MX2011004973A - Lipidos y composiciones novedosas para el suministro de terapeuticos. - Google Patents

Lipidos y composiciones novedosas para el suministro de terapeuticos.

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MX2011004973A
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Muthiah Manoharan
Muthusamy Jayaraman
Laxman Eltepu
Steven Ansell
Jianxin Chen
Kallanthottathil G Rajeev
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Alnylam Pharmaceuticals Inc
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Abstract

La presente invención proporciona lípidos que son ventajosamente utilizados en partículas de lípido para el suministro in vivo de agentes terapéuticos a células. En particular, la fórmula (I) de la invención proporciona lípidos que tienen la siguientes estructura XXXIII, en donde: R1 y R2 son cada uno para cada ocurrencia alquilo de 10 a 30 átomos de carbono opcionalmente substituido, alquenilo de 10 a 30 átomos de carbono opcionalmente substituido, alquinilo de 10 a 30 átomos de carbono opcionalmente substituido, acilo de 10 a 30 átomos de carbono opcionalmente substituido, un enlazador-ligando; R3 es H, alquilo de 1 a 30 átomos de carbono opcionalmente substituido, alquenilo de 2 a 10 átomos de carbono opcionalmente substituido, alquinilo de 2 a 10 átomos carbono opcionalmente substituido, alquilo-heterociclo, alquilfosfato, alquilfosforotioato, alquilfosforoditioato, alquilfosfonatos, alquilaminas, hidroxialquilos, ?-aminoalquilos, ?-aminoalquilos (substituidos), ?-fosfoalquilos, ?-tiofosfoalquilos, polietilen glicol opcionalmente substituido (PEG, mw 100-40K), mPEG opcionalmente substituido (mw 120-40K), heteroarilo, heterociclo, o un enlazador-ligando; y E es C(O)O, ó OC(O).

Description

LÍPIDOS Y COMPOSICIONES NOVEDOSAS PARA EL STJMINISTRO DE AGENTES TERAPÉUTICOS Apoyo del gobierno El trabajo descrito en la presente se llevó a cabo, al menos en parte, usando fondos del Gobierno estadounidense con el número de concesión HHSN266200600012C otorgada por el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas.
Por consiguiente, el gobierno podría tener algunos derechos con respecto a la invención.
Reivindicación de prioridad La presente solicitud reivindica prioridad de U.S.S.N. 61/113,179, presentada el 10 de noviembre de 2008; U.S.S.N. 61/154,350, presentada el 20 de febrero de 2009; U.S.S.N. 61/171,439, presentada el 21 de abril de 2009; U.S.S.N. 61/185,438, presentada el 9 de junio de 2009; U.S.S.N. 61/225,898, presentada el 15 de julio de' 2009; U.S.S.N. 61/234,098, presentada el 14 de agosto de 2009, cuyos contenidos se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad.
Anteceden-bes de la invención Campo técnico La presente invención se refiere al campo de la administración de agentes terapéuticos usando partículas lipidicas. En particular, la presente invención proporciona lipidos catiónicos y partículas lipidicas que comprenden estos lipidos, que son ventajosos para la administración in vivo de ácidos nucleicos, así como también composiciones de partículas de ácido nucleico-lípido adecuadas para uso terapéutico in vivo. Adicionalmente, la presente invención proporciona métodos para realizar estas composiciones, así como también métodos para introducir ácidos nucleicos en células usando estas composiciones, por e . , para el tratamiento de varios estados patológicos.
Breve descripción de la invención Ácidos nucleicos terapéuticos incluyen, por ej . , RNA pequeño de interferencia (siRNA) , micro RNA (miRNA) , oligonucleótidos antisentido, ribozimas, plásmidos, ácidos nucleicos inmunoestimuladores, antisentido, antagomir, antimir, mimético de micro RNA, supermir, adaptador Ul y aptámero. Estos ácidos nucleicos actúan mediante diversos mecanismos. En el caso del siRNA o miRNA, estos ácidos nucleicos pueden regular por disminución los niveles intracelulares de proteínas específicas mediante un proceso denominado interferencia por RNA (iRNA) . Luego de la introducción de siRNA o miRNA dentro del citoplasma celular, estas construcciones de RNA de cadena doble pueden unirse a una proteína denominada RISC. La cadena codificante del siRNA o miRNA se desplaza del complejo RISC proporcionando una plantilla dentro de RISC que puede reconocer y unir mRNA con una secuencia complementaria a aquella del siRNA o miRNA unidos. Una vez unido el RNA complementario, el complejo RISC escinde el mRNA y libera las cadenas escindidas. El iRNA puede proporcionar la regulación por disminución de proteínas específicas al direccionar la destrucción específica del mRNA correspondiente que codifica la síntesis de proteínas.
Las aplicaciones terapéuticas de iRNA son extremadamente amplias, ya ,que las construcciones de siRNA y miRNA pueden sintetizarse con cualquier secuencia de nucleótidos dirigida a una proteína objetivo. Hasta la fecha, las construcciones de siRNA han mostrado la capacidad de regular por disminución específicamente las proteínas objetivo tanto en modelos in vitro como in vivo. Además, en la actualidad las construcciones de siRNA están siendo evaluadas en estudios clínicos .
No obstante, dos problemas actualmente afrontados por las construcciones de siRNA o miRNA son, en primer lugar, su propensión a la digestión de nucleasa en plasma y, en segundo lugar, su capacidad limitada para acceder al compartimiento intracelular donde pueden unirse al RISC al administrarse sistémicamente como siRNA o miRNA libres. Estas construcciones de cadena doble pueden estabilizarse mediante la incorporación de enlaces de nucleótidos químicamente modificados dentro de la molécula, por ejemplo, grupos fosfotioato. Sin embargo, estas modificaciones químicas proporcionan únicamente protección limitada de la digestión de nucleasa y pueden disminuir la actividad de la construcción. La administración intracelular de siRNA o miRNA puede facilitarse mediante el uso de sistemas portadores tales como polímeros, liposomas catiónicos o mediante la modificación química de la construcción, por ejemplo mediante la unión covalente de moléculas de colesterol. Sin embargo, se requieren sistemas de administración mejorados para aumentar la potencia de las moléculas de siRNA y miRNA y para reducir o eliminar la necesidad de modificación química.
Las ribozimas y los oligonucleótidos antisentido pueden también inhibir la traducción de mRNA en proteína. En el caso de las construcciones antisentido, estos ácidos desoxinucleicos de cadena simple tienen una secuencia complementaria a aquella del mRNA de proteínas objetivo y pueden unirse al mRNA mediante el apareamiento de bases de Watson-Crick . Esta unión previene la traducción del mRNA objetivo y/o provoca la degradación mediada por RNasa H de las transcripciones de mRNA. Por consiguiente, los oligonucleótidos antisentido poseen un enorme potencial de especificidad de acción (es decir, regulación por disminución de una proteína específica relacionada con la enfermedad) . Hasta la fecha, estos compuestos son prometedores respecto de diversos modelos in vitro e in vivo, incluyendo modelos de enfermedad inflamatoria, cáncer y HIV (analizado en Agrawal, Trends in Biotech. 14:376-387 (1996)) . El antisentido también puede afectar la actividad celular mediante la hibridación especifica con DNA cromosómico. En la actualidad hay avanzadas evaluaciones clínicas a humanos de diversos fármacos antisentido en curso. Los objetivos de estos fármacos incluyen los genes de apolipoproteína B y bcl2 y productos de mRNA.
Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores incluyen ácidos desoxirribonucleicos y ácidos ribonucleicos. En el caso de los ácidos desoxirribonucleicos, se ha demostrado que algunas secuencias o motivos no permiten la estimulación inmunitaria en mamíferos. Estas secuencias o motivos incluyen el motivo CpG, secuencias ricas en pirimidina y secuencias palindrómicas . Se cree que el motivo CpG en ácidos desoxirribonucleicos se reconoce específicamente mediante un receptor endosómico, receptor 9 tipo toll (TLR-9) , que luego provoca tanto la vía de estimulación inmunitaria innata como la adquirida. También se han registrado algunas secuencias de ácido ribonucleico inmunoestimuladoras . Se cree que estas secuencias de RNA provocan la activación inmunitaria mediante la unión a receptores 6 y 7 tipo toll (TLR-6 y TLR-7) . Además, también se observó que el RNA de cadena doble es estimulante del sistema inmunitario y se cree que activa mediante la unión a TLR-3.
Un problema conocido con el uso de ácidos nucleicos terapéuticos se refiere a la estabilidad del enlace fosfodiéster internucleótido y la propensión de este enlace a nucleasas. La presencia de exonucleasas y endonucleasas en suero da como resultado la rápida digestión de los ácidos nucleicos que poseen enlaces fosfodiéster y, por consiguiente, los ácidos nucleicos terapéuticos pueden tener semividas muy cortas en presencia de suero o dentro de las células. (Zelphati, O.,, et al., Antisense. Res. Dev. 3:323-338 (1993); y Thierry, A.R., et al., ppl47-161 in Gene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA (Eds. Erickson, RP and Izant, JG; Raven Press, NY (1992) ) . El ácido nucleico terapéutico que se desarrolla actualmente no emplea la química básica de fosfodiéster encontrada en ácidos nucleicos naturales, debido a estos y otros problemas conocidos.
Este problema se ha superado parcialmente mediante modificaciones químicas que reducen el suero o la degradación intracelular . Se han probado modificaciones en el puente fosfodiéster internucleótido (por ej., usando enlaces fosforotioato, metilfosfonato o fosforamidato) , en la base del nucleótido (por ej . , 5-propinil-pirimidinas ) o en el azúcar (por ej . , azúcares modificados en 2') (Uhlmann E., et al. Antisense: Chemical Modifications . Encyclopedia of Cáncer, Vol . X., pp 64-81 Academic Press Inc. (1997)). Otros han intentado mejorar la estabilidad usando enlaces de azúcar en 2' -5' {véase, por ej . Patente estadounidense N° 5,532,130) . Se han intentado otros cambios. Sin embargo, ninguna de estas soluciones ha sido completamente satisfactoria y los ácidos nucleicos terapéuticos libres in vivo aún tienen solo eficacia limitada.
Además, tal como se observa anteriormente en relación al siRNA y miRNA, persisten los problemas relativos a la capacidad limitada de ácidos nucleicos terapéuticos para cruzar membranas celulares (véase, Vlassov, et al., Biochim. Blophys. Acta 1197:95-1082 (1994)) y en los problemas asociados con la toxicidad sistémica, tales como anafilaxia mediada por complemento, propiedades coagulatorias alteradas y citopenia (Galbraith, et al., Antisense Nucí, ñcid Drug Des. 4:201-206 (1994) ) .
Para intentar mejorar la eficacia, los investigadores también han empleado sistemas portadores basados en lipidos para administrar ácidos nucleicos terapéuticos modificados o no modificados. En Zelphati, 0 and Szoka, F.C., J. Contr. Reí. 41:99-119 (1996), los autores se refieren al uso de liposomas aniónicos (convencionales), liposomas sensibles al pH, inmunoliposomas , liposomas fusogénicos y agregados de lipidos catiónicos/antisentido. De manera similar, siRNA se ha administrado de manera sistémica en liposomas catiónicos, y se ha indicado que estas partículas de ácido nucleico- lipido proporcionan regulación por disminución mejorada de proteínas objetivo en mamíferos, incluidos los primates no humanos (Zimmermann et al., Nature 441: 111-114 (2006)) .
A pesar de este progreso, persiste la necesidad en la técnica de composiciones mejoradas de lípido-ácido nucleico terapéutico adecuadas para el uso terapéutico general. Preferentemente, estas composiciones encapsularían ácidos nucleicos con alta eficacia, tendrían altas relaciones de fármaco : lipido, protegerían el ácido nucleico encapsulado de degradarse y depurarse en suero, serían adecuadas para la administración sistémica y proporcionarían administración intracelular del ácido nucleico encapsulado. Además, estas partículas de lípido-ácido nucleico deberían tolerarse bien y proporcionar un índice terapéutico adecuado, para que el tratamiento del paciente a una dosis efectiva de ácido nucleico no se asocie con una toxicidad considerable y/o riesgo para el paciente. La presente invención proporciona tales composiciones, métodos para fabricar las composiciones y métodos para usar las composiciones para introducir ácidos nucleicos en células, incluso para el tratamiento de enfermedades .
Breve descripción de la invención La presente invención proporciona lípidos catiónicos novedosos, así como también partículas lipídicas que comprenden los mismos. Estas partículas lipídicas pueden comprender adicionalmente un agente activo y usarse de acuerdo con métodos relacionados de la invención para administrar el agente activo a una célula.
En un aspecto, la invención proporciona lípidos que poseen la estructura ' sa^es o' isómeros de los mismos, donde: ????II Ri y R2 son cada uno independientemente para cada aparición alquilo C10-C30 opcionalmente sustituido, . alquenilo C10-C30 opcionalmente sustituido, alquinilo C 10-C30 opcionalmente sustituido, acilo C10-C30 opcionalmente sustituido o enlazador-ligando; R3 es H, alquilo C1-C10 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-Cio opcionalmente sustituido, alquinilo C2-Cio opcionalmente sustituido, alquilheterociclo, alquilfosfato, alquilfosforotioato, alquilfosforoditioato, alquilfosfonatos , alquilaminas , hidroxialquilos, ?-aminoalquilos , ? aminoalquilos ( sustitutidos ) , ? -fosfoalquilos, ? tiofosfoalquilos , polietilenglicol opcionalmente sustituido (PEG, mw 100-40K), mPEG opcionalmente sustituido (mw 120-40K) , heteroarilo, heterociclo o enlazador-ligando; y E es C(0)0 o OC(O) .
En otro aspecto, la invención proporciona una partícula lipídica que comprende lipidos de la presente invención. En algunas modalidades, la partícula lipídica comprende adicionalmente un lípido neutro y un lípido capaz de reducir la agregación de partículas. En una modalidad, la partícula lipídica consiste esencialmente en (i) al menos un lípido de la presente invención; (ii) un lípido neutro que se selecciona de DSPC, DPPC, POPC, DOPE y SM; (iii) esterol, por ej . colesterol; y (iv) peg-lípido, por ej . PEG-DMG o PEG-DMA, en una relación molar de alrededor de 20-60% de lípido catiónico: 5-25% de lípido neutro: 25-55% de esterol; 0.5-15% PEG-lípido. En una modalidad, el lípido de la presente invención es ópticamente puro.
En modalidades relacionadas adicionales, la presente invención incluye partículas lipídicas de la invención que comprenden adicionalmente un agente terapéutico. En una modalidad, el agente terapéutico es un ácido nucleico. En una modalidad, el ácido nucleico es un plásmido, un oligonucleótido inmunoestimulador, un oligonucleótido de filamento simple, por ej . un oligonucleótido antisentido, un antagomir; un oligonucleótido de filamento doble, por ej . un siRNA; un aptámero o una ribozima.
En aun otra modalidad relacionada, la presente invención incluye una composición farmacéutica que comprende una partícula lipídica de la presente invención y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
La presente invención incluye adicionalmente, en otras modalidades relacionadas, un método para modular la expresión de un gene objetivo en una célula, el cual comprende proporcionar a una célula una partícula lipídica o composición farmacéutica de la presente invención. El gene objetivo puede ser un gene de tipo salvaje. En otra modalidad, el gene objetivo contiene una o más mutaciones. En una modalidad particular, el método comprende específicamente modular la expresión de un gene objetivo que contiene una o más mutaciones. En modalidades particulares, la partícula lipídica comprende un agente terapéutico que se selecciona de un oligonucleótido inmunoestimulador , un oligonucleótido de cadena simple, por ej . un oligonucleótido antisentido, un antagomir; un oligonucleótido de cadena doble, por ej . un siRNA, un aptémero, una ribozima. En una modalidad, el ácido nucleico es plásmido que codifica un siRNA, un oligonucleótido antisentido, un aptámero o una ribozima.
En un aspecto de la invención, el gene objetivo se selecciona del grupo que consiste en Factor VII, Eg5, PCSK9, TPX2, apoB, SAA, TTR, RSV, PDGF gene beta, gene Erb-B, gene Src, gene CRK, gene GRB2, gene RAS, gene MEKK, gene JNK, gene RAF, gene Erkl/2, gene PCNA(p21), gene MYB, gene JUN, gene FOS, gene BCL-2, gene de la ciclina D, gene VEGF, gene EGFR, gene de la ciclina A, gene de la ciclina E, gene WNT-1, gene de la beta-catenina, gene c-MET, gene PKC, gene NFKB, gene STAT3, gene de survivina, gene Her2/Neu, gene S0RT1, gene XBPl, gene de la topoisomerasa I, gene de la topoisomerasa II alfa, gene p73, gene p21 (WAF1/CIP1) , gene p27(KIPl), gene PPM1D, gene RAS, gene de la caveolina I, gene MIB I, gene MTAI , gene M68, mutaciones en genes supresores tumorales, gene supresor tumoral p53 y combinaciones de los mismos.
En otra modalidad, el ácido nucleico es un plásmido que codifica un polipéptido o un fragmento o variante funcional del mismo, para que aumente la expresión del polipéptido o fragmento o variante funcional del mismo.
En una modalidad relacionada aun adicional, la presente invención incluye un método para tratar una enfermedad o trastorno caracterizados por la sobreexpresión de un polipéptido en un sujeto, que comprende proporcionar al sujeto una partícula lipídica o composición farmacéutica de la presente invención, donde el agente terapéutico se selecciona de un siRNA, un micro RNA, un oligonucleótido antisentido y un plásmido capaces de expresar un siRNA, un micro RNA o un oligonucleótido antisentido, y donde el siRNA, micro RNA o RNA antisentido comprenden un polinucleótido que específicamente se une a un polinucleótido que codifica el polipéptido o un complemento del mismo.
En otra modalidad relacionada, la presente invención incluye un método para tratar una enfermedad o trastorno caracterizados por la subexpresión de un polipéptido en un sujeto, que comprende proporcionar al sujeto la composición farmacéutica de la presente invención, donde el agente terapéutico es un plásmido que codifica el polipéptido o un fragmento o variante funcional del mismo.
En una modalidad adicional, la presente invención incluye un método para inducir una respuesta inmunológica en un sujeto que comprende proporcionarle al sujeto una composición farmacéutica de la presente invención donde el agente terapéutico es un oligonucleótido inmunoestimulador . En modalidades particulares, se proporciona al paciente la composición farmacéutica en combinación con una vacuna o antigeno .
En una modalidad relacionada, la presente invención incluye una vacuna que comprende la partícula lipídica de la presente invención y un antigeno asociado con una enfermedad o patógeno. En una modalidad, la partícula lipídica comprende un ácido nucleico inmunoestimulador o un oligonucleótido En una modalidad particular, el antígeno es un antígeno tumoral. En aún otra modalidad, el antígeno es un antígeno viral, un antígeno bacteriano o un antígeno parasitario .
La presente invención además incluye métodos para preparar las partículas lipídicas y las composiciones farmacéuticas de la presente invención así como equipos útiles en la preparación de estas partículas lipídicas y composiciones farmacéuticas.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para evaluar una composición que incluye un agente, por ej . , un agente terapéutico o un agente de diagnóstico y un lipido de la presente invención.
Breve desrcipción de las figuras Figura 1. Representación esquemática de un lipido ópticamente puro con ligandos conjugados objetivo.
Figura 2. Representación esquemática de elementos de los lipidos de la presente invención.
Figura 3. Muestra una tabla que representa los valores de EC50 y pKa de ejemplos de lipidos probados usando un método descrito en los Ejemplos.
Descripción detallada de la inversión La presente invención se basa, en parte, en el descubrimiento de lipidos catiónicos que proporcionan ventajas al usarse en partículas lipídicas para la administración in vivo de un agente terapéutico. En particular, tal como se ilustra en los Ejemplos adjuntos, la presente invnción proporciona composiciones de partículas ácido nucleico-lípido que comprenden un lipido catiónico de acuerdo con la presente invención. En algunas modalidades, una composición descrita en la presente proporciona una actividad aumentada del ácido nucleico y/o tolerancia mejorada de las composiciones in vivo, que pueden resultar en un aumento significativo en el índice terapéutico comparado con las composiciones de partículas de lípido-ácido nucleico descritas anteriormente. Adicionalmente, las composiciones y métodos de uso descritas pueden proporcionar la mejoran de la toxicidad observada con algunas partículas terapéuticas ácido nucleico-lípido .
En algunas modalidades, la presente invención proporciona específicamente composiciones mejoradas para la administración de moléculas de siRNA. En la presente se muestra que estas composiciones son efectivas en la regulación por disminución de los niveles de proteínas y/o niveles de mRNA de proteínas objetivo. Además, se muestra que la actividad de estas composiciones mejoradas depende de la presencia de algunos lípidos catiónicos y que la relación molar del lipido catiónico en la formulación puede influir en la actividad.
Las partículas y composiciones lipídicas de la presente invención pueden usarse con .varios fines, incluida la administración de agentes terapéuticos asociados o encapsulados a las células, tanto in vitro como in vivo. Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos para tratar enfermedades o trastornos en un sujeto que lo necesita, al poner en contacto al sujeto con una partícula lipidica de la presente invención asociada con un agente terapéutico adecuado.
Tal como se describe en la presente, las partículas lipídicas de la presente invención son particularmente útiles para la administración de ácidos nucleicos, incluyendo, por ej . , plásmidos y moléculas de siRNA. Por consiguiente, las partículas lipídicas y composiciones de lá presente invención pueden usarse para modular la expresión de genes y proteínas objetivo tanto in vitro como in vivo al poner en contacto células con una partícula lipidica de la presente invención asociada con un ácido nucleico que reduce la expresión del gene objetivo (por ej , un siRNA) o un ácido nucleico que puede usarse para incrementar la expresión de una proteína deseada (por ej . , un plásmido que codifica la proteína deseada) .
A continuación se describen en más detalle varios ejemplos de modalidades de lípidos catiónicos de la presente invención, así como también partículas lipídicas y composiciones que comprenden las mismas y su uso para administrar agentes terapéuticos y modular la expresión de genes y proteínas.
Lípidos La presente invención proporciona lípidos novedosos que poseen algunos elementos de diseño Tal como se muestra en la Figura 2, los rasgos de diseño de los lipidos incluyen al menos uno de los siguientes: un grupo principal con pKa variante, una monoamina, di y triamina 1°, 2° y 3° catiónica, oligoamina/poliamina, grupos principales de pKa bajos imidazoles y colas de piridina, guanidinio, aniónicas, zwitteriónicas e hidrofóbicas pueden incluir cadenas simétricas y/o asimétricas, cadena larga y más corta, saturada e insaturada; la cadena principal incluye glicérido de cadena principal y otros análogos aciclicos, enlaces cíclicos, espiro, bicíclicos y policíclicos con éteres, ásteres, fosfato y análogos, sulfonato y análogos, disulfuros, enlaces sensibles al pH como acétales y cetales, iminas e hidrazonas y oximas.
La presente invención proporciona lipidos que se usan de manera ventajosa en partículas lipídicas de la presente invención para la administración in vivo de agentes terapéuticos a células, incluidos lipidos que poseen la siguiente estrucutra. En un aspecto, el lípido es un compuesto de la fórmula XXXIII XXXIII ' sales ° isómeros de los mismos, donde: Rl y R2 son cada uno independientemente para cada aparición alquilo Ci0-C30 opcionalmente sustituido, alquenilo C10-C30 opcionalmente sustituido, alquinilo C io-C30 opcionalmente sustituido, acilo C 10-C30 opcionalmente sustituido o enlazador-ligando; R3 es H, alquilo C1 -C10 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-Ci0 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-Ci0 opcionalmente sustituido, alquilheterociclo, alquilfosfato, alquilfosforotioato, alquilfosforoditioato, alquilfosfonatos, alquilaminas, hidroxialquilos, ?-aminoalquilos , ?-aminoalquilos- ( sustitutidos ) , ?-fosfoalquilos, ?-tiofosfoalquilos, polietilenglicol opcionalmente sustituido ( PEG, mw 100-40K) , mPEG opcionalmente sustituido (mw 120-40K) , heteroarilo, heterociclo o -enlazador-ligando; y E es C (0)0 o 0C (0) .
En una modalidad, Ri y R2 son cada uno independientemente para cada aparición alquilo C10-C30 opcionalmente sustituido, alcoxi C10-C30 opcionalmente sustituido, alquenilo Cio-C30 opcionalmente sustituido, alqueniloxi C 10-C30 opcionalmente sustituido, alquinilo C10-C30 opcionalmente sustituido, alquiniloxi Ci0-C30 opcionalmente sustituido o acilo C 10-C30 opcionalmente sustituido.
En otra modalidad, R3 es H, alquilo C1-C10 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-C i0 opcionalmente sustituido, alquinilo C2~C10 opcionalmente sustituido, alquilheterociclo opcionalmente sustituido, heterocicloalquilo opcionalmente sustituido, alquilfosfato opcionalmente sustituido, fosfoalquilo opcionalmente sustituido, alquilfosforotioato opcionalmente sustituido, fosforotioalquilo opcionalmente sustituido, alquilfosforoditioato opcionalmente sustituido, fosforoditioalquilo opcionalmente sustituido, alquilfosfonato opcionalmente sustituido, fosfonoalquilo opcionalmente sustituido, amino opcionalmente sustituido, alquilamino opcionalmente sustituido, di (alquil ) amino opcionalmente sustituido, aminoalquilo opcionalmente sustituido, alquilaminoalquilo opcionalmente sustituido, di ( alquil ) aminoalquilo opcionalmente sustituido, hidroxialquilo opcionalmente sustituido, polietilenglicol opcionalmente sustituido (PEG, mw 100-40K) , mPEG opcionalmente sustituido (mw 120-40K) , heteroarilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido o -enlazador-ligando .
En una modalidad, donde el lipido es un compuesto de fórmula XXXIII, siempre que cuando E es C(0)0 y R3 es I , R1 y R2 no son ambos linoleilo.
En una modalidad, el lipido es un compuesto de fórmula XXXIII, donde R3 es H, alquenilo C2-Ci0 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-Ci0 opcionalmente sustituido, alquilheterociclo, alquilfosfato, alquilfosforotioato, alquilfosforoditioato, alquilfosfonatos , alquilaminas, hidroxialquilos , ?-aminoalquilos, ?-aminoalquilos ( sustitutidos ) , ?-fosfoalquilos, ?- tiofosfoalquilos , polietilenglicol opcionalmente sustituido (PEG, mw 100-40K), mPEG opcionalmente sustituido (mw 120-40K) , heteroarilo, heterociclo o enlazador-ligando .
En aun otra modalidad, el lipido es un compuesto de fórmula XXXIII, donde Ri y R2 son cada uno independientemente para cada aparición alquilo ?10-?3? opcionalmente sustituido, alquinilo Cio-C30 opcionalmente sustituido, acilo C10-C30 opcionalmente sustituido o enlazador-ligando; En un aspecto, la invención presenta un lipido de fórmula XXXVIII: XXXVIII, sales o isómeros de los mismos, donde E es C(0)0 o OC(O) ; ¾ y R2 y Rx son cada uno independientemente para cada aparición H, alquilo C1-C10 opcionalmente sustituido, alquilo Cio~C3o opcionalmente sustituido, alquenilo C10-C30 opcionalmente sustituido, alquinilo C10-C30 opcionalmente sustituido, acilo Cio-C30 opcionalmente sustituido o enlazador-ligando, siempre que al menos uno de Rj., R2 y Rx no sea H; R3 es H, alquilo C1-C 10 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-C10 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-Cio opcionalmente sustituido, alquilheterociclo, alquilfosfato, alquilfosforotioato, alquilfosforoditioato, alquilfosfonatos, alquilaminas , hidroxialquilos , ?-aminoalquilos , ?-aminoalquilos ( sustitutidos ) , ?-fosfoalquilos, ?-tiofosfoalquilos, polietilenglicol opcionalmente sustituido (PEG, mw 100-40K) , mPEG opcionalmente sustituido (m 120-40K) , heteroarilo, heterociclo o enlazador-ligando; n es 0, 1, 2 o 3.
En una modalidad, donde el lipido es un compuesto de fórmula XXXVIII, siempre que cuando E es C(0)0, R3 es , y uno de Ri, R2 o Rx es H, entonces los restantes Ri( R2, o Rx no son ambos linoleilo.
En algunas modalidades, cada uno de Ri y R2 es independientemente para cada aparición alquilo Ci0-C3o opcionalmente sustituido, alquenilo Cio-C30 opcionalmente sustituido, alquinilo C10-C30 opcionalmente sustituido, acilo Cio~C3o opcionalmente sustituido o enlazador-ligando.
En algunas modalidades, Rx es H o alquilo C1-C10 opcionalmente sustituido.
En algunas modalidades, Rx es alquilo C10-C30 opcionalmente sustituido, alquenilo Cio-C30 opcionalmente sustituido, alquinilo C10-C30 opcionalmente sustituido, acilo Cio~C3o opcionalmente sustituido o enlazador-ligando.
En una modalidad, Ri y R2 es cada uno independientemente para cada aparición alquilo Cio-C30 opcionalmente sustituido, alcoxi C10-C30 opcionalmente sustituido, alquenilo C10-C30 opcionalraente sustituido, alqueniloxi C 10-C30 opcionalmente sustituido, alquinilo C 10- C30 opcionalmente sustituido, alquiniloxi C10-C30 opcionalmente sustituido o acilo C10-C30 opcionalmente sustituido o enlazador-ligando .
En una modalidad, R3 es independientemente para cada aparición H, alquilo C1-C10 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-C10 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-C10 opcionalmente sustituido, alquilheterociclo opcionalmente sustituido, heterocicloalquilo opcionalmente sustituido, alquilfosfato opcionalmente sustituido, fosfoalquilo opcionalmente sustituido, alquilfosforotioato opcionalmente sustituido, fosforotioalquilo opcionalmente sustituido, alquilfosforoditioato opcionalmente sustituido, fosforoditioalquilo opcionalmente sustituido, alquilfosfonato opcionalmente sustituido, fosfonoalquilo opcionalmente sustituido, amino opcionalmente sustituido, alquilamino opcionalmente sustituido, di (alquil ) amino opcionalmente sustituido, aminoalquilo opcionalmente sustituido, alquilaminoalquilo opcionalmente sustituido, di (alquil) aminoalquilo opcionalmente sustituido, hidroxialquilo opcionalmente sustituido, polietilenglicol opcionalmente sustituido ( PEG, mw 100-40K) , mPEG opcionalmente sustituido (mw 120-40K) , heteroarilo opcionalmente sustituido, heterociclo opcionalmente sustituido o enlazador-ligando.
En una modalidad, E es -C(0)0- o -0C(0)-.
En una modalidad, Z' es -0-, -S-, -N(Q)-, o alquileno. En algunas circunstancias, R3 es ?-aminoalquilo, ?-aminoalquilo ( sustituido) , ?-fosfoalquilo o ?-tiofosfoalquilo; cada uno de los cuales está opcionalmente sustituido. Ejemplos de grupos ?-aminoalquilo ( sustituido) incluye 2-(dimetilamino) etilo, 3- (diisopropilamino) propilo, o 3- (N-etil-N-isopropilamino) -1-metilpropilo.
Se ha descubierto que los lipidos catiónicos que comprenden cadenas alquilo insaturadas son particularmente útiles para formar partículas de ácido nucleico-lípido con fluidez de membrana aumentada. En una modalidad, al menos uno de Ri o R2 comprende al menos uno, al menos dos o al menos tres sitios de insaturación, por ej . enlace doble o enlace triple .
En una modalidad, únicamente uno de Ri o R2 comprende al menos uno, al menos dos o al menos tres sitios de insaturación .
En una modalidad, ambos Ri y R2 comprenden al menos uno, al menos dos o al menos tres sitios de insaturación.
En una modalidad, Ri y R2 comprenden diferentes números de insaturación, por ej . , uno de Ri y R2 tiene un sitio de insaturación y el otro tiene dos o tres sitios de insaturación.
En una modalidad, ambos Ri y R2 comprenden la misma cantidad de sitios de insaturación .
En una modalidad, Ri y R2 comprenden diferentes tipos de insaturación, por e . , la insaturación en uno de Rj. y R2 es de enlace doble y en el otro la insaturación es de enlace triple .
En una modalidad, ambos Ri y R2 comprenden el mismo tipo de insaturación, por ej . enlace doble o enlace triple.
En una modalidad, al menos uno de Ri o R2 comprende al menos un enlace doble y al menos un enlace triple.
En una modalidad, únicamente uno de Ri o R2 comprende al menos un enlace doble y al menos un enlace triple.
En una modalidad, ambos Ri y R2 comprenden al menos un enlace doble y al menos un enlace triple.
En una modalidad, Ri y R2 son ambos iguales, por ej . ambos Ri y R2 son linoleilo (C18) o Ri y R2 son ambos heptadeca-9-enilo .
En una modalidad, Ri y R2 son diferentes el uno del otro. En una modalidad, al menos uno de Ri y R2 es colesterol. En una modalidad, uno de Rx y R2 es enlazador-ligando .
En una modalidad, uno de Ri y R2 es enlazador-ligando y el ligando es un lipófilo.
En una modalidad, al menos uno de Ri o R2 comprende al menos un grupo CH2 con un o ambos H remplazados por F, por e . CHF o CF2. En una modalidad, ambos Ri o R2 comprenden al menos un grupo CH2 con un o dos H remplazados por F, por e . CHF o CF2.
En una modalidad, únicamente uno de Ri y R2 comprende al menos un grupo CH2 con un o ambos H remplazados por F.
En una modalidad, al menos uno de Ri o R2 termina en CH2F, CHF2 o CF3. En una modalidad, ambos Ri y R2 terminan en CH2F, CHF2 o CF3.
En una modalidad, al menos uno de Ri o R2 es ~(CF2)y-Z"-(CH2)y-CH3, donde cada y es independientemente 1-10 y Z' ' es 0, S o N(Q) .
En una modalidad, ambos Ri y R2 son - (CF2) y-Z"- (CH2) y-CH3, donde cada y es independientemente 1-10 y Z' ' es O, S o (Q) .
En una modalidad, al menos uno de Ri o R2 es -(CH2)y-Z"~ (CF2)y-CF3, donde cada y es independientemente 1-10 y Z' ' es 0, S o N (Q) .
En una modalidad, ambos Ri y R2 son - (CH2) y-Z"- (CF2) y-CF3, donde cada y es independientemente 1-10 y Z' ' es O, S o N(Q).
En una modalidad, al menos uno de Ri o R2 es -(CF2)y-(CF2)y-CF3, donde cada y es independientemente 1-10.
En una modalidad, ambos Ri y R2 son - (CF2) y- (CF2) y-CF3, donde cada y es independientemente 1-10.
En una modalidad, R3 se elige de un grupo que consiste en metilo, etilo, poliamina, - (CH2) h_heteroarilo, ~(CH2)h-N(Q)2, -0-N(Q)2, - (CH2) h-Z' - (CH2) h-heteroarilo, enlazador-ligando, - (CH2) h-heterciclo, y - (CH2) h-Z' ' - (CH2) h-heterociclo, donde cada h es independientemente 0-13 y Z' ' es O, S o N(Q) .
En una modalidad, donde Z es C(R3) , al menos un R3 es ?-aminoalquilo o ? -aminoalquilo (sustituido) .
En una modalidad, donde Z' es 0, S o alquilo, al menos un R3 es ?-aminoalquilo o ? -aminoalquilo (sustituido).
En una modalidad, Q es enlazador-ligando .
En una modalidad, el ligando es péptido fusogénico.
En una modalidad, el lipido es una mezcla racémica.
En una modalidad, el lipido se enriquece en un diastereómero, por e . el lipido tiene al menos 95%, al menos 90%, al menos 80% o al menos 70% de exceso diastereomérico .
En una modalidad, el lipido se enriquece en un enantiómero, por ej . el lipido tiene al menos 95%, al menos 90%, al menos 80% o al menos 70% de exceso enantiomérico .
En una modalidad, el lipido es quiralmente puro, por ej . es un isómero óptico único.
En una modalidad, el lipido se enriquece para un isómero óptico .
Cuando hay un enlace doble presente (por ej . enlace doble carbono-carbono o enlace doble carbono-nitrógeno) , puede haber isomerismo en la configuración acerca del enlace doble (es decir, isomerismo cis/trans o E/Z). Cuando la configuración de un enlace doble se ilustra en una estructura química, se entiende que el isómero correspondiente puede también estar presente. La cantidad de isómero presente puede variar, dependiendo de las estabilidades relativas de los isómeros y la energía requerida para convertir entre los isómeros. Por consiguiente, algunos enlaces dobles están, a efectos prácticos, presentes solamente en una única configuración, mientras que otros (por ej . , cuando las estabilidades relativas son similares y la energía de conversión es baja) pueden estar presentes como una inseparable mezcla equilibrada de configuraciones.
La presente invención comprende la síntesis de lípidos descrita en la presente tanto en forma racémica como ópticamente pura.
En una modalidad, el lípido catiónico se elige del grupo que consiste en lípidos que se muestra en la Tabla 1 a continuación .
Tabla 1: Algunos lípidos catiónicos de la presente invención.
Q es 0 Q es 0 \ Q es 0 Q es 0 \ Q es 0 Q es 0 \ 0 X = S.
X = 0, S, NH, NMe; n = 0-6 Aunque no se muestran todos los diastereómeros para un lipido, un aspecto de la presente invención es proporcionar todos los diastereómeros, y como tal los lípidos quiralmente puros y diastereoméricamente enriquecidos son también parte de la presente invención.
En una modalidad, R3 es enlazador-ligando .
En modalidades particulares, los lipidos de la presente invención son lipidos catiónicos. Tal como se usa en la presente, el término "lipido catiónico" pretende incluir aquellos lipidos que tienen ono o dos ácidos grasos o cadenas de alquilo grasas y un grupo amino principal (incluyendo un grupo alquilamino o dialquilamino) que pueda protonarse para formar un lipido catiónico a pH fisiológico. En algunas modalidades, a un lipido catiónico se lo conoce como "amino lipido" .
Otros lipidos catiónicos incluirían aquellos que tienen grupos de ácidos grasos alternativos u otros grupos dialquilamino, incluyendo aquellos en los que los sustituyentes alquilo son diferentes (por ej . , N-etil-N-metilamino-, N-propil-N-etilamino- y similares) . Para aquellas modalidades donde Ri y R2 son ambos grupos acilo o alquilo de cadena larga, estos pueden ser iguales o diferentes. En general, los lipidos (por ej . , un lipido catiónico) que tiene menos cadenas de acilo saturadas se dimensionan más fácilmente, particularmente cuando los complejos se dimensionan por debajo de 0,3 micrones, a efectos de esterilización del filtro. Son típicos los lipidos catiónicos que contienen ácidos grasos insaturados con longitud de cadena de carbono en el rango de Cío a C20-También se pueden usar otros andamios para separar el grupo amino (por ej . , el grupo amino del lipido catiónico) y la porción de ácido graso o alquilo graso del lipido catiónico. Los andamios adecuados son conocidos por los expertos en la técnica .
En algunas modalidades, los lipidos catiónicos de la presente invención tienen al menos un grupo protonable o desprotonable, para que el lipido se cargue positivamente a un pH a pH fisiológico o por debajo de este (por ej . pH 7.4), y neutro a un segundo pH, preferentemente a pH fisiológico o por encima de este. A tales lipidos también se los conoce como lipidos catiónicos. Se entenderá, por supuesto, que la adición o eliminación de protones como una función de pH es un proceso de equilibrio, y que la referencia a un lipido cargado o neutro se refiere a la naturaleza de las especies predominantes y no requiere que todo el lipido esté presente en la forma cargada o neutra. Los lipidos que tienen más de un grupo protonable o desprotonable o que son z itteriónicos no están excluidos de usarse en la invención.
En algunas modalidades, los lipidos protonables (es decir, lipidos catiónicos) de acuerdo con la invención tienen un pKa del grupo protonable en el rango de alrededor de 4 a alrededor de 11. Típicamente, los lipidos tendrán un pKa de alrededor de 4 a alrededor de 7, por ej, entre alrededor de 5 y 7, tal como entre alrededor de 5.5 y 6.8, al incorporarse en partículas lipidicas. Tales lípidos serán catiónicos en una etapa de formulación de pH más bajo, mientras que las partículas se neutralizarán en la superficie en gran medida (aunque no completamente) a pH fisiológico alrededor de pH 7.4. Uno de los beneficios de un pKa en el rango de alrededor de 4 y 7 es que al menos algún ácido nucleico asociado con la superficie exterior de la partícula perderá su interacción electrostática a pH fisiológico y se eliminará mediante diálisis simple; de esa manera reduciendo en gran medida la susceptibilidad de la partícula a depurarse. Las mediciones de pKa de lípidos dentro de partículas lipidicas pueden llevarse a cabo, por ejemplo, usando la sonda fluorescente de ácido sulfónico 2- (p-toluidino) -6-naftaleno (TNS) , usando métodos descritos en Cullis et al., (1986) Chem Phys Lipids 40, 127-144.
En una modalidad, las formulaciones de la invención están atrapadas por al menos 75%, al menos 80% o al menos 90%.
En una modalidad, las formulaciones de la invención adicionalmente comprenden una apolipoproteína . Tal como se usa en la presente, el término "apolipoproteína" o "lipoproteína" se refiere a apolipoproteínas conocidas por los expertos en la técnica y variantes y fragmentos de las mismas y a agonistas de apolipoproteína, análogos o fragmentos de los mismos descritos a continuación.
Apolipoproteinas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, ApoA-I, ApoA-II, ApoA-IV, ApoA-V y ApoE y formas polimórficas activas, isoformas, variantes y mutantes asi como también fragmentos o formas truncadas de las mismas. En algunas modalidades, la apolipoproteina es una apolipoproteina que contiene tiol . "Apolipoproteina que contiene tiol" se refiere a una apolipoproteina, variante, fragmento o isoforma que contiene al menos un residuo de cisteina. Las apolipoproteinas que contienen tiol más comunes son ApoA-I Milano (ApoA-IM) y ApoA-I Paris (ApoA-IP) que contienen un residuo de cisteina (Jia et al., 2002, Biochem. Biophys. Res. Comm. 297: 206-13; Bielicki and Oda, 2002, Biochemistry 41: 2089-96) . ApoA-II, ApoE2 y ApoE3 también son apolipoproteinas que contienen tiol. ApoE aislado y/o fragmentos activos y análogos de polipéptidos del mismo, incluyendo formas recombinantemente producidas del mismo, se describen en las patentes estadounidenses Nos. 5, 672, 685; 5,525, 472; 5, 473, 039; 5,182, 364; 5,177, 189; 5, 163, 045; 5,116,739; cuyas descripciones se incorporan a la presente a modo de referencia. ApoE3 se describe en eisgraber, et al., "Human E apoprotein heterogeneity: cysteine-arginine interchanges in the amino acid sequence of the apo-E isoforms," J. Biol . Chem. (1981) 256: 9077-9083; y Rail, et al., "Structural basis for receptor binding heterogeneity of apolipoprotein E from type III hyperlipoproteinemic subjects," Proc. Nat. Acad. Sci. (1982) 79: 4696-4700. Véase también GenBank número de acceso K00396.
En algunas modalidades, la apolipoproteina puede estar en su forma madura, en forma de preproapolipoproteina o en forma de proapolipoproteina . Los homo- y heterodímeros (cuando es posible) de ApoA-I pro- y maduras (Duverger et al., 1996, Arterioscler . Thromb. Vasc. Biol. 16 (12) : 1424-29) , ApoA-I Milano (Klon et al., 2000, Biophys. J. 79: (3) 1679-87; Franceschini et al., 1985, J. Biol. Chem. 260: 1632-35), ApoA-I París (Daum et al., 1999, J. Mol. Med. 77:614-22), ApoA-II (Shelness et al., 1985, J. Biol. Chem. 260 ( 14 ) : 8637-46; Shelness et al., 1984, J. Biol. Chem. 259 (15) : 929-35) , ApoA-IV (Duverger et al., 1991, Euro. J. Biochem. 201 (2): 373-83), and ApoE (McLean et al., 1983, J. Biol. Chem. 258 (14) : 8993-9000) también pueden usarse dentro del alcance de la invención.
En algunas modalidades, la apolipoproteina puede ser un fragmento, variante o isoforma de la apolipoproteina. El término "fragmento" se refiere a cualquier apolipoproteina que tiene una secuencia de aminoácidos más corta que la de una apolipopoproteína nativa y cuyo fragmento retiene la actividad de apolipoproteina nativa, incluyendo propiedades de unión a lípidos . Por "variante" se entiende sustituciones o alteraciones en las secuencias de aminoácidos de la apolipoproteina, cuyas sustituciones o alteraciones, por ej . , adiciones y eliminaciones de los residuos de aminoácidos no suprimen la actividad de apolipoproteina nativa, incluyendo las propiedades de unión a lipidos. Por consiguiente, una variante puede comprender una proteína o péptido que tienen una secuencia de aminoácidos sustancialmente idéntica a una apolipoproteina nativa proporcionada en la presente en la que uno o más residuos de aminoácidos se han sustituido de manera conservadora con aminoácidos químicamente similares. Ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de al menos un residuo hidrofóbico tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro. De la misma manera, la presente invención contempla, por ejemplo, la sustitución de al menos un residuo hidrofílico tal como, por ejemplo, entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina y entre glicina y serina (véase patente estadounidense Nos. 6,004,925, 6,037,323 y 6,046,166) . El término "isoforma" se refiere a una proteína que tiene la misma función, mayor o parcial y secuencia similar, idéntica o parcial, y puede o no ser el producto del mismo gene y normalmente específica de tejido (véase Weisgraber 1990, J. Lipid Res. 31 (8) : 1503-11; Hixson and Powers 1991, J. Lipid Res. 32 (9) : 1529-35; Lackner et al., 1985, J. Biol. Chem. 260 (2) : 703-6; Hoeg et al., 1986, J. Biol. Chem. 261 ( 9) : 3911-4/ Gordon et al., 1984, J. Biol. Chem. 259 ( 1 ) : 68-74 ; Powell et al., 1987, Cell 50 ( 6) : 831-40; Aviram et al., 1998, Arterioscler . Throm . Vase. Biol. 18 (10) : 1617-24; Aviram et al., 1998, J. Clin. Invest. 101 (8) : 1581-90; Billecke et al., 2000, Drug Metab. Dispos. 28 (11) : 1335-42; Draganov et al., 2000, J. Biol . Chem. 275 (43) : 33435-42; Steinmetz and Utermann 1985, J. Biol . Chem. 260 (4) :2258-64; Widler et al . , 1980, J. Biol . Chem. 255 (21) : 10464-71; Dyer et al., 1995, J. Lipid Res. 36(1) :80-8; Sacre et al., 2003, FEBS Lett. 540 (1-3 ) : 181-7 ; Weers, et al., 2003, Biophys. Chem. 100 ( 1-3) : 81-92 ; Gong et al., 2002, J. Biol. Chem. 277 (33) : 29919-26; Ohta et al., 1984, J. Biol. Chem. 259 (23) : 14888-93 y patente estadounidense N° 6, 372, 886) .
En algunas modalidades, los métodos y composiciones de la presente invención incluyen el uso de una construcción quimérica de una apolipoproteina . Por ejemplo, una construcción quimérica de una apolipoproteina puede estar comprendida de un dominio de apolipoproteina con alta capacidad de unión a lipidos asociada con un dominio de apolipoproteina que contiene propiedades de protección de reperfusión isquémica. Una construcción quimérica de una apolipoproteina puede ser una construcción que incluye regiones separadas dentro de una apolipoproteina (es decir, construcción homologa) o una construcción quimérica puede ser una construcción que incluye regiones separadas entre diferentes apolipoproteinas (es decir, construcciones heterólogas) . Las composiciones que comprenden una construcción quimérica también pueden incluir segmentos que son variantes de apolipoproteina o segmentos diseñados para tener un carácter especifico (por ej . , propiedad de unión a lipidos, unión a receptores, enzimática, activación de enzimas, antioxidante o reducción-oxidación) (véase eisgraber 1990, J. Lipid Res. 31 (8) : 1503-11; Hixson and Powers 1991, J. Lipid Res. 32 (9) : 1529-35; Lackner et al., 1985, J. Biol. Chem. 260 (2) : 703-6; Hoeg et al, 1986, J. Biol. Chem. 261 (9) : 3911- ; Gordon et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(l) :468-74; Powell et al., 1987, Cell 50 (6) : 831-40; Aviram et al., 1998, Arterioscler . Thromb. Vasc. Biol. 18(10) :1617-24; Aviram et al., 1998, J. Clin. Invest. 101 (8) : 1581-90; Billecke et al., 2000, Drug Metab. Dispos. 28 ( 11 ): 1335-42 ; Draganov et al., 2000, J. Biol. Chem. 275 ( 43 ) : 33435-42 ; Steinmetz and Utermann 1985, J. Biol. Chem. 260 (4 ): 2258-6 ; Widler et al., 1980, J. Biol. Chem. 255 (21 ) : 10464-71 ; Dyer et al., 1995, J. Lipid Res. 36(l):80-8; Sorenson et al., 1999, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 19 (9) : 2214-25; Palgunachari 1996, Arterioscler. Throb. Vasc. Biol. 16 ( 2 ) : 328-38 : Thurberg et al., J. Biol. Chem. 271 ( 11 ): 6062-70 ; Dyer 1991, J. Biol. Chem. 266 (23) : 150009-15; Hill 1998, J. Biol. Chem. 273(47) :30979-84) .
Las apolipoproteinas utilizadas en la invención también incluyen apolipoproteinas recombinantes, sintéticas, semisintéticas o purificadas. Los métodos para obtener apolipoproteinas o equivalentes de las mismas utilizados en la invención son muy conocidos en la técnica. Por ejemplo, las apolipoproteinas pueden separarse del plasma o productos naturales mediante, por ejemplo, centrifugación en gradiente de densidad o cromatografía de inmunoafinidad, o producirse de manera sintética, semisintética o usando técnicas de DNA recombinante conocidas para los expertos en la técnica (véase, por ej . , Mulugeta et al., 1998, J. Chromatogr. 798(1-2) : 83-90; Chung et al., 1980, J. Lipid Res. 21 (3) : 284-91; Cheung et al., 1987, J. Lipid Res. 28 ( 8 ) : 913-29 ; Persson, et al., 1998, J. Chromatogr. 711:97-109; patentes estadounidenses Nos. 5,059,528, 5,834,596, 5,876,968 y 5,721,114; y publicaciones de PCT WO 86/04920 y WO 87/02062).
Las apolipoproteinas utilizadas en la invención adicionalmente incluyen agonistas de apolipoproteína tales como péptidos y análogos de péptidos que imitan la actividad de ApoA-I, ApoA-I Milano (ApoA-IM) , ApoA-I Paris (ApoA-IP) , ApoA-II, ApoA-IV y ApoE . Por ejemplo, la apolipoproteína puede ser cualquiera de las descritas en las patentes estadounidenses Nos. 6,004,925, 6,037,323, 6,046,166 y 5,840,688, cuyos contenidos se incorporan s la presente a modo de referencia en su totalidad.
Los péptidos o análogos de péptidos de agonistas de apolipoproteína se pueden sintetizar o fabricar usando cualquier técnica para síntesis de péptidos conocida en la técnica incluyendo, por ej . , las técnicas descritas en las patentes estadounidenses Nos. 6,004,925, 6,037,323 y 6,046,166. Por ejemplo, los péptidos se pueden preparar usando la técnica de síntesis de fase sólida descrita inicialmente en Merrifield (1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154). Otras técnicas de síntesis de péptidos se pueden encontrar en Bodanszky et al., Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2a Ed., (1976) y otras referencias disponibles para los expertos en la técnica. Un resumen de técnicas de síntesis de polipéptidos se puede encontrar en Stuart and Young, Solid Phase Peptide. Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford, 111., (1984). Los péptidos también pueden sintetizarse mediante métodos de soluciones descritos en The Proteins, Vol. II, 3d Ed., Neurath et. al., Eds . , p. 105-237, Academic Press, Nueva York, N.Y.* (1976). Los grupos protectores apropiados para uso en diferentes síntesis de péptidos se describen en los textos mencionados anteriormente así como también en McOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, Nueva York, N.Y. (1973). Los péptidos de la presente invención también pueden prepararse mediante escisión química o enzimática a partir de porciones más grandes de, por ejemplo, apolipoproteína A-I. En ciertas modalidades, la apolipoproteína puede ser una mezcla de apolipoproteínas . En una modalidad, la apolipoproteina puede ser una mezcla homogénea, es decir, un único tipo de apolipoproteina. En otra modalidad, la apolipoproteina puede ser una mezcla heterogénea de apolipoproteinas, es decir, una mezcla de dos o más apolipoproteinas diferentes. Modalidades de mezclas heterogéneas de apolipoproteinas pueden comprender, por ejemplo, una mezcla de una apolipoproteina de una fuente animal y una apolipoproteina de una fuente semisintética . En algunas modalidades, una mezcla heterogénea puede comprender, por ejemplo, una mezcla de ApoA-I y ApoA-I Milano. En algunas modalidades, una mezcla heterogénea puede comprender, por ejemplo, una mezcla de ApoA-I Milano y ApoA-I París. Las mezclas adecuadas para uso en métodos y composiciones de la invención serán evidentes para el experto en la técnica.
Si la apolipoproteina se obtiene de fuentes naturales, puede obtenerse de una fuente vegetal o animal. Si la apolipoproteina se obtiene de una fuente animal, la apolipoproteina puede ser de cualquier especie. En algunas modalidades, la apolipoproteina puede obtenerse de una fuente animal. En algunas modalidades, la apolipoproteina puede obtenerse de una fuente humana. En modalidades preferidas de la invención, la apolipoproteina proviene de la misma especie igual que el individuo al que se le administra la apolipoproteina .
Partículas lipídicas La presente invención también proporciona partículas lipídicas que comprenden uno o más de los lipidos catiónicos descritos anteriormente. Las partículas lipídicas incluyen, pero no se limitan a, liposomas. Tal como se usa en la presente, un liposoma es una estructura que tiene membranas que contienen lipidos que encierran un interior acuoso. Los liposomas pueden tener una o más membranas lipídicas. La invención contempla tanto liposomas unilaminares , denominados unilamelares y liposomas multilaminares , denominados multilamelares . Al formar complejo con ácidos nucleicos, las partículas lipídicas también pueden ser lipoplejas, las cuales se componen de bicapas lipídicas catiónicas intercaladas entre capas de DNA, tal como se describe, por ej . , en Felgner, Scientific American .
Las partículas lipídicas de la presente invención pueden comprender adicionalmente uno o más lipidos adicionales y/u otros componentes tales como colesterol. Otros lipidos pueden incluirse en las composiciones de liposomas de la presente invención para diversos efectos, tales como para prevenir la oxidación de lipidos o para unir ligandos a la superficie del liposoma. Cualquier cantidad de lipidos puede estar presente en liposomas de la presente invención, incluyendo lipidos antipáticos, neutros, catiónicos y aniónicos. Tales lipidos pueden usarse solos o en combinación. Ejemplos específicos de componentes de lípidos adicionales que pueden estar presentes se describen a continuación .
Los componentes adicionales que pueden estar presentes en una partícula lipídica de la presente invención incluyen componentes estabilizantes bicapa tales como oligómeros de poliamida (véase, por ej . , patente estadounidense N° 6,320,017), péptidos, proteínas, detergentes, derivados de lípidos, tales como PEG acoplado a fosfatidiletanolamina y PEG conjugado a ceramidas (véase, patente estadounidense N° 5, 885, 613) .
En modalidades particulares, las partículas lipídicas incluyen uno o más de un segundo lípido' amino o lípido catiónico, un lípido neutro, un esterol y un lípido que se selecciona para reducir la agregación de partículas lipídicas durante la formación, que pueden resultar de la estabilización estérica de partículas que previene la agregación inducida por la carga durante la formación.
Ejemplos de lípidos que reducen la agregación de partículas durante la formación incluyen lípidos modificados con polietilenglicol (PEG), monosialogangliosido Gml y oligómeros de poliamida ("PAO") tales como (descritos en patente estadounidense. N° 6,320,017) . Otros compuestos con porciones sin carga, hidrofílicos y con barrera estérica, que previenen la agregación durante la formulación, como PEG, Gml o ATTA, también pueden acoplarse a lipidos para uso como en los métodos y composiciones de la invención. Los lipidos ATTA se describen, por ej . , en la patente estadounidense N° 6,320,017 y los conjugados de lipidos PEG se describen, por e . , en las patentes estadounidenses Nos. 5,820,873, 5,534,499 y 5,885,613. Típicamente, la concentración del componente de lipidos seleccionado para reducir la agregación es de alrededor de 1 a 15% (por porcentaje molar de lipidos) . Ejemplos específicos de lipidos modificados con PEG (o conjugados de lípido-polioxietileno) que son útiles en la presente invención pueden tener diversas porciones lipídicas "de anclaje" para asegurar la porción de PEG a la superficie de la vesícula lipídica. Ejemplos de lipidos modificados con PEG adecuados incluyen fosfatidiletanolamina y ácido fosfatídico modificados con PEG, conjugados de PEG-ceramida (por e . r PEG-CerC14 o PEG-CerC20) que se describen en USSN 08/486,214 co-pendiente, incorporada a la presente a modo de referencia, dialquilaminas modificadas con PEG y 1,2-diaciloxipropan-3-aminas modificadas con PEG. Son particularmente preferidos los diacilgliceroles y dialquilgliceroles modificados con PEG.
En modalidades donde una porción estéricamente grande tal como PEG o ATTA se conjuga a un ancla lipídica, la selección del ancla lipídica depende de qué tipo de asociación va a tener el conjugado con la partícula lipídica.
Es bien conocido que mPEG (mw2000)-diastearoilfosfatidiletanolamina (PEG-DSPE) permanecerá asociado con un liposoma hasta que la partícula se quite de circulación, posiblemente en cuestión de días. Otros conjugados, tal como PEG-CerC20 tienen capacidad de resistencia. Sin embargo, el PEG-CerC14 intercambia rápidamente de la formulación tras la exposición al suero, con Tí 2 menor a 60 mins . en algunos ensayos. Tal como se ilustra en la solicitud de patente estadounidense SN 08/486,214, al menos tres características influyen en la tasa de cambio: longitud de la cadena de acilo, saturación de la cadena de acilo y tamaño del grupo principal con barrera esférica. Los compuestos que tienen variaciones adecuadas de estas características pueden ser útiles para la invención. Para algunas aplicaciones terapéuticas puede preferirse que el lípido modificado con PEG desaparezca rápidamente de la partícula de ácido nucleico-lípido in vivo y por consiguiente el lípido modificado con PEG poseerá anclas lipídicas relativamente cortas. En otras aplicaciones terapéuticas puede preferirse que la partícula de ácido nucleico-lípido exhiba una vida de circulación en plasma más larga y por consiguiente el lípido modificado con PEG poseerá anclas lipídicas relativamente más largas.
Cabe destacar que los compuestos que previenen la agregación no necesariamente requieren conjugación lipídica para funcionar adecuadamente. PEG libre o ???? libre en solución pueden ser suficientes para prevenir la agregación. Si las partículas están estables luego de la formulación, el PEG o ???? pueden dializarse antes de la administración a un sujeto.
Los lípidos neutros, al estar presentes en la partícula lipídica, pueden ser cualquiera de una cantidad de especies lipídicas que existen ya sea en forma zwitteriónica neutra o sin carga a pH fisiológico. Tales lípidos incluyen, por ejemplo diacilfos atidilcolina, diacilfosfatidiletanolamina, ceramida, esfingomielina, dihidroesfingomielina, cefalina y cerebrósidos . La selección de lípidos neutros para uso en las partículas descritas en la presente está generalmente guiada tomando en cuenta, por ej . , el tamaño del liposoma y la estabilidad de los liposomas en el torrente sanguíneo. Preferentemente, el componente de lípidos neutros es un lípido que tiene dos grupos acilo (es decir, diacilfosfatidilcolina y diacilfosfatidiletanolamina) . Los lípidos que tienen distintos grupos de cadena acilo de diversas longitudes de cadena y grado de saturación están disponibles o pueden aislarse o sintetizarse mediante técnicas muy conocidas. En un grupo de modalidades, se prefieren los lípidos que contienen ácidos grasos saturados con longitudes de cadena de carbono en el rango de C10 a C2o-En otro grupo de modalidades, se usan los lípidos con ácidos grasos mono o diinsaturados con longitudes de cadena de carbono en el rango de Cío a C2o- Adicionalmente, se pueden usar los lipidos que tienen mezclas de cadenas de ácidos grasos saturados e insaturados. Preferentemente, los lipidos neutros usados en la presente invención son DOPE, DSPC, POPC, DPPC o cualquier fosfatidilcolina relacionada. Los lipidos neutros útiles en la presente invención también pueden componerse de esfingomielina, dihidroesfingomielina o fosfolipidos con otros grupos principales, tales como serina e inositol.
El componente esterol de la mezcla lipidica, al estar presente, puede ser cualquiera de aquellos esteróles convencionalmente usados en materia de preparaciones de liposomas, vesícula lipidica o partícula lipidica. Un esterol preferido es colesterol.
Otros lipidos catiónicos que tienen carga neta positiva de alrededor de pH fisiológico, además de aquellos específicamente descritos anteriormente, también se pueden incluir en partículas lipídicas de la presente invención. Tales lipidos catiónicos incluyen, pero no se limitan a, cloruro de N, N-dioleil-N, N-dimetilamonio ( "DODAC" ) ; cloruro de N- (2, 3-dioleiloxi ) propil-N, -N-trietilamonio ( " DOTMA" ) ; bromuro de N, -diestearil-N, N-dimetilamonio ( " DDAB" ) ; cloruro de N- (2, 3-dioleoiloxi)propil) -N, N, N-trimetilamonio ( "DOTAP" ) ; sal de cloruro de 1, 2-Dioleiloxi-3-trimetilaminopropano ("D0TAP.C1") ; 3D- (N- (?' , N ' -dimetilaminoetano) -carbamoil ) colesterol ("DC-Chol"), trifluoroacetato de N-(l-(2, 3-dioleiloxi)propil) -N-2- (esperminacarboxamido) etil) -N,N-dimetilamonio ("DOSPA"), carboxiespermina de dioctadecilamidoglicilo ("DOGS"), 1 , 2-dileoil-sn-3-fosfoetanolamina ("DOPE"), propano de 1 , 2-dioleoil-3-dimetilamonio ("DODAP") , N, N-dimetil-2 , 3-dioleiloxi ) propilamina ("DODMA") y bromuro de amonio de N-(1, 2-dimiristiloxiprop-3-il) -N, -dimetil-N-hidroxietilo ( "DMRIE" ) . Adicionalmente, se puede usar una cantidad de preparaciones comerciales de lipidos catiónicos tales como, por ej . , LIPOFECTIN (incluyendo DOTMA y DOPE, disponible en GIBCO/BRL) y LI POFECTAMINE (que comprende DOSPA y DOPE, disponible en GIBCO/BRL) . En modalidades particulares, un lipido catiónico es un amino lipido.
Lipidos aniónicos adecuados para uso en partículas lipídicas de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, fosfatidilglicerol , cardiolipina , diacilfosfatidilserina, ácido diacilfosfatídico, fosfatidiletanolamina de N-dodecanoilo, fosfatidiletanolamina de N-succinilo, fosfatidiletanolamina de N-glutarilo, lisilfosfatidilglicerol y otros grupos modificadores de aniones unidos a lipidos neutros.
En numerosas modalidades, los lipidos anfipáticos se incluyen en partículas lipídicas de la presente invención.
Los "lípidos antipáticos " se refieren a cualquier material adecuado, donde la porción hidrofóbica del material lipidico se encamina a la fase hidrofóbica, mientras que la porción hidrofilica se encamina a la fase acuosa. Tales compuestos incluyen, pero no se limitan a, fosfolipidos , aminolipidos y esfingolipidos . Fosfolipidos representativos incluyen esfingomielina, fosfatidilcolina, fos atidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol , ácido fosfatidico, palmitoiloleoil fosfatdilcolina, lisofosfatidilcolina, lisofosfatidiletanolamina, dipalmitoilfosfatidilcolina, dioleoilfosfatidilcolina, distearoilfosfatidilcolina o dilinoleoilfosfatidilcolina . También pueden usarse otros compuestos sin fósforo, tales como esfingolipidos, familias de glicoesfingolipidos, diacilgliceroles y aciloxiácidos . Adicionalmente, tales lipidos anfipáticos pueden mezclarse fácilmente con otros lipidos, tales como triglicéridos y esteróles .
Los lipidos de fusión programables son también adecuados para incluir en las partículas lipídicas de la presente invención. Tales partículas lipídicas tienen poca tendencia a fusionarse con membranas celulares y administrar su carga útil hasta que ocurra un determinado evento de señal. Esto permite que la partícula lipídica se distribuya más uniformemente luego de la inyección en un organismo o sitio de enfermedad antes de que se empiece a fusionar con células.
El evento de señal puede ser, por ejemplo, un cambio en el pH, temperatura, ambiente iónico o tiempo. En el último caso, un componente "oculto" o retardante de fusión, tal como un conjugado ATTA-lipido o un conjugado PEG-lípido, puede simplemente intercambiarse de la membrana de la partícula lipídica con el paso del tiempo. Para cuando la partícula lipídica se distribuye adecuadamente en el cuerpo, esta ha perdido agente oculto suficiente como para ser fusogénico. Con otros eventos de señal, se desea elegir una señal que esté asociada con el sitio de enfermedad o célula objetivo, tal como temperatura aumentada en el sitio de la inflamación. En ciertas modalidades, se desea dirigir las partículas lipídicas de la presente invención usando porciones objetivo que son específicos de un tejido o tipo celular. El direccionamiento de partículas lipídicas usando diversos porciones objetivo, tales como ligandos, receptores de superficie celular, glucoproteínas , vitaminas (por ej . , riboflavina) y anticuerpos monoclonales se ha descrito previamente (véase por ej . , patentes estadounidenses Nos. 4,957,773 y 4,603,044) . Los porciones objetivo pueden comprender toda la proteína o fragmentos de la misma. Los mecanismos objetivo generalmente requieren que los agentes objetivo se posicionen en la superficie de la partícula lipídica de manera tal que el resto objetivo esté disponible para interactuar con la objetivo, por ejemplo, un receptor de superficie celular. Se conocen diversos agentes objetivo y métodos y están disponibles en la técnica, incluyendo aquellos descritos, por e . , en Sapra, P. and Alien, TM, Prog. Lipid Res. 42 (5): 439-62 (2003); y Abra, RM et al., J. Liposome Res. 12:1-3, (2002) .
Se ha propuesto el uso de partículas lipídicas, es decir, liposomas, con un recubrimiento de superficie de cadenas poliméricas hidrofílicas , tales como cadenas polietilenglicol (PEG), para direccionamiento (Alien, et al., Biochi ica et Biophysica Acta 1237: 99-108 (1995); DeFrees, et al., Journal of the American Chemistry Society 118: 6101-6104 (1996); Blume, et al., Biochimica et Biophysica Acta 1149: 180-184 (1993); Klibanov, et al., Journal of Liposome Research 2: 321-334 (1992); patente estadounidense N° 5,013,556; Zalipsky, Bioconjugate Chemistry 4: 296-299 (1993); Zalipsky, FEBS Letters 353: 71-74 (1994); Zalipsky, in Stealth Liposomes Chapter 9 (Lasic and Martin, Eds) CRC Press, Boca Ratón Fl (1995) . En un enfoque, un ligando, tal como un anticuerpo, para dirigir la partícula lipídica se une a un grupo principal polar de lipidos que forman la partícula lipídica. En otro enfoque, el ligando objetivo se une a los extremos distales de las cadenas de PEG formando el recubrimiento polimérico hidrofílico (Klibanov, et al., Journal of Liposome Research 2: 321-334 (1992); Kirpotin et al., FEBS Letters 388: 115-118 (1996)) .
Se pueden usar los métodos estándar para el acoplamiento de los agentes objetivo. Por ejemplo, se pueden usar fosfatidiletanolamina, que puede activarse para la unión de agentes objetivo, o compuestos lipofilicos derivatizados, tales como una bleomicina derivatizada de lipidos. Los liposomas dirigidos a anticuerpos pueden construirse usando, por ejemplo, liposomas que incorporan proteina A (véase, Renneisen, et al., J. Bio. Chem., 265:16337-16342 (1990) y Leonetti, et al., Proc. Nati. Acad. Sci . (USA), 87:2448-2451 (1990) . Otros ejemplos de conjugación de anticuerpos se describen en la patente estadounidense N° 6,027,726, cuyas demostraciones se incorporan a la presente a modo de referencia. Ejemplos de porciones objetivo también pueden incluir otras proteínas, específicas de componentes celulares, incluyendo antígenos asociados a neoplasmas o tumores. Las proteínas usadas como porciones objetivo pueden unirse a los liposomas. a través de enlaces covalentes (véase, Heath, Covalent Attachment of Proteins to Liposomes , 149 Methods in Enzymology 111-119 (Academic Press, Inc. 1987)) . Otros métodos objetivo incluyen el sistema biotina-avidina .
En un ejemplo de modalidad, la partícula lipídica comprende una mezcla de un lípido catiónico de la presente invención, lipidos neutros (distintos de lipidos catiónicos), un esterol (por ej . , colesterol) y un lípido modificado con PEG (por ej . , un PEG-DMG o PEG-DMA) . En algunas modalidades, la mezcla lipidica consiste en o consiste esencialmente en un lipido catiónico de la presente invención, un lipido neutro, colesterol y un lipido modificado con PEG. En modalidades preferidas adicionales, la partícula lipidica consiste en o consiste esencialmente en la mezcla lipidica anterior en relaciones molares de alrededor de 20-70% de amino lipido: 5-45% de lipido neutro : 20-55% de colesterol : 0.5-15% de lipido modificado por PEG.
En una modalidad, la partícula lipidica comprende al menos dos lípidos descritos en la presente. Por ejemplo, se puede usar una mezcla de lípidos catiónicos en una partícula lipidica, de manera que la mezcla comprenda 20-60% del contenido lipídico total molar/en términos molares.
En modalidades particulares, la partícula lipidica consiste en o consiste esencialmente en un lipido catiónico elegido de la Tabla 1, DSPC, Col y ya sea PEG-DMG o PEG-DMA, por e . , en una relación molar de alrededor de 20-60% de lipido catiónico: 5-25% de DSPC :25-55% de Col:0.5-15% de PEG-DMG o PEG-DMA. En modalidades particulares, la relación lipidica molar es aproximadamente 40/10/40/10 (mol% de lipido catiónico/DSPC/Col/PEG-DMG o PEG-DMA) , 35/15/40/10 (mol% de lipido catiónico/DSPC/Col/PEG-DMG o PEG-DMA) o 52/13/30/5 (mol% de lipido catiónico/DSPC/Col/PEG-DMG o PEG-DMA) . En otro grupo de modalidades, el lipido neutro, DSPC, en estas composiciones se reemplaza con POPC, DPPC, DOPE o SM.
Composiciones y formulaciones de partícula lipidica-agente terapéutico La presente invención incluye composiciones que comprenden una partícula lipídica de la presente invención y un agente activo, donde el agente activo se asocia con la partícula lipídica. En modalidades particulares, el agente activo es un agente terapéutico. En modalidades particulares, el agente activo se encapsula dentro de un interior acuoso de la partícula lipídica. En otras modalidades, el agente activo está presente dentro de una o más capas lipídicas de la partícula lipídica. En otras modalidades, el agente activo está unido a la superficie lipídica exterior o interior de una partícula lipídica.
"Completamente encapsulado" tal como se usa en la presente indica que el ácido nucleico en las partículas no se degrada considerablemente luego de la exposición al suero o a un ensayo de nucleasa que sí degradarían considerablemente los ácidos nucleicos libres. En un sistema completamente encapsulado, preferentemente se degrada menos del 25% del ácido nucleico de la partícula en un tratamiento que normalmente degradaría el 100% del ácido nucleico libre, más preferentemente se degrada menos del 10% y aun más preferentemente menos del 5% del ácido nucleico de la partícula. Alternativamente, la encapsulación completa se puede determinar mediante un ensayo Oligreen®. Oligreen® es una cepa de ácido nucleico fluorescente ultra sensible para cuantificar oligonucleótidos y DNA de cadena simple en solución (disponible de Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) . Completamente encapsulado también sugiere que las partículas son estables en suero, lo que significa que no se descomponen rápidamente en sus partes componentes al administrarse in vivo.
Los agentes activos, tal como se usa en la presente, incluyen cualquier molécula o compuesto capaz de ejercer un efecto deseado en una célula, tejido, órgano o sujeto. Tales efectos pueden ser biológicos, fisiológicos o cosméticos, por ejemplo. Los agentes activos pueden ser de cualquier tipo de molécula o compuesto, incluyendo, por ej . , ácidos nucleicos, péptidos y polipéptidos , incluyendo por ej . , anticuerpos, tales como por ej . , anticuerpos policlonales , anticuerpos monoclonales , fragmentos de anticuerpo; anticuerpos humanizados, anticuerpos recombinantes , anticuerpos humanos recombinantes y anticuerpos Primatized™, citocinas, factores de crecimiento, factores apoptóticos, factores inductores de la diferenciación, receptores de la superficie celular y sus ligandos; hormonas y moléculas pequeñas, incluyendo moléculas o compuestos orgánicos pequeños.
En una modalidad, el agente activo es un agente terapéutico o una sal o derivado del mismo. Los derivados de agentes terapéuticos pueden ser terapéuticamente activos en si mismos o pueden ser profármacos, que se vuelven activos al modificarse adicionalmente . Por consiguiente, en una modalidad, un derivado de agente terapéutico retiene un poco o toda la actividad terapéutica en comparación con un agente sin modificar, mientras que en otra modalidad, un derivado de agente terapéutico carece de actividad terapéutica.
En varias modalidades, los agentes terapéuticos incluyen cualquier agente o fármaco terapéuticamente efectivos, tales como compuestos antiinflamatorios, antidepresivos, estimulantes, analgésicos, antibióticos, medicamentos para el control de la natalidad, antipiréticos, vasodilatadores, antiangiogénicos, agentes citovasculares , inhibidores de la transducción de señales, fármacos cardiovasculares, por ej . , agentes antiarritmicos, vasoconstrictores, hormonas y esferoides .
En ciertas modalidades, el agente terapéutico es un fármaco oncológico, que también puede denominarse fármaco antitumoral, fármaco anticáncer, fármaco tumoral, agente antineoplásico o similar. Ejemplos de fármacos oncológicos que se pueden usar de acuerdo con la invención incluye, pero no se limitan a, adriamicina, alkeran, alopurinol, altretamina, amifostina, anastrozol, araC, trióxido arsénico, azatioprina, bexaroteno, biCNU, bleomicina, busulfan intravenoso, busulfan oral, capecitabina (Xeloda) , carboplatina, carmustina, CCNU, celecoxib, clorambucilo, cisplatina, cladribina, ciclosporina A, citarabina, citosina arabinosida, daunorubicina, citoxan, daunorubicina, dexametasona, dexrazoxano, dodetaxel, doxorubicina, doxorubicina, DTIC, epirubicina, estramustina, etopósido fosfato, etopósido y VP-16, exemestano, FK506, fludarabina, fluorouracilo, 5-FU, gemcitabina (Gemzar) , gemtuzumab-ozogamicina, acetato de goserelina, hidrea, hidroxiurea, idarubicina, ifosfamida, mesilato de imatinib, interferón, irinotecan (Camptostar, CPT-111), letrozol, leucovorina, leustatina, leuprolida, levamisol, litretinoína, megastrol, melfalan, L-PAM, mesna, metotrexato, metoxsalén, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, mostaza de nitrógeno, paclitaxel, pamidronato, Pegademasa, pentostatina, porfímero de sodio, prednisona, rituxan, estreptozocina, STI-571, tamoxifeno, taxotere, temozolamida, tenipósido, VM-26, topotecan (Hycamtin), toremifeno, tretinoína, ATRA, valrubicina, velban, vinblastina, vincristina, VP16 y vinorelbina. Otros ejemplos de fármacos oncológicos que se pueden usar de acuerdo con la invención son elipticina y análogos o derivados de elipticina, epotilonas, inhibidores de la cinasa intracelulares y camptotecinas .
Partículas de ácido nucleico-lípido En algunas modalidades, las partículas lipidicas de la presente invención están asociadas con un ácido nucleico, que da como resultado una partícula de ácido nucleico-lípido . En modalidades particulares, el ácido nucleico está completamente encapsulado en la partícula lipídica. Tal como se usa en la presente, el término "ácido nucleico" pretende incluir incluye cualquier oligonucleótido o polinucleótido . Los fragmentos que contienen hasta 50 nucleótidos generalmente se denominan oligonucleótidos , y los fragmentos más largos se denominan polinucleótidos . En modalidades particulares, los oligonucleótidos de la presente invención tienen 15-50 nucleótidos de longitud.
En el contexto de la presente invención, los términos "polinucleótido" y "oligonucleótido" se refieren a un polímero u oligómero de monómeros de nucleótido o nucleósido que consisten en enlaces de bases, azúcares e interazúcares (de cadena principal) de origen natural. Los términos "polinucléotido " y "oligonucleótido" también incluyen polímeros u oligómeros que comprenden monómeros que no son de origen natural o porciones de los mismos que funcionan de forma similar. A menudo tales oligonucleótidos modificados o sustituidos se prefieren a las formas nativas debido a propiedades como, por ejemplo, la absorción celular mejorada y estabilidad aumentada en presencia de nucleasas.
El ácido nucleico que está presente en una partícula de lipido-ácido nucleico de acuerdo con la presente invención incluye cualquier forma conocida de ácido nucleico. Los ácidos nucleicos usados en la presente pueden ser de ca DNA o RNA de filamento simple o DNA o RNA de filamento doble o híbridos de DNA-RNA. Ejemplos de DNA de filamento doble incluyen genes estructurales, genes que incluyen regiones de control y terminación y sistemas de autorreplicación tales como DNA viral o plásmido. Ejemplos de RNA de filamento doble incluyen siRNA y otros reactivos de interferencia por RNA. Ácidos nucleicos de filamento simple incluyen, por ej . , oligonucléotidos antisentido, ribozimas, micro RNA y oligonucléotidos que forman un triple. El ácido nucleico que está presente en una partícula de lípido-ácido nucleico de esta invención puede incluir una o más de las modificaciones de oligonucléotidos descritas a continuación.
Los ácidos nucleicos de la presente invención pueden tener distintas longitudes, que en general dependen de la forma particular del ácido nucleico. Por ejemplo, en modalidades particulares, los plásmidos o genes pueden tener alrededor de 1,000 a 100,000 residuos de nucleótidos de longitud. En modalidades particulares, los oligonucléotidos pueden variar entre alrededor de 10 y 100 nucleótidos de longitud. En varias modalidades relacionadas, los oligonucléotidos, de cadena simple, de cadena doble y de cadena triple pueden variar en longitud alrededor de entre 10 y alrededor de 50 nucleótidos, entre alrededor de 20 y alrededor de 50 nucleótidos, entre alrededor de 15 y alrededor de 30 nucleótidos, entre alrededor de 20 y alrededor de 30 nucleótidos de longitud.
En modalidades particulares, el oligonucleótido (o una cadena del mismo) de la presente invención se híbrida específicamente con o es complementario a un polinucléotido objetivo. "Hibridizable específicamente" y "complementario" son términos que se usan para indicar un nivel suficiente de complementariedad de manera tal que la unión estable y específica ocurre entre la objetivo DNA o RNA y el oligonucleótido. Se cree que un oligonucleótido no necesita ser 100% complementario a su secuencia de ácido nucleico objetivo para ser específicamente hibridizable. Un oligonucleótido es hibridizable específicamente cuando la unión del oligonucleótido con la objetivo interfiere con el normal funcionamiento de la molécula objetivo causando una pérdida de utilidad o expresión del mismo y existe un nivel suficiente de complementariedad para evitar la unión no específica del oligonucleótido a secuencias no objetivo en condiciones donde se desea la unión específica, esto es, en condiciones fisiológicas en el caso de ensayos in vivo tratamiento terapéutico, o en caso de ensayos in vitro en condiciones donde se conducen los ensayos. Por tanto, en otras modalidades, este oligonucleótido incluye 1, 2 o 3 sustituciones de base, por ej . discrepancias, según se compara con la región de un gene o una secuencia de mRNA que está dirigiendo o a la que se híbrida específicamente. Ácidos nucleicos de interferencia por RNA En modalidades particulares, las partículas de ácido nucleico-lípido de la presente invención se asocian con moléculas de interferencia por RNA (iRNA) . Los métodos de interferencia por RNA usando moléculas de IRNA pueden usarse para alterar la expresión de un gene o un polinucléotido de interés. El RNA pequeño de interferencia (siRNA) reemplazó esencialmente el ODN antisentido y las ribozimas como la próxima generación de fármacos oligonucleótidos dirigidos en desarrollo .
Los siRNA son dúplex RNA normalmente de 16-30 nucleótidos de largo que pueden asociarse con un complejo multiproteína citoplásmico conocido como complejo iRNA de silenciamiento inducido (RISC) . El RISC cargado con siRNA media la degradación de transcripciones de mRNA homologas, por lo tanto, el siRNA puede diseñarse para reducir la expresión proteica con alta especificidad. A diferencia de otras tecnologías antisentido, la función de siRNA a través de un mecanismo natural evolucionó para controlar la expresión génica a través de RNA no codificante. Esta es en general considerada la razón por la cual su actividad es más potente in vitro e in vivo que los ODN antisentido o ribozimas. Una variedad de reactivos de iRNA, incluidos siRNA dirigidos a objetivos clínicamente relevantes, se encuentra actualmente en desarrollo farmacéutico, tal como se describe en por ej . Fougerolles, A. et al., Nature Reviews 6:443-453 (2007).
Mientras que las moléculas de iRNA descritas en primer lugar fueron híbridos de RNA:RNA que comprenden tanto filamentos sentido de RNA y antisentido de RNA, se ha demostrado actualmente que los híbridos de DNA sentido:RNA antisentido, híbridos de RNA sentido: DNA antisentido e híbridos de DNA : DNA son capaces de mediar iRNA (Lamberton, J.S. and Christian, A.T., (2003) Molecular Biotechnology 24:111-119). Por tanto, la invención incluye el uso de moléculas de iRNA que comprenden cualquiera de estos tipos diferentes de moléculas de filamento doble. Además, se entiende que las moléculas de iRNA pueden usarse e introducirse a las células de diversas formas. Por consiguiente, tal como se usa en la presente, las moléculas de iRNA comprenden cualesquiera y todas las moléculas capaces de inducir una respuesta de iRNA en las células, que incluyen pero no se limitan a oligonucleótidos de filamento doble que comprenden dos filamentos separados, esto es, un filamento sentido y un filamento antisentido, por ej . RNA pequeño de interferencia (siRNA); un oligonucleótido de cadena doble que comprende dos filamentos separados que están unidos entre si mediante un enlace no nucleotidilo; oligonucleótidos que comprenden un bucle tipo horquilla de secuencias complementarias, que forma una región de filamento doble, por ej . moléculas de shiRNA y vectores de expresión que expresan uno o más polinucleótidos capaces de formar un polinucleótido de filamento doble solo o en combinación con otro polinucleótido .
Un "compuesto de siRNA de filamento simple" tal como se usa en la presente, es un compuesto de siRNA formado por una única molécula. Puede incluir una región doble formada por apareamiento en filamento, por ej., puede ser o incluir una estructura tipo horquilla o faja. Los compuestos de siRNA de cadena simple pueden ser antisentido con respecto a la molécula objetivo.
Un compuesto de siRNA de cadena simple puede ser suficientemente largo como para entrar en el RISC y participar en la escisión mediada por RISC de un mRNA objetivo. Un compuesto de siRNA de filamento simple es de al menos 14 y en otras modalidades al menos 15, 20, 25, 29, 35, 40 o 50 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, es menor a 200, 100 o 60 nucleótidos de longitud.
Los compuestos de siRNA de tipo horquilla tendrán una región doble igual a o de al menos 17, 18, 19, 29, 21, 22, 23, 24 o 25 pares de nucleótidos. La región doble será igual a o menor a 200, 100 o 50 de longitud. En algunas modalidades, los rangos para la región doble son 15-30, 17 a 23, 19 a 23 y 19 a 21 pares de nucleótidos de longitud. La horquilla puede tener excedentes de filamento simple o una región impar terminal. En algunas modalidades, el excedente tiene 2-3 nucleótidos de longitud. En algunas modalidades, el excedente se encuentra en el lado sentido de la horquilla y en algunas modalidades en el lado antisentido de la horquilla .
Un "compuesto de siRNA de filamento doble" tal como se usa en la presente, es un compuesto de siRNA que incluye más de una, en algunos casos dos, filamentos donde la hibridación intercadena puede formar una región de estructura doble.
El filamento antisentido de un compuesto de siRNA de cadena doble puede ser igual a o de al menos 14, 15, 16 17, 18, 19, 25, 29, 40 o 60 nucleótidos de longitud. Puede ser igual a o menor a 200, 100 o 50 nucleótidos de longitud. Los rangos pueden ser 17 a 25, 19' a 23 y 19 a 21 nucleótidos de longitud. Tal como se usa en la presente, el término "filamento antisentido" significa que el filamento de un compuesto de siRNA es suficientemente complementaria a la molécula objetivo, por e . un RNA objetivo.
El filamento sentido de un compuesto de siRNA de filamento' doble puede ser igual a o de al menos 14, 15, 16, 17, 18, 19, 25, 29, 40 o 60 nucleótidos de longitud. Puede ser igual a o menor a 200, 100 o 50 nucleotidos de longitud. Los rangos pueden ser 17 a 25, 19 a 23 y 19 a 21 nucleotidos de longitud.
La porción de filamento doble de un compuesto de siRNA de filamento doble puede ser igual a o de al menos 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 29, 40 o 60 pares de nucleotidos de longitud. Puede ser igual a o menor a 200, 100 o 50 pares de nucleotidos de longitud. Los rangos pueden ser 15-30, 17 a 23, 19 a 23 y 19 a 21 pares de nucleotidos de longitud.
En muchas modalidades, el compuesto de siRNA es suficientemente largo como para ser escindido por una molécula endógena, por ej . , mediante Dicer, para producir compuestos de siRNA más pequeños, por ej . , agentes de siRNA. Los filamentos sentido y antisentido pueden elegirse de manera tal que el compuesto de siRNA de filamento doble incluye un filamento simple o región impar en uno o ambos extremos de la molécula. Por tanto, un compuesto de siRNA de filamento doble puede contener cadenas sentido y antisentido, arregladas en pares para contener un excedente, por ej., uno o dos excedentes 5' o 3' o un excedente 3' de 1 3 nucleotidos. Los excedentes pueden resultar de que un filamento sea más largo que el otro, o de que dos filamentos del mismo largo estén escalonados. Algunas modalidades tendrán al menos un excedente 3' . En una modalidad, ambos extremos de una molécula de siRNA tendrán un excedente 3'. En algunas modalidades, el excedente son 2 nucleótidos.
En algunas modalidades, la longitud de la región doble es de entre 15 y 30 o 18, 19, 20, 21, 22 y 23 nucleótidos de longitud, por ej . , en el rango del compuesto de ssiRNA discutido anteriormente. Los compuestos de ssiRNA pueden parecerse en longitud y estructura a los productos procesados de Dicer natural a partir de los dsiRNA largos. También se incluyen las modalidades donde las dos cadenas del compuesto de ssiRNA se enlazan, por ej., se enlazan covalentemente . Las horquillas u otras estructuras de filamento simple que proporcionan la región de filamento doble requerida y un excedente 3 ' también se encuentran comprendidas en la invención .
Los compuestos de siRNA descritos en la presente, incluidos los compuestos de siRNA de filamento doble y los compuestos de siRNA de filamento simple pueden mediar el silenciamiento de un RNA objetivo, por ej., mRNA, por ej., una transcripción de un gene que codifica una proteina. Por comodidad, tal mRNA también se lo conoce en la presente como mRNA a ser silenciado. Tal gene también se denomina gene objetivo. En general, el RNA a ser silenciado es un gene endógeno o un gene patógeno. Además, se pueden direccionar los RNA que no son mRNA, por ej., los tRNA y los RNA virales. Tal como se usa en la presente, la frase "media iRNA" se refiere a la capacidad de silenciar un RNA objetivo de una forma de secuencia de específica. Sin pretender limitarse a la teoría, se cree que el silenciamiento usa mecanismos o procesos de iRNA y un RNA guía, por ej . , un compuesto de ssiRNA de 21 a 23 nucleótidos.
En una modalidad, el compuesto de siRNA es "suficientemente complementario" de un RNA objetivo, por ej., un mRNA objetivo, de manera tal que el compuesto de siRNA silencia la producción de una pro'teína codificada por el mRNA objetivo. En otra modalidad, el compuesto de siRNA es "exactamente complementario" de un RNA objetivo, por ej., el híbrido del compuesto de RNA objetivo y de siRNA, por ejemplo para formar un híbrido formado exclusivamente de pares de base Watson-Crick en la región de complementariedad exacta. Un RNA objetivo "suficientemente complementario" puede incluir una región interna (por ej . , de al menos 10 nucleótidos) que es exactamente complementaria al RNA objetivo. Además, en algunas modalidades, el compuesto de siRNA discrimina específicamente una diferencia de un solo nucleótido. En este caso, el compuesto de siRNA únicamente media iRNA si la complementariedad exacta se encuentra en la región (por ej., dentro de 7 nucleótidos de) la diferencia de un solo nucleótido.
MicroRNA Los micro RNA (miRNA) son una clase altamente conservada de moléculas pequeñas de RNA que se transcriben del DNA en los genomas de plantas y animales pero no se traducen en proteínas . Los miRNA procesados son moléculas de RNA de cadena simple, que tienen --17-25 nucleótido (nt) que se incorporan al complejo de silenciamiento inducido por RNA (RISC) y se han identificado como reguladores clave del desarroll , proliferación, apoptosis y diferenciación celular. Se creen que estas cumplen un rol en la regulación de la expresión génica mediante la unión a la región no traducida 3' de mRNA especificas. El RISC media la regulación por disminución de la expresión génica a través de la inhibición traduccional, la escisión de la transcripción o ambas. El RISC también se ve involucrado en el silenciamiento transcripcional en el núcleo de un amplio rango de eucariotas .
La cantidad de secuencias de miRNA identificadas hasta la fecha es numerosa y creciente; se pueden encontrar ejemplos ilustrativos de las mismas, por ejemplo en: "miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature" Griffiths-Jones S, Grocock RJ, van Dongen S, Bateman A, Enright AJ. NAR, 2006, 34, Datábase Issue, D140-D144 "The microRNA Registry" Griffiths-Jones S. NAR, 2004, 32, Datábase Issue, D109-D111; y también en http : //microrna . sanger . ac . uk/sequences/ .
Oligonucleótidos antisentido En una modalidad, un ácido nucleico es un oligonucleótido antisentido dirigido a un polinucleótido objetivo. El término "oligonucleótido antisentido" o simplemente "antisentido" pretende incluir oligonucleótidos que son complementarios a una secuencia de polinucleótidos objetivo/dirigida. Los oligonucleótidos antisentido son cadenas simples de DNA o RNA que son complementarios a una secuencia elegida, por e . un mRNA génico objetivo. Se cree que los oligonucleótidos antisentido inhiben la expresión génica mediante la unión a un mRNA complementario. La unión al mRNA objetivo puede llevar a la inhibición de la expresión génica mediante ya sea prevenir la traducción de filamentos de mRNA complementarios mediante la unión al mismo o llevar a la degradación del mRNA objetivo. El DNA antisentido puede usarse para dirigir un RNA específico, complementario (codificante o no codificante) . Si la unión se lleva a cabo este híbrido de DNA/RNA puede degradarse mediante la enzima RNasa H. En modalidades particulares, los oligonucleótidos antisentido contienen de alrededor de 10 a alrededor de 50 nucleótidos, más preferentemente de alrededor de 15 a alrededor de 30 nucleótidos. El término también comprende oligonucleótidos antisentido que pueden no ser exactamente complementarios al gene objetivo deseado. Por consiguiente, la invención puede utilizarse en casos donde las actividades específicas no objetivo se encuentran con antisentido o donde una secuencia antisentido que contiene una o más incompatibilidades con la secuencia objetivo es la más preferida para un uso particular.
Se ha demostrado que los oligonucleótidos antisentido son inhibidores efectivos y dirigidos de síntesis de proteínas, y, consecuentemente, se pueden usar para inhibir específicamente síntesis de proteínas por un gene dirigido. Se ha demostrado la eficacia de oligonucleótidos antisentido para inhibir la síntesis de proteínas. Por ejemplo, la síntesis de poligalactauronasa y el receptor de acetilcolina muscarina tipo 2 se inhiben mediante oligonucleótidos antisentido dirigidos a sus secuencias de RNA corerspondientes (Patente estadounidense 5.739.119 y Patente estadounidense 5.759.829) . Se han demostrado ejemplos adicionales de la inhibición antisentido con la proteína nuclear ciclina, el gene resistente a múltiples fármacos (MDG1), ICAM-1, selectina E, STK-1, receptor GABAA estriatal y EGF humano (Jaskulski et al., Science. 1988 Jun 10; 240 (4858) : 1544-6; Vasanthakumar and Ahmed, Cáncer Commun. 1989; 1 (4) : 225-32; Peris et al., Brain Res Mol Brain Res. 1998 Jun 15; 57 (2) : 310-20; patente estadounidense 5,801,154; patente estadounidense 5,789,573; patente estadounidense 5,718,709 y patente estadounidense 5,610,288) . Además, también se han descrito las construcciones antisentido que inhiben y se pueden usar para tratar diversas proliferaciones celulares anormales, por ej . cáncer (patente estadounidense 5,747,470; patente estadounidense 5,591,317 y patente estadounidense 5,783,683) .
Los métodos para producir oligonucleótidos antisentido son conocidos en la técnica y se pueden adaptar fácilmente para producir un oligonucleótido antisentido que dirija cualquier secuencia de polinucleótidos . La selección de secuencias de oligonucleótidos antisentido especificas de una secuencia objetivo dada se basa en el análisis de la secuencia objetivo elegida y determinación de la estructura secundaria, Tm, energía de enlace y estabilidad relativa. Los oligonucleótidos antisentido se pueden seleccionar según su incapacidad relativa para formar dímeros, horquillas u otras estructuras secundarias que reducirían o prohibirían uniones específicas al mRNTA objetivo en una célula hospedadora. Las regiones objetivo altamente preferidas del mRNA incluyen aquellas regiones en o próximas a los codones de iniciación de la traducción de AUG y aquellas secuencias que son sustancialmente complementarias a regiones 5' del mRNA. Estos análisis de estructuras secundarias y consideraciones de selección del sitio objetivo se pueden llevar a cabo, por ejemplo, usando la v.4 del software de análisis del cebador OLIGO (Molecular Biology Insights) y/o el software de algoritmo BLASTN 2.0.5 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997, 25 ( 17 ): 3389-402 ) Antagomir Los antagomires son oligonucleótidos similares a RNA que hospedan varias modificaciones para la protección de ribonucleasa y propiedades farmacológicas, tales como absorción tisular y celular mejoradas. Difieren del RNA normal en, por ejemplo, 2 ' -O-metilación completa de azúcar, cadena principal de fosforotioato y, por ejemplo, una porción de colesterol en el extremo 3*. Los antagomir pueden usarse para silenciar eficientemente los miRNA endógenos mediante la formación de dúplex que comprenden el antagomir y el miRNA endógeno, asi previniendo el silenciamiento génico inducido por miRNA. Un ejemplo del silenciamiento del miRNA mediado por antagomir es el silenciamiento de miR-122, descrito en Krutzfeldt et al, Nature, 2005, 438: 685-689, que se incorporan expresamente en la presente a modo de referencia en su totalidad. Los RNA del antagomir se pueden sintetizar usando protocolos estándar de síntesis de oligonucleótidos en fase sólida. Véase Solicitud de Patente estadounidense N° de serie 11/502,158 y 11/657,341 (cuyas descripciones se incorporan en la presente a modo de referencia) .
Un antagomir puede incluir subunidades de monoméro conjugado con ligando y monómeros para la síntesis de oligonucleótidos. Ejemplos de monómeros se describen en la Solicitud estadounidense N° 10/916,185 presentada el 10 de agosto de 2004. Un antagomir puede tener una estructura ZXY, tal como se describe en la Solicitud PCT N° PCT/US2004/07070 presentada el 8 de marzo de 2004. Un antagomir puede formar un complejo con una porción amfifático. Ejemplos de porciones amfifáticos para su uso con agentes oligonucleótidos se describen en la Solicitud PCT N° PCT/US2004/07070, presentada el 8 de marzo de 2004.
Aptámeros Los aptámeros son moléculas de ácido nucleico o de péptidos que se unen a una molécula particular de interés con alta afinidad y especificidad (Tuerk and Gold, Science 249:505 (1990); Ellington and Szostak, Nature 346:818 (1990)) . Los aptámeros de DNA o RNA se han producido exitosamente y se unen a varias entidades diferentes desde proteínas grandes hasta moléculas orgánicas pequeñas. Véase Eaton, Curr. Opin. Chem. Biol. 1:10-16 (1997), Famulok, Curr. Opin. Struct. Biol. 9:324-9(1999), and Hermann and Patel, Science 287:820-5 (2000) . Los aptámeros pueden estar basados en RNA o DNA y pueden incluir un riboswitch. Un riboswitch es parte de una molécula de mRNA que se puede unir directamente a una molécula objetivo pequeña y cuya unión a la objetivo afecta la activididad del gene. Por tanto, un mRNA que contiene un riboswitch está directamente involucrado en la regulación de su propia actividad dependiendo de la presencia o ausencia de su molécula objetivo. En general, los aptámeros están diseñados a través de repetidas rondas de selección in vitro o equivalentemente, SELEX (evolución sistemática de ligandos mediante enriquecimiento exponencial) para unirse a varias objetivos moleculares tales como moléculas pequeñas, proteínas, ácidos nucleicos y hasta células, tejidos y organismos. El aptámero puede prepararse mediante cualquier método conocido incluidos los métodos sintético, recombinante y de purificación y puede usarse solo o en combinación con otros aptámeros específicos para el mismo objetivo. Además, tal como se describe más en detalle en la presente, el término "aptámero" incluye específicamente "aptámeros secundarios" que contienen una secuencia unánime que surge de la comparación de dos o más aptámeros conocidos con un objetivo dado.
Ribozimas De acuerdo con otra modalidad de la invención, las partículas de ácido nucleico-lípido están asociadas con ribozimas. Las ribozimas son complejos de moléculas de RNA que tienen dominios catalíticos específicos que poseen actividad endonucleasa (Kim and Cech, Proc Nati Acad Sci U S A. 1987 Dec;8 (24) :8788-92; Forster and Symons, Cell. 1987 Apr 24; 49 (2) : 211-20) . Por ejemplo, una gran cantidad de ribozimas aceleran las reacciones de transferencia de fosfoéster con un alto grado de especificidad, por lo general escindiendo solo uno de los varios fosfoésteres en un sustrato oligonucleótido (Cech et al., Cell. 1981 Dec;27(3 Pt 2) :487-9ß; ichel and Westhof, J Mol Biol. 1990 Dec 5; 216 (3) : 585-610; Reinhold-Hurek and Shub, Nature . 1992 May 1 ; 357 ( 6374 ) : 173-6 ) . La especificidad se ha atribuido al requerimiento de que el sustrato se una a través de interacciones especificas de apareamiento de bases con la secuencia guia interna ("IGS") de la ribozima previo a la reacción química.
Hoy en día se conocen al menos seis variedades básicas de RNA enzimáticos de origen natural. Cada una puede catalizar la hidrólisis de uniones de fosfodiéster de RNA in trans (y por tanto puede escindir otras moléculas de RNA) en condiciones fisiológicas. En general, los ácidos nucleicos enzimáticos actúan primero uniéndose a un RNA objetivo. Dicha unión ocurre a través de la porción de unión objetivo de un ácido nucleico enzimático que se mantiene muy próximo a una porción enzimática de la molécula que actúa para escindir el RNA objetivo. Por tanto, el ácido nucleico enzimático primero reconoce y luego se une al RNA objetivo a través de los pares de bases complementarios y una vez unido al sitio correcto actúa enzimáticamente para cortar el RNA objetivo. La escisión estratégica de tal RNA objetivo destruirá su capacidad de dirigir la síntesis de una proteína codificada. Luego de que un ácido nucleico enzimático se unió y escindió su RNA objetivo, se libera del RNA para buscar otro objetivo y puede repetidamente unirse y escindir nuevos objetivos.
La molécula de ácido nucleico enzimático puede formarse en un motivo de cabeza de martillo, horquilla, un virus de hepatitis o intrón del grupo I o RNA RNasaP (asociado con una secuencia guía de RNA) o Neurospora VSRNA, por ejemplo. Se describen ejemplos específicos de motivos de cabeza de martillo en Rossi et al. Nucleic Acids Res. 1992 Sep 11; 20 (17 ) : 4559-65. Se describen ejemplos de motivos de horquilla en Hampel et al. (Solicitud de patente europea publicada N° EP 0360257), Hampel and Tritz, Biochemistry 1989 Jun 13;28 (12) : 929-33; Hampel et al., Nucleic Acids Res. 25 de enero de 1990; 18 (2) : 299-304 y Patente estadounidense 5,631,359. Un ejemplo del motivo del virus de la hepatitis se describe en Perrotta and Been, Biochemistry. 1992 Dic 1;31 (47) : 11843-52; un ejemplo del motivo RNasaP se describe en Guerrier-Takada et al., Cell. 1983 Dec;35(3 Pt 2):849-57; motivos de ribozima de RNA Neurospora VS se describen en Collins (Saville and Collins, Cell. 1990 May 18 ; 61 ( ) : 685-96; Saville and Collins, Proc Nati Acad Sci U S A. 1991 Oct 1;88 (19) :8826-30; Collins and Olive, Biochemistry. 1993 Mar 23; 32 (11) : 2795-9) ; y un ejemplo del intrón del Grupo I se describe en la Patente estadounidense 4,987,071.
Características importantes de moléculas de ácido nucleico enzimático usadas de acuerdo con la invención son que poseen un sitio de unión al sustrato específico que es complementario a una o más regiones de DNA o RNA de gene objetivo y que poseen secuencias de nucleótido dentro o alrededor del sitio de unión al sustrato que imparten una actividad de escisión de RNA a la molécula. Por tanto, las construcciones de ribozima no deben limitarse a motivos específicos mencionados en la presente.
Los métodos para producir una ribozima dirigida a cualquier secuencia de polinucleótidos son conocidos en la técnica. Las ribozimas pueden diseñarse según se describe en la Solicitud de patente internacional publicada N° WO 93/23569 y en la Solicitud de patente internacional publicada N° WO 94/02595, cada una específicamente incorporada en la presente a modo de referencia y sintetizadas para ser probadas in vitro e in vivo, tal como se describe en la presente .
La actividad de la ribozima se puede optimizar alterando la longitud de los grupos de unión a ribozima o sintetizando químicamente las ribozimas con modificaciones que previenen su degradación mediante ribonucleasas séricas (véase, por ej . , la Solicitud de patente internacional publicada N° WO 92/07065; Solicitud de patente internacional publicada N° WO 93/15187; Solicitud de patente internacional publicada N° WO 91/03162; Solicitud europea de patente internacional publicada N° 92110298.4; Patente estadounidense 5,334,711; y Solicitud, de patente internacional publicada N° O 94/13688, que describen varias modificaciones químicas que pueden realizarse a los porciones de azúcar de las moléculas de RNA enzimáticas) , modificaciones que mejoran su eficacia en las células y la eliminación de bases de estirpe II para acortar los tiempos de síntesis de RNA acortados y reducir los requisitos químicos.
Oligonucleótidos inmunoestimuladores Los ácidos nucleicos asociados con partículas lipídicas de la presente invención pueden ser inmunoestimuladores incluidos oligonucleótidos inmunoestimuladores (ISS: de cadena simple o doble) capaces de inducir una respuesta inmunológica al administrarse a un sujeto que puede ser un mamífero u otro paciente. Los ISS incluyen, por ej . , algunas palíndromas que conducen a estructuras secundarias tipo horquilla (véase Yamamoto S., et al. (1992) J. Immunol. 148: 4072-4076) , o motivos CpG, así como otros rasgos conocidos de ISS (tales como dominios multi-G, véase WO 96/11266) .
La respuesta inmunológica puede ser una respuesta inmunológica innata o adaptativa. El sistema inmunológico se divide en un sistema inmunológico más innato y en un sistema inmunológico adaptativo adquirido de vertebrados, este último se divide además en componentes celulares humorales. En modalidades particulares, la respuesta inmunológica puede ser mucosa .
En modalidades particulares, un ácido nucleico inmunoestimulador solo es inmunoestimulador al administrarse en combinación con una partícula lipídica y no es inmunoestimulador al administrarse en su "forma libre". De acuerdo con la presente invención, dicho oligonucleótido se considera inmunoestimulador.
Los ácidos nucleicos inmunoestimuladores se consideran específicos no de secuencia cuando no se requiere que se unan y reduzcan específicamente la expresión de un polinucleótido objetivo para provocar una respuesta inmunológica. Por tanto, algunos ácidos nucleicos inmunoestimuladores pueden comprender una secuencia que corresponde a una región del gene o mRNA de origen natural pero pueden aun ser considerados ácidos nucleicos inmunoestimuladores específicos no de secuencia.
En una modalidad, el ácido nucleico o el oligonucleótido inmunoestimulador comprenden al menos un dinucleótido CpG. El oligonucleótido o el dinucleótido CpG puede estar no metilado o metilado. En otra modalidad, el ácido nucleico inmunoestimulador comprende al menos un dinucleótido CpG que posee una citocina metilada. En una modalidad, el ácido nucleico comprende un dinucleótido CpG simple donde la citocina en dicho dinucleótido CpG está metilada. En una modalidad especifica, el ácido nucleico comprende la secuencia 5' TAACGTTGAGGGGCAT 3'. En una modalidad alternativa, el ácido nucleico comprende al menos dos dinucleótidos CpG donde al menos una citocina en el dinucleótido CpG está metilada. En una modalidad adicional, cada citocina en el dinucleótido CpG presente en la secuencia, está metilada. En otra modalidad, el ácido nucleico comprende una pluralidad de dinucleótidos CpG donde al menos uno de dichos dinucleótido CpG comprende una citocina metilada.
En una modalidad especifica, el ácido nucleico comprende la secuencia 5' TTCCATGACGTTCCTGACGT 3'. En otra modalidad especifica, la secuencia de ácido nucleico comprende la secuencia 5' TCCATGACGTTCCTGACGT 3' donde las dos citocinas indicadas en negrita están metiladas. En modalidades particulares, el ODN se selecciona de un grupo de ODN que consiste en ODN #1, ODN #2, ODN #3, ODN #4, ODN #5, ODN #6, ODN #7, ODN #8 y ODN #9, tal como se muestra a continuación.
Tabla 3. Ejemplos de oligonucleótidos inmunoestimuladores (ODN) "Z" representa un residuo de citocina metilada. ODN14 es un oligonucleótido de 15-mer y ODN1 es el mismo oligonucleótido que posee timidina agregada al extremo 5' formando ODN1 en un 16-mer. No se han detectado diferencias en la actividad biológica entre ODN14 y ODN1 y ambos exhiben una actividad inmunoestimuladora similar (Mui et al., 2001) Secuencias de ácido nucleico especifico adicionales de oligonucleótidos (ODN) adecuados para su uso en composiciones y métodos de la invención se describen en Raney et al., Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 298:1185-1192 (2001). En algunas modalidades, los ODN usados en las composiciones y métodos de la presente invención tienen una cadena principal de fosfodiéster ("PO") o una cadena principal de fosforotioato ("PS") y/o al menos un residuo de citocina metilada en un motivo CpG.
Oligonucleótidos señuelos Dado que los factores de transcripción reconocen sus secuencias de unión relativamente cortas, aun en la ausencia de DNA genómico envolvente, oligonucleótidos cortos que soporten la secuencia unánime de unión para un factor de transcripción especifico, pueden usarse como herramientas para manipular la expresión génica en células vivientes. Esta estrategia involucra la administración intracelular de dichos "oligonucleótidos señuelos" que luego son reconocidos y unidos por el factor objetivo. La ocupación del sitio de unión de DNA del factor de transcripción por parte de los señuelos hacen que el factor de transcripción sea incapaz de unirse posteriormente a las regiones promotoras de los genes objetivos. Los señuelos pueden usarse como agentes terapéuticos, ya sea para inhibir la expresión de genes activados por un factor de transcripción o para regular por incremento genes que se suprimen mediante la unión de un factor de transcripción. Podemos encontrar ejemplos de utilización de oligonucleótidos señuelos en Mann et al., J. Clin. Invest., 2000, 106: 1071-1075, que se incorpora expresamente en la presente a modo de referencia en su totalidad.
Supermir Un supermir se refiere a un oligómero o polímero de ácido ribonucleico (RNA) o de ácido desoxiribonucleico (DNA) o ambos o de filamento simple, doble o parcialmente doble, o modi icaciones de los mismos, que tiene una secuencia de nucleótido que es sustancialmente idéntica a un miRNA y que es antisentido con respecto a su objetivo. Este término incluye oligonucléotidos compuestos por nucleobases, azúcares y enlaces de internucleósido de origen natural (cadena principal) covalente y que contiene una porción que no es de origen natural que funciona de forma similar. Tales oligonucléotidos modificados o sustituidos se prefieren sobre las formas nativas debido a propiedades deseadas como, por ejemplo, la absorción celular mejorada, afinidad mejorada de la objetivo de ácido nucleico y estabilidad aumentada en presencia de nucleasas. En una modalidad preferida, el supermir no incluye un filamento simple y en otra modalidad preferida el supermir no se autohibrida en una medida considerable. Un supermir presentado en la invención puede tener una estructura secundaria pero es sustancialmente de filamento simple en condiciones fisiológicas. Un supermir que tiene sustancialmente un filameto simple es de filamento simple en la medida en que menos de aproximadamente el 50% (por ej., menos de aproximadamente el 40%, 30%, 20%, 10% o 5%) del supermir forme un dúplex consigo mismo. El supermir puede incluir un segmento tipo horquilla, por ej . , una secuencia, preferentemente en el extremo 3' se puede autohibridizar y formar una región doble, por ej . , una región doble de al menos 1, 2, 3 o 4 y preferentemente menos de 8, 7, 6 o n nucleótidos, por e . , 5 nucleótidos. La región doble puede estar conectada mediante un enlace, por ej . , un enlace nucleótido, por ej . , 3, 4, 5 o 6 dT, por ej . , dT modificados. En otra modalidad, el supermir se forma un dúplex con un oligo más corto, por ej . , de 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos de longitud, por ej . , en uno o ambos extremos 3' y 5' o en un extremo y el no terminal o el medio del supermir .
Miméticos de miRNA Los miméticos de miRNA representan una clase de moléculas que pueden usarse para imitar la capacidad de silenciamiento génico de uno o más miRNA. Por lo tanto, el término "mimético de micro RNA" se refiere a RNA no codificantes sintéticos (es decir, el miRNA no se obtiene por purificación de una fuente del miRNA endógeno) que son capaces de ingresar a la senda de iRNA y regular la expresión genética. Los miméticos de miRNA se pueden diseñar como moléculas maduras (ej. de cadena simple) o precursores miméticos (ej . pri- o pre-miRNA) . Los miméticos de miRNA pueden estar compuestos por ácido nucleico (ácidos nucleicos modificados o modificados) incluyendo oligonucleótidos que comprenden, sin limitación, RNA, RNA modificado, DNA, DNA modificado, ácidos nucleicos bloqueados, ácidos nucleicos 2'-0, 4 ' -C-etileno-puenteados ("ENA") o cualquier combinación de los anteriores (incluyendo híbridos de DNA-RNA) . Además, los miméticos de miRNA pueden comprender conjugados que pueden afectar la administración, compartimentación intracelula , estabilidad, especificidad, funcionalidad, uso de cadena y/o potencia. En un diseño, los miméticos de miRNA son moléculas de cadena doble (por ej . , con una región doble de entre aproximadamente 16 y aproximadamente 31 nucleótidos de longitud) y contienen una o más secuencias que tienen identidad con la cadena madura de un miRNA dado. Las modificaciones pueden comprender modificaciones 2' (que incluyen modificaciones 2'-0-metilo y modificaciones 2' F) en una o ambas cadenas de las modificaciones de molécula e internucleótido (por ej . , modificaciones de fosforotioato) que mejoran la estabilidad y/o especificidad del ácido nucleico. Además, los miméticos de miRNA pueden incluir excedentes. Los excedentes pueden consistir en 1-6 nucleótidos en ya sea el extremo 3' o 5' de cualquier cadena y se pueden modificar para mejorar la estabilidad o la funcionalidad. En una modalidad, un mimético de miRNA comprende una región doble de entre 16 y 31 nucleótidos y uno o más de los siguientes patrones de modificación química: la cadena simple contiene modificaciones 2'-0-metilo de nucleótidos 1 y 2 (contando a partir del extremo 5' del oligonucleótido sentido) y todos los Cs y Us; las modificaciones de cadena antisentido pueden comprender una modificación 2' F de todos los Cs y Us, la fosforilación del extremo 5' del oligonucleótido y enlaces de internucleótidos estabilizados asociados con un excedente de 2 nucleótidos 3' Antimir o inhibidor de miRNA Los términos "antimir", "inhibidor de miRNA", "inhibidor de Rmi" o "inhibidor" son sinónimos y se refieren a oligonucleótidos u oligonucleótidos modificados que interfieren con la capacidad de miRNA específicos. En general, los inhibidores son ácidos nucleicos o ácidos nucleicos modificados en la naturaleza que incluyen oligonucleótidos que comprenden RNA, RNA modificado, DNA, DNA modificado, ácidos nucleicos bloqueados (LNA) o cualquier combinación de los anteriores. Las modificaciones incluyen modificaciones 2' (que incluyen modificaciones de alquilo 2'-0 y modificaciones 21 F) y modificaciones de internucleótido (por ej . , modificaciones de fosforotioato) que pueden afectar la administración, estabilidad, especificidad, compartimentación intracelular o potencia. Además, los inhibidores de miRNA pueden comprender conjugados que pueden afectar la administración, compartimentación intracelular, estabilidad y/o potencia. Los inhibidores pueden adoptar una variedad de configuraciones que incluyen diseños de cadena simple, de cadena doble (dúplex RNA/RNA o RNA/DNA) y de tipo horquilla, en general, los inhibidores micro RNA comprenden una o más secuencias o porciones de secuencias que son complementarias o parcialmente complementarias con la cadena madura (o cadenas) del miRNA a ser dirigido, además, el inhibidor de miRNA también puede comprender secuencias adicionales ubicadas en las posiciones 5' y 3 ' a la secuencia que son un complemento inverso del miRNA maduro. Las secuencias adicionales pueden ser los complementos inversos de las secuencias que son adyacentes al miRNA maduro en el pri-miRNA a partir del cual proviene el miRNA maduro o las secuencias adicionales pueden ser secuencias arbitrarias (que poseen una mezcla de A, G, C o U) . En algunas modalidades, una o ambas secuencias adicionales son secuencias arbitrarias capaces de formar horquillas. Por tanto, en algunas modalidades, la secuencia que es el complemento inverso del miRNA está flanqueado en el lado 5' y en el lado 3' mediante estructuras tipo horquilla. Los inhibidores micro RNA, cuando tienen filamento doble, pueden incluir incompatibilidades entre nucleótidos en filamentos opuestos. Además, los inhibidores de micro RNA pueden estar unidos a las porciones conjugadas para facilitar la absorción del inhibidor en la célula. Por ejemplo, un inhibidor de micro RNA puede estar unido a colesteril 5- (bis (4-metoxifenil) ( fenil ) metoxi ) -3 hidroxipentilcarbamato) que permite la absorción pasiva de un inhibidor de micro RNA en una célula. Los inhibidores de micro RNA, incluidos inhibidores de mi NA tipo horquilla, se describen en detalle en Vermeulen et al., "Double-Stranded Regions Are Essential Design Components Of Potent Inhibitors of RISC Function, " RNA 13: 723-730(2007) y en WO2007/095387 y WO 2008/036825, que se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad. Una persona experta en la técnica puede seleccionar una secuencia de la base de datos para un miRNA deseado y diseñar un inhibidor útil para los métodos descritos en la presente.
Adaptador Ul El adaptador Ul inhibe los sitios polyA y son oligonucleótidos bifuncionales con un dominio objetivo complementario a un sitio en el exón terminal del gene objetivo y un "dominio Ul" que se une al componente de RNA nuclear más pequeño de Ul de la snRNP del Ul (Goraczniak, et al., 2008, Nature Biotechnology, 27(3), 257-263, que se incorpora expresamente a la presente a modo de referencia en su totalidad) . La snRNP de Ul es un complejo de ribonucleoproteinas que funciona principalmente para dirigir los primeros pasos en la formación del espliceosoma por medio de la unión al limite pre-mRNA exón-intrón (Brown and Simpson, 1998, Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 49:77- 95) . Los nucleótidos 2-11 del extremo 5' del par base de RNAsn de Ul se unen con el 5 ' ss del pre mRNA. En una modalidad, los oligonucleótidos de. la invención son adaptadores Ul. En una modalidad, el adaptador Ul se puede administrar en combinación con al menos otro agente de iRNA.
Modificaciones de oligonucleótidos Los oligonucleótidos no modificados pueden no llegar a ser óptimos en algunas aplicaciones, por ej . , los oligonucleótidos no modificados pueden ser propensos a degradación por medio de, por ej . , nucleasas celulares. Las nucleasas pueden hidrolizar los enlaces de fosfodiéster del ácido nucleico. Sin embargo, las modificaciones químicas de los oligonucleótidos pueden otorgar propiedades mejoradas y, por ej . , pueden suministrar oligonucleótidos más estables a las nucleasas.
Debido a que los oligonucleótidos son polímeros de subunidades o monómeros, muchas de las modificaciones descritas a continuación ocurren en una posición que se repite dentro de un oligonucleótido, por ej . , una modificación de una base, un azúcar, una porción de fosfato o el oxígeno no puente de una porción de fosfato. No es necesario que todas las posiciones en un oligonucleótido dado se modifiquen de forma uniforme y, de hecho, se puede incorporar más de una de las modificaciones antes mencionadas en un solo oligonucleótido o incluso en un solo nucleósido dentro de un oligonucleótido.
En algunos casos la modificación ocurrirá en todas las posiciones sujeto en el oligonucleótido pero en muchos casos, de hecho en la mayoría, no lo hará. A modo de ejemplo, una modificación solo puede ocurrir en una posición del extremo 3' o 5', solo puede ocurrir en la región interna, solo puede ocurrir en una región terminal, por ej . en una posición de un nucleótido terminal o en los últimos 2, 3, 4, 5 o 10 nucleótidos de un oligonucleótido. Una modificación puede ocurrir en una región de cadena doble, en una región de cadena simple o en ambas. Una modificación solo puede ocurrir en la región de filamento doble de un oligonucleótido de filamento doble o solo puede ocurrir en una región de filamento simple de un oligonucleótido de filamento doble. Por ej . , una modificación de fosforotioato en una posición de oxígeno no de puente solo puede ocurrir en uno o los dos extremos, solo puede ocurrir en una región terminal, por ej . en una posición de un nucleótido terminal o en los últimos 2, 3, 4, 5 o 10 nucleótidos de un filamento, o puede ocurrir en regiones de filamento doble y filamento simple, particularmente en los extremos. El extremo o los extremos 5' pueden ser fosforilados .
Una modificación descrita en la presente puede ser la única modificación, o el único tipo de modificación incluida en múltiples nucleótidos, o una modificación puede combinarse con una o más modificaciones distintas descritas en la presente. Las modificaciones descritas en la presente también pueden combinarse en un oligonucleótido, por e . , diferentes nucleótidos de un oligonucleótido tienen diferentes modificaciones descritas en la presente.
En algunas modalidades se prefiere particularmente, por ej . para mejorar la estabilidad, incluir nucleobases particulares en excedentes o incluir nucleótidos modificados o sustitutos de nucleótidos, en excedentes de filamento simple, por e . en un excedente 5' o 3', o en ambas. Por e . se puede desear incluir nucleótidos de purina en excedentes. En algunas modalidades, se modificarán todas o algunas de las bases en un excedente 3' o 5', por e . , con una modificación descrita en la presente. Las modificaciones pueden incluir, por ej . , el uso de modificaciones en el grupo OH 2 ' de azúcar ribosa, por ej . el uso de desoxiribonucleótidos , por ej . desoxitimidina, en lugar de ribonucleótidos y modificaciones en el grupo fosfato, por e . modificaciones al fosfotioato. Los excedentes no necesariamente deben ser homólogos con la secuencia objetivo.
A continuación se describen modificaciones específicas en más detalle.
El grupo fosfato El grupo fosfato es una especie cargada negativamente. La carga se distribuye equitativamente entre los dos átomos de oxigeno sin puente. Sin embargo, el grupo fosfato puede modificarse por medio del reemplazo de uno de los oxígenos por un sustituyente diferente. Un resultado de esta modificación a las estructuras principales de fosfato RNA puede ser la resistencia aumentada del oligoribonucleótido a la desintegración nucleolítica . Por lo tanto, sin pretender limitarse a la teoría, puede ser deseable, en algunas modalidades, introducir alteraciones que den como resultado un enlace sin carga o un enlace con carga con una distribución de carga no simétrica.
Los ejemplos de grupos fosfato modificados incluyen fosforotioato, fosforoselenatos , fosfatos de borano, ésteres de fosfato de borano, fosfonatos de hidrógeno, osforoamidatos , fosfonatos de alquilo o arilo y fosfotriésteres . En ciertas modalidades, uno de los átomos de oxifosfato sin puente en la porción del esqueleto principal de fosfato puede reemplazarse por cualquiera de los siguientes: S, Se, BR3 (R es hidrógeno, alquilo, arilo), C (es decir, un grupo alquilo, un grupo arilo, etc..) , H, NR2 (R es hidrógeno, alquilo, arilo) u OR (R es alquilo o arilo) . El átomo de fósforo en un grupo fosfato no modificado es aquiral. Sin embargo, el reemplazo de uno de los oxígenos no puente por uno de los átomos o grupos de átomos antes mencionados hacen que el átomo de fósforo sea quiral; en otras palabras, un átomo de fósforo en un grupo fosfato modificado de esta forma es un centro estereogénico . El átomo de fósforo estereogénico puede tener una configuración "R" (en la presente, Rp) o configuración "S" (en la presente, Sp) .
Los fosforoditioatos tienen ambos oxígenos sin puente reemplazados por azufre. El centro de fósforo en los fosforoditioatos es aquiral, lo que impide la formación de diastereómeros de oligoribonucleótidos . Por lo tanto, sin pretender limitarse a la teoría, se pueden desear modificaciones a ambos oxígenos no puente que eliminan el centro quiral, por ej . formación de fosforoditioato, ya que no pueden producir mezclas de diastereómeros. Por lo tanto, los oxígenos no puente pueden ser independientemente cualquiera de S, Se, B, C, H, N u OR (R es alquilo o arilo) . El enlace de fosfato también puede modificarse por medio del reemplazo del oxígeno puente (es decir, oxígeno que enlaza el fosfato al nucleósido) por nitrógeno (fosforoamidatos puenteados), azufre ( fosforotioatos puenteados) y carbono (metilenfosfonatos puenteados) . El reemplazo puede ocurrir en cualquiera de los oxígenos de enlace o en los dos oxígenos enlazadores. Cuando el oxígeno puente es el oxígeno 3' de un nucleósido, se prefiere el reemplazo por carbono. Cuando el oxígeno puente es el oxígeno 5' de un nucleósido, se prefiere el reemplazo por nitrógeno.
Reemplazo del grupo fosfato El grupo fosfato se puede reemplazar por conectores que no contienen fósforo. Sin pretender limitarse a la teoría, se cree que debido a que el grupo fosfodiéster cargado es el centro de reacción en la degradación nucleolítica, su reemplazo por miméticos estructurales neutros debería proporcionar una estabilidad de nucleasa mejorada. Nuevamente, sin pretender limitarse a la teoría, se puede desear, en alguna modalidad, introducir alteraciones en las cuales el grupo fosfato cargado se reemplaza por una porción neutra .
Los ejemplos de porciones que pueden reemplazar el grupo fosfato incluyen fosfonato de metilo, hidroxilamino, siloxano, carbonato, carboximetilo, carbamato, amida, tioéter, enlace de óxido de etileno, sulfonato, sulfonamida, tioformacetal, formacetal, oxima, metilenimino, metilenmetilimino, metilenhidrazo, metilendimetilhidrazo y metilenoximetilimino . Los reemplazos preferidos incluyen los grupos metilencarbonilamino y metilenmetilimino.
También se hace referencia a los enlaces de fosfato modificados donde al menos uno de los oxígenos enlazados al fosfato fue reemplazado o el grupo fosfato fue reemplazado por un grupo no fosforoso como "enlace de cadena principal no fosfodiéster" .
Reemplazo de esqueleto principal de ribofosfato También se pueden construir andamios que imitan oligonucleótidos donde el enlace de fosfato y el azúcar ribosa se reemplazan por un nucleósido resistente a la nucleasa o sustitutos de nucleótido. Sin pretender limitarse a la teoría, se cree que la ausencia de un esqueleto principal cargado reiteradas veces reduce la unión a proteínas que reconocen polianiones (por e . nucleasas) . Nuevamente, sin pretender limitarse a la teoría, se puede desear, en alguna modalidad, introducir alteraciones en las cuales las bases están enlazadas por una cadena principal sustituta neutra. Los ejemplos incluyen los sustitutos de nucléosido mofilino, ciclobutilo, pirrolidina y ácido nucleico peptídico (PNA). Un sustituto preferido es un sustituto de PNA.
Modificaciones de azúcar Un RNA modificado puede incluir modificaciones de todos o algunos de los grupos de azúcar del ácido ribonucleico. Por ej., el grupo hidroxilo 2' (OH) se puede modificar o reemplazar por un número de diferentes sustituyentes "oxi" o "desoxi". Sin limitarse a la teoría, se espera una estabilidad mejorada debido a que el hidroxilo ya no puede ser desprotonado para formar un ión 2'-alcóxido. El 2'-alcóxido puede catalizar la degradación por un ataque nucleofilico intramolecular al átomo de fósforo de enlace. Nuevamente, sin pretender limitarse a la teoría, se puede desear, en algunas modalidades, introducir alteraciones en las cuales no sea posible la formación de alcóxido en la posición 2' .
Ejemplos de modificaciones de grupos hidroxilo "oxi"-2' incluyen alcoxi o ariloxi (OR, j.g., R = H, alquilo, cicloalquilo, arilo, arilalquilo, heteroarilo o azúcar); polietilenglicoles (PEG), O (CH2CH20) nCH2CH2OR; ácidos nucleicos "bloqueados" (LNA) donde el 2 ' hidroxilo se conecta, por e ., mediante un puente metileno al 4' carbono del mismo azúcar ribosa; O-AMINA (AMINA = NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclilo, arilamino, diarilamino, heteroarilamino o diheteroarilamino, etilendiamina, poliamino) y aminoalcoxi, 0(CH2)nAMINA, (por e . , AMINA = NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclilo, arilamino, diarilamino, heteroarilamino, o diheteroarilamino, etilendiamina, poliamino) . Cabe destacar que los oligonucleótidos que solo contienen el grupo metoxietilo (MOE) , (OCH2CH2OCH3, un derivado de PEG), muestran estabilidades de nucleasa que se pueden comparar con aquellas modificadas con la fuerte modificación de fosforotioato .
Las modificaciones "desoxi" incluyen hidrógeno (es decir, azúcares desoxiribosa, que son de importancia particular para las porciones excedentes de RNA parcialmente de doble filamento); halo (por ej . , fluoro) , amino (por ej . , NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclilo, arilamino, diarilamino, heteroarilamino, diheteroarilamino o aminoácido); NH (CH2CH2NH ) nCH2CH2-AMINA (AMINA = NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclilo, arilamino, diarilamino, heteroarilamino o diheteroarilamino), -NHC(0)R (R = alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, heteroarilo o azúcar), ciano; mercapto; alquiltio-alquilo; tioalcoxi y alquilo, cicloalquilo, arilo, alquenilo y alquinilo, que pueden estar opcionalmente sustituidos por ej . por una funcionalidad de amino. Los sustituyentes preferidos son 2'-metoxietilo, 2'-OCH3, 2'-0-alilo, 2'-C- alilo y 2'-fluoro.
El grupo de azúcar también puede contener uno o más carbonos que poseen la configuración estereoquímica contraria a la del carbono correspondiente en ribosa. Por lo tanto, un oligonucleótido puede incluir nucleótidos que contienen por ej . arabinosa como el azúcar. El monómero puede tener un enlace alfa en la posición 1' del azúcar, por ej., alfa-nucleósidos. Los oligonucleótidos también pueden incluir azúcares "abásicos" que carecen de una nucleobase en C- . Estos azúcares abásicos también pueden contener otras modificaciones en uno o más de los átomos de azúcar constitutivos. Los oligonucleótidos también pueden contener uno o más azúcares que están en forma L, por e . , L-nucleósidos .
Modificaciones terminales Se pueden modificar los extremos 3' y 5' de un oligonucleótido . Tales modificaciones pueden estar en el extremo 3' , extremo 5' o ambos extremos de la molécula. Pueden incluir la modificación o reemplazo de un fosfato terminal completo o de uno o más de los átomos del grupo fosfato. Por ej . , los extremos 3' y 5' de un oligonucleótido pueden conjugarse a otras entidades moleculares funcionales tales como porciones de marcado, por ej . , fluoróforos (por ej . , pireno, TAMRA, fluoresceina, tintes Cy3 o Cy5) o grupos protectores (basados por e . , en azufre, silicio, boro o éster) . Las entidades moleculares funcionales se pueden unir al azúcar a través de un grupo fosfato y/o un enlace. El átomo terminal del enlace se puede conectar a o reemplazar el átomo de enlace del grupo fosfato o el grupo C-3' o C-5' O, N, S o C del azúcar. Alternativamente, el enlace enlazador se puede conectar a o reemplazar el átomo terminal de un sustituto de nucleótido (por ej . , PNAs) .
Cuando un arreglo enlazador/fosfato-entidad molecular funcional-enlazador/fosfato se interpone entre dos filamentos de un dsRNA, este arreglo puede ser el sustituto de un bucle de RNA horquilla en un agente RNA tipo horquilla.
Las modificaciones terminales útiles para modular la actividad incluyen la modificación del extremo 5' con fosfato o análogos de fosfato. Por e . , en modalidades preferidas, los filamentos no codificantes de dsRNA están modificados en la posición 5' o incluyen un análogo de fosforilo en el extremo 5' principal. Las modificaciones 5 '-fosfato incluyen aquellas que son compatibles con el silenciamiento génico mediado por RISC. Las modificaciones adecuadas incluyen: 5 ' -monofosfato ( (HO) 2(0) P-O-5 ' ) ; 5 '-difosfato ( (HO) 2 (O) P-O-P (HO) (O) -0-51 ) ; 5 ' -trifosfato ( (HO) 2 (O) -0- (HO) (0) -O- P(H0) (0)-0-5'); cubierta de 51 -guanosine ( 7-metilado o no metilado) (7m-G-0-5 ' - (H0) (0) P-0- (H0) (0) P-0-P (H0) (0) -0-5 ' ) ; cubierta de 5'-adenosina (Appp) , y cualquier estructura de cubierta de nucleótido modificada o sin modificar (N-0-5'-(H0) (0) P-0- (H0) (0) P-O-P (H0) (0) -0-5 ' ) ; 5 ' -monotio osfato (fosforotioato; (HO) 2 (S) P-0-5 ' ) ; 5 ' -monoditiofosfato (fosforoditioato; (HO) (HS) (S) -0-5 ') , 5 ' -fosforotiolato ( (H0) 2 (0) P-S-5 ' ) cualquier combinación adicional de monofosfato, difosfato y trifosfatos reemplazados por oxigeno/azufre (por ej. 5 ' -alfa-tiotrifosfato, 5'-gamma-tiotrifosfato, etc.), 5 ' -fosforamidatos ( (H0) 2 (0) P-NH-5 ' , (H0) (NH2) (0) P-0-5 ') , 5 ' -alquilfosfonatos (R=alquil=metil, etil, isopropil, propil, etc., por ej . RP (OH) (0) -0-5 ' -, (OH) 2 (O) P-5 '-CH2-) , 5 ' -alquileterfosfonatos (R=alquileter=metoximetil (MeOCH2-) , etoximetil, etc., por ej . RP(OH) (O) -0-5'-) .
Las modificaciones terminales también pueden ser útiles para monitorear la distribución y, en tales casos, los grupos preferidos a ser agregados incluyen fluoróforos, por ej . , fluoresceina o un tinte Alexa, por 'ej . Alexa 488. Las modificaciones terminales también pueden ser útiles para mejorar la absorción, las modificaciones útiles para esto incluyen colesterol. , Las modificaciones terminales también pueden ser útiles para reticular un agente de RNA a otro resto, las modificaciones útiles para esto incluyen mitomicina C.
Nucleobases Adenina, guanina, citosina y uracilo son las bases más comunes encontradas en el RNA. Estas bases se pueden modificar o reemplazar para proporcionar RNA con propiedades mejoradas. Por ej . , se pueden preparar oligoribonucleótidos resistentes a la nucleasa con estas bases o con nucleobases sintéticas y naturales (por ej . inosina, timina, xantina, hipoxantina, nubularina, isoguanisina o tubercidina) y cualquiera de las modificaciones antes mencionadas. Alternativamente, se pueden utilizar análogos sustituidos o modificados de cualquiera de la bases anteriores, por ej . "bases poco comunes", "bases modificadas", "bases no naturales" y "bases universales" descritas en la presente. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados alquilo de adenina y guanina, 2- propilo y otros derivados alquilo de adenina y guanina, 5- halouracilo y citosina, 5-propinil uracilo y citosina, 6-azo uracilo, citosina y tintina, 5-uracilo (pseudouracilo) , 4- tiouracilo, 5-halouracilo, 5- (2-aminopropil) uracilo, 5-amino alil uracilo, 8-halo, amino, tiol, tioalquilo, hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas , 5-trifluorometilo y otros uracilos y citocinas 5-sustituidas, 7-rnetilguanina, pirimidinas 5-sustituidas, 6-azapirimidinas y purinas N-2, N- 6 y 0-6 sustituidas, incluyendo 2-aminopropiladenina, 5-propiniluracilo y 5-propinilcitosina, dihidrouracilo, 3-deaza-5-azacitosina, 2-aminopurina, 5-alquiluracilo, 7-alquilguanina, 5-alquil citosina, 7-deazaadenina, N6, N6-dimetiladenina, 2 , 6-diaminopurina, 5-amino-alil-uracilo, N3-metiluracilo, 1 , 2 , 4-triazoles sustituidos, 2-piridinona, 5-nitroindol, 3-nitropirrol , 5-metoxiuracilo, ácido uracil-5-oxiacético, 5-metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metil-2-tiouracilo, 5-metoxicarbonilmetil-2-tiouracilo, 5-metilaminometil-2-tiouracilo, 3- (3-amino- 3carboxipropil) uracilo, 3-metilcitosina , 5-metilcitosina, N4-acetil citosins, 2-tiocitosina, N6-metiladenina, N6-isopentiladenina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, N- metilguaninas, o bases O-alquiladas . Las purinas y pirimidinas adicionales incluyen aquellas descritas en la Patente estadounidense N° 3,687,808, las descritas en la Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, páginas 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990 y aquellas descritas por Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613.
Grupos catiónicos Las modificaciones a los oligonucleótidos también pueden incluir la unión de uno o más grupos catiónicos al azúcar, base, y/o el átomo de fósforo de una porción de esqueleto principal de fosfato o fosfato modificado. Un grupo catiónico puede estar unido a cualquier átomo capaz de sustitución en una base natural, rara o universal. Una posición preferida es una que no interfiere con la hibridación, es decir, no interfiere con las interacciones de unión a hidrógeno necesarias para el apareamiento de bases. Un grupo catiónico puede unirse por ej . a través de la posición C2 ' de un azúcar o una posición análoga en un sustituto de azúcar cíclico o acíclico. Los grupos catiónicos pueden incluir por ej . , grupos amino protonados derivados de por ej . , O-AMINA (AMINA = NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclilo, arilamino, diaril amino, heteroaril amino, o diheteroaril amino, etilen diamina, poliamino) ; aminoalcoxi, por ej . , 0 (CH2) nAMINA, (por ej . , AMINA = NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclilo, arilamino, diaril amino, heteroaril amino, o diheteroaril amino, etilen diamino, poliamino); amino (por ej . NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclilo, arilamino, diaril amino, heteroaril amino, diheteroaril amino, o aminoácido) ; o NH (CH2CH2NH)nCH2CH2-AMINA (AMINA = NH2; alquilamino, dialquilamino, heterociclilo, arilamino, diaril amino, heteroaril amino o diheteroaril amino) .
Colocación dentro de un oligonucleótido Algunas modificaciones pueden preferentemente estar incluidas en un oligonucleótido en una ubicación particular, por ej . , en una posición interna de un filamento o en el extremo 5' o 3' de un oligonucleótido. Una ubicación preferida de una modificación de un oligonucleótido puede otorgar propiedades preferidas al agente. Por ejemplo, las ubicaciones preferidas de modificaciones particulares pueden otorgar propiedades óptimas de silenciamiento génico o resistencia aumentada a la actividad de endonucleasa o exonucleasa .
Uno o más nucleótidos de un oligonucleótido puede tener un enlace 2 '-5'. Uno o más nucleótidos de un oligonucleótido puede tener enlaces invertidos, por ej . enlaces 3' -3', 5' -5', 2' -2' o 2' -3' .
Un oligonucleótido de doble filamento puede incluir al menos un dinucleótido 5 ' -uridina-adenina-3' (5'-UA-3') donde la uridina es un nucleótido 2 ' -modificado, o un dinucleótido 5'-uridina-guanina-3' (5'-UG-3') terminal, donde la 5' -uridina es un nucleótido 2 ' -modificado o un dinucleótido 5'-citidina-adenina-3' (5'-CA-3') terminal, donde la 5' -citidina es un nucleótido 2' -modificado o un dinucleótido 5'-uridina-uridina-3' (5'-UU-3') terminal, donde la 5' -uridina es un nucleótido 2 ' -modificado o un dinucleótido 5'-citidina-citidina-3' (5'-CC-3') terminal, donde la 5' -citidina es un nucleótido 2' -modificado, o un dinucleótido 5'-citidina-uridina-3' (5'-CU-3') terminal, donde la 5' -citidina es un nucleótido 2' -modificado, o un dinucleótido 5'-uridina-citidina-3' (5'-UC-3') terminal, donde la 5' -uridina es un nucleótido 2' -modificado . Los oligonucleótidos de doble cadena que incluyen estas modificaciones están particularmente estabilizados contra la actividad de la endonucleasa .
Referencias generales Los oligoribonucleótidos y oligoribonucleósidos utilizados de acuerdo con esta invención pueden sintetizarse con síntesis de fase sólida, véase por ejemplo "Oligonucleotide synthesis, a practical approach", Ed. M. J. Gait, IRL Press, 1984; "Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach", Ed. F. Eckstein, IRL Press, 1991 (especialmente capitulo 1, Modern machine-aided methods of oligodeoxyribonucleotide synthesis, capitulo 2, Oligoribonucleotide synthesis, capitulo 3, 2 ' -0--Methyloligoribonucleotide- s: synthesis and applications, capitulo 4, Phosphorothioate oligonucleotides, capitulo 5, Synthesis of oligonucleotide phosphorodithioates, capitulo 6, Synthesis of oligo-21 -deoxyribonucleoside methylphosphonates, y capitulo 7, Oligodeoxynucleotides containing modified bases. Otros procedimientos sintéticos, reactivos, grupos bloqueantes y condiciones de reacción particularmente útiles se describen en Martin, P., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504; Beaucage, S. L. e Iyer, R. P., Tetrahedron, 1992, 48, 2223-2311 y Beaucage, S. L. e Iyer, R. P., Tetrahedron, 1993, 49, 6123-6194, o referencias mencionadas en los mismos. En la presente se pueden utilizar las modificaciones descritas en los documentos WO 00/44895, WO01/75164, o WO02/44321. La descripción de todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente publicadas mencionadas en la presente se incorporan a la presente a modo de referencia.
Referencias a grupos fosfato La preparación de oligoribonucleótidos de fosfinato se describe en la patente estadounidense N° 5,508,270. La preparación de oligoribonucleótidos de alquil fosfonato se describe en la patente estadounidense N° 4,469,863. La preparación de oligoribonucleótidos de fosforamidita se describe en la patente estadounidense N° 5,256,775 o patente de EUA N° 5,366,878. La preparación de oligoribonucleótidos de fosfotriéster se describe en la patente estadounidense N° 5,023,243. La preparación de oligoribonucleótidos de borano fosfato se describe en las patentes estadounidenses Nos. 6,004,925, 5,130,302 y 5,177,198. La preparación de oligoribonucleótidos de 3 ' -desoxi-3 ' -amino fosforamidato se describe en la patente estadounidense N° 5,476,925. Los oligoribonucleótidos de 3 ' -desoxi-31 -metilenfosfonato se describen en An, H, et al. J. Org. Chem. 2001, 66, 2789-2801. La preparación de nucleótidos de azufre puenteados se describe en Sproat et al. Nucleosides Nucleotides 1988, 7,651 y Crosstick et al. Tetrahedron Lett. 1989, 30, 4693.
Referencias a grupos de azúcar Las modificaciones a las modificaciones 2' se pueden encontrar en Verma, S. et al. Annu. Rev. Biochem. 1998, 67, 99-134 y todas las referencias en el mismo. Las modificaciones especificas a la ribosa se pueden encontrar en las siguientes referencias: 2'-fluoro (Ka asaki et. al., J.
Med. Chem., 1993, 36, 831-841), 21 -MOE (Martin, P. Helv.
Chim. Acta 1996, 79, 1930-1938), "LNA" (Wengel, J. Acc. Chem. Res. 1999, 32, 301-310.
Referencias al reemplazo de los grupos fosfatos Los oligoribonucleósidos unidos a metilenemetilimino, también identificados en la presente como oligoribonucleósidos unidos a MMI, oligoribonucleósidos unidos a metilendimetilhidrazo, también identificados en la presente como oligoribonucleósidos unidos a MDH y oligonucleósidos unidos a metilencarbonilamino, también identificados en la presente como oligoribonucleósidos unidos a amida-3 y oligonucleósidos unidos a metilenaminocarbonilo, también identificados en la presente como oligoribonucleósidos unidos a amida-4 asi como compuestos de estructura principal mixta que tienen, por ejemplo, enlaces alternos de MMI y PO o PS, se pueden preparar tal como se describe en las patentes estadounidenses Nos. 5,378,825, 5,386,023, 5,489,677 y en las solicitudes PCT publicadas PCT/ÜS92/04294 y PCT/US92/04305 (publicadas como documento WO 92/20822 y WO 92/20823, respectivamente) . Los oligoribonucleósidos unidos a formacetal y tioformacetal se pueden preparar tal como se describe en las patentes estadounidenses Nos. 5,264,562 y 5,264,564. Los oligoribonucleósidos unidos a óxido de etileno se pueden preparar tal como se describe en la patente estadounidense N° 5,223,618. Los reemplazos de siloxano se describen en Cormier,J.F. et al. Nucleic Acids Res. 1988, 16, 4583. Los reemplazos de carbonato se describen en Tittensor, J.R. J.
Chem. Soc. C 1971, 1933. Los reemplazos de carboximetilo se describen en Edge, M.D. et al. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 1972, 1991. Los reemplazos de carbamato se describen en Stirchak, E.P Nucleic Acids Res. 1989, 17, 6129.
Referencias al reemplazo del esqueleto principal de fosfato-ribosa Los compuestos sustitutos del azúcar ciclobutilo se pueden preparar tal como se describe en la patente estadounidense N° 5,359,044. El sustituto del azúcar pirrolidina se puede preparar tal como se describe en la patente estadounidense N° 5,519,134. Los sustitutos del azúcar morfolino se pueden preparar tal como se describe en las patentes estadounidenses N° 5,142,047 y 5,235,033 y otras descripciones de patentes relacionadas. Los ácidos nucleicos peptidicos (PNA) son conocidos por si mismos y se pueden preparar de acuerdo con cualquiera de los diversos procedimientos a los que se hace referencia en Peptide Nucleic Acids (PNA): Synthesis, Properties and Potential Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4, 5-23. También se pueden preparar de acuerdo con la patente estadounidense N° 5,539,083.
Referencias a modificaciones terminales Las modificaciones terminales se describen en Manoharan, M. et al. Antisense and Nucleic Acid Drug Development 12, 103-128 (2002) y las referencias en el mismo.
Referencias a nucleobases Las purina nucleósido amiditas N-2 sustituidas se pueden preparar tal como se describe en la patente estadounidense N° 5,459,255. Las purina nucleósido amiditas 3-desaza se pueden preparar tal como se describe en la patente estadounidense N° 5,457,191. Las pirimidina nucleósido amiditas 5 , 6-sustituidas se pueden preparar tal como se describe en la patente estadounidense N° 5,614,617. Las pirimidina nucleósido amiditas 5-propinilo se pueden preparar tal como se describe en la patente estadounidense N° 5,484,908.
Enlazadores El término "enlazador" significa una porción orgánica que conecta dos partes de un compuesto. Los enlaces típicamente comprenden un enlace directo o un átomo tal como oxígeno o azufre, una unidad tal como NR1, C(O), C(0)NH, SO, SO2, S02NH o una cadena de átomos, tal como un alquilo sustituido o insustituido, alquenilo sustituido o insustituido, alquinilo sustituido o insustituido, arilalquilo, arilalquenilo, arilalquinilo, heteroarilalquilo, heteroarilalquenilo, heteroarilalquinilo, heterociclilalquilo, heterociclilalquenilo, heterociclolalquinilo, arilo, heteroarilo, heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo, alquilarilalquilo, alquilarilalquenilo, alquilarilalquinilo, alquenilarilalquilo, alquenilarilalquenilo, alquenilarilalquinilo, alquinilarilalquilo, alquinilarilalquenilo, alquinilarilalquinilo, alquilheteroarilalquilo, alquilheteroarilalquenilo, alquilheteroarilalquinilo, alquenilheteroarilalquilo, alquenilheteroarilalquenilo, alquenilheteroarilalquinilo, alquinilheteroarilalquilo, alquinilheteroarilalquenilo, alquinilheteroarilalquinilo, alquilheterociclilalquilo, alquilheterociclilalquenilo, alquilhererociclilalquinilo, alquenilheterocicli1alquilo, alquenilheterociclilalquenilo, alquenilheterociclilalquinilo, alquinilheterociclilalquilo, alquinilheterociclilalquenilo, alqu i nilheterociclilalquinilo, alquilarilo, alquenilarilo, alquinilarilo, alquilheteroarilo, alquenilheteroarilo, alquinilheteroarilo, donde uno o más metilenos pueden estar interrumpido o terminados por O, S, S(O), S02, N(R1)2, C(O), grupos de unión escindibles, arilo sustituido o insustituido, heteroarilo sustituido o insustituido, heterociclico sustituido o insustituido; donde R1 es hidrógeno, acilo, alifático o alifático sustituido.
En una modalidad, el enlazador es - [ (P-Q-R) q-X- ( P' -Q' -R' ) q' ]q"~T-, donde: P, R, T, P' , R' y T son cada uno, independientemente para cada aparición, ausente, CO, NH, O, S, OC (O) , NHC (O) , CH2, CH2NH, CH20; NHCH (Ra) C (O) , -C (O) -CH (Ra) -NH-, CH=N-0, o heterociclilo; Q y Q' son cada uno, independientemente para cada aparición, ausente, -(CH2)n-, -C (R1) (R2) (CH2) n-, (CH2)nC(R1) (R2) -, -(CH2CH20)mCH2CH2-, o - (CH2CH20) mCH2CH2NH- ; X está ausente o es un grupo de unión escindible; Ra es H o una cadena lateral de aminoácido; R1 y R2 son cada una, independientemente para cada aparición, H, CH3, OH, SH o N(RN)2; RN es, independientemente para cada ocurrencia, H, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo o bencilo; Y <3" son cada uno, independientemente para cada aparición, 0-20 y donde la unidad de repetición puede ser la misma o diferente; n es, independientemente para cada aparición, 1-20; y m es, independientemente para cada aparición, 0-50.
En una modalidad, el enlace comprende al menos un grupo de unión escindible.
En algunas modalidades, el enlace es un enlace ramificado. El punto de ramificación del enlace ramificado puede ser al menos trivalente, pero puede ser un átomo tetravalente, pentavalente, o hexavalente o un grupo que presenta tales múltiples valencias. En algunas modalidades, el punto de ramificación es -N, -N(Q)-C, -O-C, -S-C, -SS-C, - C(0)N(Q)-C, -OC(0)N(Q)-C, -N(Q)C(0)-C, O -N (Q) C (O) O-C; donde Q es independientemente para cada aparición H u alquilo opcionalmente sustituido. En otra modalidad, el punto de ramificación es glicerol o un derivado de glicerol.
Grupos de unión escindibles Un grupo de unión escindible es uno que es lo suficientemente estable fuera de la célula pero que tras el ingreso a una célula objetivo se escinde para liberar las dos partes que el enlace está uniendo. En una modalidad preferida, el grupo de unión escindible se escinde al menos 10 veces o más, preferentemente al menos 100 veces más rápido en la célula objetivo o conforme a una primera condición de referencia (lo que puede, por ej . , seleccionarse para imitar o representar condiciones intracelulares ) que en la sangre de un sujeto o conforme a una segunda condición de referencia (lo que puede, por e . , seleccionarse para imitar o representar condiciones encontradas en la sangre o suero) . Los grupos de unión escindibles son propensos a agentes de escisión, por ej . , pH, potencial de oxidorreducción o la presencia de moléculas de degradación. Generalmente, los agentes de escisión son más prevalentes o se' encuentran en niveles más altos o actividades dentro de las células que en suero o sangre. Los ejemplos de tales agentes de degradación incluyen: agentes de oxidorreducción que se seleccionan para sustratos particulares o que no tienen especificidad de sustrato, incluyendo, por ej . , enzimas oxidativas o de reducción o agentes de reducción tales como mercaptanos, presentes en células, que pueden degradar un grupo de unión escindible de oxidorreducción por reducción; esterasas; endosomas o agentes que pueden crear un ambiente acidico, por ej . , aquellos que dan como resultado un pH de cinco o menos; enzimas que pueden hidrolizar o degradar un grupo de unión escindible ácido actuando como un ácido general, peptidasas (que pueden ser especificas para el sustrato) y fosfatasas. Un grupo de unión escindible tal como un enlace disulfuro puede ser susceptible al pH. El pH del suero humano es de 7,4 mientras que el pH intracelular promedio es un poco menor, ubicado en el rango 7,1-7,3. Las endosomas tienen un pH más ácido, en el rango 5,5-6,0 y los lisosomas tienen un pH aun más ácido de aproximadamente 5,0. Algunos enlaces tendrán un grupo de unión escindible que se escinde a un pH preferido, liberando asi el lipido catiónico del ligando dentro de la célula o dentro del compartimiento deseado de la célula .
Un enlazador puede incluir un grupo de unión escindible que es escindible por una enzima particular. El tipo de grupo de unión escindible incorporado en un enlace puede depender de la célula a ser dirigida. Por ejemplo, los ligandos que se dirigen al hígado se pueden enlazar a los lípidos catiónicos a través de un enlace que incluye un grupo éster. Las células hepáticas son ricas en esterasas y por lo tanto el enlace se escindirá más eficazmente en células hepáticas que en tipos celulares que no son ricos en esterasa. Otros tipos celulares ricos en esterasas incluyen células del pulmón, corteza renal y testículos.
Los enlazadores que contienen enlaces peptídicos se pueden utilizar al direccionar tipos celulares ricos en peptidasas, tales como células hepáticas y sinoviocitos.
En general, para evaluar si un grupo de unión escindible candidato es adecuado se somete a prueba la capacidad de un agente de degradación (o condición) de escindir el grupo de unión candidato. También se desea probar el grupo de unión escindible candidato para determinar la capacidad de resistir la escisión en la sangre o cuando entra en contacto con otro tejido no objetivo. Por lo tanto se puede determinar la propensión relativa a la escisión entre una primera y una segunda condición, donde la primera se selecciona por ser un indicio de escisión en una célula objetivo y la segunda se selecciona por ser un indicio de escisión en otros tejidos o fluidos biológicos, por ej . , sangre o suero. Las evaluaciones se pueden llevar a cabo en sistemas libres de células, en células, en cultivos celulares, en cultivos de órganos o tisulares o en animales enteros. Puede ser útil realizar evaluaciones iniciales en condiciones libres de células o condiciones de cultivo y realizar una confirmación por evaluaciones adicionales en animales enteros. En modalidades preferidas, los compuestos candidatos útiles se escinden al menos 2, 4, 10 o 100 veces más rápido en la célula (o en condiciones in vitro seleccionadas para imitar condiciones intracelulares ) según se compara con sangre o suero (o en condiciones in vitro seleccionadas para imitar condiciones extracelulares ) .
Grupos de unión escindibles por oxido-reducción Una clase de grupos de unión escindibles son grupos de unión escindibles por oxidorreducción que se escinden tras la reducción u oxidación. Un ejemplo de grupo de unión escindible por reducción es un grupo de unión disulfuro (-S-S-) . Para determinar si un grupo de unión escindible candidato es un "grupo de unión escindible por reducción" adecuado, o por ejemplo es adecuado para su uso con una porción iRNA particular o un agente objetivo particular se pueden utilizar los métodos descritos en la presente. Por ejemplo, un candidato se puede evaluar por incubación con ditiotreitol (DTT) u otro agente reductor utilizando reactivos conocidos en la técnica, que imitan la velocidad de escisión que se observaría en una célula, por e . , una célula objetivo. Los candidatos también se pueden evaluar en condiciones que se seleccionan para imitar condiciones de sangre o suero. En una modalidad preferida, los compuestos candidatos se escinden en un 10% como máximo en la sangre. En modalidades preferidas, los compuestos candidatos útiles se degradan al menos 2, 4, 10 o 100 veces más rápido en la célula (o en condiciones in vitro seleccionadas para imitar condiciones intracelulares) según se compara con sangre (o en condiciones in vitro seleccionadas para imitar condiciones extracelulares) . La velocidad de escisión de los compuestos candidatos se puede determinar usando ensayos de cinética enzimática estándar en condiciones elegidas para imitar medios intracelulares y en comparación con condiciones elegidas para imitar medios extracelulares.
Grupos de unión escindióles basados en fosfato Los grupos de unión escindibles basados en fosfato se escinden por agentes que degradan o hidrolizan el grupo fosfato. Un ejemplo de un agente que escinde grupos fosfato en células son enzimas tales como fosfatasas en células. Los ejemplos de grupos de unión basados en fosfato son -0-P (O) (ORk) -O-, -O-P(S) (ORk)-O-, -O-P (S) (SRk) -O-, -S-P (O) (ORk) -O-, -O-P(O) (ORk)-S-, -S-P (O) (ORk) -S-, -O-P (S) (ORk) -S-, -S- P(S) (ORk)-O-, -O-P(O) (Rk)-O-, -O-P ( S ) (Rk) -0- , -S-P (0) (Rk) -0-, -S-P (S) (Rk) -0-, -S-P (0) (Rk) -S-, -0-P(S) ( Rk)-S-. Son modalidades preferidas: -O-P (O) (OH) -O-, -O-P (S) (OH) -O-, -0-P(S) (SH)-0-, -S-P(O) (OH)-O-, -O-P(O) (OH)-S-, -S-P (O) (OH) -S-, -O-P(S) (OH)-S-, -S-P(S) (OH)-O-, -O-P (O) (H) -O-, -O-P (S) (H) -O-, -S-P(O) {.H)-0-, -S-P(S) (H)-0-, -S-P(O) (H)-S-, -O-P (S) (H) -S- . Una modalidad preferida es -O-P (O) (OH) -O- . Estos candidatos se pueden evaluar usando métodos análogos a los descritos anteriormente .
Grupos de unión escindibles ácidos Los grupos de unión escindibles ácidos son grupos de unión que se escinden en condiciones ácidas. En modalidades preferidas los grupos de unión escindibles se escinden en un ambiente ácido con un pH de alrededor de 6,5 o menos (por ej . , alrededor de 6,0, 5,5, 5, 0 o menos) o por agentes tales como enzimas que pueden actuar como un ácido general. En una célula, los orgánulos de pH bajo específicos, tales como endosomas y lisosomas pueden proporcionar un ambiente de escisión a los grupos de unión escindibles ácidos. Los ejemplos de grupos de unión escindibles ácidos incluyen, pero no se limitan a hidrazonas, ésteres y ésteres de aminoácidos. Los grupos escindibles ácidos pueden tener la fórmula general -C=NN-, C(0)0, o -OC(O) . Una modalidad preferida es cuando el carbón unido al oxígeno del éster (el grupo alcoxi) es un grupo arilo, grupo alquilo sustituido, o grupo alquilo terciario tal como dimetil pentilo o t-butilo. Estos candidatos se pueden evaluar usando métodos análogos a los descritos anteriormente.
Grupos de unión basados en ésteres Los grupos de unión escindibles basados en ésteres son escindidos por enzimas tales como esterasas y amidasas en células. Los ejemplos de grupos de unión escindibles basados en éster incluyen, pero no se limitan a ésteres de grupos alquileno, alquenileno y alquinileno. Los grupos de unión escindibles de éster tienen la fórmula general -C(0)0-, o -OC(O)-. Estos candidatos se pueden evaluar usando métodos análogos a los descritos anteriormente.
Grupos escindibles basados en péptidos Los grupos de unión escindibles basados en péptidos son escindidos por enzimas tales como peptidasas y proteasas en células. Los grupos de unión escindibles basados en péptidos son enlaces peptidicos formados entre aminoácidos para proporcionar oligopéptidos (por ej . , dipéptidos, tripéptidos, etc.) y polipéptidos . Los grupos escindibles basados en péptidos no incluyen el grupo amida (-C(O)NH-) . El grupo amida puede formarse entre cualquier alquileno, alquenileno o alquinileno. Un enlace peptidico es un tipo especial de enlace amida formado entre aminoácidos para proporcionar péptidos y proteínas. El grupo de escisión basado en péptidos generalmente se limita al enlace peptídico (es decir, el enlace amida) formado entre aminoácidos proporcionando péptidos y proteínas y no incluye el grupo funcional de amida completo. Los grupos de unión escindibles basados en péptidos tienen la fórmula general NHCHRAC (0) NHCHRBC (O) -, donde RA y RB son los grupos R de los dos aminoácidos adyacentes. Estos candidatos se pueden evaluar usando métodos análogos a los descritos anteriormente.
Ligandos Una amplia variedad de entidades se puede acoplar a los oligonucleótidos y lípidos de la presente invención. Son porciones preferidos los ligandos que están acoplados, preferentemente de forma covalente, ya sea directa o indirectamente por medio de un enlace intermedio.
En modalidades preferidas, un ligando altera la distribución, direccionamiento o vida de una molécula en la cual se incorpora. En modalidades preferidas un ligando proporciona una afinidad mejorada por un objetivo elegido, por ej . molécula, célula o tipo celular, compartimiento, por ej . , un compartimiento celular o de órgano, tejido, órgano o región del cuerpo en comparación por e . , con una especie que carece de dicho ligando. Los ligandos que proporcionan una afinidad mejorada por una objetivo elegida también se llaman ligandos objetivo. Los ligandos preferidos para la conjugación de los lipidos de la presente invención son ligandos objetivo.
Algunos ligandos pueden tener propiedades endosomolíticas . Los ligandos endosomoliticos promueven la lisis de la endosoma y/o transporte de la composición de la invención, o sus componentes, de la endosoma al citoplasma de la célula. El ligando endosomolítico puede ser un péptido polianiónico o peptidomimético que muestra una fusogenicidad y actividad de membrana dependiente del pH . En ciertas modalidades, el ligando endosomolítico asume su conformación activa a un pH endosomal. La conformación "activa" es aquella conformación en la cual el ligando endosomolítico promueve la lisis de la endosoma y/o transporte de la composición de la invención, o sus componentes, de la endosoma al citoplasma de la célula. Los ejemplo de ligandos endosomoliticos incluyen péptido GALA (Subbarao et al., Biochemistry, 1987, 26: 2964-2972), el péptido. EALA (Vogel et al., J. Am. Chem. Soc, 1996, 118: 1581-1586) y sus derivados (Turk et al., Biochem. Biophys. Acta, 2002, 1559: 56-68). En ciertas modalidades, el componente endosomolítico puede contener un grupo químico (por ej . un aminoácido) que experimentará un cambio en la carga o la protonación en respuesta a un cambio en el pH. El componente endosomolitico puede ser lineal o ramificado. Los ejemplos de secuencias primarias de ligandos endosomolíticos basados en péptidos se muestran en la Tabla 4.
Tabla 4: Lista de péptidos con actividad endosomolitica.
Nombre Secuencia (N a C) Ref .
GALA AALEALAEALEALAEALEALAEAAAAGGC 1 EALA AALAEALAEALAEALAEALAEALAAAAGGC 2 ALEALAEALEALAEA 3 INF-7 GLFEAIEGFIENG EGMIWDYG 4 Inf HA-2 GLFGAIAGFIENGWEGMI DG YG 5 diINF-7 GLF EAI EGFI ENGW EGMI DGWYGC 5 GLF EAI EGFI ENGW EGMI DGWYGC diINF3 GLF EAI EGFI ENGW EGMI DGGC 6 GLF EAI EGFI ENGW EGMI DGGC GLF GLFGALAEALAEALAEHLAEALAEALEALAAGGSC 6 GALA-INF3 GLFEAIEGFIENGWEGLAEALAEALEALAAGGSC 6 INF-5 GLF EAI EGFI ENGW EGnl DG K 4 GLF EAI EGFI ENGW EGnl DG N: norleucina Referencias 1. Subbarao et al . , Biochemistry, 1987, 26: 2964-2972. 2. Vogel et al., J. Am. Chem. Soc, 1996, 118: 1581-1586 3. Turk, M. J., Reddy, J. A . et al. (2002). Characterization of a novel pH-sensitive peptide that enhances drug reléase from folate-targeted liposomes at endosomal pHs . Biochim. Biophys. Acta 1559, 56-68. 4. Plank, C. Oberhauser, B. Mechtler, K. Koch, C. Wagner, E. (1994). The influence of endosome-disruptive peptides on gene transfer using synthetic virus-like gene transfer systems, J. Biol. Chem. 269 12918-12924. 5. Mastrobattista, E . , Koning, G. A . et al. (2002).
Functional characterization of an endosome-disruptive peptide and its application in cytosolic delivery of immunoliposome-entrapped proteins. J. Biol. Chem. 277, 27135-43. 6. Oberhauser, B., Plank, C. et al. (1995). Enhancing endosomal exit of nucleic acids using pH-sensitive viral fusión peptides. Deliv. Strategies Antisense Oligonucleotide Ther. 247-66.
Los ligandos preferidos pueden mejorar el transporte, la hibridación y las propiedades de especificidad y también pueden mejorar la resistencia a nucleasa del oligoribonucleótido natural o modificado resultante, o una molécula polimérica que comprende cualquier combinación de monómeros descritos en la presente y/o ribonucleótidos naturales o modificados.
Los ligandos en general pueden incluir modificadores terapéuticos, por ej . para mejorar la absorción; compuestos de diagnóstico o grupos indicadores, por e . para monitorear la distribución; agentes reticulantes y porciones que confieren resistencia a nucleasa. Los ejemplos generales incluyen lipidos, esteroides, vitaminas, azúcares, proteínas, péptidos, poliaminas e imitadores de péptídos.
Los ligandos pueden incluir una sustancia de origen natural, tal como una proteína (por ej . , albúmina sérica humana (HSA) , lipoproteína de baja densidad (LDL) , lipoproteína de alta densidad (HDL) o globulina) , un carbohidrato (por e . un dextrano, pululano, quitina, quitosano, inulina, ciclodextrina o ácido hialurónico) o un lípido. El ligando también puede ser una molécula recombinante o sintética, tal como un polímero sintético, por ej . , un poliaminoácido sintético, un oligonucleótido (por ej . un aptámero) . Los ejemplos de poliaminoácidos incluyen poliaminoácidos tales como polilisina (PLL), ácido poli L-aspártico, ácido poli L-glutámico, copolímero anhídrido de ácido estiren-maleico, copolímero poli(L- láctido-co-glicolied) , copolímero de anhídrido divinil éter- maleico, copolímero N- ( 2-hidroxipropil ) metacrilamida (HMPA) , polietilenglicol (PEG) , polivinil alcohol (PVA), poliuretano, poli(2-ácido etilacrílico) , polímeros N-isopropilacrilamida o polifosfazina . Los ejemplos de poliaminas incluyen: polietilenimina, polilisina (PLL) , espermina, espermidina, poliamina, pseudopéptido-poliamina, poliamina peptidomimético, poliamina dendrímero, arginina, amidina, protamina, lipido catiónico, porfirina catiónica, sal cuaternaria de una poliamina, o un péptido alfa helicoidal.
Los ligandos también pueden incluir grupos objetivo, por ej . un agente que se dirige a una célula o tejido, por ej . una lecitina, glucoproteína, lipido o proteína, por ej . un anticuerpo que se une a un tipo celular especificado tal como una célula renal. Un grupo objetivo puede ser una tirotropina, melanotropina, lectina, glucoproteína, proteína A tensoactiva, carbohidrato mucina, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, mañosa multivalente N-acetil-gulucosamina, fucosa multivalente, poliaminoácidos glicosilados , galactosa multivalente, transferrina, bisfosfonato, poliglutamato, poliaspartato, un lipido, colesterol, un esteroide, ácido biliar, folato, vitamina B12, biotina, un péptido RGD, un mimético del péptido RGD o un aptámero. La Tabla 5 muestra algunos ejemplos de ligandos objetivo y sus receptores asociados.
Tabla 5: Ligandos objetivo y sus receptores asociados Células hepáticas Ligando Receptor 1) Célula Galactosa ASGP-R parenquimatosa (Receptor de (PC) (Hepatocitos) asiologlicoproteina) Gal NAc (n-acetil- ASPG-R galactosamina) Receptor Gal NAc Lactosa Asialofetuina ASPG-r 2) Célula Hialuronano Receptor de endotelial hialuronano sinusoidal (SEC) Procolágeno Receptor de procolágeno Moléculas con carga Receptores negativa depuradores Mañosa Receptores de mañosa N-acetil Receptores glucosalina depuradores Inmunoglobulinas Receptor Fe LPS Receptor CD14 Insulina Transcitosis mediada por receptor Transferrina Transcitosis mediada por receptor Albúminas No específico Conjugados de azúcar-albúmina Mañosa-6-fosfato Receptor de manosa- 6-fosfato 3) Célula Kupffer Mañosa Receptores de mañosa (KC) Mucosa Receptores de mucosa Albúminas No especifico Conjugados de manosa-albúmina Otros ejemplos de ligandos incluyen tintes, agentes intercalantes (por ej . acridinas) , reticulantes (por e . psoraleno, mitomicina C) , porfirinas (TPPC4, texafirina, Sapfirina) , hidrocarburos aromáticos policíclicos (por ej . , fenazina, dihidrofenazina) , endonucleasas artificiales (por ej . EDTA) , moléculas lipofílicas, e.j, colesterol, ácido cólico, ácido acético adamantano, ácido butírico 1-pireno, dihidrotestosterona, 1 , 3-Bis-O (hexadecil ) glicerol , grupo geraniloxihexil , hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3- propanodiol, grupo heptadecilo, ácido palmitico, ácido miristico, ácido 03- (oleoil) litocólico, ácido 03- (oleoil ) colénico, dimetoxitritilo o fenoxazina) y conjugados de péptido (por ej., péptido antennapedia, péptido Tat) , agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG (por ej . PEG-40K) , MPEG, [ PEG]2, poliamino, alquilo, alquilo sustituido, marcadores radiomarcados, enzimas, haptenos (por ej . biotina), facilitadores de transporte/absorción (por ej . , aspirina, vitamina E, ácido fólico) , ribonucleasas sintéticas (por ej . , imidazol, bisimidazol, histamina, grupo imidazol, conjugados acridina-imidazol , complejos Eu3+ de tetraazamacrociclos ) , dinitrofenilo, HRP, o AP.
Los ligandos pueden ser proteínas, por ej . glicoproteína o péptidos, por ej . moléculas que tienen una afinidad específica por un co-ligando, o anticuerpos por e . un anticuerpo que se une a un tipo celular específico tal como una célula cancerosa, célula endotelial o célula ósea. Los ligandos también pueden incluir hormonas y receptores de hormonas. También pueden incluir especies no peptídicas, tales como lípidos, lectinas, carbohidratos, vitaminas, cofactores, lactosa multivalente, galactosa multivalente, N-acetil-galactosamina, mañosa multivalente N-acetil-glucosamina, fucosa multivalente o aptámeros. El ligando puede ser, por ejemplo, un lipopolisacárido, un activador de p38 AP cinasa o un activador de NF-KB.
El ligando puede ser una sustancia, por ej . , un fármaco, que puede aumentar la absorción del agente iRNA a la célula, por ejemplo, alterando el citoesqueleto de la célula, por ej . alterando los microtúbulos de la célula, microfilamentos y/o filamentos intermedios. El fármaco puede ser, por ejemplo, taxon, vincristina, vinblastina, citocalasina, nocodazol, j aplakinolida, latrunculina A, faloidina, swinholida A, indanocina o mioservina.
El ligando puede aumentar la absorción del agente iRNA en la célula por medio de la activación de una respuesta inflamatoria, por ejemplo. Ejemplos de ligandos que tendrían tal efecto incluyen factor de necrosis tumoral alfa (TNFalfa) , interleucina-1 beta o gamma interferón.
En un aspecto, el ligando es un lípido o una molécula basada en lípidos. Tal lípido o molécula basada en lípidos preferentemente une una proteína de suero, por ej . albúmina sérica humana (HSA) . Un ligando de unión a HSA permite la distribución del conjugado a un tejido objetivo, por ej . un tejido objetivo no de riñon del cuerpo. Por ejemplo, el tejido objetivo puede ser el hígado, incluyendo células parenquimatosas del hígado. Otras moléculas que pueden unir HSA también pueden usarse como ligandos. Por ejemplo, se puede usar neproxina o aspirina. Un ligando lipídico basado en lípidos puede (a) aumentar la resistencia a la degradación del conjugado, (b) aumentar el direccionamiento o transporte hacia una célula objetivo o membrana celular, y/o (c) ser usado para ajustar la unión a una proteina de suero, por ej . HSA.
Un ligando basado en lipidos puede ser usado para modular, por ej . controlar la unión del conjugado a un tejido objetivo. Por ejemplo, un ligando lipidico basado en lipidos que se une a HSA más fuertemente será menos probable que esté dirigido al riñón y por lo tanto menos probable que sea eliminado del cuerpo. Un ligando lipidico basado en lipidos que se une a HSA con menos fuerza puede ser usado para direccionar el conjugado al riñón.
En una modalidad preferida, el ligando basado en lipidos une HSA. Preferentemente, une HSA con una afinidad suficiente de forma tal que el conjugado se distribuirá preferentemente a un tejido no de riñón. Sin embargo, se prefiere que la afinidad no sea tan fuerte como para que la unión HSA-ligando no pueda revertirse.
En otra modalidad preferida, el ligando basado en lipidos une HSA débilmente o directamente no une, de forma tal que el conjugado se distribuirá preferentemente al riñón. Otros porciones que se dirigen a células de riñón también pueden usarse en lugar de o además del ligando basado en lipidos .
En otro aspecto, el ligando es una porción, por ej . una vitamina, que es absorbida por una célula objetivo, por ej . una célula proliferante. Estos son particularmente útiles para tratar trastornos caracterizados por una proliferación celular no deseada, por e . del tipo maligno o no maligno, por e . , células cancerosas. Los .ejemplos de vitaminas incluyen vitamina A, E y K. Otros ejemplos de vitaminas son vitamina B, por ej . , ácido fólico, B12, riboflavina, biotina, piridoxal u otras vitaminas o nutrientes absorbidos por células cancerosas. También se incluyen HAS, lipoproteína de baja densidad (LDL) y lipoproteína de alta densidad (HDL) .
En otro aspecto, el ligando es un agente de penetración celular, preferentemente un agente de penetración celular helicoidal. Preferentemente el agente es anfipático. Un ejemplo de agente es un péptido tal como tat o antenopedia. Si el agente es un péptido, puede modificarse, incluyendo un peptidilmimético, invertómeros , enlaces no peptídicos o pseudo peptídicos y el uso de D-aminoácidos . El agente helicoidal es preferentemente un agente alfa-helicoidal, que preferentemente tiene una fase lipofílica y una lipofóbica.
El ligando puede ser un péptido o peptidomimético . Un peptidomimético (al que también se hace referencia en la presente como oligopeptidomimético) es una molécula capaz de plegarse en una estructura tridimensional definida similar a un péptido natural. El resto de péptido o peptidomimético puede ser de alrededor de 5-50 aminoácido de longitud, por ej. alrededor de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50 aminoácidos de longitud (véase Tabla 6, por ejemplo) .' Tabla 6 Ejemplos de péptidos de permeación celular Péptido de Secuencia de aminoácidos Referencia penetración celular Penetratina RQIKIWFQNRRMKWKK Derossi et al., J. Biol. Chem. 269:10444, 1994 Fragmento tat GRKKRRQRRRPPQC Vives et al . , (48-60) J. Biol. Chem., 272:16010, 1997 Péptido basado GALFLGWLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV Chaloin et al . , en secuencia de Biochem. señal Biophys. Res.
Común . , 243:601, 1998 PVEC LLIILRRRIRKQAHAHSK Elmquist et al., Exp. Cell Res., 269:237, 2001 Transportano GWTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL Pooga et al . , FASEB J., 12:67, 1998 Péptido de KLALKLALKALKAALKLA Oehlke et al . , modelo Mol. Ther., anfifilico 2:339, 2000 Argig RRRRRRRRR Mitchell et al., J. Pept. Res., 56:318, 2000 Penetración de KFFKFFKFF pared celular bacteriana LL-37 LLGDFFRKSKE IGKEFKRIVQRI KDFLRNLVPRTES Cecropina Pl SWLSKGAKKLENSAKKRISEGIAI AIQGGPR A-defensina ACYCRIPACIAGERRYGTCIYQGR LWAFCC b-defensina DHYNCVSSGGQCLYSACPIFTKIQ GTCYRGKAKCCK Bactenecina RKCRIVVIRVCR PR-39 RRRPRPPYLPRPRPPPFFPPRLPP RIPPGFPPRFPPRFPGKR-NH2 Indolicidina ILP KWP WPWRR-NH2 Un péptido o peptidomimético puede ser, por ejemplo, un péptido de permeación celular, péptido catiónico, péptido anfipático o péptido hidrofóbico (por e . que consiste principalmente en Tyr, Trp o Phe) . La porción de péptido puede ser un péptido dendrimero, péptido restringido o péptido reticulado. En otra alternativa, el resto de péptido puede incluir una secuencia de translocación de membrana (MTS) hidrofóbica. Un péptido que contiene un ejemplo de MTS hidrofóbica es RFGF que tiene la secuencia de aminoácidos AAVALLPAVLLALLAP . Un análogo de RFGF (por ej . , secuencia de aminoácidos AALLPVLLAAP) que contiene una MTS hidrofóbica también puede ser una porción objetivo. El resto de péptido puede ser un péptido de "entrega", que puede transportar grandes moléculas polares incluyendo péptidos, oligonucleótidos y proteínas a través de las membranas celulares. Por ejemplo, se ha encontrado que las secuencias de la proteína Tat del HIV (GRKKRRQRRRPPQ) y la proteína Drosophila Antennapedia (RQIKIWFQNRRMKWKK) son capaces de funcionar como péptidos de entrega. Un péptido o peptidomimético se puede codificar por una secuencia aleatoria de DNA, tal como un péptido identificado de una biblioteca de expresión de fagos o una biblioteca combinatoria de compuestos one-bead-one (OBOC) (Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991). Preferentemente el péptido o peptidomimético enlazado a un agente de iRNA por medio de una unidad incorporada de monómero es un péptido dirigido a una célula tal como un ácido arginina-glicina-aspártido péptido- (RGD) o mimético de RGD: Un resto de péptido puede variar en longitud desde alrededor de 5 aminoácidos hasta alrededor de 40 aminoácidos. Los porciones de péptidos pueden tener una modificación estructural, tal como para aumentar las propiedades de estabilidad o las propiedades conformacionales directas. Se puede utilizar cualquiera de las modificaciones estructurales descritas a continuación.
Se puede utilizar una porción de péptido RGD para direccionar a una célula tumoral, tal como una célula tumoral endotelial o una célula tumoral de cáncer de mama (Zitzmann et al., Cáncer Res., 62:5139-43, 2002) . Un péptido RGD puede facilitar el direccionamiento de un agente de iRNA hacia tumores de una variedad de otros tejidos, incluyendo el pulmón, riñon, bazo o hígado (Aoki et al., Cáncer Gene Therapy 8:783-787, 2001) . Preferentemente, el péptido RGD facilitará el direccionamiento de un agente de iRNA hacia el riñon. El péptido RGD puede ser lineal o cíclico y puede modificarse, por ej . glicosilarse o metilarse para facilitar el direccionamiento hacia tejidos específicos. Por ejemplo, un péptido RGD glicosilado puede administrar un agente de iRNA a una célula tumoral que expresa ?ß3 (Haubner et al., Jour. Nucí. Med., 42:326-336, 2001) .
Se pueden usar péptidos que se dirigen a marcadores enriquecidos en células proliferativas . Por ej . los péptidos y peptidomiméticos que contienen RGD pueden direccionarse a células cancerosas, en particular células que presentan una integrina a?ß3. Por lo tanto, se podrían utilizar péptidos RGD, péptidos cíclicos que contienen RGD, péptidos RGD que incluyen D-aminoácidos, así como miméticos RGD sintéticos. Además de RGD, se pueden utilizar otros porciones que se dirigen al ligando de la integrina ?ß3. Generalmente, tales ligandos se pueden utilizar para controlar las células proliferativas y la angiogénesis . Los conjugados preferidos de este tipo de ligandos que se dirigen a PECAM-1, VEGF u otro gene de cáncer, por ej . un gene de cáncer descrito en la presente .
Un "péptido de permeación celular" es capaz de penetrar una célula, por ej . una célula microbiana, tal como una célula bacteriana o fúngica, o una célula de mamífero, tal como una célula humana. Un péptido de penetración celular microbiano puede ser, por ejemplo, un péptido lineal or-helicoidal (por e . , LL-37 o Ceropina Pl), un péptido que confien un enlace disulfuro (por ej . , a -defensina, ß-defensina o bactenecina) , o un péptido que contiene solo uno o dos aminoácidos dominantes (por ej . , PR-39 o indolicidina) . Un péptido de permeación celular también puede incluir una señal de localización nuclear (NLS) . Por ejemplo, un péptido de penetración celular puede ser un péptido anfipático bipartido, tal como MPG, que proviene del dominio del péptido de fusión de HIV-1 gp41 y el NLS de SV40 antígeno T grande (Simeoni et al., Nucí. Acids Res. 31:2717-2724, 2003).
En una modalidad, un péptido objetivo enlazado a un agente de iRNA y/o el oligómero portador puede ser un péptido a-helicoidal anfipático. Los péptidos a-helicoidales anfipáticos incluyen, pero no se limitan a, cecropinas, licotoxinas, paradaxinas, buforin, CPF, péptido tipo bombinina (BLP), catelicidinas , ceratotoxinas , péptidos S. clava, péptidos antimicrobianos intestinales hagfish (HFIAP) , magaininas, brevininas-2 , dermaseptinas , melitinas, pleurocidina, péptidos H2A, péptidos Xenopus, esculentinis-l y caerinas . Preferentemente se considerará un número de factores para mantener la integridad de la estabilidad del hélice. Por ejemplo, se utilizará un número máximo de residuos de estabilización de hélice (por ej . leu, ala o lys) y un número mínimo de residuos de desestabilización de hélice (por ej . prolina o unidades monoméricas cíclicas) . El residuo de recubrimiento será considerado (por ejemplo Gly es un ejemplo de residuo de N-recubrimiento y/o la amidación C-terminal se puede usar para proporcionar un enlace H extra para estabilizar el hélice. La formación de puentes salinos entre los residuos con cargas opuestas, separados por posiciones i ± 3, o i ± 4 puede proporcionar estabilidad. Por ejemplo, los residuos catiónicos tales como lisina, arginina, homo-arginina, ornitina o histidina pueden formar puentes salinos con los residuos aniónicos glutamato o aspartato .
Los ligandos de péptido y peptidomiméticos incluyen aquellos que tienen péptidos de origen natural o modificados, por ej . péptidos D o L, péptidos a, ß o ?, péptidos N-metilo, azapéptidos, péptidos que tienen una o más amida, es decir, péptido, enlaces reemplazados con uno o más enlaces de urea, tiourea, carbamato o sulfonilurea o péptidos cíclicos.
El ligando de direccionamiento puede ser cualquier ligando que es capaz de direccionarse a un receptor especifico. Son ejemplos: folato, GalNAc, galactosa, mañosa, manosa-6P, grupos de azúcares tais como grupo de GalNAc, grupo de mañosa, grupo de galactosa o un aptámero. Un grupo es una combinación de dos o más unidades de azúcar. Los ligandos de direccionamiento también incluyen ligandos del receptor de integrina, ligandos del receptor de quimiocina, transferrina, biotina, ligandos del receptor de serotonina, PSMA, endotelina, GCPII, somatoestatina, ligandos de LDL y HDL. Los ligandos también pueden estar basados en ácido nucleico, por ej . , un aptámero. El aptámero puede no estar modificado o puede tener cualquier combinación de modificaciones descritas en la presente.
Los agentes de liberación endosomal incluyen imidazoles, poli o oligoimidazoles, PEI, péptidos, péptidos fusogénicos, policarboxilatos, poliacationes , oligo o poli cationes o aniones enmascarados, acétales, poliacetales, cetal/policeales, ortoésteres, polímeros con cargas catiónicas o aniónicas enmascaradas o no enmascaradas, dendrímeros con cargas catiónicas o aniónicas enmascaradas o no enmascaradas.
Modulador PK significa modulador farmacocinético . El modulador PK incluye lipófilos, ácidos biliares, esteroides, análogos de fosfolípidos, péptidos, agentes de unión a/de proteínas, PEG, vitaminas, etc. Ejemplos de moduladores PK incluyen, pero no se limitan a, colesterol, ácidos grasos, ácido cólico, ácido litocólico, dialquilglicéridos, diacilglicéridos, fosfolípidos , esfingolípidos, naproxeno, ibuprofeno, vitamina E, biotina, etc. También se sabe que los oligonucleótidos que comprenden una cantidad de enlaces de fosforotioato se unen a la proteína de suero; por lo tanto los oligonucleótidos cortos, por ej . oligonucleótidos de alrededor de 5 bases, 10 bases, 15 bases o 20 bases, que comprenden múltiples enlaces de fosforotioato en la estructura principal también se pueden considerar en la presente invención como ligandos (por ej . como ligandos moduladores PK) .
Además, los aptámeros que se unen a componentes séricos (por e . proteínas en suero) también se pueden considerar en la presente invención como ligandos moduladores PK.
Otros ligandos adecuados para la invención se describen en solicitudes co-pendientes USSN: 10/916,185, presentada el 10 de agosto, 2004; USSN: 10/946,873, presentada el 21 de setiembre, 2004; USSN: 10/833,934, presentada el 3 de agosto, 2007; USSN: 11/115,989, presentada el 27 de abril, 2005 y USSN: 11/944,227 presentada el 21 de noviembre, 2007, que se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad a todos los efectos.
Cuando dos o más ligandos están presentes, todos los ligandos pueden tener las mismas propiedades, todos pueden tener diferentes propiedades o algunos ligandos pueden tener las mismas propiedades mientras que otros tienen diferentes propiedades. Por ejemplo, un ligando puede tener propiedades de direccionamiento, tener actividad endosomolítica o tener propiedades moduladoras PK. En una modalidad preferida, todos los ligandos tienen propiedades diferentes.
Los ligandos se pueden acoplar a los oligonucleótidos en diversos lugares, por ejemplo, extremo 3', extremo 5' y/o en una posición interna. En modalidades preferidas, el ligando está unido a los oligonucleótidos por medio de un enlace intermedio. El ligando o ligando enlazador puede estar presente en un monómero cuando dicho monómero está incorporado en el filamento creciente. En algunas modalidades, el ligando puede incorporarse por medio de acoplamiento a un monómero "precursor" luego de que dicho monómero "precursor" haya sido incorporado al filamento creciente. Por ejemplo, un monómero que tiene, por e . , un enlace con terminación amino (es decir, que no tiene un ligando asociado) por ej . TAP- (CH2) nNH2 se puede incorporar a un filamento sentido o antisentido creciente. En una operación posterior, es decir, luego de la incorporación del monómero precursor a la cadena, un ligando que tiene un grupo electrofilico, por ej . un pentafluorofenil éster o un grupo aldehido, puede unirse posteriormente al monómero precursor por medio de acoplamiento del grupo electrofilico del ligando con el grupo nucleofilico terminal del enlace del monómero precursor.
En el caso de oligonucleótidos de doble filamento, los ligandos pueden unirse a una o ambas cfilamentos. En algunas modalidades, un agente de iRNA de doble filamento contiene un ligando conjugado al filamento sentido. En otras modalidades, un agente de iRNA de doble filamento contiene un ligando conjugado al filamento antisentido.
En algunas modalidades, los ligandos se pueden conjugar a las nucleobases, porciones de azúcar o enlaces internucleosidicos de moléculas de ácido nucleico. La conjugación a nucleobases de purina o derivados de las mismas puede ocurrir en cualquier posición incluyendo, átomos endociclicos y exociclicos. En algunas modalidades, las posiciones 2-, 6-, 7- u 8- de una nucleobase de purina están unidas a una porción conjugado. La conjugación a nucleobases de pirimidina o derivados de las mismas también puede ocurrir en cualquier posición. En algunas modalidades, las posiciones 2-, 5- y 6- de una nucleobase de pirimidina pueden estar sustituidas por una porción conjugado. La conjugación a porciones de azúcar de los nucleótidos puede ocurrir en cualquier átomo de carbono. Los ejemplos de átomos de carbono de una porción de azúcar que pueden estar unidos a una porción conjugado incluyen los átomos de carbono 2', 3' y 5'. La posición 1' también puede estar unida a una porción conjugado tal como un residuo abásico. Los enlaces internucleosidicos también pueden soportar porciones conjugados. Para los enlaces que contienen fósforo (por ej . fosfodiéster, fosforotioato, fosforoditioato, fosforoamidato y similares), el resto conjugado puede estar unido directamente al átomo de fósforo o a un átomo O, N o S unido a un átomo de fósforo. Para los enlaces internucleosidicos que contienen amina o amida (por ej . PNA) , el resto conjugado puede estar unido al átomo de nitrógeno de la amina o amida o a un átomo de carbono adyacente.
Existen numerosos métodos para preparar conjugados de compuestos oligoméricos . En general, un compuesto oligomérico está unido a una porción conjugado por medio del contacto de un grupo reactivo (por ej . , OH, SH, amina, carboxilo, aldehido y similares) en el compuesto oligomérico con un grupo reactivo en el resto conjugado. En algunas modalidades, un grupo reactivo es electrofilico y el otro es nucleofilico .
Por ejemplo, un grupo electrofílico puede ser una funcionalidad que contiene carbonilo y un grupo nucleofílico puede ser una amina o un tiol. Los métodos de conjugación de ácidos nucleicos y compuestos oligoméricos relacionados con y sin grupos de unión se describen bien en la bibliografía tal como, por ejemplo, en Manoharan in Antisense Research and Applications, Crooke and LeBleu, eds . , CRC Press, Boca Ratón, Fia., 1993, capítulo 17, que se incorpora a la presente a modo de referencia en su totalidad.
Las patentes estadounidenses representativas que enseñan la preparación de conjugados de oligonucleótidos incluyen, pero no se limitan a, patentes estadounidenses Nos 4, 828, 979; 4, 948, 882; 5,218, 105; 5, 525, 65; 5,541, 313 5,545,730; 5, 552, 538; 5,578, 717, 5, 580, 731; 5, 580, 731 5,591,584; 5, 109, 124; 5,118, 802; 5, 138, 045; 5, 414, 077 5, 86, 603; 5, 512, 439; 5,578, 718; 5, 608, 046; 4, 587, 044 4, 605, 735; 4, 667, 025; 4,762, 779; 4, 789, 737; 4, 824, 941 4, 835,263; 4, 876, 335; 4, 904, 582; 4, 958, 013; 5, 082, 830 5, 112, 963; 5, 214, 136; 5, 082, 830; 5, 112, 963; 5, 149, 782 5, 214, 136; 5, 245, 022; 5,254, 469; 5,258,506; 5, 262, 536 5, 272,250; 5, 292, 873; 5,317, 098; 5, 371,241, 5, 391, 723 5, 16,203, 5, 451, 463; 5,510, 475; 5, 512, 667; 5, 514, 785 5, 565,552; 5, 567, 810; 5, 574, 142; 5,585,481; 5, 587, 371 5, 595,726; 5, 597, 696; 5, 599, 923; 5, 599, 928; 5, 672, 662 5, 688, 941; 5,714, 166; 6, 153, 737; 6, 172,208; 6, 300, 319 6,335,434; 6,335,437; 6,395, 437; 6,444,806; 6, 486,308; 6,525,031; 6,528,631; 6,559, 279; cada una de las cuales se incorpora a la presente a modo de referencia.
Características de partículas de ácido nucleico-lípido En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a métodos y composiciones para producir partículas de ácido nucleico encapsuladas en lípido en las que los ácidos nucleicos están encapsulados con una capa lipídica. Tales partículas de ácido nucleico-lípido que incorporan oligonucleótidos de siRNA se caracterizan usando una variedad de parámetros biofísicos que incluyen: (1) relación de fármaco-lípido; (2) eficiencia de encapsulación y (3) tamaño de partícula. Se desean altas relaciones fármaco-lípido, una alta eficiencia de encapsulación, una buena resistencia a la nucleasa y estabilidad sérica y un tamaño de partícula controlable, generalmente menor a 200 nm en diámetro. Además, la naturaleza del polímero de ácido nucleico es significativa debido a que la modificación de los ácidos nucleicos en un esfuerzo por transmitir resistencia de nucleasa aumenta el costo de los terapéuticos mientras que en muchos casos solo proporciona una resistencia limitada. A menos que se indique lo contrario, estos criterios se calculan en esta memoria descriptiva de la siguiente manera: La relación de ácido nucleico-lípido es la cantidad de ácido nucleico en un volumen definido de preparación dividido por la cantidad de lipido en el mismo volumen. Esto puede ser en una base mol por mol o en una base peso por peso o en una base peso por mol. Para las formulaciones finales, prontas para la administración, la relación de ácido nucleico : lipido se calcula luego de que se ha utilizado diálisis, cromatografía y/o digestión enzimática (por ej . nucleasa) para quitar tanto ácido nucleico externo como sea posible.
La eficiencia de encapsulación se refiere a la relación de fármaco-lípido de la mezcla inicial dividida por la relación de fármaco-lípido de la formulación final, aceptable para la administración. Esta es una medida de eficiencia relativa. Para una medida de eficiencia absoluta, también se puede calcular la cantidad total de ácido nucleico agregada a la mezcla inicial que termina en la formulación competente de administración. También se puede calcular la cantidad de lipido que se pierde durante el proceso de formulación. La eficiencia es una medida del desperdicio y gasto de la formulación .
El tamaño indica el tamaño (diámetro) de las partículas formadas. La distribución de tamaño se puede determinar usando dispersión de luz casi elástica (QELS) en un medidor de partículas de sub micrones Nicomp modelo 370. Se prefieren las partículas menores a 200 nm para la distribución de tejidos neovascularizados (leaky), tales como neoplasmas y sitios de inflamación.
Composiciones farmacéuticas Las partículas lipídicas de la presente invención, particularmente cuando están asociadas con un agente terapéutico, se pueden formular como una composición farmacéutica, por ej . que también comprende un diluyente, excipiente o portador farmacéuticamente aceptable, tal como un amortiguador fisiológico de solución salina o fosfato, seleccionado de acuerdo con la vía de administración y práctica farmacéutica estándar.
En modalidades particulares, las composiciones farmacéuticas que comprenden las partículas de ácido nucleico-lípido de la invención se preparan de acuerdo con técnicas estándar y comprenden adicionalmente un portador farmacéuticamente aceptable. Generalmente, se empleará solución salina normal como el portador farmacéuticamente aceptable. Otros portadores adecuados incluyen, por ej . agua, agua tamponada, 0.9% de solución salina, 0.3% de glicina y similares, incluyendo glicoproteínas para una estabilidad mejorada, tal como albúmina, lipoproteína, globulina, etc. En las composiciones que comprenden solución salina u otros portadores que contienen sal, el portador preferentemente se agrega luego de la formación de partículas lipídica. Por lo tanto, luego de que se forman las composiciones de lípido- ácido nucleico, las composiciones se pueden diluir en portadores farmacéuticamente aceptables tales como solución salina normal.
Las preparaciones farmacéuticas resultantes se pueden esterilizar por técnicas de esterilización convencionales bien conocidas en la técnica. Las soluciones acuosas pueden entonces empaquetarse para su uso o filtrarse en condiciones asépticas y liofilizarse ; la preparación liofilizada se combina con una solución acuosa estéril antes de la administración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables tal como es requerido para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes de ajuste de pH y tamponantes, agentes de ajuste de tonicidad y similares, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, etc. Adicionalmente , la suspensión lipidica puede incluir agentes protectores de lipidos que protegen a los lipidos contra daños de radicales libres y lipido peroxidativo tras el almacenamiento. Son adecuados los inactivadores lipofilicos de radicales libres, tales como a-tocoferol y agentes quelantes solubles en agua específicos del hierro, tales como ferrioxamina .
La concentración de partícula lipidica o partícula de ácido nucleico-lípido en las formulaciones farmacéuticas puede variar ampliamente, es decir, desde menos de aproximadamente 0,01%, generalmente a o al menos aproximadamente 0,05-5% hasta tanto como 10 a 30% en peso y se seleccionará principalmente por volúmenes, viscocidades de fluido, etc. de acuerdo con el modo particular de administración elegido. Por ejemplo, la concentración se puede aumentar para reducir la carga de fluido asociada con el tratamiento. Esto se puede desear particularmente en pacientes que tienen insuficiencia cardiaca congestiva asociada con ateroesclerosis o hipertensión severa. Alternativamente, los complejos compuestos por lipidos irritantes se pueden diluir en bajas concentraciones para disminuir la inflamación en el sitio de administración. En un grupo de modalidades, el ácido nucleico tendrá una etiqueta adjunta y se utilizará para el diagnóstico (por medio de la indicación de la presencia de ácido nucleico complementario) . En este caso, la cantidad de complejos administrados dependerá de la etiqueta particular utilizada, el estado de enfermedad que se diagnostica y el criterio del médico pero generalmente será entre alrededor de 0,01 y alrededor de 50 mg por kilogramo de peso corporal, preferentemente entre alrededor de 0,1 y alrededor de 5 mg/kg de peso corporal.
Como se indica anteriormente, las partículas del agente terapéutico lipídico (por ej . ácido nucleico) de la invención pueden incluir fosfolípidos modificados con polietilenglicol (PEG) , PEG-ceramida, o lípidos modificados con gangliósido GMiU otros lipidos efectivos para prevenir o limitar la agregación. La adición de tales componentes no solo previene la agregación de complejo. Preferentemente, también puede proporcionar un medio para aumentar la vida de circulación y aumentar la entrega de la composición de ácido nucleico- lipido a los tejidos objetivo.
La presente invención también proporciona composiciones de agente terapéutico-lipido en forma de kit. El kit típicamente comprenderá un contenedor que está dividido en compartimientos para contener los diversos elementos del kit. El kit contendrá las partículas o composiciones farmacéuticas de la presente invención, preferentemente en forma deshidratada o concentrada, con instrucciones para su rehidratación o dilución y administración. En ciertas modalidades, las partículas comprenden el agente activo, mientras que en otras modalidades, no lo hacen.
Métodos de fabricación Los métodos y composiciones de la invención usan algunos lípidos catiónicos, cuya síntesis, preparación y caracterización se describe a continuación y en los Ejemplos que acompañan. Además, la presente invención proporciona métodos para preparar partículas lipídicas, incluyendo aquellas asociadas con un agente terapéutico, por ej . , un ácido nucleico. En los métodos descritos en la presente, una mezcla de lípidos se combina con una solución acuosa tamponada de ácido nucleico para producir una mezcla intermedia que contiene ácido nucleico encapsulado en partículas lipídicas donde los ácidos nucleicos encapsulados están presentes en una relación ácido nucleico/lípido de alrededor de 3% en peso a alrededor de 25% en peso, preferentemente 5 a 15% en peso. Opcionalmente, a la mezcla intermedia se le puede ajustar el tamaño para obtener partículas de ácido nucleico encapsuladas en lípido donde las porciones lipídicas son vesículas unilaminares, que preferentemente tienen un diámetro de 30 a 150 nm, más preferentemente alrededor de 40 a 90 nm. Luego el pH se eleva para neutralizar al menos una porción de las cargas de superficie en las partículas de ácido nucleico-lípido, proporcionando así una composición de ácido nucleico encapsulada en lípido con superficie neutralizada al menos parcialmente .
Tal como se describe anteriormente, varios de estos lípidos catiónicos son amino lípidos que están cargados a un pH por debajo del pKa del grupo amino y son sustancialmente neutros a un pH por encima del pKa. Estos lípidos catiónicos se llaman lípidos catiónicos titulables y pueden utilizarse en las formulaciones de la invención usando un proceso de dos pasos. En primer lugar, las vesículas lipídicas se pueden formar al pH más bajo con lípidos catiónicos titulables y otros componentes de vesícula en presencia de ácidos nucleicos. De esta forma, las vesículas encapsularán y atraparán a los ácidos nucleicos. En segundo lugar, la carga de superficie de las vesículas recién formadas se puede neutralizar aumentando el pH del medio a un nivel por encima del pKa de los lípidos catiónicos titulables presentes, es decir, a un pH fisiológico o más alto. Los aspectos particularmente ventajosos de este proceso incluyen tanto la fácil eliminación de cualquier ácido nucleico adsorbido en la superficie como un vehículo de entrega de ácido nucleico resultante que tiene una superficie neutra. Se espera que los liposomas o partículas lipídícas que tienen una superficie neutra eviten la depuración rápida de la circulación y eviten algunas toxicidades que están asociadas con preparaciones de liposomas catiónicos. Se proporcionan detalles adicionales con respecto a los usos de tales lípidos catiónicos titulables en la formulación de partículas de ácido nucleico-lípido en la patente estadounidense 6.287.591 y la patente estadounidense 6.858.225, que se incorporan a la presente a modo de referencia.
También cabe destacar que las vesículas formadas de esta manera proporcionan formulaciones con un tamaño de vesícula uniforme con alto contenido de ácidos nucleicos. Adicionalmente, las vesículas tienen un rango de tamaño de entre alrededor de 30 hasta alrededor de 150 nm, más preferentemente alrededor de 30 hasta alrededor de 90 nm.
Sin pretender limitarse a ninguna teoría particular, se cree que la eficiencia muy alta de la encapsulación de ácido nucleico es un resultado de la interacción electroestática a un pH bajo. A un pH ácido (por ej . pH de 4,0) la superficie de la vesícula está cargada y une una porción de los ácidos nucleicos a través de interacciones electroestáticas . Cuando el amortiguador ácido externo se intercambia por un amortiguador más neutro (por ej . pH de 7.5) la superficie de la partícula lipídica o liposoma se neutraliza, permitiendo que se elimine cualquier ácido nucleico externo. En diversas publicaciones se proporciona información más detallada sobre el proceso de formulación (por ej . patente estadounidense 6.287.591 y patente estadounidense 6.858.225) .
En vista de lo anterior, la presente invención proporciona métodos para preparar formulaciones de ácido nucleico/lipídicas . En los métodos descritos en la presente, una mezcla de lípidos se combina con una solución acuosa tamponada de ácido nucleico para producir una mezcla intermedia que contiene ácido nucleico encapsulado en partículas lipídicas, por ej . , donde los ácidos nucleicos encap-sulados están presentes en una relación ácido nucleico/lípido de alrededor de 10% en peso a alrededor de 20% en peso. Opcionalmente, a la mezcla intermedia se le puede ajustar el tamaño para obtener partículas de ácido nucleico encapsuladas en lipido donde las porciones lipidicas son vesículas unilaminares, que preferentemente tienen un diámetro de 30 a 150 nm, más preferentemente alrededor de 40 a 90 nm. Luego el pH se eleva para neutralizar al menos una porción de las cargas de superficie en las partículas de ácido nucleico-lípido, proporcionando así una composición de ácido nucleico encapsulada en lipido con superficie neutralizada al menos parcialmente.
En algunas modalidades, la mezcla de lípidos incluye al menos dos componentes lipidíeos: un primer componente lipídico de la presente invención que se selecciona a partir de lípidos que tienen un pKa tal que el lipido es catiónico a un pH por debajo del pKa y neutro a un pH por encima del pKa y un segundo componente lipídico que se selecciona entre lípidos que previenen la agregación de partículas durante la formación de partículas ácido nucleico-lípido. En modalidades particulares, el amino lipido es un lipido catiónico novedoso de la presente invención.
Al preparar las partículas de ácido nucleico-lípido de la invención, la mezcla de lípidos es típicamente una solución de lípidos en un solvente orgánico. Esta mezcla de lípidos luego puede secarse para formar una película delgada o liofilizarse para formar un polvo antes de que se hidrate con un amortiguador acuoso para formar liposomas. Alternativamente, en un método preferido, la mezcla lipídica puede solubilizarse en un alcohol miscible en agua, tal como etanol y esta solución etanólica puede agregarse a un amortiguador acuoso que da como resultado una formación de liposoma espontánea. En la mayoría de las modalidades, el alcohol se utiliza en la forma en que se encuentra disponible comercialmente . Por ejemplo, se puede utilizar etanol como etanol absoluto (100%) o como 95% de etanol, el resto es agua. Este método se describe en más detalle en la patente estadounidense 5.976.567.
En un ejemplo de modalidad, la mezcla de lípidos es una mezcla de lípidos catiónicos, lípidos neutros (distintos de lípidos catiónicos), un esterol (por ej . colesterol) y un lípido modificado por PEG (por ej . un PEG-DMG o PEG-DMA) en un solvente de alcohol. En modalidades preferidas, la mezcla lipídica consiste esencialmente de un lípido catiónico, un lípido neutro, colesterol y lípido modificado por PEG en alcohol, más preferentemente etanol. En modalidades preferidas adicionales, la primera solución consiste en la mezcla lipídica anterior en relaciones molares de alrededor de 20-70% de lípido catiónico: 5-45% de lípido neutro : 20-55% de colesterol : 0.5-151 de lípido modificado por PEG. En aun otras modalidades preferidas, la primera solución consiste esencialmente en un lípido elegido de la Tabla 1, DSPC, Col y PEG-DMG o PEG-DMA, más preferentemente en una relación molar de alrededor de 20-60% de lípido catiónico: 5-25% de DSPC : 25-55% de Col: 0.5-15% de PEG-DMG o PEG-DMA. En modalidades particulares, la relación lipidica molar es aproximadamente 40/10/40/10 (mol% de lipido catiónico/DSPC/Col/PEG-DMG o PEG- DMA) , 35/15/40/10 (mol% de lipido catiónico/DSPC/Col/PEG-DMG o PEG-DMA) o 52/13/30/5 (mol% de lipido catiónico/DSPC/Col/PEG-DMG o PEG-DMA) . En otro grupo de modalidades preferidas, el lipido neutro en estas composiciones se reemplaza con POPC, DPPC, DOPE o SM.
De acuerdo con la invención, la mezcla lipidica se combina con una solución acuosa tamponada que puede contener los ácidos nucleicos. La solución acuosa tamponada de [sic] es típicamente una solución en la cual el amortiguador tiene un pH menor al pKa del lipido protonable en la mezcla lipidica. Los ejemplos de tampones adecuados incluyen citrato, fosfato, acetato y MES. Un amortiguador particularmente preferido es amortiguador de citrato. Los tampones preferidos estarán en el rango de 1-1000 mM del anión, dependiendo de la química del ácido nucleico que está siendo encapsulado y la optimización de la concentración de amortiguador puede ser significativa para lograr altos niveles de carga (véase, por ej, patente estadounidense 6.287.591 y patente estadounidense 6.858.225).
Alternativamente, puede ser útil agua pura acidificada a un pH 5-6 con cloruro, sulfato o similar. En este caso, puede ser adecuado agregar 5% de glucosa u otro soluto no iónico que equilibrará el potencial osmótico a través de la membrana de partícula cuando las partículas se dializan para quitar el etanol, aumentar el pH o mezclarlo con un portador farmacéuticamente aceptable tal como solución salina normal. La cantidad de ácido nucleico en amortiguador puede variar, pero típicamente será desde alrededor de 0,01 mg/mL a alrededor de 200 mg/mL, más preferentemente desde alrededor de 0,5 mg/mL a alrededor de 50mg/mL.
La mezcla de lípidos y la solución acuosa amortiguada de ácidos nucleicos terapéuticos se combina para proporcionar una mezcla intermedia. La mezcla intermedia es típicamente una mezcla de partículas lipídicas que tienen ácidos nucleicos encapsulados . Adicionalmente, la mezcla intermedia también puede contener alguna porción de ácidos nucleicos que están unidos a la superficie de las partículas lipídicas (liposomas o vesículas lipídicas) debido a la atracción iónica de los ácidos nucleicos cargados negativamente y los lípidos cargados positivamente en la superficie de partícula lipídica (los amino lípidos u otros lípidos que constituyen el primer componente lipídico protonable están cargados positivamente en un amortiguador que tiene un pH menor al de pKa del grupo protonable en el lípido) . En un grupo de modalidades preferidas, la mezcla de lípidos es una solución alcohólica de lípidos y los volúmenes de cada una de las soluciones se ajusta de forma tal que, luego de la combinación, el contenido resultante de alcohol sea de alrededor de 20% en volumen hasta alrededor de 45% en volumen. El método de combinación de las mezclas puede incluir uno cualquiera de una variedad de procesos, lo que generalmente depende de la escala de formulación producida. Por ejemplo, cuando el volumen total es de alrededor de 10-20 mL o menos, las soluciones se pueden combinar en un tubo de ensayo y agitarse entre si usando un mezclador vórtex. Los procesos a gran escala se pueden llevar a cabo en cristalerías a escala de producción adecuadas.
Opcionalmente, los complejos de agente terapéutico encapsulado en lípido (por ej . ácido nucleico) que se producen combinando la mezcla lipidica y a la solución acuosa tamponada de los agentes terapéuticos (ácidos nucleicos) se les puede ajustar el tamaño para lograr un rango de tamaño deseado y una distribución relativamente reducida de los tamaños de partículas lipídicas. Preferentemente, a las composiciones proporcionadas en la presente se les ajustará el tamaño para que tenga un diámetro promedio desde alrededor de 70 hasta alrededor de 200 nm, más preferentemente alrededor de 90 hasta alrededor de 130 nm. Existen diversas técnicas para ajustar el tamaño de los liposomas a un tamaño deseado. Un método de ajuste de tamaño se describe en la patente estadounidense N° 4, 737, 323, que se incorpora a la presente a modo de referencia. La sonicación de una suspensión de liposoma ya sea por sonicación con baño o sonda produce una reducción progresiva de tamaño hasta vesículas pequeñas unilaminares (SUV) menor de alrededor de 0,05 micrones de tamaño. La homogeneización es otro método que depende de la energía de cizallamiento para fragmentar grandes liposomas en unos más pequeños. En un procedimiento típico de homogeneización, las vesículas multilaminares se hacen recircular a través de un homogeneizador de emulsión estándar hasta que se observan tamaños de liposoma seleccionados, típicamente entre alrededor de 0,1 y 0,5 micrones. En ambos métodos, la distribución del tamaño de partícula se puede monitorear por determinación de tamaño de partícula de rayo láser. Para algunos métodos de la presente, se utiliza la extrusión para obtener un tamaño de vesícula uniforme.
La extrusión de composiciones de liposoma a través de una membrana de policarbonato de poro pequeño o una membrana de cerámica asimétrica da como resultado una distribución de tamaño relativamente bien definida. Típicamente, la suspensión se cicla a través de la membrana una o más veces hasta que se logra el tamaño de distribución del complejo de liposoma deseado. Los liposomas pueden extruirse haciéndolos pasar sucesivamente por membranas de poro más pequeño, para lograr una reducción gradual en el tamaño del liposoma. En algunos casos, las composiciones de ácido nucleico-lípido que se forman pueden utilizarse sin realizarle ningún ajuste a su tamaño .
En modalidades particulares, los métodos de la presente invención comprenden además un paso de neutralizar al menos alguna de las cargas de superficie en las porciones lipídicas de las composiciones de ácido nucleico-lípido . Al neutralizar al menos parcialmente las cargas de superficie, el ácido nucleico no encapsulado se libera de la superficie de partícula lipídica y se puede eliminar de la composición utilizando técnicas convencionales. Preferentemente, los ácidos nucleicos no encapsulados y absorbidos en la superficie se quitan de las composiciones resultantes a través del intercambio de soluciones tamponadas . Por ejemplo, el reemplazo de un amortiguador de citrato (pH de alrededor de 4,0, utilizado para formar las composiciones) con una solución salina tamponada HEPES (HBS con un pH de alrededor de 7,5), da como resultado la neutralización de la superficie de liposoma y la liberación de ácido nucleico de la superficie. El ácido nucleico liberado puede luego quitarse por medio de cromatografía usando métodos estándar y luego puede transformarse en un amortiguador con un pH por encima del pKa del lípido utilizado.
Opcionalmente las vesículas lipídicas (es decir, partículas lipídicas) se pueden formar por hidratación en un amortiguador acuoso y se les puede ajusfar el tamaño utilizando cualquiera de los métodos descritos anteriormente antes de la adición de ácido nucleico. Tal como se describe anteriormente, el amortiguador acuoso debería ser de un pH menor al pKa del amino lípido. Luego, puede agregarse una solución de los ácidos nucleicos a estas vesículas formadas previamente, con tamaño ajustado. Para permitir la encapsulación de ácidos nucleicos en tales vesículas "previamente formadas", la mezcla debería contener un alcohol tal como etanol. En el caso de etanol, debería estar presente en una concentración de alrededor de 20% (p/p) a alrededor de 45% (p/p) . Además, puede ser necesario calentar la mezcla de vesículas previamente formadas y ácido nucleico en la mezcla acuosa de amortiguador-etanol a una temperatura de alrededor de 25°C hasta alrededor de 50°C dependiendo de la composición de las vesículas lipídicas y la naturaleza del ácido nucleico. Será evidente para el experto en la técnica que la optimización del proceso de encapsulación para lograr un nivel deseado de ácido nucleico en las vesículas lipídicas requerirá de la manipulación de variables tales como concentración de etanol y temperatura. En la sección Ejemplos se proporcionan ejemplos de condiciones adecuadas para la encapsulación de ácido nucleico. Una vez que los ácidos nucleicos se encapsulan dentro de las vesículas previamente formadas, el pH externo puede aumentarse para neutralizar al menos parcialmente la carga de la superficie.
Los ácidos nucleicos no encapsulados y adsorbidos por la superficie pueden entonces eliminarse como se describe anteriormente .
Método de uso Las partículas lipidicas de la presente invención pueden utilizarse para administrar un agente terapéutico a una célula, in vitro o in vivo. En modalidades particulares, el agente terapéutico es un ácido nucleico que se administra a una célula usando partículas lipidicas de ácido nucleico de la presente invención. Si bien la siguiente descripción de diversos métodos de utilizar las partículas lipidicas y composiciones farmacéuticas relacionadas de la presente invención son ejemplificadas por medio de una descripción relacionada con partículas lipidicas de ácido nucleico, se entiende que estos métodos y composiciones se pueden adaptar fácilmente para la entrega de cualquier agente terapéutico para el tratamiento de cualquier enfermedad o trastorno que se vería beneficiada por dicho tratamiento.
En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para introducir un ácido nucleico en una célula. Los ácidos nucleicos preferidos para la introducción en células son siRNA, oligonucleótidos inmunoestimuladores, plásmidos, antisentidos y ribosomas. Estos métodos se pueden llevar a cabo poniendo en contacto las partículas o composiciones de la presente invención con las células por un período de tiempo suficiente para que ocurra la administración intracelular .
Las composiciones de la presente invención pueden ser adsorbidas a cualquier tipo de célula. Una vez adsorbidas, las partículas de ácido nucleico-lípido pueden ser endocitadas por una porción de las células, intercambio de lípidos con membranas celulares o fusión con las células. La transferencia o incorporación de la porción de ácido nucleico del complejo puede tener lugar por medio de cualquiera de estas sendas. Sin pretender limitarse con respecto al alcance de la invención, se cree que en el caso de las partículas capturadas en la célula por endocitosis las partículas interactúan entonces con la membrana endosomal, lo que da como resultado la desestabilización de la membrana endosomal, posiblemente por la formación de fases que no son bicapa, lo que da como resultado la introducción del ácido nucleico encapsulado en el citoplasma celular. De manera similar, en el caso de fusión directa de las partículas con la membrana plasmática celular, cuando ocurre la fusión, la membrana de liposoma está integrada en la membrana celular y los contenidos del liposoma combinados/se combinan con el fluido intracelular. El contacto entre las células y las composiciones de ácido nucleico-lípido, cuando se llevan a cabo in vitro, tendrá lugar en un medio biológicamente compatible. La concentración de las composiciones puede variar ampliamente dependiendo de la aplicación particular, pero es generalmente alrededor de 1 pmol y alrededor de 10 mmol. En ciertas modalidades, el tratamiento de las células con las composiciones de ácido nucleico-lípido generalmente se llevará a cabo a temperaturas fisiológicas (alrededor de 37°C) por períodos de tiempo desde alrededor de 1 a 24 horas, preferentemente desde alrededor de 2 hasta 8 horas. Para las aplicaciones in vitro, la administración de ácidos nucleicos puede ser a cualquier célula que crece en cultivo, ya sea de origen vegetal o animal, vertebrado o invertebrado y de cualquier tejido o tipo. En modalidades preferidas, las células serán células animales, más preferentemente células de mamífero y aun más preferentemente células de humano.
En un grupo de modalidades, una suspensión de partícula de ácido nucleico-lipídica se agrega a 60-80% de células confluentes colocadas en placas que tienen una densidad celular de alrededor de 103 a alrededor de 105 células/mL, más preferentemente alrededor de 2 ? 104 células/mL. La concentración de la suspensión agregada a las células es preferentemente de alrededor de 0,01 a 20 pg/mL, más preferentemente alrededor de 1 pg/mL.
En otra modalidad, las partículas lipídicas de la invención pueden ser utilizadas para administrar un ácido nucleico a una célula o línea celular (por ejemplo, una línea celular tumoral) . Los ejemplos no limitantes de tales lineas celulares incluyen: HELA (ATCC Cat N: CCL-2), KB (ATCC Cat N: CCL-17), HEP3B (ATCC Cat N: HB-8064), SKOV-3 (ATCC Cat N: HTB-77), HCT-116 (ATCC Cat N: CCL-247), HT-29 (ATCC Cat N: HTB-38), PC-3 (ATCC Cat N: CRL-1435), A549 (ATCC Cat N: CCL-185), MDA-MB-231 (ATCC Cat N: HTB-26) .
Las aplicaciones típicas incluyen utilizar procedimientos bien conocidos para proporcionar la administración intracelular de siRNA para interferir o silenciar objetivos celulares específicas. Alternativamente, las aplicaciones incluyen la administración de secuencias de DNA o mRNA que codifican polipéptidos terapéuticamente útiles. De esta forma, se proporciona tratamiento para enfermedades genéticas por medio del suministro de productos deficientes en genes o que carecen de genes (es decir, para distrofia de Duchenne, véase Kunkel, et al., Brit. Med. Bull. 45 (3) : 630-643 (1989) y para fibrosis quística véase Goodfello , Nature 341:102-103 (1989)). Otros usos para las composiciones de la presente invención incluyen la introducción de ol igonucleótidos antisentido en células (véase, Bennett, et al., Mol. Pharm. 41:1023-1033 (1992)) .
Alternativamente, las composiciones de la presente invención también pueden ser utilizadas para la administración de ácidos nucleicos a células in vivo, usando métodos que son conocidos por los expertos en la técnica.
Con respecto a la administración de secuencias de DNA o mRNA, Zhu, et al., Science 261:209-211 (1993), incorporado a la presente a modo de referencia, describe la administración intravenosa de plásmido de expresión de citomegalovirus (CMV) -cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) usando complejos DOTMA-DOPE. Hyde, et al., Nature 362:250-256 (1993), incorporado a la presente a modo de referencia, describe la administración del gene regulador de conductancia de transmembrana de fibrosis quistica (CFTR) al epitelio de las vias respiratorias y los alvéolos en el pulmón de ratones, usando liposomas. Brigham, et al., Am. J. Med. Sci . 298:278-281 (1989), incorporado a la presente a modo de referencia, describe la transfección in vivo de pulmones de ratones con un gene procariótico en funcionamiento que codifica la enzima intracelular, cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) . Por lo tanto, las composiciones de la invención se pueden utilizar en el tratamiento de enfermedades infecciosas.
Para la administración in vivo, las composiciones farmacéuticas se administran preferentemente de forma parenteral, es decir, de forma intraarticular, intravenosa, intraperitoneal , subcutánea o intramuscular. En modalidades particulares, las composiciones farmacéuticas se administran de forma intravenosa o intraperitoneal por una inyección en bolo. Por un ejemplo, véase Stadler, et al. patente estadounidense N° 5.286.634 que se incorpora a la presente a modo de referencia. La administración de ácido nucleico intracelular también ha sido discutida en Straubringer , et al., Methods in Enzymology, Academic Press, Nueva York. 101:512-527 (1983); Mannino, et al., Biotechniques 6:682-690 (1988); Nicolau, et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 6:239-271 (1989) y Behr, Acc . Chem. Res. 26:274-278 (1993) . Incluso otros métodos de administrar tratamientos basados en lipidos se describen en, por ejemplo, Rahman et al., patente estadounidense N° 3.993.754, Sears, patente estadounidense N° 4,145,410; Papahadj opoulos et al., patente estadounidense N° 4,235,871; Schneider, patente estadounidense N° 4,224,179; Lenk et al., patente estadounidense N° 4,522,803 y Fountain et al., patente estadounidense N° 4,588,578.
En otros métodos, las preparaciones farmacéuticas pueden ponerse en contacto con el tejido objetivo por medio de la aplicación directa de la preparación al tejido. La aplicación puede ser por procedimiento tópicos, "abiertos" o "cerrados". Por "tópico" se entiende la aplicación directa de la preparación farmacéutica a un tejido expuesto al ambiente, tal como la piel, orofaringe, canal auditivo externo y similares. Los procedimientos "abiertos" son aquellos procedimientos que incluyen hacer una incisión en la piel de un paciente y visualizar directamente el tejido subyacente al cual se aplican las preparaciones farmacéuticas. Esto se logra generalmente por un procedimiento quirúrgico, tal como una toracotomia para tener acceso a los pulmones, laparotomía abdominal para tener acceso a las visceras abdominales u otro enfoque quirúrgico directo al tejido objetivo. Los procedimientos "cerrados" son procedimientos invasivos donde los tejidos objetivo internos no se visualizan directamente pero se acceden medianía la inserción de instrumentos a través de heridas en la piel. Por ejemplo, las preparaciones se pueden administrar al peritoneo mediante lavado con aguja. Asimismo, las preparaciones farmacéuticas se pueden administrar a las meninges o a la médula espinal mediante infusión durante la punción lumbar seguido del posicionamiento apropiado del paciente según se practica comúnmente para la anestesia en la médula espinal u obtención der imágenes por metrazamida de la médula espinal. Alternativamente, las preparaciones se pueden administrar por medio de dispositivos endoscópicos .
Las composiciones de ácido nucleico-lípido también se pueden administrar en un aerosol inhalado hacia los pulmones (véase Brigham, et al., Am. J. Sci . 298 ( 4 ) : 278-281 (1989)) o por inyección directa al sitio de la enfermedad (Culver, Human Gene Therapy, aryAnn Liebert, Inc., Publishers, Nueva York. pp.70-71 (1994) ) .
Los métodos de la presente invención se pueden poner en práctica en una variedad de hospedadores . Los hospedadores preferidos incluyen especies mamiferas, tales como humanos, primates no humanos, perros, gatos, ganado, caballos, ovejas y similares.
Las dosis para las partículas de agente terapéutico-lípido de la presente invención dependerán de la relación del agente terapéutico al lípido y la opinión del médico que lo administra con base en la edad, peso y afección del paciente. En una modalidad, la presente invención proporciona un método para modular la expresión de un polinucleótido o polipéptido objetivo. Estos métodos generalmente comprenden poner en contacto una célula con una partícula lipídica de la presente invención que está asociada con un ácido nucleico capaz de modular la expresión de un polinucleótido o polipéptido objetivo. Tal como se usa en la presente, el término "modular" se refiere a alterar la expresión de un polinucleótido o polipéptido objetivo. En modalidades diferentes, modular puede significar aumentar o mejorar, o puede significar disminuir o reducir. Los métodos para medir el nivel de expresión de un polinucleótido o polipéptido objetivo son conocidos y están disponibles en la técnica e incluyen, por ej . , métodos que utilizan transcripción inversa-reacción en cadena de polimerasa (RT-PCR) y técnicas inmunohistoquímicas . En modalidades particulares, el nivel de expresión de un polinucleótido o polipéptido objetivo se aumenta o reduce en al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50% o más que 50% en comparación con un valor de control adecuado.
Por ejemplo, si se desea la expresión aumentada de un polipéptido, el ácido nucleico puede ser un vector de expresión que incluye un polinucleótido que codifica el polipéptido deseado. Por otro lado, si se desea la expresión reducida de un polinucleótido o polipéptido, entonces el ácido nucleico puede ser, por e . , un oligonucleótido antisentido, siRNA, o micro RNA que comprenden una secuencia de polinucleótido que se híbrida específicamente a un polinucleótido que codifica el polipéptido objetivo, alterando así la expresión del polinucleótido o polipéptido objetivo. Alternativamente, el ácido nucleico puede ser un plásmido que expresa tal oligonucleótido antisentido, siRNA o micro RNA.
En una modalidad particular, la presente invención proporciona un método para modular la expresión de un polipéptido por una célula, que comprende proporcionar a la célula una partícula lipídica que consiste en o consiste básicamente en un lípido elegido de la Tabla 1, DSPC, Col y PEG-DMG o PEG-DMA, por ej . , en una relación molar de alrededor de 20-60% de lípido catiónico: 5-25% de DSPC: 25-55% de Col: 0.5-15% de PEG-DMG o PEG-DMA, donde la partícula lipídica está asociada con un ácido nucleico capaz de modular la expresión del polipéptido. En modalidades particulares, la relación lipídica molar es aproximadamente 40/10/40/10 (mol% de lipido catiónico/DSPC/Col/PEG-DMG o PEG-DMA) , 35/15/40/10 (mol% de lipido catiónico/DSPC/Col/PEG-DMG o PEG-DMA) o 52/13/30/5 (mol% de lipido catiónico/DSPC/Col/PEG-DMG o PEG-DMA) . En otro grupo de modalidades, el lipido neutro en estas composiciones se reemplaza con POPC, DPPC, DOPE o SM.
En modalidades particulares, el agente terapéutico se selecciona de un siRNA, un micro RNA, un oligonucleótido antisentido y un plásmido capaz de expresar un siRNA, un micro RNA o un oligonucleótido antisentido y donde el siRNA, el micro RNA o el oligonucleótido antisentido comprenden un polinucleótido que se une específicamente a un polinucleótido que codifica el polipéptido, o un complemento del mismo, de manera tal que se reduce la expresión del polipéptido.
En otras modalidades, el ácido nucleico es un plásmido que codifica el polipéptido o una variante funcional o un fragmento del mismo, de manera tal que se aumenta la expresión del polipéptido o la variante funcional o un fragmento del mismo.
En modalidades relacionadas, la presente invención proporciona un método para tratar una enfermedad o trastorno caracterizados por la sobreexpresión de un polipéptido en un sujeto, que comprende proporcionar al sujeto una composición farmacéutica de la presente invención, donde el agente terapéutico se selecciona de un siRNA, un micro RNA, un oligonucleótido antisentido y un plásmido capaces de expresar un siRNA, un micro RNA o un oligonucleótido antisentido, y donde el siRNA, el micro RNA o el RNA antisentido comprenden un polinucleótido que se une específicamente a un polinucleótido que codifica el polipéptido o un complemento del mismo.
En una modalidad, la composición farmacéutica comprende una partícula lipídica que consiste en o consiste esencialmente en un lípido elegido de la Tabla 1, DSPC, Col y PEG-DMG o PEG-D A, por ej . , en una relación molar de alrededor de 20-60% de lípido catiónico: 5-25% de DSPC: 25-55% de Col: 0.5-15% de PEG-DMG o PEG-DMA, donde la partícula lipídica está asociada con el ácido nucleico terapéutico. En modalidades particulares, la relación lipídica molar es aproximadamente 40/10/40/10 (mol% de lípido catiónico/DSPC/Col/PEG-DMG o PEG-DMA) , 35/15/40/10 (mol% de lípido catiónico/DSPC/Col/PEG-DMG o PEG-DMA) o 52/13/30/5 (mol% de lípido catiónico/DSPC/Col/PEG-DMG o PEG-DMA) . En otro grupo de modalidades, el lípido neutro en estas composiciones se reemplaza con POPC, DPPC, DOPE o SM.
En otra modalidad relacionada, la presente invención incluye un método para tratar una enfermedad o trastorno caracterizados por la subexpresión de un polipéptido en un sujeto, que comprende proporcionar al sujeto la composición farmacéutica de la presente invención, donde el agente terapéutico es un plásmido que codifica el polipéptido o un fragmento o variante funcional del mismo.
En una modalidad, la composición farmacéutica comprende una partícula lipídica que consiste en o consiste esencialmente en un lípido elegido de la Tabla 1, DSPC, Col y PEG-DMG o PEG-DMA, por ej . , en una relación molar de alrededor de 20-60% de lípido catiónico: 5-25% de DSPC: 25-55% de Col: 0.5-15% de PEG-DMG o PEG-DMA, donde la partícula lipídica está asociada con el ácido nucleico terapéutico. En modalidades particulares, la relación lipídica molar es aproximadamente 40/10/40/10 (mol% de lípido catiónico/DSPC/Col/PEG-DMG o PEG-DMA), 35/15/40/10 (mol de lípido catiónico/DSPC/Col/PEG-DMG o PEG-DMA) o 52/13/30/5 (mol% de lípido catiónico/DSPC/Col/PEG-DMG o PEG-DMA) . En otro grupo de modalidades, el lípido neutro en estas composiciones se reemplaza con POPC, DPPC, DOPE o SM.
La presente invención proporciona adicionalmente un método para inducir una respuesta inmunológica en un sujeto que comprende proporcionarle al sujeto la composición farmacéutica de la presente invención donde el agente terapéutico es un oligonucleótido inmunoestimulador En algunas modalidades, la respuesta inmunológica es una respuesta inmunológica humoral o mucosa. En una modalidad, la composición farmacéutica comprende una partícula lipídica que consiste en o consiste esencialmente en un lípido elegido de la Tabla 1, DSPC, Col y PEG-DMG o PEG-DMA, por ej . , en una relación molar de alrededor de 20-60% de lípido catiónico: 5-25% de DSPC: 25-55% de Col: 0.5-15% de PEG-DMG o PEG-DMA, donde la partícula lipídica está asociada con el ácido nucleico terapéutico. En modalidades particulares, la relación lipídica molar es aproximadamente 40/10/40/10 (mol% de lípido catiónico/DSPC/Col/PEG-DMG o PEG-DMA), 35/15/40/10 (mol% de lípido catiónico/DSPC/Col/PEG-DMG o PEG-DMA) o 52/13/30/5 (mol'% de lípido catiónico/DSPC/Col/PEG-DMG o PEG-DMA) . En otro grupo de modalidades, el lípido neutro en estas composiciones se reemplaza con POPC, DPPC, DOPE o SM.
En modalidades adicionales, se proporciona la composición farmacéutica al paciente en combinación con una vacuna o antígeno. Por lo tanto, la presente invención en sí misma proporciona vacunas que comprenden una partícula lipídica de la presente invención, que comprende un oligonucleótido inmunoestimulador y también está asociada con un antígeno del cual se desea una respuesta inmunológica . En modalidades particulares, el antígeno es un antígeno tumoral o está asociado con un agente infeccioso, tal como, por ej . , un virus, una bacteria o un parásito.
En la técnica es bien conocida una variedad de antígenos tumorales, antígenos de agentes infecciosos y antígenos asociados con otra enfermedad y los ejemplos de estos se describen en las referencias citadas en la presente. Los ejemplos de antígenos adecuados para su uso en la presente invención incluyen, pero no se limitan a, antigenos polipeptidicos y antigenos de DNA. Los ejemplos específicos de antígenos son antígenos de Hepatitis A, Hepatitis B, viruela, polio, ántrax, gripe, tifus, tétanos, sarampión, rotavirus, difteria, tos ferina, tuberculosis y rubéola. En una modalidad preferida, el antígeno es un antígeno recombinante de Hepatitis B. En otros aspectos, el antígeno es un antígeno recombinante de Hepatitis A. En otro aspecto, el antígeno es un antígeno tumoral. Los ejemplos de tales antígenos asociados con tumores son antígeno MUC-1, EBV y antígenos asociados con linfoma de Burkitt. En un aspecto adicional, el antígeno es un antígeno recombinante antígeno de proteína tumoral relacionado con tirosinasa. Los expertos en la técnica conocerán otros antígenos adecuados para su uso en la presente invención.
Los antígenos asociados con tumores adecuados para su uso en la presente invención incluyen moléculas mutadas o no mutadas que pueden indicar un único tipo de tumor, compartido entre diferentes tipos de tumores y/o expresados o sobreexpresados exclusivamente en células tumorales en comparación con células normales. Además de las proteínas y glicoproteínas , también se han documentado patrones de expresión específicos de tumor de carbohidratos, gangliósidos, glucolípidos y mucinas. Los antígenos asociados a ejemplos de tumores para usarse en las vacunas en cuestión contra el cáncer incluyen productos de proteina de oncógenos, genes supresores tumorales y otros genes con mutación o nuevas disposiciones únicas a las células tumorales, productos genéticos embriónicos reactivados, antigenos oncofetales, antigenos de diferenciación específicos del tejido (pero no específicos del tumor), receptores del factor de crecimiento, residuos de carbohidrato de superficie celular, proteínas virales externas y una cantidad de otras auto-proteínas.
Las modalidades específicas de antígenos asociados con tumores incluyen, por ej . , antígenos mutados tales como los productos de proteína del protoncogene Ras p21, supresor de tumor p53 y oncogene BCR-abl, así como CDK4, MUM1, Caspasa 8 y beta catenina; antígenos sobreexpresados tales como galectina 4, galectina 9, anhidrasa carbónica, Aldolasa A, PRAME, Her2/neu, ErbB-2 y KSA, antígenos oncofetales tales como alfa fetoproteína (AFP) , gonadotrofina coriónica humana (hCG) ; autoantígenos tales como antígeno carcinoembriónico (CEA) y antígenos de diferenciación de melanocito tales como Mart 1/ elan A, gplOO, gp75, Tirosinasa, TRP1 y TRP2; antígenos asociados con la próstata tales como PSA, PAP, PSMA, PSM-P1 y PSM-P2; productos genéticos embriónicos reactivados tales como MAGE 1, MAGE 3, MAGE 4, GAGE 1, GAGE 2, BAGE, RAGE y otros antígenos de cáncer testicular tales como NY-ES01, SSX2 y SCP1; mucinas tales como Muc-1 y Muc-2; gangliosidos tales como GM2, GD2 y GD3, glicolípidos y glicoproteínas neutras tales Lewis (y) y globo-H y glicoproteinas tales como Tn, antigeno Thompson-Freidenreich (TF) y sTn. En la presente también se incluyen como antigenos asociados a tumor, lisados celulares completos y celulares tumorales asi como porciones inmunogénicas de los mismos, asi como idiotipos de inmunoglobulina expresados en proliferaciones monoclonales de linfocitos B para su uso contra linfomas de linfocitos B.
Los patógenos incluyen, pero no se limitan a, agentes infecciosos, por ej . , virus que infectan mamíferos y más particularmente humanos. Los ejemplos de virus infecciosos incluyen, pero no se limitan a: Retroviridae (por ej . , virus de inmunodeficiencia humana, tales como HIV-1 (también llamado HTLV-III, LAV or HTLV-III/LAV o HIV-III y otras cepas víricas aisladas, tales como HIV-LP; Picornaviridae (ej, virus de polio, virus de hepatitis A; enterovirus, virus de Coxsackie humano, rinovirus, ecovirus) ; Calciviridae (por ej . , cepas que causan gastroenteritis); Togaviridae (ej, virus de encefalitis equina, virus de la rubéola) ; Flaviridae (ej, virus del dengue, virus de la encefalitis, virus de la fiebre amarilla); Coronoviridae (ej, coronavirus); Rhabdoviradae (ej, virus de la estomatitis vesicular, virus de la rabia); Coronaviridae (ej, coronavirus); Rhabdoviridae (ej, virus de la estomatitis vesicular, virus de la rabia); Filoviridae (ej, virus del Ébola) ; Paramyxoviridae (ej, virus paragripal, virus de las paperas, virus del sarampión, virus sincicial respiratorio); Orthomyxoviridae (ej, virus de la gripe); Bungaviridae (ej, virus de Hantaan, bungavirus, flebovirus y Nairovirus) ; Arena viridae (virus de fiebre hemorrágica) ; Reoviridae (ej, reovirus, orbiviurs y rotavirus) ; Birnaviridae; Hepadnaviridae (virus de la Hepatitis B) ; Parvovirida (parvovirus) ; Papovaviridae (virus del papiloma, virus del poliomas); Adenoviridae (mayoría de los adenovirus) ; Herpesviridae virus de herpes simple (HSV) 1 y 2, virus de la varicela zóster, citomegalovirus (CMV) , herpes virus; Poxviridae (virus de la viruela, virus vacuna, virus de la varicela) e Iridoviridae (ej, virus de la fiebre porcina africana) y virus no clasificados (ej, los agentes etiológicos de las encefalopatías espongiforme, el agente delta hepatitis (que se cree es un satélite defectuoso del virus de la hepatitis B) , los agentes de hepatitis que no es A ni B (clase l=trasmitidos internamente; clase 2=transmitidos parenteralmente (es decir, Hepatitis C) ; virus Norwalk y virus relacionados y astrovirus) .
Las bacterias gram negativas y gram positivas también sirven como antígenos en animales vertebrados. Tales bacterias gram positivas incluyen, pero no se limitan al género Pasteurella, género Staphylococci y género Streptococcus . Las bacterias gram negativas incluyen, pero no se limitan Escherichia coli, género Pseudomonas y género Salmonella. Los ejemplos específicos de bacterias infecciosas incluyen, pero no se limitan a: Helicobacterpyloris, Borelia burgdorferi, Legionella pneumophilia , ycobacteria sps (ej, M. tuberculosis, M. avium, . intracellulare, M. kansaii, M. gordonae) , Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis , Listeria monocytogenes , Streptococcus pyogenes (Streptococcus del grupo A) , Streptococcus agalactiae (Streptococcus del grupo B) , Streptococcus (grupo viridans), Streptococcusfaecalis, Streptococcus bovis, Streptococcus (anaerobio sps.)? Streptococcus pneumoniae, pathogenic Campylobacter sp., Enterococcus sp., Haemophilus infuenzae, Bacillus antracis, corynebacterium diphtheriae, corynebacterium sp . , Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringers, Clostridium tetani, Enterobacter aerogenes, Klebsiella pneumoniae, Pasturella multocida, Bacteroides sp., Fusobacterium nucleatum, Streptobacillus moniliformis, Treponema pallidium, Treponema pertenue, Leptospira, Rickettsia y Actinomyces israelli.
Ejemplos adicionales de patógenos incluyen, pero no se limitan a, hongos infecciosos que infectan mamíferos y más particularmente humanos. Los ejemplos de hongos infecciosos incluyen, pero no se limitan a: Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatitidis , Chlamydia trachomatis, Candida albicans. Los ejemplos de parásitos infecciosos incluyen Plasmodium tal como Plasmodium falciparum, Plasmodium malariae, Plasmodium ovale y Plasmodium vivax. Otros organismos infecciosos (es decir, protistas) incluyen Toxoplasma gondii.
En una modalidad, las formulaciones de la invención se pueden usar para silenciar o modular un gene objetivo tal como pero sin limitarse a FVII, Eg5, PCSK9, TPX2, apoB, SAA, TTR, RSV, gene PDGF beta, gene Erb-B, gene Src, gene CRK, gene GRB2, gene RAS, gene MEKK, gene JNK, gene RAF, gene Erkl/2, gene PCNA(p21), gene MYB, gene JUN, gene FOS, gene BCL-2, gene de la ciclina D, gene VEGF, gene EGFR, gene de la ciclina A, gene de la ciclina E, gene WNT-1, gene de la beta-catenina, gene c-MET, gene PKC, gene NFKB, gene STAT3, gene de survivina, gene Her2/Neu, gene SORT1, gene XBP1, gene de la topoisomerasa I, gene de la topoisomerasa II alfa, gene p73, gene p21 (WAFl/CIPl ) , gene p27(KIPl), gene PPM1D, gene RAS, gene de la caveolina I, gene MIB I, gene MTAI , gene M68, genes supresores tumorales, genes supresores tumorales p53, DN-p63 miembro de la familia p53, gene supresor tumoral pRb, gene supresor tumoral APC1, gene supresor tumoral BRCA1, gene supresor tumoral PTEN, gene de fusión mLL, gene de fusión BCR/ABL, gene de fusión TEL/AML1, gene de fusión EWS/FLI1, gene de fusión TLS/FUSl, gene de fusión PAX3/FKHR, gene de fusión AML1/ETO, gene alpha v-integrina, gene receptor Flt-1, gene tubulina, gene del virus de papiloma humano, un gene requerido para la replicación del virus del papiloma humano, gene del virus de inmunodeficiencia humano, un gene requerido para la replicación del virus de inmunodeficiencia humano, gene del virus de la Hepatitis A, un gene requerido para la replicación del virus de la Hepatitis A, gene del virus de la Hepatitis B, un gene requerido para la replicación del virus de la Hepatitis B, gene del virus de la Hepatitis C, un gene requerido para la replicación del virus de la Hepatitis C, gene del virus de la Hepatitis D, un gene requerido para la replicación del virus de la Hepatitis D, gene del virus de la Hepatitis E, un gene requerido para la replicación del virus de la Hepatitis E, gene del virus de la Hepatitis F, un gene requerido para la replicación del virus de la Hepatitis F, gene del virus de la Hepatitis G, un gene requerido para la replicación del virus de la Hepatitis G, gene del virus de la Hepatitis H, un gene requerido para la replicación del virus de la Hepatitis H, gene del virus sincicial respiratorio, un gene requerido para la replicación del virus sincicial respiratorio, gene del virus de herpes simple, un gene requerido para la replicación del virus de herpes simple, gene del herpes Citomegalovirus , un gene requerido para la replicación del herpes Citomegalovirus, gene del virus de herpes Epstein Barr, un gene requerido para la replicación del virus de herpes Epstein Barr, gene de herpesvirus asociado con el sarcoma de Kaposi, un gene requerido para la replicación del gene de herpesvirus asociado con el sarcoma de Kaposi, gene del virus JC, gene humano que es requerido para la replicación del virus JC, gene mixovirus, un gene que es requerido para la replicación del gene mixovirus, gene rinovirus, un gene que es requerido para la replicación del rinovirus, gene coronavirus, un gene que es requerido para la replicación del coronavirus, gene del virus West Nile, un gene que es requerido para la replicación del virus West Nile, gene de la encefalitis San Luis, un gene que es requerido para la replicación de la encefalitis de San Luis, gene del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, un gene que es requerido para la replicación de la encefalitis transmitida por garrapatas, gene del virus de la encefalitis Murray Valley, un gene que es requerido para la replicación del virus de la encefalitis Murray Valley, gene del virus del dengue, un gene que es requerido para la replicación del gene del virus del dengue, gene del virus 40 de simio, un gene que es requerido para la replicación del virus 40 de simio, gene del virus linfotrópico humano de células T, un gene que es requerido para la replicación del virus linfotrópico humano de células T, gene del virus de la leucemia murina de Moloney, un gene que es requerido para la replicación del virus de la leucemia murina de Moloney, gene del virus de la encefalomiocarditis, un gene que es requerido para la replicación del virus de la encefalomiocarditis, gene del virus del sarampión, un gene que es requerido para la replicación del virus del sarampión, gene del virus de varicela zóster, un gene que es requerido para la replicación del virus de la varicela zóster, gene adenovirus, un gene que es requerido para la replicación del adenovirus, gene del virus de la fiebre amarilla, un gene que es requerido para la replicación del virus de la fiebre amarilla, gene poliovirus, un gene que es requerido para la replicación del poliovirus, gene del virus de la varicela, un gene que es requerido para la replicación del virus de la varicela, gene de plasmodium, un gene que es requerido para la replicación del gene de plasmodium, gene Mycobacterium ulcerans, un gene que es requerido para la replicación del Mycobacterium ulcerans, gene Mycobacterium tuberculosis, un gene que es requerido para la replicación del Mycobacterium tuberculosis, gene Mycobacterium leprae, un gene que es requerido para la replicación del Mycobacterium leprae, gene Staphylococcus aureus, un gene que es requerido para la replicación del Staphylococcus aureus, gene Streptococcus pneumoniae, un gene que es requerido para la replicación del Streptococcus pneumoniae, gene Streptococcus pyogenes, un gene que es requerido para la replicación del Streptococcus pyogenes, gene Chlamydia pneumoniae, un gene que es requerido para la replicación del Chlamydia pneumoniae, gene Mycoplasma pneumoniae, un gene que es requerido para la replicación del Mycoplasma pneumoniae, un gene de integrina, un gene de selectina, gene de sistema de complemento, gene de quimiocina, gene del receptor de la quimiocina, gene GCSF, gene Grol, gene Gro2, gene Gro3, gene PF4, gene MIG, gene de la proteina básica proplaqueta, gene MIP-1I, gene IP-1J, gene RANTES, gene MCP-1, gene MCP-2, gene MCP-3, gene C BKR1 , gene CMBKR2, gene CMBKR3, CMBKR5v, gene AIF-1, gene 1-309, un gene para un componente de un canal iónico, un gene para un receptor de neurotransmisor, un gene para un ligando neurotransmisor, gene de la familia amiloide, gene de la presenilina, gene HD, gene DRPLA, gene SCA1, gene SCA2, gene MJD1, gene CACNL1A4, gene SCA7, gene SCA8, gene alelo encontrado en las células LOH o un gene alelo de un gene polimórfico .
Definiciones "Alquilo" significa un hidrocarburo alifático saturado, de cadena recta o ramificada, no cíclico o cíclico, que contiene de 1 a 24 átomos de carbono. Los alquilos saturados de cadena recta representativos incluyen metilo, etilo, n-propilo, n-butilo, n-pentilo, n-hexilo y similares; mientras que los alquilos ramificados saturados incluyen isopropilo, sec-butilo, isobutilo, ter-butilo, isopentilo y similares.
Los alquilos cíclicos saturados representativos incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y similares; mientras que los alquilos cíclicos no saturados incluyen ciclopentenilo y ciclohexenilo y similares.
"Alquenilo" significa un alquilo, según se definió anteriormente, que contiene al menos un doble enlace entre átomos de carbono adyacentes. Los alquenilos incluyen isómeros tanto cis como trans. Los alquenilos de cadena recta o ramificada representativos incluyen etilenilo, propilenilo, 1-butenilo, 2-butenilo, isobutilenilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, 3-metil-l-butenilo, 2-metil-2-butenilo, 2, 3-dimetil-2-butenilo y similares.
"Alquinilo" significa un alquilo o alquenilo, tal como se define anteriormente, que adicionalmente contiene al menos un enlace triple entre carbonos adyacentes. Los alquinilos de cadena recta o ramificada representativos incluyen acetilenilo, propinilo, 1-butinilo, 2-butinilo, 1-pentinilo, 2-pentinilo, 3-metil-l-butinilo y similares.
El término "acilo" se refiere a hidrógeno, alquilo, cicloalquilo parcialmente saturado o completamente saturado, heterociclo parcialmente saturado o completamente saturado, arilo y grupos carbonilo sustituidos por heteroarilo. Por ejemplo, acilo incluye grupos tales como alcanoilo (C1-C20) (por ej . , formilo, acetilo, propionilo, butirilo, valerilo, caproilo, t- butilacetilo, etc.), cicloalquilcarbonilo (C3- C20) (por ej . , ciclopropilcarbonilo, ciclobutilcarbonilo, ciclopentilcarbonilo, ciclohexilcarbonilo, etc.), carbonilo heterocíclico (por ej., pirrolidinilcarbonilo, pirrolid-2-ona-5 -carbonilo, piperidinilcarbonilo, piperazinilcarbonilo, tetrahidrofuranilcarbonilo, etc.), aroilo (por e . , benzoilo) y heteroarilo (por ej . , tiofenil-2-carbonilo, tiofenil-3-carbonilo, furanil-2-carbonilo, furanil-3-carbonilo, 1H-pirroi1-2 -carbonilo, lH-pirroil-3-carbonilo, benzo [b ] tiofenil-2-carbonilo, etc.) .
El término "arilo" se refiere a un sistema de anillos hidrocarburo aromático, monocíclico, biciclico o triciclico, donde cualquier átomo de anillo puede estar sustituido. Los ejemplos de porciones de arilo incluyen, pero no se limitan a, fenilo, naftilo, antracenilo y pirenilo.
"Heterociclo" significa un anillo heterocíclico monocíclico de 5 a 7 miembros o biciclico de 7 a 10 miembros, que está saturado, insaturado o es aromático y que contiene de 1 o 2 heteroátomos seleccionados independientemente a partir de nitrógeno, oxígeno y azufre y donde los heteroátomos de nitrógeno y azufre pueden estar opcionalmente oxidados y el heteroátomo de nitrógeno puede estar opcionalmente cuaternizado, incluyendo anillos bicíclicos en los cuales cualquiera de los heterociclos anteriores están fusionados a un anillo de benceno. El heterociclo puede estar unido por medio de un heteroátomo o átomo de carbono.
Los heterociclos incluyen heteroarilos tal como se definen a continuación. Los heterociclos incluyen morfolinilo, pirrolidinonilo, pirrolidinilo, piperidinilo, piperizinilo, hidantoinilo, valerolactamilo, oxiranilo, oxetanilo, tetrahidrofuranilo, tetrahidropiranilo, tetrahidropiridinilo, tetrahidroprimidinilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo, tetrahidropirimidinilo, tetrahidrotiofenilo, tetrahidrotiopiranilo y similares.
El término "heteroarilo" se refiere a un sistema de anillo aromático, monociclico de 5-8 miembros, biciclico de 8-12 miembros o triciclico de 11-14 miembros, que tiene 1-3 heteroátomos en caso de ser monociclico, 1-6 heteroátomos en caso de ser biciclico o 1-9 heteroátomos en caso de ser triciclico, dichos heteroátomos se seleccionan de O, N o S (por e . átomos de carbono y 1-3, 1-6 o 1-9 heteroátomos de N, O o S en caso de ser monociclico, biciclico o triciclico, respectivamente) donde cualquier átomo del anillo puede estar sustituido. Los grupos heteroarilo descritos en la presente también pueden contener anillos fusionados que comparten un enlace carbono-carbono común. El término "alquilheterociclo" se refiere a un heteroarilo donde al menos uno de los átomos del anillo está sustituido con alquilo, alquenilo o alquinilo .
El término "sustituido" se refiere al reemplazo de uno o más radicales de hidrógeno en una estructura dada por el radical de un sustituyente especificado que incluye, pero no se limita a: halo, alquilo, alquenilo, alquinilo, arilo, heterociclilo, tiol, alquiltio, oxo, tioxi, ariltio, alquiltioalquilo, ariltioalquilo, alquilsulfonilo, alquilsulfonilalquilo, arilsulfonilalquilo, alcoxi, ariloxi, aralcoxi, aminocarbonilo, alquilaminocarbonilo, arilaminocarbonilo, alcoxicarbonilo, ariloxicarbonilo, haloalquilo, amino, trifluorometilo, ciano, nitro, alquilamino, arilamino, alquilaminoalquilo, arilaminoalquilo, aminoalquilamino, hidroxi, alcoxialquilo, carboxialquilo, alcoxicarbonilalquilo, aminocarbonilalquilo, acilo, aralcoxicarbonilo, ácido carboxilico, ácido sulfónico, sulfonilo, ácido fosfónico, arilo, heteroarilo, heterocíclico y alifático. Se entiende que el sustituyente puede estar sustituido adicionalmente . Los ejemplos de sustituyentes incluyen amino, alquilamino, dialquilamino y compuestos cíclicos de amino.
"Halógeno" significa fluoro, cloro, bromo y yodo.
Los términos "alquilamina" y "dialquilamina" se refieren a radicales -NH (alquilo) y -N (alquilo) 2 respectivamente.
El término "alquilfosfato" se refiere a -O-P (Q' ) (Q") -0-R, donde Q' y Q" son cada una independientemente 0, S, N(R)2, alquilo o alcoxi opcionalmente sustituido; y R es alquilo opcionalmente sustituido, ?-aminoalquilo o ?-aminoalquilo sustituido.
El término "alquilfosforotioato" se refiere a un alquilfosfato donde al menos uno de Q' o Q" es S.
El término "alquilfosfonato" se refiere a un alquilfosfato donde al menos uno de Q' o Q" es alquilo.
El término "hidroxialquilo" significa un radical -O-alquilo .
El término "alquilheterociclo" se refiere a un alquilo donde al menos un metileno ha sido remplazado por un heterociclo.
El término "?-aminoalquilo" se refiere a un radical -alquil-NH2. Y el término "?- (sustituido) aminoalquilo" se refiere a un ?-aminoalquil donde al menos uno de H o N han sido remplazados por alquilo.
El término "?-fosfoalquilo" se refiere a -alquil-O-P (Q' ) (Q" ) -O-R, donde Q' y Q" son cada una independientemente O o S y R alquilo opcionalmente sustituido.
El término "?-tiofosfoalquilo " se refiere a ?-fosfoalquilo donde al menos uno de Q' o Q" es S.
En algunas modalidades, los métodos de la invención pueden requerir el uso de grupos protectores. La metodología de los grupos protectores es bien conocida para los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Protective Groups in Organic Synthesis, Green, T.W. et. al., iley-Interscience, Nueva York, 1999) . Brevemente, los grupos protectores dentro del contexto de esta invención son cualquier grupo que reduce o elimina la reactividad no deseada de un grupo funcional. Un grupo protector puede agregarse a un grupo funcional para enmascarar su reactividad durante algunas reacciones y luego quitarse para revelar el grupo funcional original. En algunas modalidades, se usa un "grupo protector alcohólico". Un "grupo protector alcohólico" es cualquier grupo que reduce o elimina la reactividad no deseada de un grupo funcional alcohólico. Los grupos protectores se pueden agregar y quitar usando técnicas bien conocidas en el arte.
Los compuestos de la presente invención se pueden preparar por técnicas de síntesis orgánicas conocidas, incluyendo los métodos descritos en más detalle en los Ejemplos.
Ejemplos E emplo 1 : Síntesis de éster octadeca-9, 12-dienílico de ácido metanosulfónico 2 Esquema 1 7 A una solución del alcohol 1 (26.6 g, 100 mmol) en diclorometano (100 mL) , se agregó trietilamina (13.13 g, 130 mmol) y la solución se enfrió en un baño de hielo. A esta solución fría, se agregó una solución de cloruro de mesilo (12.6 g, 110 mmol) en diclorometano (60 mL) gota a gota y luego de completar la adición, la mezcla de reacción se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se agitó durante la noche. La TLC de la mezcla de reacción mostró que la reacción se completó. La mezcla de reacción se diluyó con diclorometano (200 mL) , lavó con agua (200 mL) , NaHC03 saturado (200 mL) , salmuera (100 mL) y (NaS04) seco. La capa orgánica se concentró para obtener el producto crudo que se purificó por cromatografía en columna (gel de sílice) usando 0-10% de Et20 en hexanos . Las fracciones de producto puro se combinaron y concentraron para obtener el producto puro 2 como un aceite incoloro (30.6 g, 89%) . 1ti NMR (CDC13, 400 MHz) d = 5.42-5.21 (m, 4H) , 4.20 (t, 2H) , 3.06 (s, 3H) , 2.79 (t, 2H) , 2.19-2.00 (m, 4H) , 1.90-1.70 (m, 2H) , 1.06-1.18 (m, 18H), 0.88 (t, 3H) . 13C NMR (CDC13) d = 130.76, 130.54, 128.6, 128.4, 70.67, 37.9, 32.05, 30.12, 29.87, 29.85, 29.68, 29.65, 29.53, 27.72, 27.71, 26.15, 25.94, 23.09, 14.60. MS . Peso molecular calculado para C19H315O3S, Cal. 344.53, Encontrado 343.52 (M-H~) .
Síntesis de 18-Bromo-octadeca-6, 9-dieno 3 El mesilato 2 (13.44 g, 39 mmol ) se disolvió en éter anhidro (500 mL) y a eso se agregó el complejo MgBr.Et20 (30.7 g, 118 mmol) en argón y la mezcla se sometió a reflujo en argón durante 26 h luego de lo cual la TLC mostró que se completó la reacción. La mezcla de reacción se diluyó con éter (200 mL) y se agregó agua enfriada con hielo (200 mL) a esta mezcla y las capas se separaron. La capa orgánica se lavó con 1% de K2C03 acuoso (100 mL) , salmuera (100 mL) y se secó (Na2S04 anhidro) . La concentración de la capa orgánica proporcionó el producto crudo que se purificó adicionalmente por cromatografía en columna (gel de sílice) usando 0-1% de Et2Ü en hexanos para aislar el bromuro 3 (12.6 g, 94 %) como un aceite incoloro. XH NMR (CDC13, 400 MHz) d = 5.41-5.29 (m, 4H), 4.20 (d, 2H), 3.40 (t, J = 7 Hz, 2H) , 2.77 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 2.09-2.02 (m, 4H) , 1.88-1.00 (m, 2H) , 1.46-1.27 (m, 18H), 0.88 (t, J = 3.9 Hz, 3H) . 13C NMR (CDC13) d = 130.41, 130.25, 128.26, 128.12, 34.17, 33.05, 31.75, 29.82, 29.57, 29.54, 29.39, 28.95, 28.38, 27.42, 27.40, 25.84, 22.79, 14.28.
Síntesis de 18-Ciano-octadeca-6, 9-dieno 4 A una solución del mesilato (3.44 g, 10 mmol) en etanol (90 mL) , se agregó una solución de KCN (1.32 g, 20 mmol) en agua (10 mL) y la mezcla se sometió a reflujo durante 30 min. luego de lo cual la TLC de la mezcla de reacción mostró que la reacción se había completado, luego de lo cual se agregó éter (200 mL) a la mezcla de reacción seguido de la adición de agua. La mezcla de reacción se extrajo con éter y las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua (100 mL) , salmuera (200 mL) y se secaron. La concentración de la capa orgánica proporcionó el producto crudo que se purificó por cromatografía en columna (0-10 % de Et20 en hexanos) . El producto puro 4 se aisló como un aceite incoloro (2 g, 74%). 1H NMR (CDCI3, 400 MHz) d = 5.33-5.22 (m, 4H), 2.70 (t, 2H) , 2.27-2.23 (m, 2H) , 2.00-1.95 (m, 4H) , 1.61-1.54 (m, 2H) , 1.39-1.20 (m, 18H) , 0.82 (t, 3H) . 13C NMR (CDCI3 ) d = 130.20, 129.96, 128.08, 127.87, 119.78, 70.76, 66.02, 32.52, 29.82, 29.57, 29.33, 29.24, 29.19, 29.12, 28.73, 28.65, 27.20, 27.16, 25.62, 25.37, 22.56, 17.10, 14.06. S . Peso molecular calculado para CieH33N, Cal. 275.47, Encontrado 276.6 (M-H~) .
Síntesis de Heptatriaconta-6, 9, 28, 31-tetraen-19-ona 7 A un matraz de fondo redondo con 2 cuellos secado a llama de 500 mL, se agregaron limaduras de Mg recién activadas (0.144 g, 6 mmol) y el matraz se equipó con una barra de agitación magnética y un condensador de reflujo. Este sistema se desgasificó, purgó con argón y se agregaron 10 mL de éter anhidro al matraz mediante una jeringa. El bromuro 3 (1.65 g, 5 mmol) se disolvió en éter anhidro (10 mL) y se agregó al matraz gota a gota mediante una jeringa. Se observó una reacción exotérmica (para confirmar /acelerar la formación de reactivo de Grignard, se agregaron 2 mg de yodo e inmediatamente se observó una decoloración que confirmó la formación del reactivo de Grignard) y el éter comenzó el reflujo. Luego de completar la adición la mezcla de reacción se mantuvo a 35 °C durante 1 h y luego se enfrió en baño de hielo. El cianuro 4 (1.38 g, 5 mmol) se disolvió en éter anhidro (20 mL) y se agregó gota a gota a la mezcla de reacción con agitación. Se observó una reacción exotérmica y la mezcla de reacción se agitó durante ' la noche a temperatura ambiente. La reacción se extinguió mediante la adición de 10 mL de acetona gota a gota seguido por agua enfriada con hielo (60 mL) . La mezcla de reacción se trató con H2S04 acuoso (10 % en volumen, 200 mL) hasta que la solución se homogeneizó y las capas se separaron. La fase acuosa se extrajo con éter (2x100 mL) . Las capas de éter combinadas se secaron (Na2S04) y concentraron para obtener el producto crudo que se purificó por cromatografía en columna (gel de sílice, 0-10% de éter en hexanos) . Las fracciones de producto puro se evaporaron para proporcionar la cetona pura 7 como un aceite incoloro (2 g, 74%) . XH NMR (CDCI3, 400 MHz) d = 5.33-5.21 (m, 8H) , 2.69 (t, 4H) , 2.30 (t, 4H) , 2.05-1.95 (m, 8H), 1.55-1.45 (m, 2H) , 1.35-1.15 (m, 18H) , 0.82 (t, 3H) . 13C NMR (CDCI3) d = 211.90, 130.63, 130.54, 128.47, 128.41, 43.27, 33.04, 32.01, 30.93, 29.89, 29.86, 29.75, 29.74, 27.69, 26.11, 24.35, 23.06, 14.05. MS . Peso molecular calculado para C37H660, Cal. 526.92, Encontrado 528.02 ( +H+) .
Ejemplo 2: Síntesis alternativa de la cetona 7 Esquema 2 Síntesis del compuesto 6b A un matraz de fondo redondo secado a llama de 500 mL, se agregaron limaduras de Mg recién activadas (2.4 g, 100 mmol) y el matraz se equipó con una barra de agitación magnética, un embudo de adición y un condensador de reflujo. Este sistema se desgasificó y purgó con argón y se agregaron 10 mL de éter anhidro al matraz mediante una jeringa. El bromuro 3 (26.5 g, 80.47 mmol) se disolvió en éter anhidro (50 mL) y se agregó al embudo de adición. Se agregó alrededor de 5 mL de esta solución de éter a las limaduras de Mg mientras que se agitó vigorosamente. Se observó una reacción exotérmica (para confirmar/acelerar la formación de reactivo de Grignard, se agregaron 5 mg de yodo e inmediatamente se observó una decoloración que confirmó la formación del reactivo de Grignard) y el éter comenzó el reflujo. El resto de la solución del bromuro se agregó gota a gota mientras se mantuvo la reacción a ligero reflujo al enfriar el matraz en agua. Luego de completar la adición la mezcla de reacción se mantuvo a 35 °C durante 1 h y luego se enfrió en baño de hielo. El formiato de etilo (2.68 g, 36.2 mmol) se disolvió en éter anhidro (40 mL) y se transfirió al embudo de adición y se agregó gota a gota a la mezcla de reacción con agitación. Se observó una reacción exotérmica y la mezcla de reacción comenzó el reflujo. Luego del inicio de la reacción el resto de la solución etérea de formiato se agregó rápidamente a chorros y la mezcla de reacción se agitó durante un periodo adicional de 1 h a temperatura ambiente. La reacción se extinguió mediante la adición de 10 mL de acetona gota a gota seguido por agua enfriada con hielo (60 mL) . La mezcla de reacción se trató con H2S04 acuoso (10 % en volumen, 300 mL) hasta que la solución se homogeneizó y las capas se separaron. La fase acuosa se extrajo con éter (2x100 mL) . Las capas de éter combinadas se secaron (Na2SO<) y concentraron para obtener el producto crudo que se purificó por cromatografía en columna (gel de sílice, 0-10% de éter en hexanos) . Las fracciones apenas menos polares se concentraron para obtener el formiato 6a (1.9 g) y las fracciones de producto puro se evaporaron para proporcionar el producto puro 6b como un aceite incoloro (14.6 g, 78%) .
Síntesis del compuesto 7 A una solución del alcohol 6b (3 g, 5.68 mmol) en CH2CI2 (60 mL), se agregaron tamices moleculares 4 A recién activados (50 g) y a esta solución se agregó PCC en polvo (4.9 g, 22.7 mmol) por porción durante un periodo de 20 minutos y la mezcla se agitó adicionalmente durante 1 hora (Cabe observar: es necesario un monitoreo minucioso de la reacción para obtener un buen rendimiento ya que los tiempos de reacción prolongados producen un rendimiento más bajo) y la TLC de la mezcla de reacción se controló cada 10 minutos (5% de éter en hexanos) . Luego de completar la reacción, la mezcla de reacción se filtró a través de una almohadilla de gel de sílice y el residuo se lavó con CH2CI2 (400 mL) . El filtrado se concentró y el producto crudo obtenido de esta manera se purificó adicionalmente por cromatografía en columna (gel de sílice, 1% de Et20 en hexanos) para aislar el producto puro 7 (2.9 g, 97%) como un aceite incoloro. 1H NMR (CDCI3, 400 MHz) d = 5.33-5.21 (m, 8H) , 2.69 (t, 4H) , 2.30 (t, 4H), 2.05-1.95 (m, 8H), 1.55-1.45 (m, 2H) , 1.35-1.15 (m, 18H), 0.82 (t, 3H) . 13C NMR (CDCI3) d = 211.90, 130.63, 130.54, 128.47, 128.41, 43.27, 33.04, 32.01, 30.93, 29.89, 29.86, 29.75, 29.74, 27.69, 26.11, 24.35, 23.06, 14.05. MS . Peso molecular calculado para C3-7H660, Cal. 526.92, Encontrado 528.02 (M+H+) .
Ejemplo 3: Síntesis de cetonas asimétricas 25 y 27.
Esquema 3 Síntesis de heptatriaconta-6, 9, 28-trien-19-ona 25 A un matraz de fondo redondo con 2 cuellos seco de 50 mL, se agregaron limaduras de Mg recién activadas (132 mg, 0.0054 mol) y el matraz se equipó con una barra de agitación magnética y un condensador de reflujo. Este sistema se desgasificó y purgó con nitrógeno y se agregaron 10 mL de éter anhidro al matraz mediante una jeringa. El bromuro 24 (1.8g, 0.0054 mol) se disolvió en éter anhidro (10 mL) y se agregó al matraz gota a gota mediante una jeringa. Se observó una reacción exotérmica (reacción iniciada con dibromoetano) y el éter comenzó el reflujo. Luego de completar la adición la mezcla de reacción se mantuvo a 35°C durante lh y luego se enfrió en un baño de hielo a 10-15° C. El cianuro ' 4 (0.5 g, 0.0018 mol) se disolvió en THF seco (5 mL) y se agregó gota a gota a la reacción con agitación. Se observó una reacción exotérmica y la mezcla de reacción se sometió a reflujo (a 70°C) durante 12h y se extinguió con una solución de cloruro de amonio. Luego se trató con 25% de solución de HC1 hasta que la solución se homogeneizó y las capas se separaron. La fase acuosa se extrajo con éter. Las capas de éter combinadas se secaron y concentraron para obtener el producto crudo que se purificó por cromatografía en columna. Las fracciones de producto puro se evaporaron para proporcionar la cetona pura 25 como un aceite incoloro.
Rendimiento: 0.230 g (24%) . 1H-NMR (CDC13, 400MHz) : d = 5.37-5.30 (m, 6H), 2.77-2.74 (t, 2H) , 2.38-2.34 (t, 4H) , 2.05-1.95 (m, 8H) , 1.56-1.52 (m, 4H) , 1.35-1.25 (m, protones alifáticos), 0.89-0.85 (t, 6H) . IR (cm-1 ) : 2924, 2854,1717,1465,1049,721.
Síntesis de heptatriaconta-6, 9-dien-19-ona 27 A un matraz de fondo redondo con 2 cuellos secado a llama de 500 mL, se agregaron limaduras de Mg recién activadas (0.144 g, 6 mmol) y el matraz se equipó con una barra de agitación magnética y un condensador de reflujo.
Este sistema se desgasificó y purgó con argón y se agregaron 10 mL de éter anhidro al matraz mediante una jeringa. El bromuro 26 (2.65 g, 5 mmol) comercialmente disponible se disolvió en éter anhidro (10 mL) y se agregó al matraz gota a gota mediante una jeringa. Luego de completar la adición la mezcla de reacción se mantuvo a 35 °C durante 1 h y luego se enfrió en baño de hielo. El cianuro 4 (1.38 g, 5 mmol) se disolvió en éter anhidro (20 mL) y se agregó gota a gota a la mezcla de reacción con agitación. Se observó una reacción exotérmica y la mezcla de reacción se agitó durante la noche a temperatura ambiente. La reacción se extinguió mediante la adición de 10 mL de acetona gota a gota seguido por agua enfriada con hielo (60 mL) . La mezcla de reacción se trató con H2SO4 acuoso (10 % en volumen, 200 mL) hasta que la solución se homogeneizó y las capas se separaron. La fase acuosa se extrajo con éter (2x100 mL) . Las capas de éter combinadas se secaron (Na2S04) y concentraron para obtener el producto crudo que se purificó por cromatografía en columna para proporcionar la cetona pura 27 como un aceite incoloro. 1H-NMR (CDC13, 400MHz) : d = 5.42-5.30 (m, 4H) , 2.79-2.78 (t,2H), 2.40-2.37 (t,4H), 2.08-2.03 (m, 4H) , 1.58-1.54 (m, 4H) , 1.36-1.26 (br m, protones alifáticas) , 0.91-0.87 (t, 6H) . IR (cm-l) :2924, 2854, 1716, 1465, 1375, 721.
Ejemplo 4: Síntesis de cetonas asimétricas con cadena C12. Esquema 4 A un matraz de fondo redondo con 2 cuellos seco de 50 mL, se agregaron limaduras de Mg recién activadas (175 mg, 0.0072 mol) y el matraz se equipó con una barra de agitación magnética y un condensador de reflujo. Este sistema se desgasificó y purgó con argón y se agregaron 10 mL de éter anhidro al matraz mediante una jeringa. El bromuro 28 (1.5g, 0.006 mol) se disolvió en éter anhidro (7 mL) y se agregó al matraz gota a gota mediante una jeringa. Se observó una reacción exotérmica (reacción iniciada con dibromoetano) y el éter comenzó el reflujo. Luego de completar la adición la mezcla de reacción se mantuvo a 35°C durante lh y luego se enfrió en un baño de hielo a 10-15° C. El cianuro 4 (lg, 0.0036mol) se disolvió en éter anhidro (7 mL) y se agregó gota a gota a la reacción con agitación. Se observó una reacción exotérmica y la mezcla de reacción se sometió a reflujo durante 12h y se extinguió con una solución de cloruro de amonio. Luego se trató con 25% de solución de HC1 hasta que la solución se homogeneizó y las capas se separaron. La fase acuosa se extrajo con éter. Las capas de éter combinadas se secaron y concentraron para obtener el producto crudo que se purificó por cromatografía en columna. Las fracciones de producto puro se evaporaron para proporcionar la cetona pura 29 como un aceite incoloro. Rendimiento: 0.65 g (26%) . 1H-NMR (d ppm) : 5.388-5.302 (m, 4H) , 2.77 - 2.74 (t, 2H), 2.38 - 2.34 (t, 4H) , 2.04-2.01 ( m, 4H) , 1.34 - 1.18 (m, 36H), 0.89 - 0.85 (m 6H) . IR (cm ^1) : 3009, 2920, 2851, 1711 (C=0) , 1466, 1376, 1261.
Ejemplo 5: Síntesis de cetonas asimétricas con cadena 31 Cío Esquema 5 A un matraz de fondo redondo con 2 cuellos seco de 50 mL, se agregaron limaduras de Mg recién activadas (266 mg, 0.0109 mol) y el matraz se equipó con una barra de agitación magnética y un condensador de reflujo. Este sistema se desgasificó y purgó con nitrógeno y se agregaron 10 mL de éter anhidro al matraz mediante una jeringa. El bromuro (2.43 g, 0.0109 mol) se disolvió en éter anhidro (7 mL) y se agregó al matraz gota a gota mediante una jeringa. Se observó una reacción exotérmica (reacción iniciada con dibromoetano) y el éter comenzó el reflujo. Luego de completar la adición la mezcla de reacción se mantuvo' a 35°C durante lh y luego se enfrió en un baño de hielo a 10-15° C. El cianuro (1 g, 0.0036 mol) se disolvió en éter anhidro (7 mL) y se agregó gota a gota a la reacción con agitación. Se observó una reacción exotérmica y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 hr. Se agregó THF (4ml) a la mezcla de reacción y se calentó a 45-50°C durante 4 hr hasta que el derivado de ciano se consumió completamente. La reacción se extinguió mediante la adición de 3mL de acetona gota a gota seguido por agua enfriada con hielo. La mezcla de reacción se trató con 25% de solución de HC1 hasta que la solución se homogeneizó y las capas se separaron. La fase acuosa se extrajo con éter. Las capas de éter combinadas se secaron y concentraron para obtener el producto crudo que se purificó por cromatografía en columna. Las fracciones de producto puro se evaporaron para proporcionar la cetona pura como un aceite incoloro. Rendimiento: 0.93 gms (61%) . 1H-NMR (d ppm) : 5.37- 5.302 (m, 4H) , 2.77 - 2.74 (t, 2H) , 2.38 - 2.34 (t, 4H) , 2.05-2.00 (m, 4H) , 1.55 - 1.52 (m, 2H) , 1.35 - 1.24 (m, 34H) , 0.89 - 0.84 (m 6H) . IR (cm _1) : 3009, 2925, 2854, 1717 (C=0) , 1465, 1376.
Ejemplo 6: Síntesis de cetonas asimétricas con colesterol Esquema 6 33 Usando un procedimiento similar al usado para la síntesis de la cetona 31, el cloruro de colesterilo que se convirtió al cloruro de magnesio correspondiente seguido por la adición al cianuro de linoleilo proporcionó la cetona 33.
Ejemplo 7: Síntesis de cetonas asimétricas con colesterol 35 Esquema 7 35 El tratamiento del colesterolcloroformiato con 3-bromopropilamina proporcionó el bromuro 34 que se convirtió en el reactivo de Grignard 34a correspondiente que en tratamiento con el cianuro de linoleilo proporcionó la cetona asimétrica 35 correspondiente con buen rendimiento.
Ejemplo 8: Síntesis de cetona asimétrica 40 Síntesis del compuesto 37 A un matraz de fondo redondo con dos cuellos de 500ml que contiene L1AIH4 (1.02g, 0.0269 mol) se agregó THF anhidro (20 mL) a temperatura ambiente en atmósfera de nitrógeno. La suspensión se agitó durante 1 h a temperatura ambiente y luego se enfrió hasta 0 °C . A esta mezcla se agregó una solución del compuesto 1 (5g, 0.01798 mol) en THF anhidro (50 mL) lentamente manteniendo la temperatura interna en 0 °C . Luego de completar la adición, la mezcla de reacción se calentó a temperatura ambiente y se agitó durante 1 h. El progreso de la reacción se monitoreó mediante TLC. Al completarse la reacción, la mezcla se enfrió hasta 0 °C y se extinguió con solución saturada de Na2S04 acuoso. La mezcla de reacción se agitó durante 30 minutos y el sólido formado se filtró a través de un lecho de celita y se lavó con acetato de etilo (100 mL) . El filtrado y los lavados se combinaron y evaporaron en evaporador rotatorio para proporcionar el compuesto 37 como un liquido incoloro, que se tomó como tal para la siguiente etapa sin ninguna purificación. Rendimiento: (4.5g, 95%); XH NMR (400MHz, CDC13) d = 5.39-5.28 (m, 6H) , 3.64-3.61 (t, 2H) , 2.81-2.78 (t, 4H) , 2.10-2.01(m, 4H), 1.59-1.51 (m, 2H) , 1.29-1.22 (m, protones alifáticos), 0.98-0.94 (t, 3H) .
Síntesis del compuesto 38 El compuesto 37 (14 g, 0.0530 mol) se disolvió en DC (300 mi) en un matraz de fondo redondo de dos cuellos de 500 mi y se enfrió hasta 0 °C. A esta solución se agregó tretilamina (29.5 mi, 0.2121 mol) lentamente en atmósfera inerte. La mezcla de reacción se agitó luego durante 10-15 minutos y a se le agregó lentamente cloruro de mesilo (6.17 mL, 0.0795 mol)) . Luego de completar la adición, la mezcla de reacción se dejó calentar hasta temperatura ambiente y se agitó durante 20 h. La reacción se monitoreó mediante TLC. Al completarse, la mezcla de reacción se diluyó con agua (200 mL) se agitó durante unos pocos minutos y la capa orgánica se separó. La fase orgánica se lavó adicionalmente con salmuera (1 x 70 mL) , se secó sobre Na2S04.y el solvente se eliminó en evaporador rotatorio para obtener el compuesto crudo 38 como un aceite tostado que se usó como tal para la siguiente reacción. Rendimiento: (17 g, 93 %) H NMR (400MHz, CDC13) d = 5.39-5.31 (m, 6H) , 4.22-4.19 (t, 2H) , 2.99 (s, 3H) , 2.81-2.78 (m, 4H), 2.08-2.01 (m, 4H) , 1.75.1.69 (m, 2H) , 1.39-1.29 (m, protones alifáticos), 0.98-0.94 (t, 3H) .
Síntesis del compuesto 39 El mesilato 38 (10 g, 0.2923 mol) se disolvió en éter anhidro (300 mL) en un matraz de fondo redondo de dos cuellos 1000 mL y se agregó complejo de MgBr2.Et20 (22.63 g, 0.0877 mol) a este en atmósfera de nitrógeno. La mezcla resultante se calentó luego a reflujo durante 26 h. Luego de completar la reacción (mediante TLC) , la mezcla de reacción se diluyó con éter (300 mL) y agua helada (200 mL) y la capa de éter se separó. La capa orgánica se lavó luego con 1% de K2C03 (100 mL) seguido de salmuera (80 mL) . La fase orgánica se secó luego en Na2S04 anhidro y el solvente se evaporó al vacío para dar el material crudo que se sometió a cromatografía en gel de sílice (malla 60-120) usando 0-1% de acetato de etilo en hexanos como sistema eluyente para proporcionar el compuesto deseado 39 como un aceite. Rendimiento: (7g, 73 %) 1H NMR (400MHz, CDC13) d = 5.39-5.31 (m, 6H) , 3.41-3.37 (t, 2H), 2.81-2.78 (m, 4H) , 2.08-2.02 (m, 4H) , 1.86-1.80 (m, 2H) , 1.42-1.29 (m, protones alifáticos), 0.98-0.94 (t, 3H) .
Síntesis de cetona asimétrica 40 A un matraz de fondo redondo de dos cuellos de 500mL secado a llama, equipado con una barra de agitación magnética y un condensador a reflujo, se agregaron limaduras de g recién activadas (0.88 g, 0.03636 mol) . Este sistema se desgasificó, purgó con argón y a este se agregó éter (150 mL) . Se agregaron unas pocas gotas del compuesto de bromo 4 (11.89 g, 0.03636 mol) en 50mL de éter al comienzo para iniciar la reacción (cabe destacar: también se agregó una cantidad catalítica de 1, 2-dibromo etano para acelerar la formación de reactivo de grignard) . Al iniciarse, la solución restante del compuesto de bromo se agregó lentamente a la solución etérea en reflujo. Luego de completar la adición, la mezcla de reacción se sometió a reflujo a 40°C durante 1.5 h. Luego se enfrió hasta 10°C y el cianuro de linoleilo 4 (5 g, 0.01818 mol) en 30 mL de éter seco se agregó gota a gota y la mezcla resultante se calentó luego a reflujo durante 20 h a 40°C. El progreso de la reacción se monitoreó mediante TLC. Luego de completar el consumo del derivado de ciano 40 (mediante TLC) , la mezcla se enfrió hasta temperatura ambiente y se extinguió con 30 mL de acetona seguido de agua helada (50 mL) . Esta solución se acidificó adicionalmente con 10% de solución de HC1 y la capa de éter se separó. La fase acuosa se extrajo adicionalmente con dietil éter (2 x 100 mL) . La eliminación del solvente luego de secarse con/sobre a2S04 anhidro proporcionó la cetona bruta que se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (malla 100-200) usando 0-5% de éter en hexanos como sistema eluyente para dar el compuesto del título 40 como un aceite amarillo pálido. Rendimiento: (4.8g, 50.5%) XH NMR (400MHz, CDC13) d= 5.38-5.28 (m, 10H) , 2.80-2.74 (m, 6H) , 2.38-2.34 (t, 4H) , 2.08-2.00 (m, 8H) , 1.55-1.52 (m, 4H) , 1.35-1.26 (m, protones alifáticos), 0.98-0.94 (t, 3H) , 0.89-0.85 (t, 3H) . HPLC-98.04%.
Ejemplo 9: Síntesis de oligonucleótidos : Todos los oligonucleótidos se sintetizaron en un sintetizador AKTAoligopilot . Se usó soporte sólido de vidrio de poro controlado comercialmente disponible (dT-CPG, 500Á, Síntesis principal) y fosforamiditas de RNA con grupos protectores estándar, 5' -O-dimetoxitritil N6-benzoil-2 ' -t-butildimetilsilil-adenosina-3' -O-N, N' -diisopropil-2-cianoetilfosforamidita, 5' -0-dimetoxitritil-N4-acetil-2' -t-butildimetilsilil-citidina-3 ' -?-?,?' -diisopropil-2-cianoetilfosforamidita, 5' -0-dimetoxitritil-N2--isobutril-2 ' -t-butildimetilsilil-guanosina-3' -O-N, ' -diisopropil-2-cianoetilfosforamidita y 5 ' -O-dimetoxitritil-2 ' -t-butildimetilsilil-uridina-3' -O-N, N' -diisopropil-2-cianoetilfosforamidita (Pierce Nucleic Acids Technologies) para la síntesis de oligonucleótidos. Se compraron 2'-F fosforamiditas, 5' -0-dimetoxitritil-N4-acetil-2' -fluro-citidina-3' -O-N, N' -diisopropil-2-cianoetil-fosforamidita y 5' -O-dimetoxitritil-2' -fluro-uridina-3' -0-N, N' -diisopropil-2-cianoetil-fosforamidita de (Promega) . Todas las fosforamiditas se usaron a una concentración de 0.2M en acetonitrilo (CH3CN) excepto por guanosina que se usó a una concentración de 0.2M en 10% de THF/ANC (v/v) . Se usó un tiempo de acoplamiento/reciclaje de 16 minutos. El activador fue tiotetrazol de 5-etilo (0.75M, /American International Chemicals), para la oxidación PO se usó Yodo/Agua/Piridina y para la oxidación PS se usó PADS (2 %) en 2, 6-lutidina/ACN (1:1 v/v) .
Las cadenas conjugadas de ligando 3' se sintetizaron usando soporte sólido que contiene el ligando correspondiente. Por ejemplo, la introducción de unidades de colesterol en la secuencia se llevó a cabo desde fosforamidita de hidroxiprolinol-colesterol . El colesterol se enlazó a trans-4-hidroxiprolinol a través de un enlace de 6-aminohexanoato para obtener una porción de hidroxiprolinol-colesterol. Los siRNA de extremo 5', Cy-3 y Cy-5.5 (fluoróforo) marcados se sintetizaron desde la correspondiente fosforamidita (Cy-3) Quasar-570 comprada a Biosearch Technologies. La conjugación de los ligandos al extremo 5' y o posición interna se logar mediante el uso del elemento fundamental del ligando-fosforamidita protegido de manera adecuada. Un acoplamiento extendido de 15 min de 0.1M de solución de fosforamidita en CH3CN anhidro en presencia de activador 5- (etiltio) -lH-tetrazol a un oligonucleótido unido a un sólido. La oxidación del fosfito internucleótido al fosfato se llevó a cabo usando yodo-agua estándar tal como se informó (1) o mediante tratamiento con hidroperóxido de ter-butilo/acetonitrilo/agua (10: 87: 3) con oligonucleótido conjugado con 10 min de tiempo de espera de oxidación. El fosforotioato se introdujo por oxidación del fosfito al fosforotioato usando un reactivo de transferencia de azufre tal como DDTT (comprado a AM Chemicals), PADS y o reactivo de Beaucage. La fosforamidita de colesterol se sintetizó en el lugar y se usó a una concentración de 0.1 M en diclorometano . El tiempo de acoplamiento para la fosforamidita de colesterol fue de 16 minutos.
Luego de completar la síntesis, el soporte se transfirió a una botella de vidrio de 100 mi (VWR) . El oligonucleótido se escindió del soporte con desprotección simultánea de los grupos base y fosfato con 80 mL de una mezcla de amoníaco etanólico [amoníaco: etanol (3:1)] durante 6.5h a 55°C. La botella se enfrió con hielo durante un corto período de tiempo y luego la mezcla de amoníaco etanólico se filtró en una nueva botella de 250 mi. El CPG se lavó con porciones de 2 x 40 mL de etanol/agua (1:1 v/v) . El volumen de la mezcla se redujo luego a ~ 30 mi mediante evaporador rotatorio. La mezcla se congeló luego en dyince [SIC] y se secó al vacío en un concentrador centrífugo tipo speed vac.
El residuo seco se volvió a suspender en 26 mi de trietilamina, trihidrofluoruro de trietilamina (TEA.3HF) o piridina-HF y DMSO (3:4:6) y se calentó a 60°C durante 90 minutos para eliminar los grupos de ter-butildimetilsililo (TBDMS) en la posición 2' . La reacción se extinguió luego con 50 mi de 20m de acetato de sodio y el pH se ajustó a 6.5, y se almacenó en freezer hasta la purificación.
Los oligonucleótidos se analizaron por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) antes de la purificación y la selección del amortiguador y la columna depende de la naturaleza de la secuencia y o ligando conjugado.
Los oligonucleótidos conjugados con ligandos se purificaron por HPLC preparativa de fase inversa. Los oligonucleótidos no conjugados se purificaron mediante HPLC de intercambio de aniones en una columna de gel TSK envasada en el lugar. Los amortiguadores fueron 20 mM de fosfato sódico (pH 8.5) en 10% de CH3CN (amortiguador A) y 20 mM de fosfato sódico (pH 8.5) en 10% de CH3CN, NaBr 1M (amortiguador B) . Las fracciones que contenían oligonucleótidos de longitud total se agruparon, desalaron y liofilizaron . Aproximadamente 0.15 OD de los oligonucleótidos desalados se diluyeron en agua hasta 150 µ? y luego se pipetearon en frascos especiales para análisis CGE y LC/MS . Los compuestos se analizaron finalmente por LC-ESMS y CGE.
Para la preparación de siRNA, se calentaron cantidades equimolares de cadenas sentido y antisentido en lxPBS a 95°C durante 5 min y se enfriaron lentamente hasta temperatura ambiente. La integridad del dúplex se confirmó mediante análisis de HPLC.
Tabla 7. Dúplex de siRNA para el direccionamiento de FVII y Luc Dúplex Sentido/ Secuencia 5' -3' SEQ ID Diana Antisentido NO: 1000/2434 CUU ACG CUG AGU ACU UCG AdTdT Luc U*CG AAG fUAC UCA GCG füAA GdT*dT 2433/1001 C*UfU ACG CUG AGfü ACU UCG Luc AdT*d UCG AAG UAC UCA GCG UAA GdTdT 2433/2434 C*UfU ACG CUG AGfU ACU UCG Luc AdT*dT U*CG AAG fUAC UCA GCG fUAA GdT*dT 1000/1001 CUU ACG CUG AGU ACU UCG AdTdT Luc UCG AAG UAC UCA GCG UAA GdTdT AD-1596 GGAUCAUCUCAAGUCUUACdTdT FVII GÜAAGACUUGAGAUGAUCCdTdT AD-1661 GGAfUfCAfUfCfUfCAAGfUfCfüfUAf FVII CdTsdT GfUAAGAfCfUfUGAGAfUGAfUfCfCdT *dT Nota: L8 es , minúscula es nucleótido 2 ' -O-metilo modificado, * son enlaces de cadena principal de fosforotioato, fN es un nucleótido 2' -fluoro, dN es nucleótido 2'-desoxi.
Ejemplo 10: Ensayo de estabilidad en suero para siRNA Se llevó a cabo un ensayo de rendimiento medio para la selección inicial de estabilidad basada en secuencia mediante el enfoque "stains all". Para realizar el ensayo, un dúplex de siRNA se incubó en 90% de suero humano a 37 °C. Se inactivaron muestras de la mezcla de reacción a varios rangos de tiempo (a 0 min., 15, 30, 60, 120 y 240 min.) y se sometieron a análisis electroforético (Figura 1). La escisión del RNA a lo largo del tiempo proporcionó información relacionada con la susceptibilidad del dúplex de siRNA a la degradación de nucleasa en suero.
Se usó un ensayo de estabilidad en suero y dsRNA radiomarcado para caracterizar adicionalmente eventos de escisión de siRNA. En primer lugar, un dúplex de siRNA se marcó en el extremo 5' con 32P ya sea en la cadena sentido como antisentido. El dúplex de siRNA marcado se incubó con 90% de suero humano a 37°C, y se eliminó una muestra de la solución y se extinguió a rangos de tiempo cada vez mayores. Las muestras se analizaron por electroforesis .
Ejemplo 11: Evaluación FVII in vivo usando los liposomas derivados de lipidos catiónicos Experimentos de silenciamiento in vivo de Factor VII de roedor y ApoB .
Ratones C57BL/6 (Charles River Labs, MA) y ratas Sprague-Dawley (Charles River Labs, MA) recibieron ya sea solución salina o siRNA en formulaciones deseadas a través, de una inyección en la vena de la cola en un volumen de 0.01 mL/g. En varios rangos de tiempo luego de la administración, se anestesió a los animales mediante inhalación de isofluorano y se recogió sangre en tubos separadores de suero mediante sangrado retroorbital . Los niveles en suero de la proteina del Factor VII se determinaron en muestras usando un ensayo cromogénico (Coaset Factor VII, DiaPharma Group, OH or Biophen FVII, Aniara Corporation, OH) de acuerdo con protocolos de los fabricantes. Se generó una curva estándar usando suero recogido de animales tratados con solución salina. En experimentos donde se evaluaron los niveles hepáticos de mRNA, los animales se sacrificaron y los hígados se extrajeron y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido en varios rangos de tiempo luego de la administración. El tejido de hígado congelado se pulverizó.
Se prepararon lisados de tejido y se determinaron los niveles hepáticos de mRNA de Factor VII y apoB usando un ensayo de DNA ramificado (QuantiGene Assay, Panomics, CA) .
Ejemplo 12 : Preparación de 1, 2-Di-0-alquil-sn3- Carbomoilglicérido (PEG-DMG) Preparación de IVa Se colocaron 1 , 2-Di-O-tetradecil-sn-glicérido la (30 g, 61.80 mmol) y N, N' -succinimidilcarboanto (DSC, 23.76 g, 1.5 eq.) en diclorometano (DCM, 500 mL) y se agitaron sobre una mezcla de agua helada. Se agregó trietilamina (TEA, 25.30 mL, 3 eq.) a la solución en agitación y a continuación la mezcla de reacción se dejó agitar durante la noche a temperatura ambiente. El progreso de la reacción se monitoreó mediante TLC. La mezcla de reacción se diluyó con DCM (400 mL) y la capa orgánica se lavó con agua (2X500 mL) , solución acuosa de NaHC03 (500 mL) seguido por procesamiento estándar. El residuo obtenido se secó a temperatura ambiente a alto vacio durante la noche. Luego de secar el carbonato lia crudo asi obtenido se disolvió en diclorometano (500 mL) y se agitó sobre un baño de hielo. A la solución en agitación se agregaron mPEG2ooo-NH2 (III, 103.00 g, 47.20 mitiol, comprada a NOF Corporation, Japón) y piridina anhidra (Py, 80 mL, exceso) en argón. La mezcla de reacción se dejó luego agitar a temperatura ambiente durante la noche. Los solventes y volátiles se eliminaron al vacío y el residuo se disolvió en DCM (200 mL) y se cargó a una columna de gel de sílice envasada en acetato de etilo. La columna se eluyó inicialmente con acetato de etilo y a continuación con gradiente de 5-10 % de metanol en diclorometano para proporcionar el PEG-Lípido IVa deseado como un sólido blanco (105.30g, 83%). *H NMR (CDC13, 400 MHz) = 5.20-5.12 (m, 1H), 4.18-4.01 (m, 2H) , 3.80-3.70(m, 2H), 3.70-3.20 (m, -0-CH2-CH2-0-, PEG-CH2), 2.10-2.01(m, 2H) , 1.70-1.60 (m, 2H), 1.56-1.45(m, 4H), 1.31-1.15(m, 48H), 0.84(t, J= 6.5Hz, 6H) . Rango MS encontrado: 2660-2836.
Preparación de IVb Se mezclaron 1, 2-Di-O-hexadecil-sn-glicérido Ib (1.00 g, 1.848 mmol) y DSC (0.710 g, 1.5 eq.) en diclorometano (20 mL) y se enfriaron hasta 0°C en una mezcla de agua helada. Se agregó trietilamina (1.00 mL, 3 eq.) y la mezcla de reacción se agitó durante la noche. La reacción se siguió mediante TLC, se diluyó con DCM, se lavó con agua (2 veces), solución de NaHC03 y se secó sobre sulfato de sodio. Los solventes se eliminaron a presión reducida y el residuo resultante de Ilb se mantuvo a alto vacio durante la noche. Este compuesto se usó directamente para la siguiente reacción sin purificación adicional. Se disolvieron MPEG2ooo~NH2 III (1.50g, 0.687 mmol, comprado a NOF Corporation, Japón) y Ilb (0.702g, 1.5 eq.) en diclorometano (20 mL) en argón. La reacción se enfrió hasta 0°C. Se agregó piridina (1 mL, exceso) y la reacción se agitó durante la noche. La reacción se monitoreó mediante TLC. Los solventes y volátiles se eliminaron al vacio y el residuo se purificó por cromatografía (primero acetato de etilo seguido por 5-10% de MeOH/DCM como gradiente de elución) para obtener el compuesto requerido IVb como un sólido blanco (1.46 g, 76 %). H NMR (CDC13, 400 Hz) d = 5.17(t, J= 5.5Hz, 1H), 4.13 (dd, J= 4.00Hz, 11.00 Hz, 1H) , 4.05 (dd, J= 5.00Hz, 11.00 Hz, 1H), 3.82-3.75(m, 2H) , 3.70-3.20(m, -0-CH2-CH2-0-, PEG-CH2), 2.05-1.90(m, 2H), 1.80-1.70 (m, 2H) , 1.61-1. 5 (m, 6H), 1.35-1.17 (m, 56H) , 0.85(t, J= 6.5Hz, 6H) . Rango MS encontrado: 2716-2892.
Preparación de IVc Se mezclaron 1, 2-Di-O-octadecil-sn-glicérido Ic (4.00 g, 6.70 mmol) y DSC (2.58 g, 1.5 eq.) en diclorometano (60 mL) y se enfriaron hasta 0°C en una mezcla de agua helada. Se agregó trietilamina (2.75 mL, 3 eq.) y la mezcla de reacción se agitó durante la noche. La reacción se siguió mediante TLC, se diluyó con DCM, se lavó con agua (2 veces), solución de NaHC03 y se secó sobre sulfato de sodio. Los solventes se eliminaron a presión reducida y el residuo se mantuvo a alto vacio durante la noche. Este compuesto se usó directamente para la siguiente reacción sin purificación adicional. Se disolvieron MPEG2ooo-NH2 III (1.50g, 0.687 mmol, comprado a NOF Corporation, Japón) y lie (0.760g, 1.5 eq.) en diclorometano (20 mL) en argón. La reacción se enfrió hasta 0°C. Se agregó piridina (1 mL, exceso) y la reacción se agitó durante la noche. La reacción se monitoreó mediante TLC. Los solventes y volátiles se eliminaron al vacio y el residuo se purificó por cromatografía (acetato de etilo seguido por 5-10% de MeOH/DCM como gradiente de elución) para obtener el compuesto deseado IVc como un sólido blanco (0.92 g, 48 %) . 1H NMR (CDCI3, 400 MHz) d = 5.22-5.15(m, 1H), 4.16(dd, J= 4.00Hz, 11.00 Hz, 1H), 4.06(dd, J= 5.00Hz, 11.00 Hz, 1H) , 3.81-3.75 (m, 2H) , 3.70-3.20(m, -0-CH2-CH2-0- , PEG-CH2) , 1.80-1.70 (m, 2H), 1.60-1.48(m, 4H) , 1.31-1.15 (m, 64H), 0.85(t, J= 6.5Hz, 6H) . Rango MS encontrado: 2774-2948.
Ejemplo 13: Síntesis de 2005: A una solución de 2004 (50g, 95 mmol) en DCM (400 mi) en atmósfera de Ar, se agregó TEA (53 mL, 378 mmol) y DMAP (1.2g, 9.5 mmol) y se agitó a temperatura ambiente en atmósfera de Ar. La masa de reacción se enfrió hasta -5°C y la solución de cloruro de mesilo (15 mL, 190 mmol) en DCM (100 mi) se agregó lentamente a una temperatura por debajo de -5°C y se dejó calentar hasta TA luego de la adición. Luego de 30 minutos (TLC), la masa de reacción se extinguió con agua helada (20 mi) . La capa orgánica se separó, se lavó con 1N HC1 (30 mi) , agua, salmuera, se secó sobre sulfato de sodio y evaporó a presión reducida para obtener producto puro (55g, 95.5%) como liquido amarillo. 1H NMR (400 MHz, CDCI3) : d 0.89 (t, 6H, J = 6.8), 1.2-1.5 (m, 36H), 1.67 (m, 4H) , 2.05 (q, 8H, Jl = 6.8, J2 = 6.8), 2.77 (t, 4H, J = 6.4), 2.99 (s, 3H) , 4.71 (m, 1H) and 5.36 (m, 8H) . Síntesis 2006: A una solución de 2005 (50g, 82 mmol) en DMF (500 mL) en atmósfera de argón, se agregó NaN3 (21 q, 410 mmol) y se calentó hasta 70°C y la temperatura se mantuvo durante cuatro horas (TLC) . La mezcla se diluyó con agua y se extrajo con acetato de etilo (3x250 mi) . La capa orgánica se lavó con agua, salmuera, se secó sobre a2S04 y se evaporó a presión reducida para dar el producto crudo, que se purificó por cromatografía en gel de sílice usando hexanos/éter como eluyente. El producto se eluyó al 2% de éter hexanos para obtener 2006 (36g, 86%) como líquido amarillo pálido. 1H NMR (400 MHz, CDC13) : d 0.90 (t, 8H) , 1.30 (m, 36H) , 1.49 (t, 4H, J = 6.4 Hz) 2.04 (q, 8H, Jl =7.6, J2 = 14Hz), 2.77 (t, 4H, J = 6.4 Hz), 3.22 (m, 1H) , 5.34 (m, 8H) . 13C NMR (400 MHz, CDC13): d 14.1, 22.5, 25.6, 26.1, 27.2, 29.2, 29.3, 29.45, 29.65, 31.5, 34.1, 63.1, 127.9, and 130.1. IR (KBr) : 2098.
Ejemplo 14: Formulación de siRNA usando vesículas preformadas Las partículas que contienen lípido catiónico se fabricaron usando el método de vesículas preformadas. El lípido catiónico, DSPC, colesterol y PEG-lípido se solubilizaron en etanol a una relación molar de 40/10/40/10, respectivamente. La mezcla lipídica se agregó a un amortiguador acuoso (50mM citrato, pH 4) mezclando hasta una concentración final de etanol y lípidos de 30% (vol/vol) y 6.1 mg/mL respectivamente y permitió equilibrar a temperatura ambiente durante 2 min antes de la extrusión. Los lípidos hidratados se extruyeron a través de dos filtros de tamaño de poro 80 nm apilados (Nuclepore) a 22° usando Lipex Extruder (Northern Lipids, Vancouver, BC) hasta obtener un diámetro de vesícula de 70-90 nm, según determinado por el análisis Nicomp. Esto generalmente requirió 1-3 pasadas. Para algunas mezclas de lípidos catiónicos que no formaron vesículas pequeñas que hidratan la mezcla de lípidos con un amortiguador de pH más bajo (50mM de citrato, pH 3) para protonar el grupo de fosfato en el grupo principal DSPC ayudó a formar vesículas estables de 70-90 nm.
El siRNA FVII ( solubilizado en un citrato de 50mM, solución acuosa de pH 4 que contiene 30% de etanol) se agregó a las vesículas, preequilibradas hasta 35°C, a una velocidad de ~5mL/min. Luego de lograr una relación objetivo final siRNA/lípido de 0.06 (p/p) , la mezcla se incubó por unos 30 min adicionales a 35°C para permitir la reorganización de la vesícula y la encapsulación de siRNA FVII. El etanol se eliminó y el amortiguador externo se reemplazó por PBS (155mM NaCl, 3mM Na2HP04, lmM KH2P04, pH 7.5) ya sea por diálisis o diafiltración de flujo transgenital. La relación fina de siRNA-a-lípido encapsulada se determinó luego de eliminar el siRNA encapsulado usando columnas de exclusión de tamaños o columnas de intercambio de iones.
Ejemplo 15: Determinación in vivo de la eficacia de las formulaciones del lípido novedosas Las formulaciones de prueba se evaluaron inicialmente para determinar su silenciamiento génico de FVII en hembras de 7-9 semanas de edad, 15-25g, ratones C57B1/6 hembra a 0.1, 0.3, 1.0 y 5.0 mg/kg con 3 ratones por grupo de tratamiento. Todos los estudios incluyeron animales que recibieron ya sea solución salina tamponada con fosfato (PBS, grupo de control) o una formulación de referencia. Las formulaciones se diluyeron hasta la concentración adecuada en PBS inmediatamente antes de las pruebas. Los ratones se pesaron y se calcularon los volúmenes de dosis adecuados (10 Dl/g de peso corporal) . Las formulaciones de prueba y de referencia asi como también la PBS (para animales de control) se administraron por vía intravenosa a través de la vena lateral de la cola. Los animales se anestesiaron 24 h después con una inyección intraperitoneal de Ketamina/Xilazina y se recolectó 500-700 DI de sangre mediante punción cardiaca en tubos separadores de suero (BD Microtainer) . La sangre se centrifugó a 2, 000 x g durante 10 min a 15°C y el suero se recolectó y almacenó a -70°C hasta el análisis. Las muestras de suero se descongelaron a 37°C durante 30 min, se diluyeron en PBS y se repartieron en alícuotas en placas de ensayo de 96 pocilios. Los niveles del Factor VII se evaluaron usando un ensayo cromogénico (Biophen FVII kit, Hyphen BioMed) de acuerdo con las instrucciones del fabricante y la absorbancia medida/se midió en lector de microplacas equipado con un filtro de longitud de onda de 405 nm. Los niveles de FVII en plasma se cuantificaron y se calcularon las DE50 (dosis que dan como resultado un 50% de reducción en niveles de FVII en plasma con comparación con animales de control) usando una curva estándar generada a partir de una muestra combinada de suero de los animales de control. Aquellas formulaciones de interés que muestran altos niveles de silenciamiento de FVII (ED50 << 0.1 mg/kg) se volvieron a probar en estudios independientes a un rango de dosis menor para confirmar la potencia y establecer ED50.
La Figura 3 proporciona una Tabla que presente el CE50 de ejemplos de compuestos probados usando este método.
Ejemplo 15a ¡Determinación de pKA de los lipidos formulados Los pKa de diferentes lipidos catiónicos ionizables fueron determinados esencialmente tal como se describe en (Eastman et al 1992 Biochemistry 31:4262-4268) usando la sonda fluorescente de ácido 2- (p-toluidino) -6-naftalenosulfónico (TNS), que es no fluroscente en agua pero se torna sensiblemente fluorescente al unirse a las membranas. Las vesículas compuestas por lipido catiónico/DSPC/CH/PEG-c-DOMG (relación molar 40:10:40:10) se diluyeron hasta 0. lmM en tampones (130mM de NaCl, lOmM de CH3COONH4, lOmM de MES, lOmM de HEPES) de diferentes pH, que varían desde 2 a 11. Una alícuota de solución acuosa de TNS (1 DM final) se agregó a las vesículas diluidas y luego de un período de equilibración de 30 segundos el fluorescente de la solución que contiene TNS se midió en longitudes de onda de excitación y emisión de 321nm y 445nm, respectivamente. El pKa de las vesículas que contienen lípidos catiónicos se determinó por el trazado de la fluorescencia medida contra el pH de las soluciones y ajustando los datos a una curva sigmoidal usando el programa de gráfica comercial Igor Pro. La Figura 3 proporciona una Tabla que representa la pKa de ejemplos de compuestos probados usando este método.
Ejemplo 16: Síntesis de lípidos enlazados a guanidinio Análogos del guanidinio Preparación del compuesto 7204: Preparación del compuesto 7013: A una mezcla de 1,2,4- butanotriol (7012, 21.2 g, '200 mmol, 5.0 eq.)7 dilinoleil cetona (21.0 g, 40.0 mmol, 1.0 eq.) y ácido p-toluenesulfónico (0.76 g, 4.0 mmol, 0.1 eq. ) en tolueno se sometió a reflujo en condiciones Dean-stock durante la noche. Luego de completar la reacción, se enfrió, se evaporó el solvente y se purificó mediante cromatografía en columna usando hexano y acetato de etilo (15%) como gradiente proporcionó el cetal deseado (7013) en 47% de rendimiento como un aceite. 1R NMR (400 MHz, CDC13) d 5.48 - 5.24 (m, 8H) , 4.32 - 4.17 (m, 1H) , 4.08 (dd, J = 7.8, 6.1, 1H) , 3.86 - 3.74 (m, 2H), 3.53 (t, J = 8.0, 1H) , 2.77 (t, J = 6.4, 4H) , 2.30 -2.19 (m, 1H), 2.05 (q, J = 6.8, 8H) , 1.88 - 1.75 (m, 2H) , 1.69 - 1.51 (m, 4H) , 1.42 - 1.19 (m, 36H) , 0.89 (t, J = 6.8, 6H) . Masa calculada para C4iH7403 is 614.5; 637.3 encontrada (+Na) .
Síntesis del compuesto 7201: A una solución del compuesto 7013 (11.6 g, 18.9 mmol, 1.0 eq.) y trietilamina (5.45 mL, 37.7 mmol, 2.0 eq.) en diclorometano a 0 °C se agregó gota a gota una solución de cloruro de metanosulfonilo (1.74 mL, 22.67 mmol, 1.2 eq.), y la reacción de continnuó a temperatura ambiente durante lh. Luego de completar la reacción, se lavó con agua, salmuera y los orgánicos combinados se secaron en MgSO La mezcla concentrada se purificó en cromatografía en columna usando hexano y acetato de etilo (20%) como gradientes para obtener un derivado mesilato (7201) como un aceite en 93% de rendimiento. XH NMR (400 MHz, CDC13) d 5.48 - 5.22 (m, 8H) , 4.35 (qd, J = 10.0, 4.9, 2H), 4.25 - 4.14 (m, 1H) , 4.13 - 4.03 (m, 1H) , 3.53 (t, J = 7.6, 1H), 3.02 (s, 3H), 2.77 (t, J = 6.4, 4H), 2.13 -1.85 (m, 10H), 1.57 (dd, J = 18.2, 9.2, 4H), 1.44 - 1.15 (m, 36H), 0.89 (t, J = 6.7, 6H) . Masa calculada para C42H 60s es 693.1; 693.2 encontrada.
Síntesis del compuesto 7202: A una solución del compuesto 7201 (2.0 g, 3.0 mmol, 1.0 eq.) en DMF se agregó NaN3 sólido (0.98 g, 15.0 mmol, 5.0 eq.) a temperatura ambiente y la reacción continuó a 65°C hasta completar la reacción. La mezcla de reacción se vertió en agua helada, se extrajo en acetato de etilo, los orgánicos combinados se secaron en Na2S04, se concentraron, purificaron en cromatografía en columnas usando hexano y acetato de etilo (5%) como gradientes para obtener un derivado de azido puro (7202) en 89% de rendimiento. :H NMR (400 MHz, CDCl3) d 5.53 - 5.19 (m, 8H) , 4.21 - 3.97 (m, 2H) , 3.57 - 3.29 (m, 3H), 2.76 (t, J = 6.4, 4H), 2.04 (q, J = 6.8, 8H) , 1.80 (m, 2H), 1.66 - 1.43 (m, 4H) , 1.40 - 1.07 (m, 36H) , 0.88 (t, J = 6.8, 6H) . Masa calculada para C41H73O3O2 es 640.0; 612.5 encontrada (-N2) .
Síntesis del compuesto 7203: A una solución del compuesto 7202 (1.7 g, 2.65 mmol, 1.0 eq.) en tetrahidrofurano anhidro, se agregó gota a gota una solución IM de LAH (3.98 mL, 3.98 mmol, 1.5 eq.) a O °C . La reacción se continuó a temperatura ambiente, luego de completar la reacción se extinguió con solución saturada de Na^SC^ suavemente a 0 °C . El compuesto se extrajo en un exceso de cantidad de acetato de etilo, la capa orgánica se lavó con salmuera, se secó en a2S04, se concentró y se secó adicionalmente al vacío para obtener una amina pura (7203) en 90% de rendimiento y esto se usó directamente sin purificación adicional. XH NMR (400 MHz, CDC13) d 5.51 - 5.16 (m, 8H) , 4.13 (dd, J = 9.3, 3.6, 1H) , 4.03 (dd, J = 7.5, 6.1, 1H), 3.46 (t, J = 7.8, 1H), 2.96 - 2.67 (m, 6H) , 2.20 - 1.92 (m, 8H) , 1.82 - 1.49 (m, 6H) , 1.46 - 1.12 (m, 38H) , 0.88 (t, J = 6.8, 6H) . Masa calculada para C41H75NO2 es 614.0; 614.5 encontrada .
Síntesis del compuesto 7204: (ALNY-232) : A una solución de amina 7203 (0.61 g, 1.0 mmol, 1.0 eq.) y DIPEA (1.84 mL, 10.0 mmol, 10.0 eq. ) en una mezcla del solventee (DCM:DMF) se agregó clorhidrato de lH-pirazol-l-carboxamidina (1.46 g, 10.0 mmol, 10.0 eq. ) en porciones a temperatura ambiente en una atmósfera de argón. La reacción se continuó durante la noche, luego de completar la reacción se vertió en hielo y se extrajo con acetato de etilo. Los orgánicos combinados se lavaron con agua, salmuera, se secaron con Na2SC>4 y se purificaron por cromatografía preparativa para obtener 0.16 g (25%) del derivado de guanidina puro (7204). 1H NMR (400 MHz, CDC13) d 11.76 (s, 1?) , 7.99 (t, J = 6.3, 1H) , 7.44 (s, 2H) , 5.48 - 5.20 (m, 8H) , 4.24 - 4.00 (m, 2H) , 3.54 (dd, J = 7.3, 6.2, 1H), 3.32 (d, J = 3.0, 2H), 3.09 (dt, J = 10.5, 5.3, 1H), 2.76 (t, J = 6.5, 4H), 2.03 (q, J = 6.8, 8H) , 1.90 -1.77 (m, 1H), 1.76 - 1.49 (m, 6H) , 1.48 - 1.05 (m, 34H) , 0.87 (dd, J = 6.8, 6H) . 13C NMR (101 MHz, cdcl3) d 158.96, 130.41, 130.36, 130.33, 128.18, 128.14, 113.52, 77.54, 77.22, 76.90, 76.60, 72.36, 69.54, 46.09, 38.39, 37.68, 37.01, 34.09, 31.74, 30.10, 29.92, 29.78, 29.76, 29.56, 29.55, 29.53, 27.47, 27.46, 27.41, 25.84, 24.37, 24.12, 22.79, 14.31, 8.86. Masa calculada para C42H77N3O2 es 656.0; 656.2 encontrada.
Ejemplo 17: Síntesis de lípidos enlazados a éster Análogos de éster Esquema 1 I- 7004 7003 Experimental Compuesto 7002: Se colocó magnesio (711 mg, 29.25 mmol) en un frasco redondo. Se agregó THF (30 mL) y 2-3 mg de I2. La mezcla se calentó a 50 °C y se agregó suavemente bromuro de oleilo (7001, 6.46 g, 19.50 mmol) . Al agregar ~1 mL de bromuro oleilo, se inició la formación del reactivo Grignard. Luego de la adición del resto de bromuro de oleiolo, el reactivo Grignard se agitó a temperatura ambiente durante 60 min, luego se agregó suavemente a una solución de 1,1'-carbonildiimidazol (1.54 g, 9.51 mmol) en THF (100 mL) a -50 °C . La mezcla de reacción se mantuvo en agitación a -50 °C durante 30 min y luego a temperatura ambiente durante 60 min. La reacción se extinguió con 40 mL de NH4C1 acuoso saturado y la mezcla se extrajo con Et20 y H2O. La capa orgánica se secó sobre MgS04, se filtró y se concentró. El material crudo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (0-5% Et20 en Hexano) para dar el compuesto 7002 (2.70 g, 5.09 mmol, 53%, Rf = 0.48 desarrollado con 5% de EtOAc en hexano) . Peso molecular para C37H7iO (M+H)+ Cale. 531.55, Encontrado 531.5.
Compuesto 7003: A una solución del compuesto 7002 (1.36 g, 2.56 mmol) en THF (25 mL) , se agregó 1 M de hidruro de litio aluminio en THF (5.12 mL, 5.12 mmol) a 0 °C. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3 horas. La reacción se extinguió con Na2S04 acuoso saturado (20 mL) , luego se extrajo con Et20 y H20. La capa orgánica se secó sobre MgSCj, se filtró y se concentró. El material crudo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (0-5% Et20 en Hexano) para dar el compuesto 7003 (942 mg, 1.77 mmol, 69%, Rf = 0.26 desarrollado con 5% de EtOAc en hexano).
Compuesto 7004: A una solución del compuesto 7003 (940 mg, 1.76 mmol) y clorhidrato de ácido 4- (dimetilamino) utírico (355 mg, 2.12 mmol) en CH2CI2 (15 mL) , se agregó diisopropiletilamina (0.920 mL, 5.28 mmol), clorhidrato de N- (3-dimetilaminopropil) -N' -etilcarbodiimida (406 mg, 2.12 mmol) y DMAP (43 mg, 0.352 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 14 horas. La mezcla de reacción se diluyó con CH2CI2 (100 mL) y se lavó con NaHCC>3 ac. saturado. (50 mL) . La capa orgánica se secó sobre MgS04, se filtró y se concentró. El producto crudo se purificó por cromatografía en columna de gel de sílice (0-5% MeOH en CH2CI2) para dar el compuesto 7004 (817 mg, 1.26 mmol, 72%, Rf = 0.29 desarrollado con 5% de MeOH en CH2C12) . Peso molecular para C3H84 02 (M+H) + Cale . 646.65, Encontrado 646.5.
Esquema 4 Compuesto 7017: A una solución agitada de cetona 7016 (1.5 g, 2.84 mmol, 1.0 eq.) en metanol y THF (2:1) se agregó NaBH sólido (0.16 g, 4.26 mmol, 1.5 eq.) a 0 °C en porciones y se continuó la reacción a temperatura ambiente hasta completar la reacción. La reacción se extinguió con adición gota a gota de solución 2N HC1 a temperatura helada, es solvente orgánico se evaporó y se redisolvió en acetato de etilo, se lavó con agua, salmuera, los orgánicos combinados se secaron sobre MgS04, se concentraron y purificaron por cromatografía en columna usando hexano : acetato de etilo (20%) como gradientes para obtener alcohol puro 7017 en 94% (1.42 g) de rendimientos. XH NMR (400 MHz, CDC13) d 5.49 - 5.20 (m, 6H), 3.57 (s, 1H), 2.76 (t, J = 6.4, 2H) , 2.13 - 1.88 (m, 9H), 1.51 - 1.12 (m, 53H) , 0.95 - 0.75 (m, 6H) . Masa calculada para C37H7oO: 530.5, encontrada 531.5.
Compuesto 7018: Preparado por condiciones experimentales similares usadas para el compuesto 7010, usando alcohol 7017 (1.42 g, 2.68 mmol, 1.0 eq.), clorhidrato del ácido N,N-dimetilamino butírico (0.53 g, 3.21 mmol, 1.2 eq.), DIPEA (1.48 mL, 8.0 mmol, 3.0 eq.), EDCI (0.56 g, 2.94 mmol, 1.1 eq.), DMAP (0.065 g, 0.53 mmol, 0.1 eq. ) en DCM proporcionó 1.34 g (78%) del producto puro 7018. XH NMR (400 MHz, CDC13) d 5.47 - 5.20 (m, 8H) , 4.92 - 4.77 (m, 1H), 2.76 (t, J = 6.3, 2H), 2.28 (dt, J = 16.6, 7.5, 4H) , 2.20 (s, 6H) , 2.08 - 1.89 (m, 8H), 1.83 - 1.70 (m, 2H) , 1.48 (d, J = 5.2, 4H) , 1.38 - 1.16 (m, 40H) , 0.91 - 0.80 (m, 6H) . 1JC NMR (101 MHz, cdcl3) d 173.61, 130.51, 130.40, 130 35, 130.13, 130.05, 128.16, 128.13, 77.55, 77.23, 76.91, 74.46, 59.18, 45.68, 34.36, 32.84, 32.69, 32.13, 31.75, 29.99, 29.92, 29.89, 29.78, 29.76, 29.72, 29.67, 29.58, 29.54, 29.52, 29.40, 29.36, 27.45, 27.43, 25.84, 25.57, 23.39, 22.91, 22.80, 14.36, 14.31. Masa calculada para C43H81N02: 643.6, encontrada 644.5.
Esquema 5 Compuesto 7020: Preparado por condiciones experimentaless similares usados como el compuesto 7017, usando cetona 57 (0.75 g, 1.43 mmol, 1.0 eq.) en metanol y THF (2:1) se agregó NaBH sólido (0.08 g, 2.14 mmol, 1.5 eq.) en metanol: THF, proporcionó 0.63 g (84%) del alcohol puro 7020. ¾ NMR (400 MHz, CDC13) d 5.48 - 5.20 (m, 10H) , 3.57 (s, 1H), 2.88 - 2.65 (m, 6H) , 2.06 (dq, J = 14.0, 7.1, 8H) , 1.50 - 1.18 (m, 35H) , 0.96 (t, J = 7.5, 3H) , 0.88 (dd, J 12.8, 6.2, 3H) . Masa calculada para C37H660 : 526.5, encontrada 527.5.
Preparación del compuesto 7021: Preparado por condiciones experimentales similares usadas para el compuesto 7010, usando alcohol 7020 (0.62 g, 1.18 mmol, 1.0 eq.), clorhidrato del ácido N, N-dimetilamino butírico (0.23 g, 1.41 mmol, 1.2 eq.), DIPEA (0.65 mL, 3.54 mmol, 3.0 eq.), EDCI (0.24 g, 1.3 mmol, 1.1 eq.), DMAP (0.028 g, 0.23 mmol, 0.1 eq.) en DCM proporcionó 0.63 g (84%) del producto puro 7021. XH NMR (400 MHz, CDC13) d 5.46 - 5.19 (m, 8H) , 4.91 - 4.78 (m, 1H), 2.85 - 2.68 (m, 6H), 2.29 (dt, J = 15.2, 7.5, 4H) , 2.20 (s, 6H), 2.11 - 1.95 (m, 8H), 1.78 (dd, J = 14.8, 7.5, 2H) , 1.49 (d, J = 5.5, 4H), 1.40 - 1.17 (m, 32H) , 0.96 (t, J = 7.5, 3H), 0.87 (t, J = 6.8, 3H) . 13C NMR (101 MHz, CDCI3) d 168.17, 126.73, 125.15, 124.98, 124.93, 123.06, 123.04, 122.75, 122.72, 122.43, 121.91, 72.13, 71.81, 71.49, 69.04, 53.75, 40.25, 28.95, 27.27, 26.33, 24.47, 24.45, 24.36, 24.33, 24.29, 24.15, 24.10, 22.05, 22.04, 22.00, 20.42, 20.41, 20.32, 20.15, 17.95, 17.38, 15.35, 9.08, 8.88. Masa calculada para C43H77NO2: 639.6, encontrada 640.5.
Esquema 6 7023 Compuesto 7023: A una solución del compuesto 7022 en una mezcla de metanol : solvente de etialcetato (2:1) se agregó-10% Pd/C, eliminó el aire por vacío, se purgó con argón, se repitió e ciclo (2x) , finalmanete se purgó con H2 y se continuó la reacción bajo H2 a temperatura ambiente durante la noche. Luego de completar la reacción, se filtró a través de una pequeña almohadilla de celita, se lavó con acetato de etilo, se evaporó el solvente y se purificó por cromatografía en columna usando diclorometano: metanol (5%) como gradientes para obtener formas sólidas blancas del compuesto 7023 en 64% (0.64 g) de rendimientos. XH NMR (400 MHz, CDC13) d 5.37 (s, OH), 4.85 (p, J = 6.2, 1H), 2.29 (dt, J = 14.8, 7.5, 4H) , 2.21 (s, 6H), 1.84 - 1.71 (m, 2H) , 1.49 (d, J = 5.4, 4H) , 1.36 - 1.13 (m, 64H) , 0.87 (t, J = 6.8, 6H) . 13C NMR (101 MHz, cdcl3) d 173.58, 77.54, 77.22, 76.91, 74.49, 59.17, 45.64, 34.36, 32.83, 32.70, 32.15, 29.92, 29.88, 29.81, 29.78, 29.58, 25.55, 23.36, 22.91, 14.33. Masa calculada para C43H87N02: 649.6, encontrada 650.8.
Ejemplo 18: Síntesis de éster.
Esquema 1: Síntesis serie M (ésteres) DLin-M-Cl-DMA DLin-M-Cl-DMA. Una solución de dilinolenilmetanol (0.50 g) , N, N-dimetilglicina (0.53 g), 4-N, -dimetilaminopiridina (0.60 g) y clorhidrato de l-Etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (0.50 g) en cloruro de metileno (5 mL) se agitaron a temperatura ambiente. La reacción se monitoreó mediante TLC. Cuando se convirtió la totalidad del dilinolenilmetanol, la mezcla de reacción se lavó con ácido clorhídrico diluido seguido de una solución de bicarbonato de sodio diluido. Las fracciones orgánicas se secaron en sulfato de magnesio anhidro, se filtraron y el solvente se eliminó. El residuo se transmitió a una columna de gel de sílice usando 0-3% de gradiente elución metanol/cloruro de metileno, dando como resultado DLin-M-Cl-DMA (0.35 g) como un aceite incoloro. 1HNMR: (CDC13) d.0.91 (t; J=6.8Hz; 6H) ; 2.07 (m; 8H) ; 2.42 (s; 6H) ; 2.79 (t; J=6.5Hz; 4H) ; 3.21 (s; 2H) ; 4.97 (m; 1H) ; 5.37 (m; 8H) DLin-M-C4-DMA Ácido N, -dimetil-5-aminopentanoico . Se disolvió ácido bromovalérico (2 g) en solución acuosa de dimeti lamina y se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El solvente se eliminó en un evaporador rotatorio y el residuo se trató con una solución acuosa que contiene un equivalente de bicarbonato de sodio. El solvente se eliminó, el residuo se suspendió en etanol y se filtró. El solvente se eliminó del filtrado y el residuo se suspendió en cloruro de metileno y se suspendió nuevamente. Luego de la filtración, la eliminación del solvente del filtrado dio como resultado un aceite (1.3 g) que se cristalizó suavemente en almacenamiento .
DLin-M-C4-D A; tal como se describe para DLin-M-Cl-DMA usando ácido N, N-dimetil-5-aminopentanoico . 1HNMR : (CDC13) d.0.91 (t; J=6.9Hz; 6H) ; 1.67 (m; 2H) ; 2.07 (m; 8H) ; 2.32 (s; 6H) ; 2.37 (m; 4H) ; 2.79 (t; J=6.5Hz; 4H) ; 4.88 (m; 1H) ; 5.37 (m; 8H) DLin-M-C5-DMA Ácido N, N-dimetil-6-arninobutanoico; tal como se describe para ácido N, N-dimetil-5-aminopentanoico usando ácido 6-bromobutanoico .
DLin-M-C5-DMA; tal como se describe para DLin-M-Cl-DMA usando ácido N, N-dimetil-6-aminobutanoico . 1HNMR: (CDC13) d.0.91 (t; J=6.9Hz; 6H) (m; 8H); 2.31 (t; J=7.5Hz; 2H) ; 2.39 (s; 6H) ; 2.47 (bm; 2H) 4.88 (m; 1H) ; 5.37 (m; 8H) DLen-K5-C2-DMA Len-Br. Una solución de linolenilo mesilato (2.2 g) y bromuro de litio (2.5 g) en acetona (25 mL) se agitó a temperatura ambiente durante la noche. Se agregó cloruro de metileno y la solución se lavó dos veces con agua. Las fracciones orgánicas se secaron en sulfato de magnesio anhidro, se filtraron y el solvente se eliminó. El residuo se transmitió a una columna de gel de sílice usando 0-2% de gradiente elución acetato de etilo/hexano, dando como resultado Len-Br (2.1 g) como un aceite incoloro.
DLen-M-formato . Una solución de Len-Br (2.1 g) en éter dietilico anhidro (60 mL) se trató con limaduras de magnesio (180 mg) a reflujo durante la noche. La solución se dejó enfriar y se agregó gota a gota formato de etilo (0.5 mL) . La reacción se agitó a temperatura ambiente durante tres horas. Se agregó ácido sulfúrico acuoso (5%, 40 mL) y la solución se extrajo con éter dietilico. La fracción orgánica se lavó con solución salina, se secó con sulfato de magnesio anhidro, se filtró y el solvente se eliminó. El residuo se transmitió a una columna de gel de sílice usando 0-3% de gradiente elución acetato de etilo/hexano, dando como resultado DLen-formatocomo un aceite incoloro.
DLen-M. El DLen-M-formato crudo preparado anteriormente se trató con 5% solución de hidróxido de sodio en agua/etanol (10 mL, 10:90 v/v) durante 30 minutos. La solución se diluyó con agua y se extrajo con cloruro de metileno. Las fracciones orgánicas se secaron en sulfato de magnesio anhidro, se filtraron y el solvente se eliminó. El residuo se transmitió a una columna de gel de sílice usando 0-10% de gradiente elución metanol/cloruro de metileno, dando como resultado DLen-M como un aceite incoloro.
DLen-cetona. Una solución de DLEN-M (preparada anteriormente) en cloruro de metileno (20 mL) se trató con clorocromato de piridinio (1 g) a temperatura ambiente durante dos horas. Se agregó éter dietilico (50 mL) y la suspensión resultante se lavó a través de un lecho de gel de sílice (2x) . El solvente se eliminó y el residuo se transmitió a una columna de gel de sílice usando 0-2% de gradiente acetato de etilo/hexano, dando como resultado DLen-cetona (0.57 g) como un aceite incoloro.
DLen-K5-C2-OH . Una solución de DLen-cetona (0.57 g) , p-toluensulfonato de piridinio (0.10 g) y butan-1 , 2 , 4-triol (0.50 g) en tolueno (100 mL) se sometió a reflujo en un aparato Dean & Stark durante la noche. La mezcla de reacción se dividió entre cloruro de metileno y salmuera. Las fracciones orgánicas se secaron en sulfato de magnesio anhidro, se filtraron y el solvente se eliminó. El residuo se transmitió a una columna de gel de sílice usando cloruro de metileno, dando como resultado DLen-K5-C2-OH (0.52 g) como un aceite incoloro.
Procedimiento 09-028 (17 de abril de 2009) : DLen-K5-C2-OMs. Una solución de DLen-K5-C2-OH (0.52 g) en cloruro de metileno (20 mL) se trató con metanosulfonilo anhídrido (0.40 g) y trietilamina (0.7 mL) a temperatura ambiente durante la noche. La fracción orgánica se lavó con solución salina, se secó con sulfato de magnesio anhidro, se filtró y el solvente se eliminó. El residuo se usó en reacciones posteriores sin purificación adicional.
DLen-K5-C2-DMA Una solución de DLen-K5-C2-OMs crudo en 2.0 M dimetilamina en THF (15 mL) se agitó a temperatura ambiente durante dos días. El solvente se eliminó en un evaporador rotatorio y el residuo se transmitió al gel de sílice usando 0-6% de gradiente metanol/cloruro de metileno, dando como resultado DLen-K5-C2-DMA (0.34 g) como un aceite incoloro . 1HNMR : (CDC13) d.0.95 (t; J=7.5Hz; 6H) ; 1.56 (m; 4H) ; 1.70 (m; 1H); 1.81 (m; 1H) ; 2.05 (m; 8H) ; 2.27 (s; 6H) ; 2.36 (m; 1H) ; 2.46 (m; 1H) ; 2.79 (t; J=6.0Hz; 8H) ; 3.27 (t; J=7.2Hz; 1H) ; 4.06 (m; 2H) ; 5.34 (m; 12H) DO-K5-C2-DMA O-Br; tal como se describe para Len-Br usando oleilo mesilato .
DO-M-formato; tal como se describe para DLen-M-formato usando O-Br.
DO-M; tal como se describe para DLen-M usando DO-M-formato .
DO-cetona; tal como se describe para DLen-cetona usando DO-M.
DO-K5-C2-OH; tal como se describe para DLen-K5-C2-OH usando DO-cetona.
DO-K5-C2-OMs; tal como se describe para DLen-K5-C2-OMs usando DO-K5-C2-OH.
DO-K5-C2-DMA; tal como se describe para DLen-K5-C2-DMA usando DO-K5-C2-O S . 1HNMR : (CDCI3) d.0.86 (t; J=6.8Hz; 6H) ; 1.55 (m; 4H) ; 1.64 (m; 1H) ; 1.79 (ddd; J=12.6Hz, J'=11.2Hz, J"=6.2Hz; 1H) ; 1.99 (m; 8H) ; 2.20 (s; 6H) ; 2.26 (ddd; J=12.2Hz, J'=9.5Hz; J"=5.9Hz; 1H); 2.38 (ddd; J=11.9Hz, J'=9.7Hz, J"=5.6Hz; 1H) ; 3.46 (t; J=7.3Hz; 1H) ; 4.05 (m; 2H) ; 5.32 (m; 4H) DLin-M-C3-A Procedimiento 09-071 (14 de julio de 2009) : DLin-M-C3-A. Una solución de dilinolenilmetanol (0.51 g) , ácido N-BOC-4-aminobutirico (0.53 g) , 4-N, -dimetilaminopiridina (0.39 g) y clorhidrato de l-Etil-3- ( 3-dimetilaminopropil ) carbodiimida (0.30 g) en cloruro de metileno (5 mL) se agitaron a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se lavó con ácido clorhídrico diluido. Las fracciones orgánicas se secaron en sulfato de magnesio anhidro, se filtraron y el solvente se eliminó. El residuo se trató con ácido trifluoroacético (2 mL) a temperatura ambiente durante una hora. La solución se diluyó con cloruro de metileno, se lavó con agua y luego se lavó con bicarbonato de sodio acuoso. Las fracciones orgánicas se secaron en sulfato de magnesio anhidro, se filtraron y el solvente se eliminó. El residuo se transmitió a una columna de gel de sílice usando 0-10% de gradiente elución metanol/cloruro de metileno, dando como resultado DLin-M-C3-A (0.45 g) como un aceite incoloro . 1HNMR : (CDC13) d.0.87 (t; J=6.8Hz; 6H) ; 1.75 (p; J=7.3Hz; 2H); 2.03 (m; 8H) ; 2.32 (t; J=7.4Hz 2H) ; 2.75 (m; 6H) ; 4.84 (p; J= 6.2Hz; 1H) ; 5.35 (m; 8H) DLin-M-C3-MA DLin-M-C3-Br . Una solución de dilinolenilmetanol (0.5 g) en cloruro de metileno (20 mL) se trató con cloruro de 4-bromobutiril (0.40 g) y trietilamina (1 mL) con agitación a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de reacción se diluyó con agua, se acidificó con ácido clorhídrico y se extrajo con cloruro de metileno. Las fracciones orgánicas se secaron en sulfato de magnesio anhidro, se filtraron y el solvente se eliminó. El DLin-M-C3-Br crudo se usó en reacciones posteriores sin purificación adicional.
Procedimiento 09-061 (16 de junio de 2009) : DLin-M-C3-??. Una solución de DLin-M-C3-Br (0.51 g) se trató con una solución de metilamina en THF/cloruro de metileno (50 mL; 20/30 v/v) a temperatura ambiente. La reacción se monitoreó mediante TLC. Cuando la reacción se completó el solvente se eliminó en un evaporador rotatorio. El residuo se dividió entre cloruro de metileno y ácido clorhídrico diluido. La fase orgánica se lavó con solución de bicarbonato de sodio acuoso diluido, se secó con sulfato de magnesio anhidro, se filtró y el solvente se eliminó. El residuo se transmitió a una columna de gel de sílice usando 0-4% de gradiente elución metanol/cloruro de metileno, dando como resultado DLin-M-C3-MA (0.31 g) como un aceite incoloro. 1HNMR : (CDC13) d.0.87 (t; J=6.9Hz; 6H) ; 1.82 (m; 2H) ; 2.03 (m; 8H) ; 2.33 (t; J=7.4Hz; 2H) ; 2.43 (s; 3H) ; 2.62 (t; J=7.1Hz; 2H) ; 2.75 (t; J=6.4Hz; 4H) ; 4.84 (p; J= 6.3Hz; 1H) ; 5.35 (m; 8H) DLin-M-C3-EA DLin-M-C3-EA; tal como se describe para DLin-M-C3- A usando etilamina.
XHNMR: (CDCI3) d.0.87 (t; J=6.8Hz; 6H) ; 1.10 (t; J=7.1Hz; 3H) ; 1.82 (p; J=7.3Hz; 2H) ; 2.03 (m; 8H) ; 2.33 (t; J=7.4Hz; 2H) ; 2.65 (q; J=7.0Hz; 4H) ; 2.62 (t; J=7.1Hz; 2H); 2.75 (t; J=6.4Hz; 4H) ; 4.84 (p; J= 6.3Hz; 1H) ; 5.33 (m; 8H) DLin-M-C3-IPA DLin-M-C3-IPA; tal como se describe para DLin-M-C3-MA ussando isopropilamina. 1HNMR : (CDCI3) d.0.87 (t; J=6.8Hz; 6H) ; 1.03 (d; J=6.2Hz; 6H) ; 1.78 (p; J=7.3Hz; 2H) ; 2.03 (m; 8H) ; 2.32 (t; J=7.4Hz; 2H) 2.60 (t; J=7.3Hz; 2H) ; 2.77 (m; 5H) ; 4.84 (p; J= 6.2Hz; 1H) ; 5.34 (m; 8H) DLin-M-C3-DEA (ED50 = 0.3) DLin- -C3-DEA; tal como se describe para DLin-M-C3-MA usando dietilamina .
DLÍn-M-C3-DIPA (ED50=4.5) DLin-M-C3-DIPA; tal como se describe para DLin- -C3-MA usando diisopropilamina.
DLin-M-C3-MIPA DLin-M-C3-MIPA; tal como se describe para DLin-M-C3-MA usando metilisopropilamina.
DLin-M-C3-EIPA DLin-M-C3-EIPA; tal como se describe para DLin-M-C3-MA usando etilisopropilamina . • 1HNMR : (CDCI3) d.0.87 (t; J=6.8Hz; 6H) ; 0.94 (d; J=6.2Hz; 6H) ; 0.99 (t; J=7.lHz; 3H) ; 1.71 (m; 2H) ; 2.03 (m; 8H) ; 2.30 (t; J=7.3Hz; 2H) ; 2.37 (m; 2H) ; 2.43 (q; J=7.1Hz; 2H) ; 2.75 (t; J=6.4Hz; 4H) ; 2.90 (m; 1H) ; 4.84 (m; 1H) ; 5.34 (m; 8H) DLin-M-C3-MEA DLin-M-C3-MEA; tal como se describe para DLin-M-C3-MA usando metiletilamina . 1HNMR : (CDCI3) d.0.87 (t; J=6.9Hz; 6H) ; 1.02 (t; J=7.2Hz; 3H) ; 1.77 (m; 2H) ; 2.03 (m; 8H) 2.19 (s; 3H) ; 2.30 (m; 4H) ; 2.39 (q; J=7.2Hz; 2H) ; 2.75 (t J=6.5Hz; 4H) ; 4.84 (m; 1H) ; 5.34 (m; 8H) Ejemplo 19: Síntesis de 2 , 2-Dilinoleil-5-dimetilaminometil-[1, 3] -dioxano ( DLin-K6S-Cl-DMA) LiBr Acetona Mg, éter II Etil formiato 1. Síntesis de Bromuro de linoleilo (II) Una mezcla de sulfonato de linoleilo metano (26.6g, 77.2 mmol) y bromuro de litio (30.5g, 350 mmol) en acetona (350 mL) se agitó en nitrógeno durante dos días. La suspensión resultante se filtró y el sólido se lavó con acetona. El filtrado y el lavado se combinaron y el solvente se evaporó.
El residuo resultante se trató con agua (300 mL) . La fase acuosa se extrajo con éter (3x150 mL) . La fase de éter combinada se lavó con agua (200 mL) , salmuera (200 mL) y luego se secó en Na2SC> anhidro. El solvente se evaporó para proporcionar 29.8g de aceite amarillento. El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 700 mL) eluido con hexanos. Esto proporcionó 20.8 g (82%) de bromuro de linoleilo (II) . 2. Síntesis de Formato de Dilinoleilmetilo (III) A una suspensión de limaduras de Mg (1.64g, 67.4 mmol) con un cristal de yodo en 500 mL de éter anhidro en nitrógeno se agregó a una solución de bromuro de linoleilo (II, 18.5g, 56.1 mmol) en 250 mL de éter anhidro a temperatura ambiente. La mezcla resultante se sometió a reflujo en nitrógeno durante la noche. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente. A la mezcla nebulosa en nitrógeno se agregó gota a gota formato de etilo (4.24g, 57.2 mmol) . Tras la adición, la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se trató con 10% de solución acuosa de H2S04 (250 mL) . La fase de éter se separó y la fase acuosa de extrajo con éter (150 mL) . La fase orgánica combinada se lavó con agua (400 mL) , salmuera (300 mL) y luego se secó en Na2S04 anhidro. La evaporación del solvente proporcionó 17.8 g de un ácido amarillento como producto crudo (III). El producto crudo se usó directamente en el siguiente paso sin purificación adicional . 3. Síntesis de Dilinoleilo metanol (IV) El anterior formato de dilinoleilmetilo crudo (III, 17.8g, 0.71 mmol) y KOH (3,75g) se agitaron en 85% de EtOH a temperatura ambiente en nitrógeno durante la noche. Tras completar 'la reacción, la mayoría del solvente se evaporó. La mezcla resultante se trató con 150 mL de 5% de solución HC1. La fase acuosa se extrajo con éter (2x150 mL) . El extracto de éter combinado se lavó con agua (2 x 100 mL) , salmuera (100 mL) y luego se secó en a2S04 anhidro. La evaporación del solvente proporcionó 20.0 g de dilinoleilo metanol (IV) como un aceite amarillento. El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 700 mL) eluido con 0-5% de gradiente de acetato de etilo en hexanos . Esto proporcionó 9.6 g de dilinoleilo metanol (IV) . 4. Síntesis de dilinoleilo cetona (V) A una mezcla de dilinoleilo metanol (4.0g, 7.2 mmol) y carbonato de potasio anhidro (0.4g) en 100 mL de CH2CI2 se agregaron a clorocromato de piridinio (PCC, 4.0g, 19 mmol) . La suspensión resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Luego se agregó éter (300 mL) en la mezcla y la suspensión café resultante se filtró a través de una almohadilla de gel de sílicel (150 mL) . La almohadilla de gel de sílice luego se lavó con éter (3 x 75 mL) . El filtrado de éter y los lavados se combinaron. La evaporación del solvente proporcionó 5.1 g de un residuo oleoso como producto crudo. El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 200 mL) eluido con 0-4% de acetato de etilo en hexanos. Esto proporcionó 3.0 g (79%) de dilinoleilo cetona (V) . 5. Síntesis de 2 , 2-dilinoleilo-5-hidroximetil ) - [ 1 , 3 ] - dioxano (VI) Una mezcla de dilinoleilo cetona (V, 1.05 g, 2.0 mmol), 2-hidroximetil-l , 3-propanodiol (490 mg, 4.2 mmol) y p-toluensulfonato de piridinio (100 mg) en 150 mL de tolueno se sometieron a reflujo en argón durante la noche con un tubo Dean-Stark para eliminar el agua. La mezcla resultante se enfrió a temperatura ambiente. La fase orgánica se lavó con agua (2 x 100 mL) , salmuera (100 mL) y luego se secó en Na2S04 anhidro. La evaporación del solvente dio como resultado un aceite pálido (1.2 g) . El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 100 mL) con 0-5% gradiente de metanol en diclorometano como eluyente. Esto proporcionó 0.93 g de VI puro como un aceite pálido. 6. Síntesis de 2 , 2-Dilinoleil-5-metanosulfonilmetil- [1, 3] -dioxano (VII) A una solución de 2, 2-dilinoleil-5-hidroximetil) - [1, 3] -dioxano (VI, 0.93 g, 1.5 mmol) y trietilamina seca (290 mg, 2.9 mmol) en 50 mL de CH2CI2 anhidro se agregó metanosulfonilo anhídrido (400 mg, 2.3 mmol) en nitrógeno. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La fase orgánica se lavó con agua (2 x 75 mL) , salmuera (75 mL) y luego se secó en Na2S04 anhidro. El solvente se evaporó para proporcionar 1.0 g de aceite pálido. El producto crudo se usó en el siguiente paso sin purificación adicional. 7. Síntesis de 2, 2-Dilinoleil-5-dimetilaminometil- [1, 3] - dioxano ( DLin-K6S-Cl-DMA) Al material crudo anterior (VII, 1.0 g) en nitrógeno se agregó 20 mL de dimetilamina en THF (2.0 M) . La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 7 mins. Se obtuvo un residuo oleoso tras la evaporación del solvente. La cromatografía en columna de gel de sílice (malla 230-400, 100 mL) con 0-3% gradiente de metanol en cloroformo como eluyente dio como resultado 150 mg del producto DLin-K6S-Cl-DMA como un aceite pálido. H NMR (400 MHz, CDC13) d: 5.24-5.51 (8, m, 4x CH=CH), 4.04 (2H, dd, 2 x OCH) ) , 3.75 [2H, dd OCH) , 2.7-2.9 (2H, br, NCH2) , 2.78 (4H, t, 2 x C=C-CH2-C=C) , 2.57 (6H, s, 2 x NCH3), 1.95-2.17 (9H, q, 4 x CH2 alílico y CH) , 1.67- 1.95 (2H, m, CH2), 1.54-1.65 (4H, m, 2 x CH2), 1.22-1.45 (32H, m) , 0.90 (6H, t, 2 x CH3) ppm.
Ejemplo 20: Síntesis de 2, 2-Dilinoleil-5-dimetilaminobutil- [1, 3] -dioxano ( DLin-K6S-C4-DMA) Este compuesto se sintetizó como un aceite pálido en una manera similar a aquél del Ejemplo 19 donde 2- hidroximetil-1, 3-propanodiol se reemplazó por 2- hidroxibutil-1 , 3-propanodiol. XH NMR (400 MHz , CDC13) d: 5.24-5.45 (8, m, 4x CH=CH) , 3.79 (2H, dd, 2 x OCH) ) , 3.50 (2H, dd OCH), 2.76 (4H, t, 2 x C=C-CH2-C=C) , 2.37 (2H, t, NCH2) , 2.31 (6H, s, 2 x NCH3), 2.04 (8H, q, 4 x CH2 alílico) , 1.63-1.90 (3H, m, ), 1.45-1.62 (4H, m, 2 x CH2) , 1.22-1.45 (36H, m) , 0.90 (6H, t, 2 x CH3) ppm.
Ejemplo 21: Síntesis de 2, 2-Dilinoleil-5-dimetilaminoetil-[1, 3] -dioxano ( DLin-K6S-C2-DMA) Este compuesto se sintetizó como un aceite pálido en una manera similar a aquél del Ejemplo 19 donde 2- hidroximetil-1, 3-propanodiol se reemplazó por 2- hidroxietil-1 , 3- propanodiol. XH NMR (400 MHz, CDC13) d: 5.25-5.45 (8, m, 4x CH=CH), 3.87 (2H, dd, 2 x OCH) ) , 3.55 (2H, dd OCH) , 2.75 (4H, t, 2 x C=C-CH2-C=C) , 2.45-2.60 (2H, br, NCH2) , 2.40 (6H, s, 2 x NCH3) , 2.03 (8H, q, 4 x CH2 alilico) , 1.73-1.86 (1H, m) , 1.56-1.72 (6H, m, 2 x CH2) , 1.22-1.45 (32H, m) , 0.90 (6H, t, 2 x CH3) ppm.
Ejemplo 22: Síntesis de 2, 2-dilinoleilo-4-dimetilaminoetil ) -[1,3] -dioxano (DLin-K6A-C2—DMA) Tolueno DLin-K6A-C2-DMA 1. Síntesis de 1 , 3 , 5-pentanotriol (II) Se agregó gota a gota Dietil 3-hidroxiglutarato (I, 1.0 g, 4.9 mmol) en THF anhidro (10 mL) a una suspensión de L1AIH4 en THF anhidro (110 mL) en nitrógeno con un baño de agua fría. Tras la adición, el baño se eliminó y la suspensión se agitó a temperatura ambiente durante 2 días. La mezcla resultante se extinguió mediante la adición de 13 mL de salmuera muy lentamente con un baño de agua helada. Dio como resultado una suspensión blanca y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El sólido se filtró y se lavó con THF. El filtrado y el lavado se combinaron y el solvente se evaporó para proporcionar 0.70 g de aceite pálido. La cromatografía en columna del producto crudo (malla 230-400 Si02, 100 mL, 0-12% gradiente de metanol en cloroformo) proporcionó 0.54 g de II como un aceite incoloro. 2. Síntesis de 2, 2-dilinoleilo-4- (2-hidroxietil) - [1, 3] - dioxano (IV) Una mezcla de dilinoleilo cetona (III, 0.80 g, 1.5 mmol), 1, 3, 5-pentanotriol (II, 0,54 g, 4.5 mmol) y p-toluensulfonato de piridinio (60 mg) en 150 mL de tolueno se sometieron a reflujo en nitrógeno durante la noche con un tubo Dean-Stark para eliminar el agua. La mezcla resultante se enfrió a temperatura ambiente. La fase orgánica se lavó con agua (2 x 75 mL) , salmuera (75 mL) y luego se secó en Na2S04 anhidro. La evaporación del solvente dio como resultado un aceite pálido (1.1 g) . El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 75 mL) con 0-3% gradiente de metanol en diclorometano como eluyente. Esto proporcionó 0.75 g (79%) de IV puro como un aceite incoloro. 3. Síntesis de 2, 2-dilinoleilo-4- (2-metanosulfoniletilo) - [1, 3] -dioxano (V) A una solución de 2, 2-dilinoleilo-4- (2-hidroxietil ) - [ 1 , 3 ] -dioxano (IV, 0.75 g, 1.2 mmol) y trietilamina seca (0,58 g, 5.7 mmol) en 40 mL de CH2C12 anhidro se agregó metanosulfonilo anhídrido (0.50 g, 2.9 mmol) en nitrógeno. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La fase orgánica se lavó con agua (2 x 50 mL) , salmuera (50 mL) y luego se secó en Na2SC>4 anhidro. El solvente se evaporó para proporcionar 0.80 g de aceite pálido como producto crudo. El producto crudo se usó en el siguiente paso sin purificación adicional. 4. Síntesis de 2, 2-dilinoleilo-4- ( 2-dimetilaminoetil ) - [1, 3] - dioxano (DLin-K6A-C2-DMA) Al material crudo anterior (V, 0.80 g) en nitrógeno se agregó 15 mL de dimetilamina en THF (2.0 M) . La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 6 mins. El sólido se filtró. Se obtuvo un residuo oleoso tras la evaporación del solvente. La cromatografía en columna en gel de sílice (malla 230-400, 100 mL) con 0-6% gradiente de metanol en diclorometano como eluyente dio como resultado 0.70 g del producto DLin-K6A-C2-DMA como un aceite pálido. ?? NMR (400 MHz, CDC13) d: 5.28-5.45 (8, m, 4x CH=CH) , 3.85-4.0 (2H, m, 2 x OCH) , 3.78 (1H, dd, OCH) , 2.78 (4H, t, 2 x C=C- CH2-C=C), 2.55-2.90 (2H, br, NCH2), 2.47 (6H, s, 2 x NCH3) , 2.05 (8H, q, 4 x CH2 alilico) , 1.65-1.90 (4H, m, CH2) , 1.47- 1.65 (4H, m, CH2) , 1.1-1.65 (36H, m) , 0.90 (6H, t, 2 x CH3) ppm.
Ejemplo 23: Síntesis de 2, 2-dilinoleilo-4- (3- dimetilaminopropil ) -[1,3] -dioxano ( DLin- 6A-C3-DMA) 1. Síntesis de 1 , 3, 6-hexanotriol (II) Se agregó gota a gota Dietil ß-cetoadipato (I, 1.86 g, 8.6 ramol) a una suspensión de LiAlH4 en THF anhidro (90 mL) en argón con un baño de agua helada. Tras la adición, el baño se eliminó y la suspensión se agitó a temperatura ambiente durante 2 días. La mezcla resultante se extinguió mediante la adición de 10 mL de salmuera muy lentamente con un baño de agua helada. Dio como resultado una suspensión blanca y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El sólido si filtró y lavó con THF seguido de EtOH (2 x 50 mL) . El filtrado y el lavado se combinaron y el solvente se evaporó para proporcionar 0.90 g de aceite pálido. La cromatografía en columna del producto crudo (malla 230-400 Si02, 100 mL, 0-10% gradiente de metanol en diclorometano) proporcionó 0.70 g de II como un aceite incoloro. 2. Síntesis de 2, 2-dilinoleilo-4- (3-hidroxipropil) - [1, 3] - dioxano (IV) Una mezcla de dilinoleilo cetona (III, 1.80 g, 3.4 mmol) , 1 , 3, 6-hexanotriol (II, 0,50 g, 3.7 mmol) y p-toluensulfonato de piridinio (100 mg) en 120 mL de tolueno se sometieron a reflujo en nitrógeno durante 3 horas con un tubo Dean-Stark para eliminar el agua. La mezcla resultante se enfrió a temperatura ambiente. La fase orgánica se lavó con agua (2 x 50 mL) , salmuera (50 mL) y luego se secó en Na2S04 anhidro. La evaporación del solvente dio como resultado un aceite pálido (2.0 g) . El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 50 mL) con 0-3% gradiente de metanol en diclorometano como eluyente. Esto proporcionó 0.90 g (41%) de IV puro como un aceite incoloro. 3. Síntesis de 2 , 2-dilinoleilo-4- ( 3-metanosulfonilpropilo) - [1, 3] -dioxano (V) A una solución de 2, 2-dilinoleilo-4- (3-hidroxipropil) -[ 1, 3] -dioxano (IV, 0.97 g, 1.5 mmol) y trietilamina seca (0,44 g, 4.3 mmol) en 60 mL de CH2C12 anhidro se agregó metanosulfonilo anhídrido (0.60 g, 3.5 mmol) en argón. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La fase orgánica se lavó con agua (2 x 30 mL) , salmuera (30 mL) y se secó en MgS04 anhidro. El solvente se evaporó para proporcionar 1.1 g de aceite pálido como producto crudo. El producto crudo se usó en el siguiente paso sin purificación adicional. 4. Síntesis de 2 , 2-dilinoleilo-4- ( 3-dimetilaminopropil ) - [1, 3] -dioxano ( DLin-K6A-C3-DMA) Al material crudo anterior (V, 1.1 g) en argón se agregó 20 mL de dimetilamina en THF (2.0 M) . La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 5 mins . El sólido se filtró. Se obtuvo un residuo oleoso tras la evaporación del solvente. La cromatografía en columna de gel de sílice (malla 230-400, 40 mL) con 0-7% gradiente de metanol en diclorometano como eluyente dio como resultado 0.85 g del producto DLin-K6A-C3-D A como un aceite pálido. XH NMR (400 Hz, CDC13) d: 5.25-5.45 (8, m, 4 x CH=CH) , 3.7-4.0 (3H, m, 3 x OCH) , 2.77 (4H, t, 2 x C=C-CH2-C=C) , 2.5-2.8 (2H, br, NCH2), 2.5 (6H, s, 2 x NCH3) , 2.05 (8H, q, 4 x CH2 alílico) , 1.65-1.90 (4H, m, 2 x CH2), 1.40-1.65 (4H, m, 2 x CH2) , 1.1- (38H, m) , 0.90 (6H, t, 2 x CH3) ppm Ejemplo 24: Síntesis de 2 , 2-Diaraquidonil-4- ( 2- dimetilaminoetil) - [1, 3] -dioxalano ( DAra-K5-C2--DMA) oso2CH3 Eter I l.Mg, éter II DAra-K5-C2-DMA 1. Síntesis de Bromuro de Araquidonilo (II) Una mezcla de sulfonato de araquidonil metano (1.0 g, 2.7 mmol) y bromuro de magnesio (2.2 g, 12 mmol) en éter anhidro (40 mL) se agitó en argón durante dos días. La suspensión resultante se filtró y el sólido se lavó con éter (2x10) mL) . El filtrado y el lavado se combinaron y el solvente se evaporó. El residuo resultante se trató con hexanos (50 mL) . El sólido se filtró y el solvente se evaporó dando como resultando un residuo oleoso. El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 30 mL) eluido con hexanos. Esto proporcionó 1 g de bromuro de araquidonilo (II) como un aceite incoloro. 2. Síntesis de Formato de diaraquidonilmetilo (III) A una solución de bromuro de araquidonilo (II, 1 g, 3 mmol) en éter anhidro (30 mL) se agregaron limaduras de Mg (78 mg, 3.2 mmol) seguido de un cristal de yodo. La mezcla resultante se sometió a reflujo en nitrógeno durante 10 horas. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente. A la mezcla nebulosa en nitrógeno se le agregó formato de etilo (0,25 mL) y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. A la reacción se agregó 20 mL de 10% de solución acuosa de H2SO4. La fase de éter se separó y la fase acuosa de extrajo con éter (30 mL) . La fase orgánica combinada se lavó con agua (2 x 25 mL) , salmuera (25 mL) y luego se secó en Na2S04 anhidro. La evaporación del solvente proporcionó 1.1 g de un ácido pálido como producto crudo (III) . El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 40 mL) eluido con 0-3% de gradiente de acetato de etilo en hexanos. Esto proporcionó 0.43 g (40%) de formato de diaraquidonilmetilo (III) como un aceite pálido. 3. Síntesis de diaraquidonil metanol (IV) El anterior formato de diaraquidonilmetilo (III, 0.43 g, 0.71 mmol) y KOH (100 mg) se agitaron en 95% de EtOH (20 mL) a temperatura ambiente en nitrógeno durante la noche. Tras completar la reacción, la mayoría del solvente se evaporó. La mezcla resultante se trató con 20 mL de solución HC1 2 . La fase acuosa se extrajo con éter (2x30 mL) . El extracto de éter combinado se lavó con agua (2 x 25 mL) , salmuera (25 mL) y luego se secó en a2S0 anhidro. La evaporación del solvente proporcionó 0.44 g de IV como un aceite pálido. El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 40 mL) eluido con 0-5% de gradiente de acetato de etilo en hexanos . Esto proporcionó 0.41 g de diaraquidonilmetilo metanol (IV) como un aceite incoloro. 4. Síntesis de diaraquidonil cetona (V) A una mezcla de diaraquidonil metanol (IV, 0.41 g, 0.71 mmol) y carbonato de potasio anhidro (0.05g) en 10 mL de CH2CI2 se agregaron a clorocromato de piridinio (PCC, 0.50 g, 2.3 mmol) . La suspensión resultante se agitó a temperatura ambiente durante 90 mins . Luego se agregó éter (50 mL) en la mezcla y la suspensión café resultante se filtró a través de una almohadilla de floresil (30 mL) . La almohadilla luego se lavó con éter (3 x 30 mL) . El filtrado de éter y los lavados se combinaron. La evaporación del solvente proporcionó 0.40 g de un residuo oleoso como producto crudo. El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 10 mL) eluido con 0-3% de éter en hexanos. Esto proporcionó 0.30 g (75%) de diaraquidonil cetona (V) . 1H NMR (400 MHz, CDC13) 5: 5.3-5.5 (16H, m, 8 x CH=CH) , 2.82 (12H, t, 6 x C=C-CH2-C=C) , 2.40 (4H, t, 2 x CO-CH2), 2.08 (8H, m, 4 x CH2 alílico), 1.25-1.65 (20H, m) , 0.90 (6H, t, 2 x CH3) ppm. 5. Síntesis de 2, 2-Diaraquidonil-4- (2-hidroxietil) - [1, 3] - dioxalano (VI) Una mezcla de diaraquidonil cetona (V, 0.30 g, 0.52 mmol), 1, 2, 4-butanotriol (0.25 g, 2.4 mmol) y p-toluensulfonato de piridinio (20 mg) en 60 mL de tolueno se sometieron a reflujo en argón durante la noche con un tubo Dean-Stark para eliminar el agua. La mezcla resultante se enfrió a temperatura ambiente. La fase orgánica se lavó con agua (2 x 30 mL), salmuera (30 mL) y luego se secó en Na2S04 anhidro. La evaporación del solvente dio como resultado un residuo oleoso amarillento. El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 40 mL) con 0-2% de metanol en diclorometano como eluyente. Esto proporcionó 0.29 g (84%) de VI puro como un aceite pálido. 6. Síntesis de 2 , 2-Diaraquidonil-4- ( 2-metanosulfoniletil ) - [1, 3] -dioxalano (VII) A una solución de 2, 2-diaraquidonil-4- ( 2-hidroxietil ) -[1, 3] -dioxalano (VI, 0.29 g, 0.43 mmol) y trietilamina seca (254 mg, 2.5 mmol) en 20 mL de CH2C12 anhidro se agregó metanosulfonilo anhídrido (0.20 g, 1.1 mmol) en nitrógeno. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se diluyó con 30 mL de CH2C12. La fase orgánica se lavó con agua (2 x 25 mL) , salmuera (25 mL) y se secó en MgS04 anhidro. El solvente se evaporó para proporcionar 0.30 g de aceite pálido. El producto crudo se usó en el siguiente paso sin purificación adicional. 7. Síntesis de 2, 2-Diaraquidonil-4- (2-dimetilaminoetil) - [1, 3] -dioxalano ( DAra-K5-C2--D A) Al material crudo anterior (VII, 0.30 g) en argón se agregó 15 mL de dimetilamina en THF (2.0 ) . La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 6 mins . Se obtuvo un residuo oleoso tras la evaporación del solvente. La cromatografía en columna en gel de sílice (malla 230-400, 40 mL) con 0-5% gradiente de metanol en diclorometano como eluyente dio como resultado 0.18 g del producto DAra-K5-C2-DMA como un aceite pálido. *H NMR (400 MHz , CDC13) d: 5.3-5.5 (16H, m, 8 x CH-CH), 4.0-4.17 (2H, m, 2 x OCH) , 3.49 (1H, t, OCH), 2.65-2.85 (14H, m, 6 x C=C-CH2-C=C, NCH2) , 2.55 (6H, s, br, 2 x NCH3), 2.06 (8H, m, 4 x CH2 alílico) , 1.80-1.92 (2H, m, CH2), 1.4-1.75 (4H, m, 2 x CH2), 1.22-1.45 (20H, m) , 0.90 (6H, t, 2 x CH3) ppm.
Ejemplo 25: Síntesis de 2, 2-Didocosahexaenoil-4- (2-dimetilaminoetil) -[1,3] -dioxalano (DDha-K5-C2—DMA) VII Dimetilamina DDha-K5-C2-DMA 1. Síntesis de Bromuro de Didocosahexaenoilo (II) Una mezcla de docosahexaenoilo metanosulfonato (2.0 g, 5.1 mmol) y bromuro de magnesio (4.3 g, 23 mmol) en éter anhidro (100 mL) se agitó en argón durante la noche. La suspensión resultante se filtró y el sólido se lavó con éter (2x30 mL) . El filtrado y el lavado se combinaron y el solvente se evaporó. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 40 mL) eluido con hexanos . Esto proporcionó 2,2 g de bromuro de docosahexaenoilo ( II ) como un aceite incoloro. 2. Síntesis de Formato de Didocosahexaenoilo (III) A una solución de bromuro de docosahexaenoilo (II, 2,2 g, 6,0 mmol) en éter anhidro (60 mL) se agregaron limaduras de Mg (145 mg, 6.0 mmol) seguido de un cristal de yodo. La mezcla resultante se sometió a reflujo en argón durante 5 horas. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente. A la mezcla nebulosa en argón se le agregó formato de etilo (0,50 mL) y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. A la reacción se agregó 40 mL de 5% de solución acuosa de H2SO4. La fase de éter se separó y la fase acuosa de extrajo con éter (50 mL) . La fase orgánica combinada se lavó con agua (2 x 50 mL) , salmuera (50 mL) y luego se secó en MgS04 anhidro. La evaporación del solvente proporcionó 2.3 g de un ácido amarillento como producto crudo (III) . El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 50 mL) eluido con 0-7% de gradiente de acetato de etilo en hexanos. Esto proporcionó 1.38 g (65%) de Didocosahexaenoil metil formato (III) como un aceite pálido. 3. Síntesis de Didocosahexaenoilo metanol (IV) El didocosahexaenoil metil formato (III, 1.38 g, 2.1 mmol) y KOH (300 mg) se agitaron en 90% de EtOH (70 mL) a temperatura ambiente en nitrógeno durante 90 min. Tras completar la reacción, la mayoría del solvente se evaporó. La mezcla resultante se trató con 60 mL de solución 2M HC1. La fase acuosa se extrajo con éter (2x75 mL) . El extracto de éter combinado se lavó con agua (2 x 50 mL) , salmuera (50 mL) y se secó en MgS04 anhidro. La evaporación del solvente proporcionó 1.18 g de IV como un aceite amarillento. El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 50 mL) eluido con 0-6% de gradiente de acetato de etilo en hexanos. Esto proporcionó 1,0 g de Didocosahexaenoil metanol (IV) como un aceite incoloro. 4. Síntesis de Didocosahexaenoilo cetona (V) A una mezcla de Didocosahexaenoilo metanol (IV, 1.2 g, 1.9 mmol) y carbonato de potasio anhidro (O.lg) en 30 mL de CH2CI2 se agregaron a clorocromato de piridinio (PCC, 1.05 g, 4.8 mmol). La suspensión resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Luego se agregó éter (120 mL) en la mezcla y la suspensión café resultante se filtró a través de una almohadilla de gel de sílice (75 mL) . La almohadilla luego se lavó con éter (3 x 75 mL) . El filtrado de éter y los lavados se combinaron. La evaporación del solvente proporcionó 1.3 g de un residuo oleoso como producto crudo. El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 40 mL) eluido con 0-3% de acetato de etilo en hexanos. Esto proporcionó 0.83 g (69%) de Didocosahexaenoilo cetona (V) . 5. Síntesis de 2 , 2-Didocosahexaenoil -4- (2-hidroxietil ) - [1, 3] -dioxalano (VI) Una mezcla de diaraquidonil cetona (V, 0.43 g, 0.69 mmol), 1, 2, -butanotriol (0.35 g, 3.3 mmol) y p-toluensulfonato de piridinio (50 mg) en 75 mL de tolueno se sometieron a reflujo en argón durante la noche con un tubo Dean-Stark para eliminar el agua. La mezcla resultante se enfrió a temperatura ambiente. La fase orgánica se lavó con agua (2 x 30 mL) , salmuera (30 mL) y se secó en MgS04 anhidro. La evaporación del solvente dio como resultado un residuo oleoso amarillento. El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 40 mL) con 0-2% de metanol en diclorometano como eluyente. Esto proporcionó 0.43 g (95%) de VI puro como un aceite pálido. 6. Síntesis de 2, 2-Didocosahexaenoil -4- (2- metanosulfoniletil ) -[1,3] -dioxalano (VII ) A una solución de 2, 2-Didocosahexaenoil-4- (2- hidroxietil) - [1, 3] -dioxalano (VI, 0.42 g, 0.59 mmol) y trietilamina seca (300 mg, 2.9 mmol) en 50 mL de CH2CI2 anhidro se agregó metanosulfonilo anhídrido (0.25 g, 1.4 mmol) en nitrógeno. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La fase orgánica se lavó con agua (2 x 25 mL) , salmuera (25 mL) y se secó en MgS04 anhidro. El solvente se evaporó para proporcionar 0.43 g de aceite pálido. El producto crudo se usó en el siguiente paso sin purificación adicional. 7. Síntesis de 2, 2-Didocosahexaenoil-4- ( 2-dimetilaminoetil ) - [1, 3] -dioxalano (DDha-K5-C2—DMA) Al material crudo anterior (VII, 0.43 g) en argón se agregó 15 mL de dimetilamina en THF (2.0 M) . La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 6 mins. Se obtuvo un residuo oleoso tras la evaporación del solvente. La cromatografía en columna en gel de sílice (malla 230-400, 40 mL) con 0-5% gradiente de metanol en diclorometano como eluyente dio como resultado 0.31 g del producto DDha-K5-C2-DMA como un aceite amarillento. H NMR (400 MHz , CDC13) d: 5.25-5.45 (24H, m, 12 x CH=CH) , 4.05-4.17 (2H, m, 2 x OCH) , 3.50 (1H, t, OCH), 2.87-3.15 (2H, br., NCH2) 2.73-2.87 (20H, m, 10 x C=C-CH2-C=C) , 2.65 (6H, s, br, 2 x NCH3) , 2.06 (8H, m, 4 x CH2 alílico) , 2.0-2.2 (2H, m, CH2) , 1.75-1.95 (2H, m, CH2), 1.3-1.65 (8H, m, 4 x CH2) , 0.90 (6H, t, 2 x CH3) ppm.
Ejemplo 26: Síntesis de Dilinoleil 2- ( 2-Dimetilaminoetil ) -malonato ( DLin-MAL-C2-DMA) 1 . NaH 2. (CH3)2NCH2CH,CI DLin-MAL-C2-DMA 1. Síntesis de Dilinoleilo malonato (II) A una solución de linoneilo alcohol (I, 5.0 g, 19 mmol) en CH2C I2 anhidro (70 mL) se agregó gota a gota dicloruro de malonilo (1.36 g, 9.3 mmol) en argón a 0-5°C. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 6 horas. La mezcla se diluyó con 50 mL de CH2C I2 . La fase orgánica se lavó con agua (3 x 75 mL) , salmuera (75 mL) y se secó en Na2S04 anhidro. La evaporación del solvente proporcionó un residuo oleoso pardo (5.8 g) . El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 200 mL) eluido con 0-4% de gradiente en hexanos como eluyente. Esto proporcionó 3.1 g (55%) de II puro como un aceite incoloro. XH NMR (400 MHz, CDCI3) d: 5.25-5.45 (8, m, 4x CH=CH) , 4.13 (4H, t, 2 x OCH2) , 3.35 (2H, s, CO-CH2-CO) , 2.78 (4H, t, 2 x C=C-CH2-C=C) , 2.05 (8H, q, 4 x CH2 alílico) , 1.55-1.65 (4H, m, CH2) , 1.2-1.4 (32H, m) , 0.90 (6H, t, 2 x CH3) ppm. 2. Síntesis de Dilinoleil 2- (2-Dimetilaminoetil) -malonato (DLin-MAL-C2-DMA) A una suspensión de NaH (0.17g, 60%, 4.1 mmol) en benceno anhidro (40 mL) se agregó dilinoleilo malonato (II, 0.50 g, 0.83 mmol) en argón. La suspensión resultante se 1 agitó a temperatura ambiente durante 60 min. A la mezcla resultante se agregó clorhidrato de N, N-dimetilamimoetilo cloruro (0.12 g, 0.83 mmol) en una porción y la mezcla resultante se sometió a reflujo en argón durante 2 días. La fase orgánica se lavó con agua (3 x 20 mL) , salmuera (2x25 mL) y se secó en Na2S04 anhidro. La evaporación del solvente proporcionó un residuo oleoso pálido (0.50 g) . La cromatografía en columna en gel de sílice (malla 230-400, 40 mL) con 0-4% metanol en diclorometano como eluyente dio como resultado 0.13 g del producto DLin-MAL-C2-DMA como un aceite pálido. JH NMR (400 Hz, CDCI3 ) 5: 5.25-5.40 (8, m, 4 x CH=CH), 4.05-4.20 (4H, m, 2 x OCH2) , 3.47 (1H, t, CO-CH-CO) , 2.75 (4H, t, 2 x C=C-CH2-C=C) , 2.35-2.9 (6H, br, 2 x NCH3) , 2.15-2.35 (2H, br, NCH2) , 2.05 (8H, q, 4 x CH2 alílico) , 1.55-1.65 (4H, m, CH2) , 1.2-1.45 (32H, m) , 0.90 (6H, t, 2 x CH3) ppm.
Ejemplo 27: Síntesis de Dilinoleil 2- (2-Dimetilaminoetil ) -malonato ( TetraLin-MAL-C2-DMA) Este compuesto se sintetizó como un aceite pálido en una manera similar a aquél del Ejemplo 26 donde el linoleilo alcohol se reemplazó por dilinoleilo metanol. 1H NMR (400 MHz , CDC13) d: 5.15-5.50 (16, m, 8 x CH=CH) , 4.89 (2H, quinteto), 3.46 (1H, t, CO-CH-CO) , 3.08-3.2 (2H, m) , 2.8-2.85 (6H, 2 s), 2.78 (8H, t, 4 x C=C-CH2-C=C) , 2.35-2.48 (2H, br, NCH2), 2.05 (16H, q, 8 x CH2 alílico) , 1.45-1.65 (8H, m, CH2) , 1.2-1.45 (64H, m) , 0.90 (12H, t, 2 x CH3) ppm.
Ejemplo 28: Síntesis de ácido 4-Dimetilamino-butírico 1-octadeca-6, 9, 12-trienil-nonadeca-7, 10, 13-trienil éster (005-14) 005-8 KOH 85% EtOH DCC, DMAP HCI CH2CI2 OH O Los compuestos 005-8 to 005-12 se sintetizaron en una manera similar a aquellos en el Ejemplo 19.
En una atmósfera de argón, a un frasco de fondo redondo cargado con DLen(y)-MeOH (005-12, 262 mg, 0.5 mmol), clorhidrato de ácido 4-dimetilaminobutirico (lOlmg, 0.6 mmol) y 4- (dimetilamino) piridina (13 mg) en diclorometano (5 mL) se agregó diciclohexilcarbodiimida (134 mg) . Luego de que la mezcla se agitó durante 16 h a temperatura ambiente, el solvente se evaporó y el residuo se tomó en éter dietilico. El precipitado blanco se desechó por filtración. El filtrado se concentró hasta sequedad (0.4 g aceite) . El residuo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 50 mL) eluido con 2% a 3% de metanol en diclorometano . Las fracciones que contienen el producto puro se combinaron y concentraron. El residuo se pasó por una capa de gel de sílice (2 mm) lavado con hexanos (6 mL) . El filtrado luego se concentró y secó en alto vacío durante 1 h. Esto proporcionó 166 mg (0.26 mmol, 53%) de 005-14 como un aceite amarillo levemente claro. 1H NMR (400 MHz, CDC13) d: 5.41-5.26 (m, 12H, CH=CH) , 4.83 (quinteto, J=6 Hz, 1H), 2.77 (similar a t, J=5.2 Hz, 8H) , 2.29 (t, J=7.6 Hz, 2H) , 2.25 (t, J=7.6, 2H), 2.18 (s, 6H) , 2.02 (similar a q, J=6.8 Hz, 8H) , 1.75 (similar a quinteto, J=7.6 Hz, 2H) , 1.48 (m, 4H) , 1.37-1.20 (m, 24H), 0.86 (t, J=6.8 Hz, 6H) ppm.
Ejemplo 29: Síntesis de ácido 5-Dimetilamino-pentanoico 1-octadeca-6, 9, 12-trienil-nonadeca-7 , 10, 13-trienil éster (005-23) Paso 1, 005-21: En una atmósfera de argón, a un frasco de fondo redondo cargado con DLen(y)-MeOH (005-12, 262 mg, 0.5 mmol), ácido 5 bromovalérico (181 mg, 1.0 mmol) y 4- (dimetilamino) piridina (30 mg) en diclorometano (10 mL) se ' agregó diciclohexilcarbodiimida (227 mg) . Luego de que la mezcla se agitó durante 16 h a temperatura ambiente, el solvente se evaporó y el residuo se tomó en hexanos . El precipitado blanco se desechó por filtración. El filtrado se concentró hasta sequedad. El residuo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 50 mL) eluido con acetato en hexanos (0-2%). Las fracciones que contienen el producto puro se combinaron y concentraron. Esto proporcionó 290 mg (0.42 mmol, 84%) de 005-21 como un aceite levemente amarillo.
Paso 2, 005-23: A 005-21 (290 mg) se agregó dimetilamina (2M en THF, 10 mL) . La solución se agitó a temperatura ambiente durante 6 días. El exceso de amina y el solvente se evaporaron. El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 50 mL) con metanol en diclorometano (13%). Las fracciones que contienen el producto se combinaron y concentraron. El aceite residual se pasó por una capa de celita y se lavó con hexanos (6 mL) . El filtrado luego se concentró y secó en alto vacío durante 2 h. Esto proporcionó 204 mg (0.31 mmol, 74%) de 005-23 como un aceite levemente amarillo. 1H NMR (400 MHz, CDC13) d: 5.43-5.30 (m, 12H, CH=CH) , 4.84 (quinteto, J=6 Hz, 1H) , 2.77 (similar a t, J=5.2 Hz, 8H) , 2.39-2.28 (m, 4H) , 2.28 (s, 6H) , 2.06 (similar a q, J=6.8 Hz, 8H) , 1.66 (similar a quinteto, J=7.2 Hz, 2H), 1.60-1.48 (m, 6H) , 1.41-1.24 (m, 24H) , 0.90 (t, 6H, J=6.8 Hz) ppm.
Ejemplo 30: Síntesis de [2- (2, 2-Di-octadeca-6, 9, 12-trienil-[l,3]dioxolan-4-il)- etil ] -dimetilamina (005-31) Paso 1, 005-28: ? una mezcla de dilinolenilo (y) metanol (IV, 550 mg, 1.05 mmol) y carbonato de potasio anhidro (58 mg) en 25 mL de CH2C12 se agregaron a clorocromato de piridinio (PCC, 566 mg, 2.63 mmol, 2.5 equiv.). La suspensión resultante se agitó a temperatura ambiente durante 90 min. Luego se agregó éter (100 mL) en la mezcla y la suspensión parda resultante se filtró a través de una almohadilla de gel de gel de sílice (150 mL) . La almohadilla de gel de sílice luego se lavó con éter (3 x 50 mL) . El filtrado de éter y los lavados se combinaron. La evaporación del solvente proporcionó 510 mg de un residuo oleoso como producto crudo. El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 50 mL) eluido con 0-3% de acetato de etilo en hexanos . Esto proporcionó 344g (63%) del producto del título (005-28) .
Paso 2, 005-29: Una mezcla de 005-28 (344 mg, 0.66 mmol) , 1,2,4-butanotriol (349 mg, 3.2 mmol) y p-toluensulfonato de piridinio (30 mg) en 50 mL de tolueno se calentaron a reflujo en argón durante la noche con un tubo Dean-Stark para eliminar el agua. La mezcla resultante se enfrió a temperatura ambiente. La fase orgánica se lavó con agua (30 mL) (el butantriol no es soluble en tolueno, por lo que se vierte la solución y el triol se deja atrás), salmuera (30 mL) y se seca en Na2S04anhidro . La evaporación del solvente dio como resultado un residuo oleoso amarillento. El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 40 mL) eluido con 04 % de acetato de etilo en hexanos. Las fracciones que contienen el producto puro se combinaron y concentraron. Esto proporcionó 337 mg (83%) de 005-29 puro como un aceite incoloro.
Paso 3, 005 A una solución de 005-29 (337 mg, 0.55 mmol) y trietilamina seca (300 mg, 2 mmol) en 30 mL de CH2C12 anhidro se agregó metanosulfonilo anhídrido (310 mg, 1.78 mmol) en nitrógeno. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se diluyó con 30 mL de CH2C12. La fase orgánica se lavó con agua (2 x 25 mL) , salmuera (25 mL) y se secó en MgS04 anhidro. El solvente se evaporó para proporcionar 377g del producto deseado como un aceite incoloro transparente (99%) . El producto fue lo suficientemente puro y se usó en el siguiente paso sin purificación adicional.
Paso 4, 005-31: Al 005-30 (377 mg) en argón se agregó 15 mL de dimetilamina en THF (2.0 M) . La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 6 mins. Se obtuvo un residuo oleoso tras la evaporación del solvente. La cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 40 mL) se eluyó con 3% de metanol en diclorometano . Las fracciones que contienen el producto puro se combinaron y concentraron para proporcionar 314 mg del producto del título (005-31) como un aceite pálido claro. XH NMR (400 MHz , CDC13) d: 5.41-5.26 (m, 12H, CH=CH), 4.06 (m, 1H) , 4.01 (dd, 1H, J=7.5, 7.5 Hz), 3.45 (dd, 1H, J=7.5, 7.5 Hz) , 2.77 (similar a t, J=5.6 Hz, 8H) , 2.36 (m, 1H) , 2.26 (m, 1H) , 2.19 (s, 6H) , 2.02 (similar a q, J=6.8 Hz, 8H), 1.78 (m, 1H) , 1.67 (m, 1H) , 1.60-1.51 (m, 4H) , 1.38-1.21 (m, 24H) , 0.86 (t, 6H, J=6.8 Hz) ppm.
Ejemplo 31: Síntesis de ácido 4- ( 2-Metil-aziridin-l-il ) - butírico l-octadeca-9, 12-dienil-nonadeca-10 , 13-dienil éster (005-18) Paso 1, 005-13: En una atmósfera de argón, a un frasco de fondo redondo cargado con DLin)-MeOH (001-17, 528,9 mg, 0.5 mmol) , 4- (dimetilamino) piridina (25 mg) en diclorometano (10 mL) se agregó diciclohexilcarbodiimida (268 mg) . Luego de que la mezcla se agitó durante 16 h a temperatura ambiente, el solvente se evaporó y el residuo se tomó en éter dietílico. El precipitado blanco (DCU) se desechó por filtración. El filtrado se concentró y el residuo oleoso resultante se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 50 mL) eluido con 0 a 1% de acetato de etilo en hexanos. Esto proporcionó 0,44 g (65%) de 005-13 como un aceite incoloro.
Paso 2, 005-18: Una mezcla de 005-13 (0.44 g, 0.65 mmol) , 2-metilaziridina (148 mg, 2.6 mmol, tech. 90%), CS2CO3 (2.6 mmol) y TBAI (2.4 mmol) en acetonitrilo (10 mL) se agitó en Ar durante 4 días. Luego de que el solvente se eliminó, se agregó al residuo hexanos y agua. Las dos fases se separaron seguido de la extracción de la fase acuosa con hexanos (X 2). La fase orgánica combinada se secó en sulfato de sodio y se concentró hasta sequedad. El residuo oleoso resultante se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 50 mL) eluido con 1% a 3% de metanol en diclorometano . Las fracciones que contienen el producto se combinaron y concentraron (200 mg de aceite) . Este se purificó nuevamente por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 50 mL) eluido con gradiente de acetato de etilo en hexanos (5%-20%) . Las fracciones que contienen el producto puro se combinaron y concentraron. Esto proporcionó 96 mg (33%) de 005-18 como un aceite incoloro. 1H NMR (400 MHz, CDCI3) d: 5.43-5.30 (m, 8H, CH=CH) , 4.87 (quinteto, J=6 Hz, 1H), 2.78 (similar a t, J=6 Hz, 4H) , 2.39 (similar a t, J=7.8 Hz, 2H), 2.26 (similar a t, 2H) , 2.06 (similar a q, J=6.8 Hz, 8H) , 1.89 (similar a quinteto, J=7.2 Hz, 2H) , 1.56-1.48 (m, 5H), 1.41-1.24 (m, 38H), 1.18 (d, J=5.2 Hz, 3H) , 0.90 (t, 6H, J=6.8 Hz) ppm.
Ejemplo 32: Síntesis de 2 , 2-Dilinoleil-5-dimetilaminometil-[1, 3] -dioxano ( DLin-K6S-Cl-DMA) „OS02CH3 ÜBr Br Acetona g, éter Etil formiato VII DL¡n-K6S-Cl-DMA 8. Síntesis de Bromuro de linoleilo (II) Una mezcla de sulfonato de linoleilo metano (26.6g, 77.2 mmol) y bromuro de litio (30.5g, 350 mmol) en acetona (350 mL) se agitó en nitrógeno durante dos días. La suspensión resultante se filtró y el sólido se lavó con acetona. El filtrado y el lavado se combinaron y el solvente se evaporó. El residuo resultante se trató con agua (300 mL) . La fase acuosa se extrajo con éter (3?G50 mL) . La fase de éter combinada se lavó con agua (200 mL) , salmuera (200 mL) y luego se secó en Na2S04 anhidro. El solvente se evaporó para proporcionar 29.8g de aceite amarillento. El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 700 mL) eluido con hexanos . Esto proporcionó 20.8 g (82%) de bromuro de linoleilo (II) . 9. Síntesis de Formato de Dilinoleilmetilo (III) A una suspensión de limaduras de Mg (1.64g, 67.4 mmol) con un cristal de yodo en 500 mL de éter anhidro en nitrógeno se agregó a una solución de bromuro de linoleilo (II, 18.5g, 56.1 mmol) en 250 mL de éter anhidro a temperatura ambiente. La mezcla resultante se sometió a reflujo en nitrógeno durante la noche. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente. A la mezcla nebulosa en nitrógeno se agregó gota a gota formato de etilo (4.24g, 57.2 mmol) . Tras la adición, la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se trató con 10% de solución acuosa de H2SO (250 mL) . La fase de éter se separó y la fase acuosa de extrajo con éter (150 mL) . La fase orgánica combinada se lavó con agua (400 mL) , salmuera (300 mL) y luego se secó en Na2SC>4 anhidro. La evaporación del solvente proporcionó 17.8 g de un ácido amarillento como producto crudo (III) . El producto crudo se usó directamente en el siguiente paso sin purificación adicional . 10. Síntesis de Dilinoleilo metanol (IV) El anterior formato de dilinoleilmetilo crudo (III, 17.8g, 0.71 mmol) y KOH (3,75g) se agitaron en 85% de EtOH a temperatura ambiente en nitrógeno durante la noche. Tras completar la reacción, la mayoría del solvente se evaporó. La mezcla resultante se trató con 150 mL de 5% de solución HC1. La fase acuosa se extrajo con éter (2x150 mL) . El extracto de éter combinado se lavó con agua (2 x 100 mL) , salmuera (100 mL) y luego se secó en Na2S04 anhidro. La evaporación del solvente proporcionó 20.0 g de dilinoleilo metanol (IV) como un aceite amarillento. El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 700 mL) eluido con 0-5% de gradiente de acetato de etilo en hexanos. Esto proporcionó 9.6 g de dilinoleilo metanol (IV) . 11. Síntesis de dilinoleilo cetona (V) A una mezcla de dilinoleilo metanol (4.0g, 7.2 mmol) y carbonato de potasio anhidro (0.4g) en 100 mL de CH2CI2 se agregaron a clorocromato de piridinio (PCC, 4.0g, 19 mmol). La suspensión resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Luego se agregó éter (300 mL) en la mezcla y la suspensión café resultante se filtró a través de una almohadilla de gel de sílicel (150 mL) . La almohadilla de gel de sílice luego se lavó con éter (3 x 75 mL) . El filtrado de éter y los lavados se combinaron. La evaporación del solvente proporcionó 5.1 g de un residuo oleoso como producto crudo. El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 200 mL) eluido con 0-4% de acetato de etilo en hexanos . Esto proporcionó 3.0 g (79%) de dilinoleilo cetona (V) . 12. Síntesis de 2 , 2-dilinoleilo-5-hidroximetil ) - [ 1 , 3 ] - dioxano (VI) Una mezcla de dilinoleilo cetona (V, 1.05 g, 2.0 mmol), 2-hidroximetil-l, 3-propanodiol (490 mg, 4.2 mmol) y p-toluensulfonato de piridinio (100 mg) en 150 mL de tolueno se sometieron a reflujo en argón durante la noche con un tubo Dean-Stark para eliminar el agua. La mezcla resultante se enfrió a temperatura ambiente. La fase orgánica se lavó con agua (2 x 100 mL) , salmuera (100 mL) y luego se secó en a2S04 anhidro. La evaporación del solvente dio como resultado un aceite pálido (1.2 g) . El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 100 mL) con 0-5% gradiente de metanol en diclorometano como eluyente. Esto proporcionó 0.93 g de VI puro como un aceite pálido. 13. Síntesis de 2, 2-Dilinoleil-5-metanosulfonilmetil- [1, 3] - dioxano (VII) A una solución de 2, 2-dilinoleil-5-hidroximetil) - [1, 3] -dioxano (VI, 0.93 g, 1.5 mmol) y trietilamina seca (290 mg, 2.9 mmol) en 50 mL de CH2CI2 anhidro se agregó metanosulfonilo anhídrido (400 mg, 2.3 mmol) en nitrógeno. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La fase orgánica se lavó con agua (2 x 75 mL) , salmuera (75 mL) y luego se secó en Na2S04 anhidro. El solvente se evaporó para proporcionar 1.0 g de aceite pálido. El producto crudo se usó en el siguiente paso sin purificación adicional. 14. Síntesis de 2, 2-Dilinoleil-5-dimetilaminometil- [ 1 , 3 ] - dioxano ( DLin-K6S-Cl-DMA) Al material crudo anterior (VII, 1.0 g) en nitrógeno se agregó 20 mL de dimetilamina en THF (2.0 M) . La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 7 mins . Se obtuvo un residuo oleoso tras la evaporación del solvente. La cromatografía en columna de gel de sílice (malla 230-400, 100 mL) con 0-3% gradiente de metanol en cloroformo como eluyente dio como resultado 150 mg del producto DLin-K6S-Cl-DMA como un aceite pálido. 1H NMR (400 MHz, CDC13) d: 5.24-5.51 (8, m, 4x CH=CH) , 4.04 (2H, dd, 2 x OCH) ) , 3.75 (2H, dd OCH) , 2.7-2.9 (2H, br, NCH2), 2.78 (4H, t, 2 x C=C-CH2-C=C) , 2.57 (6H, s, 2 x NCH3), 1.95-2.17 (9H, q, 4 x CH2 alilico y CH) , 1.67-1.95 (2H, m, CH2) , 1.54-1.65 (4H, m, 2 x CH2) , 1.22-1.45 (32H, m) , 0.90 (6H, t, 2 x CH3) ppm.
Ejemplo 33: Síntesis de 2 , 2-Dilinoleil-5-dimetilaminobutil-[1, 3] -dioxano ( DLin-K6S-C4-DMA) Este compuesto se sintetizó como un aceite pálido en una manera similar a aquél del Ejemplo 32 donde 2- hidroximetil-1, 3-propanodiol se reemplazó por 2- hidroxibutil-1, 3-propanodiol. ½ N R (400 MHz , CDC13) d: 5.24-5.45 (8, m, 4x CH=CH), 3.79 (2H, dd, 2 x OCH) ) , 3.50 (2H, dd OCH), 2.76 (4H, t, 2 x C=C-CH2-C=C) , 2.37 (2H, t, NCH2) , 2.31 (6H, s, 2 x NCH3), 2.04 (8H, q, 4 x CH2 alilico) , 1.63-1.90 (3H, m, ), 1.45-1.62 (4H, m, 2 x CH2) , 1.22-1.45 (36H, m) , 0.90 (6H, t, 2 x CH3) ppm.
Ejemplo 34: Síntesis de 2 , 2-Dilinoleil-5-dimetilaminoetil-[1, 3] -dioxano ( DLin-K6S-C2-DMA) Este compuesto se sintetizó como un aceite pálido en una manera similar a aquél del Ejemplo 32 donde 2- hidroximetil-1, 3-propanodiol se reemplazó por 2- hidroxietil-1, 3-propanodiol. XH NMR (400 MHz, CDC13) 8: 5.25-5.45 (8, m, 4x CH=CH), 3.87 (2H, dd, 2 x OCH)), 3.55 (2H, dd OCH), 2.75 (4H, t, 2 x C=C-CH2-C=C) , 2.45-2.60 (2H, br, NCH2) , 2.40 (6H, s, 2 x NCH3), 2.03 (8H, q, 4 x CH2 alilico), 1.73-1.86 (1H, m) , 1.56-1.72 (6H, m, 2 x CH2) , 1.22-1.45 (32H, m) , 0.90 (6H, t, 2 x CH3) ppm.
Ejemplo 35: Síntesis de 2, 2-dilinoleilo-4- (2-dimetilaminoetil ) - [1, 3] -dioxalano (DLin-K6A-C2—DMA) 5. Síntesis de 1, 3, 5-pentanotriol (II) Se agregó gota a gota Dietil 3-hidroxiglutarato (I, 1.0 g, 4.9 mmol) en THF anhidro (10 mL) a una suspensión de L1AIH4 en THF anhidro (110 mL) en nitrógeno con un baño de agua fría. Tras la adición, el baño se eliminó y la suspensión se agitó a temperatura ambiente durante 2 días. La mezcla resultante se extinguió mediante la adición de 13 mL de salmuera muy lentamente con un baño de agua helada. Dio como resultado una suspensión blanca y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El sólido se filtró y se lavó con THF. El filtrado y el lavado se combinaron y el solvente se evaporó para proporcionar 0.70 g de aceite pálido. La cromatografía en columna del producto crudo (malla 230-400 Si02, 100 mL, 0-12% gradiente de metanol en cloroformo) proporcionó 0.54 g de II como un aceite incoloro. 6. Síntesis de 2 , 2-dilinoleilo-4- ( 2-hidroxietil )-[ 1 , 3 ] - dioxano (IV) Una mezcla de dilinoleilo cetona (III, 0.80 g, 1.5 mmol) , 1, 3, 5-pentanotriol (II/ 0,54 g, 4.5 mmol) y p-toluensulfonato de piridinio (60 mg) en 150 mL de tolueno se sometieron a reflujo en nitrógeno durante la noche con un tubo Dean-Stark para eliminar el agua. La mezcla resultante se enfrió a temperatura ambiente. La fase orgánica se lavó con agua (2 x 75 mL) , salmuera (75 mL) y luego se secó en Na2S04 anhidro. La evaporación del solvente dio como resultado un aceite pálido (1.1 g) . El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 75 mL) con 0-3% gradiente de metanol en diclorometano como eluyente. Esto proporcionó 0.75 g (79%) de IV puro como un aceite incoloro. 7. Síntesis de 2, 2-dilinoleilo-4- (2-metanosulfoniletilo) - [1, 3] -dioxano (V) A una solución de 2, 2-dilinoleilo-4- (2-hidroxietil) -[ 1 , 3 ] -dioxano (IV, 0.75 g, 1.2 mmol) y trietilamina seca (0,58 g, 5.7 mmol) en 40 mL de CH2CI2 anhidro se agregó metanosulfonilo anhídrido (0.50 g, 2.9 mmol) en nitrógeno. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La fase orgánica se lavó con agua (2 x 50 mL) , salmuera (50 mL) y luego se secó en Na2S04 anhidro. El solvente se evaporó para proporcionar 0.80 g de aceite pálido como producto crudo. El producto crudo se usó en el siguiente paso sin purificación adicional. 8. Síntesis de 2, 2-dilinoleilo-4- (2-dimetilaminoetil) - [1, 3] - dioxano (DLin-K6A-C2--DMA) Al material crudo anterior (V, 0.80 g) en nitrógeno se agregó 15 mL de dimetilamina en THF (2.0 M) . La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 6 mins . El sólido se filtró. Se obtuvo un residuo oleoso tras la evaporación del solvente. La cromatografía en columna en gel de sílice (malla 230-400, 100 mL) con 0-6% gradiente de metanol en diclorometano como eluyente dio como resultado 0.70 g del producto DLin-K6A-C2-DMA como un aceite pálido. 1H NMR (400 MHz, CDCI3 ) d: 5.28-5.45 (8, m, 4x CH=CH) , 3.85-4.0 (2H, m, 2 x OCH), 3.78 (1H, dd, OCH) , 2.78 (4H, t, 2 x C=C-CH2-C=C), 2.55-2.90 (2H, br, NCH2), 2.47 (6H, s, 2 x NCH3) , 2.05 (8H, q, 4 x CH2 alílico), 1.65-1.90 (4H, m, CH2) , 1.47-1.65 (4H, m, CH2) , 1.1-1.65 (36H, m) , 0.90 (6H, t, 2 x CH3) ppm.
Ejemplo 36: Síntesis de 2 , 2-dilinoleilo-4- ( 3-dimetilaminopropil ) -[1,3] -dioxano ( DLin-K6A-C3-DMA) 5. Síntesis de 1 , 3 , 6-hexanotriol (II) Se agregó gota a gota Dietil ß-cetoadipato (I, 1.86 g, 8.6 mmol) a una suspensión de LiAlH4 en THF anhidro (90 mL) en argón con un baño de agua helada. Tras la adición, el baño se eliminó y la suspensión se agitó a temperatura ambiente durante 2 días. La mezcla resultante se extinguió mediante la adición de 10 mL de salmuera muy lentamente con un baño de agua helada. Dio como resultado una suspensión blanca y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche. El sólido si filtró y lavó con THF seguido de EtOH (2 x 50 mL) . El filtrado y el lavado se combinaron y el solvente se evaporó para proporcionar 0.90 g de aceite pálido. La cromatografía en columna del producto crudo (malla 230-400 S1O2, 100 mL, 0-10% gradiente de metanol en diclorometano) proporcionó 0.70 g de II como un aceite incoloro. 6. Síntesis de 2, 2-dilinoleilo-4- (3-hidroxipropil) - [1, 3] - dioxano (IV) Una mezcla de dilinoleilo cetona (III, 1.80 g, 3.4 mmol) , 1 , 3 , 6-hexanotriol (II, 0,50 g, 3.7 mmol) y p-toluensulfonato de piridinio (100 mg) en 120 mL de tolueno se sometieron a reflujo en nitrógeno durante 3 horas con un tubo Dean-Stark para eliminar el agua. La mezcla resultante se enfrió a temperatura ambiente. La fase orgánica se lavó con agua (2 x 50 mL) , salmuera (50 mL) y luego se secó en Na2S04 anhidro. La evaporación del solvente dio como resultado un aceite pálido (2.0 g) . El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 50 mL) con 0-3% gradiente de metanol en diclorometano como eluyente. Esto proporcionó 0.90 g (41%) de IV puro como un aceite incoloro. 7. Síntesis de 2, 2-dilinoleilo-4- ( 3-metanosulfonilpropilo) - [1, 3] -dioxano (V) A una solución de 2, 2-dilinoleilo-4- (3-hidroxipropil) -[1, 3] -dioxano (IV, 0.97 g, 1.5 mmol) y trietilamina seca (0,44 g, 4.3 mmol) en 60 mL de CH2C12 anhidro se agregó metanosulfonilo anhídrido (0.60 g, 3.5 mmol) en argón. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La fase orgánica se lavó con agua (2 x 30 mL) , salmuera (30 mL) y se secó en gS04 anhidro. El solvente se evaporó para proporcionar 1.1 g de aceite pálido como producto crudo. El producto crudo se usó en el siguiente paso sin purificación adicional. 8. Síntesis de 2 , 2-dilinoleilo-4- ( 3-dimetilaminopropil ) - [1, 3] -dioxano ( DLin-K6A-C3-DMA) Al material crudo anterior (V, 1.1 g) en argón se agregó 20 mL de dimetilamina en THF (2.0 M) . La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 5 mins. El sólido se filtró. Se obtuvo un residuo oleoso tras la evaporación del solvente. La cromatografía en columna de gel de sílice (malla 230-400, 40 mL) con 0-7% gradiente de metanol en diclorometano como eluyente dio como resultado 0.85 g del producto DLin-K6A-C3-DMA como un aceite pálido. XH NMR (400 MHz, CDC13) d: 5.25-5.45 (8, m, 4 x CH=CH) , 3.7-4.0 (3H, m, 3 x OCH) , 2.77 (4H, t, 2 x C=C-CH2-C=C) , 2.5-2.8 (2H, br, NCH2), 2.5 (6H, s, 2 x NCH3) , 2.05 (8H, q, 4 x CH2 alílico) , 1.65-1.90 (4H, m, 2 x CH2) , 1.40-1.65 (4H, m, 2 x CH2) , 1.1-1.65 (38H, m) , 0.90 (6H, t, 2 x CH3) ppm.
Ejemplo 37: Síntesis de 2, 2-Diaraquidonil-4- (2-dimetilaminoetil) -[1,3] -dioxalano (DAra-K5-C2—DMA) OS02CH3 MgBr2 Br éter l 1..MMgg,, éétter II 2. Etil formiato DAra- 5-C2-DMA 8. Síntesis de Bromuro de Araquidonilo (II) Una mezcla de sulfonato de araquidonil metano (1.0 g, 2.7 mmol) y bromuro de magnesio (2.2 g, 12 mmol) en éter anhidro (40 mL) se agitó en argón durante dos días. La suspensión resultante se filtró y el sólido se lavó con éter (2x10) mL) . El filtrado y el lavado se combinaron y el solvente se evaporó. El residuo resultante se trató con hexanos (50 mL) . El sólido se filtró y el solvente se evaporó dando como resultando un residuo oleoso. El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 30 mL) eluido con hexanos. Esto proporcionól g de bromuro de araquidonilo (II) como un aceite incoloro. 9. Síntesis de Formato de diaraquidonilmetilo (III) A una solución de bromuro de araquidonilo (II, 1 g, 3 mmol) en éter anhidro (30 mL) se agregaron limaduras de Mg (78 mg, 3.2 mmol) seguido de un cristal de yodo. La mezcla resultante se sometió a reflujo en nitrógeno durante 10 horas. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente. A la mezcla nebulosa en nitrógeno se le agregó formato de etilo (0,25 mL) y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. A la reacción se agregó 20 mL de 10% de solución acuosa de H2SO . La fase de éter se separó y la fase acuosa de extrajo con éter (30 mL) . La fase orgánica combinada se lavó con agua (2 x 25 mL) , salmuera (25 mL) y luego se secó en Na2SC>4 anhidro. La evaporación del solvente proporcionól .1 g de un ácido pálido como producto crudo (III) . El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 40 mL) eluido con 0-3% de gradiente de acetato de etilo en hexanos. Esto proporcionó 0.43 g (40%) de formato de diaraquidonilmetilo (III) como un aceite pálido. 10. Síntesis de diaraquidonil metanol (IV) El anterior formato de diaraquidonilmetilo (III, 0.43 g, 0.71 mmol) y KOH (100 mg) se agitaron en 95% de EtOH (20 mL) a temperatura ambiente en nitrógeno durante la noche. Tras completar la reacción, la mayoría del solvente se evaporó. La mezcla resultante se trató con 20 mL de solución 2M HC1. La fase acuosa se extrajo con éter (2x30 mL) . El extracto de éter combinado se lavó con agua (2 x 25 mL) , salmuera (25 mL) y luego se secó en Na2S04 anhidro. La evaporación del solvente proporcionó 0.44 g de IV como un aceite pálido. El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 40 mL) eluido con 0-5% de gradiente de acetato de etilo en hexanos. Esto proporcionó 0,41 g de diaraquidonilmetilo metanol (IV) como un aceite incoloro. 11. Síntesis de diaraquidonil cetona (V) A una mezcla de diaraquidonil metanol (IV, 0.41 g, 0.71 mmol) y carbonato de potasio anhidro (0.05g) en 10 mL de CH2C12 se agregaron a clorocromato de piridinio (PCC, 0.50 g, 2.3 mmol) . La suspensión resultante se agitó a temperatura ambiente durante 90 mins. Luego se agregó éter (50 mL) en la mezcla y la suspensión café resultante se filtró a través de una almohadilla de floresil (30 mL) . La almohadilla luego se lavó con éter (3 x 30 mL) . El filtrado de éter y los lavados se combinaron. La evaporación del solvente proporcionó 0.40 g de un residuo oleoso como producto crudo. El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 10 mL) eluido con 0-3% de éter en hexanos. Esto proporcionó 0.30 g (75%) de diaraquidonil cetona (V) . 1H NMR (400 MHz, CDC13) d: 5.3-5.5 (16H, m, 8 x CH=CH) , 2.82 (12H, t, 6 x C=C-CH2-C=C) , 2.40 (4H, t, 2 x CO-CH2) , 2.08 (8H, m, 4 x CH2 alilico), 1.25-1.65 (20H, m) , 0.90 (6H, t, 2 x CH3) ppm. 12. Síntesis de 2 , 2-Diaraquidonil-4- ( 2-hidroxietil ) - [ 1 , 3 ] - dioxalano (VI) Una mezcla de diaraquidonil cetona (V, 0.30 g, 0.52 mmol) , 1, 2, 4-butanotriol (0.25 g, 2.4 mmol) y p-toluensulfonato de piridinio (20 mg) en 60 mL de tolueno se sometieron a reflujoen argón durante la noche con un tubo Dean-Stark para eliminar el agua. La mezcla resultante se enfrió a temperatura ambiente. La fase orgánica se lavó con agua (2 x 30 mL) , salmuera (30 mL) y luego se secó en Na2S04 anhidro. La evaporación del solvente dio como resultado un residuo oleoso amarillento. El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 40 mL) con 0-2% de metanol en diclorometano como eluyente. Esto proporcionó 0.29 g (84%) de VI puro como un aceite pálido. 13. Síntesis de 2 , 2-Diaraquidonil-4- ( 2-metanosulfoniletil ) - [1, 3] -dioxalano (VII) A una solución de 2, 2-diaraquidonil-4- (2-hidroxietil) -[1, 3] -dioxalano (VI, 0.29 g, 0.43 mmol) y trietilamina seca (254 mg, 2.5 mmol) en 20 mL de CH2C12 anhidro se agregó metanosulfonilo anhídrido (0.20 g, 1.1 mmol) en nitrógeno. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se diluyó con 30 mL de CH2CI2. La fase orgánica se lavó con agua (2 x 25 mL) , salmuera (25 mL) y se secó en MgS04 anhidro. El solvente se evaporó para proporcionar 0.30 g de aceite pálido. El producto crudo se usó en el siguiente paso sin purificación adicional. 14. Síntesis de 2, 2-Diaraquidonil-4- ( 2-dimetilaminoetil ) - [1, 3] -dioxalano (DAra-K5-C2—DMA) Al material crudo anterior (VII, 0.30 g) en argón se agregó 15 mL de dimetilamina en THF (2.0 M) . La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 6 mins . Se obtuvo un residuo oleoso tras la evaporación del solvente. La cromatografía en columna en gel de sílice (malla 230-400, 40 mL) con 0-5% gradiente de metanol en diclorometano como eluyente dio como resultado 0.18 g del producto DAra-K5-C2-DMA como un aceite pálido. ¾ NMR (400 MHz , CDC13) d: 5.3-5.5 (16H, m, 8 x CH=CH), 4.0-4.17 (2H, m, 2 x OCH) , 3.49 (1H, t, OCH) , 2.65-2.85 (14H, m, 6 x C=C-CH2-C=C, NCH2) , 2.55 (6H, s, br, 2 x NCH3), 2.0d (8H, m, 4 x CH2 alílico) , 1.80-1.92 (2H, m, CH2), 1.4-1.75 (4H, m, 2 x CH2) , 1.22-1.45 (20H, m) , 0.90 (6H, t, 2 x CH3) ppm.
Ejemplo 38: Síntesis de 2 , 2-Didocosahexaenoil-4- ( 2-dimetilaminoetil) - [1, 3] -dioxalano (DDha-K5-C2—DMA) ^OS02CH3 MgBr2 éter l.Mg, éter II DDha-K5-C2-DMA 8. Síntesis de Bromuro de Didocosahexaenoilo (II) Una mezcla de docosahexaenoilo metanosulfonato (2.0 g, 5.1 mmol) y bromuro de magnesio (4.3 g, 23 mmol) en éter anhidro (100 mL) se agitó en argón durante la noche. La suspensión resultante se filtró y el sólido se lavó con éter (2x30 mL) . El filtrado y el lavado se combinaron y el solvente se evaporó. El residuo resultante se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 40 mL) eluido con hexanos . Esto proporcionó 2,2 g de bromuro de docosahexaenoilo(II) como un aceite incoloro. 9. Síntesis de Formato de Didocosahexaenoilo (III) A una solución de bromuro de docosahexaenoilo (II, 2,2 g, 6,0 mmol) en éter anhidro (60 mL) se agregaron limaduras de Mg (145 mg, 6.0 mmol) seguido de un cristal de yodo. La mezcla resultante se sometió a reflujo en argón durante 5 horas. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente. A la mezcla nebulosa en argón se le agregó formato de etilo (0,50 mL) y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. A la reacción se agregó 40 mL de 5% de solución acuosa de H2SO4. La fase de éter se separó y la fase acuosa de extrajo con éter (50 mL) . La fase orgánica combinada se lavó con agua (2 x 50 mL) , salmuera (50 mL) y luego se secó en MgS04 anhidro. La evaporación del solvente proporcionó 2.3 g de un ácido amarillento como producto crudo (III) . El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 50 mL) eluido con 0-7% de gradiente de acetato de etilo en hexanos . Esto proporcionó 1.38 g (65%) de Didocosahexaenoil metil formato (III) como un aceite pálido. 10. Síntesis de Didocosahexaenoilo metanol (IV) El didocosahexaenoil metil formato (III, 1.38 g, 2.1 mmol) y KOH (300 mg) se agitaron en 90% de EtOH (70 mL) a temperatura ambiente en nitrógeno durante 90 min. Tras completar la reacción, la mayoría del solvente se evaporó. La mezcla resultante se trató con 60 mL de solución 2M HC1. La fase acuosa se extrajo con éter (2x75 mL) . El extracto de éter combinado se lavó con agua (2 x 50 mL) , salmuera (50 mL) y se secó en MgS04 anhidro. La evaporación del solvente proporcionó 1.18 g de IV como un aceite amarillento. El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 50 mL) eluido con 0-6% de gradiente de acetato de etilo en hexanos. Esto proporcionó I, 0 g de Didocosahexaenoil metanol (IV) como un aceite incoloro.
II. Síntesis de Didocosahexaenoilo cetona (V) A una mezcla de Didocosahexaenoilo metanol (IV, 1.2 g, 1.9 mmol) y carbonato de potasio anhidro (O.lg) en 30 mL de CH2CI2 se agregaron a clorocromato de piridinio (PCC, 1.05 g, 4.8 mmol) . La suspensión resultante se agitó a temperatura ambiente durante 2 horas. Luego se agregó éter (120 mL) en la mezcla y la suspensión café resultante se filtró a través de una almohadilla de gel de sílicel (75 mL) . La almohadilla luego se lavó con éter (3 x 75 mL) . El filtrado de éter y los lavados se combinaron. L'a evaporación del solvente proporcionó 1.3 g de un residuo oleoso como producto crudo. El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 40 mL) eluido con 0-3% de acetato de etilo en hexanos. Esto proporcionó 0.83 g (69%) de Didocosahexaenoilo cetona (V) . 12. Síntesis de 2 , 2-Didocosahexaenoil -4- (2-hidroxietil ) - [1, 3] -dioxalano (VI) Una mezcla de diaraquidonil cetona (V, 0.43 g, 0.69 mmol), 1 , 2 , 4-butanotriol (0.35 g, 3.3 mmol) y p-toluensulfonato de piridinio (50 mg) en 75 mL de tolueno se sometieron a reflujoen argón durante la noche con un tubo Dean-Stark para eliminar el agua. La mezcla resultante se enfrió a temperatura ambiente. La fase orgánica se lavó con agua (2 x 30 mL) , salmuera (30 mL) y se secó en gSC anhidro. La evaporación del solvente dio como resultado un residuo oleoso amarillento. El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 40 mL) con 0-2% de metanol en diclorometano como eluyente. Esto proporcionó 0.43 g (95%) de VI puro como un aceite pálido. 13. Síntesis de 2 , 2-Didocosahexaenoil -4- (2- metanosulfoniletil ) - [1, 3] -dioxalano (VII ) A una solución de 2 , 2-Didocosahexaenoil-4- ( 2-hidroxietil) - [1, 3] -dioxalano (VI, 0.42 g, 0.59 mmol) y trietilamina seca (300 mg, 2.9 mmol) en 50 mL de CH2CI2 anhidro se agregó metanosulfonilo anhídrido (0.25 g, 1.4 mmol) en nitrógeno. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La fase orgánica se lavó con agua (2 x 25 mL) , salmuera (25 mL) y se secó en MgS04 anhidro. El solvente se evaporó para proporcionar 0.43 g de aceite pálido. El producto crudo se usó en el siguiente paso sin purificación adicional. 14. Síntesis de 2 , 2-Didocosahexaenoil-4- ( 2- dimetilaminoetil) - [1, 3] -dioxalano (DDha-K5-C2— DMA) Al material crudo anterior (VII, 0.43 g) en argón se agregó 15 mL de dimetilamina en THF (2.0 M) . La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 6 mins . Se obtuvo un residuo oleoso tras la evaporación del solvente. La cromatografía en columna en gel de sílice (malla 230-400, 40 mL) con 0-5% gradiente de metanol en diclorometano como eluyente dio como resultado 0.31 g del producto DDha-K5-C2-DMA como un aceite amarillento. 2? NMR (400 Hz, CDC13) d: 5.25-5.45 (24H, m, 12 x CH=CH) , 4.05-4.17 (2H, m, 2 x OCH) , 3.50 (1H, t, OCH), 2.87-3.15 (2H, br., NCH2) 2.73-2.87 (20H, m, 10 x C=C-CH2-C=C) , 2.65 (6H, s, br, 2 x NCH3) , 2.06 (8H, m, 4 x CH2 alílico) , 2.0-2.2 (2H, m, CH2) , 1.75-1.95 (2H, m, CH2), 1.3-1.65 (8H, m, 4 x CH2) , 0.90 (6H, t, 2 x CH3) ppm.
Ejemplo 39: Síntesis de ácido 4-Dimetilamino-butírico 1-octadeca-6, 9, 12-trienil-nonadeca-7 , 10, 13-trienil éster (005-14) En una atmósfera de argón, a un frasco de fondo redondo cargado con DLen(y)-MeOH (005-12, 262 mg, 0.5 mmol) , clorhidrato de ácido 4-dimetilaminobutírico (lOlmg, 0.6 mmol) y 4- (dimetilamino) piridina (13 mg) en diclorometano (5 mL) se agregó diciclohexilcarbodiimida (134 mg) . Luego de que la mezcla se agitó durante 16 h a temperatura ambiente, el solvente se evaporó y el residuo se tomó en éter dietilico. El precipitado blanco se desechó por filtración. El filtrado se concentró hasta sequedad (0.4 g aceite). El residuo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 50 mL) eluido con 2% a 3% de metanol en diclorometano . Las fracciones que contienen el producto puro se combinaron y concentraron. El residuo se pasó por una capa de gel de sílice (2 mm) lavado con hexanos (6 mL) . El filtrado luego se concentró y secó en alto vació durante 1 h. Esto proporcionó 166 mg (0.26 mmol, 53%) de 005-14 como un aceite amarillo levemente claro. XH NMR (400 MHz, CDC13) d: 5.41-5.26 (m, 12H, CH=CH) , 4.83 (quinteto, J=6 Hz, 1H) , 2.77 (similar a t, J=5.2 Hz, 8H) , 2.29 (t, J=7.6 Hz, 2H) , 2.25 (t, J=7.6, 2H), 2.18 (s, 6H) , 2.02 (similar a q, J=6.8 Hz, 8H) , 1.75 (similar a quinteto, J=7.6 Hz, 2H), 1.48 (m, 4H) , 1.37-1.20 (m, 24H), 0.86 (t, J=6.8 Hz, 6H) ppm.
Ejemplo 40: Síntesis de ácido 5-Dimetilamino-pentanoico 1-octadeca-6, 9, 12-trienil-nonadeca-7, 10, 13-trienil éster (005-23) Paso 1, 005-21: En una atmósfera de argón, a un frasco de fondo redondo cargado con DLen (?) -MeOH (005-12, 262 mg, 0.5 mmol), ácido 5 bromovalérico (181 mg, 1.0 mmol) y 4- (dimetilamino) piridina (30 mg) en diclorometano (10 mL) se agregó diciclohexilcarbodiimida (227 mg) . Luego de que la mezcla se agitó durante 16 h a temperatura ambiente, el solvente se evaporó y el residuo se tomó en hexanos. El precipitado blanco se desechó por filtración. El filtrado se concentró hasta sequedad. El residuo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 50 mL) eluido con acetato en hexanos (0-2%) . Las fracciones que contienen el producto puro se combinaron y concentraron. Esto proporcionó 290 mg (0.42 mmol, 84%) de 005-21 como un aceite levemente amarillo .
Paso 2, 005-23: A 005-21 (290 mg) se agregó dimetilamina (2M en THF, 10 mL) . La solución se agitó a temperatura ambiente durante 6 días. El exceso de amina y el solvente se evaporaron. El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 50 mL) con metanol en diclorometano (13%) . Las fracciones que contienen el producto se combinaron y concentraron. El aceite residual se pasó por una capa de celita y se lavó con hexanos (6 mL) . El filtrado luego se concentró y secó en alto vacío durante 2 h. Esto proporcionó 204 mg (0.31 mmol, 74%) de 005-23 como un aceite levemente amarillo. 1H N R (400 MHz , CDC13) d: 5.43-5.30 (m, 12H, CH=CH) , 4.84 (quinteto, J=6 Hz, 1H) , 2.77 (similar a t, J=5.2 Hz, 8H) , 2.39-2.28 (m, 4H) , 2.28 (s, 6H) , 2.06 (similar a q, J=6.8 Hz, 8H) , 1.66 (similar a quinteto, J=7.2 Hz, 2H), 1.60-1.48 (m, 6H) , 1.41-1.24 (m, 24H) , 0.90 (t, 6H, J=6.8 Hz) ppm.
Ejemplo 41: Síntesis de [2- (2, 2-Di-octadeca-6, 9, 12-trienil-[1, 3] dioxolan-4-il) -etil] -dimetilamina (005-31) A una mezcla de dilinolenilo (?) metanol (IV, 550 mg, 1.05 mmol) y carbonato de potasio anhidro (58 mg) en 25 mL de CH2C12 se agregaron a clorocromato de piridinio (PCC, 566 mg, 2.63 mmol, 2.5 equiv. ) . La suspensión resultante se agitó a temperatura ambiente durante 90 min. Luego se agregó éter (100 mL) en la mezcla y la suspensión café resultante se filtró a través de una almohadilla de gel de sílice (150 mL) . La almohadilla de gel de sílice luego se lavó con éter (3 x 50 mL) . El filtrado de éter y los lavados se combinaron. La evaporación del solvente proporcionó 510 mg de un residuo oleoso como producto crudo. El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 50 mL) eluido con 0-3% de acetato de etilo en hexanos . Esto proporcionó 344g (63%) del producto del título (005-28) .
Paso 2, 005-29: Una mezcla de 005-28 (344 mg, 0.66 mmol) , 1,2,4-butanotriol (349 mg, 3.2 mmol) y p-toluensulfonato de piridinio (30 mg) en 50 mL de tolueno se calentaron a reflujo en argón durante la noche con un tubo Dean-Stark para eliminar el agua. La mezcla resultante se enfrió a temperatura ambiente. La fase orgánica se lavó con agua (30 mL) (el butantriol no es soluble en tolueno, por lo que se vierte la solución y el triol se deja atrás), salmuera (30 mL) y se seca en Na2SC> anhidro . La evaporación del solvente dio como resultado un residuo oleoso amarillento. El producto crudo se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 40 mL) eluido con 04 % de acetato de etilo en hexanos . Las fracciones que contienen el producto puro se combinaron y concentraron. Esto proporcionó 337 mg (83%) de 005-29 puro como un aceite incoloro.
Paso 3, 005-30: A una solución de 005-29 (337 mg, 0.55 mmol) y trietilamina seca (300 mg, 2 mmol) en 30 mL de CH2Cl2 anhidro se agregó metanosulfonilo anhídrido (310 mg, 1.78 mmol) en nitrógeno. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla se diluyó con 30 mL de CH2CI2. La fase orgánica se lavó con agua (2 x 25 mL) , salmuera (25 mL) y se secó en MgS04 anhidro. El solvente se evaporó para proporcionar 377g del producto deseado como un aceite incoloro transparente (99%) . El producto fue lo suficientemente puro y se usó en el siguiente paso sin purificación adicional.
Paso 4, 005-31: Al 005-30 (377 mg) en argón se agregó 15 mL de dimetilamina en THF (2.0 M) . La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 6 mins. Se obtuvo un residuo oleoso tras la evaporación del solvente. La cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 40 mL) se eluyó con 3% de metanol en diclorometano . Las farcciones que contienen el producto puro se combinaron y concentraron para proporcionar 314 mg del producto del título (005-31) como un aceite pálido claro. XH NMR (400 MHz, CDC13) d: 5.41-5.26 (m, 12H, CH=CH), 4.06 (m, 1H) , 4.01 (dd, 1H, J=7.5, 7.5 Hz), 3.45 (dd, 1H, J=7.5, 7.5 Hz) , 2.77 (similar a t, J=5.6 Hz, 8H) , 2.36 (m, 1H), 2.26 (m, 1H) , 2.19 (s, 6H) , 2.02 (similar a q, J=6.8 Hz, 8H), 1.78 (m, 1H) , 1.67 (m, 1H) , 1.60-1.51 (m, 4H) , 1.38-1.21 (m, 24H), 0.86 (t, 6H, J=6.8 Hz) ppm.
Ejemplo 42: Síntesis de ácido 4- (2-Metil-aziridin-l-il } -butírico l-octadeca-9, 12-dienil-nonadeca-10, 13-dienil éster (005-18) Paso 1, 005-13: En una atmósfera de argón, a un frasco de fondo redondo cargado con DLin) -MeOH (001-17, 528,9 mg, 0.5 mmol)-, 4- (dimetilamino) piridina (25 mg) en diclorometano (10 mL) se agregó diciclohexilcarbodiimida (268 mg) . Luego de que la mezcla se agitó durante 16 h a temperatura ambiente, el solvente se evaporó y el residuo se tomó en éter dietílico. El precipitado blanco (DCU) se desechó por filtración. El filtrado se concentró y el residuo oleoso resultante se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 50 mL) eluido con 0 a 1% de acetato de etilo en hexanos . Esto proporcionó 0,44 g (65%) de 005-13 como un aceite incoloro.
Paso 2, 005-18: Una mezcla de 005-13 (0.44 g, 0.65 mmol) , 2-metilaziridina (148 mg, 2.6 mmol, tech. 90%), Cs2C03 (2.6 mmol) y TBAI (2.4 mmol) en acetonitrilo (10 mL) se agitó en Ar durante 4 días. Luego de que el solvente se eliminó, se agregó al residuo hexanos y agua. Las dos fase se separaron seguido de la extracción de la fase acuosa con hexanos (X 2). La fase orgánica combinada se secó en sulfato de sodio y se concentró hasta sequedad. El residuo oleoso resultante se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 50 mL) eluido con 1% a 3% de metanol en diclorometano . Las fracciones que contienen el producto se combinaron y concentraron (200 mg de aceite) . Este se purificó nuevamente por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 50 mL) eluido con gradiente de acetato de etilo en hexanos (5%-20%) . Las fracciones que contienen el producto puro se combinaron y concentraron. Esto proporcionó 96 mg (33%) de 005-18 como un aceite incoloro. XH NMR (400 MHz, CDC13) d: 5.43-5.30 (m, 8H, CH=CH) , 4.87 (quinteto, J=6 Hz, 1H), 2.78 (similar a t, J=6 Hz, 4H) , 2.39 (similar a t, J=7.8 Hz, 2H) , 2.26 (similar a t, 2H) , 2.06 (similar a q, J=6.8 Hz, 8H) , 1.89 (similar a quinteto, J=7.2 Hz, 2H) , 1.56-1.48 (m, 5H), 1.41-1.24 (m, 38H) , 1.18 (d, J=5.2 Hz, 3H) , 0.90 (t, 6H, J=6.8 Hz) ppm.
Ejemplo 43: Síntesis de ácido 4-Dimetilamino-but-2-enoico 1- octadeca-9, 12-dienil-nonadeca-10, 13-dienil éster (005-34) Paso 1, 005-32: En una atmósfera de argón, a un frasco de fondo redondo cargado con DLin-MeOH (001-17, 528,9 mg, lmmol), ácido 4 bromocrotónico (330 mg, 2mmol) y 4- (dimetilamino) piridina (49 mg) en diclorometano (10 mL) se agregó diciclohexilcarbodiimida (454 mg, 2.2 mmol) . Luego de que la mezcla se agitó durante 16 h a temperatura ambiente, el precipitado se eliminó por filtración y el sólido se lavó con diclorometano. Al filtrado se le agregó ácido -4- bromocrotónico (165 mg) , 4- (dimetilamino) piridina (15 mg) y finalmente diciclohexilcarbodiimida (250 mg) . Luego de que la mezcla se agitó durante 16 h a temperatura ambiente, el solvente se evaporó y el residuo se tomó en hexanos . El precipitado blanco (DCU) se desechó por filtración. El filtrado se concentró y el residuo oleoso resultante (587 mg) se usó en el siguiente paso sin purificación adicional.
Paso 2, 005-34: Al 005-32 (587 mg) en argón se agregó 7 mL de dimetilamina en THF (2.0 M) . La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 3 rains. El residuo oleoso resultante se obtuvo por evaporación del solvente y se purificó por cromatografía en columnas en gel de sílice (malla 230-400, 40 mL) eluido con 100 mL de diclorometano, 1% a 3% de metanol en diclorometano. Las fracciones que contienen el producto puro se combinaron y concentraron para proporcionar un aceite parduzco (XD-005-34, 69 mg, 11% de DLin-MeOH, 001-17) . XH NMR (600 MHz, CDC13) d: 6.92 (dt, J=6.2 Hz, 15.7 Hz, 1H), 5.97 (d, J=15.7 Hz), 5.41-5.31 (8H, m, CH=CH), 4.93 (quinteto, J=6.7 Hz, 1H) , 3.07 (dd, J=l .1 Hz, 6.2 Hz, 2H), 2.78 (t, J=6.9 Hz, 4H) , 2.27 (s, 6H) , 2.05 (m, 8H), 1.58-1.52 (m, 4H) , 1.39-1.24 (m, 36H) , 0.90 (t, 6H, J=6.8 Hz) ppm.
Las diversas modalidades descritas anteriormente se pueden combinar para proporcionar modalidades adicionales. Todas las patentes estadounidenses, las publicaciones de solicitud de patente estadounidense, patente extranjeras, solicitudes de patente extranjera y publicaciones no de patente a las que se hace referencia en esta memoria descriptiva y/o listadas en la Hoja de Datos de Solicitud, se incorporan a la presente a modo de referencia en su totalidad. Aspectos de las modalidades se pueden modificar, si fuera necesario para emplear conceptos de diversas patentes, solicitudes y publicaciones, para proporcionar aún otras modalidades adicionales.
Se pueden realizar estos y otros cambios a las modalidades en vista de la descripción antes detallada. En general, en las reivindicaciones a continuación, no se interpretará que los términos usados limitan las reivindicaciones a las modalidades especificas descritas en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, pero si se interpretará que incluyen todas las modalidades posibles junto con la totalidad del alcance de los equivalentes a los que correspondan dichas reivindicaciones. Por consiguiente, las reivindicaciones no se encuentran limitadas por la descripción .

Claims (25)

REIVINDICACIONES
1. Un lípido que posee la estructura XXXIII o sales o isómeros del mismo, donde : Rl y R2 son cada uno independientemente para cada aparición alquilo C10-C30 opcionalmente sustituido, alquenilo C10-C30 opcionalmente sustituido, alquinilo C10-C30 opcionalmente sustituido, acilo C10-C30 opcionalmente sustituido o -enlazador-ligando; R3 es H, alquilo C1-C10 opcionalmente sustituido, alquenilo C2 -C10 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-C10 opcionalmente sustituido, alquilheterociclo, alquilfosfato, alquilfosforotioato, alquilfosforoditioato, alquilfosfonatos, alquilaminas , hidroxialquilos, ?-aminoalquilos , ?-aminoalquilos (sustitutidos) , ?-fosfoalquilos, ?-tiofosfoalquilos, polietilenglicol opcionalmente sustituido (PEG, mw 100-40K) , mPEG opcionalmente sustituido (mw 120-40K) , heteroarilo, heterociclo o enlazador-ligando; y E es C(0)0 o OC (O) .
2. Un lipido que posee la estructura XXXVIII o sales o isómeros de los mismos, donde E es C (O) 0 o OC (0) ; Rl y R2 y Rx son cada uno independientemente para cada aparición H, alquilo Ci-Cio opcionalmente sustituido, alquilo Cio~C3o opcionalmente sustituido, alquenilo C 10-C30 opcionalmente sustituido, alquinilo C10-C3o opcionalmente sustituido, acilo C10-C30 opcionalmente sustituido o enlazador-ligando, siempre que al menos uno de Rl, R2 y Rx no sea H; R3 es H, alquilo C1-C10 opcionalmente sustituido, alquenilo C2-C10 opcionalmente sustituido, alquinilo C2-Cio opcionalmente sustituido, alquilheterociclo, alquilfosfato, alquilfosforotioato, alquilfosforoditioato, alquilfosfonatos, alquilaminas, hidroxialquilos, ?-aminoalquilos, ?-aminoalquilos (sustitutidos) , ?-fosfoalquilos, ?-tiofosfoalquilos , polietilenglicol opcionalmente sustituido (PEG, mw 100-40K), mPEG opcionalmente sustituido (mw 120-40K) , heteroarilo, heterociclo o enlazador-ligando; n es 0, 1, 2 o 3.
3. Una partícula lipídica que comprende un lípido de las reivindicaciones 1 o 2.
4. La partícula lipidica de la reivindicación 3 que comprende el lipido de la reivindicación 2.
5. La partícula lipidica de la reivindicación 3, donde la partícula comprende adicionalmente un lipido neutro y un lipido capaz de reducir la agregación.
6. La partícula lipidica de la reivindicación 5 donde la partícula lipidica consiste esencialmente de a. Lipido de la reivindicación 1 o 2; b. un lipido neutro seleccionado de DSPC, DPPC, POPC, DOPE y SM; c. esterol; y d. PEG-DMG, en una relación molar de aproximadamente 20-60% de lipído:5-25% de lipido neutro : 25-55% de esterol : 0.5-15% de PEG-DMG o PEG-DMA.
7. La partícula lipidica de la reivindicación 3, que comprende adicionalmente un agente terapéutico.
8. La partícula lipidica de la reivindicación 7, donde el agente terapéutico es un ácido nucleico.
9. La partícula lipidica de la reivindicación 8, donde el ácido nucleico es un plásmido.
10. La partícula lipidica de la reivindicación 8, donde el ácido nucleico es un oligonucleótido inmunoestimulador .
11. La partícula lipidica de la reivindicación 8, donde el ácido nucleico se selecciona del grupo que consiste en siRNA, un oligonucleótido antisentido, un microRNA, un antagomir, un aptámero y una ribozima.
12. La partícula lipidica de la rei indicación 11, donde el ácido nucleico es un siRNA.
13. Una composición farmacéutica que comprende una partícula lipidica de la reivindicación 8 y un excipiente, portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
1 . Un método para modular la expresión de un gene objetivo en una célula, que comprende proporcionar a una célula la partícula lipidica de la reivindicación 7.
15. El método de la reivindicación 14, donde el agente terapéutico se selecciona de un siRNA, un antagomir, un oligonucleótido antisentido y un plásmido capaz de expresar un siRNA, una ribozima, un aptámero o un oligonucleótido antisentido .
16. El método de la reivindicación 14, donde el ácido nucleico es un plásmido que codifica el polipéptido o una variante funcional o un fragmento del mismo, de manera tal que se aumenta la expresión del polipéptido o fragmento o variante funcional del mismo.
17. Un método para tratar una enfermedad o trastorno caracterizado por la sobreexpresión de un polipéptido en un sujeto, que comprende proporcionar al sujeto la composición farmacéutica de la reivindicación 13, donde el agente terapéutico se selecciona de un siRNA, un micro RNA, un oligonucleótido antisentido y un plásmido capaces de expresar un siRNA, un microRNA o un oligonucleótido antisentido, y donde el siRNA, el microRNA o el RNA antisentido comprenden un polinucleótido que se une específicamente a un polinucleótido que codifica el polipéptido o un complemento del mismo.
18. Un método para tratar una enfermedad o trastorno caracterizado por la subexpresión de un polipéptido en un sujeto, que comprende proporcionar al sujeto la composición farmacéutica de la reivindicación 13, donde el agente terapéutico es un plásmido que codifica el polipéptido o un fragmento o variante funcional del mismo.
19. Un método para inducir una respuesta inmunológica en un sujeto que comprende proporcionarle al sujeto la composición farmacéutica de la reivindicación 13, donde el agente terapéutico es un oligonucleótido inmunoestimulador .
20'. El método de la reivindicación 19, donde se proporciona al paciente la composición farmacéutica en combinación con una vacuna o antígeno.
21. Una vacuna que comprende la partícula lipídica de la reivindicación 9 y un antígeno asociado con una enfermedad o patógeno.
22. La vacuna de la reivindicación 22, donde dicho antígeno es un antígeno tumoral.
23. La vacuna de la reivindicación 22, donde dicho antígeno es un antigeno viral, un antigeno bacteriano o un antigeno parasitario .
24. La partícula lipídica de la reivindicación 7, donde la relación molar es 52% de lípido:5% de lípido neutro:30% de esterol:13% de PEG-DMG.
25. El método de la reivindicación 15, donde el gene objetivo se selecciona del grupo que consiste en Factor VII, Eg5, PCSK9, TPX2, apoB, SAA, TTR, RSV, PDGF gene beta, gene Erb-B, gene Src, gene CRK, gene GRB2, gene RAS, gene MEKK, gene JNK, gene RAF, gene Erkl/2, gene PCNA(p21), gene YB, gene JUN, gene FOS, gene BCL-2, gene de la ciclina D, gene VEGF, gene EGFR, gene de la ciclina A, gene de la ciclina E, gene WNT-1, gene de la beta-catenina, gene c-MET, gene PKC, gene NFKB, gene STAT3, gene de survivina, gene Her2/Neu, gene SORT1, gene XBP1, gene de la topoisomerasa I, gene de la topoisomerasa II alfa, gene p73, gene p21 (WAF1/CIP1 ) , gene p27(KIPl), gene PPM1D, gene RAS, gene de la caveolina I, gene MIB I, gene MTAI, gene M68, genes supresores tumorales, gene supresor tumoral p53.
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