермир является спаренным с более коротким олиго, например, состоящим из 5, 6, 7, 8, 9 или 10 нуклеотидов в длину, например с одним или двумя 3' и 5' концами или с одним концом в нетерминальной части или в середине супермира.
Имитаторы микроРНК.
Имитаторы микроРНК представляют собой класс молекул, которые могут быть использованы для имитации способности сайленсинга генов одной или нескольких микроРНК. Таким образом, термин имитатор микроРНК относится к синтетическим некодирующим РНК (т.е. микроРНК, не полученная посредством очистки от ресурса эндогенной микроРНК), которые способны проникать в пути метаболизма РНК-и и регулирования генной экспрессии.
Имитаторы микроРНК могут быть разработаны как зрелые молекулы (например, одноцепочечные) или имитировать предшественников (например, в при- или пре-микроРНК). Имитаторы микроРНК могут состоять из нуклеиновой кислоты (модифицированных или немодифицированных нуклеиновых кислот), в том числе содержащей олигонуклеотиды, без ограничений, РНК, модифицированной РНК, ДНК, модифицированной ДНК, заблокированных нуклеиновых кислот или 2'-О,4'-С-этиленового мостика нуклеиновых кислот (ЭНК), или любой комбинации из вышеупомянутых (в том числе ДНК-РНК-гибридов). Кроме того, имитаторы микроРНК могут содержать конъюгаты, что может влиять на доставку, внутриклеточную компартментализацию, устойчивость, специфичность, функциональность, использование цепочек, и/или потенцию. В одной модели, имитаторы микроРНК являются двухцепочечными молекулами (например, с дуплексной областью, длиной приблизительно в пределах 1631 нуклеотидов) и содержат одну или несколько последовательностей, которые идентичны зрелой цепи данной микроРНК. Модификации могут включать 2'-модификации (в том числе 2'-О-метил модификации и 2'-F модификации) на одной или обеих цепочках молекулы и межнуклеотидные модификации (например, фосфортиоатные модификации), которые повышают стабильность нуклеиновых кислот и/или специфичность. Кроме того, имитаторы микроРНК могут включать выступы. Выступы могут состоять из 1-6 нуклеотидов на любом 3' и 5' конце любой цепочки и могут быть модифицированы в целях повышения стабильности и функциональности. В одном из вариантов имитатор микроРНК включает дуплексную область в пределах 1631 нуклеотидов и один или более из следующих образцов химической модификации: смысловая цепочка, содержащая 2'-О-метил модификации нуклеотидов 1 и 2 (считая с 5' конца смыслового олигонуклеотида), и все Ц и У; модификации антисмысловой цепочки могут включать 2'-F модификацию всех Ц и У, фосфорилирование 5' конца олигонуклеотида и стабилизированные межнуклеотидные связи, ассоциированные с 2-нуклеотид 3' выступом.
Антимир или ингибитор микроРНК.
Термины антимир, микроРНК ингибитор, миР ингибитор, или ингибитор являются синонимами и относятся к олигонуклеотидам или модифицированным олигонуклеотидам, которые влияют на возможности специфических микроРНК. В общем, ингибиторы являются по своей природе нуклеиновой кислотой или модифицированными нуклеиновыми кислотами, включая олигонуклеотиды, содержащие РНК, модифицированную РНК, ДНК, модифицированную ДНК, заблокированные нуклеиновые кислоты (ЗНК), или любую комбинацию вышеупомянутых. Модификации включают 2'-модификации (в том числе 2'-О-алкил модификации и 2'-F модификации) и межнуклеотидные модификации (например, фосфо- 24 037404 ротиоатные модификации), что может влиять на доставку, устойчивость, специфичность, внутриклеточную компартментализацию или потенцию. Ингибиторы могут принимать различные конфигурации, в том числе одноцепочечную, двухцепочечную (РНК/РНК или РНК/ДНК-дуплексов), и конструкции шпильки, в общем, ингибиторы микроРНК содержат одну или несколько последовательностей или частей последовательности, которые являются комплементарными или частично комплементарными зрелой цепочке (или цепочкам) из микроРНК, являющейся целевой, кроме того, ингибитор микроРНК может также содержать дополнительные последовательности, расположенные в 5' и 3' по отношению к последовательности, которая является обратным комплементом зрелой миРНК. Дополнительные последовательности могут быть обратными комплементами к последовательностям, которые примыкают к зрелой микроРНК в при-микроРНК, из которых зрелая микроРНК получена, или дополнительные последовательности могут быть случайными последовательностями (имеющими смесь из А, Г, Ц или У). В некоторых вариантах одна или обе дополнительных последовательности являются случайными последовательностями, способными образовывать шпильки. Таким образом, в некоторых вариантах последовательности, являющиеся обратным комплементом микроРНК, защищены с боков на стороне 5', и на стороне 3' структурами шпильки. Когда ингибиторы микро-РНК двухцепочечные, они могут включать несоответствия между нуклеотидами на противоположных цепочках. Кроме того, ингибиторы микро-РНК могут быть связаны со спаренными фрагментами в целях содействия поглощению ингибитора в клетку. Так, например, ингибитор микро-РНК может быть связан с холестерином 5-(бис(4метоксифенил)(фенил)метокси)-3-гидроксипентилкарбамат), который позволяет пассивное поглощение ингибитора микро-РНК в клетку. Ингибиторы микро-РНК, в том числе ингибиторы шпильки микроРНК, подробно описаны в работах. Vermeulen et al., Double-Stranded Regions Are Essential Design Components Of Potent Inhibitors of РИСК Function, RNA 13: 723-730 (2007) и в WO 2007/095387 и WO 2008/036825, каждая из которых включена здесь в качестве ссылки в полном объеме. Обычный специалист в данной области техники может выбрать последовательность из базы данных для желаемого микроРНК и сконструировать ингибитор, пригодный для способов, описанных здесь.
U1 адаптер.
U1 адаптер ингибирует полиА сайты и является бифункциональными олигонуклеотидами с целевой комплементарностью домена к сайту в терминальном экзоне гена-мишени и U1 домене, который связывается с U1 малым ядерным компонентом РНК U1 малого ядерного рибонуклеопротеина (мяРНП) (работа Goraczniak, et al., 2008, Nature Biotechnology, 27(3), 257-263, которая в точности включена здесь в качестве ссылки, в полном объеме). U1 мяРНП является рибонуклеопротеиновым комплексом, который функционирует в основном, чтобы направлять первые шаги в формировании сплайсосомы путем связывания с пре-мРНК экзон-интронной границей (Brown and Simpson, 1998, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol. Biol. 49:77-95). Нуклеотиды 2-11 5' конца U1 мяРНК пары оснований связываются с 5'ss пре-мРНК. В одном из вариантов олигонуклеотиды изобретения являются U1 адаптерами. В одном из вариантов U1 адаптер может быть введен в сочетании по крайней мере с одним другим иРНК агентом.
Модификации олигонуклеотидов.
Немодифицированные олигонуклеотиды могут быть меньше, чем оптимальные в некоторых приложениях, например немодифицированные олигонуклеотиды могут быть склонны к деградации, например, клеточными нуклеазами. Нуклеазы могут гидролизовать фосфодиэфирные связи нуклеиновых кислот. Однако химические модификации олигонуклеотидов могут придавать улучшенные свойства и, например, могут помогать олигонуклеотидам быть более устойчивыми к нуклеазам.
Поскольку олигонуклеотиды являются полимерами подразделений или мономерами, многие из модификаций, описанных ниже, происходят в положении, которое повторяется в рамках олигонуклеотида, например модификация основания, сахара, фосфатного фрагмента или немостикового кислорода фосфатного фрагмента. Нет необходимости для всех позиций данного олигонуклеотида быть однообразно модифицированными, а на самом деле больше, чем одна из вышеупомянутых модификаций могут быть включены в единственный олигонуклеотид или даже в единственный нуклеозид в олигонуклеотиде.
В некоторых случаях модификация будет происходить на всех позициях субъектов в олигонуклеотиде, но во многих и фактически в большинстве случаев модификации не будет. К примеру, модификация может произойти только на 3' и 5' терминальной позиции, может происходить только во внутренней области, может произойти только в терминальных регионах, например, в положении на терминальном нуклеотиде или в последних 2, 3, 4, 5 или 10 нуклеотидах олигонуклеотида. Модификация может произойти в области двойной цепочки, области одинарной цепочки, или в обеих областях. Модификация может произойти только в области двойной цепочки двухцепочечного олигонуклеотида или может произойти только в области одинарной цепочки двухцепочечного олигонуклеотида. Например, фосфоротиоатная модификация на немостиковой позиции кислорода может происходить только на одном или обоих концах, может происходить только в терминальной области, например, в позиции на терминальном нуклеотиде или в последних 2, 3, 4, 5 или 10 нуклеотидах цепочки, или может произойти в областях двойной и одинарной цепочек, особенно на концах. 5' конец или концы могут быть фосфорилированны.
Модификация, описанная здесь, может быть единственной модификацией или единственным типом модификации, включенным в несколько нуклеотидов, или модификация может быть объединена с одной
- 25 037404 или несколькими другими модификациями, описанными здесь. Модификации, описанные здесь, могут быть объединены в олигонуклеотид, например, различные нуклеотиды олигонуклеотидов имеют различные модификации, описанные здесь.
В некоторых вариантах особенно предпочтительно, например, повысить стабильность, включить особые нуклеиновые основы в выступ или включить модифицированные нуклеотиды или нуклеотидные заместители в одиночную цепочку выступов, например в 5' или 3' выступ или в оба. Например, может быть желательно включить пуриновые нуклеотиды в выступы. В некоторых вариантах все или некоторые из оснований в 3' и 5' выступе будут модифицированы, например, с помощью модификации, описанной здесь. Модификации могут включать, например, использование модификаций на 2' ОН группе рибозы сахара, например, использование дезоксирибонуклеотидов, например дезокситимидина вместо рибонуклеотидов, и модификации в фосфатной группе, например, фосфотиоатные модификации. Выступы не должны быть гомологичными с целевой последовательностью.
Специфические модификации обсуждаются более подробно ниже.
Фосфатная группа.
Фосфатная группа является отрицательно заряженной частицей. Заряд распределен равномерно на два немостиковых атома кислорода. Однако фосфатная группа может быть модифицированна заменой одного из атомов кислорода различными заместителями. Одним из результатов этой модификации для фосфатного скелета РНК может быть повышенная устойчивость олигорибонуклеотидов к нуклеолитическому пробою. Таким образом, не углубляясь в теорию, может быть желательным в некоторых вариантах вносить изменения, которые приводят к незаряженному линкеру или заряженному линкеру с ассимметричным распределением заряда.
Примеры модифицированных фосфатных групп включают фосфоротиоат, фосфороселенаты, боранофосфаты, боранофосфатные эфиры, фосфонаты водорода, фосфороамидаты, фосфонаты и фосфотриэфиры алкила или арила. В некоторых вариантах, один из немостиковых атомов фосфата кислорода в фосфатных фрагментах скелета можно заменить на любое из следующих: S, Se, BR3 (R представляет собой водород, алкил, арил), С (т.е. алкильная группа, арильная группа, и т.д.), Н, NR2 (R представляет собой водород, алкил, арил) или OR (R представляет собой алкил или арил). Атом фосфора в немодифицированной фосфатной группе является ахиральным. Тем не менее, замена одного из немостиковых кислородных атомов одним из выше названных атомов или групп атомов превращает атом фосфора в хиральный, другими словами, атом фосфора в фосфатной группе, модифицированный таким образом, является стереогенным центром. Стереогенный атом фосфора может обладать либо R конфигурацией (далее Rp) или S конфигурацией (далее Sp).
Фосфородитиоаты имеют оба немостиковых кислорода, замещенными серой. Фосфорный центр в фосфородитиоатах является ахиральным, что исключает образование диастереомеров олигорибонуклеотидов. Таким образом, не углубляясь в теорию, модификации обоих немостиковых атомов кислорода, которые исключают хиральный центр, например образование фосфородитиоата, могут быть желательным потому, что они не могут производить смеси диастереомеров. Таким образом, немостиковыми атомами кислорода может быть независимо любой из S, Se, В, С, Н, N или OR (R представляет собой алкил или арил).
Фосфатный линкер также может быть изменен путем замены мостикового кислорода (т.е. кислорода, который связывает фосфат с нуклеозидом), азотом (соединенные мостом фосфороамидаты), серой (соединенные мостом фосфоротиоаты) и углеродом (соединенные мостом метиленфосфонаты). Замена может произойти в любом связывающем атоме кислорода или в обоих связывающих атомах кислорода. Когда мостиковый кислород является 3'-кислородом нуклеозида, замещение углеродом является предпочтительным. Когда мостиковый кислород является 5'-кислородом нуклеозида, замещение азотом является предпочтительным.
Замещение фосфатной группы.
Фосфатная группа может быть замещена коннекторами, не содержащими фосфор. Не углубляясь в теорию, считается, что поскольку заряженная фосфодиэфирная группа является реакционным центром в нуклеолитической деградации, замена ее нейтральными структурными имитаторами должна способствовать усилению стабильности нуклеазы. Опять же, не углубляясь в теорию, может быть желательным в некоторых вариантах внести изменения, в которых заряженная фосфатная группа замещена нейтральным фрагментом.
Примеры фрагментов, которые могут заменить фосфатную группу, включают метилфосфонат, гидроксиламино, силоксан, карбонат, карбоксиметил, карбамат, амид, тиоэфир, линкер окиси этилена, сульфонат, сульфонамид, тиоформацетал, формацетал, оксим, метиленимино, метиленметилимино, метиленгидразо, метилендиметилгидразо и метиленоксиметиламино. Предпочтительные замены включают метиленкарбониламино и метиленметиламино группы.
Модифицированные фосфатные связи, где по крайней мере один из атомов кислорода связан с фосфатом был заменен или фосфатная группа была заменена безфосфорной группой, также рассматриваются как не фосфодиэфирная скелетная связь.
- 26 037404
Замещение рибофосфатного скелета.
Имитирующие олигонуклеотид каркасы могут быть сконструированы там, где фосфатный линкер и сахар рибозы заменен нуклеозидом, устойчивым к нуклеазе, или нуклеотидными заместителями. Не углубляясь в теорию, считается, что отсутствие периодически повторяющейся зарядки скелета снижает связывание с белками, которые распознают полианионы (например, нуклеазы). Снова не углубляясь в теорию, может быть желательно в некоторых вариантах внести изменения, в которых базы привязаны к нейтральному суррогатному скелету. Примеры включают мофилино, циклобутил, пирролидин и нуклеозидные заместители пептидо-нуклеиновую кислоту (ПНК). Предпочтительный заместитель это заместитель ПНК.
Модификации сахара.
Модифицированная РНК может включать модификацию всех или некоторых из групп сахара рибонуклеиновой кислоты. Например, 2'-гидроксильные группы (ОН) могут быть изменены или заменены множеством различных окси или дезокси заместителей. Не углубляясь в теорию, ожидается увеличение стабильности, поскольку гидроксил больше не может быть депротонированным, чтобы сформировать ион 2'-алкоксида. 2'-Алкоксид может катализировать деградацию путем внутримолекулярной нуклеофильной атаки на атом фосфора линкера. Опять же, не углубляясь в теорию, может быть желательно для некоторых вариантов вносить изменения, в которых формирование алкоксида в 2' позиции не представляется возможным.
Примеры модификаций окси-2' гидроксильной группы включают алкокси или арилокси (OR, например, R = Н, алкил, циклоалкил, арил, аралкил, гетероарил или сахар); полиэтиленгликоли (ПЭГ), О(CH2CH2O)nCH2CH2OR; заблокированные нуклеиновые кислоты (ЗНК), в которых 2'-гидроксил связан, например, метиленовым мостиком с 4'-углеродом сахара той же рибозы; О-АМИН (АМИН = NH2; алкиламино, диалкиламино, гетероциклил, ариламино, диариламино, гетероариламино или дигетероариламино, этилендиамин, полиамино) и аминоалкокси, О(СН2)п АМИН, (например, АМИН = NH2; алкиламино, диалкиламино, гетероциклил, ариламино, диариламино, гетероариламино или дигетероариламино, этилендиамин, полиамино). Следует отметить, что олигонуклеотиды, содержащие только метоксиэтил-группы (МОЭ), (ОСН2СН2ОСН3, производные ПЭГ), демонстрируют стабильность нуклеазы, сравнимую со стабильностью, модифицированной при помощи надежной фосфоротиоатной модификации.
Дезокси модификации включают водород (т.е. сахара дезоксирибозы, которые имеют особое значение для частей выступа частично двухцепочечной РНК); гало (например, фтор), амино (например, NH2; алкиламино, диалкиламино, гетероциклил, ариламино, диариламино, гетероариламино, дигетероариламино- или аминокислота); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-AMHH (АМИН = NH2; алкиламино, диалкиламино, гетероциклил, ариламино, диариламино, гетероариламино или дигетероариламино), -NHC(O)R (R = алкил, циклоалкил, арил, аралкил, гетероарил или сахара), циано; меркапто; алкил-тио-алкил; тиоалкокси и алкил, циклоалкил, арил, алкенил и алкинил, который может быть необязательно замещен, например, амино-функциональностью. Предпочтительными заместителями являются 2'-метоксиэтил, 2'-ОСН3, 2'-Оаллил, 2'-С-аллил и 2'-фтор.
Группа сахара может также содержать один или несколько атомов углерода, которые обладают противоположной стереохимической конфигурацией по отношению к соответствующему углероду в рибозе. Таким образом, олигонуклеотид может включать нуклеотиды, содержащие, например, арабинозу, в качестве сахара. Мономер может иметь α-связь в позиции 1' сахаров, например α-нуклеозидов. Олигонуклеотиды могут также включать абазические сахара, с отсутствием нуклеотических оснований на С1'. Эти абазические сахара могут еще содержать модификации в одной или нескольких составляющих атомов сахара. Олигонуклеотиды могут также содержать один или более сахаров, которые находятся в Lформе, например L-нуклеозиды.
Терминальные модификации.
3'- и 5'-концы олигонуклеотида могут быть модифицированны. Такие модификации могут находиться в 3'-конце, 5'-конце или обоих концах молекулы. Они могут включать модификацию или замену полного терминального фосфата или одного или больше атомов фосфатной группы. Например, 3'- и 5'концы олигонуклеотида могут быть конъюгированы к другим функциональным молекулярным объектам, таким как меченые фрагменты, например флуорофоры (например, пирен, TAMRA, флуоресцеин, Су3 или Су5 красители) или защитные группы (на основе, например, серы, кремния, бора или эфира). Функциональные молекулярные объекты могут быть присоединены к сахару через фосфатную группу и/или линкер. Терминальный атом линкера может соединять или замещать соединяющий атом фосфатной группы или С-3' или С-5' О, N, S или С группы сахара. Кроме того, линкер может соединять или замещать терминальный атом нуклеотидных заменителей (например, ПНК).
Когда набор линкер/фосфат-функциональный молекулярный объект-линкер/фосфат помещен между двумя нитями дцРНК, этот набор может заменить петлю шпильки РНК в агенте типа шпильки РНК.
Терминальные модификации, пригодные для модулирования активности, включают модификацию на 5'-конце с фосфатом или фосфатными аналогами. Например, в предпочтительных вариантах антисмысловыми нитями дцРНК, являются 5'-фосфорилированные или включающие фосфорильный аналог на 5' начальном крае. 5'-фосфатные модификации включают те, которые совместимы с РИСК
- 27 037404 опосредованным сайленсингом гена. Подходящие модификации включают 5'-монофосфат ((НО)2(О)Р-О5’); 5'-дифосфат ((НО)2(О)Р-О-Р(НО)(О)-О-5’); 5'-трифосфат ((НО)2(О)Р-О-(НО)(О)Р-О-Р(НО)(О)-О-5‘); 5'-гуанозин кэп (7-метилированый или неметилированый) (7m-G-0-5'-(H0)(0)P-0-(Н0)(0)Р-0Р(НО)(О)-О-5'); 5'-аденозин кэп (Аррр), и любая модифицированная или немодифицированная нуклеотидная кэп формула (N-O-5'-(HO)(0)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-О-5'); 5'-монотиофосфат (фосфоротиоат; (HO)2(S)P-O-5‘); 5'-монодитиофосфат (фосфородитиоат; (HO)(HS)(S)P-O-5‘), 5'-фосфоротиолат ((HO)2(O)P-S-5‘); любая дополнительная комбинация кислорода/серы, замещенная монофосфаом, дифосфатом и трифосфатами (e.g. 5'-а-тиотрифосфат, 5'-γ-тиотрифосфат и т.д.), 5'-амидофосфаты ((HO)2(O)PNH-5', (HO)(NH2)(O)P-O-5'), 5'-алкилфосфонаты (R=алкил=метил, этил, изопропил, пропил и т.д., например RP(OH)(O)-O-5'-, (OH)2(O)P-5'-CH2-), 5'-алкилэфирфосфонаты (R=алкилэфир=метоксиметил (МеОСН2-), этоксиметил и т.д., например RP(OH)(O)-O-5'-).
Терминальные модификации также могут быть пригодными для мониторинга распределения, и в таких случаях предпочтительные группы для присоединения включаюют флуорофоры, например флуоресцин или краситель Alexa, например Alexa 488. Терминальные модификации также могут быть пригодными для повышения поглощения, пригодные для этого модификации включают холестерин. Терминальные модификации также могут быть пригодными для сшивки агента РНК с другим фрагментом; пригодные для этого модификации включают митомицин С.
Нуклеиновые основания.
Аденин, гуанин, цитозин и урацил являются наиболее распространенными основаниями, обнаруженными в РНК. Эти основания могут быть модифицированы или заменены, чтобы придать РНК улучшенные свойства. Например, олигорибонуклеотиды, устойчивые к действию нуклеазы, могут быть составлены из этих оснований или из синтетических и природных нуклеиновых оснований (например, инозина, тимина, ксантина, гипоксантина, нубуларина, изогуанизина или туберцидина) и любой из вышеуказанных модификаций. Кроме того, могут быть использованы замещенные или модифицированные аналоги любого из выше названных оснований, например, редкие основания, модифицированные основания, основания неприродного происхождения и универсальные основания, описанные здесь. Примеры включают, без ограничений 2-аминоаденин, 6-метил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 5-галоурацил и цитозин, 5пропинил урацил и цитозин, 6-азоурацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдоурацил), 4-тиоурацил, 5галоурацил, 5-(2-аминопропил) урацил, 5-аминоаллил урацил, 8-гало, амино, тиол, тиоалкил, гидроксил и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-трифторметил и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин, 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2, N-6 и О-6 замещенные пурины, в том числе 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин, дигидроурацил, 3-деаза-5азацитозин, 2-аминопурин, 5-алкилурацил, 7-алкилгуанин, 5-алкилцитозин, 7-деазааденин, N6, N6диметиладенин, 2,6-диаминопурин, 5-аминоаллилурацил, N3-метилурацил, замещенные 1,2,4-триазолы, 2-пиридинон, 5-нитроиндол, 3-нитропиррол, 5-метоксиурацил, урацил-5-оксиуксусная кислота, 5метоксикарбонилметилурацил, 5-метил-2-тиоурацил, 5-метоксикарбонилметил-2-тиоурацил, 5метиламинометил-2-тиоурацил, 3-(3-амино-3-карбоксипропил)урацил, 3-метилцитозин, 5-метилцитозин, N4-ацетилцитозин, 2-тиоцитозин, N6-метиладенин, N6-изопентиладенин, 2-метилтио-N6изопентениладенин, N-метилгуанины или О-алкилированные основания. Кроме того, пурины и пиримидины включают описанные в патенте США № 3687808, описанные в Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, и те, которые раскрыты в работе Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613.
Катионные группы.
Модификации в олигонуклеотидах могут также включать присоединение одной или нескольких катионных групп к сахарам, основанию и/или атому фосфора из фосфата или модифицированному фрагменту фосфатного скелета. Катионная группа может быть присоединена к любому атому на природном, необычном или универсальном основании, способному к замещению. Предпочтительной позицией является та, которая не мешает гибридизации, т.е. не мешает взаимодействиям водородных связей, необходимым для спаривания оснований. Катионная группа может быть присоединена, например, через позицию С2' сахара или аналогичную позицию в циклических или ациклических заместителях сахара. Катионные группы могут включать, например, протонированные аминогруппы, полученные, например, из Оамина (амин = NH2; алкиламино, диалкиламино, гетероциклил, ариламино, диариламино, гетероариламино или дигетероариламино, этилендиамин, полиамино); аминоалкокси, например О(СН2)п амин, (например, амин = NH2; алкиламино, диалкиламино, гетероциклил, ариламино, диариламино, гетероариламино или дигетероариламино, этилендиамин, полиамино); амино (например, NH2; алкиламино, диалкиламино, гетероциклил, ариламино, диариламино, гетероариламино, или дигетероариламино или аминокислота); или NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-амин (амин = NH2 алкиламино, диалкиламино, гетероциклил, ариламино, диариламино, гетероариламино или дигетероариламино).
Размещение в олигонуклеотиде.
Некоторые модификации могут быть предпочтительно включены в олигонуклеотидах в определенном месте, например на внутреннем месторасположении цепочки или по 5’- или З'-концу олигонуклеоти- 28 037404 да. Предпочтительное расположение модификации в олигонуклеотидах может обеспечивать предпочтительные свойства агенту. Например, предпочтительные локализации отдельных модификаций могут обеспечивать оптимальные свойства сайленсинга генов или повышенную устойчивость к эндонуклеазной или экзонуклеазной активности.
Один или несколько нуклеотидов олигонуклеотида могут иметь 2'-5' связь. Один или несколько нуклеотидов олигонуклеотида могут иметь обратные (инвертированные) связи, например 3'-3', 5'-5', 2'-2' или 2'-3' связи.
Двухцепочечный олигонуклеотид может включать по меньшей мере один 5'-уридин-аденин-3' (5'УА-3' динуклеотид), где уридин является 2'-модифицированным нуклеотидом, или терминальный 5'уридин-гуанин-3' (5'-УГ-3') динуклеотид, где 5'-уридин является 2'-модифицированным нуклеотидом, или терминальный 5'-цитидин-аденин-3' (5'-ЦА-3' динуклеотид), где 5'-цитидин является 2'модифицированным нуклеотидом, или терминальный 5'-уридин-уридин-3' (5'-УУ-3') динуклеотид, где 5'уридин является 2'-модифицированным нуклеотидом, или терминальный 5'-цитидин-цитидин-3' (5'-ЦЦ3') динуклеотид, где 5'-цитидин является 2'-модифицированным нуклеотидом, или терминальный 5'цитидин-уридин-3' (5'-ЦУ-3') динуклеотид, где 5'-цитидин является 2'-модифицированным нуклеотидом, или терминальный 5'-уридин-цитидин-3' (5'-УЦ-3') динуклеотид, в котором 5'-уридин является 2'модифицированным нуклеотидом. Двухцепочечные олигонуклеотиды, в том числе с этими модификациями, особенно стабильны против активности эндонуклеазы.
Общий список источников.
Олигорибонуклеотиды и олигорибонуклеозиды, используемые в соответствии с настоящим изобретением, могут быть синтезированы с помощью твердофазного синтеза, см., например, работу Oligonucleotide synthesis, a practical approach, Ed. M. J. Gait, IRL Press, 1984; Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Ed. F. Eckstein, IRL Press, 1991 (см. особенно гл. 1, Современные автоматизированные методы синтеза олигодезоксирибонуклеотидов; гл. 2, Синтез олигорибонуклеотидов, гл. 3, 2'-ОМетилолигорибонуклеотид-S: синтез и использование, гл. 4, Фосфоротиоатные олигонуклеотиды, гл. 5, Синтез олигонуклеотидных фосфородитиоатов, гл. 6, Синтез олиго-2'-дезоксирибонуклеозид метилфосфонатов и гл. 7, Олигодезоксинуклеотиды, содержащие модифицированные основания). Другие особенно пригодные синтетические процедуры, реагенты, блокирующие группы и условия реакции, описанные в работе Martin, P., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Beaucage, S.L. и lyer, R.P., Tetrahedron, 1992, 48, 2223-2311 and Beaucage, S.L. and lyer, R.P., Tetrahedron, 1993, 49, 6123-6194, или ссылках, упомянутых здесь. Модификация, описанная в WO 00/44895, WO 01/75164 или WO 02/44321, может быть использована здесь. Раскрытие всех публикаций, патентов и опубликованных патентных заявок, перечисленных здесь, включено здесь в качестве ссылки.
Список источников, относящихся к фосфатной группе.
Приготовление фосфинатных олигорибонуклеотидов описано в патенте США № 5508270. Приготовление алкилфосфонатных олигорибонуклеотидов описано в патенте США № 4469863. Приготовление фосфорамидитных олигорибонуклеотидов описано в патенте США № 5256775 или патенте США № 5366878. Приготовление фосфотриэфирных олигорибонуклеотидов описано в патенте США № 5023243. Приготовление боранофосфатных олигорибонуклеотидов описано в патенте США №№ 5130302 и 5177198. Приготовление 3'-дезокси-3'-аминофосфорамидатных олигорибонуклеотидов описано в патенте США № 5476925. 3'-Дезокси-3'-метиленфосфонатные олигорибонуклеотиды описаны в работе An, H., et al. J. Org. Chem. 2001, 66, 2789-2801. Приготовление нуклеотидов с серным мостиком описывается в работе Sproat et al. Nucleosides Nucleotides 1988, 7 ,651 и Crosstick et al. Tetrahedron Lett. 1989, 30, 4693.
Список источников, относящихся к группе сахара.
Изменения в 2'-модификациях можно найти в работе Verma, S. et al. Annu. Rev. Biochem. 1998, 67, 99-134 и всех ссылках этой работы. Специфические модификации в рибозе могут быть найдены в следующих источниках: 2'-фторо (Kawasaki et. al., J. Med. Chem., 1993, 36, 831-841), 2'-МОЭ (Martin, P. Helv. Chim. Acta 1996, 79, 1930-1938), LNA (Wengel, J. Acc. Chem. Res. 1999, 32, 301-310).
Список источников, относящихся к замещению фосфатной группы.
Метиленметилиминосвязанные олигорибонуклеозиды, идентифицированные здесь как ММИсвязанные олигорибонуклеозиды, метилендиметилгидразосвязанные олигорибонуклеозиды, идентифицированные здесь как ММГ-связанные олигорибонуклеозиды, и метиленкарбомиламиносвязанные олигорибонуклеозиды, также идентифицированные здесь как амид-3-связанные олигорибонуклеозиды, и метиленаминокарбонилсвязанные олигорибонуклеозиды, также идентифицированные здесь как амид-4связанные олигорибонуклеозиды, также как и смешанные скелетные соединения, имеющие, например, перемежающиеся ММИ РО или PS связи могут быть получены, как это описано в патентах США №№ 5378825, 5386023, 5489677 и в опубликованных заявках по процедуре РСТ PCT/US 92/04294 и PCT/US 92/04305 (опубликованые как WO 92/20822 и WO 92/20823 соответственно). Формацитал и тиоформациталсвязанные олигорибонуклеозиды могут быть получены как это описано в патентах США №№ 5264562 и 5264564. Этиленоксидсвязанные олигорибонуклеозиды могут быть получены, как это описано в патенте США № 5223618. Силоксановые замещения описаны в работе Cormier.J.F. et al. Nucleic Acids
- 29 037404
Res. 1988, 16, 4583. Карбонатные замещения описаны в работе Tittensor, J.R. J. Chem. Soc. С 1971, 1933.
Карбоксиметильные замещения описаны в работе Edge, M.D. et al. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 1972,
1991. Карбаматные замещения описаны в работе Stirchak, E.P. Nucleic Acids Res. 1989, 17, 6129.
Список источников, относящихся к замещению фосфат-рибозного скелета.
Циклобутильные соединения заменителей сахара могут быть получены, как это описано в патенте США № 5359044. Пирролидиновый суррогат сахара может быть получен, как это описано в патенте США № 5519134. Морфолиновые суррогаты сахара могут быть получены, как это описано в патентах США №№ 5142047 и 5235033, а также других соответствующих раскрытиях патента. Пептидонуклеиновые кислоты (ПНК) известны сами по себе и могут быть получены в соответствии с любой из различных процедур, относящихся к пептидонуклеиновым кислотам (ПНК): синтез, свойства и возможности применения, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4, 5-23. Они также могут быть получены в соответствии с патентом США № 5539083.
Список источников, относящихся к терминальной модификации.
Терминальные модификации описаны в работе Manoharan, M. et al. Antisense and Nucleic Acid Drug Development 12, 103-128 (2002) и в ссылках этой работы.
Список источников, относящихся к нуклеотидным основаниям.
N-2-замещенные пуриновые нуклеозидные амидиты могут быть получены, как это описано в патенте США № 5459255. 3-Деазапуриновые нуклеозидные амидиты могут быть получены, как это описано в патенте США № 5457191. 5,6-Замещенные пиримидиновые нуклеозидные амидиты могут быть получены, как это описано в патенте США № 5614617. 5-Пропинилпиримидиновые нуклеозидные амидиты могут быть получены, как это описано в патенте США № 5484908.
Линкеры.
Термин линкер означает органическую частицу, которая связывает две части соединения. Линкеры обычно содержат прямую связь или атом, такой как кислород или сера, элемент, такой как NR1, C(O), C(O)H, SO, SO2, SO2NH, или цепочку атомов, таких как замещенный или незамещенный алкил, замещенный или незамещенный алкенил, замещенный или незамещенный алкинил, арилалкил, арилалкенил, арилалкинил, гетероарилалкил, гетероарилалкенил, гетероарилалкинил, гетероциклилалкил, гетероциклилалкенил, гетероциклилалкинил, арил, гетероарил, гетероциклил, циклоалкил, циклоалкенил, алкиларилалкил, алкиларилалкенил, алкиларилалкинил, алкениларилалкил, алкениларилалкенил, алкениларилалкинил, алкиниларилалкил, алкиниларилалкенил, алкиниларилалкинил, алкилгетероарилалкил, алкилгетероарилалкенил, алкилгетероарилалкинил, алкенилгетероарилалкил, алкенилгетероарилалкенил, алкенилгетероарилалкинил, алкинилгетероарилалкил, алкинилгетероарилалкенил, алкинилгетероарилалкинил, алкилгетероциклилалкил, алкилгетероциклилалкенил, алкилгетероциклилалкинил, алкенилгетероциклилалкил, алкенилгетероциклилалкенил, алкенилгетероциклилалкинил, алкинилгетероциклилалкил, алкинилгетероциклилалкенил, алкинилгетероциклилалкинил, алкиларил, алкениларил, алкиниларил, алкилгетероарил, алкенилгетероарил, алкинилгетероарил, где один или несколько метиленов могут быть прерваны или ограничены О, S, S(O), SO2, N(R1)2, С(О), расщепляемой связывающей группой, замещенным или незамещенным арилом, замещенным или незамещенным гетероарилом, замещенным или незамещенным гетероциклическим соединением; где R1 представляет собой водород, ацил, алифатическое или замещенное алифатические соединения. В одном варианте линкер является -[(P-Q-R)q-X-(P'-Q'R')q']q-T-, где Р, R, T, P', R' и Т являются каждый самостоятельно для каждого проявления отсутствующим, CO, NH, О, S, OC(O), NHC(O), CH2, CH2NH, CH2O; NHCH(Ra)C(O), -C(O)-CH(Ra)-NH-, CH=N-O,
или гетероциклил;
Q и Q' являются каждый самостоятельно для каждого проявления отсутствующим, -(CH2)n-, -C(R1)(R2)(CH2)n-, -(CH2)nC(R1)(R2)-, -(CH2CH2OLCH2CH2-, или -(^CHO^^CHNH-;
X является отсутствующим или расщепляемой связывающей группой;
Ra является Н или боковой цепью аминокислоты;
R1 и R2 являются каждый самостоятельно для каждого проявления Н, СН3, ОН, SH или N(Rn)2;
RN является самостоятельно для каждого проявления Н, метил, этил, пропил, изопропил, бутил или бензил;
q, q' и q каждый самостоятельно для каждого проявления равняются 0-20 и где повторяющийся элемент может быть одинаковым или отличным.
n самостоятельно для каждого проявления равняется 1-20; и m самостоятельно для каждого проявления равняется 0-50.
В одном варианте линкер содержит по меньшей мере одну расщепляемую связывающую группу.
В некоторых вариантах линкер является разветвленным линкером. Точка ветвления разветвленного линкера может быть, по меньшей мере, трехвалентным, но может быть четырехвалентным, пяти- или шестивалентным атомом или группой, представляющей валентности, кратные названным. В некоторых
- 30 037404 вариантах точка ответвления представляет собой -N, -N(Q)-C, -О-С, -S-C, -SS-C, -C(O)N(Q)-C,
-OC(O)N(Q)-C, -N(Q)C(O)-C или -N(Q)C(O)O-С; где Q является самостоятельно для каждого проявления
Н или факультативно замещенным алкилом. В другом варианте точка ветвления является глицеролом или производным глицерола.
Расщепляемые связывающие группы.
Расщепляемая связывающая группа - это та, которая является достаточно стабильной вне клетки, но после вхождения в клетки-мишени расщепляется, чтобы высвободить две части, которые линкер держит вместе. В предпочтительном варианте расщепляемая связывающая группа расщепляется как минимум в 10 раз быстрее или более, предпочтительно по меньшей мере в 100 раз быстрее в клетке-мишени или при первом обусловленном состоянии (которое может, например, быть выбрано, чтобы имитировать или представить внутриклеточную среду), чем в крови субъекта, или при втором обусловленном состоянии (которое может, например, быть выбрано, чтобы имитировать или представить условия, обнаруживаемые в крови или сыворотке). Расщепляемые связывающие группы чувствительны к расщепляющим факторам, например рН, окислительно-восстановительному потенциалу и наличию деградационных молекул. Как правило, расщепляющие факторы более распространены или обнаруживаются на более высоких уровнях или активности внутри клеток, чем в сыворотке или крови. Примеры таких деградационных факторов включают окислительно-восстановительные факторы, которые выбраны для определенных субстратов, или которые не имеют субстратной специфичности, в том числе, например, окислительные или восстановительные ферменты или редуктивные средства, такие как меркаптаны, присутствующие в клетках, которые могут привести к уменьшению редокс расщепляемой связывающей группы путем восстановления; эстеразы; эндосомы или вещества, которые могут создать кислую среду, например, те, которые приводят к уровню рН, равному пяти или меньше; ферменты, которые могут гидролизовать или разлагать кислото-расщепляемую связывающую группу, выступая в качестве обычной кислоты, пептидазы (которые могут быть субстрат-специфичными), и фосфатазы.
Расщепляемая связывающая группа, такая как дисульфидная связь, может быть чувствительной к рН. рН сыворотки крови человека составляет 7,4, в то время как средняя внутриклеточная рН несколько ниже, находится в пределах примерно 7,1-7,3. Эндосомы имеют более кислую рН в диапазоне 5,5-6,0, и лизосомы имеют еще более кислую рН около 5,0. Некоторые линкеры будут иметь расщепляемую связывающую группу, которая расщепляется при предпочтительном значении рН, тем самым высвобождая катионный липид из лиганда внутри клетки или в желаемый отсек клетки.
Линкер может включать расщепляемую связывающую группу, которая расщепляется конкретным ферментом. Тип расщепляемой связывающей группы, встроенной в линкер, может зависеть от клетки, являющейся целевой. Например, таргетинговые (нацеливающие) лиганды печени могут быть соединены с катионными липидами через линкер, который включает эфирную группу. Клетки печени богаты эстеразами, поэтому линкер будет расщеплен в клетках печени более эффективно, чем в типах клеток, которые не являются богатыми эстеразой. Другие типы клеток, богатые эстеразми, включают клетки легких, коркового вещества почек и яичка.
Линкеры, содержащие пептидные связи, могут быть использованы, когда целевые типы клеток богаты пептидазами, как клетки печени и синовиоциты.
В общем, пригодность кандидатуры расщепляемой связывающей группы может быть оценена тестированием способности деградационного агента (или состояния) расщеплять кандидатуру связывающей группы. Также будет желательно проверить кандидатуру расщепляемой связывающей группы и на способность противостоять расщеплению в крови или при контакте с другими нецелевыми тканями. Таким образом, можно определить относительную восприимчивость к расщеплению между первым и вторым обусловленным состоянием, где первое выбрано в качестве ориентировочного для расщепления в клеткемишени, а второе выбрано в качестве ориентировочного для расщепления в других тканях или биологических жидкостях, например, в крови или сыворотке. Оценка может быть осуществлена в бесклеточных системах, в клетках, в клеточной культуре, в культуре органа или ткани или в целом организме животных. Может быть полезно провести начальную оценку в бесклеточных условиях или в культуральных условиях и подтвердить дальнейшими оценками в организме животных. В предпочтительных вариантах пригодные соединения-кандидаты расщеплялись по крайней мере в 2, 4, 10 или 100 раз быстрее в клетке (или in vitro в условиях, подобранных для имитации внутриклеточной среды) по сравнению с кровью или сывороткой (или in vitro в условиях, подобранных для имитации внеклеточной среды).
Редокс-расщепляемые связывающие группы.
Одним классом расщепляемых связывающих групп являются редокс-расщепляемые связывающие группы, которые расщепляются при восстановлении или окислении. Примером восстановительно расщепляемой связывающей группы является дисульфидная связывающая группа (-S-S-). Чтобы определить, является ли кандидатура расщепляемой связывающей группы подходящей восстановительно расщепляемой связывающей группой, или, например, подходящей для использования с определенным иРНК фрагментом и определенным целевым агентом, можно посмотреть на способы, описанные в настоящем документе. Например, кандидат может быть оценен путем инкубации с дитиотреитолом (ДТТ) или другим восстановителем с использованием реагентов, известных в технике, которые имитируют уровень
- 31 037404 расщепления, который будет наблюдаться в клетке, например клетке-мишени. Кандидаты могут также быть оценены в условиях, которые подобраны для имитации условий крови или сыворотки. В предпочтительном варианте соединения-кандидаты расщеплялись не более чем на 10% в крови. В предпочтительных вариантах пригодные соединения-кандидаты расщеплялись по крайней мере в 2, 4, 10 или 100 раз быстрее в клетке (или in vitro в условиях, подобранных для имитации внутриклеточной среды) по сравнению с кровью или сывороткой (или in vitro в условиях, подобранных для имитации внеклеточной среды). Скорость расщепления соединений-кандидатов может быть определена с использованием стандартных кинетических анализов ферментативных реакций в условиях, подобранных для имитации внутриклеточной среды, по сравнению с условиями, подобранными для имитации внеклеточной среды.
Расщепляемые связывающие группы на основе фосфата.
Расщепляемые связывающие группы на основе фосфата расщепляются средствами, которые разлагают или гидролизуют фосфатную группу. Примером средства, которое расщепляет фосфатные группы в клетках, являются ферменты, такие как фосфатазы в клетках. Примерами расщепляемых связывающих групп на основе фосфата являются -O-P(O)(ORk)-О-, -O-P(S)(ORk)-O-, -O-P(S)(SRk)-O-, -S-P(O)(ORk)-O-, -O-P(O)(ORk)-S-, -S-P(O)(ORk)-S-, -O-P(S)(ORk)-S-, -S-P(S)(ORk)-O-, -O-P(O)(Rk)-O-, -O-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-O-, -S-P(S)(Rk)-O-, -S-P(O)(Rk)-S-, -O-P(S)(Rk)-S-. Предпочтительными вариантами являются -О-Р(О)(ОН)-О-, -C-P(S)(OH)-O-, -O-P(S)(SH)-O-, -S-P(O)(OH)-O-, -O-P(O)(OH)-S-, -S-P(O)(OH)-S-, -O-P(S)(OH)-S-, -S-P(S)(OH)-O-, -O-P(O)(H)-O-, -O-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-O-, -S-P(S)(H)-O-, -S-P(O)(H)-S-, -O-P(S)(H)-S-. Предпочтительным вариантом является -О-Р(О)(ОН)-О-. Эти кандидаты могут быть оценены с использованием способов, аналогичных описанным выше.
Кислоторасщепляемые связывающие группы.
Кислоторасщепляемые связывающие группы - это связывающие группы, которые расщепляются в кислой среде. В предпочтительных вариантах кислоторасщепляемые связывающие группы расщепляются в кислой среде с уровнем рН, равным приблизительно 6,5 или ниже (например, около 6,0, 5,5, 5,0 или ниже), или средствами, такими как ферменты, которые могут вести себя как обычная кислота. В клетке особые органеллы с низким уровнем рН, такие как эндосомы и лизосомы, могут обеспечить условия для расщепления кислоторасщепляемых связывающих групп. Примеры кислоторасщепляемых связывающих групп включают, не ограничиваясь, гидразоны, эфиры и эфиры аминокислот. Кислоторасщепляемые связывающие группы могут иметь общую формулу -C=NN-С(О)О или -ОС(О). Предпочтительным вариантом является такой, когда углерод прикреплен к кислороду эфира (алкоксигруппа), арилгруппа, замещенная алкилгруппа или третичная алкилгруппа, такая как диметилпентил или трет-бутил. Эти кандидаты могут быть оценены с использованием способов, аналогичных описанным выше.
Расщепляемые связывающие группы на основе эфира.
Расщепляемые связывающие группы на основе эфира расщепляются в клетках ферментами, такими как эстеразы или амидазы. Примеры расщепляемых связывающих групп на основе эфира включают, не ограничиваясь, эфиры групп алкилена, алкенилена и алкинилена. Расщепляемые связывающие группы на основе эфира имеют общую формулу-С(О)О- или -ОС(О)-. Эти кандидаты могут быть оценены с использованием способов, аналогичных описанным выше.
Расщепляемые связывающие группы на основе пептидов.
Расщепляемые связывающие группы на основе пептидов расщепляются в клетках ферментами, такими как пептидазы и протеазы. Расщепляемые связывающие группы на основе пептидов являются пептидными связями, образованными между аминокислотами, образующими олигопептиды (например, дипептиды, трипептиды и т.д.) и полипептиды. Расщепляемые связывающие группы на основе пептидов не включают амидную группу (-C(O)NH-). Амидная группа может быть сформирована между любым алкиленом, алкениленом или алкинеленом. Пептидная связь является особым видом амидной связи, образованной между аминокислотами для получения пептидов и белков. Расщепляемые связывающие группы на основе пептидов, как правило, ограничиваются пептидной связью (т.е. амидной связью), сформированной между аминокислотами, образующими пептиды и белки, и не включают в себя всю амидную функциональную группу. Расщепляемые связывающие группы на основе пептидов имеют общую формулу NHCHRaC(O)NHCHRbC(O)-, где RA и RB являются R-группами двух смежных аминокислот. Эти кандидаты могут быть оценены с использованием способов, аналогичных описанным выше.
Лиганды.
С олигонуклеотидами и липидами согласно настоящему изобретению может быть связано большое разнообразие объектов. Предпочтительными фрагментами являются лиганды, которые связаны, желательно ковалентно, либо непосредственно, либо косвенно через промежуточный трос.
В предпочтительных вариантах лиганд изменяет распределение, нацеливание или продолжительность жизни молекулы, в которую он встроен. В предпочтительных вариантах лиганд обеспечивает увеличение сродства к выбранной цели, например молекуле, клетке или типу клетки, отделу, например отделу клетки или органа, ткани, органу или области тела, как, например, по сравнению с видами, у которых лиганды отсутствуют. Лиганды, обеспечивающие увеличенное сродство к выбранной цели, еще называют таргетинг (нацеливающими) лигандами.
Некоторые лиганды могут обладать эндосомолитическими свойствами. Эндосомолитические ли
- 32 037404 ганды способствуют лизису эндосомы и/или транспортировке композиции изобретения или его компонентов из эндосомы в цитоплазму клетки. Эндосомолитический лиганд может быть полианионным пептидом или пептидомиметиком, который демонстрирует рН-зависимую мембранную активность и фузогенность. В некоторых вариантах эндосомолитический лиганд обретает свою активную конформацию при эндосомальной рН. Активная конформация - это такая конформация, в которой эндосомолитический лиганд способствует лизису эндосомы и/или транспортировке композиции изобретения или его компонентов из эндосомы в цитоплазму клетки. Типичные эндосомолитические лиганды включают GALA пептид (Subbarao et al., Biochemistry, 1987, 26: 2964-2972), EALA пептид (Vogel et al., J. Am. Chem. Soc, 1996, 118: 1581-1586) и их производные (Turk et al., Biochem. Biophys. Acta, 2002, 1559: 56-68). В некоторых вариантах эндосомолитический компонент может содержать химическую группу (например, аминокислоту), которая в ответ на изменение уровня рН будет проходить замену заряда или протонирование. Эндосомолитический компонент может быть прямолинейным или разветвленным. Типичные первичные последовательности эндосомолитических лигандов на основе пептидов приведены в табл. 4.
Таблица 4
Перечень пептидов с эндосомолитической активностью
Название Последовательность (οτΝ до С) Ссылка.
GALA AALEALAEALEALAEALEALAEAAAAGGC 1
EALA AALAEALAEALAEALAEALAEALAAAAGGC 2
ALEALAEALEALAEA 3
INF-7 GLFEAIEGFIENGWEGMIWDYG 4
Inf НА-2 GLFGAIAGFIENGWEGMIDGWYG 5
dilNF-7 GLF EAI EGFI ENGW EGMI DGWYGC GLF EAI EGFI ENGW EGMI DGWYGC 5
dilNF3 GLF EAI EGFI ENGW EGMI DGGC GLF EAI EGFI ENGW EGMI DGGC 5
GLF GLFGALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAAGGSC 3
GALA-INF3 GLFEAIEGFIENGWEGLAEALAEALEALAAGGSC 3
INF-5 GLF EAI EGFI ENGW EGnl DG К GLF EAI EGFI ENGW EGnl DG 4
n, норлейцин.
Ссылки.
Subbarao etal, Biochemistry, 19В7, 26 2964-2972
Vogeletal.J Am Chem Soc.1996,118 1581-1586
Turk, M J , Reddy, J A et al (2002) Characterization of a novel pH-sensitive peptide that enhances drug release from folate-targeted liposomes at endosomal pHs Brachim Biophys Acta 1559, 56-68
Plank, C Oberhausen В Mechtler, К Koch, C Wagner, E (1994) The influence of endosome-disruptive peptides on gene transfer using synthetic virus-ike gene transfer systems, J Biol Chem 26912918-12924
Mastrobattista, E , Koning, G A et al (2002) Functional characterization of an endosome-disruptive peptide and its application in cytosolic delivery of immunoliposome-entrapped proteins J Biol Chem 277,27135-43
Oberhauser, В , Plank, C et al (1995) Enhancing endosomal exit of nucleic acids using pH-sensitive viral fusion peptides
Deliv Strategies Antisense Oligonucleotide Ther 247-66
Предпочтительные лиганды могут улучшать транспорт, гибридизацию и специфичные свойства, а также могут улучшить устойчивость к нуклеазе, образующихся в результате естественных или модифицированных олигорибонуклеотидов или полимерных молекул, содержащих любую комбинацию мономеров, описанную в данном документе, и/или естественных или модифицированных рибонуклеотидов.
Лиганды обычно могут включать терапевтические модификаторы, например, для повышения поглощения; диагностические соединения или репортер-группы, например, для мониторинга распределения; сшивающие агенты и фрагменты, обеспечивающие нуклеазоустойчивость. Характерные примеры включают липиды, стероиды, витамины, сахара, белки, пептиды, полиамины и имитаторы пептида.
- 33 037404
Лиганды могут включать вещества естественного происхождения, такие как белок (например, человеческий сывороточный альбумин (ЧСА), липопротеин низкой плотности (ЛПНП), липопротеин высокой плотности (ЛПВП) или глобулин); углевод (например, декстран, пуллулан, хитин, хитозан, инулин, циклодекстрин или гиалуроновая кислота) или липид. Лиганд может также быть рекомбинантной или синтетической молекулой, такой как синтетический полимер, например синтетическая полиаминокислота, олигонуклеотид (например, аптамер). Примеры полиаминокислот включают полиамино кислоту - полилизин (ПЛЛ), поли-Ь-аспарагиновую кислоту, поли-Ь-глутаминовую кислоту, сополимер стирола и малеинового ангидрида, сополимер поли-(Ь-лактида-со-гликолида), сополимер дивинилэфира и малеинового ангидрида, сополимер N-(2-гидроксипропил)метакриламида (ГМПА), полиэтиленгликоль (ПЭГ), поливиниловый спирт (ПВС), полиуретан, поли-(2-этилакрилловую кислоту), N-изопропилакриламидные полимеры или полифосфазин. Примеры полиаминов включают полиэтиленимин, полилизин (ПЛЛ), спермин, спермидин, полиамин, псевдопептид-полиамин, полиамин пептидомиметик, дендример полиамин, аргинин, амидин, протамин, катионный липид, катионный порфирин, четвертичную соль полиамина или α-спиральный пептид.
Лиганды могут также включать нацеливающие группы, например агент, нацеливающий на клетку или ткань, например лектин, гликопротеин, липид или белок, например антитело, которое связывается с заданным типом клеток, таким как клетки почек. Нацеливающей группой может быть тиреотропин, меланотропин, лектин, гликопротеин, поверхностный белок А, углеводы муцина, поливалентная лактоза, поливалентная галактоза, N-ацетил-галактозамин, N-ацетил-глюкозамин поливалентная манноза, поливалентная фукоза, гликозилированные полиаминокислоты, поливалентная галактоза, трансферрин, бисфосфонат, полиглутамат, полиаспартат, липид, холестерин, стероид, желчная кислота, фолиевая кислота, витамин В12, биотин, РГД пептид, РГД пептидомиметик или аптамер. В табл. 5 представлены некоторые примеры нацеливающих лигандов и связанных с ними рецепторов.
Таблица 5
Нацеливающие лиганды и связанные с ними рецепторы
Клетки печени Лиганд Рецептор
1) Паренхимальные клетки (ПК) (Гепатоциты! Галактоза АЗГП-Р (азиологликопротеиновый рецептор)
Gal NAc (n-ацетил-галактозамин) АЗПГ-Р Gal NAc Рецептор
Лактоза
Азиалофетуин АЗПГ-р
2) Синусоидальные эндотелиальные клетки (СЭК) Гиалуроновая кислота рецептор гиалуроновой кислоты
Проколлаген проколлагеновый рецептор
Отрицательно заряженные молекулы фагоцитарные рецепторы
Манноза маннозный рецептор
N-ацетил Глюкозамин фагоцитарные рецепторы
Иммуноглобулины Fc Рецептор
ЛПС CD14 Рецептор
Инсулин Рецептор посредник трансцитоза
Трансферрин Рецептор посредник трансцитоза
Альбумины Неспецифический
Сахаро-альбуминовые коньюгаты
Манноза-6-фосфат манноза-бфосфатрецептор
3) Клетки Купфера (КК) Манноза маннозные рецепторы
Фукоза фукозные рецепторы
Альбумины Неспецифический
Маннозо-ал ьбуминовые коньюгаты
Другие примеры лигандов включают красители, интеркалирующие агенты (например, акридины), кросс-линкеры (например, псорален, митомицин С), порфирины (ТРРС4, тексафирин, сапфирин), полициклические ароматические углеводороды (например, феназин, дигидрофеназин), искусственные эндонуклеазы (например, ЭДТА), липофильные молекулы, например холестерин, желчная кислота, адамантан уксусная кислота, 1-пиренмасляная кислота, дигидротестостерон, 1,3-бис-О-(гексадецил)глицерин, группу геранилоксигексила, гексадецилглицерол, борнеол, ментол, 1,3-пропандиол, группу гептадецила, пальмитиновую кислоту, миристиновую кислоту, О3-(олеоил)литохолевую кислоту, О3(олеоил)холеневую кислоту, диметокситритил или феноксазин и пептидные конъюгаты (например, пептид антеннапедии, Тат пептид), алкилирующие агенты, фосфат, амино, меркапто, ПЭГ (например, ПЭГ- 34 037404
40K), МПЭГ, [МПЭГ]2, полиамино, алкил, замещенный алкил, меченые маркеры, ферменты, гаптены (например, биотин), посредники транспорта/поглощения (например, аспирин, витамин Е, фолиевая кислота), синтетические рибонуклеазы (например, имидазол, бисимидазол, гистамин, имидазол кластеры, акридин-имидазол конъюгаты, Eu3 + комплексы тетраазамакроциклов), динитрофенил, HRP, или АР.
Лиганды могут быть белками, например гликопротеинами, или пептидами, например молекулами, имеющими специфическое сродство к колиганду, или антителами, например антителами, которые связываются с заданным типом клеток, таким как раковая клетка, эндотелиальная клетка или костная клетка. Лиганды могут также включать гормоны и гормональные рецепторы. Они могут также включать непептидные разновидности, такие как липиды, лектины, углеводы, витамины, кофакторы, поливалентная лактоза, поливалентная галактоза, N-ацетил-галактозамин, N-ацетил-глюкозамин поливалентной маннозы, поливалентная фукоза или аптамеры. Лиганд может быть, например, липополисахаридом, активатором р38 MAP киназ или активатором NF-кВ.
Лиганд может быть веществом, например лекарственным средством, которое может увеличить поглощение иРНК агента в клетке, например, путем разрушения цитоскелета клетки, например разрушая микротрубочки клетки, микрофиламенты и/или промежуточные филаменты. Лекарственное средство может быть, например, таксоном, винкристином, винбластином, цитохалазином, нокодазолом, джаплакинолидом, латрункулином А, фаллоидином, свинхолидом А, инданосином или миосервином.
Лиганд может увеличить поглощение иРНК агента в клетку путем активации воспалительной реакции, например. Типичные лиганды, которые могут обладать таким действием включают фактор некроза опухоли α (TNFalpha), интерлейкин-1 β- или γ-интерферон.
В одном аспекте лиганд является липидом или молекулой на основе липида. Такой липид или молекула на основе липида преимущественно связывает сывороточный белок, например человеческий сывороточный альбумин (ЧСА). ЧСА-связывающий лиганд допускает распределение конъюгата в тканимишени, например, непочечные ткани-мишени организма. Например, тканью-мишенью может быть печень, включая паренхиматозные клетки печени. Другие молекулы, которые могут связывать ЧСА, также могут быть использованы в качестве лигандов. Например, может быть использован непроксин или аспирин. Липид или лиганд на основе липида может (а) повышать устойчивость к деградации конъюгата, (б) увеличивать нацеливание или транспорт в клетку-мишень или клеточную мембрану и/или (С) может быть использован для регулирования связывания с сывороточным белком, например ЧСА.
Лиганд, основанный на липиде, может быть использован для модуляции, например, для контроля связывания конъюгата к ткани-мишени. Например, липид и лиганд, основанный на липиде, которые связываются с ЧСА сильнее, с меньшей вероятностью будут направлены на почки и, следовательно, менее вероятно, будут выводится из организма. Липид и лиганд, основанный на липиде, которые связываются с ЧСА менее сильно, могут быть использованы для нацеливания конъюгата в почки.
В предпочтительном варианте лиганд, основанный на липиде, связывает ЧСА. Предпочтительно он связывает ЧСА с достаточной афинностью, так что конъюгат будет преимущественно распределен в непочечные ткани. Однако является предпочтительным, чтобы сродство не было настолько сильным, что ЧСП-лиганд связывание могло быть необратимым.
В другом предпочтительном варианте лиганд, основанный на липиде, связывает ЧСА слабо или совсем не связывает, таким образом, что конъюгат будет преимущественно распределен в почки. Другие фрагменты, нацеленные к клеткам почек, могут также использоваться вместо или в дополнение к лиганду, основанному на липиде.
В другом аспекте лиганд является частицей, например витамином, который захватывается клеткоймишенью, например пролиферирующей клеткой. Такие лиганды особенно пригодны для лечения нарушений, которые характеризуются нежелательной пролиферацией клеток, например, злокачественного или доброкачественного типа, например раковых клеток. Типичные витамины включают витамин А, Е и K. Другие примеры витаминов включают витамины группы В, например, фолиевую кислоту, B12, рибофлавин, биотин, пиридоксаль или другие витамины или питательные вещества, захватываемые раковыми клетками. Также включены HAS, липопротеины низкой плотности (ЛПНП) и липопротеины высокой плотности (ЛПВП).
В другом аспекте лиганд является агентом проникновения в клетку, предпочтительно винтовым агентом проникновения в клетку. Предпочтительно агент является амфипатическим. Типичный агент пептид, такой как тат или антеннопедия. Если агент является пептидом, он может быть модифицирован, включая пептидилмиметик, инвертомеры, непептидные или псевдопептидные связи, а также использование D-аминокислот. Винтовой агент является предпочтительно α-спиральным агентом, который имеет предпочтительно липофильную и липофобную фазы.
Лиганд может быть пептидом или пептидомиметиком. Пептидомиметик (также называется здесь олигопептидомиметик) - это молекула, способная складываться в определенную трехмерную структуру, сходную с природным пептидом. Фрагмент пептида или пептидомиметика может быть длиной около 550 аминокислот, например около 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 аминокислот в длину (см. табл. 6, например).
- 35 037404
Таблица 6
Типичные пептиды, проникающие в клетку
проникающие в клетку пептиды Аминокислотная последовательность Ссылка
Пенетратин RQIKIWFQNRRMKWKK Derossi et al., J. Biol. Chem. 269:10444,1994
Тат фрагмент (48-60) GRKKRRQRRRPPQC Vives ef al., J. Biol. Chem., 272:16010,1997
Пептид, основанный на сигнальной последовательно сти GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV Chalom et al., Biochem. Biophys. Res. Common., 243:601, 1998
PVEC LLIILRRRIRKQAHAHSK Elmquist et al., Exp. Cell Res., 269:237, 2001
Транспортам GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL Pooga ef al., FASEB J., 12:67,1998
Амфифильная модель пептида KLALKLALKALKAALKLA Oehlke ef al., Mol. Ther., 2:339,2000
Args RRRRRRRRR Mitchell ef al., J. Pept. Res., 56:318, 2000
Бактериальное проникновение клеточной стенки KFFKFFKFFK
LL-37 LLGDFFRKSKEKIGKEFKRIVQRIKDFLRNL VPRTES
Цекропин Р1 SWLSKTAKKLENSAKKRISEGIAIAIQGGPR
а-дефенсин ACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGRLWAFC С
Ь-дефенсин DHYNCVSSGGQCLYSACPIFTKIQGTCYR GKAKCCK
Бактенецин RKCRIWIRVCR
PR-39 RRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPPRIPPGF PPRFPPRFPGKR-NH2
Индолицидин ILPWKWPWWPWRR-NH2
Пептид или пептидомиметик может быть, например, проникающим в клетку пептидом, катионным пептидом, амфипатическим пептидом или гидрофобным пептидом (например, состоящий в основном из тирозина (Tyr), триптофана (Trp) или фенилаланина (Phe)). Пептидная частица может представлять собой пептид дендример, ограниченный пептид или сшитый пептид. В другом варианте пептидный фрагмент может включать гидрофобную последовательность мембранной транслокации (МТП). Типичный гидрофобный МТП-содержащий пептид - это RFGF, имеющий аминокислотную последовательность AAVALLPAVLLALLAP. Аналог RFGF (например, аминокислотная последовательность AALLPVLLAAP), содержащий гидрофобную МТП, также может быть нацеливающей частицей. Пептидная частица может быть доставочным пептидом, который может переносить через клеточные мембраны большие полярные молекулы, включая пептиды, олигонуклеотиды, и белок. Например, была обнаружена способность к функционированию в качестве доставки пептидов, последовательности ТАТ белка ВИЧ (GRKKRRQRRRPPQ) и белка дрозофилы Антеннапедия (RQIKIWFQNRRMKWKK). Пептид или пептидомиметик могут быть закодированы случайной последовательностью ДНК, такой как пептид, идентифицированный из фаг-дисплей библиотеки или комбинаторной библиотеки одна-бусина-односоединение (ОБОС) (Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991). Предпочтительно, если пептид или пептидомиметик, привязаный к иРНК агенту через встроенный мономерный элемент ячейки, является нацеливающим клеточным пептидом, таким как пептид аргинин-глицин-аспарагиновой кислоты (РГД) или имитирующий РГД. Пептидный фрагмент может варьироваться в длину от 5 аминокислот до приблизительно 40 аминокислот. Пептидные фрагменты могут иметь структурные модификации для повышения стабильности или прямых конформационных свойств. Любая из структурных модификаций, описанных ниже, может быть использована.
Фрагмент РГД пептида может быть использован для опухолевой клетки-мишени, такой как эндотелиальная клетка опухоли или клетка опухоли рака молочной железы (Zitzmann et al., Cancer Res., 62:5139-43, 2002). РГД пептид может способствовать таргетингу иРНК к опухолям ряда других тканей, в том числе легких, почек, селезенки и печени (Aoki et al., Cancer Gene Therapy 8:783-787, 2001). Предпочтительно, когда РГД пептид будет способствовать таргетингу иРНК агента к почкам. РГД пептид может быть линейным или циклическим и может быть модифицированным, например гликозилированным или метилированным, для облегчения нацеливания на специфические ткани. Например, гликозилированный РГД пептид может доставить иРНК агент в опухолевую клетку, экспрессирующую aVe3 (Haubner et al., Jour. Nucl. Med., 42:326-336, 2001).
Могут быть использованы пептиды, целью которых являются маркеры, наделенные пролиферирующими клетками. Например, РГД-содержащие пептиды и пептидомиметики могут выбирать в качест
- 36 037404 ве цели раковые клетки, в частности клетки, которые демонстрируют ανβ3 интегрин. Таким образом, можно использовать РГД пептиды, циклические пептиды, содержащие РГД, РГД пептиды, которые содержат D-аминокислоты, а также и синтетические РГД имитаторы. В дополнение к РГД можно использовать и другие фрагменты, которые нацеливают aVe3 интегрин лиганд. Как правило, такие лиганды могут быть использованы для контроля пролифирирующих клеток и ангиогенеза. Предпочтительные конъюгаты этого типа - лиганды, которые выбирают в качестве цели РЕСАМ-1, VEGF или другой ген рака, например ген рака, описанный в данном документе.
Проникающий в клетку пептид способен проникать в клетку, например микробную клетку, такую как бактериальная или грибковая клетка, или в клетки млекопитающих, такие как клетки человека. Микробным проникающим в клетку пептидом может быть, например, α-спиральный линейный пептид (например, LL-37 или Ceropin P1), пептид, содержащий дисульфидные связи (например, α-дефенсин, βдефенсин или бактенецин), или пептид, содержащий только одну или две доминирующие аминокислоты (например, PR-39 или индолицидин). Проникающий в клетку пептид может также включать сигнал ядерной локализации (NLS). Например, проникающий в клетку пептид может быть двудольным амфипатическим пептидом, таким как MPG, который является производным от слияния пептидного домена ВИЧ-1 др41 и NLS из SV40 большого Т антигена (Simeoni et al., Nucl. Acids Res. 31:2717-2724, 2003).
В одном из вариантов таргетинг пептид привязан к иРНК агенту и/или олигомер-носитель может быть амфипатическим α-спиральным пептидом. Типичные амфипатические α-спиральные пептиды включают, но не ограничиваясь, цекропины, ликотоксины, парадаксины, буфорин, CPF, бомбининподобный пептид (БПН), кателицидины, цератотоксины, S. clava пептиды, кишечные антимикробные пептиды миксины (КАМПм), магаинины, бревинины-2, дермасептины, мелиттины, плевроцидин, Н2А пептиды, пептиды Xenopus, эскулентин-1 и церины. Чтобы сохранить целостность спиральной стабильности, будет желательно учесть ряд факторов. Например, будет использоваться максимальное количество стабилизирующих остатков спирали (например, лейцин, аланин, или лизин), а количество дестабилизирующих остатков спирали будет использовано минимальное (например, пролин, или циклические мономерные единицы). Будут учтены кэп остатки (например могут быть использованы глицин, являющийся типичным N-кэп остатком и/или С-концевое амидирование для обеспечения дополнительной Н-связи для стабилизации спирали). Формирование солевых мостов между остатками с противоположными зарядами, разделенных по i±3, или i±4 позиции, может обеспечить стабильность. Например, катионные остатки, такие как лизин, аргинин, гомо-аргинин, орнитин и гистидин, могут образовывать солевые мосты с анионными остатками глутамата и аспартата.
Пептидные и пептидомиметические лиганды включают те, которые обладают естественными или модифицированными пептидами, например D или L пептиды; α, β, или γ пептиды, N-метил пептиды; азапептиды; пептиды, имеющие один или несколько амидов, т.е. пептид с замененой связей одной или более связями мочевины, тиомочевины, карбамата, или сульфонил мочевины, или циклические пептиды.
Нацеливающим лигандом может быть любой лиганд, способный выбирать в качестве цели специфический рецептор. Примерами являются фолат, GalNAc, галактоза, манноза, манноза-6Р, кластеры сахаров, такие как GalNAc кластер, кластер маннозы, кластер галактозы или апатамер. Кластер представляет собой сочетание двух или более элементов сахара. Таргетинг лиганды также включают лиганды интегрин рецепторов, лиганды хемокиновых рецепторов, трансферрин, биотин, лиганды рецептора серотонина, ПСМА, эндотелин, GCPII, соматостатин, лиганды ЛПНП и ЛПВП. Лиганды могут быть также на основе нуклеиновых кислот, например аптамеров. Аптамер может быть немодифицированным или иметь любую комбинацию модификаций, описанных в данном документе.
Эндосомальные релиз-агенты включают имидазолы, поли или олигоимидазолы, ПЭИ, пептиды, фузогенные пептиды, поликарбоксилаты, поликатионы, замаскированные олиго- или поликатионы или анионы, ацетали, полиацетали, кетали/поликетали, ортоэфиры, полимеры с замаскированными или незамаскированными катионными или анионными зарядами, дендримеры с замаскированными или незамаскированными катионными или анионными зарядами.
ФК модулятор означает фармакокинетический модулятор. ФК модулятор включает липофилы, желчную кислоту, стероиды, аналоги фосфолипидов, пептиды, вещества, связывающиеся с белками, ПЭГ, витамины и др. Типичный ФК модулятор включает, но не ограничиваясь, холестерин, жирные кислоты, желчную кислоту, литохолевую кислоту, диалкилглицериды, диацилглицериды, фосфолипиды, сфинголипиды, напроксен, ибупрофен, витамин Е, биотин и др. Олигонуклеотиды, которые включают множество фосфоротиоатных связей, которые, как известно, связываются с белком сыворотки, являются короткими олигонуклеотидами, например олигонуклеотиды, состоящие из около 5 баз, 10 баз, 15 баз или 20 баз, включающими множество из фосфоротиоатных связей в скелете, также подлежат настоящему изобретению в качестве лигандов (например, ФК модулирующие лиганды).
Кроме того, аптамеры, которые связывают компоненты сыворотки (например, белки сыворотки) также подлежат настоящему изобретению в качестве ФК-модулирующих лигандов.
Другие лиганды, подлежащие изобретению, описаны в находящихся одновременно на рассмотрении заявках USSN 10/916185, поданной 10 августа 2004 г.; USSN 10/946873, поданной 21 сентября 2004 г.;
- 37 037404
USSN 10/833934, поданной 3 августа 2007 г.; USSN 11/115989, поданной 27 апреля 2005 г и USSN
11/944227, поданной 21 ноября 2007 г, которые включены в качестве ссылки во всей их полноте для всех предназначений.
Если имеются в наличии два или более лигандов, все лиганды могут иметь одинаковые свойства, все могут иметь различные свойства или некоторые лиганды имеют одинаковые свойства, а другие обладают различными свойствами. Например, лиганд может иметь таргетинг свойства, иметь эндосомолитическую активность или ФК-модулирующие свойства. В предпочтительном варианте все лиганды обладают различными свойствами.
Лиганды могут быть спарены с олигонуклеотидами в различных местах, например на 3'-конце, 5'конце и/или на внутренней позиции. В предпочтительных вариантах лиганд присоединяется к олигонуклеотидам через промежуточные троса. Лиганд или привязанный лиганд могут присутствовать на мономере, когда упомянутый мономер встроен в растущую цепь. В некоторых вариантах лиганд может быть встроен через соединение с предшественником (прекурсором) мономера после того, как названный предшественник мономера был встроен в растущую цепь. Например, мономер, имеющий аминоограниченный трос (т.е. не имеющий связанных лигандов), например TAP-(CH2)nNH2, может быть встроен в растущую смысловую или антисмысловую цепь. В последующей операции, т.е. после встраивания предшественника мономера в цепь, лиганд, имеющий электрофильную группу, например пентафторфенильный эфир, или альдегидную группу, впоследствии может быть присоединен к предшественнику мономера через связывание электрофильной группы лиганда с терминальной нуклеофильной группой троса предшественника мономера.
Для двухцепочечных олигонуклеотидов лиганды могут быть прикреплены к одной или обеим цепям. В некоторых вариантах двухцепочечный иРНК агент содержит лиганд, соединенный со смысловой цепью. В других вариантах двухцепочечный иРНК агент содержит лиганд, соединенный с антисмысловой цепью.
В некоторых вариантах лиганд может быть присоединен к нуклеиновым основаниям, фрагментам сахара или межнуклеозидным связям молекул нуклеиновых кислот. Соединение с пуриновыми нуклеиновыми основаниями или их производными может произойти в любой позиции, включая эндоциклический и экзоциклический атомы. В некоторых вариантах позиции 2-, 6-, 7- или 8-пуриновых нуклеиновых оснований присоединены к конъюгированному фрагменту. Соединение с пиримидиновыми нуклеиновыми основаниями или их производными также может произойти в любой позиции. В некоторых вариантах позиции 2-, 5- и 6-пиримидиновых нуклеиновых оснований могут быть замещены конъюгированным фрагментом. Соединение с фрагментами сахара нуклеозидов может произойти в любом атоме углерода. Пример атомов углерода фрагмента сахара, которые могут быть присоединены к конъюгированным фрагментам, включает 2', 3' и 5' атомы углерода. 1' позиция может быть также присоединена к конъюгированному фрагменту, такому как абазический остаток. Межнуклеозидные связи могут также переносить конъюгированные фрагменты. Для фосфорсодержащих связей (например, фосфодиэфирных, фосфоротиоатных, фосфородитиоатных, фосфороамидатных и т.п.), конъюгированный фрагмент может быть прикреплен непосредственно к атому фосфора или к О, N, S атомной связи с атомом фосфора. Для амин- или амидсодержащих межнуклеотидных связей (например, PNA), конъюгированный фрагмент может быть присоединен к атому азота амина или амида или к соседним атомам углерода.
Есть множество способов для получения конъюгатов олигомерных соединений. Как правило, олигомерное соединение крепится к конъюгированному фрагменту, посредством контакта реактивной группы (например, ОН, SH, амина, карбоксила, альдегида и им подобных) на олигомерном соединении с реактивной группой на конъюгированном фрагменте. В некоторых вариантах одна реактивная группа является электрофильной, а другая является нуклеофильной.
Например, электрофильная группа может быть карбонилсодержащей по функциональности и нуклеофильная группа может быть аминовой или тиоловой. Способы конъюгации нуклеиновых кислот и связанных с ними олигомерных соединений со связывающими группами и без связывающих групп, хорошо описаны в литературе, как, например, в работе Manoharan in Antisense Research and Applications, Crooke and LeBleu, eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1993, Chapter 17, которая включена здесь в качестве ссылки полностью.
Репрезентативные патенты Соединенных Штатов, которые обучают приготовлению олигонуклеотидных конъюгатов, включают, но не ограничиваясь, патенты США №№ 4828979; 4948882; 5218105; 5525465; 5541313; 5545730; 5552538; 5578717, 5580731; 5580731; 5591584; 5109124; 5118802; 5138045;
5414077; 5486603; 5512439; 5578718; 5608046; 4587044; 4605735; 4667025; 4762779; 4789737; 4824941;
4835263; 4876335; 4904582; 4958013; 5082830; 5112963; 5214136; 5082830; 5112963; 5149782; 5214136;
5245022; 5254469; 5258506; 5262536; 5272250; 5292873; 5317098; 5371241, 5391723, 5416203, 5451463,
5510475; 5512667; 5514785; 5565552; 5567810; 5574142; 5585481; 5587371; 5595726; 5597696; 5599923;
5599928; 5672662; 5688941; 5714166; 6153737; 6172208; 6300319; 6335434; 6335437; 6395437; 6444806;
6486308; 6525031; 6528631; 6559279, каждый из которых приведен здесь в качестве ссылки.
Характеристика частиц нуклеиновая кислота-липид.
В некоторых вариантах настоящее изобретение относится к способам и композициям для производ- 38 037404 ства липид-инкапсулированных частиц нуклеиновой кислоты, в которых нуклеиновые кислоты заключены в липидный слой. Такие частицы нуклеиновая кислота-липид, включающие миРНК олигонуклеотиды, характеризуются использованием различных биофизических параметров, в том числе (1) сотношение лекарственного средства к липиду; (2) эффективность инкапсуляции и (3) размер частицы. Высокое соотношение лекарственного средства к липиду, высокая эффективность инкапсуляции, хорошая устойчивость к нуклеазе и стабильность в сыворотке крови и контролируемый размер частиц, как правило, менее 200 нм в диаметре, являются желательными. Кроме того, характер полимера нуклеиновых кислот имеет значение, так как модификация нуклеиновых кислот в попытке придать устойчивость к нуклеазе, добавляет стоимость терапии, в то время как во многих случаях обеспечивает лишь ограниченную устойчивость. Если не указано иное, эти критерии рассчитываются в этой спецификации следующим образом.
Сотношение лекарственного средства к липиду - это количество нуклеиновой кислоты в определенном объеме препарата, разделенное на количество липидов в том же объеме. Этот параметр может быть на основе моль к молю, или на основе масса к массе, или на основе масса к молю. Для окончательного, готового к введению состава соотношение нуклеиновая кислота:липид рассчитывается после диализа, хроматографии и/или ферментного (например, нуклеазного) расщепления, использованных для удаления наиболее возможного количества внешних нуклеиновых кислот.
Эффективность инкапсуляции означает сотношение лекарственного средства к липиду в исходной смеси, разделенное на сотношение лекарственного средства к липиду в конечном препарате, отвечающем требованиям для введения. Это измерение относительной эффективности. Для измерения абсолютной эффективности общее количество нуклеиновой кислоты, добавленной в исходную смесь, которое остается в конечном препарате, отвечающем требованиям для введения, также может быть вычислено. Количество липидов, утраченных во время процесса производства, также может быть рассчитано. Эффективность является мерой утрат и затрат на препарат.
Размер указывает на размер (диаметр) образующихся частиц. Размер распределения может быть определен с помощью квазиупругого рассеяния света (QELS) на сайзере субмикронных частиц Nicomp Model 370. Частицы менее 200 нм являются предпочтительными для распределения в неоваскуляризированных (протекающих) тканях, таких как новообразования и места воспаления.
Фармацевтические композиции.
Липидные частицы согласно настоящему изобретению особенно в сочетании с терапевтическим средством могут быть представлены в виде фармацевтической композиции, например, той, что дополнительно содержит фармацевтически приемлемый растворитель, наполнитель или транспортное средство, например физиологический раствор или фосфатный буфер, выбранные в соответствии со способом введения и стандартной фармацевтической практикой.
В отдельных вариантах фармацевтические композиции, содержащие частицы липид-нуклеиновая кислота данного изобретения, изготовлены в соответствии со стандартными технологиями и сверх того включают фармацевтически приемлемый носитель. В большинстве случаев в качестве фармацевтически приемлемого носителя будет использоваться физиологический раствор. Другие подходящие носители включают, например, воду, буферизованную воду, 0,9% физиологический раствор, 0,3% раствор глицина и подобные, содержащие гликопротеины для повышения стабильности, такие как альбумин, липопротеин, глобулин и т.д. В композициях, содержащих физиологический раствор или другие солесодержащие носители, носитель желательно добавлять после формирования липидных частиц. Таким образом, после того как композиции липид-нуклеиновая кислота изготовлены, композиции могут быть разбавлены фармацевтически приемлемыми носителями, такими как физиологический раствор.
Полученные в результате фармацевтические препараты могут быть стерилизованы обычными, хорошо известными способами стерилизации. Водные растворы могут быть упакованы для использования или профильтрованы в асептических условиях и лиофилизированы, лиофилизированный препарат должен быть соединен со стерильным водным раствором перед введением. Композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для соответствия физиологическим условиям, такие как регулирующие рН и буферизирующие средства, регулирующие концентрацию (тоничность) вещества, как, например, ацетат натрия, лактат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция и т.д. Кроме того, липидная суспензия может включать липидозащитные вещества, которые защищают липиды от свободных радикалов и липидно-перекисного повреждения при хранении. Липофильные гасители свободных радикалов, такие как α-токоферол и водорастворимые железоспецифичные сорбенты, такие как ферриоксамин, являются подходящими.
Концентрация частиц липидов или частиц липид-нуклеиновая кислота в фармацевтических препаратах может широко варьировать, т.е. приблизительно от менее чем 0,01%, обычно на уровне или как минимум от около 0,05-5 до 10-30 мас.% и выбирается в первую очередь в зависимости от объема жидкости, вязкости и т.д., в соответствии с конкретным выбранным видом введения. Например, концентрация может быть увеличена, чтобы снизить нагрузку жидкости, связанную с лечением. Это может быть особенно желательно у пациентов с застойной сердечной недостаточностью, связанной с атеросклерозом или у пациентов с тяжелой гипертензией. Кроме того, комплексы, состоящие из раздражающих липидов могут быть разведены до низких концентраций, чтобы уменьшить воспаление в месте введения. В одной
- 39 037404 группе вариантов, нуклеиновая кислота будет иметь присоединенный ярлык и будет использоваться для диагностики (путем индикации наличия комплементарной нуклеиновой кислоты). В этом случае количество введенных комплексов будет зависеть от используемого конкретного ярлыка, состояния заболевания, которое диагностируется, и решения врача, но обычно будет составлять от примерно 0,01 мг до примерно 50 мг на 1 кг массы тела, предпочтительно от 0,1 до около 5 мг/кг массы тела.
Как отмечалось выше, частицы липид-терапевтический агент (например, нуклеиновая кислота) согласно изобретению может включать полиэтиленгликоль (ПЭГ)-модифицированные фосфолипиды, ПЭГ церамиды или ганглиозид GM1-модифицированные липиды или другие липиды, эффективные для предотвращения или ограничения агрегации. Добавление таких компонентов не только предотвращает агрегацию состава. Скорее это может также обеспечить возможность для увеличения продолжительности жизни циркуляции и для увеличения доставки композиций липид-нуклеиновая кислота к тканяммишеням.
Настоящее изобретение также предусматривает композиции липид-терапевтическое вещество в виде комплекта. Комплект, как правило, состоит из контейнера, разделенного на отсеки для хранения различных элементов комплекта. Комплект будет содержать частицы или фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению предпочтительно в обезвоженной или концентрированной формах, с инструкциями по их регидратации или разбавлению и введению. В некоторых вариантах частицы содержат активные вещества, в то время как в других вариантах они не содержат активных веществ.
Способы изготовления.
Способы и композиции изобретения используют определенные катионные липиды, синтез, изготовление и характеристика которых описывается ниже и в сопровождающих примерах. Кроме того, настоящее изобретение предлагает способы получения липидных частиц, в том числе связанных с терапевтическим средством, например нуклеиновой кислотой. В способах, описанных в данном документе, смеси липидов объединены с буферным водным раствором нуклеиновой кислоты для получения промежуточной смеси, содержащей нуклеиновую кислоту, инкапсулированную в липидные частицы, где инкапсулированные нуклеиновые кислоты присутствуют в частицах нуклеиновая кислота/липид в соотношении примерно от 3 до 25 мас.%, предпочтительно от 5 до 15 мас.%. По желанию, промежуточной смеси может быть обеспечен размер для получения частиц липид-инкапсулированной нуклеиновой кислоты, в которых липидные части представляют собой однослойные везикулы предпочтительно с диаметром от 30 до 150 нм, более предпочтительно от 40 до 90 нм. Затем уровень рН повышают, чтобы нейтрализовать по крайней мере часть поверхностных зарядов на частицах липид-нуклеиновая кислота, обеспечивая тем самым хотя бы частично поверхностно-нейтрализованные композиции липид-инкапсулированная нуклеиновая кислота.
Как описано выше, некоторые из этих катионных липидов являются аминолипидами, которые заряжены при рН ниже рКа аминогруппы и, по существу, нейтральны при уровне рН выше рКа. Эти катионные липиды называются титруемые катионные липиды, и они могут быть использованы в технологии приготовления лекарственого средства согласно изобретению, используя два этапа. Во-первых, липидные пузырьки могут быть сформированы при более низком уровне рН с титруемыми катионными липидами и другими компонентами везикул в присутствии нуклеиновых кислот. Таким образом, пузырьки будут инкапсулировать и удерживать нуклеиновые кислоты. Во-вторых, поверхностный заряд вновь образованных пузырьков может быть нейтрализован путем увеличения уровня рН среды до уровня выше рКа присутствующих титруемых катионных липидов, т.е. до физиологического уровня рН или выше. Особенно благоприятные аспекты этого процесса включают в себя как легкодостижимое удаление любой поверхностно адсорбированной нуклеиновой кислоты, так и получение в результате транспортного средства для доставки нуклеиновой кислоты, которое имеет нейтральную поверхность. Ожидается, что липосомные или липидные частицы, имеющие нейтральную поверхность, позволят избежать быстрого клиренса из циркуляции и позволят избежать определенной токсичности, которая связана с катионными липосомными препаратами. Дополнительные подробности относительно использования таких титруемых катионных липидов в изготовлении частиц нуклеиновая кислота-липид раскрыты в патенте США № 6287591 и патенте CLUA № 6858225, включенных здесь в качестве ссылки.
Далее отмечено, что везикулы, произведенные таким образом, обеспечивают изготовление везикул одинакового размера с высоким содержанием нуклеиновых кислот. Кроме того, везикулы имеют размер в диапазоне от 30 до 150 нм, преимущественно примерно от 30 до 90 нм.
Не углубляясь в детали теории, считается, что очень высокая эффективность инкапсуляции нуклеиновой кислоты является результатом электростатического взаимодействия при низких значениях рН. При кислых уровнях рН (например, рН 4,0) поверхность везикул заряжена и связывает часть нуклеиновых кислот через электростатическое взаимодействие. Когда внешний кислый буфер изменяется на более нейтральный буфер (например, рН 7,5), поверхность липидной частицы или липосомы нейтрализуется, что позволяет удалить любую поверхностную нуклеиновую кислоту. Более подробная информация о процессе изготовления приводится в различных публикациях (например, патент США № 6287591 и патент США № 6858225).
С учетом вышеизложенного согласно настоящему изобретению обеспечены способы изготовления
- 40 037404 композиций липид/нуклеиновая кислота. В способах, описанных в данном документе, смесь липидов объединена с буферным водным раствором нуклеиновой кислоты для получения промежуточной смеси, содержащей нуклеиновую кислоту, инкапсулированную в липидные частицы, где инкапсулированные нуклеиновые кислоты присутствуют в частицах нуклеиновая кислота/липид в соотношении примерно от 10 до приблизительно 20 мас.%. Промежуточной смеси может быть по желанию обеспечен размер для получения частиц липид-инкапсулированной нуклеиновой кислоты, в которых липидные части представляют собой однослойные везикулы предпочтительно с диаметром от 30 до 150 нм, более предпочтительно от 40 до 90 нм. Затем уровень рН повышают, чтобы нейтрализовать по крайней мере часть поверхностных зарядов на частицах липид-нуклеиновая кислота, обеспечивая тем самым хотя бы частично поверхностно-нейтрализованные композиции липид-инкапсулированная нуклеиновая кислота.
В некоторых вариантах смесь липидов включает в себя по крайней мере два липидных компонента: первый липидный компонент согласно настоящему изобретению, который выбран из липидов, которые имеют уровень рКа, при котором липид является катионным при уровне рН ниже рКа и нейтральным при уровне рН выше рКа, и второй липидный компонент, который выбран из числа липидов, предупреждающих агрегацию частиц на протяжении времени образования частиц липид-нуклеиновая кислота. В отдельных вариантах аминолипид является новым катионным липидом согласно настоящему изобретению.
При подготовке частиц нуклеиновая кислота-липид данного изобретения, смесь липидов, как правило, является раствором липидов в органическом растворителе. Эта смесь липидов может быть затем высушена с образованием тонкой пленки или лиофилизированна с образованием порошка перед тем, как она будет гидратирована с водным буфером для формирования липосом. Кроме того, в предпочтительном способе липидная смесь может быть растворена в воде, смешанной с алкоголем, таким как этанол, и этот раствор этанола добавляется в водный буфер, что приводит к спонтанному образованию липосом. В большинстве вариантов спирт используется в том виде, в котором он доступен в продаже. Например, этанол может использоваться в виде абсолютного этанола (100%) или как 95% этанол, остальное составляет вода. Этот способ более подробно описан в патенте США № 5976567.
В одном типичном варианте смесь липидов представляет собой смесь катионных липидов, нейтральных липидов (кроме катионных липидов), стерола (например, холестерина) и ПЭГмодифицированного липида (например, ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-ДМА) в спиртовом растворителе. В предпочтительных вариантах смесь липидов состоит главным образом из катионного липида, нейтрального липида, холестерина и ПЭГ-модифицированного липида в спирте, более предпочтительно в этаноле. В следующих предпочтительных вариантах первый раствор состоит из вышеупомянутой смеси липидов в молярном соотношении примерно 20-70% катионный липид:5-45% нейтральный липид:20-55% холестерин: 0,5-15% ПЭГ модифицированный липид. В еще более предпочтительных вариантах первый раствор состоит в основном из липидов, выбранных из табл. 1, ДСФХ, холестерина и ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-ДМА, более предпочтительно в молярном соотношении примерно 20-60% катионный липид:5-25% ДСФХ:2555% холестерин:0,5-15% ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-ДМА. В отдельных вариантах молярное липидное соотношение составляет примерно 40/10/40/10 (моль.% катионный липид/ДСФХ/холестерин/ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-ДМА), 35/15/40/10 (моль.% катионный липид/ДСФХ/холестерин/ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-ДМА) или 52/13/30/5 (моль.% катионный липид/ДСФХ/холестерин/ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-ДМА). В другой группе предпочтительных вариантов нейтральный липид в этих композициях замещается на ПОФХ, ДПФХ, ДОФЭ или СМ.
В соответствии с изобретением липидная смесь объединена с буферным водным раствором, который может содержать нуклеиновые кислоты. Буферный водный раствор, как правило, является раствором, в котором буфер имеет уровень рН менее рКа протонируемого липида в липидной смеси. Примеры подходящих буферов включают цитрат, фосфат, ацетат и МЭС. Особенно предпочтительным буфером является цитратный буфер. Предпочтительные буферы будут находиться в диапазоне 1-1000 мМ аниона в зависимости от химических свойств инкапсулированых нуклеиновых кислот, и для достижения высокого уровня загрузки может понадобиться существенная оптимизация концентрации буфера (см., например, патент США № 6287591 и патент США № 6858225). Кроме того, может быть пригодна чистая вода, подкисленная хлоридом, сульфатом или подобными веществами до уровня рН 5-6. В этом случае можно применить добавление 5% раствора глюкозы или другого неионного раствора, который будет сохранять равновесие осмотического потенциала по ту сторону мембраны частицы, когда частицы подвергнутся диализу для удаления этанола, повышению рН или будут смешаны с фармацевтически приемлемым носителем, таким как физиологический раствор. Количество нуклеиновой кислоты в буфере может варьироваться, но, как правило, будет примерно на уровне от 0,01 до 200 мг/мл, более предпочтительно от примерно 0,5 до 50 мг/мл.
Смесь липидов и буферный водный раствор терапевтических нуклеиновых кислот объединяют, чтобы получить промежуточную смесь. Промежуточная смесь, как правило, представляет собой смесь липидных частиц, обладающих инкапсулированными нуклеиновыми кислотами. Кроме того, промежуточная смесь может также содержать какую-то часть нуклеиновых кислот, которые присоединены к поверхности липидных частиц (липосом или липидных везикул) в связи с ионным притяжением отрицательно заряженных нуклеиновых кислот и положительно заряженных липидов на поверхности липидной
- 41 037404 частицы (амино липиды или другие липиды, входящие в состав протонируемого первого липидного компонента заряжены положительно в буфере с уровнем рН меньше рКа протонируемой группы на липиде). В одной группе предпочтительных вариантов смесь липидов является спиртовым раствором липидов, и объем каждого из растворов регулируется таким образом, что при сочетании полученное в результате содержание алкоголя составляет примерно от 20 до 45 об.%. Способ объединения смесей может включать любой из множества процессов, часто зависящий от масштабов производства состава. Например, если общий объем составляет около 10-20 мл или менее, растворы могут быть соединены в пробирке и перемешаны с использованием вихревого смесителя. Масштабные процессы могут осуществляться в соответствующей стеклянной измерительной емкости для серийного производства.
При желании комплексы липид-инкапсулированное терапевтическое вещество (например, нуклеиновая кислота), которые производятся путем объединения смеси липидов и буферного водного раствора терапевтических веществ (нуклеиновых кислот), могут быть откалиброваны для достижения желаемого диапазона размеров и относительно узкого распределения размеров липидных частиц. Предпочтительно, если композиции, предусмотренные в данном документе, будут откалиброваны по размеру до среднего диаметра от 70 до 200 нм, более предпочтительно от 90 до около 130 нм. Доступны несколько способов для калибровки липосом до нужного размера. Один способ калибровки описан в патенте США № 4737323, включенном здесь в качестве ссылки. Ультразвуковое разрушение липосомной суспензии с помощью обработки ультразвуком в ванной или с помощью зонда служит причиной постепенного сокращения размеров вплоть до мелких однослойных везикул (SUV), по размеру меньше, чем около 0,05 мкм. Гомогенизация - это другой способ, который опирается на гидродинамическое фрагментирование энергии фрагмента больших липосом на более мелкие. При типичной процедуре гомогенизации, многослойные везикулы рециркулируют через стандартный гомогенизатор эмульсии до того времени, как регистрируется липосома заданного размера, как правило, от 0,1 до 0,5 мкм. В обоих способах распределение частиц по размерам можно контролировать с помощью обычного определения размера частиц лазерным пучком. Для некоторых способов в настоящем документе для получения одинакового размера везикул используется экструзия.
Экструзия липосомных композиций через поликарбонатную мембрану с малыми порами или асимметричную керамическую мембрану приводит к относительно хорошо определенному размеру распределения. Как правило, суспензия циркулирует через мембраны один или несколько раз до достижения желаемого размера распределения липосомного комплекса. Липосомы могут быть экструдированы через последовательные мембраны с уменьшением пор, для достижения постепенного сокращения размера липосом. В некоторых случаях образующиеся композиции липид-нуклеиновая кислота могут быть использованы без калибровки.
В отдельных вариантах способы настоящего изобретения дополнительно содержат шаг нейтрализации, по крайней мере, некоторых поверхностных зарядов на липидной части композиций липиднуклеиновая кислота. Посредством, по крайней мере, частичной нейтрализации поверхностных зарядов неинкапсулированная нуклеиновая кислота освобождается от поверхности липидной частицы и может быть удалена из композиции при использовании обычных способов. Предпочтительно удалять неинкапсулированные и поверхностно адсорбированные нуклеиновые кислоты из полученной композиции путем обмена буферных растворов. Например, замена цитратного буфера (рН около 4,0, используемого для формирования композиции) на HEPES-солевой буферный раствор (HBS рН около 7,5) приводит к нейтрализации поверхности липосом и высвобождению нуклеиновых кислот с поверхности. Освобожденные нуклеиновые кислоты могут быть удалены с помощью хроматографии с использованием стандартных способов, а затем переведены в буфер с рН выше рКа использованных липидов.
По выбору липидные везикулы (т.е. липидные частицы) могут быть сформированы путем гидратации в водном буфере и откалиброваны с помощью любого из способов, описанных выше, до добавления нуклеиновой кислоты. Как описано выше, уровень рН водного буфера должен быть ниже рКа аминолипидов. Затем к этим откалиброваным, предварительно сформированным везикулам может быть добавлен раствор нуклеиновых кислот. Чтобы сделать возможной инкапсуляцию нуклеиновых кислот в такие предварительно сформированные везикулы, смесь должна содержать алкоголь, такой как этанол. Что касается этанола, он должен присутствовать в концентрации от около 20 до примерно 45 мас.%. Кроме того, может быть необходимо нагреть смесь предварительно сформированных пузырьков и нуклеиновых кислот в смеси водного буфера и этанола до температуры от около 25 до 50°С в зависимости от состава липидных везикул и характера нуклеиновой кислоты. Для специалиста в данной области техники будет очевидным, что оптимизация процесса инкапсуляции для достижения желаемого уровня нуклеиновых кислот в липидных везикулах потребует манипулирования переменными, такими как концентрация этанола и температура. Примеры подходящих условий для инкапсуляции нуклеиновых кислот приводится в примерах. Как только нуклеиновые кислоты инкапсулированы в предварительно сформированные везикулы, уровень внешней рН может быть увеличен, чтобы, по крайней мере частично, нейтрализовть поверхностный заряд. Неинкапсулированные и поверхностно адсорбированных нуклеиновые кислоты могут быть удалены, как описано выше.
- 42 037404
Способы применения.
Липидные частицы согласно настоящему изобретению могут быть использованы для доставки терапевтических средств в клетку, in vitro или in vivo. В отдельных вариантах терапевтическим средством является нуклеиновая кислота, которая доставляется в клетку с помощью частиц нуклеиновая кислоталипид согласно настоящему изобретению. Хотя следующее описание различных способов использования липидных частиц и связанных с ними фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению проиллюстрировано описанием, связанным с частицами нуклеиновая кислота-липид, понятно, что эти способы и композиции могут быть легко адаптированы для доставки любого терапевтического средства для лечения любого заболевания или нарушения, которые извлекают пользу от такого лечения.
В некоторых вариантах настоящее изобретение относится к способам введения нуклеиновых кислот в клетку. Предпочтительными нуклеиновыми кислотами для введения в клетку являются миРНК, иммунностимулирующие олигонуклеотиды, плазмиды, антисмысловые и рибозимы. Эти способы могут быть проведены посредством контактирования частиц или композиций согласно настоящему изобретению с клетками в течение периода времени, достаточного для того, чтобы произошла внутриклеточная доставка.
Композиции согласно настоящему изобретению могут адсорбироваться практически любым типом клеток. После адсорбирования частицы нуклеиновая кислота-липид могут быть эндоцитированы частью клеток, обменяться липидами с клеточными мембранами или слиться с клетками. Перемещение или инкорпорация нуклеиновокислотной части комплекса может осуществляться любым из этих путей. Не желая быть ограничеными, признавая масштаб изобретения, считается, что в случае захвата частиц в клетку путем эндоцитоза, частицы затем взаимодействуют с эндосомальной мембраной, что приводит к дестабилизации эндосомальной мембраны, возможно, посредством формирования недвухслойных фаз, результатом чего является введение инкапсулированных нуклеиновых кислот в цитоплазму клетки. Точно так же, в случае прямого слияния частиц с плазматической мембраной клетки, когда происходит слияние, липосомная мембрана становиться интегрированной в клеточную мембрану и содержимое липосом объединяется с внутриклеточной жидкостью. Контакт между клетками и композициями липиднуклеиновая кислота при осуществлении in vitro будет происходить в биологически совместимой среде. Концентрация композиции может широко варьироваться в зависимости от конкретного применения, но, как правило, примерно находится в диапазоне от 1 мкмоль до 10 ммоль. В некоторых вариантах лечение клеток композициями липид-нуклеиновая кислота, как правило, будет осуществляться при физиологических температурах (около 37°С) в течение периода времени от 1 до 24 ч, преимущественно от 2 до 8 ч. При применении in vitro нуклеиновые кислоты могут быть доставлены в любую клетку, выращенную в культуре, будь она растительного или животного происхождения, позвоночных или беспозвоночных животных, а также из любой ткани или любого типа. В предпочтительных вариантах клетки будут клетками животных, более предпочтительно клетками млекопитающих и наиболее предпочтительно человеческими клетками.
В одной группе вариантов суспензия из частиц липид-нуклеиновая кислота добавляется к 60-80% сливных гальванизированных клеток, имеющих плотность клеток от примерно 103 клеток/мл до примерно 105 клеток/мл, более предпочтительно около 2х104 клеток/мл. Концентрация суспензии, добавленной к клеткам, предпочтительно равняется примерно от 0,01 до 20 мкг/мл, более предпочтительно около 1 мкг/мл.
В другом варианте липидные частицы изобретения могут быть использованы для доставки нуклеиновой кислоты в клетки или клеточные линии (например, линии опухолевых клеток). Неограничивающие примеры таких клеточных линий включают HELA (ATCC Cat N: CCL-2), KB (ATCC Cat N: CCL-17), HEP3B (ATCC Cat N: HB-8064), SKOV-3 (ATCC Cat N: HTB-77), HCT-116 (ATCC Cat N: CCL-247), HT29 (ATCC Cat N: HTB-38), PC-3 (ATCC Cat N: CRL-1435), A549 (ATCC Cat N: CCL-185), MDA-MB-231 (ATCC Cat N: HTB-26).
Типичные области применения включают использование известных процедур для обеспечения внутриклеточной доставки миРНК, чтобы разрушить или выключить специфические клеточные мишени. Альтернативные области применения включают доставку ДНК или мРНК последовательностей, которые кодируют терапевтически пригодные полипептиды. Таким образом, обеспечивается терапия генетических заболеваний путем поставки недостающих или отсутствующих генных продуктов (т.е. для дистрофии Дюшенна, см. Kunkel, et al., Brit. Med. Bull. 45(3):630-643 (1989), муковисцидоза, см. Goodfellow, Nature 341:102-103 (1989)). Другие виды применения для композиций согласно настоящему изобретению включают введение антисмысловых олигонуклеотидов в клетки (см., Bennett, et al., Mol. Pharm. 41:10231033 (1992)).
Кроме того, композиции согласно настоящему изобретению могут также быть использованы для доставки нуклеиновых кислот в клетки in vivo, с использованием способов, которые известны специалистам в данной области техники. В отношении доставки ДНК или РНК последовательностей работа Zhu, et al., Science 261:209-211 (1993), включенная здесь в качестве ссылки, описывает внутривенную доставку цитомегаловирус(ЦМВ)-хлорамфеникол ацетилтрансфераза (ХАТ)-экспрессирующей плазмиды с использованием ДОТМА-ДОФЭ комплексов. Работа Hyde, et al., Nature 362:250-256 (1993), включенная
- 43 037404 здесь в качестве ссылки, описывает доставку гена трансмембранного регулятора проводимости муковисцидоза (МВТР) к эпителию дыхательных путей и к альвеолам в легких мышей, используя липосомы. Работа Brigham, et al., Am. J. Med. Sci. 298:278-281 (1989), включенная здесь в качестве ссылки, описывает in vivo трансфекцию легких мышей с функционирующим прокариотическим геном, кодирующим внутриклеточный фермент, хлорамфеникола ацетилтрансферазу (ХАТ).
Таким образом, составы изобретения могут быть использованы в лечении инфекционных заболеваний.
При введении in vivo фармацевтические композиции предпочтительно вводить парентерально, т.е. внутрисуставно, внутривенно, внутрибрюшинно, подкожно или внутримышечно. В отдельных вариантах фармацевтические композиции вводят внутривенно или внутрибрюшинно в виде болюсной инъекции. Для примера см. работу Stadler, et al., патент США № 5286634, которая включена здесь в качестве ссылки. Внутриклеточная доставка нуклеиновой кислоты также обсуждалась в работах Straubringer, et al., Methods in Enzymology, Academic Press, New York. 101:512-527 (1983); Mannino, et al., Biotechniques 6:682-690 (1988); Nicolau, et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 6:239-271 (1989), и Behr, Acc. Chem. Res. 26:274-278 (1993). Тем не менее, другие способы введения лекарственных средств на основе липидов описаны, например, в работах Rahman et al., патенте США № 3993754; Sears, патенте США № 4145410; Papahadjopoulos et al., патенте США № 4235871; Schneider, патенте США № 4224179; Lenk et al., патенте США № 4522803; Fountain et al., патенте США № 4588578.
В других способах фармацевтические препараты могут контактировать с тканью-мишенью путем непосредственного нанесения (аппликации) препарата на ткани. Аппликация может быть выполнена путем местных, открытых или закрытых процедур. Под местной процедурой подразумевается непосредственная аппликация фармацевтических препаратов на ткань, подвергающуюся воздействию окружающей среды, такую как кожа, ротоглотка, наружный слуховой проход и подобные. Открытые процедуры - это те процедуры, которые включают рассечение кожи пациента и непосредственую визуализацию подлежащей ткани, на которую наносятся фармацевтические препараты. Обычно это достигается путем хирургического вмешательства, такого как торакотомия для доступа к легким, брюшная лапаротомия для доступа к брюшной полости или другой непосредственный хирургический подход к целевой ткани. Закрытые процедуры - это инвазивные процедуры, при которых внутренние ткани непосредственно не визуализируются, но доступны благодаря введению инструментов через небольшие раны на коже. Например, препараты могут быть введены в брюшину при помощи лаважа через иглу. Подобным образом фармацевтические препараты могут быть введены в мозговые оболочки или спинной мозг путем инфузии во время люмбальной пункции, которая проводится после соответствующего расположения пациента, как обычно принято на практике при проведении спинальной анестезии или контрастной визуализации спинного мозга с метразамидом. Кроме того, препараты могут быть введены через эндоскопические приборы.
Композиции липид-нуклеиновая кислота могут быть также введены в виде аэрозольных ингаляций в легкие (см. Brigham, et al., Am. J. Sci. 298(4):278-281 (1989)) либо путем инъкции непосредственно в область заболевания (Culver, Human Gene Therapy, MaryAnn Liebert, Inc., Publishers, New York, pp. 70-71 (1994)).
Способы настоящего изобретения могут быть применены на практике для различных организмов. Предпочтительные организмы включают виды млекопитающих, такие как люди, не человеческие приматы, собаки, кошки, крупный рогатый скот, лошади, овцы и им подобные.
Дозы для частиц липид-терапевтическое вещество согласно настоящему изобретению будут зависеть от соотношения терапевтического вещества к липиду и заключения врача, который назначает средство, основанного на возрасте, массе тела и состоянии пациента.
В одном из вариантов настоящее изобретение обеспечивает способ модуляции экспрессии целевого полинуклеотида или полипептида. Эти способы обычно включают контакт клетки с липидной частицей настоящего изобретения, которая является связанной с нуклеиновой кислотой, способной модулировать экспрессию целевого полинуклеотида или полипептида. Используемый здесь термин модулировать означает изменять экспрессию целевого полинуклеотида или полипептида. В разных вариантах модулирование может означать увеличение или повышение или может означать уменьшение или сокращение. Способы измерения уровня экспрессии целевого полинуклеотида или полипептида известны и доступны в области техники и включают, например, способы, использующие обратную транскрипциюполимеразную цепную реакцию (ОТ-ПЦР) и иммуногистохимические способы. В отдельных вариантах уровень экспрессии целевого полинуклеотида или полипептида увеличивается или уменьшается по крайней мере на 10, 20, 30, 40, 50 или более чем на 50% по сравнению с соответствующим контрольным значением.
Например, если желательна повышенная экспрессия полипептида, нуклеиновая кислота может быть вектором экспрессии, который включает полинуклеотид, кодирующий заданный полипептид. С другой стороны, если желательна сниженная экспрессия полинуклеотида или полипептида, то нуклеиновая кислота может быть, например, антисмысловым олигонуклеотидом, миРНК или микроРНК, которые включают в себя последовательность полинуклеотида, которая специфически гибридизируется к полинуклео- 44 037404 тиду, который кодирует целевой полипептид, тем самым нарушая экспрессию целевого полинуклеотида или полипептида. Кроме того, нуклеиновая кислота может быть плазмидой, который экспрессирует антисмысловой олигонуклеотид, миРНК или микроРНК.
В одном конкретном варианте настоящее изобретение обеспечивает способ модуляции экспрессии полипептида клеткой, включая доставку в клетку липидной частицы, которая состоит из или состоит в основном из липида, выбранного из табл. 1, ДСФХ, холестерина и либо ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-ДМА, например, в молярном соотношении равным примерно 20-60% катионный липид:5-25% ДСФХ:25-55% холестерин:0,5-15% ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-ДМА, где липидная частица связана с нуклеиновой кислотой, способной к модуляции экспрессии полипептида. В отдельном варианте молярное липидное соотношение составляет приблизително 40/10/40/10 (моль.% катионный липид/ДСФХ/холестерин/ПЭГ-ДМГ или ПЭГДМА), 35/15/40/10 (моль.% катионный липид/ДСФХ/холестерин/ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-ДМА) или 52/13/30/5 (моль.% катионный липид/ДСФХ/холестерин/ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-ДМА). В другой группе вариантов нейтральный липид в этих композициях замещается на ПОФХ, ДПФХ, ДОФЭ или СМ.
В отдельных вариантах терапевтическое средство выбрано из миРНК, микроРНК, антисмыслового олигонуклеотида и плазмиды, способной экспрессировать миРНК, микроРНК или антисмысловой олигонуклеотид, и где миРНК, микроРНК или антисмысловая РНК содержат полинуклеотид, который специфически связывается с полинуклеотидом, кодирующим полипептид или его комплемент, такой, что экспрессия полипептида снижается.
В других вариантах нуклеиновая кислота является плазмидой, которая кодирует полипептид или его функциональный вариант или его фрагмент, например, таким образом, что экспрессия полипептида или его функционального варианта или его фрагмента увеличивается.
В связанных вариантах настоящее изобретение обеспечивает способ лечения заболевания или нарушения, характеризующегося черезмерной экспрессией полипептида у субъекта, включающий обеспечение субъекта фармацевтической композицией согласно настоящему изобретению, в которой терапевтическое средство выбрано из миРНК, микроРНК, антисмыслового олигонуклеотида и плазмиды, способной экспрессировать миРНК, микроРНК или антисмысловой олигонуклеотид, и где миРНК, микроРНК или антисмысловая РНК содержат полинуклеотид, который специфически связывается с полинуклеотидом, кодирующим полипептид или его комплемент.
В одном из вариантов фармацевтическая композиция содержит липидную частицу, которая состоит из или состоит в основном из липида, выбранного из табл. 1, ДСФХ, холестерина и либо ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-ДМА, например, в молярном соотношении, равном примерно 20-60% катионный липид:5-25% ДСФХ:25-55% холестерин:0,5-15% ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-ДМА, где липидная частица, связана с терапевтической нуклеиновой кислотой. В отдельных вариантах молярное липидное соотношение составляет приблизително 40/10/40/10 (моль.% катионный липид/ДСФХ/холестерин/ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-ДМА), 35/15/40/10 (моль.% катионный липид/ДСФХ/холестерин/ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-ДМА) или 52/13/30/5 (моль.% катионный липид/ДСФХ/холестерин/ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-ДМА). В другой группе вариантов нейтральный липид в этих композициях замещается на ПОФХ, ДПФХ, ДОФЭ или СМ.
В другом связанном варианте настоящее изобретение включает способ лечения заболевания или расстройства, характеризующегося недостаточной экспрессией полипептида у субъекта, включая обеспечение субъекта фармацевтической композицией согласно настоящему изобретению, в котором терапевтическим агентом является плазмида, которая кодирует полипептид или его функциональный вариант или его фрагмент.
В одном из вариантов фармацевтическая композиция содержит липидную частицу, которая состоит исключительно или в основном из липида выбранного из табл. 1, ДСФХ, холестерина и либо ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-ДМА, например, в молярном соотношении равным примерно 20-60% катионный липид:5-25% ДСФХ:25-55% холестерин:0,5-15% ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-ДМА, где липидная частица, связанна с терапевтической нуклеиновой кислотой. В отдельных вариантах молярное липидное соотношение составляет приблизително 40/10/40/10 (моль.% катионный липид/ДСФХ/холестерин/ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-ДМА), 35/15/40/10 (моль.% катионный липид/ДСФХ/холестерин/ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-ДМА) или 52/13/30/5 (моль.% катионный липид/ДСФХ/холестерин/ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-ДМА). В другой группе вариантов нейтральный липид в этих композициях замещается на ПОФХ, ДПФХ, ДОФЭ или СМ.
Согласно настоящему изобретению также обеспечен способ индуцирования иммунного ответа у субъекта, включающий обеспечение субъекта фармацевтической композицией согласно настоящему изобретению, в котором терапевтическое средство является иммуностимулирующим олигонуклеотидом. В некоторых вариантах иммунный ответ является гуморальным иммунным ответом или иммунным ответом слизистых оболочек. В одном варианте фармацевтическая композиция содержит липидную частицу, которая состоит из или состоит в основном из липида, выбранного из табл. 1, ДСФХ, холестерина и либо ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-ДМА, например, в молярном соотношении, равным примерно 20-60% катионный липид:5-25% ДСФХ:25-55% холестерин:0,5-15% ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-ДМА, где липидная частица связана с терапевтической нуклеиновой кислотой. В отдельных вариантах молярное липидное соотношение составляет приблизително 40/10/40/10 (моль.% катионный липид/ДСФХ/холестерин/ПЭГ-ДМГ или ПЭГДМА), 35/15/40/10 (моль.% катионный липид/ДСФХ/холестерин/ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-ДМА) или
- 45 037404
52/13/30/5 (моль.% катионный липид/ДСФХ/холестерин/ПЭГ-ДМГ или ПЭГ-ДМА). В другой группе вариантов нейтральный липид в этих композициях замещается на ПОФХ, ДПФХ, ДОФЭ или СМ.
В дальнейших вариантах фармацевтическая композиция вводится субъекту в сочетании с вакциной или антигеном. Таким образом, настоящее изобретение само обеспечивает вакцинами, содержащими в составе липидную частицу согласно настоящему изобретению, которая включает в себя иммуностимулирующий олигонуклеотид, а также является связанной с антигеном, к которому желателен иммунный ответ. В отдельных вариантах антиген является опухолевым антигеном или связан с инфекционным агентом, таким как, например, вирус, бактерия или паразит.
Многообразие опухолевых антигенов, антигенов инфекционных агентов и антигенов, связанных с другими заболеваниями, хорошо известны в данной области техники, и примеры этих антигенов описаны в ссылках, приведенных в настоящем документе. Примеры антигенов подходящих для использования в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваясь, полипептидные антигены и ДНК-антигены. Конкретные примеры антигенов включают антиген гепатита А, гепатита В, натуральной оспы, полиомиелита, сибирской язвы, гриппа, тифа, столбняка, кори, ротавируса, дифтерии, коклюша, туберкулеза, краснухи. В предпочтительном варианте антиген является рекомбинантным антигеном гепатита В. В других подходах антиген является рекомбинантным антигеном гепатита А. В других подходах антиген является опухолевым антигеном. Примерами таких ассоциированных с опухолью антигенов являются MUC-1, ЭБВ (вирус Эпштейна-Барра) антиген и антигены, связанные с лимфомой Беркитта. В еще одном аспекте антиген является рекомбинантным антигеном родственного тирозаназе белкового опухолевого антигена. Специалисты в данной области техники будут знать о других антигенах, подходящих для использования в настоящем изобретении.
Антигены, ассоциированные с опухолью, подходящие для использования в обсуждаемом изобретении, включают в себя как мутированные, так и немутированные молекулы, которые могут указывать на один тип опухоли, быть общими для нескольких типов опухолей, и/или экспрессироваться или черезмерно экспрессироваться исключительно в опухолевых клетках по сравнению с нормальными клетками. В дополнение к белкам и гликопротеинам также были зарегистрированы опухоль-специфические образцы экспрессии углеводов, ганглиозидов, гликолипидов и муцинов. Типичные опухоль-специфичные антигены для использования в раковых вакцинах, являющихся предметом обсуждения, включают белковые продукты онкогенов, генов-супрессоров опухолей и других генов с мутациями или перестановками, уникальными для опухолевых клеток, реактивированные продукты эмбриональных генов, онкоэмбриональные антигены, дифференцировочные тканеспецифические (но не опухоль-специфические) антигены, рецепторы фактора роста, углеводные остатки клеточной поверхности, чужеродные вирусные белки и ряд других аутобелков.
Специфические варианты опухолевых антигенов включают, например, мутировавшие антигены, такие как белковые продукты Ras p21 протоонкогенов, онкогены супрессора опухоли р53 и BCR-abl, а также CDK4, MUM1, каспазу 8, и β-катенин; черезмерно экспрессированные антигены, такие как галектин 4, галектин 9, карбоангидраза, альдолаза А, PRAME, Her2/neu, ErbB-2 и KSA, онкоэмбриональные антигены, такие как α-фетопротеин (АФП), хорионический гонадотропин человека (ХГч); аутоантигены, такие как карциноэмбриональный антиген (КЭА) и антигены дифференциации меланоцитов, такие как Mart 11/Melan А, gp100, gp75, тирозиназа, TRP1 и TRP2; простатспецифические антигены, такие как PSA, PAP, PSMA, PSM-P1 и PSM-P2, реактивированные продукты эмбриональных генов, такие как MAGE 1, MAGE 3, MAGE 4, GAGE 1, GAGE 2, BAGE, RAGE и другие антигены рака яичка, такие как NY-ES01, SSX2 и SCP1; муцины, такие как Мис-1 и Мис-2; ганглиозиды, такие как GM2, GD2 и GD3, нейтральные гликолипиды и гликопротеиды, такие как Lewis (у) и globo-Н, и гликопротеины, такие как Tn, Thompson-Freidenreich антиген (TF) и sTn. Также включены в данный документ в качестве опухольассоциированных антигенов цельноклеточные и опухолевоклеточные лизаты, а также их иммуногенные части, а также идиотипы иммуноглобулина, экспрессированные на моноклональных пролиферациях Влимфоцитов для использования против В-клеточных лимфом.
Патогенные микроорганизмы включают, но не ограничиваясь, инфекционные агенты, например вирусы, которые инфицируют млекопитающих, и особенно людей. Примеры контагиозных вирусов включают, но не ограничиваясь, ретровирусы (например, вирусы иммунодефицита человека, такие как ВИЧ-1 (также упоминается как HTLV-III, LAV или HTLV-III/LAV, или ВИЧ-III; и другие изоляты, такие как ВИЧ-LP; пикорнавирусы (например, вирусы полиомиелита, вирус гепатита А, энтеровирусы, человеческие вирусы Коксаки, риновирусы, эховирусы); калицивирусы (например, штаммы, вызывающие гастроэнтерит); тогавирусы (например, вирусы энцефалитов лошадей, вирусы краснухи); флавивирусы (например, вирусы лихорадки Денге, вирусы энцефалита, вирусы желтой лихорадки); короновирусы (например, коронавирус); рабдовирусы (например, вирусы везикулярного стоматита, вирусы бешенства); филовирусы (например, вирусы Эбола); парамиксовирусы (например, вирусы парагриппа, вирус паротита, вирус кори, респираторно-синцитиальный вирус); ортомиксовирусы (например, вирусы гриппа); буньявирусы (например, хантаан вирусы, буньявирусы, флебовирусы, наировирусы); аренавирусы (вирусы геморрагической лихорадки); реовирусы (например, реовирусы, орбивирусы и ротавирусы); бирнавирусы; гепад- 46 037404 навирусы (вирус гепатита В); парвовирусы (парвовирусы); паповавирусы (папилломавирусы, вирусы полиомы); аденовирусы (большинство аденовирусов); герпесвирусы (вирус простого герпеса (ВПГ) 1 и 2 типа, вирус ветряной оспы, цитомегаловирус (ЦМВ), вирус герпеса); поксвирусы (вирусы натуральной оспы, вирусы коровьей оспы, вирусы оспы) и иридовирусы (например, вирус африканской чумы свиней); неклассифицированные вирусы (например, возбудители губчатой энцефалопатии, возбудитель дельта гепатита (считается дефектным спутником вируса гепатита В), возбудители гепатита ни А ни В (класс 1 = фекально оральный (энтеральный) путь передачи; класс 2 = парентеральный путь передачи (например, гепатит С); норовирус (вирус Норуолк и связанные вирусы и астровирусы).
Кроме того, в качестве антигенов у позвоночных животных, служат грамотрицательные и грамположительные бактерии. Такие грамположительные бактерии включают, но не ограничиваясь виды пастереллы, виды стафилококков и виды стрептококков. Грамотрицательные бактерии включают, но не ограничиваясь, кишечную палочку, бактерии вида псевдомонад и вида сальмонелл. Конкретные примеры инфекционных бактерий включают, но не ограничиваясь ими, Helicobacterpyloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia, Mycobacteria виды (например., M. tuberculosis, M. avium, M. intracellulare, M. kansaii, M. gordonae), Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes (Streptococcus группы A), Streptococcus agalactiae (Streptococcus группы В), Streptococcus (группы viridans), Streptococcusfaecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (анаэробные виды), Streptococcus pneumoniae, pathogenic Campylobacter вид, Enterococcus вид, Haemophilus infuenzae, Bacillus antracis, corynebacterium diphtheriae, corynebacterium вид, Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides вид, Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia, и Actinomyces israelli.
Дополнительные примеры патогенных микроорганизмов включают, но не ограничиваясь, инфекционные грибы, поражающие млекопитающих и особенно людей. Примеры инфекционных грибов включают, но не ограничиваясь Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis, Chlamydia trachomatis, Candida albicans. Примеры инфекционных паразитов включают Plasmodium как, например, Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale, и Plasmodium vivax. Другие инфекционные организмы (например, простейшие) включают Toxoplasma gondii.
В одном варианте состав изобретения может быть использован, чтобы выключить или модулировать гены-мишени, такие как, но не ограничиваясь ими, FVII, Eg5, PCSK9, ТРХ2, апоВ, SAA, TTR, RSV, PDGF β ген, Erb-B ген, Src ген, CRK ген, GRB2 ген, RAS ген, MEKK ген, JNK ген, RAF ген, Erk1/2 ген, PCNA(p21) ген, MYB ген, JUN ген, FOS ген, BCL-2 ген, Cyclin D ген, VEGF ген, EGFR ген, циклин А ген, циклин Е ген, WNT-1 ген, β-катенин ген, с-МЕТ ген, PKC ген, NFKB ген, STAT3 ген, сурвивин ген, Her2/Neu ген, SORT1 ген, XBP3 ген, топоизомераза/ген, топоизомераза/α ген, р73 ген, p21(WAF1/CIP1) ген, р27(К1Р1) ген, PPM1D ген, RAS ген, caveolin/ген, MIB/ген, MTA/ген, М68 ген, гены супрессоры опухолей, р53 ген супрессор опухоли, р53 член семьи DN-p63, pRb ген супрессор опухоли, АРС1 ген супрессор опухоли, BRCA1 ген супрессор опухоли, PTEN ген супрессор опухоли, mLL ген слияния, BCR/ABL ген слияния, TEL/AML1 ген слияния, EWS/FLI1 ген слияния, TLS/FUS1 ген слияния, PAX3/FKHR ген слияния, AML1/ETO ген слияния, α v-интегрин ген, ген рецептора Flt-1, tubulin ген, ген вируса папилломы человека, ген, необходимый для репликации вируса папилломы человека, ген вируса иммунодефицита человека, ген, необходимый для репликации вируса иммунодефицита человека, ген вируса гепатита А, ген, необходимый для репликации вируса гепатита А, ген вируса гепатита В, ген, необходимый для репликации вируса гепатита В, ген вируса гепатита С, ген, необходимый для репликации вируса гепатита С, ген вируса гепатита D, ген, необходимый для репликации вируса гепатита D, ген вируса гепатита Е, ген, необходимый для репликации вируса гепатита Е, ген вируса гепатита F, ген, необходимый для репликации вируса гепатита F, ген вируса гепатита G, ген, необходимый для репликации вируса гепатита G, ген вируса гепатита Н, ген, необходимый для репликации вируса гепатита Н, ген Respiratory Syncytial Virus, ген, необходимый для репликации Respiratory Syncytial Virus, ген Herpes Simplex Virus, ген, необходимый для репликации Herpes Simplex Virus, ген herpes Cytomegalovirus, ген, необходимый для репликации herpes Cytomegalovirus, ген herpes Epstein Barr Virus, ген, необходимый для репликации herpes Epstein Barr Virus, ген Kaposi's Sarcoma-associated Herpes Virus, ген, необходимый для репликации Kaposi's Sarcoma-associated Herpes Virus, JC Virus ген, человеческий ген, необходимый для репликации JC Virus, myxovirus ген, ген, необходимый для репликации myxovirus, rhinovirus ген, ген, необходимый для репликации rhinovirus, ген coronavirus, ген, необходимый для репликации coronavirus, ген West Nile Virus, ген, необходимый для репликации West Nile Virus, ген St. Louis Encephalitis, ген, необходимый для репликации St. Louis Encephalitis, ген Tick-borne encephalitis virus, ген, необходимый для репликации Tick-borne encephalitis virus, ген Murray Valley encephalitis virus, ген, необходимый для репликации Murray Valley encephalitis virus, ген dengue virus, ген, необходимый для репликации dengue virus гена, Simian Virus 40 ген, ген, необходимый для репликации Simian Virus 40, ген Human T Cell Lymphotropic Virus, ген, необходимый для репликации Human T Cell Lymphotropic Virus, ген Moloney-Munne Leukemia Virus, ген, необходимый для репликации Moloney-Munne Leukemia Virus, ген encephalomyocar
- 47 037404 ditis virus, ген, необходимый для репликации encephalomyocarditis virus, ген measles virus, ген, необходимый для репликации measles virus, ген Vericella zoster virus, ген, необходимый для репликации Vericella zoster virus, ген adenovirus, ген, необходимый для репликации adenovirus, ген вируса желтой лихорадки, ген, необходимый для репликации вируса желтой лихорадки, ген poliovirus, ген, необходимый для репликации poliovirus, ген poxvirus, ген, необходимый для репликации poxvirus, ген plasmodium, ген, необходимый для репликации plasmodium гена, ген Mycobacterium ulcerans, ген, необходимый для репликации Mycobacterium ulcerans, ген Mycobacterium tuberculosis, ген, необходимый для репликации Mycobacterium tuberculosis, ген Mycobacterium leprae, ген, необходимый для репликации Mycobacterium leprae, ген Staphylococcus aureus, ген, необходимый для репликации Staphylococcus aureus, ген Streptococcus pneumoniae, ген, необходимый для репликации Streptococcus pneumoniae, ген Streptococcus pyogenes, ген, необходимый для репликации Streptococcus pyogenes, ген Chlamydia pneumoniae, ген, необходимый для репликации Chlamydia pneumoniae, ген Mycoplasma pneumoniae, ген, необходимый для репликации Mycoplasma pneumoniae, ген интегрина, ген селектина, ген системы комплемента, ген хемокина, ген рецептора хемокина, ген GCSF, ген Gro1, ген Gro2, ген Gro3, ген PF4, ген MIG, ген Pro-Platelet Basic Protein, ген MIP-1I, ген MIP-1J, ген RANTES, ген МСР-1, ген МСР-2, ген МСР-3, ген CMBKR1, ген CMBKR2, ген CMBKR3, CMBKR5v, ген AIF-1, I-309 ген, ген компонента ионного канала, ген рецептора нейротрансмиттера, ген нейромедиатора лиганда, ген амилоидной семьи, ген presenilin, ген HD, ген DRPLA, ген SCA1, ген SCA2, ген MJD1, ген CACNL1A4, ген SCA7, ген SCA8, аллелый ген, обнаруженный в клетках LOH, или аллелый ген полиморфного гена.
Определения.
Алкил означает прямую или разветвленную цепь, нециклическую или циклическую, насыщенную алифатическим углеводородом, содержащую от 1 до 24 атомов углерода. Типичными представителями алкилов с насыщенной прямой цепью являются метил, этил, n-пропил, n-бутил, n-пентил, n-гексил и им подобные, в то время как насыщенные разветвленные алкилы включают изопропил, втор-бутил, изобутил, трет-бутил, изопентил и им подобные. Типичные представители насыщенных циклических алкилов включают циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и им подобные; в то время как ненасыщенные циклические алкилы включают циклопентенил и циклогексенил и им подобные.
Алкенил означает алкил, описанный выше, содержащий по меньшей мере одну двойную связь между соседними атомами углерода. Алкенилы включают как цис-, так и транс-изомеры. Представители алкенилов с прямой цепью и разветвленные алкенилы включают этиленил, пропиленил, 1-бутенил, 2бутенил, изобутиленил, 1-пентенил, 2-пентенил, 3-метил-1-бутенил, 2-метил-2-бутенил, 2,3-диметил-2бутенил и им подобные.
Алкинил означает любой алкил или алкенил, описанный выше, который дополнительно содержит по крайней мере одну тройную связь между смежными углеродными атомами. Представители алкинилов с прямой цепью и разветвленные алкинилы включают ацетиленил, пропинил, 1-бутинил, 2-бутинил, 1пентинил, 2-пентинил, 3-метил-1-бутинил и им подобные.
Термин ацил относится к водороду, алкилу, частично насыщенному или полностью насыщенному циклоалкилу, частично насыщенному или полностью насыщенному гетероциклу, арилу, замещенному гетероарилу, и карбонильным группам. Например, ацил включает в себя такие группы, как (С1С20)алканоил (например, формил, ацетил, пропионил, бутирил, валерил, капроил, t-бутилацетил и т.д.), (С3-С20)циклоалкилкарбонил (например, циклопропилкарбонил, циклобутилкарбонил, циклопентилкарбонил, циклогексилкарбонил и т.д.), гетероциклический карбонил (например, пирролидинилкарбонил, пирролид-2-он-5-карбонил, пиперидинилкарбонил, пиперазинилкарбонил, тетрагидрофуранилкарбонил и т.д.), ароил (например, бензоил) и гетероароил (например, тиофенил-2-карбонил, тиофенил-3-карбонил, фуранил-2-карбонил, фуранил-3-карбонил, IH-пирроил-2-карбонил, IH-пирроил-3-карбонил, бензо[b]тиофенил-2-карбонил и др.).
Термин арил относится к ароматической моноциклической, бициклической или трициклической кольцевой системе углеводородов, где любой кольцевой атом может быть замещен. Примеры арильных фрагментов включают, но не ограничиваясь, фенил, нафтил, антраценил и пиренил.
Гетероцикл означает 5-7-членное моноциклическое или 7-10-членное бициклическое гетероциклическое кольцо, которое является либо насыщенным, ненасыщенным или ароматическим, и которое содержит от 1 или 2 гетероатомов, независимо выбранных из азота, кислорода и серы, и где гетероатомы азота и серы могут быть факультативно окислены и гетероатом азота может быть факультативно кватернизован, включая бициклические кольца, в которых любой из вышеназванных гетероциклов слиты в бензольное кольцо. Гетероцикл может быть присоединен через любой гетероатом или атом углерода. Гетероциклы включают гетероарилы, как определено ниже. Гетероциклы включают морфолинил, пирролидинонил, пирролидинил, пиперидинил, пиперизинил, гидантоинил, валеролактамил, оксиранил, оксетанил, тетрагидрофуранил, тетрагидропиранил, тетрагидропиридинил, тетрагидропримидинил, тетрагидротиофенил, тетрагидротиопиранил, тетрагидропиримидинил, тетрагидротиофенил, тетрагидротиопиранил и им подобные.
Термин гетероарил относится к ароматической 5-8-членной моноциклической, 8-12-членной бициклической или 11-14-членной трициклической кольцевой системе, обладающей 1-3 гетероатомами,
- 48 037404 если эта система моноциклическая, 1-6 гетероатомами, если эта система бициклическая, или 1-9 гетероатомами, если эта система трициклическая, названные гетероатомы выбраны из О, N или S (например, атомов углерода и 1-3, 1-6 или 1-9 гетероатомов N, О или S, если система моноциклическая, бициклическая, или трициклическая соответственно), где любой атом кольца может быть заменен. Группы гетероарила, описанные в данном документе, также могут содержать слившиеся кольца, которые совместно используют общие связи углерод-углерод. Термин алкилгетероцикл относится к гетероарилу, где по меньшей мере один из атомов кольца заменяется алкилом, алкенилом или алкинилом.
Термин замещенный относится к замене одного или нескольких радикалов водорода в данной формуле на радикал указанного заместителя, включающего, но не ограничиваясь, галоген, алкил, алкенил, алкинил, арил, гетероциклил, тиол, алкилтио, оксо, тиокси, арилтио, алкилтиоалкил, арилтиоалкил, алкилсульфонил, алкилсульфонилалкил, арилсульфонилалкил, алкокси, арилокси, аралкокси, аминокарбонил, алкиламинокарбонил, ариламинокарбонил, алкоксикарбонил, арилоксикарбонил, галогеналкил, аминокислоты, трифторметил, циано, нитро, алкиламино, ариламино, алкиламиноалкил, ариламиноалкил, аминоалкиламино, гидрокси, алкоксиалкил, карбоксиалкил, алкоксикарбонилалкил, аминокарбонилалкил, ацил, аралкоксикарбонил, карбоновая кислота, сульфоновая кислота, сульфонил, фосфоновая кислота, арил, гетероарил, гетероциклические и алифатические радикалы. Понятно, что заместитель может быть в дальнейшем замещен. Типичные заместители включают амино, алкиламино, диалкиламино и циклические аминосоединения.
Галоген означает фтор, хлор, бром и йод.
Термины алкиламин и диалкиламин относятся к -NH(алкил) и -N(алкил)2 радикалам соответственно.
Термин алкилфосфат относится к -O-P(Q')(Q)-O-R, где Q' и Q являются каждый независимо О, S, N(R)2, факультативно замещенный алкил или алкокси; и R - это факультативно замещенный алкил, ωаминоалкил или ω-(замещенный)аминоалкил.
Термин алкилфосфоротиоат относится к алкилфосфату, в котором по меньшей мере один из Q' или Q является S.
Термин алкилфосфонат относится к алкилфосфату, в котором по меньшей мере один из Q' или Q является алкилом.
Термин гидроксиалкил означает -О-алкильный радикал.
Термин алкилгетероцикл относится к алкилу, в котором по меньшей мере один метилен замещен гетероциклом.
Термин ω-аминоалкил относится к -алкил-NH2 радикалу. И термин ω-(замещенный)аминоалкил относится к ω -аминоалкилу в котором по меньшей мере один из атомов водорода, имеющего связь с атомом азота, замещен алкилом.
Термин ω-фосфоалкил относится к -алкил-O-P(Q')(Q)-O-R, где Q' и Q являются каждый независимо О или S и R - это факультативно замещенный алкил.
Термин ω-тиофосфоалкил относится к ω-фосфоалкилу, где по меньшей мере один из Q' или Q является S.
В некоторых вариантах способы изобретения могут потребовать использования защитных групп. Методология защитной группы хорошо известна специалистам в данной области техники (см., например, Защитные группы в органическом синтезе, Green, T.W. et. al., Wiley-lnterscience, New York City, 1999). Коротко, защитные группы в контексте данного изобретения являются любой группой, которая уменьшает или устраняет нежелательную реакционную способность функциональных групп. Защитная группа может быть добавлена в функциональную группу, чтобы замаскировать ее реактивность во время определенных реакций, а затем удалена, чтобы открыть оригинальные функциональные группы. В некоторых вариантах используется спиртовая защитная группа. Спиртовая защитная группа - это любая группа, которая снижает или устраняет нежелательные реакционные способности спиртовых функциональных групп. Защитные группы могут быть добавлены и удалены с помощью способов, хорошо известных в данной области техники.
Соединения согласно настоящему изобретению могут быть получены путем известных органических способов синтеза, включая способы более подробно описанные в примерах.
Примеры
Пример 1. Синтез метилсульфоновой кислоты октадека-9,12-диэнил эфира 2.
- 49 037404 но
Схема 1
MsCI, NEt3
Триэтиламин (13,13 г, 130 ммоль) добавляют в спиртовой раствор 1 (26,6 г, 100 ммоль) в дихлорметане (100 мл); полученный раствор охлаждают на ледяной бане. В данный охлажденный раствор по каплям добавляют мезил хлорид (12,6 г, 110 ммоль) в дихлорметане (60 мл); после завершения добавления реакционную смесь оставляют, чтобы она нагрелась до температуры окружающей среды, и перемешивают в течение ночи. Тонкослойная хроматография (ТСХ) реакционной смеси отражает завершение реакции. Реакционную смесь разбавляют дихлорметаном (200 мл), промывают водой (200 мл), насыщенным NaHCO3 (200 мл), соляным раствором (100 мл) и высушивают (NaSO4). Органический слой концентрируют для получения неочищенного продукта, который очищают с помощью колоночной хроматографии (силикагель), используя 0-10% Et2O в гексанах. Чистые фракции продукта смешивают и концентрируют с целью получения чистого продукта 2 в виде бесцветного масла (30,6 г, 89%).
1Н ЯМР (CDCl3, 400 МГц) δ = 5,42-5,21 (m, 4H), 4,20 (t, 2H), 3,06 (s, 3Н), 2,79 (t, 2Н), 2,19-2,00 (m, 4Н), 1,90-1,70 (m, 2Н), 1,06-1,18 (m, 18Н), 0,88 (t, 3Н).
13С ЯМР (CDCl3) δ = 130,76, 130,54, 128,6, 128,4, 70,67, 37,9, 32,05, 30,12, 29,87, 29,85, 29,68, 29,65, 29,53, 27,72, 27,71, 26,15, 25,94, 23,09, 14,60.
МС. Расчетная молекулярная масса для C19H36O3S 344,53, обнаруженная 343,52 (М-Н-).
Синтез 18-бром-октадека-6,9-диен 3.
Мезилат 2 (13,44 г, 39 ммоль) растворяют в безводном эфире (500 мл), после чего к нему в среде аргона добавляют комплекс MgBr-Et2O (30,7 г, 118 ммоль); данная смесь подвергается кипячению в среде аргона на протяжении 26 ч, после чего ТСХ отражает завершение реакции. Реакционную смесь разбавляют эфиром (200 мл) и добавляют в нее ледяную воду (200 мл) и разделяют слои. Органический слой промывают 1% водным раствором K2CO3 (100 мл), соляным раствором (100 мл) и высушивают (безводным Na2SO4). Концентрат органических слоев предоставляет источник неочищенного продукта, который затем очищают методом колоночной хроматографии (силикагель), используя 0-1% Et2O в гексанах для выделения бромида 3 (12,6 г, 94%) в виде бесцветного масла.
1Н ЯМР (CDCl3, 400 МГц) δ = 5,41-5,29 (m, 4Н), 4,20 (d, 2Н), 3,40 (t, J = 7 Гц, 2Н), 2,77 (t, J = 6,6 Гц, 2Н), 2,09-2,02 (m, 4Н), 1,88-1,00 (m, 2Н), 1,46-1,27 (m, 18Н), 0,88 (t, J = 3,9 Гц, 3Н).
13С ЯМР (CDCl3) δ = 130,41, 130,25, 128,26, 128,12, 34,17, 33,05, 31,75, 29,82, 29,57, 29,54, 29,39, 28,95, 28,38, 27,42, 27,40, 25,84, 22,79, 14,28.
Синтез 18-циан-октадека-6,9-диена 4.
Раствор KCN (1,32 г, 20 ммоль) в воде (10 мл) добавляют в спиртовой раствор мезилата (3,44 г, 10 ммоль) в этаноле (90 мл) и кипятят полученную смесь в течении 30 мин, после чего ТСХ реакционной смеси отражает завершение реакции, после чего в реакционную смесь добавляют эфир (200 мл) с последующим добавлением воды. Реакционную смесь экстрагируют эфиром и комбинированные органические слои промывают водой (100 мл), соляным раствором (200 мл) и высушивают. Концентрат органического слоя обеспечивает источник неочищенного продукта, который затем очищают методом колоночной хроматографии (0-10% Et2O в гексанах). Чистый продукт 4 выделяют в виде бесцветного масла (2 г, 74%).
- 50 037404
Ή ЯМР (CDCl3, 400 МГц) δ = 5,33-5,22 (m, 4Н), 2,70 (t, 2Н), 2,27-2,23 (m, 2Н), 2,00-1,95 (m, 4Н),
1,61-1,54 (m, 2Н), 1,39-1,20 (m, 18Н), 0,82 (t, 3Н), 13С ЯМР (CDCl3) δ = 130,20, 129,96, 128,08, 127,87, 119,78, 70,76, 66,02, 32,52, 29,82, 29,57, 29,33, 29,24, 29,19, 29,12, 28,73, 28,65, 27,20, 27,16, 25,62, 25,37, 22,56, 17,10, 14,06.
МС. Расчетная молекулярная масса для C19H33N, 275,47, обнаруженная 276,6 (М-Н-).
Синтез гептатриаконта-6,9,28,31-тетраен-19-он 7.
Свежеактивированную стружку Mg (0,144 г, 6 ммоль) добавляют в высушенную на огне колбу 500 мл 2NRB, оборудованную магнитной мешалкой и обратным конденсатором (рефлюкс-конденсатором). Данную установку дегазируют, промывают аргоном, после чего в колбу добавляют с помощью шприца 10 мл безводного эфира. Бромид 3 (1,65 г, 5 ммоль) растворяют в безводном эфире (10 мл) и добавляют в колбу капельно с помощью шприца.
Регистрируют экзотермическую реакцию (для подтверждения/ускорения формирования реактива Гриньяра добавляют 2 мг йода, после чего наблюдают немедленное обесцвечивание, которое подтверждает формирование реактива Гриньяра) и эфир начинает кипеть. После завершения добавления реакционную смесь выдерживают при температуре 35°С в течение 1 ч и затем охлаждают на ледяной бане. Цианид 4 (1,38 г, 5 ммоль) растворяют в безводном эфире (20 мл) и, помешивая, добавляют капельно в реакционную смесь. Наблюдают экзотермическую реакцию, и реакционную смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Реакцию гасят добавлением по каплям 10 мл ацетона, после чего добавляют ледяную воду (60 мл). Реакционную смесь обрабатывают водной H2SO4 (10% по объему, 200 мл) до тех пор, пока раствор не станет однородным, и слои разделяют. Водную фазу экстрагируют эфиром (2x100 мл). Смешанные эфирные слои высушивают (Na2SO4) и концентрируют для получения неочищенного продукта, который очищают с помощью колоночной (силикагель, 0-10% эфира в гексанах) хроматографии. Фракции очищенного продукта выпаривают для получения чистого кетона 7 в виде бесцветного масла (2 г, 74%).
1Н ЯМР (CDCl3, 400 МГц) δ = 5,33-5,21 (м, 8Н), 2,69 (t, 4H), 2,30 (t, 4H), 2,05-1,95 (м, 8Н), 1,55-1,45 (м, 2Н), 1,35-1,15 (м, 18Н), 0,82 (t, 3H).
13С ЯМР (CDCl3) δ = 211,90, 130,63, 130,54, 128,47, 128,41, 43,27, 33,04, 32,01, 30,93, 29,89, 29,86, 29,75, 29,74, 27,69, 26,11, 24,35, 23,06, 14,05.
МС. Расчетная молекулярная масса для C37H66O, 526,92, обнаруженная 528,02 (М+Н+).
Пример 2. Альтернативный синтез кетона 7.
Схема 2
Синтез соединения 6b.
Свеже активированную стружку Mg (2,4 г, 6 ммоль) добавляют в высушенную на огне RB колбу объемом 500 мл, оборудованную магнитной мешалкой, капельной воронкой и обратным конденсатором (рефлюкс-конденсатором). Данную установку дегазируют, промывают аргоном, после чего в колбу добавляют с помощью шприца 10 мл безводного эфира. Бромид 3 (26,5 г, 80,47 ммоль) растворяют в безводном эфире (50 мл) и добавляют в капельную воронку. Около 5 мл указанного эфирного раствора добавляют в магниевую стружку, энергично размешивая. Отмечают экзотермическую реакцию (для подтверждения/ускорения формирования реактива Гриньяра, добавляют 5 мг йода, после чего наблюдают немедленное обесцвечивание, которое подтверждает формирование реактива Гриньяра), и эфир начинает кипеть. Оставшийся раствор бромида добавляют по каплям, в то время как поддерживают реакцию в условиях мягкой дефлегмации, охлаждая колбу в воде. По завершению добавления реакционную смесь выдерживают при температуре 35°С в течение 1 ч, после чего охлаждают на ледяной бане. Этилформиат (2,68 г, 36,2 ммоль) растворяют в безводном эфире (40 мл), перемещают в капельную воронку и, помешивая, добавляют по каплям в реакционную смесь. Наблюдают экзотермическую реакцию, и реакционная смесь начинает кипеть. После начала реакции оставшийся эфирный раствор формиата быстро струйно добавляют и перемешивают реакционную смесь в течение часа при комнатной температуре. Реакцию гасят капельным добавлением 10 мл ацетона, после чего добавляют ледяную воду (60 мл). Реакционную
- 51 037404 смесь обрабатывают водным раствором H2SO4 (10 об.%, 300 мл) до тех пор, пока раствор не становится однородным, после чего слои разделяют. Водную фазу экстрагируют эфиром (2x100 мл). Смешанные эфирные слои высушивают (Na2SO4) и концентрируют для получения неочищенного продукта, который очищают с помощью колоночной (силикагель, 0-10% эфира в гексанах) хроматографии. Слегка менее поляризованные фракции концентрируют для получения формиата 6а (1,9 г), фракции очищенного продукта выпаривают для получения чистого продукта 6b в виде бесцветного масла (14,6 г, 78%).
Синтез соединения 7.
Свеже активированные 4А молекулярные сита (50 г) добавляют в спиртовой раствор 6b (3 г, 5,68 ммоль) в CH2Cl2 (60 мл); в данный раствор в течении 20 мин добавляют измельченный в порошок осажденный карбонат кальция (ОКК) (4,9 г, 22,7 ммоль), после чего смесь перемешивают в течение 1 ч (примечание: необходимо внимательное наблюдение за реакцией для получения хорошего результата, так как затягивание времени реакции приводит к ухудшению конечного результата) и ТСХ реакционной смеси следует каждые 10 мин (5% эфира в гексанах). После завершения реакции реакционную смесь фильтруют через слой силикагеля и остаток промывают CH2Cl2 (400 мл). Фильтрат концентрируют и полученный таким образом неочищенный продукт в дальнейшем очищают с помощью колоночной хроматографии (силикагель, 1% Et2O в гексанах) для выделения чистого продукта 7 (2,9 г, 97%) в виде бесцветного масла.
1Н ЯМР (CDCls, 400 МГц) δ = 5,33-5,21 (м, 8Н), 2,69 (t, 4Н), 2,30 (t, 4Н), 2,05-1,95 (м, 8Н), 1,55-1,45 (м, 2Н), 1,35-1,15 (м, 18Н), 0,82 (t, 3H).
13С ЯМР (CDCls) δ = 211,90, 130,63, 130,54, 128,47, 128,41, 43,27, 33,04, 32,01, 30,93, 29,89, 29,86, 29,75, 29,74, 27,69, 26,11, 24,35, 23,06, 14,05.
МС. Расчетная молекулярная масса для С37Н66О, 526,92, обнаруженная 528,02 (М+Н+).
Пример 3. Синтез асимметричных кетонов 25 и 27.
Синтез гептатриаконта-6,9,28-триен-19-он 25.
Свежеактивированную стружку Mg (132 мг, 0,0054 моль) добавляют в сухую колбу 50 мл 2NRB, оборудованную магнитной мешалкой и обратным конденсатором (рефлюкс-конденсатором). Данную установку дегазируют, промывают азотом и добавляют в колбу с помощью шприца 10 мл безводного эфира. Бромид 24 (1,8 г, 0,0054 моль) растворяют в безводном эфире (10 мл) и добавляют в колбу капельно с помощью шприца. Отмечают экзотермическую реакцию (реакцию инициирует дибромэтан) и эфир начинает кипеть. После завершения добавления реакционную смесь выдерживают при температуре 35°С в течение 1 ч и затем охлаждают на ледяной бане до 10-15°С. Цианид 4 (0,5 г, 0,0018 моль) растворяют в сухом ТГФ (5 мл) и, помешивая, добавляют капельно в реакционную смесь. Наблюдают экзотермическую реакцию; реакционная смесь кипит (при 70°С) в течение 12 ч, и реакцию гасят раствором хлорида аммония. Затем обрабатывают 25% раствором HCl до тех пор, пока раствор не становится однородным, после чего слои разделяют. Водную фазу экстрагируют эфиром. Смешанные эфирные слои высушивают и концентрируют для получения неочищенного продукта, который затем очищают с помощью колоночной хроматографии. Фракции очищенного продукта выпаривают для получения чистого кетона
- 52 037404 в виде бесцветного масла. Выход: 0,230 г (24%).
1Н-ЯМР (CDCl3, 400 МГц): δ = 5,37-5,30 (м, 6Н), 2,77-2,74 (t, 2H), 2,38-2,34 (t, 4Н), 2,05-1,95 (м, 8Н), 1,56-1,52 (м, 4Н), 1,35-1,25 (м, алифатические протоны), 0,89-0,85 (t, 6Н).
ИК (см-1): 2924, 2854, 1717, 1465, 1049, 721.
Синтез гептатриаконта-6,9-диен-19-он 27.
Свежеактивированную стружку Mg (0,144 г, 6 ммоль) добавляют в высушенную на огне 2NRB колбу объемом 500 мл, оборудованную магнитной мешалкой и обратным конденсатором (рефлюксконденсатором). Данную установку дегазируют, промывают аргоном, после чего в колбу добавляют с помощью шприца 10 мл безводного эфира. Коммерчески доступный бромид 26 (2,65 г, 5 ммоль) растворяют в безводном эфире (10 мл) и добавляют в колбу по каплям с помощью шприца. После окончания добавления реакционную смесь выдерживают при температуре 35°С в течение 1 ч и затем охлаждают на ледяной бане. Цианид 4 (1,38 г, 5 ммоль) растворяют в безводном эфире (20 мл) и, помешивая, добавляют по каплям в реакционную смесь. Наблюдается экзотермическая реакция; реакционную смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Реакцию гасят добавлением 10 мл ацетона по каплям, после чего добавляют ледяную воду (60 мл). Реакционную смесь обрабатывают водным раствором H2SO4 (10 об.%; 200 мл) до тех пор, пока раствор не становится однородным, после чего слои разделяют. Водную фазу экстрагируют эфиром (2x100 мл). Смешанные эфирные слои высушивают (Na2SO4) и концентрируют для получения неочищенного продукта, который затем очищают с помощью колоночной хроматографии для получения очищенного кетона 27 в виде бесцветного масла.
1Н-ЯМР (CDCl3, 400 МГц): δ = 5,42-5,30 (м,4Н), 2,79-2,78 (t,2H), 2,40-2,37 (t,4H), 2,08-2,03 (м,4Н), 1,58-1,54 (м,4Н), 1,36-1,26 (br m, алифатические протоны), 0,91-0,87 (t, 6H).
ИК (см-1) 2924, 2854, 1716, 1465, 1375, 721.
Пример 4. Синтез асимметричных кетонов с С12 цепью.
Свежеактивированную стружку Mg (175 мг, 0,0072 моль) добавляют в сухую 2NRB колбу 50 мл, оборудованную магнитной мешалкой и обратным конденсатором (рефлюкс-конденсатором). Данную установку дегазируют, промывают азотом и добавляют в колбу 10 мл безводного эфира с помощью шприца. Бромид 28 (1,5 г, 0,006 моль) растворяют в безводном эфире (7 мл) и добавляют в колбу по каплям с помощью шприца. Отмечают экзотермическую реакцию (реакцию инициирует дибромэтан) и эфир начинает кипеть. После окончания добавления реакционную смесь выдерживают при температуре 35°С в течение 1 ч и затем охлаждают на ледяной бане до 10-15°С. Цианид 4 (1 г, 0,0036 моль) растворяют в безводном эфире (7 мл) и, помешивая, добавляют капельно в реакционную смесь. Наблюдают экзотермическую реакцию; реакционную смесь кипятят в течение 12 ч и гасят раствором хлорида аммония. Затем смесь обрабатывают 25% раствором HCl до тех пор, пока раствор не становится однородным, после чего слои разделяют. Водную фазу экстрагируют эфиром. Смешанные эфирные слои высушивают и концентрируют для получения неочищенного продукта, который затем очищают с помощью колоночной хроматографии. Фракции чистого продукта выпаривают для получения чистого кетона 29 в виде бесцветного масла. Выход: 0,65 г (26%).
1Н-ЯМР (δ м.д.): 5,388-5,302 (м, 4Н), 2,77-2,74 (t, 2H), 2,38-2,34 (t, 4Н), 2,04-2,01 (м, 4Н), 1,34-1,18 (м, 36Н), 0,89-0,85 (м 6Н).
ИК (см-1): 3009, 2920, 2851, 1711 (С=О), 1466, 1376, 1261.
Пример 5. Синтез асимметричных кетонов с С10 цепью 31.
- 53 037404
Схема 5
Свежеактивированную стружку Mg (266 мг, 0,0109 моль) добавляют в сухую 2NRB колбу объемом 50 мл, оборудованную магнитной мешалкой и обратным конденсатором (рефлюкс-конденсатором). Данную установку дегазируют, промывают азотом, после чего добавляют в колбу с помощью шприца 10 мл безводного эфира. Бромид (2,43 г, 0,0109 моль) растворяют в безводном эфире (7 мл) и добавляют в колбу по каплям с помощью шприца. Отмечают экзотермическую реакцию (реакцию инициирует дибромэтан) и эфир начинает кипеть. После окончания добавления реакционную смесь выдерживают при температуре 35°С в течение 1 ч и затем охлаждают на ледяной бане до 10-15°С. Цианид (1 г, 0,0036 моль) растворяют в безводном эфире (7 мл) и, помешивая, добавляют по каплям в реакционную смесь. Наблюдают экзотермическую реакцию; реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. ТГФ (4 мл) добавляют в реакционную смесь и нагревают до 45-50°С в течении 4 ч до полного расходования цианистых производных. Реакцию гасят добавлением по каплям 3 мл ацетона, после чего добавляют ледяную воду. Реакционную смесь обрабатывают 25% раствором HCl до тех пор, пока раствор не становится однородным, после чего слои разделяют. Водную фазу экстрагируют эфиром. Смешанные эфирные слои высушивают и концентрируют для получения неочищенного продукта, который затем очищают с помощью колоночной хроматографии. Фракции чистого продукта выпаривают для получения чистого кетона в виде бесцветного масла. Выход: 0,93 г МС (61%).
1Н-ЯМР (δ м.д.): 5,37-5,302 (м, 4Н), 2,77 - 2,74 (t, 2H), 2,38 -2,34 (t, 4Н), 2,05-2,00 (м, 4Н), 1,55 - 1,52 (м, 2Н), 1,35 - 1,24 (м, 34Н), 0,89 - 0,84 (м, 6Н).
ИК (см-1): 3009, 2925, 2854, 1717 (С=О), 1465, 1376.
Пример 6. Синтез асимметричных кетонов с холестерином 33.
Используют процедуру, аналогичную той, которая используется для синтеза кетона 31; холестерил хлорид в пересчете на соответствующее количество хлорида магния с последующим добавлением линолеата цианида обеспечивает кетон 33.
Пример 7. Синтез асимметричных кетонов с холестерином 35.
- 54 037404
Схема 7
Обработка холестеролхлороформиата 3-бромопропиламином; предоставляет бромид 34, который превращается в соответственный реактив Гриньяра 34а, который при обработке линолеил цианидом обеспечивает соответствующий асимметричный кетон 35 в хорошем выходе.
Пример 8. Синтез асимметричного кетона 40.
Схема 8
Синтез соединения 37.
Безводный ТГФ (20 мл) в атмосфере азота добавляют при комнатной температуре в двухгорловую круглодонную колбу объемом 500 мл, содержащую LiAlH4 (1,02 г, 0,0269 моль). Суспензию перемешивают в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем охлаждают до 0°С. Раствор соединения 1 (5 г, 0,01798 моль) в безводном ТГФ (50 мл) медленно добавляют в данную смесь, поддерживая при этом внутреннюю температуру 0°С. После окончания добавления реакционную смесь нагревают до температуры окружающей среды и перемешивают в течение 1 ч. Прогресс реакции контролируют методом ТСХ. По завершению реакции смесь охлаждают до 0°С и гасят насыщенным водным раствором Na2SO4. Реакционную смесь перемешивают в течение 30 мин и фильтруют твердый осадок через целитовый слой и промывают этилацетатом (100 мл). Фильтрат и промывной материал смешивают и выпаривают в роторном испарителе для получения соединения 37 в виде бесцветной жидкости, которая используется в таком виде для следующей стадии без какой-либо очистки. Выход: (4,5 г, 95%);
% ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ = 5,39-5,28 (м, 6Н), 3,64-3,61 (t, 2Н), 2,81-2,78 (t, 4H), 2,10-2,01(м, 4Н), 1,59-1,51 (м, 2Н), 1,29-1,22 (м, алифатические протоны), 0,98-0,94 (t, 3Н).
Синтез соединения 38.
Соединение 37 (14 г, 0,0530 моль) растворяют в ДХМ (300 мл) в двухгорловой круглодонной колбе объемом 500 мл и охлаждают до 0°С. Триэтиламин (29,5 мл, 0,2121 моль) медленно добавляют в инертной атмосфере в данный раствор. Затем реакционную смесь перемешивают в течение 10-15 мин и медленно добавляют мезила хлорид (6,17 мл; 0,0795 моль). После окончания добавления реакционную смесь нагревают до температуры окружающей среды и перемешивают в течение 20 ч. Реакцию контролируют методом ТСХ. После завершения реакционную смесь разбавляют водой (200 мл), перемешивают в течение нескольких минут и отделяют органический слой. Далее органическую фазу промывают соляным раствором (1x70 мл), высушивают Na2SO4; растворитель удаляют в роторном испарителе для получения неочищенного соединения 38 в виде коричневого масла, которое используется в таком виде для следующей реакции. Выход: (17 г, 93%).
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ = 5,39-5,31 (м, 6Н), 4,22-4,19 (t, 2Н), 2,99 (s, 3Н), 2,81-2,78 (м, 4Н), 2,082,01 (м, 4Н), 1,75-1,69 (м, 2Н), 1,39-1,29 (м, алифатические протоны), 0,98-0,94 (t, 3Н).
- 55 037404
Синтез соединения 39.
Мезилат 38 (10 г, 0,2923 моль) растворяют в безводном эфире (300 мл) в двухгорловой круглодонной колбе объемом 500 мл; добавляют комлекс MgBr2Et2O (22,63 г, 0,0877 моль) в среде азота. Полученную смесь нагревают до кипения в течение 26 ч. После завершения реакции (по ТСХ) реакционную смесь разбавляют эфиром (300 мл) и ледяной водой (200 мл); эфирный слой отделяют. Органический слой промывают 1% водным раствором K2CO3 (100 мл), а затем соляным раствором (80 мл). После чего органическую фазу высушивают безводным Na2SO4; растворитель выпаривают в вакууме для получения неочищенного материала, который хроматографируют с помощью силикагеля (60-120 меш), используя 01% этилацетат в гексане в качестве элюирующей (извлекающей) системы для получения необходимого соединения 39 в виде масла. Выход: (7 г, 73%).
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ = 5,39-5,31 (м, 6Н), 3,41-3,37 (t, 2Н), 2,81-2,78 (м, 4Н), 2,08-2,02 (м, 4Н), 1,86-1,80 (м, 2Н), 1,42-1,29 (м, алифатические протоны), 0,98-0,94 (t, 3Н).
Синтез асимметричного кетона 40.
Свежеактивированную стружку Mg (0,88 г, 0,03636 моль) добавляют в высушенную на пламени двухгорловую круглодонную колбу объемом 500 мл, оборудованную магнитной мешалкой и обратным конденсатором. Данную установку дегазируют, промывают аргоном, после чего в колбу добавляют 150 мл эфира. Несколько капель соединения брома 4 (11,89 г, 0,03636 моль) в 50 мл эфира добавляют в начале для инициации реакции (обратить внимание: каталитическое количество 1,2-дибромоэтана также добавляют для ускорения формирования реактива Гриньяра). После инициации оставшийся раствор соединения брома медленно добавляют в кипящий эфирный раствор. После полного добавления реакционную смесь кипятят при температуре 40°С в течение 1,5 ч. Затем охлаждают до 10°С и добавляют по каплям линолеил цианид 4 (5 г, 0,01818 моль) в 30 мл сухого эфира, полученную смесь нагревают до кипения на протяжении 20 ч при температуре 40°С. Развитие реакции контролируют методом ТСХ. После полного потребления производных цианида 40 (в соответствии ТСХ) полученную смесь охлаждают до комнатной температуры и гасят 30 мл ацетона, а затем 50 мл ледяной воды. Далее указанный раствор подкисляют 10% раствором соляной кислоты и отделяют эфирный слой. Водную фазу экстрагируют диэтиловым эфиром (2x100 мл). Высушивают безводным Na2SO4, удаляют растворитель и получают неочищенный (сырьевой) кетон, который очищают колоночной хроматографией с силикагелем (100-200 меш), используя 0-5% эфир в гексане в качестве элюирующей системы, для получения названного соединения 40 в виде бледно-желтого масла. Выход: (4,8 г, 50,5%).
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ = 5,38-5,28 (м, 10Н), 2,80-2,74 (м, 6Н), 2,38-2,34 (t, 4H), 2,08-2,00 (м, 8Н), 1,55-1,52 (м, 4Н), 1,35-1,26 (м, алифатические протоны), 0,98-0,94 (t, 3Н), 0,89-0,85 (t, 3Н). ВЭЖХ98,04%.
Пример 9. Синтез олигонуклеотидов.
Все олигонуклеотиды синтезируют в АКТА-олигопилот синтезаторе. Для синтеза олигонуклеотидов используют коммерчески доступный контролируемый пористый стеклянный твердый носитель (dTCPG, 500 A, Prime Synthesis) и РНК фосфорамидиты со стандартными защитными группами, 5'-ОдиметоксиΊритил-N6-бензоил-2'-t-бутилдиметилсилил-аденозин-3'-O-N,N'-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит, 5'-О-диметоксиΊритил-N4-ацетил-2'-t-бутилдиметилсилил-аденозин-3'-О-N,N'-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит, 5'-О-диметокситритил-N2-изобутрил-2'-t-бутилдиметилсилиладенозин-3'-O-N,N'-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит и 5'-О-диметокситритил-2'-t-бутилдиметилсилил-аденозин-3'-O-N,N'-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит (Pierce Nucleic Acids Technologies). 2'-Е-фосфорамидиты, 5'-О-диметокситритил-N4-ацетил-2'-фтор-цитидин-3'-O-N,N'-диизопропил-2-цианоэтил-фосфорамидит и 5'-О-диметокситритил-2'-фтор-уридин-3'-О,N,N'-диизопропил-2-цианоэтилфосфорамидит закупают у производителя (Promega). Все фосфорамидиты используют в концентрации 0,2М в ацетонитриле (CH3CN), за исключением гуанозина, который был использован в концентрации 0,2М в 10% ТГФ/КНС (объемное содержание). Применяют время связывания/переработки 16 мин. В качестве активатора используют 5-этил тиотетразол (0,75М, American International Chemicals), для РОокисления используют йод/вода/пиридин и для PS-окисления используют PADS (2%) в 2,6-лутидин/КНС (в объемном соотношении 1:1).
3'-Лиганд конъюгированные цепи синтезируют с использованием твердого носителя, содержащего соответствующий лиганд. Например, введение единицы холестерина в последовательность выполняют из гидроксипролинол-холестерина фосфорамидиат.
Холестерин привязывают к транс-4- гидроксипролинолу посредством 6-аминогексаноатной связи для получения гидроксипролинол-холестериновой части. 5'-Су-3 и Су-5.5 (фторофор) меченной миРНК, синтезированной из соответствующего Квазар-570 (Су-3) фосфорамидита, который закупают у Biosearch Technologies. Конъюгацию лигандов к 5'-концу и/или внутреннему положению достигают путем использования соответствующим образом защищенного лиганд-фосфорамидит строительного блока. Соединение в течение 15-мин 0,1М раствора фосфорамидита в безводном CH3CN в присутствии 5-(этилтио)-1Нтетразола активатора к твердой связи олигонуклеотида. Окисление межнуклеотидного фосфита в фосфат проводят с использованием стандартного водного раствора йода, как сообщалось (1), или путем обработ- 56 037404 ки трет-бутил-гидропериксида/ацетонитрила /воды (10:87:3) с 10-минутным периодом ожидания окисления коньюгированного олигонуклеотида. Фосфоротиоат вводят при окислении фосфита до фосфоротиоата с помощью серного трансфер реагента, такого как КДТТ (закупают у AM Chemicals), PADS и/или
Beaucage реагент. Холестерола фосфорамидит синтезируют в фирме и используют в концентрации 0,1М в дихлорметане. Время связывания для холестерола фосфорамидита составляет 16 мин.
После завершения синтеза носитель перемещают в стеклянную бутыль емкостью 100 мл (VWR). Олигонуклеотид отщепляют от поддержки с одновременным снятием защиты оснований и фосфатных групп с 80 мл спиртовой смеси аммиака [аммиак:этанол (3:1)] на протяжении 6,5 ч при температуре 55°С. Бутыль кратковременно охлаждают во льду, а затем спиртовую смесь аммиака отфильтровывают в нову бутыль объемом 250 мл. CPG промывают дважды смесью этанола/воды 40 мл (в соотношении 1: 1 по объему). Объем смеси уменьшают приблизительно до 30 мл на роторном испарителе. Затем смесь замораживают и высушивают в вакууме на скоростном испарителе.
Высушенный осадок ресуспендируют в 26 мл триэтиламина, триэтиламина тригидрофторида (ТЭА 3-ГФ) либо пиридин-HF и ДМСО (3:4:6) и нагревают при температуре 60°С в течение 90 мин, чтобы удалить трет-бутилдиметилсилил (ТБДМС) группы во 2-й позиции. Затем реакционную смесь гасят с помощью 50 мл 20 мМ ацетата натрия; доводят уровень рН до 6,5 и хранят в морозильнике до очистки.
Олигонуклеотиды исследуют методом жидкостной хроматографии с высоким разрешением (ВЭЖХ) перед очисткой, отбор буфера и столбцов зависят от природы последовательности и/или конъюгированных лигандов.
Лиганд-конъюгированные олигонуклеотиды очищают обратно-фазовой подготовительной ВЭЖХ. Неконъюгированные олигонуклеотиды очищают анион-обменной ВЭЖХ на TSK гелевой (полистерольный гель) колонке, упакованной в отделении. В качестве буферов используют 20 мМ фосфата натрия (рН 8,5) в 10% CH3CN (буфер А) и 20 мМ фосфата натрия (рН 8,5) в 10% СН3 CN, 1M NaBr (буфер В). Фракции, содержащие полномерные олигонуклеотиды, объединяют, обессоливают и лиофилизируют. Примерно 0,15 OD из обессоленных олигонуклеотидов разводят в воде до 150 мл, а затем переносят пипеткой в специальные емкости для КГЭ и ЖХ/МС анализов. Соединения окончательно анализируют с помощью ЖХ-ЭСМС и КГЭ.
Для приготовления миРНК эквимолярные количества смысловых и антисмысловых цепей нагревают в 1xPBS при 95°С в течение 5 мин и медленно охлаждают до комнатной температуры. Целостность дуплексов подтверждают с помощью ВЭЖХ анализа.
Таблица 7
Двойные спирали миРНК для Luc и FVII мишеней
Дуплекс Смысловые / Антисмысловые Последовательность 5 -3' Иде нт ифика ционн ый Ns после доват ельно сти: Мишень
1000/2434 CUU ACG CUG AGU ACU UCG AdTdT U*CG AAG fUAC UCA GCG fUAA GdT*dT Luc
2433/1001 C*UfU ACG CUG AGfU ACU UCG AdT*dT UCG AAG UAC UCA GCG UAA GdTdT Luc
2433/2434 C*UfU ACG CUG AGfU ACU UCG AdT‘dT U*CG AAG fUAC UCA GCG fUAA GdT*dT Luc
1000/1001 CUU ACG CUG AGU ACU UCG AdTdT UCG AAG UAC UCA GCG UAA GdTdT Luc
AD1596 GGAUCAUCUCAAGUCUUACdTdT GUAAGACUUGAGAUGAUCCdTdT FVII
AD1661 GGAfUfCAfUfCfUfCAAGfUfCfUfUAfCdTsdT GfUAAGAfCfUfUGAGAfUGAfUfCfCdT*dT FVII
Примечание: L8 является нижняя строка является 2'-О-метил-модифицированным нуклеотидом, * является фосфоротиоатными скелетными соединениями, fN является -2'-фторнуклеотидом, dN является -2'-дезоксинуклеотидом.
Пример 10/ Химический анализ сывороточной стабильности для миРНК.
Химический анализ пропускной способности среды для исходной селекции стабильности, основанной на последовательности оснований, проводят методом stains all. Для выполнения химического анализа дуплекс миРНК инкубируют в 90% человеческой сыворотке при температуре 37°С. Образцы реакционной смеси гасят в различные точки времени (на 0-й минуте, 15-й, 30-й, 60-й, 120-й и 240-й минутах) и производят анализ методом электрофореза (фиг. 1). Расщепление РНК во время проведения теста дает
- 57 037404 информацию о восприимчивости дуплекса миРНК к разрушению сывороточной нуклеазой.
Радиоактивно меченные дцРНК и химический анализ сывороточной стабильности используют для прогноза дальнейшего характера расщепления миРНК. Изначально дуплекс миРНК метят 32Р в 5' положении либо на смысловой, либо на антисмысловой цепочке. Меченый дуплекс миРНК инкубируют в 90% сыворотке крови человека при температуре 37°С и образцы раствора извлекают для анализа и гасят в различные моменты времени по нарастающей. Образцы анализируют методом электрофореза.
Пример 11. Оценивание FVII in vivo с использованием липосом, производных катионных липидов.
In vivo эксперименты: фактор VII грызунов и АпоВ сайленсинг.
C57BL/6 мыши (Charles River Labs, MA) и Спраг-Доли крысы (Charles River Labs, MA) получают либо изотонический раствор хлорида натрия, либо миРНК в желаемых соединениях в виде инъекции в хвостовую вену в объеме 0,01 мл/г. В разные моменты времени после введения животным проводят ингаляционную анестезию изофтораном и отбирают образцы крови ретроорбитальным методом в пробирки для отделения сыворотки. Сывороточные уровни белка фактора VII определяют в образцах методом хромогенного анализа (Coaset Factor VII, DiaPharma Group, ОН или Biophen FVII, Aniara Corporation, ОН) в соответствии с протоколами производителя. Стандартную кривую генерируют, используя сыворотку подопытных животных, пролеченных изотоническим раствором. В тех экспериментах, где оценивают уровень печеночной мРНК, в различные моменты времени после введения животных умерщвляют, а извлеченную печень немедленно замораживают в жидком азоте. Замороженную печеночную ткань измельчают в порошок. Подготавливают тканевые лизаты, определяют уровни фактора VII и апоВ печеночной мРНК с помощью разветвленного ДНК анализа (QuantiGene Assay, Panomics, CA).
Пример 12. Приготовление 7,2-ди-О-алкил-сн3-карбомоилглицерида (ПЭГ-ДМГ).
ro^'^oh
R'6 la R = С14Н29 lbR = C16HM lc R - C10H37
R'
ДСК, ТЭА ДХМ 0°C-RT
OMe
III mPEGsiMo-NHj
OMe
Ila R - C14H2& HbR = C16H33 lie R - C18H37
Ру/ДХМ
O°C-RT
IVa R = C14H29
IVb R = C16H33
IVcR = C18H37
Приготовление Iva.
1,2-ди-О-Тетрадецил-сн-глицерид Ia (30 г, 61,80 ммоль) и N,N'-суцинимидилкарбоант (ДСК, 23,76 г, 1,5 экв.) помещают в дихлорметан (ДХМ, 500 мл) и перемешивают на водно-ледяной смеси. Триэтиламин (ТЭА, 25,30 мл; 3 экв.) добавляют в перемещиваемый раствор, после чего реакционную смесь перемешивают в течение ночи при температуре окружающей среды. Прогресс реакции контролируют методом ТСХ. Реакционную смесь разбавляют ДХМ (400 мл); органический слой промывают водой (2x500 мл) и водным раствором NaHCO3 (500 мл) после стандартной процедуры. Полученный остаток высушивают при температуре окружающей среды в вакууме в течение ночи. После высыхания неочищенной карбонат Ма, полученный на предыдущем этапе, растворяют в дихлорметане (500 мл) и перемешивают на ледяной бане. К перемешанному раствору добавляют мПЭГ2000-ИН2 (III, 103,00 г, 47,20 ммоль, приобретен в NOF Corporation, Japan) и безводный пиридин (Ру, 80 мл, избыток) в среде аргона. После этого реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Удаляют в вакууме растворители и летучие вещества; остаток растворяют в ДХМ (200 мл); заряжают в колонке с силикагелем, упакованным в этилацетат. Колонку изначально элюируют этилацетатом, после метанолом, с градиентом 5-10% в дихлорметане для получения необходимого ПЭГ-липида IVa в виде белого твердого вещества (105,30 г, 83%).
1Н ЯМР (CDCl3, 400 МГц) δ = 5,20-5,12 (м, 1Н), 4,18-4,01 (м, 2Н), 3,80-3,70 (м, 2Н), 3,70-3,20 (м, -ОСН2-СН2-О-, ПЭГ-СН2), 2,10-2,01 (м, 2Н), 1,70-1,60 (м, 2Н), 1,56-1,45 (м, 4Н), 1,31-1,15 (м, 48Н), 0,84 (t, J= 6,5 Гц, 6Н).
МС выявленный диапазон: 2660-2836.
Приготовление Ivb.
1,2-ди-О-Гексадецил-сн-глицерид Ib (1,00 г, 1,848 ммоль) и ДСК (0,710 г, 1,5 экв.) вместе помещают в дихлорметан (20 мл) и охлаждают до 0°С на смеси льда и воды. Триэтиламин (1,00 мл; 3 экв.) добавляют, после чего реакционную смесь перемешивают в течение ночи. Реакция сопровождается ТСХ, реакционную смесь разбавляют ДХМ; дважды промывают водой, раствором NaHCO3 и высушивают натрия сульфатом. Растворители удаляют при пониженном давлении; полученный остаток IIb помещают в вакуум на ночь. Полученное соединение непосредственно используют в последующей реакции без дальней
- 58 037404 шего очищения. МПЭГ2000-ИН2 III (1,50 г, 0,687 ммоль, закупленный у NOF Corporation, Japan) и IIb (0,702 г, 1,5 экв.) растворяют в дихлорметане (20 мл) в среде аргона. Реакцию охлаждают до 0°С. Пиридин (Ру, 1 мл, избыток) добавляют и перемешивают в течение ночи. Прохождение реакции контролируют с помощью ТСХ. Удаляют в вакууме растворители и летучие вещества, остаток очищают с помощью хроматографии (вначале этилацетатом, затем 5-10% МеОН/ДХМ в качестве градиентного элюирования) для получения необходимого соединения IVb в виде белого твердого вещества (1,46 г, 76%).
1Н ЯМР (CDCl3, 400 МГц) δ = 5,17 (t, J= 5,5 Гц, 1Н), 4,13 (dd, J=4,00 Гц, 11,00 Гц, 1Н), 4,05 (dd, J= 5,00 Гц, 11,00 Гц, 1Н), 3,82-3,75 (м, 2Н), 3,70-3,20(м, -О-СН2-СН2-О-, ПЭГ-СН2), 2,05-1,90 (м, 2Н), 1,801,70 (м, 2Н), 1,61-1,45 (м, 6Н), 1,35-1,17 (м, 56Н), 0,85 (t, J= 6,5 Гц, 6Н).
Выявленный МС диапазон: 2716-2892.
Приготовление Ivc.
1,2-ди-О-Октадецил-сн-глицерид Ic (4,00 г, 6,70 ммоль) и ДСК (2,58 г, 1,5 экв.) вместе помещают в дихлорметан (60 мл) и охлаждают до 0°С на смеси льда и воды. Триэтиламин (2,75 мл; 3 экв.) добавляют, после чего реакционную смесь перемешивают в течение ночи. За реакцией следует ТСХ, реакционную смесь разбавляют ДХМ; дважды промывают водой, раствором NaHCO3 и высушивают натрия сульфатом. Растворители удаляют в среде с пониженным давлением; полученный остаток IIb помещают в вакуум на ночь. Полученное соединение непосредственно используют в последующей реакции без дальнейшего очищения. МПЭГ2000-ИН2 III (1,50 г, 0,687 ммоль, закупленный у NOF Corporation, Japan) и IIc (0,760 г, 1,5 экв.) растворяют в дихлорметане (20 мл) в среде аргона. Реакцию охлаждают до 0°С. Пиридин (1 мл, избыток) добавляют и перемешивают в течение ночи. Реакцию контролируют с помощью ТСХ. Удаляют в вакууме растворители и летучие вещества, остаток очищают с помощью хроматографии (изначально этилацетатом, затем 5-10% МеОН/ДХМ в качестве градиентного элюирования) для получения необходимого соединения IVc в виде белого твердого вещества (0,92 г, 48 %).
1Н ЯМР (CDCl3, 400 МГц) δ = 5,22-5,15 (м, 1Н), 4,16 (dd, J= 4,00 Гц, 11,00 Гц, 1H), 4,06 (dd, J= 5,00 Гц, 11,00 Гц, 1Н), 3,81-3,75 (м, 2Н), 3,70-3,20 (м, -О-СН2-СН2-О-, ПЭГ-СН2), 1,80-1,70 (м, 2Н), 1,60-1,48 (м, 4Н), 1,31-1,15 (м, 64Н), 0,85 (t, J= 6,5 Гц, 6Н).
Выявленный МС диапазон: 2774-2948.
Пример 13.
Синтез 2005.
В раствор 2004 (50 г, 95 ммоль) в ДХМ (400 мл) в атмосфере аргона добавляют ТЭА (53 мл, 378 ммоль) и ДМАП (1,2Г, 9,5 ммоль) и перемешивают при комнатной температуре в атмосфере аргона. Реакционную массу охлаждают до -5°С и медленно добавляют раствор мезила хлорида (15 мл, 190 ммоль) в ДХМ (100 мл) при температуре ниже -5°С, после добавления нагревают до комнатной температуры. Через 30 мин (ТСХ), реакционную массу гасят ледяной водой (20 мл). Органический слой отделяют, промывают 1н. HCl (30 мл), водой, соляным раствором, высушивают сульфатом натрия и выпаривают при пониженном давлении для получения чистого продукта (55 г, 95,5%) в виде желтой жидкости.
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3): δ 0,89 (t, 6Н, J = 6,8), 1,2-1,5 (м, 36Н), 1,67 (м, 4Н), 2,05 (q, 8H, J1 = 6,8, J2 = 6,8), 2,77 (t, 4Н, J = 6,4), 2,99 (s, 3Н), 4,71 (м, 1H) и 5,36 (м, 8Н).
Синтез 2006.
В раствор 2005 (50 г, 82 ммоль) в ДМФА (500 мл) в атмосфере аргона добавляют NaN3 (27 г, 410 ммоль) и нагревают до 70°С и поддерживают данную температуру на протяжении 4 ч (ТСХ). Полученную смесь разводят водой и экстрагируют этилацетатом (3x250 мл). Органический слой промывают водой, соляным раствором, высушивают Na2SO4 и выпаривают при пониженном давлении для получения неочищенного продукта, который затем очищают при помощи хроматографии силикагелем с использованием гексана/эфира к качестве элюента. Полученный продукт элюируют 2% эфиром гексана для получения 2006 (36 г, 86%) в виде бледно-желтой жидкости.
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3): δ 0,90 (t, 8H), 1,30 (м, 36Н), 1,49 (t, 4Н, J = 6,4 Гц), 2,04 (q, 8Н, J1 = 7,6, J2= 14 Гц), 2,77 (t, 4Н, J = 6,4 Гц), 3,22 (м, 1H), 5,34 (м, 8Н).
13С ЯМР (400 МГц, CDCl3): δ 14,1, 22,5, 25,6, 26,1, 27,2, 29,2, 29,3, 29,45, 29,65, 31,5, 34,1, 63,1, 127,9 и 130,1.
ИК (KBr): 2098.
- 59 037404
Пример 14. Технология приготовления миРНК с использованием подготовленных везикул.
Частицы, содержащие катионные липиды, создают, используя способ подготовленных везикул. Катионные липиды, ДСФХ, холестерол и ПЭГ-липиды растворяют в этаноле с молярным соотношением 40/10/40/10 соответственно. Липидную смесь добавляют к водному буферу (50 мМ цитрата, рН 4), перемешивают до конечной концентрации этанола и липидов 30% (об./об.) и 6,1 мг/мл, соответственно, и оставляют для уравновешивания смеси при комнатной температуре в течение 2 мин перед экструзией. Гидратированные липиды экструдируют при температуре 22°С через дважды сложенный фильтр с пористостью 80 нм (Nuclepore), с использованием Lipex экструдера (Northern Lipids, Vancouver, ВС) до получения пузырьков диаметром 70-90 нм, как определено с помощью Nicomp анализа. Для этого обычно требуется 3 прохождения. Для некоторых смесей катионных липидов, которые не образуют мелкие пузырьки, гидратирование липидной смеси буфером с более низким рН (50 мМ цитрат, рН 3) для протонирования фосфатной группы на ДСФХ головной группы способствует формированию стабильных пузырьков 70-90 нм.
FVII миРНК (растворенный в 50 мМ цитрата, рН 4 водном растворе, содержащем 30% этанола) добавляют к везикулам, предварительно уравновешенным до 35°С, при скорости ~5мл/мин, со смешиванием. После конечного отношения целевая миРНК/липид, которое составляет 0,06 (мас./мас.) смесь инкубируют последующие 30 мин при температуре 35°С для реорганизации пузырьков и инкапсулирования FVII миРНК. Этанол затем удаляют и внешний буфер заменяют PBS (155 мМ NaCl, 3 мМ Na2HPO4, 1мМ KH2PO4, рН 7,5) либо с помощью диализа, либо тангенциальной проточной диафильтрацией. Окончательное соотношение инкапсулированной миРНК к липиду определяют после удаления неинкапсулированной миРНК с использованием размер-эксклюзионных спин-колонок либо ионно-обменных спинколонок.
Пример 15. Определения эффективности липидных формул in vivo.
Тестовые композиции первоначально оценивают по их FVII разрушению у самок мышей C57BI/6 в возрасте 7-9 недель, с массой 15-25 г в дозировках 0,1, 0,3, 1,0 и 5,0 мг/кг с 3 особями мышей в каждой группе лечения. Все исследования включают животных, получающих либо фосфатный буферный раствор (ФБР, контрольная группа), либо тестируемую композицию. Соединение разбавляют до необходимой концентрации в ФБР непосредственно перед проведением испытания. Мышей взвешивают и рассчитывают соответствующий объем вводимой дозы (10 мл/г массы тела). Тестируемые и контрольные композиции, т.е. ФБР (для контрольной группы животных), вводят внутривенно через латеральную хвостовую вену. Спустя 24 ч животных анестезируют посредством внутрибрюшинного введения кетамина/ксилазина и у них набирают 500-700 мл крови посредством внутрисердечной пункции в пробирку для сепарации сыворотки крови (BD Microtainer). Кровь центрифугируют при 2000 об. в течение 10 мин при температуре 15°С; сыворотку собирают и хранят при -70°С до проведения анализа. Образцы сыворотки размораживают при 37°С в течение 30 мин, разводят в ФБР и разделяют на 96-луночных планшетах для анализа. Уровни фактора VII оценивают хромогенным анализом (Biophen FVII набор, Hyphen BioMed) в соответствии с инструкциями производителя; абсорбция измеряется в микропланшетном счетчике, оснащенном фильтром с длиной волны 405 нм. Уровни плазменного FVII измеряют количественно и уровни ED50 (доза, обеспечивающая 50% снижение уровней FVII в плазме по сравнению с контрольной группой животных) рассчитывают по стандартной кривой, построенной, основываясь на объединенных результатах образцов сыворотки от контрольных животных. Композиции, представляющие интерес, демонстрируют высокие уровни FVII нокдауна (ED50 <<0,1 мг/кг) повторно тестируют в независимых исследованиях в более низком диапазоне доз для подтверждения эффективности и установления ED50.
Фиг. 3 представляет таблицу ЕС50 типичных соединений, которые тестируют с помощью этого метода.
Пример 15А. Определение рКа липидных соединений.
рКа различных ионизируемых катионных липидов, по существу, определяют, как описано в работах (Eastman et al. 1992, Biochemistry 31:4262-4268), с помощью флуоресцентного зонда 2-(р-толуидино)-6нафталенсульфоновой кислоты (ТНС), который является нефлуоресцентным в воде, но становится заметно флуоресцентным, когда связан с мембранами. Пузырьки, состоящие из катионного липида/ДСФХ/ СН/ПЭГ-с-ДОМГ (40:10:40:10 молярное соотношение) разбавляют до 0,1 мМ в буферах (130 мМ NaCl, 10 мМ CH3COONH4, 10 мМ МЭС, 10мМ HEPES) при различных рН, от 2 до 11. Аликвоту водного раствора ТНС (1 мкМ конечный) добавяют в разбавленные пузырьки и после 30-секундного периода уравновешивания флуоресцент ТНС-содержащего раствора измеряется при возбуждении и излучении длины волны 321 нм и 445 нм соответственно. рКа везикул, содержащих катионные липиды, определяют путем построения зависимости измеряемой флуоресценции от рН растворов и приведение данных к сигмоидальной кривой с использованием коммерческой графической программы IgorPro. Фиг. 3 представляет таблицу, изображающую рКа типичных соединений, которые тестируют с помощью этого метода.
- 60 037404
Пример 16. Синтез гуанидин-связанных липидов.
Аналоги гуанидина.
Приготовление соединения 7204.
Получение соединения 7013.
Смесь из 1,2,4-бутанетриола (7012, 21,2 г, 200 ммоль, 5,0 экв.), дилинолеил кетона (21,0 г, 40,0 ммоль, 1,0 экв.) и р-толуолсульфокислоты (0,76 г, 4,0 ммоль, 0,1 экв.) в толуоле нагревают с водоотделителем в условиях Дина-стока в течение ночи. После завершения реакцию охлаждают, испаряют растворитель и очищают с помощью колоночной хроматографии с использованием гексана и этилацетата (15%), таким образом, чтобы градиенты дали заданный кеталь (7013) в 47%-м выходе в виде масла.
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ 5,48-5,24 (м, 8Н), 4,32-4,17 (м, 1H), 4,08 (dd, J= 7,8, 6,1, 1H), 3,86-3,74 (м, 2Н), 3,53 (t, J= 8,0, 1Н), 2,77 (t, J= 6,4, 4Н), 2,30-2,19 (м, 1Н), 2,05 (q, J= 6,8, 8Н), 1,88-1,75 (м, 2Н), 1,69-1,51 (м, 4Н), 1,42-1,19 (м, 36Н), 0,89 (t, J= 6,8, 6Н).
Рассчитанная масса для С41Н74О3 составляет 614,5; обнаруженная 637,3 (+Na).
Синтез соединения 7201.
К раствору соединения 7013 (11,6 г, 18,9 ммоль, 1,0 экв.) и триэтиламина (5,45 мл, 37,7 ммоль, 2,0 экв.) в дихлорметане при температуре 0°С добавляют по каплям раствор метансульфонилхлорида (1,74 мл, 22,67 ммоль, 1,2 экв.), реакция продолжается при комнатной температуре в течение 1 ч. После завершения реакции смесь промывают водой, соляным раствором, а комбинированные органические вещества высушивают с помощью MgSO4. Концентрированную смесь очищают колоночной хроматографией с использованием гексана и этилацетата (20%) в качестве градиента, чтобы получить чистое производное мезилата (7201) в виде масла в 93% выходе.
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ 5,48 - 5,22 (м, 8Н), 4,35 (qd, J= 10,0, 4,9, 2Н), 4,25-4,14 (м, 1Н), 4,13 4,03 (м, 1Н), 3,53 (t, J= 7,6, 1Н), 3,02 (s, 3Н), 2,77 (t, J=6,4, 4H), 2,13-1,85 (м, 10Н), 1,57 (dd, J= 18,2, 9,2, 4Н), 1,44 - 1,15 (м, 36Н), 0,89 (t, J = 6,7, 6Н).
Расчетная масса для C42H76O5S составляет 693,1; обнаруженная 693,2.
Синтез соединения 7202.
К раствору соединения 7201 (2,0 г, 3,0 ммоль, 1,0 экв.) в ДМФА при комнатной температуре добавляют твердый NaN3 (0,98 г 15,0 ммоль 5,0 экв.) и реакция продолжается при температуре 65°С до завершения. Реакционную смесь выливают в ледяную воду, экстрагируют в этиловом ацетате, комбинированные органические вещества высушивают с помощью Na2SO4, концентрируют, очищают с помощью колоночной хроматографии, используя гексан и этилацетат (5%) в качестве градиентов, чтобы получить чистые производные азида (7202) в 89% выходе.
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ 5,53 - 5,19 (м, 8Н), 4,21 - 3,97 (м, 2Н), 3,57 - 3,29 (м, 3Н), 2,76 (t, J = 6,4, 4Н), 2,04 (q, J= 6,8, 8Н), 1,80 (м, 2Н), 1,66-1,43 (м, 4Н), 1,40 - 1,07 (м, 36Н), 0,88 (t, J = 6,8, 6H).
Рассчетная масса для C4iH73N3O2 составляет 640,0; обнаруженная 612,5 (-N2).
Синтез соединения 7203.
К раствору соединения 7202 (1,7 г, 2,65 ммоль, 1,0 экв.) в безводном тетрагидрофуране добавляют по каплям 1М раствора ЛАГ (3,98 мл, 3,98 ммоль, 1,5 экв.) при температуре 0°С. Реакция продолжается при комнатной температуре, после завершения реакцию медленно гасят насыщенным раствором Na2SO4 при температуре 0°С. Состав экстрагируют в избыточном количестве этилацетата, органический слой промывают соляным раствором, высушивают Na2SO4, концентрируют и далее высушивают в вакууме, чтобы получить чистый амин (7203) с 90% выходом, который затем используют непосредственно без дальнейшейшей очистки.
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ 5,51 - 5,16 (м, 8Н), 4,13 (dd, J= 9,3, 3,6, 1Н), 4,03 (dd, J= 7,5, 6,1, 1Н), 3,46 (t, J= 7,8, 1H), 2,96 - 2,67 (м, 6Н), 2,20 - 1,92 (м, 8Н), 1,82 - 1,49 (м, 6Н), 1,46 - 1,12 (м, 38Н), 0,88 (t, J = 6,8, 6Н).
- 61 037404
Расчетная масса для C41H75NO2 составляет 614,0; обнаруженная 614,5.
Синтез соединения 7204 (ALNY-232).
К раствору амина 7203 (0,61 г, 1,0 ммоль, 1,0 экв.) и ДИПЭА (1,84 мл, 10,0 ммоль, 10,0 экв.) в смеси растворителей (ДХМ:ДМФА) добавляют при комнатной температуре в атмосфере аргона порциями 1Hпиразол-1-карбоксамидина гидрохлорид (1,46 г, 10,0 ммоль, 10,0 экв.). Реакция продолжается в течение ночи, после завершения реакции смесь выливают на лед и экстрагируют с этилацетатом. Объединенные органические слои промывают водой, соляным раствором, высушивают Na2SO4 и очищают с помощью препаративной хроматографии, чтобы получить чистые 0,16 г (25%) производные гуанидина (7204).
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ 11,76 (s, 1Н), 7,99 (t, J = 6,3, 1Н), 7,44 (s, 2H), 5,48 - 5,20 (м, 8Н), 4,24 4,00 (м, 2Н), 3,54 (dd, J = 7,3, 6,2, 1H), 3,32 (d, J = 3,0, 2Н), 3,09 (dt, J = 10,5, 5,3, 1H), 2,76 (t, J = 6,5, 4H), 2,03 (q, J = 6,8, 8H), 1,90 - 1,77 (м, 1H), 1,76 - 1,49 (м, 6Н), 1,48- 1,05 (м, 34Н), 0,87 (dd, J = 6,8, 6Н).
13С ЯМР (101 МГц, CDCl3) δ 158,96, 130,41, 130,36, 130,33, 128,18, 128,14, 113,52, 77,54, 77,22, 76,90, 76,60, 72,36, 69,54, 46,09, 38,39, 37,68, 37,01, 34,09, 31,74, 30,10, 29,92, 29,78, 29,76, 29,56, 29,55, 29,53, 27,47, 27,46, 27,41, 25,84, 24,37, 24,12, 22,79, 14,31, 8,86.
Расчетная масса для C42H77N3O2 составляет 656,0; обнаруженная 656,2.
Пример 17. Синтез эфир-связанных липидов.
Аналоги эфира.
Схема 1
Экспериментально.
Соединение 7002. Магний (711 мг, 29,25 ммоль) помещают в круглодонную колбу, добавляют ТГФ (30 мл) и 2-3 мг I2. Смесь нагревают при температуре 50°С и медленно добавляют олеилбромид (7001, 6,46 г, 19,50 ммоль). Когда добавлен ~1 мл олеилбромида, инициируется образование реактива Гриньяра. После добавления остатка олеилбромида реактив Гриньяра перемешивают при комнатной температуре в течение 60 мин, затем медленно добавляют в раствор 1,1'-карбонилдиимидазол (1,54 г, 9,51 ммоль) в ТГФ (100 мл) при температуре - 50°С. Реакционную смесь выдерживают, перемешивая в течение 30 мин при температуре -50°С, затем в течение 60 мин при комнатной температуре. Реакцию гасят с помощью 40 мл насыщенного водного NH4Cl, смесь экстрагируют Et2O и Н2О. Органический слой высушивают MgSCM, фильтруют и концентрируют. Сырье очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (0-5% Et2O в гексане) для получения соединения 7002 (2,70 г, 5,09 ммоль, 53%, Rf = 0,48 разработанный с 5% EtOAc в гексане).
Молекулярная масса для C37H7iO (М+Н)+рассчитанная 531,55, обнаруженная 531,5.
Соединение 7003. К раствору соединения 7002 (1,36 г, 2,56 ммоль) в ТГФ (25 мл), при температуре 0°С добавляют 1М литий алюминий гидрида в ТГФ (5,12 мл, 5,12 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 3 ч. Реакцию гасят насыщенным водным Na2SO4 (20 мл), затем экстрагируют Et2O и Н2О. Органический слой высушивают MgSO4, фильтруют и концентрируют. Сырье очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (0-5% Et2O в гексане) для получения соединения 7003 (942 мг, 1,77 ммоль, 69%, Rf = 0,26 разработанный с 5% EtOAc в гексане).
Соединение 7003. К раствору соединения 7002 (136 г, 2.56 ммоль) в ТГФ (25 мл), при температуре 0°С добавляют 1М литий алюминий гидрида в ТГФ (5,12 мл, 5,12 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 3 ч. Реакцию гасят насыщенным водным Na2SO4 (20 мл), затем экстрагируют Et2O и Н2О. Органический слой высушивают MgSO4, фильтруют и концентрируют. Сырье очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (0-5% Et2O в гексане) для получения соединения 7003 (942 мг, 1,77 ммоль, 69%, Rf = 0,26 разработанный с 5% EtOAc в гексане).
Соединение 7004.
К раствору соединения 7003 (940 мг, 1,76 ммоль) и гидрохлориду 4-(диметиламино)масляной кислоты (355 мг, 2,12 ммоль) в CH2Cl2 (15 мл) добавляют диизопропилэтиламин (0,920 мл, 5,28 ммоль), N(3-диметиламиноnропил)-N-этилкарбодиимида гидрохлорид (406 мг, 2,12 ммоль) и ДМАП (43 мг, 0.352 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 14 ч.
Реакционную смесь разбавляют CH2Cl2 (100 мл), промывают насыщенным водным NaHCO3 (50 мл). Органический слой высушивают с помощью MgSO4, фильтруют и концентрируют. Сырье очищают колоночной хроматографией на силикагеле (0-5% МеОН в CH2Cl2) для получения соединения 7004 (817 мг,
- 62 037404
1,26 ммоль, 72%, Rf = 0,29 разработанный с 5% МеОН в CH2Cl2).
Молекулярная масса C43H84NO2 (M+H)+ рассчитанная 646,65, обнаруженная 646,5.
Схема 4
Соединение 7017. К взболтанному раствору кетона 7016 (1,5 г, 2,84 ммоль, 1,0 экв.) в метаноле и ТГФ (2:1) при температуре 0°С добавляют порциями твердый NaBH4 (0,16 г, 4,26 ммоль, 1,5 экв.) и продолжают реакцию до окончания при комнатной температуре. Реакцию гасят добавлением по каплям раствора 2н. HCl при ледяной температуре, органический растворитель выпаривают и повторно растворяют в этилацетате, промывают водой, соляным раствором объединенные органические слои, высушивают MgSO4 концентрируют и очищают с помощью колоночной хроматографии с использованием гексана: этилацетата (20%) в качестве градиента, чтобы получить чистый спирт 7017 в 94% (1,42 г) выходе.
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ 5,49-5,20 (м, 6Н), 3,57 (s, 1Н), 2,76 (t, J= 6,4, 2Н), 2,13-1,88 (м, 9Н), 1,511,12 (м, 53Н), 0,95-0,75 (м, 6Н).
Расчетная масса для С37Н70О: 530,5; обнаруженная 531,5.
Соединение 7018.
Готовят в экспериментальных условиях, аналогичных тем, которые используются для соединения 7010, используя спирт 7017 (1,42 г, 2,68 ммоль, 1,0 экв.), гидрохлорид N,N-диметиламино масляной кислоты (0,53 г, 3,21 ммоль, 1,2 экв.), ДИПЭА (1,48 мл, 8,0 ммоль, 3,0 экв.), ЭДКИ (0,56 г, 2,94 ммоль, 1,1 экв.), ДМАП (0,065 г, 0,53 ммоль, 0,1 экв.) в ДХМ, что дает 1,34 г (78%) чистого продукта 7018.
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ 5,47 - 5,20 (м, 8Н), 4,92-4,77 (м, 1Н), 2,76 (t, J = 6,3, 2Н), 2,28 (dt, J = 16,6, 7,5, 4Н), 2,20 (s, 6H), 2,08-1,89 (м, 8Н), 1,83-1,70 (м, 2Н), 1,48 (d, J= 5,2, 4Н), 1,38-1,16 (м, 40Н), 0,91 0,80 (м, 6Н).
13С ЯМР (101 МГц, CDCl3) δ 173,61, 130,51, 130,40, 130,35, 130,13, 130,05, 128,16, 128,13, 77,55, 77,23, 76,91, 74,46, 59,18, 45,68, 34,36, 32,84, 32,69, 32,13, 31,75, 29,99, 29,92, 29,89, 29,78, 29,76, 29,72, 29,67, 29,58, 29,54, 29,52, 29,40, 29,36, 27,45, 27,43, 25,84, 25,57, 23,39, 22,91, 22,80, 14,36, 14,31.
Расчетная масса для C43H81NO2: 643,6; обнаруженная 644,5.
Схема 5
Соединение 7020.
Готовят в экспериментальных условиях, аналогичных тем, которые используются для соединения 7017, с использованием кетона 57 (0,75 г, 1,43 ммоль, 1,0 экв.) в метаноле и ТГФ (2:1) добавляют твердый NaBH4 (0,08 г, 2,14 ммоль, 1,5 экв.) в метаноле:ТГФ, что дает 0,63 г (84%) чистого спирта 7020.
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ 5,48 -5,20 (м, 10Н), 3,57 (s, 1Н), 2,88 - 2,65 (м, 6Н), 2,06 (dq, J= 14,0, 7,1, 8Н), 1,50 - 1,18 (м, 35Н), 0,96 (t, J = 7,5, 3Н), 0,88 (dd, J = 12,8, 6,2, 3Н).
Расчетная масса для С37Н66О: 526,5; обнаруженная 527,5.
Приготовление соединения 7021.
Готовят в экспериментальных условиях, аналогичных тем, которые используются для соединения 7010, с использованием спирта 7020 (0,62 г, 1,18 ммоль, 1,0 экв.), гидрохлорида N,N-диметиламино масляной кислоты (0,23 г, 1,41 ммоль, 1,2 экв.), ДИПЭА (0,65 мл, 3,54 ммоль, 3,0 экв.), ЭДКИ (0,24 г, 1,3 ммоль, 1,1 экв.), ДМАП (0,028 г, 0,23 ммоль, 0,1 экв.) в ДХМ, что дает 0,63 г (84%) чистого продукта 7021.
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ 5,46-5,19 (м, 8Н), 4,91-4,78 (м, 1Н), 2,85-2,68 (м, 6Н), 2,29 (dt, J= 15,2, 7,5, 4Н), 2,20 (s, 6Н), 2,11 - 1,95 (м, 8Н), 1,78 (dd, J= 14,8, 7,5, 2Н), 1,49 (d, J= 5,5, 4Н), 1,40- 1,17 (м, 32Н), 0,96 (t, J= 7,5, 3Н), 0,87 (t, J= 6,8, 3Н).
13С ЯМР (101 МГц, CDCl3) δ 168,17, 126,73, 125,15, 124,98, 124,93, 123,06, 123,04, 122,75, 122,72, 122,43, 121,91, 72,13, 71,81, 71,49, 69,04, 53,75, 40,25, 28,95, 27,27, 26,33, 24,47, 24,45, 24,36, 24,33, 24,29,
- 63 037404
24,15, 24,10, 22,05, 22,04, 22,00, 20,42, 20,41, 20,32, 20,15, 17,96, 17,38, 15,35, 9,08, 8,88. Расчетная масса для C43H77NO2: 639,6; обнаруженная 640,5.
Схема 6
Соединение 7023.
К раствору соединения 7022 в смеси растворителей метанол:этилацетат (2:1) добавляют 10% Pd/C, удаляют воздух с помощью вакуума, очищают аргоном, повторяют цикл (2х), окончательно очищают Н2, реакция продолжается в среде H2 при комнатной температуре на протяжение ночи. После завершения реакции фильтруют через небольшую целитовую пластину, промывают этилацетатом, выпаривают растворитель и очищают с помощью колоночной хроматографии с использованием дихлорметана:метанола (5%) в качестве градиента, чтобы получить чистую белую твердую форму соединения 7023 в 64% (0,64 г) выходе.
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ 5,37 (s, ОН), 4,85 (р, J = 6,2, 1Н), 2,29 (dt, J = 14,8, 7,5, 4Н), 2,21 (s,6H), 1,84-1,71 (м, 2Н), 1,49 (d, J= 5,4, 4Н), 1,36-1,13 (м, 64Н), 0,87 (t, J= 6,8, 6Н).
13С ЯМР (101 МГц, CDCl3) δ 173,58, 77,54, 77,22, 76,91, 74,49, 59,17, 45,64, 34,36, 32,83, 32,70, 32,15, 29,92, 29,88, 29,81, 29,78, 29,58, 25,55, 23,36, 22,91, 14,33.
Расчетная масса для C43H87NO2: 649,6; обнаруженная 650,8.
Пример 18. Синтез эфира.
Схема 1
Синтез М последовательностей (эфиров)
DLin-M-Cl-DMA. Раствор дилиноленилметанола (0,50 г), Ν,Ν-диметилглицин (0.53 г), 4-N,Nдиметиламинопиридин (0,60 г) и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид (0.50 г) в метиленхлориде (5 мл) перемешивают при комнатной температуре. Реакцию контролируют методом ТСХ. Когда весь дилиноленилметанол преобразован, реакционную смесь промывают разбавленной хлористоводородной кислотой, после чего промывают разбавленным раствором гидрокарбоната натрия. Органические фракции высушивают безводным сульфатом магния, фильтруют и удаляют растворитель. Остаток пропускают по колонке силикагеля, используя градиентное элюирование с 0-3% метанолом/хлоридом метилена, что дает выход DLin-M-C1-DMA (0,35 г) в виде бесцветного масла.
1Н ЯМР: (CDCls) δ 0,91 (t; J=6,8 Гц; 6Н); 2,07 (м; 8Н); 2,42 (s; 6H); 2,79 (t; J=6,5 Гц; 4H); 3,21 (s; 2Н); 4,97 (м; 1Н); 5,37 (м; 8Н).
DLin-M-C4-DMA
N,N-Диметил-5-аминопентановая кислота. Бромовалериановую кислоту (2 г) растворяют в водном растворе диметиламина и перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель удаляют в роторном испарителе и остаток обрабатывают водным раствором, содержащим один эквивалент бикарбоната натрия. Растворитель удаляют, остаток осаждают в этаноле и фильтруют. Растворитель удаляют из фильтрата, а остаток осаждают в хлориде метилена и затем снова осаждают. После фильтрации удаление растворителя из фильтрата дает выход масла (1,3 г) которое медленно кристаллизуется при хранении. DLin-M-C4-DMA; как описано для DLin-M-C1-DMA с использованием N,N-диметил-5аминопентановой кислоты.
1Н ЯМР: (CDCl3) δ 0,91 (t; J=6,9 Гц; 6Н); 1,67 (м; 2Н); 2,07 (м; 8Н); 2,32 (s; 6Н); 2,37 (м; 4Н); 2,79 (t; J=6,5 Гц; 4Н); 4,88 (м; 1Н); 5,37 (м; 8Н).
- 64 037404
Ν,Ν-Диметил-б-аминобутановая кислота; как описано для N,N-диметил-5-аминопентановой кислоты с использованием 6-бромбутановой кислоты.
DLin-M-C5-DMA; как описано для DLin-M-C1-DMA с использованием N,N-диметил-6DLin-M-C5-DMA аминобутановой кислоты.
1Н ЯМР: (CDCl3) δ 0,91 (t; J=6,9 Гц; 6Н); 1,66 (м); 2,07 (м; 8Н); 2,31 (t; J=7,5 Гц; 2H); 2,39 (s; 6H);
2,47 (bm; 2Н); 4,88 (м; 1Н); 5,37 (м; 8Н).
DLen-K5-C2-flMA
Len-Br. Раствор линоленил мезилата (2,2 г) и лития бромида (2,5 г) в ацетоне (25 мл) перемешивают при комнатной температуре на протяжении ночи. Добавляют метилена хлорид и дважды промывают раствор водой. Органические фракции высушивают безводным сульфатом магния, фильтруют и удаляют растворитель. Остаток пропускают по колонке силикагеля, используя градиентное элюирование с 0-2% этилацетатом/гексаном, что дает выход Len-Br (2,1 г) в виде бесцветного масла.
DLen-M-формиат. Раствор Len-Br (2,1 г) в безводном диэтилэфире (60 мл) обрабатывают стружкой магния (180 мг) в условиях кипения на протяжении ночи. Позволяют раствору охладиться и добавляют по каплям этилформиат (0,5 мл). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 3 ч. Добавляют водную серную кислоту (5%, 40 мл) и экстрагируют раствор диэтилэфиром. Органическую фракцию промывают изотоническим раствором хлорида натрия, высушивают безводным сульфатом магния, фильтруют и удаляют растворитель. Остаток пропускают по колонке силикагеля, используя градиентное элюирование с 0-3% этилацетатом/гексаном, что дает выход неочищенного DLen-Mформиата в виде бесцветного масла.
DLen-M. Сырье DLen-M-формиата, приготовленного, как описано выше, обрабатывают 5% раствором гидроксида натрия (едкого натра) в воде/этаноле (10 мл, 10:90 об./об.) в течение 30 мин. Раствор разбавляют водой и экстрагируют метиленхлоридом. Органические фракции, высушивают безводным сульфатом магния, фильтруют и удаляют растворитель. Остаток пропускают по колонке силикагеля, используя градиентное элюирование с 0-10% этилацетатом/гексаном, что дает выход неочищенного DLen-M в виде бесцветного масла. DLen-кетон. Раствор DLen-M (приготовленный, как описано выше) в метиленхлориде (20 мл) обрабатывают хлорохроматом пиридиния (1 г) при комнатной температуре на протяжении 2 ч. Добавляют диэтилэфир (50 мл) и полученную суспензию промывают через слой силикагеля (2х). Растворитель удаляют и остаток пропускают по колонке силикагеля, используя градиентное элюирование с 0-2% этилацетатом/гексаном, что дает выход DLen-кетона (0,57 г) в виде бесцветного масла.
DLen-K5-C2-OH. Раствор DLen-кетона (0,57 г), р-толуолсульфонат пиридиния (0,10 г) и бутан1,2,4-триол (0,50 г) в толуоле (100 мл) кипятят в аппарате Дина-Старка на протяжении ночи. Реакционную смесь разделяют между метиленхлоридом и соляным раствором. Органические фракции, высушивают безводным сульфатом магния, фильтруют и удаляют растворитель. Остаток пропускают по колонке силикагеля, используя метиленхлорид, что дает выход неочищенного DLen-K5-C2-OH (0,52 г) в виде бесцветного масла.
Процедура 09-028 (17 Апреля 09). DLen-K5-C2-OMs. Раствор DLen-K5-C2-OH (0,52 г) в метиленхлориде (20 мл) обрабатывают при комнатной температуре ангидридом метансульфонила (0,40 г) и триэтиламином (0,7 мл) на протяжении ночи. Органическую фракцию промывают изотоническим раствором хлорида натрия, высушивают безводным сульфатом магния, фильтруют и удаляют растворитель. Остаток используют в последующих реакциях без дальнейшей очистки.
DLen-K5-C2-DMA. Раствор неочищенного DLen-K5-C2-OMs в 2,0М диметиламина в ТГФ (15 мл) перемешивают при комнатной температуре в течение двух дней. Растворитель удаляют в роторном испарителе и остаток пропускают по колонке силикагеля, используя 0-6% градиент метанол/метиленхлорид, что дает выход неочищенного DLen-K5-C2-ДМА (0,34 г) в виде бесцветного масла.
Ή ЯМР: (CDCl3) δ 0,95 (t; J=7,5 Гц; 6Н); 1,56 (м; 4Н); 1,70 (м; 1Н); 1,81 (м; 1Н); 2,05 (м; 8Н); 2,27 (s; 6Н); 2,36 (м; 1H); 2,46 (м; 1Н); 2,79 (t; J=6,0 Гц; 8Н); 3,27 (t; J=7,2 Гц; 1Н); 4,06 (м; 2Н); 5,34 (м; 12Н).
ОО-К5-С2-ДМА
О-Br; как описано для Len-Br с использованием олеил мезилата. DO-M-формиат; как описано для DLen-M-формиата с использованием О-Br. DO-M; как описано для DLen-M с использованием DO-M- 65 037404 формиата. DO-кетон; как описано для DLen-кетона с использованием DO-M. DO-K5-C2-OH; как описано для DLen-K5-C2-OH с использованием DO-кетона. DO-K5-C2-OMs; как описано для DLen-K5-C2-OMs с использованием DO-K5-C2-OH. DO-K5-C2-ДМА; как описано для DLen-K5-C2-DMA с использованием
DO-K5-C2-OMS.
1Н ЯМР: (CDCls) δ 0,86 (t; J=6,8 Гц; 6Н); 1,55 (м; 4Н); 1,64 (м; 1Н); 1,79 (ddd; J=12,6 Гц, J' =11,2 Гц, J''=6,2 Гц; 1Н); 1,99 (м; 8Н); 2,20 (s; 6H); 2,26 (ddd; J=12,2 Гц, J'=9,5 Гц; J''=5,9 Гц; 1Н); 2,38 (ddd; J=11,9 Гц, J'=9,7 Гц, J=5,6 Гц; 1H); 3,46 (t; J=7,3 Гц; 1H); 4,05 (м; 2H); 5,32 (м; 4Н)
DLin-M-C3-A
Процедура 09-071 (14 июля 09). DLin-M-С3-А. Раствор дилиноленилметанола (0,51 г), N-BOC-4аминомасляную кислоту (0,53 г), 4-N,N-диметиламинопиридин (0,39 г) и 1-этил-3-(3диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид (0,30 г) в метиленхлориде (5 мл) перемешивают при комнатной температуре на протяжении ночи. Реакционную смесь промывают разбавленной хлористоводородной кислотой. Органические фракции высушивают безводным сульфатом магния, фильтруют и удаляют растворитель. Остаток обрабатывают в течение часа трифторуксусной кислотой (2 мл) при комнатной температуре. Раствор разбавляют метиленхлоридом, промывают водой и затем промывают водным бикарбонатом натрия. Органические фракции высушивают безводным сульфатом магния, фильтруют и удаляют растворитель. Остаток пропускают по колонке силикагеля, используя градиентное элюирование с 0-10% метанолом/метиленхлоридом, что дает выход DLin-M-С3-А (0,45 г) в виде бесцветного масла.
1Н ЯМР: (CDCl3) δ 0,87 (t; J=6,8 Гц; 6Н); 1,75 (р; J=7,3 Гц; 2Н); 2,03 (м; 8Н); 2,32 (t; J=7,4 Гц; 2Н);
2,75 (м; 6Н); 4,84 (р; J= 6,2 Гц; 1H); 5,35 м; 8Н).
DLin-M-C3-MA
DLin-M-С3-Br. Раствор дилиноленилметанола (0,5 г) в метиленхлориде (20 мл) обрабатывают хлоридом 4-бромобутирила (1 мл) и триэтиленамином (1 мл), перемешивая при комнатной температуре на протяжении ночи. Реакционную смесь разбавляют водой, подкисляют хлористоводородной кислотой и экстрагируют метиленхлоридом. Органические фракции высушивают безводным сульфатом магния, фильтруют и удаляют растворитель. Сырье DLin-M-С3-Br используют в последующих реакциях без дальнейшей очистки.
Процедура 09-061 (16 июня 09). DLin-M-С3-МА. Раствор DLin-M-C3-Br (0,51 г) обрабатывают раствором метиламина в ТГФ/метиленхлориде (50 мл; 20/30 об./об.) при комнатной температуре, Реакцию контролируют методом ТСХ, После завершения реакции растворитель удаляют в роторном испарителе. Остаток разделяют между метиленхлоридом и разбавленной хлористоводородной кислотой. Органическую фазу промывают разбавленным водным раствором бикарбоната натрия, высушивают безводным сульфатом магния, фильтруют и удаляют растворитель. Остаток пропускают по колонке силикагеля, используя градиентное элюирование с 0-4% метанолом/метиленхлоридом, что дает выход DLin-M-C3-MA (0,31 г) в виде бесцветного масла.
1Н ЯМР: (CDCl3) δ 0,87 (t; J=6,9 Гц; 6Н); 1,82 (м; 2Н); 2,03 (м; 8Н); 2,33 (t; J=7,4 Гц; 2H); 2,43 (s; 3Н); 2,62 (t; J=7,1 Гц; 2Н); 2,75 (t; J=6,4 Гц; 4H); 4,84 (p; J= 6,3 Гц; 1H); 5,35 (м; 8Н).
DLin-M-C3-EA
DLin-M-С3-ЕА; как описано для DLin-M-С3-МА с использованием этиламина.
1Н ЯМР: (CDCl3) δ 0,87 (t; J=6,8 Гц; 6Н); 1,10 (t; J=7,1 Гц; 3Н); 1,82 (р; J=7,3 Гц; 2Н); 2,03 (м; 8Н); 2,33 (t; J=7,4 Гц; 2Н); 2,65 (q; J=7,0 Гц; 4Н); 2,62 (t; J=7,1 Гц; 2H); 2,75 (t; J=6,4 Гц; 4H); 4,84 (p; J= 6,3 Гц; 1Н); 5,33 (м; 8Н).
DLin-M-C3-IPA
DLin-M-C3-IPA; как описано для DLin-M-С3-МА с использованием изопропиламина.
1Н ЯМР: (CDCl3) δ 0,87 (t; J=6,8 Гц; 6Н); 1,03 (d; J=6,2 Гц; 6Н); 1,78 (р; J=7,3 Гц; 2Н); 2,03 (м; 8Н);
2,32 (t; J=7,4 Гц; 2Н); 2,60 (t; J=7,3 Гц; 2Н); 2,77 (м; 5Н); 4,84 (р; J= 6,2 Гц; 1Н); 5,34 (м; 8Н).
DLin-M-C3-DEA (ED50 = 0,3)
- 66 037404
DLin-M-C3-DEA; как описано для DLin-M-СЗ-МА с использованием диэтиламина.
DLin-M-C3-DIPA (ED50 = 4,5)
DLin-M-C3-DIPA; как описано для DLin-M-СЗ-МА с использованием диизопропиламина.
DLin-M-C3-MIPA
DLin-M-C3-MIPA; как описано для DLin-M-С3-МА с использованием метилизопропиламина.
DLin-M-C3-EIPA
DLin-M-C3-EIPA; как описано для DLin-M-С3-МА с использованием этилизопропиламина.
1Н ЯМР: (CDCl3) δ 0,87 (t; J=6,8 Гц; 6Н); 0,94 (d; J=6,2 Гц; 6Н); 0,99 (t; J=7,1 Гц; 3Н); 1,71 (м; 2Н); 2,03 (м; 8Н); 2,30 (t; J=7,3 Гц; 2Н); 2,37 (м; 2Н); 2,43 (q; J= 7,1 Гц; 2Н); 2,75 (t; J=6,4 Гц; 4H); 2,90 (м; 1Н); 4,84 (м; 1Н); 5,34 (м; 8Н).
DLin-M-C3-MEA
DLin-M-С3-МЕА; как описано для DLin-M-С3-МА с использованием метилэтиламина.
1Н ЯМР: (CDCl3) δ 0,87 (t; J=6,9 Гц; 6Н); 1,02 (t; J=7,2 Гц; 3Н); 1,77 (м; 2Н); 2,03 (м; 8Н); 2,19 (s;
3Н); 2,30 (м; 4Н); 2,39 (q; J=7,2 Гц; 2Н); 2,75 (t; J=6,5 Гц; 4Н); 4,84 (м; 1H); 5,34 (м; 8Н).
Пример 19. Синтез 2,2-дилинолеил-5-диметиламинометил-[1,3]-диоксана (DLin-K6S-C1-DMA).
Диметнламин
DLin-K6S-Cl-DMA
VII
1. Синтез линолеил бромида(П).
Смесь линолеил метан сульфоната (26,6 г, 77,2 ммоль) и лития бромида (30,5 г, 350 ммоль) в ацетоне (350 мл) перемешивают в среде азота в течение двух дней. Полученную суспензию фильтруют и су хой остаток промывают ацетоном. Фильтрат и промывную жидкость соединяют и выпаривают раствори тель. Полученный остаток обрабатывают водой (300 мл). Водную фазу экстрагируют эфиром (3x150 мл). Объединенную эфирную фазу промывают водой (200 мл), соляным раствором (200 мл) и высушивают безводным Na2SO4. Растворитель выпаривают, что дает 29,8 г желтоватого масла. Неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 700 мл), элюируют гексанами. Это дает 20,8 г (82%) линолеил бромида(П).
2. Синтез дилинолеилметил формиата(Ш).
К суспензии стружки Mg (1,64 г, 67,4 ммоль) с одним кристаллом йода в 500 мл безводного эфира добавляют в среде азота раствор линолеил бромида (II, 18,5 г, 56,1 ммоль) в 250 мл безводного эфира при комнатной температуре. Полученную смесь кипятят в среде азота на протяжении ночи. Смесь охлаждают до комнатной температуры. К мутной смеси в среде азота добавляют по каплям этилформиат (4,24 г, 57,2 ммоль). При добавлении смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Смесь обрабатывают водным раствором 10% H2SO4 (250 мл). Эфирную фазу разделяют, водную фазу экстрагируют эфиром (150 мл). Объединенную органическую фазу промывают водой (400 мл), соляным раствором (300 мл) и высушивают безводным Na2SO4. Выпаривание растворителя дает 17,8 г желтоватого масла,
- 67 037404 как неочищенный продукт (сырье) (III). Сырье непосредственно используют в последующих шагах без дальнейшей очистки.
3. Синтез дилинолеил метанола(IV).
Описанный выше неочищенный дилинолеилметил формиат (III, 17,8 г) и KOH (3,75 г) перемешивают в 85% EtOH при комнатной температуре в среде азота на протяжении ночи. По окончании реакции большую часть растворителя выпаривают. Полученную смесь выливают в 150 мл 5% раствора HCl. Водную фазу экстрагируют эфиром (2x150 мл). Объединенный эфирный экстракт промывают водой (2x100 мл), соляным раствором (100 мл), высушивают безводным Na2SO4. Выпаривание растворителя дает 20,0 дилинолеил метанола(IV) в виде желтоватого масла. Сырье очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 700 мл), элюируют 0-5% градиентом этилацетата в гексанах, Это дает 9,6 г дилинолеил метанола(IV).
4. Синтез дилинолеил кетона(V).
К смеси дилинолеил метанола (4,0 г, 7,2 ммоль) и безводного карбоната калия (0,4 г) в 100 мл CH2Cl2 добавляют пиридиния хлорохромат (ПХХ, 4,0, 19 ммоль). Полученную суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем в смесь добавляют эфир (300 мл) и полученную коричневую суспензию фильтруют через слой силикагеля (150 мл). Слой силикагеля далее промывают эфиром (3x75 мл). Эфирный фильтрат и промывную жидкость объединяют. Выпаривание растворителя дает 5,1 г маслянистого остатка в качестве неочищенного продукта. Сырье очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 200 мл), элюируют 0-4% этилацетатом в гексанах. Это дает 3,0 г (79%) дилинолеил кетона(V).
5. Синтез 2,2-дилинолеил-5-гидроксиметил)-[1,3]-диоксана(VI).
Смесь дилинолеил кетона (V, 1,05 г, 2,0 ммоль), 2-гидроксиметил-1,3-пропандиола (490 мг, 4,2 ммоль) и пиридиния р-толуолсульфоната (100 мг, 0,4 ммоль) в 150 мл толуола кипятят на протяжении ночи в среде азота с насадкой Дина-Старка для удаления воды. Полученную смесь охлаждают до комнатной температуры. Органическую фазу промывают водой (2x100 мл), соляным раствором (100 мл) и высушивают безводным Na2SO4. Выпаривание растворителя приводит к образованию бледноокрашенного масла (1,2 г). Неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 100 мл) с 0-5% градиентом метанола в дихлорметане в качестве элюента. Это дает 0,93 г чистого продукта VI в виде бледно-окрашенного масла.
6. Синтез 2,2-дилинолеил-5-метансульфонилметил-[1,3]-диоксана(VII).
К раствору 2,2-дилинолеил-5-гидроксиметил-[1,3]-диоксана (VI, 0,93 г, 1,5 ммоль) и сухого триэтиламина (290 мг, 2,9 ммоль) в 50 мл безводного CH2Cl2 в атмосфере азота добавляют ангидрид метансульфонила (400 мг, 2,3 ммоль). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре на протяжении ночи. Органическую фазу промывают водой (2x75 мл), соляным раствором (75 мл) и высушивают безводным Na2SO4. Растворитель выпаривают, что дает 1,0 г бледно окрашенного масла. Сырьевой продукт используют в следующем шаге без дальнейшей очистки.
7. Синтез 2,2-дилинолеил-5-диметиламинометил)-[1,3]-диоксана (DLin-K6S-C1-ДМА).
К описанному выше сырьевому материалу (VII, 1,0 г) в атмосфере азота добавляют 20 мл диметиламина в ТГФ (2,0М), Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 7 дней. После выпаривания растворителя получают маслянистый остаток. Колоночная хроматография на силикагеле (230-400 меш, 100 мл) с 0-3% градиентом метанола в хлороформе в качестве элюента приводит к образованию 150 мг продукта DLin-K6S-C1-ДМА в виде бледно окрашенного масла.
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 5,24-5,51 (8, м, 4x СН=СН), 4,04 (2Н, dd, 2x OCH)), 3,75 (2Н, dd OCH), 2,7-2,9 (2Н, br, NCH2), 2,78 (4Н, t, 2x С=С-СН2-С=С), 2,57 (6Н, s, 2x NCH3), 1,95-2,17 (9Н, q, 4x аллилового СН2 и СН), 1,67-1,95 (2Н, м, СН2), 1,54-1,65 (4Н, м, 2х СН2), 1,22-1,45 (32Н, м), 0,90 (6Н, t, 2x СН3) м.д.
Пример 20. Синтез 2,2-дилинолеил-5-диметиламинобутил-[1,3]-диоксана (DLin-K6S-C4-DMA).
Это соединение синтезируют в виде бледно окрашенного масла, способом, аналогичным описанному в примере 19, отличающимся тем, что 2-гидроксиметил-1,3-пропандиол замещают 2-гидроксибутил1,3-пропандиолом.
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 5,24-5,45 (8, м, 4x СН=СН), 3,79 (2Н, dd, 2x OCH)), 3,50 (2Н, dd OCH), 2,76 (4Н, t, 2x С=С-СН2-С=С), 2,37 (2Н, t, NCH2), 2,31 (6Н, s, 2x NCH3), 2,04 (8Н, q, 4x аллилового СН2), 1,63-1,90 (3Н, м), 1,45-1,62 (4Н, м, 2x СН2), 1,22-1,45 (36Н, м), 0,90 (6Н, t, 2x СН3) м.д.
Пример 21. Синтез 2,2-дилинолеил-5-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксана (DLin-K6S-C2-DMA).
χΝ ·/-< xx \_θ/\ΧΧΧ4Χ4Χ4=Χ4=Χ4Χ4Χ'
Это соединение синтезируют в виде бледно окрашенного масла способом, аналогичным описанному в примере 19, отличающимся тем, что 2-гидроксиметил-1,3-пропандиол замещают 2-гидроксиэтил- 68 037404
1,3-пропандиолом.
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 5,25-5,45 (8, м, 4x СН=СН), 3,87 (2Н, dd, 2x ОСН)), 3,55 (2Н, dd ОСН),
2,75 (4Н, t, 2x С=С-СН2-С=С), 2,45-2,60 (2Н, ответвление, NCH2), 2,40 (6Н, s, 2x NCH3), 2,03 (8Н, q, 4x аллилового СН2), 1,73-1,86 (1H, м), 1,56-1,72 (6Н, м, 2x СН2), 1,22-1,45 (32Н, м), 0,90 (6Н, t, 2x СН3) м.д.
Пример 22. Синтез 2,2-дилинолеил-4-(2-диметиламиноэтил)-[1,3]-диоксана (DLin-K6A-C2-DMA).
1. Синтез 1,3,5-пентантриола (II).
Диэтил 3-гидроксиглутарат (I, 1,0 г, 4,9 ммоль) в безводном ТГФ (10 мл) добавляют в атмосфере азота по каплям в суспензию LiAlH4 в безводном ТГФ (110 мл) на холодной водяной бане. После добавления баню убирают и суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение 2 дней. Полученную смесь гасят очень медленным добавлением 13 мл соляного раствора на ледяной бане. В результате образуется белая суспензия, смесь перемешивают при комнатной температуре на протяжении ночи. Твердый осадок фильтруют и промывают ТГФ. Фильтрат и промывную жидкость объединяют, растворитель выпаривают, чтобы получить 0,70 г бледно окрашенного масла. Колоночная хроматография сырьевого продукта (230-400 меш SiO2, 100 мл, 0-12% градиент метанола в хлороформе) дает выход 0,54 г продукта II в виде бесцветного масла.
2. Синтез 2,2-дилинолеил-4-(2-гидроксиэтил)-[1,3]-диоксана (IV).
Смесь из дилинолеил кетона (III, 0,80 г, 1,5 ммоль), 1,3,5-пентантриола (II, 0,54 г, 4,5 ммоль) и пиридиния р-толуолсульфоната (60 мг, 0,24 ммоль) в 150 мл толуола кипятят на протяжении ночи в среде азота с насадкой Дина-Старка для удаления воды. Полученную смесь охлаждают до комнатной температуры. Органическую фазу промывают водой (2x75 мл), соляным раствором (75 мл) и высушивают безводным Na2SO4, Выпаривание растворителя приводит к образованию бледно-окрашенного масла (1,1 г). Неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 75 мл) с 0-3% градиентом метанола в дихлорметане в качестве элюента. Это дает выход 0,75 г (79%) чистого продукта IV в виде бесцветного масла.
3. Синтез 2,2-дилинолеил-4-(2-метансульфонилэтил)-[1,3]-диоксана (V).
К раствору 2,2-дилинолеил-4-(2-гидроксиэтил)-[1,3]-диоксана (IV, 0,75 г, 1,2 ммоль) и сухому триэтиламину (0,58 г, 5,7 ммоль) в 40 мл безводного CH2Cl2 добавляют в атмосфере азота метансульфониловый ангидрид (0,50 г, 2,9 ммоль). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре на протяжении ночи. Органическую фазу промывают водой (2x50 мл), соляным раствором (50 мл) и высушивают безводным Na2SO4. Растворитель выпаривают, что дает 0,80 г бледно-окрашенного масла в качестве сырьевого продукта. Неочищенный продукт используют в следующем шаге без дальнейшей очистки.
4. Синтез 2,2-дилинолеил-4-(2-диметиламиноэтил)-[1,3]-диоксана (DLin-K6A-C2-DMA).
К описанному выше сырьевому материалу (V, 0,80 г) в атмосфере азота добавляют 15 мл диметиламина в ТГФ (2,0М), Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 6 дней. Твердый осадок фильтруют. После выпаривания растворителя получают маслянистый остаток. В результате колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 100 мл) с 0-6% градиентом метанола в дихлорметане в качестве элюента получают 0,70 г продукта DLin-K6A-C2-DMA в виде бледно окрашенного масла.
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 5,28-5,45 (8, м, 4x СН=СН), 3,85-4,0 (2Н, м, 2x OCH), 3,78 (1H, dd, OCH), 2,78 (4Н, t, 2x С=С-СН2-С=С), 2,55-2,90 (2Н, ответвление, NCH2), 2,47 (6Н, s, 2x NCH3), 2,05 (8Н, q, 4x аллилового СН2), 1,65-1,90 (4Н, м, СН2), 1,47-1,65 (4Н, m, СН2), 1,1-1,65 (36Н, м), 0,90 (6Н, t, 2x СН3) м.д.
- 69 037404
Пример 23. Синтез 2,2-дилинолеил-4-(3-диметиламинопропил)-[1,3]-диоксана (DLin-K6A-C3-DMA).
DLin-K6A-C3-DMA
1. Синтез 1,3,6-гексантриола (II).
Диэтил β-кетоадипат (I, 1,86 г, 8,6 ммоль) добавляют в атмосфере аргона на водно-ледяной бане по каплям в суспензию LiAlH4 в безводном ТГФ (90 мл). После добавления баню убирают и суспензию перемешивают при комнатной температуре на протяжении ночи. Полученную смесь очень медленно гасят добавлением на водно-ледяной бане 10 мл соляного раствора. Полученную в результате белую суспензию и смесь перемешивают при комнатной температуре на протяжении ночи. Твердый осадок фильтруют и промывают ТГФ с последующим промыванием EtOH (2x50 мл). Фильтрат и промывную жидкость объединяют, растворитель выпаривают, чтобы получить 0,90 г бледно-окрашенного масла. Колоночная хроматография сырьевого продукта (230-400 меш SiO2, 100 мл, 0-10% градиент метанола в дихлорметане) дает выход 0,70 г продукта II в виде бесцветного масла.
2. Синтез 2,2-дилинолеил-4-(3-гидроксипропил)-[1,3]-диоксана (IV).
Смесь дилинолеил кетона (III, 1,80 г, 3,4 ммоль), 1,3,6-гексантриола (II, 0,50 г, 3,7 ммоль) и пиридиния р-толуолсульфоната (100 мг, 0,40 ммоль) в 120 мл толуола кипятят в атмосфере аргона в течение 3 ч с насадкой Дина-Старка для удаления воды. Полученную смесь охлаждают до комнатной температуры. Органическую фазу промывают водой (2x50 мл), соляным раствором (50 мл) и высушивают безводным Na2SO4. Выпаривание растворителя приводит к образованию бледно-окрашенного масла (2,0 г). Неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле(230-400 меш, 50 мл) с 0-3% градиентом метанола в дихлорметане в качестве элюента. Это дает 0,90 г (41%) чистого продукта IV в виде бесцветного масла.
3. Синтез 2,2-дилинолеил-4-(3-метансульфонилпропил)-[1,3]-диоксана (V).
К раствору 2,2-дилинолеил-4-(3-гидроксипропил)-[1,3]-диоксана (IV, 0,97 г, 1,5 ммоль) и сухого триэтиламина (0,44 г, 4,3 ммоль) в 60 мл безводного CH2Cl2 в атмосфере аргона добавляют метансульфониловый ангидрид (0,60 г, 3,5 ммоль). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре на протяжении ночи. Органическую фазу промывают водой (2x30 мл), соляным раствором (30 мл) и высушивают безводным MgSO4. Растворитель выпаривают, что дает 1,1 г бледно-окрашенного масла в качестве сырьевого продукта. Неочищенный продукт используют в следующем шаге без дальнейшей очистки.
4. Синтез 2,2-дилинолеил-4-(3-диметиламинопропил)-[1,3]-диоксана (DLin-K6A-C3-DMA).
К описанному выше сырьевому материалу (V, 1,1 г) в атмосфере аргона добавляют 20 мл диметиламина в ТГФ (2,0М), Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 дней. Твердый осадок фильтруют. После выпаривания растворителя получают маслянистый остаток. В результате колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 40 мл) с 0-7% градиентом метанола в дихлорметане в качестве элюента получают 0,85 г продукта DLin-K6A-C3-DMA в виде бледно окрашенного масла.
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 5,25-5,45 (8, м, 4x СН=СН), 3,7-4,0 (3Н, м, 3x OCH), 2,77 (4Н, t, 2x С=С-СН2-С=С), 2,5-2,8 (2Н, ответвление, NCH2), 2,5 (6Н, s, 2x NCH3), 2,05 (8Н, q, 4x аллилового СН2), 1,65-1,90 (4Н, м, 2 x CH), 1,40-1,65 (4Н, м, 2x СН2), 1,1-1,65 (38Н, м), 0,90 (6Н, t, 2x СН3) м.д.
- 70 037404
Пример 24. Синтез 2,2-диарахидонил-4-(2-диметиламиноэтил)-[1,3]-диоксалана (DAra-K5-C2-DMA).
DAra-K5-C2-DMA
1. Синтез арахидонил бромида (II).
Смесь арахидонил метан сульфоната (1,0 г, 2,7 ммоль) и магния бромида (2,2 г, 12 ммоль) в безводном эфире (40 мл) перемешивают в атмосфере аргона в течение двух дней. Полученную суспензию фильтруют, твердый осадок промывают эфиром (2x10 мл). Фильтрат и промывную жидкость объединяют и растворитель выпаривают. Полученный остаток обрабатывают гексанами (50 мл), твердый осадок фильтруют и растворитель выпаривают, в результате чего получают маслянистый остаток. Неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 30 мл), элюируют гексанами, Это дает выход 1 г арахидонил бромида (II) в виде бесцветного масла.
2. Синтез диарахидонилметил формиата (III).
К раствору арахидонил бромида (II, 1 г, 3 ммоль) в безводном эфире (30 мл) добавляют стружку магния (78 мг, 3,2 ммоль) с последующим добавлением одного кристалла йода. Полученную смесь кипятят в атмосфере азота в течение 10 ч. Смесь охлаждают до комнатной температуры. К мутной смеси в атмосфере азота добавляют этилформиат (0,25 мл) и полученную смесь перемешивают при комнатной температуре на протяжении ночи. К смеси добавляют 20 мл 10% водного раствора H2SO4. Эфирную фазу разделяют, а водную фазу экстрагируют эфиром (30 мл). Комбинированную органическую фазу промывают водой (2x25 мл), соляным раствором (25 мл), а затем высушивают безводным Na2SO4. Выпаривание растворителя дает 1,1 г бледно-окрашенного масла в качестве неочищенного продукта (III). Неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 40 мл), элюируют 0-3% градиентом этилацетата в гексанах. Это дает 0,43 г (40%) диарахидонилметил формиата (III) в виде бледно-окрашенного масла.
3. Синтез диарахидонил метанола (IV).
Описанный выше диарахидонилметил формиат (III, 0,43 г, 0,71 ммоль) и KOH (100 мг) перемешивают в 95% EtOH (20 мл) при комнатной температуре в атмосфере азота на протяжении ночи. По окончанию реакции большую часть растворителя выпаривают. Полученную смесь обрабатывают 20 мл раствора 2М HCl. Водную фазу экстрагируют эфиром (2x30 мл). Комбинированный эфирный экстракт промывают водой (2x25 мл), соляным раствором (25 мл) и высушивают безводным Na2SO4. Выпаривание растворителя дает 0,44 г продукта IV в виде бледно-окрашенного масла. Неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 40 мл) элюируют 0-5% градиентом этилацетата в гексанах. Это дает выход 0,41 г диарахидонил метанола (IV) в виде бесцветного масла.
4. Синтез диарахидонил кетона (V).
К смеси диарахидонил метанола (IV, 0,41 г, 0,71 ммоль) и безводного карбоната калия (0,05 г) в 10 мл CH2Cl2 добавляют пиридиния хлорохромат (ПХХ, 0,50 г, 2,3 ммоль). Полученную суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение 90 мин. Затем в смесь добавляют эфир (50 мл) и полученную в результате коричневую суспензию фильтруют через слой флоресила (30 мл). Этот слой далее промывают эфиром (3x30 мл). Эфирный фильтрат и промывную жидкость объединяют. Выпаривание растворителя дает 0,40 г маслянистого остатка в качестве неочищенного продукта. Неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 10 мл), элюируют 03% эфиром в гексанах. Это дает 0,30 г (75%) диарахидонил кетона (V).
Ή ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 5,3-5,5 (16Н, м, 8x СН=СН), 2,82 (12Н, t, 6x С=С-СН2-С=С), 2,40 (4Н, t, 2x СО-СН2), 2,08 (8Н, м, 4x аллилового СН2), 1,25-1,65 (20Н, м), 0,90 (6Н, t, 2x СН3) м.д.
5. Синтез 2,2-диарахидонил-4-(2-гидроксиэтил)-[1,3]-диоксалана (VI).
Смесь диарахидонил кетона (V, 0,30 г, 0,52 ммоль), 1,2,4-бутантриола (0,25 г, 2,4 ммоль) и пириди- 71 037404 ния р-толуолсульфоната (20 мг) в 60 мл толуола кипятят в атмосфере аргона на протяжении ночи с насадкой Дина-Старка для удаления воды. Полученную смесь охлаждают до комнатной температуры. Органическую фазу промывают водой (2x30 мл), соляным раствором (30 мл) и высушивают безводным Na2SO4. Выпаривание растворителя приводит к образованию желтоватого маслянистого остатка. Неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 40 мл) с 0-2% метанолом в дихлорметане в качестве элюента. Это дает выход 0,29 г (84%) чистого продукта VI в виде бледно окрашенного масла.
6. Синтез 2,2-диарахидонил-4-(2-метансульфонилэтил)-[1,3]-диоксалана (VII).
К раствору 2,2-диарахидонил-4-(2-гидроксиэтил)-[1,3]-диоксалана (VI, 0,29 г, 0,43 ммоль) и сухого триэтиламина (254 мг, 2,5 ммоль) в 20 мл безводного CH2Cl2 в атмосфере азота добавляют метансульфониловый ангидрид (0,20 г, 1,1 ммоль). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре на протяжении ночи. Смесь разбавляют 30 мл СН2О2. Органическую фазу промывают водой (2x25 мл), соляным раствором (25 мл) и высушивают безводным MgSO4. Растворитель выпаривают, что дает 0,30 г бледно-окрашенного масла. Неочищенный продукт используют в следующем шаге без дальнейшей очистки.
7. Синтез 2,2-диарахидонил-4-(2-диметиламиноэтил)-[1,3]-диоксалана (DAra-K5-C2-DMA).
К описанному выше сырьевому материалу (VII, 0,30 г) в атмосфере аргона добавляют 15 мл диметиламина в ТГФ (2,0М). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 6 дней, После выпаривания растворителя получают маслянистый остаток. В результате колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 40 мл) с 0-5% градиентом метанола в дихлорметане в качестве элюента получают 0,18 г продукта DAra-K5-C2-DMA в виде бледно-окрашенного масла.
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 5,3-5,5 (16Н, м, 8x СН=СН), 4,0-4,17 (2Н, м, 2x OCH), 3,49 (1H, t, OCH), 2,65-2,85 (14Н, м, 6х С=С-СН2-С=С, NCH2), 2,55 (6Н, s, ответвление, 2x NCH3), 2,06 (8Н, м, 4х аллилового СН2), 1,80-1,92 (2Н, м, СН2), 1,4-1,75 (4Н, м, 2х СН2), 1,22-1,45 (20Н, m), 0,90 (6Н, t, 2x СН3)
м.д.
Пример 25. Синтез 2,2-дидокозагексаеноил-4-(2-диметиламиноэтил)-[1,3]-диоксалана (DDha-K5C2-DMA).
1. Синтез докозагексаеноил бромида (II).
Смесь докозагексаеноил метан сульфоната (2,0 г, 5,1 ммоль) и магния бромида (4,3 г, 23 ммоль) в безводном эфире (100 мл) перемешивают в атмосфере аргона на протяжении ночи. Полученную суспензию фильтруют и твердый осадок промывают эфиром (2x30 мл). Фильтрат и промывную жидкость объединяют, растворитель выпаривают. Полученный в результате остаток очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 40 мл), элюируют гексанами. Это дает 2,2 г докозагексаеноил бромида (II) в виде бесцветного масла.
2. Синтез дидокозагексаеноилметил формиата (III).
К раствору докозагексаеноил бромида (II, 2,2 г, 6,0 ммоль) в безводном эфире (60 мл) добавляют стружку магния (145 мг, 6,0 ммоль) с последующим добавлением одного кристалла йода. Полученную смесь кипятят в атмосфере аргона в течение 5 ч. Смесь охлаждают до комнатной температуры. К мутной смеси в атмосфере аргона добавляют этилформиат (0,50 мл) и на протяжении ночи полученную смесь перемешивают при комнатной температуре. К смеси добавляют 40 мл водного раствора 5% H2SO4. Эфирную фазу разделяют, а водную фазу экстрагируют эфиром (50 мл). Комбинированную органическую фазу промывают водой (2x50 мл), соляным раствором (50 мл) и затем высушивают безводным
- 72 037404
MgSO4. Выпаривание растворителя дает 2,3 г желтоватого масла в качестве неочищенного продукта (III).
Неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 50 мл), элюируют 0-7% градиентом этилацетата в гексанах. Это дает выход 1,38 г (65%) дидокозагексаеноилметила формиата (III) в виде бледно окрашенного масла.
3. Синтез дидокозагексаеноил метанола (IV).
Описанный выше дидокозагексаеноилметила формиат (III, 1,38 г, 2,1 ммоль) и KOH (300 мг) перемешивают в 90% EtOH (70 мл) при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 90 мин. По окончанию реакции большую часть растворителя выпаривают. Полученную смесь обрабатывают 60 мл раствора 2М HCl. Водную фазу экстрагируют эфиром (2x75 мл). Комбинированный эфирный экстракт промывают водой (2x50 мл), соляным раствором (50 мл) и высушивают безводным MgSO4. Выпаривание растворителя дает 1,18 г чистого вещества IV в виде желтоватого масла. Неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 50 мл), элюируют 0-6% градиентом этилацетата в гексанах. Это дает выход 1,0 г дидокозагексаеноил метанола (IV) в виде бесцветного масла.
4. Синтез дидокозагексаеноил Ketone (V).
К смеси дидокозагексаеноил метанола (IV, 1,2 г, 1,9 ммоль) и безводного карбоната калия (0,1 г) в 30 мл CH2Cl2 добавляют пиридиния хлорохромат (ПХХ, 1,05 г, 4,8 ммоль). Полученную суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем в смесь добавляют эфир (120 мл) и полученную в результате коричневую суспензию фильтруют через слой силикагеля (75 мл). Этот слой далее промывают эфиром (3x75 мл), Эфирный фильтрат и промывную жидкость объединяют. Выпаривание растворителя дает 1,3 г маслянистого остатка в качестве сырья. Сырьевой продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 40 мл) элюируют 0-3% этилацетатом в гексанах. Это дает 0,83 г (69%) дидокозагексаеноил кетона (V).
5. Синтез 2,2-дидокозагексаеноил-4-(2-гидроксиэтил)-[1,3]-диоксалана (VI).
Смесь диарахидонил кетона (V, 0,43 г, 0,69 ммоль), 1,2,4-бутантриола (0,35 г, 3,3 ммоль) и пиридиния р-толуолсульфоната (50 мг) в 75 мл толуола кипятят в атмосфере аргона на протяжении ночи с насадкой Дина-Старка для удаления воды. Полученную смесь охлаждают до комнатной температуры. Органическую фазу промывают водой (2x30 мл), соляным раствором (30 мл) и высушивают безводным MgSO4. Выпаривание растворителя приводит к образованию желтоватого маслянистого остатка. Неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 40 мл) с 0-2% метанолом в дихлорметане в качестве элюента. Это дает выход 0,43 г (95%) чистого вещества VI в виде бледно-окрашенного масла.
6. Синтез 2,2-дидокозагексаеноил-4-(2-метансульфонилэтил)-[1,3]-диоксалана (VII).
К раствору 2,2-дидокозагексаеноил-4-(2-гидроксиэтил)-[1,3]-диоксалана (VI, 0,42 г, 0,59 ммоль) и сухого триэтиламина (300 мг, 2,9 ммоль) в 50 мл безводного CH2Cl2 в атмосфере азота добавляют метансульфониловый ангидрид (0,25 г, 1,4 ммоль). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре на протяжении ночи. Органическую фазу промывают водой (2x25 мл), соляным раствором (25 мл) и высушивают безводным MgSO4. Растворитель выпаривают, что дает 0,43 г бледно-окрашенного масла. Неочищенный продукт используют в следующем шаге без дальнейшей очистки.
7. Синтез 2,2-дидокозагексаеноил-4-(2-диметиламиноэтил)-[1,3]-диоксалана (DDha-K5-C2-DMA).
К описанному выше сырьевому материалу (VII, 0,43 г) добавляют в атмосфере аргона 15 мл диметиламина в ТГФ (2,0М), Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 6 дней. После выпаривания растворителя получают маслянистый остаток. В результате колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 40 мл) с 0-5% градиентом метанола в дихлорметане в качестве элюента получают 0,31 г продукта DDha-K5-C2-DMA в виде желтоватого масла.
Ή ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 5,25-5,45 (24Н, м, 12x СН=СН), 4,05-4,17 (2Н, м, 2x OCH), 3,50 (1H, t, OCH), 2,87-3,15 (2Н, ответвление, NCH2) 2,73-2,87 (20Н, м, 10x С=С-СН2-С=С), 2,65 (6Н, s, ответвление, 2x NCH3), 2,06 (8Н, м, 4x аллилового СН2), 2,0-2,2 (2Н, м, СН2), 1,75-1,95 (2Н, м, СН2), 1,3-1,65 (8Н, m, 4x СН2), 0,90 (6Н, t, 2x СН3) м.д.
Пример 26. Синтез дилинолеил 2-(2-диметиламиноэтил)малоната (DLin-MAL-C2-DMA). о СНг(СОС1), u_o-El N 1 1 NaH 1 11 (CH,),NCH,CH,C1
DLin-MAL-C2-BMA
1. Синтез дилинолеил малоната (II).
К раствору линолеилового спирта (I, 5,0 г, 19 ммоль) в безводном CH2Cl2 (70 мл) добавляют в атмо- 73 037404 сфере аргона при температуре 0-5°С по каплям дихлорид малонила (1,36 г, 9,3 ммоль). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 6 ч. Смесь разбавляют 50 мл CH2Cl2. Органическую фазу промывают водой (3x75 мл), соляным раствором (75 мл) и высушивают безводным Na2SO4. Выпаривание растворителя дает коричневатый маслянистый остаток (5,8 г). Неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 200 мл) с 0-4% градиентом этилацетата в гексанах в качестве элюента. Это дает 3,1 г (55%) чистого продукта II в виде бес цветного масла.
% ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 5,25-5,45 (8, м, 4x СН=СН), 4,13 (4Н, t, 2x ОСН2), 3,35 (2Н, s, СО-СН2СО), 2,78 (4Н, t, 2x С=С-СН2-С=С), 2,05 (8Н, q, 4x аллилового СН2), 1,55-1,65 (4Н, м, СН2), 1,2-1,4 (32Н, м), 0,90 (6Н, t, 2x СН3) м.д.
2. Синтез дилинолеил 2-(2-диметиламиноэтил)-малоната (DLin-MAL-C2-DMA).
В суспензию NaH (0,17 г, 60%, 4,1 ммоль) в безводном бензоле (40 мл) в атмосфере аргона добавляют дилинолеила малонат (II, 0,50 г, 0,83 ммоль), Полученную суспензию перемешивают при комнатной температуре 60 мин. К полученной смеси добавляют одной порцией N,N-диметиламимоэтилхлорида гидрохлорид (0,12 г, 0,83 ммоль), полученную смесь кипятят в атмосфере аргона в течение 2 дней. Органическую фазу промывают водой (3x20 мл), соляным раствором (2x25 мл) и высушивают безводным Na2SO4. Выпаривание растворителя дает слабоокрашенный маслянистый остаток (0,50 г). В результате колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 40 мл) с 0-4% метанолом в дихлорметане в качестве элюента получают 0,13 г продукта DLin-MAL-C2-DMA в виде бледно-окрашенного масла.
% ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 5,25-5,40 (8, м, 4x СН=СН), 4,05-4,20 (4Н, м, 2х ОСН2), 3,47 (1H, t, COСН-СО), 2,75 (4Н, t, 2x С=С-СН2-С=С), 2,35-2,9 (6Н, ответвление, 2x NCH3), 2,15-2,35 (2Н, ответвление, NCH2), 2,05 (8Н, q, 4x аллилового СН2), 1,55-1,65 (4Н, m, СН2), 1,2-1,45 (32Н, m), 0,90 (6Н, t, 2x СН3) м.д.
Пример 27. Синтез дилинолеил 2-(2-диметиламиноэтил)малоната (TetraLin-MAL-C2-DMA).
Это соединение синтезируют в виде бледно окрашенного масла, способом, аналогичным описанному в примере 26, отличающимся тем, что линолеил алкоголь замещают на дилинолеил метанол.
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 5,15-5,50 (16, м, 8x СН=СН), 4,89 (2Н, квинтет), 3,46 (1Н, t, СО-СНСО), 3,08-3,2 (2Н, м), 2,8-2,85 (6Н, 2 s), 2,78 (8Н, t, 4x С=С-СН2-С=С), 2,35-2,48 (2Н, ответвление, NCH2), 2,05 (16Н, q, 8x аллилового СН2), 1,45-1,65 (8Н, м, СН2), 1,2-1,45 (64Н, м), 0,90 (12Н, t, 2x СН3) м.д.
Пример 28. Синтез 4-диметиламиномасляной кислоты 1-октадека-6,9,12-триенил-нонадека-7,10,13триенил эфира (005-14).
МдВг2 диэтиловый эфир
005-8
М о
КОН 85% EtOH
Соединения от 005-8 до 005-12 синтезируют способом, аналогичным описанному в примере 19.
В атмосфере аргона в круглодонную колбу, наполненную DLen(Y)-MeOH (005-12, 262 мг, 0,5 ммоль), гидрохлоридом 4-диметиламиномасляной кислоты (101 мг, 0,6 ммоль) и 4(диметиламин)пиридином (13 мг) в дихлорметане (5 мл), добавляют дициклогексилкарбодиимид (134 мг). После перемешивания смеси в течение 16 ч при температуре окружающей среды, растворитель выпаривают и остаток переносят в диэтилэфир. Белый осадок удаляют путем фильтрации. Фильтрат концентрируют досуха (0,4 г масла). Остаток очищают с помощью колоночной хроматографии на силикаге- 74 037404 ле (230-400 меш, 50 мл), элюируют от 2 до 3% метанолом в дихлорметане. Фракции, содержащие чистый продукт, объединяют и концентрируют. Остаток пропускают через слой силикагеля (2 мм), промывают гексанами (6 мл). Затем фильтрат концентрируют и высушивают в условиях высокого вакуума в течение
ч. Это дает выход 166 мг (0,26 ммоль, 53%) продукта 005-14 в виде прозрачного, слегка желтого масла.
Ή ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 5,41-5,26 (м, 12Н, СН=СН), 4,83 (квинтет, J=6 Гц, 1H), 2,77 (tподобный, J=5,2 Гц, 8Н), 2,29 (t, J=7,6 Гц, 2Н), 2,25 (t, J=7,6, 2H), 2,18 (s, 6H), 2,02 (q-подобный, J=6,8 Гц, 8Н), 1,75 (квинтет-подобный, J=7,6 Гц, 2H), 1,48 (м, 4Н), 1,37-1,20 (м, 24Н), 0,86 (t, J=6,8 Гц, 6Н) м.д.
Пример 29. Синтез 5-диметиламин-пентановой кислоты 1-октадека-6,9,12-триенил-нонадека7,10,13-триенил эфира (005-23).
Шаг 1, 005-21.
В атмосфере аргона в круглодонную колбу, наполненную DLen(Y)-MeOH (005-12, 262 мг, 0,5 ммоль), 5-бромовалериановой кислотой (181 мг, 1,0 ммоль) и 4-(диметиламин)пиридином (30 мг) в дихлорметане (10 мл), добавляют дициклогексилкарбодиимид (227 мг). После перемешивания смеси в течение 16 ч при температуре окружающей среды растворитель выпаривают и остаток переносят в гексаны. Белый осадок удаляют фильтрацией. Фильтрат концентрируют досуха. Остаток очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 50 мл), элюируют ацетатом в гексанах (0-2%). Фракции, содержащие чистый продукт, объединяют и концентрируют. Это дает выход 290 мг (0,42 ммоль, 84%) продукта 005-21 в виде слегка желтого масла.
Шаг 2, 005-23.
К продукту 005-21 (290 мг) добавляют диметиламин (2М в ТГФ, 10 мл). Раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 6 дней. Избыток амина и растворитель выпаривают.
Неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 50 мл) с метанолом в дихлорметане (от 1 до 3%). Фракции, содержащие продукт, объединяют и концентрируют. Оставшееся масло пропускают через целитный слой и промывают гексанами (6 мл). Затем фильтрат концентрируют и высушивают в условиях высокого вакуума в течение 2 ч. Это дает выход 204 мг (0,31 ммоль, 74%) продукта 005-23 в виде слегка желтого масла.
Ή ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 5,43-5,30 (м, 12Н, СН=СН), 4,84 (квинтет, J=6 Гц, 1Н), 2,77 (tподобный, J=5,2 Гц, 8Н), 2,39-2,28 (м, 4Н), 2,28 (s, 6H), 2,06 (q-подобный, J=6,8 Гц, 8Н), 1,66 (квинтетподобный, J=7,2 Гц, 2Н), 1,60-1,48 (м, 6Н), 1,41-1,24 (м, 24Н), 0,90 (t, 6H, J=6,8 Гц) м.д.
Пример 30. Синтез [2-(2,2-ди-октадека-6,9,12-триенил-[1,3]диоксолан-4-ил)этил]диметиламина (005-31).
- 75 037404
Шаг 1, 005-28.
К смеси дилиноленил (γ) метанола (005-12, 550 мг, 1,05 ммоль) и безводного карбоната калия (58 мг) в 25 мл безводного CH2Cl2 добавляют пиридиния хлорохромат (ПХХ, 566 мг, 2,63 ммоль, 2,5 экв.). Полученную суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение 90 мин. Затем в смесь добавляют эфир (100 мл) и полученную в результате коричневую суспензию фильтруют через слой силикагеля (150 мл). Слой силикагеля далее промывают эфиром (3x50 мл.) Эфирный фильтрат и промывную жидкость соединяют. Выпаривание растворителя дает 510 мг маслянистого остатка в качестве неочищенного продукта. Неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 50 мл), элюируют 0-3% этилацетатом в гексанах. Это дает выход 344 г (63%) названного продукта (005-28).
Шаг 2, 005-29.
Смесь из продукта 005-28 (344 мг, 0,66 ммоль), 1,2,4-бутантриола (349 мг, 3,2 ммоль) и пиридиния р-толуолсульфонат (30 мг) в 50 мл толуола нагревают до кипения в атмосфере аргона на протяжении ночи с насадкой Дина-Старка для удаления воды. Полученную смесь охлаждают до комнатной температуры. Органическую фазу промывают водой (30 мл) (бутантриол не растворяется в толуоле, поэтому раствор просто сцеживают и триол оставляют), соляным раствором (30 мл) и высушивают безводным Na2SO4. Выпаривание растворителя приводит к образованию а желтоватого маслянистого остатка. Неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 40 мл), элюируют 4% этилацетатом в гексанах. Фракции, содержащие чистый продукт, объединяют и концентрируют. Это дает 337 мг (83%) чистого 005-29 в виде бесцветного масла.
Шаг 3, 005-30.
К раствору 005-29 (337 мг, 0,55 ммоль) и сухого триэтиламина (0,28 мл, 2 ммоль) в 30 мл безводного CH2Cl2 в атмосфере азота добавляют метансульфониловый ангидрид (310 мг, 1,78 ммоль). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре на протяжении ночи. Смесь разбавляют 30 мл CH2Cl2. Органическую фазу промывают водой (2x25 мл), соляным раствором (25 мл) и высушивают безводным MgSO4. Растворитель выпаривают, что дает 377 г заданного продукта в в виде бесцветного прозрачного масла (99%). Продукт является достаточно чистым и его используют в следующем шаге без дальнейшей очистки.
Шаг 4, 005-31.
К продукту 005-30 (377 мг) в атмосфере аргона добавляют 15 мл диметиламина в ТГФ (2,0М). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 6 дней. После выпаривания растворителя получают маслянистый остаток. С помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230400 меш, 40 мл) элюируют 3% метанолом в дихлорметане. Фракции, содержащие чистый продукт, объединяют и концентрируют, чтобы получить 314 мг названного продукта (005-31) в виде прозрачного бледно-окрашенного масла.
Ή ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 5,41-5,26 (м, 12Н, СН=СН), 4,06 (м, 1H), 4,01 (dd, 1H, J=7,5, 7,5 Гц), 3,45 (dd, 1Н, J=7,5, 7,5 Гц), 2,77 (t-подобный, J=5,6 Гц, 8Н), 2,36 (м, 1Н), 2,26 (м, 1Н), 2,19 (s, 6H), 2,02 (qподобный, J=6,8 Гц, 8Н), 1,78 (м, 1Н), 1,67 (м, 1Н), 1,60-1,51 (м, 4Н), 1,38-1,21 (м, 24Н), 0,86 (t, 6H, J=6,8 Гц) м.д.
Пример 31. Синтез 4-(2-метил-азиридин-1-ил)масляной кислоты 1-октадека-9,12-диенил-нонадека10,13-диенил эфира (005-18).
Шаг 1, 005-13.
В атмосфере аргона в круглодонную колбу, наполненную DLin-MeOH (001-17, 528,9 мг), 4бромомасляной кислотой (200 мг) и 4-(диметиламин)пиридином (25 мг) в дихлорметане (10 мл), добавляют дициклогексилкарбодиимид (268 мг). После перемешивания смеси в течение 16 ч при температуре окружающей среды растворитель выпаривают и остаток переносят в диэтилэфир. Белый осадок DCU удаляют путем фильтрации. Фильтрат концентрируют и полученное в результате остаточное масло очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 50 мл), элюируют 01% этил
- 76 037404 ацетатом в гексанах. Это дает выход 0,44 г (65%) продукта 005-13 в виде бесцветного масла.
Шаг 2, 005-18.
Смесь из продукта 005-13 (0,44 г, 0,65 ммоль), 2-метилазиридина (148 мг, 2,6 ммоль, тех. 90%), Cs2CO3 (2,6 ммоль) и ТБАИ (2,4 ммоль) в ацетонитриле (10 мл) перемешивают в атмосфере аргона на протяжении 4 дней. После удаления растворителя к остатку добавляют гексаны и воду. Две фазы разделяют с последующим экстрагированием водной фазы с гексанами (X 2). Комбинированную органическую фазу высушивают натрия сульфатом и концентрируют досуха. Полученное в результате остаточное масло очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 50 мл), элюируют 13% метанолом в дихлорметане. Фракции, содержащие продукт, объединяют и концентрируют (200 мг масла). Затем снова очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 50 мл), элюируют градиентом этилацетата в гексанах (5-20%). Фракции, содержащие чистый продукт, объединяют и концентрируют. Это дает выход 96 мг (33%) продукта 005-18 в виде бесцветного масла.
1H ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 5,43-5,30 (м, 8Н, СН=СН), 4,87 (квинтет, J=6 Гц, 1H), 2,78 (t-подобный, J=6 Гц, 4Н), 2,39 (t- подобный, J=7,8 Гц, 2Н), 2,26 (t- подобный, 2Н), 2,06 (q-подобный, J=6,8 Гц, 8Н), 1,89 (квинтет-подобный, J=7,2 Гц, 2Н), 1,56-1,48 (м, 5Н), 1,41-1,24 (м, 38Н), 1,18 (d, J=5,2 Гц, 3Н), 0,90 (t, 6H, J=6,8 Гц) м.д.
Пример 32. Синтез 2,2-дилинолеил-5-диметиламинометил-[1,3]-диоксана (DLin-K6S-C1-DMA).
-4^--^--=^-4=---^--,--4^--4^080:011, LlBr » Ацетон )1 Ми эфир II
Эфирформят
Пиридиния ъ.'юрАромгт
Диметилдмнн
DLin-K6S-Cl-DMA
VII
8. Синтез линолеил бромида (II).
Смесь линолеил метан сульфоната (26,6 г, 77,2 ммоль) и лития бромида (30,5 г, 350 ммоль) в ацетоне (350 мл) перемешивают в атмосфере азота в течение 2 дней. Полученную суспензию фильтруют и твердый осадок промывают ацетоном. Фильтрат и промывную жидкость объединяют и выпаривают растворитель. Полученный остаток обрабатывают водой (300 мл). Водную фазу экстрагируют эфиром (3x150 мл). Комбинированную эфирную фазу промывают водой (200 мл), соляным раствором (200 мл) и высушивают безводным Na2SO4. Растворитель выпаривают, что дает 29,8 г желтоватого масла. Неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 700 мл), элюируют гексанами. Это дает выход 20,8 г (82%) линолеил бромида (II).
9. Синтез дилинолеилметил формиата (III).
В суспензию стружки магния (1,64 г, 67,4 ммоль) с одним кристаллом йода в 500 мл безводного эфира в атмосфере азота добавляют при комнатной температуре раствор линолеил бромида (II, 18,5 г, 56,1 ммоль) в 250 мл безводного эфира. Полученную смесь кипятят в атмосфере азота на протяжении ночи. Смесь охлаждают до комнатной температуры. К мутной смеси добавляют в атмосфере азота по каплям этил формиат (4,24 г, 57,2 ммоль). После добавления смесь перемешивают при комнатной температуре на протяжении ночи. Смесь обрабатывают 10% водным раствором H2SO4 (250 мл). Эфирную фазу разделяют, а водную фазу экстрагируют эфиром (150 мл). Комбинированную органическую фазу промывают водой (400 мл), соляным раствором (300 мл), и затем высушивают безводным Na2SO4. Выпаривание растворителя дает 17,8 г желтоватого масла в качестве неочищенного продукта (III). Неочищенный продукт непосредственно используют в следующем шаге без дальнейшей очистки.
10. Синтез дилинолеил метанола (IV).
Описанный выше неочищенный (сырьевой) дилинолеилметил формиат (III, 17,8 г) и KOH (3,75 г) перемешивают в 85% EtOH при комнатной температуре в атмосфере азота на протяжении ночи. По окончанию реакции большую часть растворителя выпаривают. Полученную смесь выливают в 150 мл 5% раствора HCl. Водную фазу экстрагируют эфиром (2x150 мл). Комбинированный эфирный экстракт промывают водой (2x100 мл), соляным раствором (100 мл) и высушивают безводным Na2SO4. Выпаривание растворителя дает 20,0 г дилинолеил метанола (IV) в виде желтоватого масла. Неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 700 мл), элюируют 0
- 77 037404
5% градиентом этилацетата в гексанах. Это дает выход 9,6 г дилинолеил метанола (IV).
11. Синтез дилинолеил кетона (V).
К смеси дилинолеил метанола (4,0 г, 7,2 ммоль) и безводного карбоната калия (0,4 г) в 100 мл CH2Cl2 добавляют пиридиния хлорохромат (ПХХ, 4,0 г, 19 ммоль). Полученную суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем в смесь добавляют эфир (300 мл) и полученную в результате коричневую суспензию фильтруют через слой силикагеля (150 мл). Слой силикагеля далее промывают эфиром (3x75 мл). Эфирный фильтрат и промывную жидкость объединяют. Выпаривание растворителя дает 5,1 г маслянистого остатка в качестве сырья. Неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 200 мл), элюируют 0-4% этилацетатом в гексанах. Это дает 3,0 г (79%) дилинолеил кетона (V).
12. Синтез 2,2-дилинолеил-5-гидроксиметил)-[1,3]-диоксана (VI).
Смесь дилинолеил кетона (V, 1,05 г, 2,0 ммоль), 2-гидроксиметил-1,3-пропандиола (490 мг, 4,2 ммоль) и пиридиния р-толуолсульфоната (100 мг, 0,4 ммоль) в 150 мл толуола кипятят в среде азота с насадкой Дина-Старка для удаления воды на протяжении ночи. Полученную смесь охлаждают до комнатной температуры. Органическую фазу промывают водой (2x100 мл), соляным раствором (100 мл) и высушивают безводным Na2SO4. Выпаривание растворителя приводит к образованию бледно окрашенного масла (1,2 г). Неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 100 мл) с 0-5% градиентом метанола в дихлорметане в качестве элюента. Это дает выход 0,93 г чистого VI в виде бледно окрашенного масла.
13. Синтез 2,2-дилинолеил-5-метансульфонилметил-[1,3]-диоксана (VII).
К раствору 2,2-дилинолеил-5-гидроксиметил-[1,3]-диоксана (VI, 0,93 г, 1,5 ммоль) и сухого триэтиламина (290 мг, 2,9 ммоль) в 50 мл безводного CH2Cl2 в атмосфере азота добавляют метансульфониловый ангидрид (400 мг, 2,3 ммоль). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре на протяжении ночи. Органическую фазу промывают водой (2x75 мл), соляным раствором (75 мл) и высушивают безводным Na2SO4. Растворитель выпаривают, что дает 1,0 г бледно-окрашенного масла. Неочищенный продукт используют в следующем шаге без дальнейшей очистки.
14. Синтез 2,2-дилинолеил-5-диметиламинометил)-[1,3]-диоксана (DLin-K6S-C1-DMA).
К описанному выше сырьевому материалу (VII, 1,0 г) в атмосфере азота добавляют 20 мл диметиламина в ТГФ (2,0М), Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 7 дней. После выпаривания растворителя получают маслянистый остаток. Колоночная хроматография на силикагеле (230-400 меш, 100 мл) с 0-3% градиентом метанола в хлороформе в качестве элюента приводит к образованию 150 мг продукта DLin-K6S-C1-DMA в виде бледно окрашенного масла.
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 5,24-5,51 (8, м, 4x CH=CH), 4,04 (2Н, dd, 2x OCH)), 3,75 (2Н, dd, OCH), 2,7-2,9 (2Н, ответвление, NCH2), 2,78 (4Н, t, 2x С=С-СН2-С=С), 2,57 (6Н, s, 2x NCH3), 1,95-2,17 (9Н, q, 4x аллиловый СН2 и СН), 1,67-1,95 (2Н, м, СН2), 1,54-1,65 (4Н, м, 2х СН2), 1,22-1,45 (32Н, м), 0,90 (6Н, t, 2x СН3) м.д.
Пример 33. Синтез 2,2-дилинолеил-5-диметиламинобутил-[1,3]-диоксана (DLin-K6S-C4-DMA).
Это соединение синтезируют в виде бледно окрашенного масла, способом, аналогичным описанному в примере 32, отличающимся тем, что 2-гидроксиметил-1,3-пропандиол замещают 2-гидроксибутил1,3-пропандиолом.
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 5,24-5,45 (8, м, 4x СН=СН), 3,79 (2Н, dd, 2x ОСН)), 3,50 (2Н, dd, ОСН), 2,76 (4Н, t, 2x С=С-СН2-С=С), 2,37 (2Н, t, NCH2), 2,31 (6Н, s, 2x NCH3), 2,04 (8Н, q, 4x аллиловый СН2), 1,63-1,90 (3Н, м,), 1,45-1,62 (4Н, м, 2х СН2), 1,22-1,45 (36Н, м), 0,90 (6Н, t, 2x СН3) м.д.
Пример 34. Синтез 2,2-дилинолеил-5-диметиламиноэтил-[1,3]-диоксана (DLin-K6S-C2-DMA).
Это соединение синтезируют в виде бледно-окрашенного масла способом, аналогичным описанному в примере 32, отличающимся тем, что 2-гидроксиметил-1,3-пропандиол замещают 2-гидроксиэтил1,3-пропандиолом.
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 5,25-5,45 (8, м, 4x СН=СН), 3,87 (2Н, dd, 2x OCH)), 3,55 (2Н, dd, ОСН), 2,75 (4Н, t, 2x С=С-СН2-С=С), 2,45-2,60 (2Н, ответвление, NCH2), 2,40 (6Н, s, 2x NCH3), 2,03 (8Н, q, 4x аллиловый СН2), 1,73-1,86 (1H, м), 1,56-1,72 (6Н, м, 2х СН2), 1,22-1,45 (32Н, м), 0,90 (6Н, t, 2x СН3) м.д.
Пример 35. Синтез 2,2-дилинолеил-4-(2-диметиламиноэтил)-[1,3]-диоксана (DLin-K6A-C2-DMA).
- 78 037404
DLin-KiA-CJ-DMA v
5. Синтез 1,3,5-пентантриола (II).
Диэтил 3-гидроксиглутарат (I, 1,0 г, 4,9 ммоль) в безводном ТГФ (10 мл) добавляют по каплям в суспензию LiAlH4 в безводном ТГФ (110 мл) в атмосфере азота на холодной водяной бане. После добавления баню убирают и суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение 2 дней. Полученную смесь гасят на водно-ледяной бане очень медленным добавлением 13 мл соляного раствора. Полученную в результате белую суспензию и смесь перемешивают при комнатной температуре на протяжении ночи. Твердый осадок фильтруют и промывают ТГФ. Фильтрат и промывную жидкость объединяют и растворитель выпаривают, чтобы получить 0,70 г бледно-окрашенного масла. Колоночная хроматография сырьевого продукта (230-400 меш SiO2, 100 мл, 0-12% градиент метанола в хлороформе) дает выход 0,54 г продукта II в виде бесцветного масла.
6. Синтез 2,2-дилинолеил-4-(2-гидроксиэтил)-[1,3]-диоксана (IV).
Смесь дилинолеил кетона (III, 0,80 г, 1,5 ммоль), 1,3,5-пентантриола (II, 0,54 г, 4,5 ммоль) и пиридиния р-толуолсульфоната (60 мг, 0,24 ммоль) в 150 мл толуола кипятят на протяжении ночи в среде азота с насадкой Дина-Старка для удаления воды. Полученную смесь охлаждают до комнатной температуры. Органическую фазу промывают водой (2x75 мл), соляным раствором (75 мл) и высушивают безводным Na2SO4. Выпаривание растворителя приводит к образованию бледно-окрашенного масла (1,1 г). Неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 75 мл) 0-3% градиентом метанола в дихлорметане в качестве элюента. Это дает 0,75 г (79%) чистого IV в виде бесцветного масла.
7. Синтез 2,2-дилинолеил-4-(2-метансульфонилэтил)-[1,3]-диоксана (V).
К раствору 2,2-дилинолеил-4-(2-гидроксиэтил)-[1,3]-диоксана (IV, 0,75 г, 1,2 ммоль) и сухого триэтиламина (0,58 г, 5,7 ммоль) в 40 мл безводного CH2Cl2 в атмосфере азота добавляют метансульфониловый ангидрид (0,50 г, 2,9 ммоль). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре на протяжении ночи. Органическую фазу промывают водой (2x50 мл), соляным раствором (50 мл) и высушивают безводным Na2SO4. Растворитель выпаривают, что дает 0,80 г бледно-окрашенного масла в качестве неочищенного продукта. Неочищенный (сырьевой) продукт используют в следующем шаге без дальнейшей очистки.
8. Синтез 2,2-дилинолеил-4-(2-диметиламиноэтил)-[1,3]-диоксана (DLin-K6A-C2-DMA).
К описанному выше сырьевому материалу (V, 0,80 г) в атмосфере азота добавляют 15 мл диметиламина в ТГФ (2,0М). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 6 дней. Твердый осадок фильтруют. После выпаривания растворителя получают маслянистый остаток. Колоночная хроматография на силикагеле (230-400 меш, 100 мл) с 0-6% градиентом метанола в дихлорметане в качестве элюента приводит к образованию 0,70 г продукта DLin-K6A-C2-DMA в виде бледно окрашенного масла.
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 5,28-5,45 (8, м, 4x СН=СН), 3,85-4,0 (2Н, м, 2x OCH), 3,78 (1H, dd, OCH), 2,78 (4Н, t, 2x С=С-СН2-С=С), 2,55-2,90 (2Н, ответвление, NCH2), 2,47 (6Н, s, 2x NCH3), 2,05 (8Н, q, 4x аллиловый СН2), 1,65-1,90 (4Н, м, СН2), 1,47-1,65 (4Н, м, СН2), 1,1-1,65 (36Н, м), 0,90 (6Н, t, 2x СН3)
м.д.
Пример 36. Синтез 2,2-дилинолеил-4-(3-диметиламинопропил)-[1,3]-дниоксаа (DLin-K6A-C3-DMA).
- 79 037404
5. Синтез 1,3,6-гексантриола (II).
Диэтил β-кетоадипат (I, 1,86 г, 8,6 ммоль) в атмосфере аргона на водно-ледяной бане добавляют по каплям в суспензию LiAlH4 в безводном ТГФ (90 мл). После добавления баню убирают и суспензию перемешивают при комнатной температуре на протяжении ночи. Полученную смесь очень медленно гасят добавлением 10 мл соляного раствора на водно-ледяной бане. Полученную в результате белую суспензию и смесь перемешивают при комнатной температуре на протяжении ночи. Твердый осадок фильтруют и промывают ТГФ с последующим промыванием EtOH (2x50 мл). Фильтрат и промывную жидкость объединяют и растворитель выпаривают, чтобы получить 0,90 г бледно-окрашенного масла. Колоночная хроматография сырьевого продукта (230-400 меш SiO2, 100 мл, 0-10% градиент метанола в дихлорметан) дает выход 0,70 г продукта II в виде бесцветного масла.
6. Синтез 2,2-дилинолеил-4-(3-гидроксипропил)-[1,3]-диоксана (IV).
Смесь из дилинолеил кетона (III, 1,80 г, 3,4 ммоль), 1,3,6-гексантриола (II, 0,50 г, 3,7 ммоль) и пиридиния р-толуолсульфоната (100 мг, 0,40 ммоль) в 120 мл толуола кипятят в атмосфере аргона в течение 3 ч с насадкой Дина-Старка для удаления воды. Полученную смесь охлаждают до комнатной температуры. Органическую фазу промывают водой (2x50 мл), соляным раствором (50 мл) и высушивают безводным Na2SO4. Выпаривание растворителя приводит к образованию бледно-окрашенного масла (2,0 г). Неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 50 мл) с 0-3% градиентом метанола в дихлорметане в качестве элюента. Это дает 0,90 г (41%) чистого продукта IV в виде бесцветного масла.
7. Синтез 2,2-дилинолеил-4-(3-метансульфонилпропил)-[1,3]-диоксана (V).
К раствору 2,2-дилинолеил-4-(3-гидроксипропил)-[1,3]-диоксана (IV, 0,97 г, 1,5 ммоль) и сухого триэтиламина (0,44 г, 4,3 ммоль) в 60 мл безводного C^Ch в атмосфере аргона добавляют метансульфониловый ангидрид (0,60 г, 3,5 ммоль). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре на протяжении ночи. Органическую фазу промывают водой (2x30 мл), соляным раствором (30 мл) и высушивают безводным MgSO4. Растворитель выпаривают, что дает 1,1 г бледно-окрашенного масла в качестве неочищенного продукта. Неочищенный продукт используют в следующем шаге без дальнейшей очистки.
8. Синтез 2,2-дилинолеил-4-(3-диметиламинопропил)-[1,3]-диоксана (DLin-K6A-C3-DMA).
К описанному выше сырьевому материалу (V, 1,1 г) в атмосфере аргона добавляют 20 мл диметиламина в ТГФ (2,0М). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 5 дней. Твердый осадок фильтруют. После выпаривания растворителя получают маслянистый остаток. Колоночная хроматография на силикагеле (230-400 меш, 40 мл) с 0-7% градиентом метанола в дихлорметане в качестве элюента приводит к образованию 0,85 г продукта DLin-K6A-C3-DMA в виде бледно окрашенного масла.
1Н ЯМР (400 МГц, CDCla) δ: 5,25-5,45 (8, м, 4x СН=СН), 3,7-4,0 (3Н, м, 3x OCH), 2,77 (4Н, t, 2x
С=С-СН2-С=С), 2,5-2,8 (2Н, ответвление, NCH2), 2,5 (6Н, s, 2x NCH3), 2,05 (8Н, q, 4x аллиловый СН2),
1,65-1,90 (4Н, м, 2x CH2), 1,40-1,65 (4Н, м, 2x СН2), 1,1-1,65 (38Н, м), 0,90 (6Н, t, 2x СН3) м.д.
Пример 37. Синтез 2,2-диарахидонил-4-(2-диметиламиноэтил)-[1,3]-диоксалана (DAra-K5-C2-DMA).
8. Синтез арахидонил бромида (II).
Смесь арахидонил метан сульфоната (1,0 г, 2,7 ммоль) и магния бромида (2,2 г, 12 ммоль) в безводном эфире (40 мл) перемешивают в атмосфере аргона в течение двух дней. Полученную суспензию фильтруют и твердый осадок промывают эфиром (2x10 мл). Фильтрат и промывную жидкость объединяют и растворитель выпаривают. Полученный остаток обрабатывают гексанами (50 мл). Твердый осадок фильтруют, растворитель выпаривают, в результате чего получают маслянистый остаток. Неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 30 мл), элюируют гексанами. Это дает выход 1 г арахидонил бромида (II) в виде бесцветного масла.
9. Синтез диарахидонилметил формиата (III).
К раствору арахидонил бромида (II, 1 г, 3 ммоль) в безводном эфире (30 мл) добавляют стружку
- 80 037404 магния (78 мг, 3,2 ммоль) с последующим добавлением одного кристалла йода. Полученную смесь кипятят в атмосфере азота в течение 10 ч. Смесь охлаждают при комнатной температуре. К мутной смеси в атмосфере азота добавляют этил формиат (0,25 мл) и полученную смесь перемешивают при комнатной температуре на протяжении ночи.
К смеси добавляют 20 мл 10% водного раствора H2SO4. Эфирную фазу разделяют, а водную фазу экстрагируют эфиром (30 мл). Комбинированную органическую фазу промывают водой (2x25 мл), соляным раствором (25 мл) и затем высушивают безводным Na2SO4. Выпаривание растворителя дает 1,1 г бледно-окрашенного масла в качестве неочищенного продукта (III). Неочищенный (сырьевой) продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 40 мл), элюируют 0-3% градиентом этилацетата в гексанах. Это дает 0,43 г (40%) диарахидонилметил формиата (III) в виде бледно окрашенного масла.
10. Синтез диарахидонил метанола (IV).
Описанный выше диарахидонилметил формиат (III, 0,43 г, 0,71 ммоль) и KOH (100 мг) перемешивают в 95% EtOH (20 мл) при комнатной температуре в атмосфере азота на протяжении ночи. По окончании реакции большую часть растворителя выпаривают. Полученную смесь обрабатывают 20 мл раствора 2М HCl. Водную фазу экстрагируют эфиром (2x30 мл). Комбинированный эфирный экстракт промывают водой (2x25 мл), соляным раствором (25 мл) и высушивают безводным Na2SO4. Выпаривание растворителя дает 0,44 г вещества IV в виде бледно-окрашенного масла. Неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 40 мл) элюируют 0-5% градиентом этилацетата в гексанах. Это дает выход 0,41 г диарахидонил метанола (IV) в виде бесцветного масла.
11. Синтез диарахидонил кетона (V).
К смеси диарахидонил метанола (IV, 0,41 г, 0,71 ммоль) и безводного карбоната калия (0,05 г) в 10 мл CH2Cl2 добавляют пиридиния хлорохромат (ПХХ, 0,50 г, 2,3 ммоль). Полученную суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение 90 мин. Затем в смесь добавляют эфир (50 мл) и полученную в результате коричневую суспензию фильтруют через слой флоресила (30 мл). Этот слой далее промывают эфиром (3x30 мл). Эфирный фильтрат и промывную жидкость объединяют. Выпаривание растворителя дает 0,40 г маслянистого остатка в качестве сырьевого продукта. Неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 10 мл), элюируют 0-3% эфиром в гексанах. Это дает 0,30 г (75%) диарахидонил кетона (V).
Ή ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 5,3-5,5 (16Н, м, 8x СН=СН), 2,82 (12Н, t, 6x С=С-СН2-С=С), 2,40 (4Н, t, 2x СО-СН2), 2,08 (8Н, м, 4x аллиловый СН2), 1,25-1,65 (20Н, м), 0,90 (6Н, t, 2x СН3) м.д.
12. Синтез 2,2-диарахидонил-4-(2-гидроксиэтил)-[1,3]-диоксалана (VI).
Смесь диарахидонил кетона (V, 0,30 г, 0,52 ммоль), 1,2,4-бутантриола (0,25 г, 2,4 ммоль) и пиридиния р-толуолсульфоната (20 мг) в 60 мл толуола кипятят в атмосфере аргона на протяжении ночи с насадкой Дина-Старка для удаления воды. Полученную смесь охлаждают до комнатной температуры. Органическую фазу промывают водой (2x30 мл), соляным раствором (30 мл) и высушивают безводным Na2SO4. Выпаривание растворителя приводит к образованию желтоватого маслянистого остатка. Неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 40 мл) с 0-2% метанолом в дихлорметане в качестве элюента. Это дает 0,29 г (84%) чистого продукта VI в виде бледно-окрашенного масла.
13. Синтез 2,2-диарахидонил-4-(2-метансульфонилэтил)-[1,3]-диоксалана (VII).
К раствору 2,2-диарахидонил-4-(2-гидроксиэтил)-[1,3]-диоксалана (VI, 0,29 г, 0,43 ммоль) и сухого триэтиламина (254 мг, 2,5 ммоль) в 20 мл безводного CH2Cl2 в атмосфере азота добавляют метансульфониловый ангидрид (0,20 г, 1,1 ммоль). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре на протяжении ночи. Смесь разбавляют 30 мл CH2Cl2. Органическую фазу промывают водой (2x25 мл), соляным раствором (25 мл) и высушивают безводным MgSO4. Растворитель выпаривают, что дает 0,30 г бледно-окрашенного масла. Неочищенный продукт используют в следующем шаге без дальнейшей очистки.
14. Синтез 2,2-диарахидонил-4-(2-диметиламиноэтил)-[1,3]-диоксалана (DAra-K5-C2-DMA).
К описанному выше сырьевому материалу (VII, 0,30 г) в атмосфере аргона добавляют 15 мл диметиламина в ТГФ (2,0М). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 6 дней. После выпаривания растворителя получают маслянистый остаток. Колоночная хроматография на силикагеле (230-400 меш, 40 мл) с 0-5% градиентом метанола в дихлорметане в качестве элюента приводит к образованию 0,18 г продукта DAra-K5-C2-DMA в виде бледно-окрашенного масла.
Ή ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 5,3-5,5 (16Н, м, 8x СН=СН), 4,0-4,17 (2Н, м, 2x OCH), 3,49 (1Н, t, OCH), 2,65-2,85 (14Н, м, 6x С=С-СН2-С=С, NCH2), 2,55 (6Н, s, ответвление, 2x NCH3), 2,06 (8Н, м, 4x аллиловый СН2), 1,80-1,92 (2Н, м, СН2), 1,4-1,75 (4Н, м, 2x СН2), 1,22-1,45 (20Н, м), 0,90 (6Н, t, 2x СН3) м.д.
Пример 38. Синтез 2,2-дидокозагексаеноил-4-(2-диметиламиноэтил)-[1,3]-диоксалана (DDha-K5C2-DMA).
- 81 037404 гч. «хч. ^OSO^CHj МсВь эфир
Ii Mg,эфир II > Этнлфэршт
DDha»K5-C2-DMA
8. Синтез докозагексаеноил бромида (II).
Смесь докозагексаеноил метан сульфоната (2,0 г, 5,1 ммоль) и магния бромида (4,3 г, 23 ммоль) в безводном эфире (100 мл) перемешивают в атмосфере аргона на протяжении ночи. Полученную суспензию фильтруют и твердый осадок промывают эфиром (2x30 мл), Фильтрат и промывную жидкость объединяют и растворитель выпаривают. Полученный в результате остаток очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 40 мл), элюируют гексанами. Это дает выход 2,2 г докозагексаеноил бромида (II) в виде бесцветного масла.
9. Синтез дидокозагексаеноилметил формиата (III).
К раствору докозагексаеноил бромида (II, 2,2 г, 6,0 ммоль) в безводном эфире (60 мл) добавляют стружку магния (145 мг, 6,0 ммоль) с последующим добавлением одного кристалла йода. Полученную смесь кипятят в атмосфере аргона в течение 5 ч. Смесь охлаждают до комнатной температуры. К мутной смеси в атмосфере аргона добавляют этил формиат (0,50 мл) и полученную смесь перемешивают при комнатной температуре на протяжении ночи. К смеси добавляют 40 мл 5% водного раствора H2SO4. Эфирную фазу разделяют, а водную фазу экстрагируют эфиром (50 мл). Комбинированную органическую фазу промывают водой (2x50 мл), соляным раствором (50 мл), а затем высушивают безводным MgSO4. Выпаривание растворителя дает 2,3 г желтоватого масла в качестве неочищенного продукта (III). Неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 50 мл), элюируют 0-7% градиентом этилацетата в гексанах. Это дает 1,38 г (65%) дидокозагексаеноилметил формиата (III) в виде бледно-окрашенного масла.
10. Синтез дидокозагексаеноил метанола (IV).
Описанный выше дидокозагексаеноилметил формиат (III, 1,38 г, 2,1 ммоль) и KOH (300 мг) перемешивают в 90% EtOH (70 мл) при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 90 мин. По окончании реакции большую часть растворителя выпаривают. Полученную смесь обрабатывают 60 мл раствора 2М HCl. Водную фазу экстрагируют эфиром (2x75 мл). Комбинированный эфирный экстракт промывают водой (2x50 мл), соляным раствором (50 мл) и высушивают безводным MgSO4. Выпаривание растворителя дает 1,18 г чистого продукта IV в виде желтоватого масла. Неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 50 мл), элюируют 0-6% градиентом этилацетата в гексанах. Это дает выход 1,0 г дидокозагексаеноил метанола (IV) в виде бесцветного масла.
11. Синтез дидокозагексаеноил кетона (V).
К смеси дидокозагексаеноил метинола (IV, 1,2 г, 1,9 ммоль) и безводного карбоната калия (0,1 г) в 30 мл CH2Cl2, добавляют пиридиния хлорохромат (ПХХ, 1,05 г, 4,8 ммоль). Полученную суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Затем в смесь добавляют эфир (120 мл) и полученную в результате коричневую суспензию фильтруют через слой силикагеля (75 мл). Этот слой далее промывают эфиром (3x75 мл). Эфирный фильтрат и промывную жидкость объединяют. Выпаривание растворителя дает 1,3 г маслянистого остатка в качестве неочищенного продукта. Неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 40 мл), элюируют 0-3% этилацетатом в гексанах. Это дает 0,83 г (69%) дидокозагексаеноил кетона (V).
12. Синтез 2,2-дидокозагексаеноил-4-(2-гидроксиэтил)-[1,3]-диоксалана (VI).
Смесь диарахидонил кетона (V, 0,43 г, 0,69 ммоль), 1,2,4-бутантриола (0,35 г, 3,3 ммоль) и пириди
- 82 037404 ния р-толуолсульфоната (50 мг) в 75 мл толуола кипятят в атмосфере аргона на протяжении ночи с насадкой Дина-Старка для удаления воды. Полученную смесь охлаждают до комнатной температуры. Органическую фазу промывают водой (2x30 мл), соляным раствором (30 мл) и высушивают безводным MgSO4. Выпаривание растворителя приводит к образованию желтоватого маслянистого остатка. Неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 40 мл) 02% метанолом в дихлорметане в качестве элюента. Это дает 0,43 г (95%) чистого VI в виде бледно окрашенного масла.
13. Синтез 2,2-дидокозагексаеноил-4-(2-метансульфонилэтил)-[1,3]-диоксалана (VII).
К раствору 2,2-дидокозагексаеноил-4-(2-гидроксиэтил)-[1,3]-диоксалана (VI, 0,42 г, 0,59 ммоль) и сухого триэтиламина (300 мг, 2,9 ммоль) в 50 мл безводного CH2Cl2, в атмосфере азота добавляют метансульфониловый ангидрид (0,25 г, 1,4 ммоль). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре на протяжении ночи. Органическую фазу промывают водой (2x25 мл), соляным раствором (25 мл) и высушивают безводным MgSO4 Растворитель выпаривают, что дает 0,43 г бледно-окрашенного масла. Неочищенный продукт используют в следующем шаге без дальнейшей очистки.
14. Синтез 2,2-дидокозагексаеноил-4-(2-диметиламиноэтил)-[1,3]-диоксалана (DDha-K5-C2-DMA).
К описанному выше сырьевому материалу (VII, 0,43 г) в атмосфере аргона добавляют 15 мл диметиламина в ТГФ (2,0М). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 6 дней. После выпаривания растворителя получают маслянистый остаток. Колоночная хроматография на силикагеле (230-400 меш, 40 мл) с 0-5% градиентом метанола в дихлорметане в качестве элюента приводит к образованию 0,31 г продукта DDha-K5-C2-DMA в виде желтоватого масла.
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 5,25-5,45 (24Н, м, 12x СН=СН), 4,05-4,17 (2Н, м, 2x OCH), 3,50 (1H, t, OCH), 2,87-3,15 (2Н, ответвление, NCH2) 2,73-2,87 (20Н, m, 10x С=С-СН2-С=С), 2,65 (6Н, s, ответвление, 2x NCH3), 2,06 (8Н, м, 4x аллиловый СН2), 2,0-2,2 (2Н, м, СН2), 1,75-1,95 (2Н, м, СН2), 1,3-1,65 (8Н, м, 4x СН2), 0,90 (6Н, t, 2x СН3) м.д.
Пример 39. Синтез 4-диметиламиномасляной кислоты 1-октадека-6,9,12-триенил-нонадека-7,10,13триенил эфира (005-14).
в круглодонную колбу, наполненную DLen(Y)-MeOH (005-12, 262 мг, 0,5
4-диметиламиномасляной кислоты (101 мг, 0,6 ммоль) и 4В атмосфере аргона ммоль), гидрохлоридом (диметиламин)пиридином (13 мг) в дихлорметане (5 мл), добавляют дициклогексилкарбодиимид (134 мг). После перемешивания смеси в течение 16 ч при температуре окружающей среды растворитель выпаривают и остаток переносят в диэтилэфир. Белый осадок удаляется путем фильтрации. Фильтрат концентрируют досуха (0,4 г масла). Остаток очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 50 мл), элюируют от 2 до 3% метанолом в дихлорметане. Фракции, содержащие чистый продукт, объединяют и концентрируют. Остаток пропускают через слой силикагеля (2 мм), промывают гексанами (6 мл). Затем фильтрат концентрируют и высушивают в условиях высокого вакуума в течение 1 ч. Это дает выход 166 мг (0,26 ммоль, 53%) продукта 005-14 в виде прозрачного, слегка желтого масла.
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 5,41-5,26 (м, 12Н, СН=СН), 4,83 (квинтет, J=6 Гц, 1H), 2,77 (tподобный, J=5,2 Гц, 8Н), 2,29 (t, J=7,6 Гц, 2Н), 2,25 (t, J=7,6, 2Н), 2,18 (s, 6Н), 2,02 (q-подобный, J=6,8 Гц, 8Н), 1,75 (квинтет-подобный, J=7,6 Гц, 2Н), 1,48 (м, 4Н), 1,37-1,20 (м, 24Н), 0,86 (t, J=6,8 Гц, 6Н) м.д.
Пример 40. Синтез 5-диметиламин-пентановой кислоты 1-октадека-6,9,12-триенил-нонадека7,10,13-триенил эфира (005-23).
- 83 037404
Шаг 1,005-21.
В атмосфере аргона в круглодонную колбу, наполненную DLen(Y)-MeOH (005-12, 262 мг, 0,5 ммоль), 5-бромовалериановой кислотой (181 мг, 1,0 ммоль) и 4-(диметиламин)пиридином (30 мг) в дихлорметане (10 мл), добавляют дициклогексилкарбодиимид (227 мг). После перемешивания смеси в течение 16 ч при температуре окружающей среды растворитель выпаривают и остаток переносят в гексаны. Белый осадок удаляют фильтрацией. Фильтрат концентрируют досуха. Остаток очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 50 мл), элюируют ацетатом в гексанах (0-2%). Фракции, содержащие чистый продукт, объединяют и концентрируют. Это дает выход 290 мг (0,42 ммоль, 84%) продукта 005-21 в виде слегка желтого масла.
Шаг 2 005-23.
К продукту 005-21 (290 мг) добавляют диметиламин (2M в ТГФ, 10 МЛ). Раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 6 дней. Избыток амина и растворитель выпаривают. Неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 50 мл) метанолом в дихлорметане (1-3%). Фракции, содержащие продукт, объединяют и концентрируют. Оставшееся масло пропускают через целитный слой и промывают гексанами (6 мл). Затем фильтрат концентрируют и высушивают в условиях высокого вакуума в течение 2 ч. Это дает выход 204 мг (0,31 ммоль, 74%) продукта 005-23 в виде слегка желтого масла.
% ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 5,43-5,30 (м, 12Н, СН=СН), 4,84 (квинтет, J=6 Гц, 1Н), 2,77 (tподобный, J=5,2 Гц, 8Н), 2,39-2,28 (м, 4Н), 2,28 (s, 6H), 2,06 (q-подобный, J=6,8 Гц, 8Н), 1,66 (квинтетподобный, J=7,2 Гц, 2Н), 1,60-1,48 (м, 6Н), 1,41-1,24 (м, 24Н), 0,90 (t, 6H, J=6,8 Гц) м.д.
Пример 41. Синтез [2-(2,2-диоктадека-6,9,12-триенил-[1,3]диоксолан-4-ил)-этил]диметиламина (005-31).
Шаг 1, 005-28.
К смеси дилиноленил (γ) метанола (005-12, 550 мг, 1,05 ммоль) и безводного карбоната калия (58 мг) в 25 мл безводного CH2Cl2 добавляют пиридиния хлорохромат (ПХХ, 566 мг, 2,63 ммоль, 2,5 экв.).
- 84 037404
Полученную суспензию перемешивают при комнатной температуре в течение 90 мин. Затем в смесь добавляют эфир (100 мл) и полученную в результате коричневую суспензию фильтруют через слой силикагеля (150 мл). Слой силикагеля далее промывают эфиром (3x50 мл), Эфирный фильтрат и промывную жидкость соединяют. Выпаривание растворителя дает 510 мг маслянистого остатка в качестве неочищенного продукта. Неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 50 мл), элюируют 0-3% этилацетатом в гексанах. Это дает выход 344 г (63%) названного продукта (005-28).
Шаг 2, 005-29.
Смесь из продукта 005-28 (344 мг, 0,66 ммоль), 1,2,4-бутантриола (349 мг, 3,2 ммоль) и пиридиния р-толуолсульфоната (30 мг) в 50 мл толуола нагревают до кипения в атмосфере аргона на протяжении ночи с насадкой Дина-Старка для удаления воды. Полученную смесь охлаждают до комнатной температуры. Органическую фазу промывают водой (30 мл) (бутантриол не растворяется в толуоле, поэтому раствор просто сцеживают и триол оставляют), соляным раствором (30 мл) и высушивают безводным Na2SO4. Выпаривание растворителя приводит к образованию желтоватого маслянистого остатка. Неочищенный продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 40 мл), элюируют 4% этилацетатом в гексанах. Фракции, содержащие чистый продукт, объединяют и концентрируют. Это дает 337 мг (83%) чистого продукта 005-29 в виде бесцветного масла.
Шаг 3, 005-30.
К раствору продукта 005-29 (337 мг, 0,55 ммоль) и сухого триэтиламина (0,28 мл, 2 ммоль) в 30 мл безводного CH2Cl2 в атмосфере азота добавляют метансульфониловый ангидрид (310 мг, 1,78 ммоль). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре на протяжении ночи. Смесь разбавляют 30 мл CH2Cl2. Органическую фазу промывают водой (2x25 мл), соляным раствором (25 мл) и высушивают безводным MgSO4. Растворитель выпаривают, что дает 377 г заданного продукта в виде бесцветного прозрачного масла (99%). Продукт является достаточно чистым и его используют в следующем шаге без дальнейшей очистки.
Шаг 4, 005-31.
К продукту 005-30 (377 мг) в атмосфере аргона добавляют 15 мл диметиламина в ТГФ (2,0М). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 6 дней. После выпаривания растворителя получают маслянистый остаток. С помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230400 меш, 40 мл) элюируют 3% метанолом в дихлорметане. Фракции, содержащие чистый продукт, объединяют и концентрируют, чтобы получить 314 мг названного продукта (005-31) в виде прозрачного бледно-окрашенного масла.
Ή ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 5,41-5,26 (м, 12Н, СН=СН), 4,06 (м, 1H), 4,01 (dd, 1H, J=7,5, 7,5 Гц), 3,45 (dd, 1Н, J=7,5, 7,5 Гц), 2,77 (t-подобный, J=5,6 Гц, 8Н), 2,36 (м, 1Н), 2,26 (м, 1Н), 2,19 (s, 6H), 2,02 (qподобный, J=6,8 Гц, 8Н), 1,78 (м, 1Н), 1,67 (м, 1Н), 1,60-1,51 (м, 4Н), 1,38-1,21 (м, 24Н), 0,86 (t, 6H, J=6,8 Гц) м.д.
Пример 42. Синтез 4-(2-метил-азиридин-1-ил)масляной кислоты 1-октадека-9,12-диенил-нонадека10,13-диенил эфира (005-18).
Шаг 1, 005-13. В атмосфере аргона в круглодонную колбу, наполненную DLin-MeOH (001-17, 528,9 мг), 4-бромомасляной кислотой (200 мг) и 4-(диметиламин)пиридином (25 мг) в дихлорметане (10 мл), добавляют дициклогексилкарбодиимид (268 мг). После перемешивания смеси в течение 16 ч при температуре окружающей среды, растворитель выпаривают и остаток переносят в диэтилэфир. Белый осадок (DCU) удаляют с помощью фильтрации. Фильтрат концентрируют и полученное в результате остаточное масло очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 50 мл), элюируют 0-1% этилацетатом в гексанах. Это дает выход 0,44 г (65%) продукта 005-13 в виде бесцветного масла.
Шаг 2, 005-18.
Смесь из продукта 005-13 (0,44 г, 0,65 ммоль), 2-метилазиридина (148 мг, 2,6 ммоль, тех. 90%), Cs2CO3 (2,6 ммоль) и ТБАИ (2,4 ммоль) в ацетонитриле (10 мл) перемешивают в среде аргона в течение 4 дней. После удаления растворителя к остатку добавляют гексаны и воду. Две фазы разделяют с после
- 85 037404 дующим экстрагированием водной фазы гексанами (X 2). Комбинированную органическую фазу высушивают сульфатом натрия и концентрируют досуха. Полученное в результате остаточное масло очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 50 мл), элюируют от 1 до 3% метанолом в дихлорметане. Фракции, содержащие продукт, объединяют и концентрируют (200 мг масла). Затем снова очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230-400 меш, 50 мл), элюируют градиентом этилацетата в гексанах (5-20%). Фракции, содержащие чистый продукт, объединяют и концентрируют. Это дает выход 96 мг (33%) продукта 005-18 в виде бесцветного масла.
1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ: 5,43-5,30 (м, 8Н, СН=СН), 4,87 (квинтет, J=6 Гц, 1Н), 2,78 (t-подобный, J=6 Гц, 4Н), 2,39 (t-подобный, J=7,8 Гц, 2Н), 2,26 (t-подобный, 2Н), 2,06 (q-подобный, J=6,8 Гц, 8Н), 1,89 (квинтет-подобный, J=7,2 Гц, 2Н), 1,56-1,48 (м, 5Н), 1,41-1,24 (м, 38Н), 1,18 (d, J=5,2 Гц, 3Н), 0,90 (t, 6H, J=6,8 Гц) м.д.
Пример 43. Синтез 4-диметиламин-бут-2-еновой кислоты 1-октадека-9,12-диенил-нонадека-10,13диенилэфира (005-34).
Шаг 1, 005-32.
В атмосфере аргона в круглодонную колбу, наполненную DLin-MeOH (001-17, 528,9 мг, 1 ммоль), 4-бромкротоновой кислотой (330 мг, 2 ммоль) и 4-(диметиламин)пиридином (49 мг) в дихлорметане (10 мл), добавляют дициклогексилкарбодиимид (454 мг, 2,2 ммоль). После перемешивания смеси в течение 16 ч при температуре окружающей среды осадок удаляют с помощью фильтрации, твердый осадок промывают дихлорметаном. К фильтрату добавляют 4-бромкротоновую кислоту (165 мг), 4(диметиламин)пиридин (15 мг) и в заключение дициклогексилкарбодиимид (250 мг). После перемешивания смеси в течение 16 ч при температуре окружающей среды растворитель выпаривают и остаток переносят в гексаны. Белый осадок DCU удаляют с помощью фильтрации. Фильтрат концентрируют и полученное в результате остаточное масло (587 мг) используют в следующем шаге без дальнейшей очистки.
Шаг 2, 005-34.
К сырью 005-32 (587 мг) в атмосфере аргона добавляют 7 мл диметиламина в ТГФ (2,0М). Полученную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 3 дней. Масляный остаток получают после выпаривания растворителя и очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (230400 меш, 40 мл), элюируют дихлорметаном 100 мл, от 1 до 3% метанола в дихлорметане. Фракции, содержащие чистый продукт, объединяют и концентрируют, чтобы получить коричневатое масло (XD-00534, 69 мг, 11% из DLin-MeOH, 001-17),
1Н ЯМР (600 МГц, CDCl3) δ: 6,92 (dt, J=6,2 Гц, 15,7 Гц, 1Н), 5,97 (d, J=15,7 Гц), 5,41-5,31 (8Н, м, СН=СН), 4,93 (квинтет, J=6,7 Гц, 1Н), 3,07 (dd, J=1,1 Гц, 6,2 Гц, 2Н), 2,78 (t, J=6,9 Гц, 4Н), 2,27 (s, 6Н), 2,05 (м, 8Н), 1,58-1,52 (м, 4Н), 1,39-1,24 (м, 36Н), 0,90 (t, 6H, J=6,8 Гц) м.д.
Различные варианты экспериментов, описанные выше, могут быть скомбинированы чтобы обеспечить дальнейшие варианты. Все публикации патентов США, заявок на патент США, иностранные патенты, иностранные патентные заявки и непатентные публикации, упомянутые в данной спецификации и/или перечисленные в листе заявок (Application Data Sheet), представлены здесь в качестве ссылок, в полном объеме. Аспекты вариантов могут быть модифицированы, если необходимо использовать концепции различных патентов, заявок и публикаций, чтобы обеспечить дальнейшие варианты.
Те или иные изменения могут быть выполнены в вариантах в свете информации, подробно изложенной выше. Таким образом, в изобретениях, заявленных в последующем, используемые здесь термины должны рассматриваться не для ограничения таких заявок в конкретных областях/вариантах раскрытия, представленного в описании изобретения, а для того, чтобы включить все возможные варианты при рассмотрении полного спектра аналогичных вариантов, к которым такие заявленные раскрытия имеют отношение. Соответственно, заявленные изобретения не ограничиваются данным раскрытием.

Claims (20)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Липид, имеющий формулу
    XXXIII или его соль или диастереомер, где каждый из R1 и R2 независимо в каждом случае представляет собой С10-С30алкенил или С10С30алкинил;
    R3 представляет собой ω-аминоС1-6алкил или ω-(С1-6алкиламино)С1-6алкил или ω-(ди(С1-6алкил)амино)С1-6алкил и
    Е представляет собой С(О)О;
    при условии, что если R3 представляет собой 2-(диметиламино)этил, каждый из R1 и R2 не представляет собой линолеил.
  2. 2. Липид по п.1, отличающийся тем, что R3 представляет собой ω-аминоС1-6алкил.
  3. 3. Липид по п.1, отличающийся тем, что R3 представляет собой ω-(С1-6алкиламино)С1-6алкил.
  4. 4. Липид по п.1, отличающийся тем, что R3 представляет собой 2-(диметиламино)этил, 3(диизопропиламино)пропил или 3 -(N-этил-N-изопропиламино)-1 -метилпропил.
  5. 5. Липид по п.1, отличающийся тем, что R3 представляет собой ω-(С1-6алкиламино)С1-6алкил или ω(ди(С1 -6алкил)амино)С1 -6алкил.
  6. 6. Липид по п.1, отличающийся тем, что каждый из Ri и R2 представляет собой С10-С30алкенил.
  7. 7. Липид по п.1, отличающийся тем, что каждый из R1 и R2 представляет собой линолеил.
  8. 8. Липидная частица для доставки терапевтического агента, содержащая липид по п.1.
  9. 9. Липидная частица по п.8, отличающаяся тем, что дополнительно содержит нейтральный липид и липид, способный снижать агрегацию.
  10. 10. Липидная частица по п.9, отличающаяся тем, что липид, способный снижать агрегацию, представляет собой ПЭГ-липид.
  11. 11. Липидная частица по п.8, отличающаяся тем, что дополнительно содержит терапевтическое средство.
  12. 12. Липидная частица по п.11, отличающаяся тем, что терапевтическое средство является нуклеиновой кислотой.
  13. 13. Липидная частица по п.12, отличающаяся тем, что нуклеиновая кислота выбрана из группы, состоящей из миРНК и антисмыслового олигонуклеотида.
  14. 14. Липидная частица по п.13, где нуклеиновая кислота является миРНК.
  15. 15. Липидная частица по п.11, отличающаяся тем, что терапевтическое средство представляет собой мРНК.
  16. 16. Липидная частица по п.8, содержащая липид по п.1, нейтральный липид, холестерин и ПЭГлипид, причем указанные липид по п.1, нейтральный липид, холестерин и ПЭГ-липид присутствуют в молярном соотношении 20-70%:5-45%:20-55%:0,5-15% соответственно.
  17. 17. Фармацевтическая композиция для доставки терапевтического агента, содержащая липидную частицу по п.11 и фармацевтически приемлемый наполнитель, носитель или растворитель.
  18. 18. Способ модуляции экспрессии гена-мишени в клетке, включающий обеспечение клетки липидной частицей по п.12.
  19. 19. Способ по п.18, отличающийся тем, что терапевтическое средство выбрано из миРНК и антисмыслового олигонуклеотида.
  20. 20. Способ лечения заболевания или нарушения у субъекта, которое отличается чрезмерной экспрессией полипептида, включающий обеспечение субъекта фармацевтической композицией по п.17, при этом терапевтическое средство выбирают из миРНК и антисмыслового олигонуклеотида, где миРНК или антисмысловый олигонуклеотид содержат полинуклеотид, который специфически связывается с полинуклеотидом, кодирующим указанный полипептид.
EA201170553A 2008-11-10 2009-11-10 Липиды и композиции для доставки лекарственных средств EA037404B1 (ru)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11317908P 2008-11-10 2008-11-10
US15435009P 2009-02-20 2009-02-20
US17143909P 2009-04-21 2009-04-21
US18543809P 2009-06-09 2009-06-09
US22589809P 2009-07-15 2009-07-15
US23409809P 2009-08-14 2009-08-14
PCT/US2009/063927 WO2010054401A1 (en) 2008-11-10 2009-11-10 Novel lipids and compositions for the delivery of therapeutics

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201170553A1 EA201170553A1 (ru) 2012-05-30
EA037404B1 true EA037404B1 (ru) 2021-03-24

Family

ID=42153319

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201170553A EA037404B1 (ru) 2008-11-10 2009-11-10 Липиды и композиции для доставки лекарственных средств
EA201170554A EA037285B8 (ru) 2008-11-10 2009-11-10 Липиды и композиции для доставки лекарственных средств

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201170554A EA037285B8 (ru) 2008-11-10 2009-11-10 Липиды и композиции для доставки лекарственных средств

Country Status (19)

Country Link
US (16) US8999351B2 (ru)
EP (10) EP3207944B1 (ru)
JP (18) JP5832898B2 (ru)
KR (12) KR102459839B1 (ru)
CN (6) CN111808084A (ru)
AU (19) AU2009313206B2 (ru)
CA (7) CA2743135C (ru)
DK (1) DK2355851T3 (ru)
EA (2) EA037404B1 (ru)
ES (1) ES2666701T3 (ru)
HK (2) HK1246166A1 (ru)
HU (1) HUE037082T2 (ru)
IL (9) IL301340A (ru)
MX (7) MX347860B (ru)
NO (1) NO2355851T3 (ru)
PL (1) PL2355851T3 (ru)
PT (1) PT2355851T (ru)
SG (3) SG195653A1 (ru)
WO (3) WO2010054406A1 (ru)

Families Citing this family (431)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9228186B2 (en) 2002-11-14 2016-01-05 Thermo Fisher Scientific Inc. Methods and compositions for selecting siRNA of improved functionality
ES2423060T3 (es) 2004-03-12 2013-09-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Agentes iRNA que tienen como diana al VEGF
AU2005252273B2 (en) 2004-06-07 2011-04-28 Arbutus Biopharma Corporation Lipid encapsulated interfering RNA
EP3578656B1 (en) 2006-05-11 2021-01-06 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of the pcsk9 gene
CA2739170A1 (en) 2008-09-25 2010-04-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of serum amyloid a gene
EP2350043B9 (en) 2008-10-09 2014-08-20 TEKMIRA Pharmaceuticals Corporation Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids
EP2344639B1 (en) 2008-10-20 2015-04-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of transthyretin
EP3207944B1 (en) 2008-11-10 2020-01-15 Arbutus Biopharma Corporation Novel lipids and compositions for the delivery of therapeutics
NZ593618A (en) 2008-12-10 2013-02-22 Alnylam Pharmaceuticals Inc Gnaq targeted dsrna compositions and methods for inhibiting expression
AU2010245933B2 (en) 2009-05-05 2016-06-16 Arbutus Biopharma Corporation Methods of delivering oligonucleotides to immune cells
AU2010259984B2 (en) * 2009-06-10 2017-03-09 Arbutus Biopharma Corporation Improved lipid formulation
US9051567B2 (en) 2009-06-15 2015-06-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Methods for increasing efficacy of lipid formulated siRNA
EP2442792A4 (en) 2009-06-15 2015-12-23 Alnylam Pharmaceuticals Inc DOUBLE STRANDED RNA IN LIPID FORMULATION TARGETING THE PCSK9 GENE
IL292615B2 (en) 2009-07-01 2023-11-01 Protiva Biotherapeutics Inc Nucleic acid-lipid particles, preparations containing them and their uses
US9018187B2 (en) 2009-07-01 2015-04-28 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
US8236943B2 (en) 2009-07-01 2012-08-07 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing apolipoprotein B
US8569256B2 (en) 2009-07-01 2013-10-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Cationic lipids and methods for the delivery of therapeutic agents
WO2011011447A1 (en) 2009-07-20 2011-01-27 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing ebola virus gene expression
AP2015008874A0 (en) * 2009-08-14 2015-11-30 Alnylam Pharmaceuticals Inc Lipid formulated compositions and methods for inhibiting expression of a gene from the ebola virus
WO2011022460A1 (en) 2009-08-20 2011-02-24 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel cationic lipids with various head groups for oligonucleotide delivery
US9187746B2 (en) 2009-09-22 2015-11-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Dual targeting siRNA agents
EP2480668A2 (en) 2009-09-23 2012-08-01 Protiva Biotherapeutics Inc. Compositions and methods for silencing genes expressed in cancer
JP5723378B2 (ja) 2009-11-03 2015-05-27 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． トランスサイレチン（ｔｔｒ）を阻害する脂質製剤化組成物及び方法
RU2573409C2 (ru) 2009-11-04 2016-01-20 Дзе Юниверсити Оф Бритиш Коламбиа Содержащие нуклеиновые кислоты липидные частицы и относящиеся к ним способы
ES2713852T3 (es) 2009-12-01 2019-05-24 Translate Bio Inc Derivado de esteroides para la administración de ARNm en enfermedades genéticas humanas
WO2011071860A2 (en) 2009-12-07 2011-06-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions for nucleic acid delivery
AU2010330814B2 (en) * 2009-12-18 2017-01-12 Acuitas Therapeutics Inc. Methods and compositions for delivery of nucleic acids
EP3721943A1 (en) * 2009-12-23 2020-10-14 Novartis AG Lipids, lipid compositions and methods of using them
US20130037977A1 (en) 2010-04-08 2013-02-14 Paul A. Burke Preparation of Lipid Nanoparticles
US9725479B2 (en) 2010-04-22 2017-08-08 Ionis Pharmaceuticals, Inc. 5′-end derivatives
US9408914B2 (en) 2010-04-28 2016-08-09 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Cationic lipid
EP2567952A4 (en) * 2010-04-28 2015-11-25 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd CATIONIC LIPID
US9254327B2 (en) * 2010-05-10 2016-02-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for delivery of active agents
WO2011141704A1 (en) 2010-05-12 2011-11-17 Protiva Biotherapeutics, Inc Novel cyclic cationic lipids and methods of use
EP2569276B1 (en) 2010-05-12 2021-02-24 Arbutus Biopharma Corporation Novel cationic lipids and methods of use thereof
US8865675B2 (en) * 2010-05-12 2014-10-21 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions and methods for silencing apolipoprotein B
US8802863B2 (en) 2010-05-24 2014-08-12 Sirna Therapeutics, Inc. Amino alcohol cationic lipids for oligonucleotide delivery
EP3254672A1 (en) 2010-06-03 2017-12-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Biodegradable lipids for the delivery of active agents
PT2591114T (pt) 2010-07-06 2016-08-02 Glaxosmithkline Biologicals Sa Imunização de mamíferos de grande porte com doses baixas de arn
RS54489B1 (en) 2010-07-06 2016-06-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa LIPOSOMS WITH LIPIDS THAT HAVE IMPROVED PKA VALUE FOR RNA RELEASE
EP2590670B1 (en) 2010-07-06 2017-08-23 GlaxoSmithKline Biologicals SA Methods of raising an immune response by delivery of rna
WO2012016188A2 (en) 2010-07-30 2012-02-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for delivery of active agents
US20130323269A1 (en) * 2010-07-30 2013-12-05 Muthiah Manoharan Methods and compositions for delivery of active agents
US8518907B2 (en) * 2010-08-02 2013-08-27 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA interference mediated inhibition of catenin (cadherin-associated protein), beta 1 (CTNNB1) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
EP2600901B1 (en) 2010-08-06 2019-03-27 ModernaTX, Inc. A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof
DK2606134T3 (da) 2010-08-17 2019-07-22 Sirna Therapeutics Inc RNA-Interferens-formidlet inhibering af hepatitis-B-virus (HBV)-genekspression ved hjælp af kort interfererende nukleinsyre (siNA)
WO2012027467A1 (en) 2010-08-26 2012-03-01 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF PROLYL HYDROXYLASE DOMAIN 2 (PHD2) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
EP3406730B1 (en) 2010-08-31 2022-02-23 Sirna Therapeutics, Inc. Novel single chemical entities and methods for delivery of oligonucleotides
PL3970742T3 (pl) 2010-08-31 2022-09-19 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Pegylowane liposomy do dostarczania rna kodującego immunogen
US8466122B2 (en) 2010-09-17 2013-06-18 Protiva Biotherapeutics, Inc. Trialkyl cationic lipids and methods of use thereof
ES2888231T3 (es) 2010-09-20 2022-01-03 Sirna Therapeutics Inc Lípidos catiónicos de bajo peso molecular para el suministro de oligonucleótidos
WO2012044638A1 (en) 2010-09-30 2012-04-05 Merck Sharp & Dohme Corp. Low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery
CN104531671A (zh) 2010-10-01 2015-04-22 现代治疗公司 设计核酸及其使用方法
US20140030292A1 (en) 2010-10-11 2014-01-30 Novartis Ag Antigen delivery platforms
EP3485913A1 (en) 2010-10-21 2019-05-22 Sirna Therapeutics, Inc. Low molecular weight cationic lipids for oligonucleotide delivery
DK2632472T3 (en) 2010-10-29 2018-03-19 Sirna Therapeutics Inc RNA INTERFERENCE-MEDIATED INHIBITION OF GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERRING NUCLEIC ACIDS (SINA)
DK2635265T3 (en) 2010-11-05 2018-07-16 Sirna Therapeutics Inc New low molecular weight cyclic amine-containing cationic lipids for oligonucleotide delivery
CN108358812B (zh) * 2010-11-15 2021-05-11 生命技术公司 含胺的转染试剂及其制备和使用方法
US8853377B2 (en) 2010-11-30 2014-10-07 Shire Human Genetic Therapies, Inc. mRNA for use in treatment of human genetic diseases
IT1404011B1 (it) * 2010-12-03 2013-11-08 Uni Degli Studi Magna Graecia Di Catanzaro Nanovettore coniugato con tsh per il trattamento del cancro della tiroide
DK3202760T3 (da) 2011-01-11 2019-11-25 Alnylam Pharmaceuticals Inc Pegylerede lipider og deres anvendelse til lægemiddelfremføring
CA2831613A1 (en) * 2011-03-31 2012-10-04 Moderna Therapeutics, Inc. Delivery and formulation of engineered nucleic acids
EA039892B1 (ru) * 2011-05-23 2022-03-24 Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. Биоразлагаемые липиды для доставки активных агентов
JP6022557B2 (ja) * 2011-06-08 2016-11-09 シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド 切断可能な脂質
IL280771B2 (en) 2011-06-08 2024-03-01 Shire Human Genetic Therapies Preparations of lipid nanoparticles and methods for administration of mRNA
US9068184B2 (en) 2011-06-21 2015-06-30 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibition of expression of protein C (PROC) genes
MX344807B (es) * 2011-06-21 2017-01-09 Alnylam Pharmaceuticals Inc Composiciones y metodos para inhibicion de genes para alipoproteina c-iii (apoc3).
US11896636B2 (en) 2011-07-06 2024-02-13 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic combination compositions and uses thereof
EP2751270B1 (en) 2011-08-29 2018-08-22 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomer-conjugate complexes and their use
BR112014004544A2 (pt) * 2011-08-31 2017-04-04 Mallinckrodt Llc modificação com peg de nanopartículas com h-fosfonatos
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP3456317A1 (en) 2011-09-27 2019-03-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Di-aliphatic substituted pegylated lipids
EP3682905B1 (en) 2011-10-03 2021-12-01 ModernaTX, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
DK2768958T3 (da) * 2011-10-18 2019-09-16 Dicerna Pharmaceuticals Inc Kationiske aminlipider og anvendelser deraf
EP2594575A1 (en) * 2011-11-15 2013-05-22 Université de Strasbourg Mannosylated compounds useful for the prevention and the treatment of infectious diseases
PL3301177T3 (pl) 2011-11-18 2020-08-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. ŚRODKI RNAi, KOMPOZYCJE I SPOSOBY ICH ZASTOSOWANIA DO LECZENIA CHORÓB ZWIĄZANYCH Z TRANSTYRETYNĄ (TTR)
CN103930398B (zh) 2011-11-18 2016-08-24 日油株式会社 具有改进的细胞内动力学的阳离子脂质
AU2012347637B2 (en) 2011-12-07 2017-09-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Biodegradable lipids for the delivery of active agents
JP6305343B2 (ja) * 2011-12-07 2018-04-04 アルニラム・ファーマシューティカルズ・インコーポレーテッド 活性薬剤の送達のための分岐アルキルおよびシクロアルキルを末端とする生分解性脂質
WO2013086373A1 (en) 2011-12-07 2013-06-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Lipids for the delivery of active agents
US10557136B2 (en) 2011-12-12 2020-02-11 Oncolmmunin Inc. In vivo delivery of oligonucleotides
ES2923757T3 (es) 2011-12-16 2022-09-30 Modernatx Inc Composiciones de ARNm modificado
DK2817287T3 (da) * 2012-02-24 2019-01-02 Arbutus Biopharma Corp Trialkyl kationisk lipid og metoder til anvendelse deraf
US8546617B1 (en) 2012-03-23 2013-10-01 Empire Technology Development Llc Dioxaborinanes and uses thereof
AU2013237873B2 (en) 2012-03-29 2017-12-14 Translate Bio, Inc. Ionizable cationic lipids
EP3865123A1 (en) 2012-03-29 2021-08-18 Translate Bio, Inc. Lipid-derived neutral nanoparticles
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
WO2013151666A2 (en) * 2012-04-02 2013-10-10 modeRNA Therapeutics Modified polynucleotides for the production of biologics and proteins associated with human disease
US10501513B2 (en) 2012-04-02 2019-12-10 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of oncology-related proteins and peptides
US9303079B2 (en) 2012-04-02 2016-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
AU2013243953A1 (en) 2012-04-02 2014-10-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
US9402816B2 (en) * 2012-04-19 2016-08-02 Sima Therapeutics, Inc. Diester and triester based low molecular weight, biodegradeable cationic lipids for oligonucleotide delivery
US9255154B2 (en) 2012-05-08 2016-02-09 Alderbio Holdings, Llc Anti-PCSK9 antibodies and use thereof
EP2858679B2 (en) 2012-06-08 2024-06-05 Translate Bio, Inc. Pulmonary delivery of mrna to non-lung target cells
EP2859102A4 (en) 2012-06-08 2016-05-11 Shire Human Genetic Therapies NUCLEASE RESISTANT POLYNUCLEOTIDES AND USES THEREOF
WO2014008334A1 (en) 2012-07-06 2014-01-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Stable non-aggregating nucleic acid lipid particle formulations
TW201726599A (zh) 2012-07-06 2017-08-01 協和醱酵麒麟有限公司 陽離子性脂質
US9120938B2 (en) 2012-07-31 2015-09-01 Empire Technology Development Llc Polymerizable organoboron alkyd resin anti fouling coatings
WO2014028429A2 (en) 2012-08-14 2014-02-20 Moderna Therapeutics, Inc. Enzymes and polymerases for the synthesis of rna
DK2922554T3 (en) 2012-11-26 2022-05-23 Modernatx Inc Terminalt modificeret rna
KR102255108B1 (ko) * 2013-03-08 2021-05-24 노파르티스 아게 활성제의 전달을 위한 지질 및 지질 조성물
DK2970955T3 (en) 2013-03-14 2019-02-11 Translate Bio Inc METHODS FOR CLEANING MESSENGER RNA
EA201591293A1 (ru) 2013-03-14 2016-02-29 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. Способы и композиции для доставки антител, кодируемых мрнк
WO2014152211A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
KR20210122917A (ko) 2013-03-14 2021-10-12 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. Cftr mrna 조성물 및 관련 방법 및 사용
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
WO2014172045A1 (en) 2013-03-15 2014-10-23 The University Of British Columbia Lipid nanoparticles for transfection and related methods
LT2972360T (lt) 2013-03-15 2018-09-10 Translate Bio, Inc. Sinergistinis nukleorūgščių pristatymo padidinimas sumaišytų kompozicijų pagalba
WO2014144767A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Moderna Therapeutics, Inc. Ion exchange purification of mrna
WO2014152031A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Moderna Therapeutics, Inc. Ribonucleic acid purification
JP6387084B2 (ja) 2013-05-01 2018-09-05 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッドＩｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． アポリポタンパク質ｃ−ｉｉｉの発現を調節するための組成物および方法
TW201534578A (zh) * 2013-07-08 2015-09-16 Daiichi Sankyo Co Ltd 新穎脂質
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
WO2015051214A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
PE20161242A1 (es) 2013-10-22 2016-12-11 Massachusetts Inst Technology Formulaciones de lipidos para la administracion de arn mensajero
US11224642B2 (en) 2013-10-22 2022-01-18 Translate Bio, Inc. MRNA therapy for argininosuccinate synthetase deficiency
EA034103B1 (ru) 2013-10-22 2019-12-27 Транслейт Био, Инк. СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ФЕНИЛКЕТОНУРИИ С ПРИМЕНЕНИЕМ мРНК
US20150110857A1 (en) 2013-10-22 2015-04-23 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Cns delivery of mrna and uses thereof
KR101647178B1 (ko) * 2013-11-28 2016-08-23 충남대학교산학협력단 효소 절단성 링커 또는 올리고 라이신을 포함하는 폴리에틸렌글리콜-리피드를 이용한 안정화된 플라스미드-지질 입자
US10821175B2 (en) 2014-02-25 2020-11-03 Merck Sharp & Dohme Corp. Lipid nanoparticle vaccine adjuvants and antigen delivery systems
EP4023249A1 (en) 2014-04-23 2022-07-06 ModernaTX, Inc. Nucleic acid vaccines
EP3134506B1 (en) 2014-04-25 2019-08-07 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger rna
WO2015168172A1 (en) 2014-04-28 2015-11-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Linkage modified oligomeric compounds
WO2015168589A2 (en) 2014-05-01 2015-11-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for modulating angiopoietin-like 3 expression
DK3137091T3 (da) 2014-05-01 2021-01-25 Ionis Pharmaceuticals Inc Konjugater af modificerede antisense-oligonukleotider og anvendelse deraf til modulation af pkk-ekspression
RU2724527C2 (ru) 2014-05-01 2020-06-23 Ионис Фармасьютикалз, Инк. Композиции и способы модулирования экспрессии рецептора гормона роста
PL3137596T3 (pl) 2014-05-01 2019-11-29 Ionis Pharmaceuticals Inc Kompozycja i sposoby modulowania ekspresji czynnika b dopełniacza
US10570169B2 (en) 2014-05-22 2020-02-25 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds and their use
CN105085292B (zh) * 2014-05-23 2017-12-15 上海交通大学 3‑((2‑(二甲氨基)乙烷基)(甲基)氨基)丙酸的两亲性衍生物及其用途
CN105085437B (zh) * 2014-05-23 2018-07-03 上海交通大学 3-(1-叔丁氧羰酰哌嗪-4-yl)丙酸的两亲性衍生物及其用途
CN105085295A (zh) * 2014-05-23 2015-11-25 上海交通大学 氨甲环酸的两亲性衍生物及其用途
BR112016027705A2 (pt) 2014-05-30 2018-01-30 Shire Human Genetic Therapies lipídios biodegradáveis para distribuição de ácidos nucleicos
UA121863C2 (uk) 2014-06-24 2020-08-10 Транслейт Байо, Інк. Стереохімічно збагачені композиції для доставки нуклеїнових кислот
RS63848B1 (sr) 2014-06-25 2023-01-31 Acuitas Therapeutics Inc Novi lipidi i formulacije lipidnih nanočestica za isporuku nukleinskih kiselina
WO2016002753A1 (ja) * 2014-06-30 2016-01-07 協和発酵キリン株式会社 カチオン性脂質
BR112016030852A2 (pt) 2014-07-02 2018-01-16 Shire Human Genetic Therapies encapsulação de rna mensageiro
WO2016010840A1 (en) 2014-07-16 2016-01-21 Novartis Ag Method of encapsulating a nucleic acid in a lipid nanoparticle host
WO2016021683A1 (ja) 2014-08-07 2016-02-11 武田薬品工業株式会社 カチオン性脂質
HUE059857T2 (hu) 2014-08-29 2023-01-28 Alnylam Pharmaceuticals Inc Patizirán transztiretin által közvetített amiloidózis kezelésében történõ alkalmazásra
JOP20200092A1 (ar) 2014-11-10 2017-06-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc تركيبات iRNA لفيروس الكبد B (HBV) وطرق لاستخدامها
WO2016081444A1 (en) 2014-11-17 2016-05-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Apolipoprotein c3 (apoc3) irna compositions and methods of use thereof
MA56412A (fr) 2014-12-05 2022-05-04 Translate Bio Inc Thérapie par l'arn messager pour le traitement des maladies articulaires
EP3270894B1 (en) 2015-03-19 2021-02-24 Translate Bio, Inc. Mrna therapy for pompe disease
KR20170130531A (ko) * 2015-03-24 2017-11-28 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤 핵산 함유 지질 나노 입자
CN104892473B (zh) * 2015-04-16 2017-01-11 武汉工程大学 一种4-巯基-1-丁醇的合成工艺
EP4026568A1 (en) 2015-04-17 2022-07-13 CureVac Real Estate GmbH Lyophilization of rna
EP3297682B1 (en) 2015-05-20 2021-07-14 CureVac AG Dry powder composition comprising long-chain rna
US10517827B2 (en) 2015-05-20 2019-12-31 Curevac Ag Dry powder composition comprising long-chain RNA
WO2016209862A1 (en) 2015-06-23 2016-12-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Glucokinase (gck) irna compositions and methods of use thereof
CN107922364B (zh) 2015-06-29 2021-12-31 爱康泰生治疗公司 用于递送核酸的脂质和脂质纳米颗粒制剂
SG10202006563PA (en) 2015-07-10 2020-08-28 Ionis Pharmaceuticals Inc Modulators of diacyglycerol acyltransferase 2 (dgat2)
JP2018150239A (ja) * 2015-07-15 2018-09-27 協和発酵キリン株式会社 β２ＧＰＩ遺伝子発現抑制ＲＮＡｉ医薬組成物
US11007260B2 (en) 2015-07-21 2021-05-18 Modernatx, Inc. Infectious disease vaccines
US11364292B2 (en) 2015-07-21 2022-06-21 Modernatx, Inc. CHIKV RNA vaccines
WO2017019568A1 (en) * 2015-07-24 2017-02-02 Fibralign Corporation Composition for targeted delivery of nucleic acid-based therapeutics
DK3329002T3 (da) 2015-07-31 2021-01-11 Alnylam Pharmaceuticals Inc Transthyretin (ttr)-irna-sammensætninger og fremgangsmåder til anvendelse deraf til behandling eller forebyggelse af ttr-forbundne sygdomme
US10544181B2 (en) * 2015-08-25 2020-01-28 Kyushu University Sugar derivative gelators
EA201890619A1 (ru) 2015-09-02 2018-09-28 Элнилэм Фармасьютикалз, Инк. КОМПОЗИЦИИ iRNA ЛИГАНДА 1 БЕЛКА ЗАПРОГРАММИРОВАННОЙ ГИБЕЛИ КЛЕТОК 1 (PD-L1) И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
LT3350157T (lt) 2015-09-17 2022-02-25 Modernatx, Inc. Junginiai ir kompozicijos terapinei medžiagai teikti intraceliuliniu būdu
BR112018004620A2 (pt) 2015-09-24 2018-09-25 Ionis Pharmaceuticals, Inc. moduladores da expressão de kras
AU2016332266B2 (en) * 2015-09-30 2020-05-07 Shionogi & Co., Ltd. Nucleic acid derivative having immunostimulatory activity
US10940201B2 (en) * 2015-09-30 2021-03-09 Shionogi & Co., Ltd. Nucleic acid derivative having immunostimulatory activity
WO2017062513A1 (en) 2015-10-05 2017-04-13 Modernatx, Inc. Methods for therapeutic administration of messenger ribonucleic acid drugs
AU2016338559B2 (en) 2015-10-14 2022-11-24 Translate Bio, Inc. Modification of RNA-related enzymes for enhanced production
US20180271970A1 (en) 2015-10-22 2018-09-27 Modernatx, Inc. Respiratory syncytial virus vaccine
JP2018531290A (ja) 2015-10-22 2018-10-25 モデルナティーエックス， インコーポレイテッド 性感染症ワクチン
WO2017070613A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
MD3718565T2 (ro) 2015-10-22 2022-09-30 Modernatx Inc Vaccinuri împotriva virusului respirator
EA201891001A1 (ru) 2015-10-22 2018-11-30 МОДЕРНАТиЭкс, ИНК. Вакцины на основе нуклеиновых кислот против вируса ветряной оспы (vzv)
EP3364950A4 (en) 2015-10-22 2019-10-23 ModernaTX, Inc. VACCINES AGAINST TROPICAL DISEASES
JP7030690B2 (ja) 2015-10-28 2022-03-07 アキィタス・セラピューティクス・インコーポレイテッド 核酸のデリバリーのための新規脂質および脂質ナノ粒子製剤
WO2017079739A1 (en) 2015-11-06 2017-05-11 Ionis Pharmaceuticals, Inc. MODULATING APOLIPOPROTEIN (a) EXPRESSION
EP4119569A1 (en) 2015-11-06 2023-01-18 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds for use in therapy
AU2016366978B2 (en) 2015-12-10 2022-07-28 Modernatx, Inc. Compositions and methods for delivery of therapeutic agents
EP4036079A3 (en) 2015-12-22 2022-09-28 ModernaTX, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of agents
US10525138B2 (en) 2015-12-25 2020-01-07 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Compound as cationic lipid
UY37146A (es) 2016-03-07 2017-09-29 Arrowhead Pharmaceuticals Inc Ligandos de direccionamiento para compuestos terapéuticos
WO2017173334A1 (en) 2016-04-01 2017-10-05 Checkmate Pharmaceuticals, Inc. Fc receptor-mediated drug delivery
DK3440206T3 (da) 2016-04-08 2020-11-23 Translate Bio Inc Multimer-kodende nukleinsyre og anvendelser deraf
WO2017186711A1 (en) 2016-04-25 2017-11-02 Invivogen Novel complexes of immunostimulatory compounds, and uses thereof
KR102533456B1 (ko) 2016-05-18 2023-05-17 모더나티엑스, 인크. 릴랙신을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드
CN106046118A (zh) * 2016-05-26 2016-10-26 首都医科大学 含S‑β‑咔啉‑3‑酰基‑RGDV的siRNA递送系统的制备及其在SURVIVIN基因沉默上的应用
US10835583B2 (en) 2016-06-13 2020-11-17 Translate Bio, Inc. Messenger RNA therapy for the treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
US10927383B2 (en) 2016-06-30 2021-02-23 Ethris Gmbh Cas9 mRNAs
SG11201900238UA (en) 2016-07-15 2019-02-27 Ionis Pharmaceuticals Inc Compounds and methods for modulation of smn2
WO2018033254A2 (en) 2016-08-19 2018-02-22 Curevac Ag Rna for cancer therapy
KR102557906B1 (ko) 2016-09-02 2023-07-20 애로우헤드 파마슈티컬스 인코포레이티드 표적화 리간드
RU2019110875A (ru) 2016-09-13 2020-10-15 Аллерган, Инк. Небелковые композиции клостридиального токсина
WO2018062233A1 (ja) 2016-09-27 2018-04-05 協和発酵キリン株式会社 カチオン性脂質としての化合物
WO2018062413A1 (ja) * 2016-09-28 2018-04-05 協和発酵キリン株式会社 核酸含有脂質ナノ粒子
KR20190065341A (ko) 2016-10-06 2019-06-11 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 올리고머 화합물들의 접합 방법
US10906905B2 (en) 2016-10-14 2021-02-02 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Five-membered heteroaryl ring bridged ring derivative, preparation method therefor and medical use thereof
JP6980780B2 (ja) 2016-10-21 2021-12-15 モデルナティーエックス， インコーポレイテッド ヒトサイトメガロウイルスワクチン
EP3532103A1 (en) 2016-10-26 2019-09-04 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations
EP3538067A1 (en) 2016-11-08 2019-09-18 Modernatx, Inc. Stabilized formulations of lipid nanoparticles
AU2017356699B2 (en) * 2016-11-08 2021-11-11 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Cationic lipids for nucleic acid delivery and preparation thereof
CN110167587A (zh) 2016-11-11 2019-08-23 摩登纳特斯有限公司 流感疫苗
JP2020501545A (ja) 2016-12-08 2020-01-23 キュアバック アーゲー 肝疾患の処置または予防のためのｒｎａ
US11103578B2 (en) 2016-12-08 2021-08-31 Modernatx, Inc. Respiratory virus nucleic acid vaccines
WO2018104540A1 (en) 2016-12-08 2018-06-14 Curevac Ag Rnas for wound healing
CN110582302A (zh) 2016-12-14 2019-12-17 利甘达尔股份有限公司 用于核酸和/或蛋白有效负载递送的组合物和方法
US11464847B2 (en) 2016-12-23 2022-10-11 Curevac Ag Lassa virus vaccine
WO2018115507A2 (en) 2016-12-23 2018-06-28 Curevac Ag Henipavirus vaccine
US11141476B2 (en) 2016-12-23 2021-10-12 Curevac Ag MERS coronavirus vaccine
EP3582790A4 (en) 2017-02-16 2020-11-25 ModernaTX, Inc. VERY POWERFUL IMMUNOGENIC COMPOSITIONS
AU2018224326B2 (en) 2017-02-27 2024-01-04 Translate Bio, Inc. Novel codon-optimized CFTR mRNA
EP3609534A4 (en) 2017-03-15 2021-01-13 ModernaTX, Inc. BROAD SPECTRUM VACCINE AGAINST THE INFLUENZA VIRUS
EP3595727A1 (en) 2017-03-15 2020-01-22 ModernaTX, Inc. Lipid nanoparticle formulation
CN110520409A (zh) 2017-03-15 2019-11-29 摩登纳特斯有限公司 用于细胞内递送治疗剂的化合物和组合物
EP3595713A4 (en) 2017-03-15 2021-01-13 ModernaTX, Inc. RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS VACCINE
US11752206B2 (en) 2017-03-15 2023-09-12 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus vaccine
US11045540B2 (en) 2017-03-15 2021-06-29 Modernatx, Inc. Varicella zoster virus (VZV) vaccine
DK3596042T3 (da) 2017-03-15 2022-04-11 Modernatx Inc Krystalformer af aminolipider
WO2018170347A1 (en) 2017-03-17 2018-09-20 Modernatx, Inc. Zoonotic disease rna vaccines
EP3595715A1 (en) 2017-03-17 2020-01-22 CureVac AG Rna vaccine and immune checkpoint inhibitors for combined anticancer therapy
JOP20190215A1 (ar) 2017-03-24 2019-09-19 Ionis Pharmaceuticals Inc مُعدّلات التعبير الوراثي عن pcsk9
CN110914433A (zh) 2017-03-24 2020-03-24 库尔维科公司 编码crispr相关蛋白质的核酸及其用途
US11433026B2 (en) * 2017-03-31 2022-09-06 University Of Rhode Island Board Of Trustees Nanoparticle-induced fusogenicity between liposome and endosome membranes for targeted delivery through endosomal escape
MA48047A (fr) 2017-04-05 2020-02-12 Modernatx Inc Réduction ou élimination de réponses immunitaires à des protéines thérapeutiques administrées par voie non intraveineuse, par exemple par voie sous-cutanée
US11357856B2 (en) 2017-04-13 2022-06-14 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for delivery of active agents
WO2018191719A1 (en) 2017-04-13 2018-10-18 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipid delivery of therapeutic agents to adipose tissue
MA50278A (fr) 2017-04-18 2020-02-26 Alnylam Pharmaceuticals Inc Méthodes pour le traitement de sujets atteints d'une infection par le virus de l'hépatite b (vhb)
AU2018256877B2 (en) 2017-04-28 2022-06-02 Acuitas Therapeutics, Inc. Novel carbonyl lipids and lipid nanoparticle formulations for delivery of nucleic acids
EP3624824A1 (en) 2017-05-16 2020-03-25 Translate Bio, Inc. Treatment of cystic fibrosis by delivery of codon-optimized mrna encoding cftr
EP3630200A4 (en) 2017-05-31 2021-02-24 Arcturus Therapeutics, Inc. THERAPEUTICS FOR PHENYLKETONURIA
AU2018278315B2 (en) 2017-05-31 2024-01-18 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Therapeutics for glycogen storage disease type III
WO2018222890A1 (en) 2017-05-31 2018-12-06 Arcturus Therapeutics, Inc. Synthesis and structure of high potency rna therapeutics
EP3638215A4 (en) 2017-06-15 2021-03-24 Modernatx, Inc. RNA FORMULATIONS
CN111328287A (zh) 2017-07-04 2020-06-23 库瑞瓦格股份公司 新型核酸分子
US20210228738A1 (en) 2017-07-17 2021-07-29 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Compositions and methods for increasing or enhancing transduction of gene therapy vectors and for removing or reducing immunoglobulins
US11633365B2 (en) 2017-08-04 2023-04-25 Kyowa Kirin Co., Ltd. Nucleic acid-containing lipid nanoparticle
WO2019036008A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. LIPIDS FOR USE IN LIPID NANOPARTICULAR FORMULATIONS
WO2019036030A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. LIPIDS FOR USE IN LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS
WO2019036028A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. LIPIDS FOR USE IN LIPID NANOPARTICULAR FORMULATIONS
WO2019038332A1 (en) 2017-08-22 2019-02-28 Curevac Ag VACCINE AGAINST BUNYAVIRUS
MX2020002348A (es) 2017-08-31 2020-10-08 Modernatx Inc Métodos de elaboración de nanopartículas lipídicas.
US10653767B2 (en) 2017-09-14 2020-05-19 Modernatx, Inc. Zika virus MRNA vaccines
EP3684931A1 (en) 2017-09-19 2020-07-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treating transthyretin (ttr) mediated amyloidosis
RU2020115287A (ru) 2017-10-19 2021-11-19 Куревак Аг Новые молекулы искусственных нуклеиновых кислот
WO2019089828A1 (en) 2017-10-31 2019-05-09 Acuitas Therapeutics, Inc. Lamellar lipid nanoparticles
WO2019092153A1 (en) 2017-11-08 2019-05-16 Curevac Ag Rna sequence adaptation
WO2019100039A1 (en) 2017-11-20 2019-05-23 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Serum amyloid p component (apcs) irna compositions and methods of use thereof
US11931406B2 (en) * 2017-12-13 2024-03-19 CureVac SE Flavivirus vaccine
EP3727428A1 (en) 2017-12-20 2020-10-28 Translate Bio, Inc. Improved composition and methods for treatment of ornithine transcarbamylase deficiency
IL275567B2 (en) 2017-12-27 2024-03-01 Takeda Pharmaceuticals Co Lipid nanoparticle comprising nucleic acid and its use
PE20211242A1 (es) 2018-01-15 2021-07-09 Ionis Pharmaceuticals Inc Moduladores de la expresion dnm2
US11911453B2 (en) 2018-01-29 2024-02-27 Modernatx, Inc. RSV RNA vaccines
US11332733B2 (en) 2018-02-12 2022-05-17 lonis Pharmaceuticals, Inc. Modified compounds and uses thereof
CN108310455B (zh) * 2018-03-20 2021-07-30 嘉兴尔云信息科技有限公司 纳米羟基磷灰石、pgs-m复合骨修复材料及其制备方法
EP3773702A2 (en) 2018-04-05 2021-02-17 CureVac AG Novel yellow fever nucleic acid molecules for vaccination
WO2019202035A1 (en) 2018-04-17 2019-10-24 Curevac Ag Novel rsv rna molecules and compositions for vaccination
JP7438135B2 (ja) 2018-05-09 2024-02-26 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド Ｆｘｉの発現を低下させるための化合物及び方法
CA3102985C (en) 2018-06-08 2023-03-28 Fujifilm Corporation Compound or salt thereof and lipid particles
WO2020002525A1 (en) 2018-06-27 2020-01-02 Curevac Ag Novel lassa virus rna molecules and compositions for vaccination
WO2020033748A1 (en) 2018-08-08 2020-02-13 Arcturus Therapeutics, Inc. Compositions and agents against nonalcoholic steatohepatitis
JP2021534101A (ja) 2018-08-09 2021-12-09 ヴェルソー セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｃｃｒ２及びｃｓｆ１ｒを標的とするためのオリゴヌクレオチド組成物ならびにその使用
CA3108544A1 (en) 2018-08-24 2020-02-27 Translate Bio, Inc. Methods for purification of messenger rna
TW202023573A (zh) 2018-09-19 2020-07-01 美商Ionis製藥公司 Pnpla3表現之調節劑
EP3852911A2 (en) 2018-09-21 2021-07-28 Acuitas Therapeutics, Inc. Systems and methods for manufacturing lipid nanoparticles and liposomes
CA3111476A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Nutcracker Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations comprising lipidated cationic peptide compounds for nucleic acid delivery
DK3860561T3 (da) 2018-10-01 2023-08-07 Alnylam Pharmaceuticals Inc Bionedbrydelige lipider til levering af aktive stoffer
CA3114699A1 (en) 2018-10-09 2020-04-16 The University Of British Columbia Compositions and systems comprising transfection-competent vesicles free of organic-solvents and detergents and methods related thereto
WO2020080475A1 (ja) 2018-10-18 2020-04-23 武田薬品工業株式会社 Ｔ細胞の活性化／増殖方法
US20210395188A1 (en) * 2018-10-18 2021-12-23 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for lipid nanoparticle delivery of active agents
AU2019383413A1 (en) * 2018-11-21 2021-05-27 Translate Bio, Inc. Cationic lipid compounds and compositions thereof for use in the delivery of messenger RNA
CA3122080A1 (en) 2018-12-06 2020-06-11 Arcturus Therapeutics, Inc. Compositions and methods for treating ornithine transcarbamylase deficiency
TW202039534A (zh) 2018-12-14 2020-11-01 美商美國禮來大藥廠 KRAS變體mRNA分子
CA3118034A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Curevac Ag Rna for malaria vaccines
WO2020146805A1 (en) 2019-01-11 2020-07-16 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for lipid nanoparticle delivery of active agents
CA3125511A1 (en) 2019-02-08 2020-08-13 Curevac Ag Coding rna administered into the suprachoroidal space in the treatment of ophthalmic diseases
US11351242B1 (en) 2019-02-12 2022-06-07 Modernatx, Inc. HMPV/hPIV3 mRNA vaccine composition
CN112010995A (zh) * 2019-05-30 2020-12-01 株式会社大赛璐 壳聚糖衍生物及光学异构体用分离剂
CN110041223B (zh) * 2019-06-03 2021-10-22 西北师范大学 以肼类化合物为原料氧化合成偶氮类化合物的方法
WO2020246581A1 (ja) 2019-06-07 2020-12-10 富士フイルム株式会社 脂質組成物
WO2020254535A1 (en) 2019-06-18 2020-12-24 Curevac Ag Rotavirus mrna vaccine
EP3986866B1 (en) * 2019-06-20 2023-12-20 Precision Nanosystems ULC Ionizable lipids for nucleic acid delivery
CA3143578A1 (en) * 2019-06-29 2021-01-07 Precision Nanosystems Inc. Ionizable lipids for nucleic acid delivery
CA3147875A1 (en) 2019-07-19 2021-01-28 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Recombinase compositions and methods of use
WO2021030522A1 (en) 2019-08-13 2021-02-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. SMALL RIBOSOMAL PROTEIN SUBUNIT 25 (RPS25) iRNA AGENT COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
JP2022544412A (ja) 2019-08-14 2022-10-18 キュアバック アーゲー 免疫賦活特性が減少したｒｎａ組み合わせおよび組成物
CR20220108A (es) 2019-08-14 2022-05-27 Acuitas Therapeutics Inc Nanopartículas lipídicas mejoradas para el suministro de ácidos nucleicos
CN114728887A (zh) 2019-09-19 2022-07-08 摩登纳特斯有限公司 用于治疗剂的细胞内递送的支链尾端脂质化合物和组合物
WO2021074772A1 (en) 2019-10-14 2021-04-22 Astrazeneca Ab Modulators of pnpla3 expression
AR120341A1 (es) 2019-11-01 2022-02-09 Alnylam Pharmaceuticals Inc COMPOSICIONES DE AGENTES DE ARNi CONTRA LA HUNTINGTINA (HTT) Y SUS MÉTODOS DE USO
CN117417265A (zh) 2019-11-15 2024-01-19 富士胶片株式会社 脂质组合物
EP4061945A1 (en) 2019-11-22 2022-09-28 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Ataxin3 (atxn3) rnai agent compositions and methods of use thereof
EP4073251A1 (en) 2019-12-13 2022-10-19 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Human chromosome 9 open reading frame 72 (c9orf72) irna agent compositions and methods of use thereof
IL293890A (en) 2019-12-20 2022-08-01 Curevac Ag Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids
JP2023513502A (ja) 2020-02-04 2023-03-31 キュアバック エスイー コロナウイルスワクチン
KR20220148230A (ko) 2020-02-28 2022-11-04 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 Smn2를 조절하기 위한 화합물 및 방법
EP4114947A1 (en) 2020-03-05 2023-01-11 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Complement component c3 irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing complement component c3-associated diseases
US11759515B2 (en) 2020-03-09 2023-09-19 Arcturus Therapeutics, Inc. Compositions and methods for inducing immune responses
KR20230003478A (ko) 2020-03-24 2023-01-06 제너레이션 바이오 컴퍼니 비-바이러스성 dna 벡터 및 고셰 치료제 발현을 위한 이의 용도
CN115667530A (zh) 2020-03-24 2023-01-31 世代生物公司 非病毒dna载体和其用于表达因子ix治疗剂的用途
CN116209759A (zh) 2020-03-26 2023-06-02 阿尔尼拉姆医药品有限公司 冠状病毒iRNA组合物及其使用方法
EP4126947A1 (en) 2020-03-30 2023-02-08 BioNTech SE Rna compositions targeting claudin-18.2
WO2021206922A1 (en) 2020-04-07 2021-10-14 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Transmembrane serine protease 2 (tmprss2) irna compositions and methods of use thereof
EP4133076A1 (en) 2020-04-07 2023-02-15 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Angiotensin-converting enzyme 2 (ace2) irna compositions and methods of use thereof
JP2023523993A (ja) 2020-04-27 2023-06-08 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）ｉＲＮＡ剤組成物およびその使用方法
CN111575310B (zh) * 2020-05-14 2022-12-13 江南大学 表达小窝蛋白的重组酿酒酵母及其应用
WO2021236980A1 (en) 2020-05-20 2021-11-25 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Coronavirus antigen compositions and their uses
US20230193311A1 (en) 2020-05-20 2023-06-22 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Immunogenic compositions and uses thereof
AU2021281453A1 (en) 2020-05-29 2022-11-17 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc. Trem compositions and methods relating thereto
US20230203510A1 (en) 2020-05-29 2023-06-29 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Trem compositions and methods relating thereto
CA3170740A1 (en) 2020-05-29 2021-12-02 Curevac Ag Nucleic acid based combination vaccines
EP4162050A1 (en) 2020-06-09 2023-04-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Rnai compositions and methods of use thereof for delivery by inhalation
IL299094A (en) 2020-06-15 2023-02-01 Res Inst Nationwide Childrens Hospital Administration of an adeno-associated virus vector for muscular dystrophies
BR112022023477A2 (pt) * 2020-06-16 2023-02-23 Rhodia Operations Compostos de amônio úteis como tensoativos
CA3188801A1 (en) 2020-07-08 2022-01-13 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Rna replicon vaccines against hbv
EP4182297A1 (en) 2020-07-16 2023-05-24 Acuitas Therapeutics, Inc. Cationic lipids for use in lipid nanoparticles
CN116234917A (zh) 2020-07-27 2023-06-06 安杰瑞姆生物科学公司 Dna分子组合物及其制备方法和使用方法
EP4172194A1 (en) 2020-07-31 2023-05-03 CureVac SE Nucleic acid encoded antibody mixtures
US11406703B2 (en) 2020-08-25 2022-08-09 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
WO2022043551A2 (en) 2020-08-31 2022-03-03 Curevac Ag Multivalent nucleic acid based coronavirus vaccines
WO2022051629A1 (en) 2020-09-03 2022-03-10 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Immunogenic compositions and uses thereof
CN116056728A (zh) 2020-09-14 2023-05-02 富士胶片株式会社 脂质组合物
US20230331670A1 (en) * 2020-09-17 2023-10-19 Enzychem Lifesciences Corporation Glycerol compounds and methods of use
WO2022066847A1 (en) 2020-09-24 2022-03-31 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Dipeptidyl peptidase 4 (dpp4) irna compositions and methods of use thereof
TW202229552A (zh) 2020-10-05 2022-08-01 美商艾拉倫製藥股份有限公司 Ｇ蛋白－偶合受體７５（ＧＰＲ７５）ｉＲＮＡ組成物及其使用方法
MX2023004170A (es) * 2020-10-09 2023-06-27 Adarx Pharmaceuticals Inc Compuestos y oligonucleótidos derivados de n-acetilgalactosamina (galnac).
AU2021362206A1 (en) * 2020-10-14 2023-05-18 George Mason Research Foundation, Inc. Methods of lipid nanoparticle manufacture and compostions derived therefrom
EP4232582A1 (en) 2020-10-23 2023-08-30 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Mucin 5b (muc5b) irna compositions and methods of use thereof
IL302817A (en) 2020-11-18 2023-07-01 Ionis Pharmaceuticals Inc Compounds and methods for modulating angiotensinogen expression
AU2021385572A1 (en) 2020-11-25 2023-06-22 Akagera Medicines, Inc. Lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids, and related methods of use
KR20230124980A (ko) * 2020-12-22 2023-08-28 코넬 유니버시티 쯔비터이온성 지질 나노입자 조성물 및 사용 방법
WO2022137133A1 (en) 2020-12-22 2022-06-30 Curevac Ag Rna vaccine against sars-cov-2 variants
CA3171051A1 (en) 2020-12-22 2022-06-30 Curevac Ag Pharmaceutical composition comprising lipid-based carriers encapsulating rna for multidose administration
US20240175020A1 (en) 2020-12-23 2024-05-30 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions of modified trems and uses thereof
EP4267740A1 (en) 2020-12-28 2023-11-01 Arcturus Therapeutics, Inc. Transcription activator-like effector nucleases (talens) targeting hbv
WO2022155404A1 (en) * 2021-01-14 2022-07-21 Translate Bio, Inc. Methods and compositions for delivering mrna coded antibodies
US20240102065A1 (en) 2021-01-27 2024-03-28 CureVac SE Method of reducing the immunostimulatory properties of in vitro transcribed rna
WO2022168884A1 (ja) 2021-02-04 2022-08-11 塩野義製薬株式会社 カチオン性脂質
TW202245835A (zh) 2021-02-04 2022-12-01 美商默沙東有限責任公司 用於肺炎球菌結合物疫苗之奈米乳化液佐劑組合物
AU2022220704A1 (en) 2021-02-12 2022-08-18 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Superoxide dismutase 1 (sod1) irna compositions and methods of use thereof for treating or preventing superoxide dismutase 1- (sod1-) associated neurodegenerative diseases
US11524023B2 (en) 2021-02-19 2022-12-13 Modernatx, Inc. Lipid nanoparticle compositions and methods of formulating the same
EP4298220A1 (en) 2021-02-25 2024-01-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Prion protein (prnp) irna compositions and methods of use thereof
EP4305169A1 (en) 2021-03-12 2024-01-17 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Glycogen synthase kinase 3 alpha (gsk3a) irna compositions and methods of use thereof
WO2022200575A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic compositions
TW202305134A (zh) 2021-03-29 2023-02-01 美商艾拉倫製藥股份有限公司 杭丁頓蛋白（ＨＴＴ）ｉＲＮＡ劑組成物及其使用方法
CA3171429A1 (en) 2021-03-31 2022-09-30 Alexander SCHWENGER Syringes containing pharmaceutical compositions comprising rna
KR20230165276A (ko) 2021-03-31 2023-12-05 플래그쉽 파이어니어링 이노베이션스 브이, 인크. 타노트랜스미션 폴리펩티드 및 암의 치료에서의 이의 용도
EP4319803A1 (en) 2021-04-08 2024-02-14 Vaxthera SAS Coronavirus vaccine comprising a mosaic protein
CN117500819A (zh) * 2021-04-09 2024-02-02 相互药工株式会社 脂质和组合物
KR20240012370A (ko) 2021-04-20 2024-01-29 안자리움 바이오사이언시스 아게 아밀로-알파-1, 6-글루코시다제, 4-알파-글루카노트랜스퍼라제를 인코딩하는 dna 분자의 조성물, 이를 제조하는 방법 및 이를 사용하는 방법
KR20240011714A (ko) 2021-04-27 2024-01-26 제너레이션 바이오 컴퍼니 치료용 항체를 발현하는 비바이러스성 dna 벡터 및 이의 용도
WO2022232286A1 (en) 2021-04-27 2022-11-03 Generation Bio Co. Non-viral dna vectors expressing anti-coronavirus antibodies and uses thereof
JPWO2022230964A1 (ru) 2021-04-28 2022-11-03
JP2024519293A (ja) 2021-04-29 2024-05-10 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド シグナル伝達兼転写活性化因子６（ＳＴＡＴ６）ｉＲＮＡ組成物およびその使用方法
EP4334446A1 (en) 2021-05-03 2024-03-13 CureVac SE Improved nucleic acid sequence for cell type specific expression
WO2022245583A1 (en) 2021-05-18 2022-11-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Sodium-glucose cotransporter-2 (sglt2) irna compositions and methods of use thereof
EP4342993A1 (en) * 2021-05-19 2024-03-27 Daiichi Sankyo Company, Limited Hpv infectious disease vaccine
WO2022246555A1 (en) * 2021-05-28 2022-12-01 Nanovation Therapeutics Inc. Method for producing an ionizable lipid
EP4347554A1 (en) * 2021-05-28 2024-04-10 Nanovation Therapeutics Inc. Mc3-type lipids and use thereof in the preparation of lipid nanoparticles
IL308743A (en) 2021-06-04 2024-01-01 Alnylam Pharmaceuticals Inc Compositions of human chromosome 9 open reading frame 72 iRNA factor (C9ORF72) and methods of using them
KR20220167770A (ko) 2021-06-11 2022-12-21 주식회사 나이벡 타겟 세포 내로 올리고뉴클레오티드를 전달하기 위한 펩타이드-지질의 결합체를 포함하는 나노입자 및 이를 포함하는 약학적 조성물
EP4377457A1 (en) 2021-07-26 2024-06-05 Flagship Pioneering Innovations VI, LLC Trem compositions and uses thereof
CA3171750A1 (en) 2021-07-30 2023-02-02 Tim SONNTAG Mrnas for treatment or prophylaxis of liver diseases
WO2023014677A1 (en) 2021-08-03 2023-02-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Transthyretin (ttr) irna compositions and methods of use thereof
WO2023023055A1 (en) 2021-08-16 2023-02-23 Renagade Therapeutics Management Inc. Compositions and methods for optimizing tropism of delivery systems for rna
IL309505A (en) 2021-09-03 2024-02-01 CureVac SE Lipid nanoparticles for nucleic acid delivery
WO2023031392A2 (en) 2021-09-03 2023-03-09 CureVac SE Novel lipid nanoparticles for delivery of nucleic acids comprising phosphatidylserine
CN115772089A (zh) * 2021-09-07 2023-03-10 广州谷森制药有限公司 新型阳离子脂质化合物
WO2023044333A1 (en) 2021-09-14 2023-03-23 Renagade Therapeutics Management Inc. Cyclic lipids and methods of use thereof
TW202325263A (zh) 2021-09-14 2023-07-01 美商雷納嘉德醫療管理公司 非環狀脂質及其使用方法
AU2022346861A1 (en) 2021-09-17 2024-03-28 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions and methods for producing circular polyribonucleotides
AU2022370530A1 (en) 2021-10-18 2024-05-02 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions and methods for purifying polyribonucleotides
WO2023073228A1 (en) 2021-10-29 2023-05-04 CureVac SE Improved circular rna for expressing therapeutic proteins
TW202334418A (zh) 2021-10-29 2023-09-01 美商艾拉倫製藥股份有限公司 杭丁頓（ＨＴＴ）ｉＲＮＡ劑組成物及其使用方法
CA3237482A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 The J. David Gladstone Institutes, A Testamentary Trust Established Under The Will Of J. David Gladstone Precise genome editing using retrons
TW202334080A (zh) 2021-11-08 2023-09-01 美商歐納醫療公司 用於遞送環狀聚核苷酸之脂質奈米粒子組合物
KR20230068047A (ko) 2021-11-10 2023-05-17 주식회사 에스엠엘바이오팜 트레할로즈 유도체 및 신규 구조 유지 화합물을 포함하는 핵산 의약품 전달용 지질나노입자의 약학 조성물
WO2023091490A1 (en) 2021-11-16 2023-05-25 Senda Biosciences, Inc. Novel ionizable lipids and lipid nanoparticles and methods of using the same
WO2023091787A1 (en) 2021-11-22 2023-05-25 Senda Biosciences, Inc. Novel ionizable lipids and lipid nanoparticles and methods of using the same
WO2023096990A1 (en) 2021-11-24 2023-06-01 Flagship Pioneering Innovation Vi, Llc Coronavirus immunogen compositions and their uses
WO2023097003A2 (en) 2021-11-24 2023-06-01 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Immunogenic compositions and their uses
CA3238370A1 (en) 2021-11-24 2023-06-01 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Varicella-zoster virus immunogen compositions and their uses
WO2023107648A2 (en) * 2021-12-09 2023-06-15 Massachusetts Institute Of Technology Synthesis of ester, carbonate, and carbamate-derived novel biodegradable ionizable lipids from methyl ricinoleate or methyl 12-hydroxystearate and its applications
WO2023115013A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Methods for enrichment of circular rna under denaturing conditions
WO2023122745A1 (en) 2021-12-22 2023-06-29 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions and methods for purifying polyribonucleotides
TW202342064A (zh) 2021-12-23 2023-11-01 美商旗艦先鋒創新有限責任公司 編碼抗融合多肽之環狀多核糖核苷酸
WO2023122752A1 (en) 2021-12-23 2023-06-29 Renagade Therapeutics Management Inc. Constrained lipids and methods of use thereof
WO2023135273A2 (en) 2022-01-14 2023-07-20 Anjarium Biosciences Ag Compositions of dna molecules encoding factor viii, methods of making thereof, and methods of use thereof
WO2023141602A2 (en) 2022-01-21 2023-07-27 Renagade Therapeutics Management Inc. Engineered retrons and methods of use
WO2023141314A2 (en) 2022-01-24 2023-07-27 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Heparin sulfate biosynthesis pathway enzyme irna agent compositions and methods of use thereof
WO2023144193A1 (en) 2022-01-25 2023-08-03 CureVac SE Mrnas for treatment of hereditary tyrosinemia type i
WO2023147090A1 (en) 2022-01-27 2023-08-03 BioNTech SE Pharmaceutical compositions for delivery of herpes simplex virus antigens and related methods
WO2023144330A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 CureVac SE Nucleic acid encoded transcription factor inhibitors
WO2023161350A1 (en) 2022-02-24 2023-08-31 Io Biotech Aps Nucleotide delivery of cancer therapy
WO2023177655A1 (en) 2022-03-14 2023-09-21 Generation Bio Co. Heterologous prime boost vaccine compositions and methods of use
WO2023183616A1 (en) 2022-03-25 2023-09-28 Senda Biosciences, Inc. Novel ionizable lipids and lipid nanoparticles and methods of using the same
CN114933569A (zh) * 2022-04-07 2022-08-23 澳门科技大学 鞘脂类化合物、含有鞘脂类化合物的脂质体和应用
WO2023196931A1 (en) 2022-04-07 2023-10-12 Renagade Therapeutics Management Inc. Cyclic lipids and lipid nanoparticles (lnp) for the delivery of nucleic acids or peptides for use in vaccinating against infectious agents
WO2023196634A2 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Vaccines and related methods
US20230346977A1 (en) 2022-04-13 2023-11-02 Universitat Autònoma De Barcelona Treatment of neuromuscular diseases via gene therapy that expresses klotho protein
WO2023220083A1 (en) 2022-05-09 2023-11-16 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Trem compositions and methods of use for treating proliferative disorders
WO2023220729A2 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Double stranded dna compositions and related methods
WO2023216232A1 (zh) * 2022-05-13 2023-11-16 南方科技大学 一种含有二硫键的脂质化合物及其组合物
WO2023218420A1 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Mrna compositions for inducing latent hiv-1 reversal
WO2023218431A1 (en) 2022-05-13 2023-11-16 BioNTech SE Rna compositions targeting hiv
WO2023230578A2 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulating circulating factors
WO2023230295A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 BioNTech SE Rna compositions for delivery of monkeypox antigens and related methods
WO2023230573A2 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulation of immune responses
WO2023230549A2 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulation of tumor suppressors and oncogenes
WO2023230570A2 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulating genetic drivers
WO2023227608A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Nucleic acid based vaccine encoding an escherichia coli fimh antigenic polypeptide
WO2023230566A2 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Compositions and methods for modulating cytokines
WO2023232747A1 (en) 2022-05-30 2023-12-07 BioNTech SE Complexes for delivery of nucleic acids
WO2023239756A1 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Generation Bio Co. Lipid nanoparticle compositions and uses thereof
WO2023250112A1 (en) 2022-06-22 2023-12-28 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions of modified trems and uses thereof
WO2024026308A2 (en) 2022-07-29 2024-02-01 Massachusetts Institute Of Technology COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING EXPRESSION OF THE SIGNAL REGULATORY PROTEIN ALPHA (SIRPα) GENE
WO2024030856A2 (en) 2022-08-01 2024-02-08 Flagship Pioneering Innovations Vii, Llc Immunomodulatory proteins and related methods
WO2024035952A1 (en) 2022-08-12 2024-02-15 Remix Therapeutics Inc. Methods and compositions for modulating splicing at alternative splice sites
WO2024040222A1 (en) 2022-08-19 2024-02-22 Generation Bio Co. Cleavable closed-ended dna (cedna) and methods of use thereof
WO2024049979A2 (en) 2022-08-31 2024-03-07 Senda Biosciences, Inc. Novel ionizable lipids and lipid nanoparticles and methods of using the same
WO2024064934A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 BioNTech SE Compositions for delivery of plasmodium csp antigens and related methods
WO2024063789A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 BioNTech SE Compositions for delivery of malaria antigens and related methods
WO2024064931A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 BioNTech SE Compositions for delivery of liver stage antigens and related methods
WO2024063788A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 BioNTech SE Compositions for delivery of malaria antigens and related methods
WO2024064910A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 Chroma Medicine, Inc. Compositions and methods for epigenetic regulation of hbv gene expression
WO2024068545A1 (en) 2022-09-26 2024-04-04 Glaxosmithkline Biologicals Sa Influenza virus vaccines
WO2024077191A1 (en) 2022-10-05 2024-04-11 Flagship Pioneering Innovations V, Inc. Nucleic acid molecules encoding trif and additionalpolypeptides and their use in treating cancer
WO2024074634A1 (en) 2022-10-06 2024-04-11 BioNTech SE Rna compositions targeting claudin-18.2
WO2024074211A1 (en) 2022-10-06 2024-04-11 BioNTech SE Rna compositions targeting claudin-18.2
WO2024089638A1 (en) 2022-10-28 2024-05-02 Glaxosmithkline Biologicals Sa Nucleic acid based vaccine
WO2024097664A1 (en) 2022-10-31 2024-05-10 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions and methods for purifying polyribonucleotides
WO2024102762A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Lipids and lipid nanoparticle compositions for delivering polynucleotides
WO2024102799A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Flagship Pioneering Innovations Vi, Llc Compositions and methods for producing circular polyribonucleotides
WO2024102730A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Lipids and nanoparticle compositions for delivering polynucleotides
WO2024102677A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Orna Therapeutics, Inc. Circular rna compositions
WO2024102954A1 (en) 2022-11-10 2024-05-16 Massachusetts Institute Of Technology Activation induced clipping system (aics)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5744625A (en) * 1994-09-30 1998-04-28 The Reagents Of The University Of California Cationic transport reagents
US20020169138A1 (en) * 1997-10-24 2002-11-14 Southern Research Institute Delivery vehicles for bioactive agents and uses thereof
US20030153081A1 (en) * 1999-12-23 2003-08-14 Toshiaki Tagawa Viral core protein-cationic lipid-nucleic acid-delivery complexes
US20050008617A1 (en) * 2002-09-28 2005-01-13 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for delivery of short interfering RNA and short hairpin RNA
US7145039B2 (en) * 1998-11-12 2006-12-05 Invitrogen Corp. Transfection reagents
US20070260055A1 (en) * 2005-08-11 2007-11-08 Rana Tariq M Methods and compositions for the efficient delivery of therapeutic agents to cells and animals
US20080020058A1 (en) * 2005-02-14 2008-01-24 Sirna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules

Family Cites Families (215)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US105A (en) 1836-12-15 knight
US5218A (en) 1847-08-07 Improvement in plows
US3288774A (en) * 1963-12-03 1966-11-29 Universal Oil Prod Co Reaction product of substituted-aminoalkyl alkanolamine and polycarboxylic acid or the like
GB1277947A (en) * 1968-08-22 1972-06-14 Armour Ind Chem Co Compositions and method for controlling insect pests
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US3993754A (en) 1974-10-09 1976-11-23 The United States Of America As Represented By The United States Energy Research And Development Administration Liposome-encapsulated actinomycin for cancer chemotherapy
US4086257A (en) 1976-10-12 1978-04-25 Sears Barry D Phosphatidyl quaternary ammonium compounds
CH624011A5 (ru) 1977-08-05 1981-07-15 Battelle Memorial Institute
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4522803A (en) 1983-02-04 1985-06-11 The Liposome Company, Inc. Stable plurilamellar vesicles, their preparation and use
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
US4603044A (en) 1983-01-06 1986-07-29 Technology Unlimited, Inc. Hepatocyte Directed Vesicle delivery system
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4588578A (en) 1983-08-08 1986-05-13 The Liposome Company, Inc. Lipid vesicles prepared in a monophase
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
DE3402146A1 (de) * 1984-01-23 1985-07-25 Henkel KGaA, 4000 Düsseldorf Neue quartaere ammoniumverbindungen, deren herstellung und verwendung als textilweichmacher
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
AU587989B2 (en) 1984-10-16 1989-09-07 Mitsubishi Chemical Corporation DMA fragments, expression vectors, proteins, hosts, and process for production of the proteins
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
DE3688418T2 (de) 1985-02-13 1993-08-26 Scios Nova Inc Menschlicher metallothionein ii-promotor in saeugetierexpressionssystemen.
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
ATE171185T1 (de) 1985-03-15 1998-10-15 Antivirals Inc Immunotestmittel für polynukleotid und verfahren
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
AU6522486A (en) 1985-10-04 1987-04-24 Biotechnology Research Partners Limited Recombinant apolipoproteins and methods
US4737323A (en) 1986-02-13 1988-04-12 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
US5453566A (en) 1986-03-28 1995-09-26 Calgene, Inc. Antisense regulation of gene expression in plant/cells
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
GB8712540D0 (en) 1987-05-28 1987-07-01 Ucb Sa Expression of human proapolipoprotein a-i
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5149782A (en) 1988-08-19 1992-09-22 Tanox Biosystems, Inc. Molecular conjugates containing cell membrane-blending agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
CA1340323C (en) 1988-09-20 1999-01-19 Arnold E. Hampel Rna catalyst for cleaving specific rna sequences
GB8822492D0 (en) 1988-09-24 1988-10-26 Considine J Apparatus for removing tumours from hollow organs of body
US4910310A (en) 1988-10-03 1990-03-20 G. D. Searle & Co. Synthesis of N-substituted 1,5-dideoxy-1,5-imino-L-fucitol derivatives
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US4957773A (en) 1989-02-13 1990-09-18 Syracuse University Deposition of boron-containing films from decaborane
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US5256775A (en) 1989-06-05 1993-10-26 Gilead Sciences, Inc. Exonuclease-resistant oligonucleotides
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5168045A (en) 1989-08-18 1992-12-01 The Scripps Research Institute Diagnostic systems and methods using polypeptide analogs of apolipoprotein e
US5473039A (en) 1989-08-18 1995-12-05 The Scripps Research Institute Polypeptide analogs of apolipoprotein E, diagnostic systems and methods using the analogs
US5182364A (en) 1990-02-26 1993-01-26 The Scripps Research Institute Polypeptide analogs of apolipoprotein E
US5177189A (en) 1989-08-18 1993-01-05 The Scripps Research Institute Polypeptide analogs of Apolipoprotein E
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
WO1991003162A1 (en) 1989-08-31 1991-03-21 City Of Hope Chimeric dna-rna catalytic sequences
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5286634A (en) 1989-09-28 1994-02-15 Stadler Joan K Synergistic method for host cell transformation
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US6153737A (en) 1990-01-11 2000-11-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Derivatized oligonucleotides having improved uptake and other properties
US5457191A (en) 1990-01-11 1995-10-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5149797A (en) 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
WO1991013080A1 (en) 1990-02-20 1991-09-05 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
JPH0662966B2 (ja) * 1990-03-14 1994-08-17 花王株式会社 燃料油添加剤組成物
EP0745689A3 (en) 1990-05-11 1996-12-11 Microprobe Corporation A dipstick for a nucleic acid hybridization assay
US6365730B1 (en) 1990-06-19 2002-04-02 Gene Shears Pty. Limited DNA-Armed ribozymes and minizymes
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5378825A (en) 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
EP0544824B1 (en) 1990-07-27 1997-06-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5386023A (en) 1990-07-27 1995-01-31 Isis Pharmaceuticals Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling
US5223618A (en) 1990-08-13 1993-06-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
US5789573A (en) 1990-08-14 1998-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of ICAM-1, E-selectin, and CMV IE1/IE2
JPH04108178A (ja) * 1990-08-22 1992-04-09 Kao Corp 柔軟仕上剤
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
CA2093664C (en) 1990-10-12 2003-07-29 Fritz Eckstein Modified ribozymes
EP0556301B1 (en) 1990-11-08 2001-01-10 Hybridon, Inc. Incorporation of multiple reporter groups on synthetic oligonucleotides
DE4216134A1 (de) 1991-06-20 1992-12-24 Europ Lab Molekularbiolog Synthetische katalytische oligonukleotidstrukturen
WO1993000443A1 (en) 1991-06-26 1993-01-07 Bio-Technology General Corp. Purification of recombinant apolipoprotein e from bacteria
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US6335434B1 (en) 1998-06-16 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc., Nucleosidic and non-nucleosidic folate conjugates
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
SE9103701D0 (sv) 1991-12-13 1991-12-13 Kabi Pharmacia Ab Apolipoprotein
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
US5652094A (en) 1992-01-31 1997-07-29 University Of Montreal Nucleozymes
EP0642589A4 (en) 1992-05-11 1997-05-21 Ribozyme Pharm Inc METHOD AND REAGENT TO INHIBIT VIRAL REPLICATION.
US6372886B1 (en) 1992-06-23 2002-04-16 Arch Development Corp. Expression and purification of kringle domains of human apolipoprotein (a) in E. coli
US6172208B1 (en) 1992-07-06 2001-01-09 Genzyme Corporation Oligonucleotides modified with conjugate groups
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
EP0786522A2 (en) 1992-07-17 1997-07-30 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Enzymatic RNA molecules for treatment of stenotic conditions
SE9203753D0 (sv) 1992-12-11 1992-12-11 Kabi Pharmacia Ab Expression system for producing apolipoprotein ai-m
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
IL108367A0 (en) 1993-01-27 1994-04-12 Hektoen Inst For Medical Resea Antisense polynzcleotide inhibition of human growth factor-sensitive cancer cells
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
GB9304620D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Compounds
US5532130A (en) 1993-07-20 1996-07-02 Dyad Pharmaceutical Corporation Methods and compositions for sequence-specific hybridization of RNA by 2'-5' oligonucleotides
CA2170869C (en) 1993-09-03 1999-09-14 Phillip Dan Cook Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5801154A (en) 1993-10-18 1998-09-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5591317A (en) 1994-02-16 1997-01-07 Pitts, Jr.; M. Michael Electrostatic device for water treatment
US5539083A (en) 1994-02-23 1996-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid combinatorial libraries and improved methods of synthesis
US5631359A (en) 1994-10-11 1997-05-20 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Hairpin ribozymes
JPH08510761A (ja) 1994-03-07 1996-11-12 ザ・ダウ・ケミカル・カンパニー 生物活性及び／又はターゲテッドデンドリマー複合体
JP3754072B2 (ja) 1994-03-22 2006-03-08 リサーチ・コーポレーション・テクノロジーズ・インコーポレーテッド 摂食抑制ペプチド
JP3631755B2 (ja) * 1994-03-23 2005-03-23 明治製菓株式会社 ポリオキシエチレン含有脂質二本鎖誘導体
US5491152A (en) 1994-03-23 1996-02-13 The Du Pont Merck Pharmaceutical Company Derivatives of cyclic ethers and sulfides for the treatment of atherosclerosis
US5534499A (en) 1994-05-19 1996-07-09 The University Of British Columbia Lipophilic drug derivatives for use in liposomes
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5892071A (en) 1994-09-30 1999-04-06 The Reagents Of The University Of California Cationic transport reagents
US5820873A (en) 1994-09-30 1998-10-13 The University Of British Columbia Polyethylene glycol modified ceramide lipids and liposome uses thereof
US5885613A (en) 1994-09-30 1999-03-23 The University Of British Columbia Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes
AU3559695A (en) 1994-09-30 1996-04-26 Inex Pharmaceuticals Corp. Glycosylated protein-liposome conjugates and methods for their preparation
WO1996011266A2 (en) 1994-10-05 1996-04-18 Amgen Inc. Method for inhibiting smooth muscle cell proliferation and oligonucleotides for use therein
US5783683A (en) 1995-01-10 1998-07-21 Genta Inc. Antisense oligonucleotides which reduce expression of the FGFRI gene
JP3413303B2 (ja) 1995-01-20 2003-06-03 花王株式会社 液体柔軟仕上剤組成物
JP3563473B2 (ja) 1995-02-24 2004-09-08 花王株式会社 新規な第４級アンモニウム塩及びその製造法
JP3221811B2 (ja) 1995-02-27 2001-10-22 花王株式会社 液体柔軟仕上剤組成物
SE9500778D0 (sv) 1995-03-03 1995-03-03 Pharmacia Ab Process for producing a protein
US5801155A (en) 1995-04-03 1998-09-01 Epoch Pharmaceuticals, Inc. Covalently linked oligonucleotide minor grove binder conjugates
JP3583505B2 (ja) 1995-05-10 2004-11-04 花王株式会社 新規な第４級アンモニウム塩及びそれを含有する柔軟剤組成物
EP0830368A1 (en) * 1995-06-07 1998-03-25 Genta Incorporated Novel carbamate-based cationic lipids
ATE285477T1 (de) 1995-06-07 2005-01-15 Inex Pharmaceutical Corp Herstellung von lipid-nukleinsäure partikeln duch ein hydrophobische lipid-nukleinsäuree komplexe zwischenprodukt und zur verwendung in der gentransfer
US5747470A (en) 1995-06-07 1998-05-05 Gen-Probe Incorporated Method for inhibiting cellular proliferation using antisense oligonucleotides to gp130 mRNA
US5672662A (en) 1995-07-07 1997-09-30 Shearwater Polymers, Inc. Poly(ethylene glycol) and related polymers monosubstituted with propionic or butanoic acids and functional derivatives thereof for biotechnical applications
US5672685A (en) 1995-10-04 1997-09-30 Duke University Source of apolipoprotein E and method of isolating apolipoprotein E
JP3469974B2 (ja) 1995-10-09 2003-11-25 花王株式会社 液体柔軟仕上剤組成物
US6444806B1 (en) 1996-04-30 2002-09-03 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. Conjugates and methods of forming conjugates of oligonucleotides and carbohydrates
US5739119A (en) 1996-11-15 1998-04-14 Galli; Rachel L. Antisense oligonucleotides specific for the muscarinic type 2 acetylcholine receptor MRNA
US6235310B1 (en) * 1997-04-04 2001-05-22 Valentis, Inc. Methods of delivery using cationic lipids and helper lipids
WO1998051278A2 (en) 1997-05-14 1998-11-19 Inex Pharmaceuticals Corporation High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles
US6046166A (en) 1997-09-29 2000-04-04 Jean-Louis Dasseux Apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
US6004925A (en) 1997-09-29 1999-12-21 J. L. Dasseux Apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
US6037323A (en) 1997-09-29 2000-03-14 Jean-Louis Dasseux Apolipoprotein A-I agonists and their use to treat dyslipidemic disorders
US6320017B1 (en) 1997-12-23 2001-11-20 Inex Pharmaceuticals Corp. Polyamide oligomers
US6300319B1 (en) 1998-06-16 2001-10-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeted oligonucleotide conjugates
US6037113A (en) * 1998-08-14 2000-03-14 Eastman Kodak Company Photographic element and process for its use
US6335437B1 (en) 1998-09-07 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for the preparation of conjugated oligomers
DE19956568A1 (de) 1999-01-30 2000-08-17 Roland Kreutzer Verfahren und Medikament zur Hemmung der Expression eines vorgegebenen Gens
BR0008711A (pt) 1999-03-02 2002-10-01 Liposome Co Inc Encapsulação de complexos bioativos em lipossomas
CN1295684C (zh) * 1999-03-26 2007-01-17 彭佐尔·奎克州立公司 磁记录介质用润滑剂及其用途
US7112337B2 (en) * 1999-04-23 2006-09-26 Alza Corporation Liposome composition for delivery of nucleic acid
US6395437B1 (en) 1999-10-29 2002-05-28 Advanced Micro Devices, Inc. Junction profiling using a scanning voltage micrograph
WO2001039793A2 (en) * 1999-11-30 2001-06-07 Smithkline Beecham P.L.C. Pharmaceutical compositions containing sema7a polypeptides
EP1261620A2 (en) * 2000-02-07 2002-12-04 Roche Diagnostics Corporation Cationic amphiphiles for use in nucleic acid transfection
IL151928A0 (en) 2000-03-30 2003-04-10 Whitehead Biomedical Inst Rna sequence-specific mediators of rna interference
US6559279B1 (en) 2000-09-08 2003-05-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Process for preparing peptide derivatized oligomeric compounds
US7427394B2 (en) 2000-10-10 2008-09-23 Massachusetts Institute Of Technology Biodegradable poly(β-amino esters) and uses thereof
ES2215494T5 (es) 2000-12-01 2017-12-28 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Moléculas de RNA pequeñas que median la interferencia de RNA
KR100475649B1 (ko) * 2001-01-29 2005-03-10 배석철 항암활성을 나타내는 ｒｕｎｘ３ 유전자 및 그의 용도
JP2002258450A (ja) * 2001-02-28 2002-09-11 Fuji Photo Film Co Ltd 発色現像主薬、ハロゲン化銀カラー写真感光材料および画像形成方法
GB0106466D0 (en) * 2001-03-15 2001-05-02 Unilever Plc Fabric softening compositions
JP2003212950A (ja) * 2002-01-17 2003-07-30 Asahi Denka Kogyo Kk チキソトロピー剤及びこれを含有するスプレー剤組成物
EP1513538A4 (en) * 2002-06-14 2007-08-22 Mirus Bio Corp Novel methods for introducing polynucleotides into cells
JP3994835B2 (ja) * 2002-09-13 2007-10-24 三菱自動車工業株式会社 内燃機関用可変動弁装置のバルブクリアランス調整方法
US7125904B2 (en) * 2002-10-11 2006-10-24 Portela & C.A., S.A. Peripherally-selective inhibitors of dopamine-β-hydroxylase and method of their preparation
MXPA06012076A (es) * 2004-04-20 2007-01-25 Nastech Pharm Co Metodos y composiciones para mejorar el suministro de arn bicatenario o un acido nucleico hibrido bicatenario para regular la expresion genetica en celulas de mamifero.
JP4584986B2 (ja) 2004-04-27 2010-11-24 アルニラム ファーマスーティカルズ インコーポレイテッド ２−アリールプロピル部分を含む１本鎖及び２本鎖オリゴヌクレオチド
AU2005252273B2 (en) 2004-06-07 2011-04-28 Arbutus Biopharma Corporation Lipid encapsulated interfering RNA
WO2006002053A2 (en) * 2004-06-15 2006-01-05 Mayo Foundation For Medical Education And Research Helicases
WO2006007712A1 (en) 2004-07-19 2006-01-26 Protiva Biotherapeutics, Inc. Methods comprising polyethylene glycol-lipid conjugates for delivery of therapeutic agents
WO2007086881A2 (en) 2005-02-14 2007-08-02 Sirna Therapeutics, Inc. Cationic lipids and formulated molecular compositions containing them
US9006487B2 (en) * 2005-06-15 2015-04-14 Massachusetts Institute Of Technology Amine-containing lipids and uses thereof
JP5478886B2 (ja) * 2005-10-20 2014-04-23 ジョージタウン・ユニバーシティ 癌の早期ｍｒｉ検出を改善するための腫瘍標的化ナノ送達系
US7294730B2 (en) * 2005-11-30 2007-11-13 Xerox Corporation Colorant compounds
DE102006005767A1 (de) * 2006-02-07 2007-08-09 Henkel Kgaa Oxidative Haarbehandlungsmittel mit Ginsengextrakt
EP1986697B1 (en) 2006-02-17 2016-06-29 GE Healthcare Dharmacon, Inc. Compositions and methods for inhibiting gene silencing by rna interference
US7879344B2 (en) * 2006-06-29 2011-02-01 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Transdermal delivery of oleocanthal for relief of inflammation
AU2007299705B2 (en) 2006-09-22 2012-09-06 Dharmacon, Inc. Duplex oligonucleotide complexes and methods for gene silencing by RNA interference
DK2068886T3 (da) 2006-10-03 2013-11-18 Tekmira Pharmaceuticals Corp Lipidholdige præparater
US8039010B2 (en) * 2006-11-03 2011-10-18 Allergan, Inc. Sustained release intraocular drug delivery systems comprising a water soluble therapeutic agent and a release modifier
JP5666763B2 (ja) * 2007-04-11 2015-02-12 味の素株式会社 油中水型乳化組成物
CN101066924B (zh) * 2007-06-08 2011-01-12 中国科学院上海有机化学研究所 2-己基-3-羟基-5-r1氧基十六羧酸r2酯,制备方法及用于制备减肥药物奥利司他的用途
EP2231195B1 (en) * 2007-12-04 2017-03-29 Arbutus Biopharma Corporation Targeting lipids
JP5697988B2 (ja) * 2007-12-27 2015-04-08 プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド 干渉ｒｎａを使用したポロ様キナーゼ発現のサイレンシング方法
US20110117125A1 (en) 2008-01-02 2011-05-19 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Compositions and methods for the delivery of nucleic acids
EP2350043B9 (en) * 2008-10-09 2014-08-20 TEKMIRA Pharmaceuticals Corporation Improved amino lipids and methods for the delivery of nucleic acids
EP3207944B1 (en) 2008-11-10 2020-01-15 Arbutus Biopharma Corporation Novel lipids and compositions for the delivery of therapeutics
NZ593618A (en) 2008-12-10 2013-02-22 Alnylam Pharmaceuticals Inc Gnaq targeted dsrna compositions and methods for inhibiting expression
CN102272145B (zh) * 2009-01-12 2014-07-30 通用电气健康护理生物科学股份公司 亲和色谱基质
JP6032724B2 (ja) * 2009-03-12 2016-11-30 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッドＡｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． 脂質製剤組成物およびＥｇ５遺伝子とＶＥＧＦ遺伝子の発現を阻害する方法
AU2010259984B2 (en) 2009-06-10 2017-03-09 Arbutus Biopharma Corporation Improved lipid formulation
EP2442792A4 (en) 2009-06-15 2015-12-23 Alnylam Pharmaceuticals Inc DOUBLE STRANDED RNA IN LIPID FORMULATION TARGETING THE PCSK9 GENE
WO2011005793A1 (en) * 2009-07-06 2011-01-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Cell-based bioprocessing
SG177590A1 (en) 2009-07-09 2012-03-29 Marina Biotech Inc Amphoteric liposomes comprising imino lipids
DE102009039097B3 (de) 2009-08-27 2010-11-25 Siemens Aktiengesellschaft Verfahren zum Übertragen von Daten in einem Sensornetzwerk, Sensorknoten und Zentral-Rechner
WO2011071860A2 (en) 2009-12-07 2011-06-16 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions for nucleic acid delivery
WO2011141704A1 (en) * 2010-05-12 2011-11-17 Protiva Biotherapeutics, Inc Novel cyclic cationic lipids and methods of use
EP2569276B1 (en) 2010-05-12 2021-02-24 Arbutus Biopharma Corporation Novel cationic lipids and methods of use thereof
WO2012005769A1 (en) 2010-07-09 2012-01-12 Telecommunication Systems, Inc. Location privacy selector
US9788835B2 (en) 2014-09-02 2017-10-17 Ethicon Llc Devices and methods for facilitating ejection of surgical fasteners from cartridges
US10833934B2 (en) 2015-06-30 2020-11-10 British Telecommunications Public Limited Company Energy management in a network
CN111845757A (zh) 2019-04-30 2020-10-30 通用汽车环球科技运作有限责任公司 分心驾驶消除系统
CN110649043B (zh) 2019-09-30 2021-11-19 厦门天马微电子有限公司 阵列基板、显示面板、显示装置及阵列基板的制备方法
KR102318555B1 (ko) 2020-03-19 2021-10-29 한국과학기술연구원 광소자용 역나노콘과 그 제조방법

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5744625A (en) * 1994-09-30 1998-04-28 The Reagents Of The University Of California Cationic transport reagents
US20020169138A1 (en) * 1997-10-24 2002-11-14 Southern Research Institute Delivery vehicles for bioactive agents and uses thereof
US7145039B2 (en) * 1998-11-12 2006-12-05 Invitrogen Corp. Transfection reagents
US20030153081A1 (en) * 1999-12-23 2003-08-14 Toshiaki Tagawa Viral core protein-cationic lipid-nucleic acid-delivery complexes
US20050008617A1 (en) * 2002-09-28 2005-01-13 Massachusetts Institute Of Technology Compositions and methods for delivery of short interfering RNA and short hairpin RNA
US20080020058A1 (en) * 2005-02-14 2008-01-24 Sirna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules
US20070260055A1 (en) * 2005-08-11 2007-11-08 Rana Tariq M Methods and compositions for the efficient delivery of therapeutic agents to cells and animals

Also Published As

Publication number Publication date
CA2743136A1 (en) 2010-05-14
AU2009313205A1 (en) 2010-05-14
EP2367571A4 (en) 2012-08-29
EP3207944B1 (en) 2020-01-15
JP2019081808A (ja) 2019-05-30
IL277157A (en) 2020-10-29
JP7227288B2 (ja) 2023-02-21
MX347860B (es) 2017-05-16
JP2023063361A (ja) 2023-05-09
EP2355851B1 (en) 2018-04-04
JP2020172500A (ja) 2020-10-22
CA2743135A1 (en) 2010-05-14
EA201170554A1 (ru) 2012-04-30
EP4241767A3 (en) 2023-11-01
EP3238738A1 (en) 2017-11-01
JP2021098718A (ja) 2021-07-01
EA201170553A1 (ru) 2012-05-30
JP6273234B2 (ja) 2018-01-31
AU2019206116A1 (en) 2019-08-08
JP6748037B2 (ja) 2020-08-26
DK2355851T3 (en) 2018-06-25
AU2023200568B2 (en) 2023-08-10
SG195653A1 (en) 2013-12-30
US9764036B2 (en) 2017-09-19
JP2018127476A (ja) 2018-08-16
CA2743136C (en) 2019-02-26
JP2021152033A (ja) 2021-09-30
JP5774486B2 (ja) 2015-09-09
EP3238738B1 (en) 2020-09-23
US20160213785A1 (en) 2016-07-28
CN102281899A (zh) 2011-12-14
US10117941B2 (en) 2018-11-06
JP6636560B2 (ja) 2020-01-29
NO2355851T3 (ru) 2018-09-01
WO2010054405A1 (en) 2010-05-14
CN102281899B (zh) 2015-07-15
AU2022215225A1 (en) 2022-09-01
CA2743139A1 (en) 2010-05-14
EP3284482B1 (en) 2020-06-03
CA3039251C (en) 2024-01-09
US20150265708A1 (en) 2015-09-24
IL212801A (en) 2015-06-30
JP2012508261A (ja) 2012-04-05
CN105152939A (zh) 2015-12-16
JP2012508264A (ja) 2012-04-05
JP2023062025A (ja) 2023-05-02
EP3284482A1 (en) 2018-02-21
AU2017279739A1 (en) 2018-01-25
JP6189461B2 (ja) 2017-08-30
IL212801A0 (en) 2011-07-31
CA3033577A1 (en) 2010-05-14
EP2355851A4 (en) 2012-08-29
US9186325B2 (en) 2015-11-17
US20190167800A1 (en) 2019-06-06
MX2018012161A (es) 2020-09-02
CA2743135C (en) 2019-05-21
AU2019222922A1 (en) 2019-09-19
AU2023200441A1 (en) 2023-03-02
US20180092971A1 (en) 2018-04-05
JP2020063281A (ja) 2020-04-23
JP2017197576A (ja) 2017-11-02
EP3757090A9 (en) 2023-07-19
AU2016208434A1 (en) 2016-08-18
KR20110091866A (ko) 2011-08-16
JP2015214560A (ja) 2015-12-03
IL247646B (en) 2020-09-30
HUE037082T2 (hu) 2018-08-28
KR20200100864A (ko) 2020-08-26
MX338780B (es) 2016-05-02
EP2355658A1 (en) 2011-08-17
AU2017254919A1 (en) 2017-11-23
MX351819B (es) 2017-10-30
CA3220821A1 (en) 2010-05-14
US8999351B2 (en) 2015-04-07
EA037285B8 (ru) 2021-09-07
SG10201901106WA (en) 2019-03-28
AU2016208434B2 (en) 2018-01-18
EP2355851A1 (en) 2011-08-17
IL212802A0 (en) 2011-07-31
EP2355658A4 (en) 2012-03-28
AU2016208436A1 (en) 2016-08-18
US11077197B2 (en) 2021-08-03
KR102344392B1 (ko) 2021-12-28
US20240042039A1 (en) 2024-02-08
KR20190039346A (ko) 2019-04-10
KR101967417B1 (ko) 2019-04-10
US20220023427A1 (en) 2022-01-27
CA3039251A1 (en) 2010-05-14
EP3699172A2 (en) 2020-08-26
AU2009313201B2 (en) 2016-06-16
KR20170143016A (ko) 2017-12-28
AU2009313206A1 (en) 2010-05-14
KR20110097823A (ko) 2011-08-31
MX2011004973A (es) 2011-07-29
JP7077254B2 (ja) 2022-05-30
US20180043009A1 (en) 2018-02-15
US10835612B2 (en) 2020-11-17
US20180064807A1 (en) 2018-03-08
EP2355658B1 (en) 2017-09-27
EP3757090A1 (en) 2020-12-30
US20210162053A1 (en) 2021-06-03
IL238885A0 (en) 2015-06-30
MX359674B (es) 2018-10-05
KR20230161525A (ko) 2023-11-27
KR20230147211A (ko) 2023-10-20
JP2016047832A (ja) 2016-04-07
US20180125985A1 (en) 2018-05-10
IL247647A0 (en) 2016-11-30
MX2011004974A (es) 2011-07-29
MX363082B (es) 2019-03-07
IL212802A (en) 2015-06-30
US10821186B2 (en) 2020-11-03
AU2021277589A1 (en) 2021-12-23
KR20210072142A (ko) 2021-06-16
HK1246166A1 (zh) 2018-09-07
JP5832898B2 (ja) 2015-12-16
HK1248565A1 (zh) 2018-10-19
KR102042721B1 (ko) 2019-11-11
AU2009313201A1 (en) 2010-05-14
KR20170089976A (ko) 2017-08-04
JP6896832B2 (ja) 2021-06-30
JP6324937B2 (ja) 2018-05-16
KR20220138415A (ko) 2022-10-12
AU2018201038A1 (en) 2018-03-01
EP4241767A2 (en) 2023-09-13
AU2023200568A1 (en) 2023-03-02
JP2016128498A (ja) 2016-07-14
EP3699172A3 (en) 2020-11-18
US20110311582A1 (en) 2011-12-22
US11712476B2 (en) 2023-08-01
EP2367571A1 (en) 2011-09-28
IL247647B (en) 2021-06-30
US20160199485A1 (en) 2016-07-14
US9707292B2 (en) 2017-07-18
US20120095075A1 (en) 2012-04-19
CN111808084A (zh) 2020-10-23
AU2009313205B2 (en) 2016-06-16
AU2019283906A1 (en) 2020-01-16
WO2010054401A1 (en) 2010-05-14
PL2355851T3 (pl) 2018-08-31
JP2023164871A (ja) 2023-11-14
PT2355851T (pt) 2018-05-23
US9682139B2 (en) 2017-06-20
AU2023200568C1 (en) 2024-01-04
SG10201901089TA (en) 2019-03-28
US20230381319A1 (en) 2023-11-30
IL283459B2 (en) 2023-02-01
US9220683B2 (en) 2015-12-29
KR102459839B1 (ko) 2022-10-27
EA037285B1 (ru) 2021-03-04
US20120027796A1 (en) 2012-02-02
KR20220150995A (ko) 2022-11-11
JP5747282B2 (ja) 2015-07-15
US20110311583A1 (en) 2011-12-22
JP2012508263A (ja) 2012-04-05
AU2023255012A1 (en) 2023-11-16
EP3207944A1 (en) 2017-08-23
AU2009313206B2 (en) 2016-05-19
AU2021201075A1 (en) 2021-03-11
CN102361650B (zh) 2016-04-20
CN111909020A (zh) 2020-11-10
ES2666701T3 (es) 2018-05-07
CA2743139C (en) 2019-04-02
JP2018012724A (ja) 2018-01-25
MX2019002632A (es) 2019-07-15
IL283459A (en) 2021-06-30
CN105709229B (zh) 2020-07-28
EP3808177A1 (en) 2021-04-21
AU2021201075B2 (en) 2022-05-12
CN105709229A (zh) 2016-06-29
CA3029724A1 (en) 2010-05-14
WO2010054406A1 (en) 2010-05-14
IL301340A (en) 2023-05-01
CN102361650A (zh) 2012-02-22
AU2016216582A1 (en) 2016-09-01
IL283459B (en) 2022-10-01
JP6726149B2 (ja) 2020-07-22
IL247646A0 (en) 2016-11-30
JP2015078229A (ja) 2015-04-23
IL238884A0 (en) 2015-06-30
KR102264822B1 (ko) 2021-06-14
AU2021201876A1 (en) 2021-04-22
KR20210158864A (ko) 2021-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6896832B2 (ja) 治療薬を送達するための新規な脂質及び組成物
JP6356171B2 (ja) Ｐｅｇ化脂質および薬剤送達のためのそれらの使用
EP2760477B1 (en) Di-aliphatic substituted pegylated lipids