JP2023063361A - 治療薬を送達するための新規な脂質及び組成物 - Google Patents
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- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
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Abstract
【課題】本発明の目的は、一般的な治療使用に好適な脂質-治療用核酸組成物を提供することである。【解決手段】本発明の目的は、式XXXIIIまたはXXXVIIIで表される構造を有する脂質、又はその塩若しくは異性体によって達成される。[化1]JPEG2023063361000056.jpg14170【選択図】図1
Description
優先権主張
本出願は、2008年11月10日に出願された、米国特許出願第61/113,179号、2009年2月20日に出願された米国特許出願第61/154,350号、2009年4月21日に出願された米国特許出願第61/171,439号、2009年6月9日に出願された米国特許出願第61/185,438号、2009年7月15日に出願された米国特許出願第61/225,898号、及び2009年8月14日に出願された米国特許出願第61/234,098号に対する優先権を主張するものであり、これらの各々の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、2008年11月10日に出願された、米国特許出願第61/113,179号、2009年2月20日に出願された米国特許出願第61/154,350号、2009年4月21日に出願された米国特許出願第61/171,439号、2009年6月9日に出願された米国特許出願第61/185,438号、2009年7月15日に出願された米国特許出願第61/225,898号、及び2009年8月14日に出願された米国特許出願第61/234,098号に対する優先権を主張するものであり、これらの各々の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
政府支援
本明細書に記載されている研究は、少なくとも部分的には、国立アレルギー感染症研究所により授与された認可番号HHSN266200600012Cに基づく米国政府からの資金を使用して行われた。したがって、米国政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
本明細書に記載されている研究は、少なくとも部分的には、国立アレルギー感染症研究所により授与された認可番号HHSN266200600012Cに基づく米国政府からの資金を使用して行われた。したがって、米国政府は、本発明に一定の権利を有し得る。
本発明は、脂質粒子を使用した治療薬送達の分野に関する。具体的には、本発明は、核酸のインビボ送達のために、並びにインビボ治療使用に好適な核酸-脂質粒子組成物のために有利である脂質を含む陽イオン性脂質及び脂質粒子を提供する。加えて、本発明は、これら組成物を製作する方法、並びに例えば、種々の疾患状態を治療するために、これら組成物を使用して核酸を細胞に導入する方法を提供する。
関連技術の説明
治療用核酸には、例えば、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、プラスミド、免疫刺激核酸、アンチセンス、アンタゴmir(antagomir)、抗mir(antimir)、マイクロRNA模倣体、スーパーmir(supermir)、U1アダプター、及びアプタマーが含まれる。これらの核酸は、様々な機序により作用する。siRNA又はmiRNAの場合、これらの核酸は、RNA干渉(RNAi)と名付けられたプロセスにより、特定タンパク質の細胞内レベルを下方制御することができる。siRNA又はmiRNAが細胞質に導入された後、これらの二本鎖RNA構築体は、RISCと名付けられたタンパク質に結合することができる。siRNA又はmiRNAのセンスDNAは、RISC複合体から解離し、結合siRNA又はmiRNAの配列に相補的な配列を有するmRNAを認識及び結合することができるテンプレートをRISC内に提供する。相補的mRNAが結合すると、RISC複合体は、そのmRNAを切断し、切断された鎖を放出する。RNAiは、タンパク質合成をコードする対応するmRNAの特異的破壊を標的とすることにより、特定タンパク質の下方制御を提供することができる。
治療用核酸には、例えば、低分子干渉RNA(siRNA)、マイクロRNA(miRNA)、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、プラスミド、免疫刺激核酸、アンチセンス、アンタゴmir(antagomir)、抗mir(antimir)、マイクロRNA模倣体、スーパーmir(supermir)、U1アダプター、及びアプタマーが含まれる。これらの核酸は、様々な機序により作用する。siRNA又はmiRNAの場合、これらの核酸は、RNA干渉(RNAi)と名付けられたプロセスにより、特定タンパク質の細胞内レベルを下方制御することができる。siRNA又はmiRNAが細胞質に導入された後、これらの二本鎖RNA構築体は、RISCと名付けられたタンパク質に結合することができる。siRNA又はmiRNAのセンスDNAは、RISC複合体から解離し、結合siRNA又はmiRNAの配列に相補的な配列を有するmRNAを認識及び結合することができるテンプレートをRISC内に提供する。相補的mRNAが結合すると、RISC複合体は、そのmRNAを切断し、切断された鎖を放出する。RNAiは、タンパク質合成をコードする対応するmRNAの特異的破壊を標的とすることにより、特定タンパク質の下方制御を提供することができる。
siRNA及びmiRNA構築体は、標的タンパク質に対する任意のヌクレオチド配列を用いて合成することができるため、RNAiの治療用途は非常に広範である。現在まで、siRNA構築体は、インビトロ及びインビボモデルの両方において、標的タンパク質を特異的に下方制御する能力を示している。加えて、siRNA構築体は、臨床研究で現在評価中である。
しかしながら、siRNA又はmiRNA構築体が現在直面している2つの問題は、第1には、それらが血漿中でのヌクレアーゼ消化に対して感受性であること、第2には、遊離siRNA又はmiRNAとして全身性に投与される場合、それらがRISCに結合することができる細胞内区画への接近を得る能力に制限があることである。化学的に修飾されたヌクレオチドリンカー、例えばホスホチオアート基を分子内に組み込むことにより、これらの二本鎖構築体を安定化することができる。しかしながら、これらの化学的修飾は、ヌクレアーゼ消化からの限定的な保護を提供するに過ぎず、構築体の活性を減少させる場合がある。siRNA又はmiRNAの細胞内送達は、ポリマー、陽イオン性リポソームなどの担体系を使用することにより、又は構築体を化学的に修飾することにより、例えばコレステロール分子を共有結合で結合させることにより促進することができる。しかしながら、改良された送達系には、siRNA及びmiRNA分子の効力を増加させ、化学的修飾の必要性を低減又は排除することが必要とされている。
アンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムは、mRNAがタンパク質に翻訳されることを阻害することもできる。アンチセンス構築体の場合、これらの一本鎖デオキシ核酸は、標的タンパク質mRNAの配列に相補的な配列を有しており、ワトソン‐クリック型塩基対によりmRNAに結合することができる。この結合は、標的mRNAの翻訳を防止するか、及び/又はmRNA転写物のRNaseH消化を誘発するかのいずれかである。結果的に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、作用特異性(つまり、特定の疾患関連タンパク質の下方制御)に非常に大きな可能性を有する。現在まで、これらの化合物は、炎症性疾患、癌、及びHIVのモデルを含む幾つかのインビトロ及びインビボモデルにおいて将来性を示している(Agrawal, Trends in Biotech. 14:376-87 (1996)に概説されている)。アンチセンスは、染色体DNAと特異的にハイブリダイズすることにより細胞活動に影響を与えることもできる。幾つかのアンチセンス薬物の先端的ヒト臨床評価が、現在進行中である。これらの薬物の標的には、bcl2及びアポリポタンパク質B遺伝子並びにmRNA産物が含まれる。
免疫刺激核酸には、デオキシリボ核酸及びリボ核酸が含まれる。デオキシリボ核酸の場合、特定の配列又はモチーフは、哺乳動物中で不正な免疫刺激を示す。これらの配列又はモチーフには、CpGモチーフ、ピリミジンに富む配列、及びパリンドローム配列が含まれる。デオキシリボ核酸中のCpGモチーフは、エンドソーム受容体、トール様受容体9(TLR-9)により特異的に認識され、その後それにより先天性及び後天性の免疫刺激経路が両方とも誘発されると考えられている。特定の免疫刺激リボ核酸配列も報告されている。これらのRNA配列は、トール様受容体6及び7(TLR-6及びTLR-7)に結合することにより、免疫活性化を誘発すると考えられている。加えて、二本鎖RNAは、免疫刺激性であることも報告されており、TLR-3に結合することにより活性化すると考えられている。
治療用核酸の使用に関する1つの周知の問題は、リン酸ジエステルヌクレオチド間結合の安定性、及びこのリンカーのヌクレアーゼに対する感受性に関する。血清中にエキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼが存在すると、リン酸ジエステルリンカーを有する核酸の迅速な消化がもたらされ、したがって、治療用核酸は、血清の存在下又は細胞内で非常に短い半減期を示す場合がある。(Zelphati, O., et al., Antisense. Res. Dev. 3:323-338 (1993);及びThierry, A.R., et al., pp147-161 in Gene Regulation: Biology of Antisense RNA and DNA (Eds. Erickson, RP and Izant, JG; Raven Press, NY (1992))。現在開発中の治療用核酸は、これらの及び他の既知の問題のため、天然核酸に見出される基本的リン酸ジエステル化学を使用しない。
この問題は、血清又は細胞内消化を低減する化学的修飾により部分的に克服されている。ヌクレオチド間リン酸ジエステル結合における修飾(例えば、ホスホロチオアート、メチルホスホネート、又はホスホルアミダート結合を使用して)、ヌクレオチド塩基における修飾(例えば、5-プロピニル-ピリミジン)、又は糖における修飾(例えば、2’修飾糖)が試験されている(Uhlmann E., et al. Antisense: Chemical Modifications. Encyclopedia of Cancer, Vol. X., pp 64-81 Academic Press Inc. (1997))。他には、2’-5’糖結合を使用して安定性を向上させる試みがなされている(例えば米国特許第5,532,130号を参照)。他の変更が試みられている。しかしながら、これらの解決策はいずれも、完全に満足のいくものではないことが判明しており、インビボ遊離治療用核酸は、依然として効力が限定的である。
加えて、siRNA及びmiRNAに関して上記で注記されているように、治療用核酸には細胞膜を通過する能力に制限があると共に(Vlassov, et al., Biochim. Biophys. Acta 1197:95-1082 (1994)を参照)、補体媒介性アナフィラキシーなどの全身毒性、凝固特性の変更、及び血球減少に関する問題が残されている(Galbraith, et al., Antisense Nucl. Acid Drug Des. 4:201206 (1994))。
効力の向上を試みるために、研究者らは、化学修飾された又は未修飾の核酸を送達するための脂質に基づくの担体系も使用してきた。Zelphati, O and Szoka, F.C., J. Contr. Rel. 41:99-119 (1996)において、著者らは、陰イオン性(従来型)リポソーム、pH感受性リポソーム、免疫リポゾーム、膜融合性リポソーム、及び陽イオン性脂質/アンチセンス凝集体に言及している。同様に、陽イオン性リポソーム中のsiRNAが、全身性に投与されており、これらの核酸-脂質粒子は、非ヒト霊長類を含む哺乳動物で標的タンパク質の下方制御の向上を提供することが報告されている(Zimmermann et al., Nature 441: 111-114 (2006))。
効力の向上を試みるために、研究者らは、化学修飾された又は未修飾の核酸を送達するための脂質に基づくの担体系も使用してきた。Zelphati, O and Szoka, F.C., J. Contr. Rel. 41:99-119 (1996)において、著者らは、陰イオン性(従来型)リポソーム、pH感受性リポソーム、免疫リポゾーム、膜融合性リポソーム、及び陽イオン性脂質/アンチセンス凝集体に言及している。同様に、陽イオン性リポソーム中のsiRNAが、全身性に投与されており、これらの核酸-脂質粒子は、非ヒト霊長類を含む哺乳動物で標的タンパク質の下方制御の向上を提供することが報告されている(Zimmermann et al., Nature 441: 111-114 (2006))。
Agrawal, Trends in Biotech. 14:376-87 (1996)
Zelphati, O., et al., Antisense. Res. Dev. 3:323-338 (1993)
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こうした進歩にもかかわらず、一般的な治療使用に好適な脂質-治療用核酸組成物の向上は、当該技術分野で依然として必要とされている。好ましくは、これらの組成物は、核酸を高効率で封入化し、高い薬物:脂質比率を有し、血清中での分解及びクリアランスから封入化核酸を保護し、全身性送達に好適であり、封入化核酸の細胞内の送達を提供するだろう。加えて、これらの脂質-核酸粒子は、十分に耐用性であり、適切な治療指数を提供すべきであり、したがって有効用量の核酸による患者治療は、患者に対する著しい毒性及び/又はリスクを伴わない。本発明は、そのような組成物、組成物を製作する方法、及び疾患を治療する目的を含む、核酸を細胞に導入するための組成物の使用方法を提供する。
本発明は、新規な陽イオン性脂質、並びにそれを含む脂質粒子を提供する。これらの脂質粒子は、活性薬剤をさらに含むことができ、細胞に活性薬剤を送達するために、本発明の関連方法に従って使用することができる。
1つの態様では、本発明は、以下の構造を有する脂質、並びにその対応する塩及び異性体を提供する:
式中、
R1及びR2は、各存在において各々独立して、随意に置換されたC10~C30アルキル、随意に置換されたC10~C30アルケニル、随意に置換されたC10~C30アルキニル、随意に置換されたC10~C30アシル、又は-リンカー-リガンドであり、
R3は、H、随意に置換されたC1~C10アルキル、随意に置換されたC2~C10アルケニル、随意に置換されたC2~C10アルキニル、アルキルヘトロ環(alkylhetrocycle)、アルキルホスフェート、アルキルホスホロチオアート、アルキルホスホロジチオアート、アルキルホスホネート、アルキルアミン、ヒドロキシアルキル、ω-アミノアルキル、ω-(置換)アミノアルキル、ω-ホスホアルキル、ω-チオホスホアルキル、随意に置換されたポリエチレングリコール(PEG、分子量:100~40K)、随意に置換されたmPEG(分子量:120~40K)、へテロアリール、ヘテロ環、又はリンカー-リガンドであり、
Eは、O、S、N(Q)、C(O)、N(Q)C(O)、C(O)N(Q)、(Q)N(CO)O、O(CO)N(Q)、S(O)、NS(O)2N(Q)、S(O)2、N(Q)S(O)2、SS、O=N、アリール、へテロアリール、環式、又はヘテロ環であり、及び
Qは、H、アルキル、ω-アミノアルキル、ω-(置換)アミノアルキル、ω-ホスホアルキル、又はω-チオホスホアルキルである。
R1及びR2は、各存在において各々独立して、随意に置換されたC10~C30アルキル、随意に置換されたC10~C30アルケニル、随意に置換されたC10~C30アルキニル、随意に置換されたC10~C30アシル、又は-リンカー-リガンドであり、
R3は、H、随意に置換されたC1~C10アルキル、随意に置換されたC2~C10アルケニル、随意に置換されたC2~C10アルキニル、アルキルヘトロ環(alkylhetrocycle)、アルキルホスフェート、アルキルホスホロチオアート、アルキルホスホロジチオアート、アルキルホスホネート、アルキルアミン、ヒドロキシアルキル、ω-アミノアルキル、ω-(置換)アミノアルキル、ω-ホスホアルキル、ω-チオホスホアルキル、随意に置換されたポリエチレングリコール(PEG、分子量:100~40K)、随意に置換されたmPEG(分子量:120~40K)、へテロアリール、ヘテロ環、又はリンカー-リガンドであり、
Eは、O、S、N(Q)、C(O)、N(Q)C(O)、C(O)N(Q)、(Q)N(CO)O、O(CO)N(Q)、S(O)、NS(O)2N(Q)、S(O)2、N(Q)S(O)2、SS、O=N、アリール、へテロアリール、環式、又はヘテロ環であり、及び
Qは、H、アルキル、ω-アミノアルキル、ω-(置換)アミノアルキル、ω-ホスホアルキル、又はω-チオホスホアルキルである。
別の態様では、本発明は、本発明の脂質を含む脂質粒子を提供する。ある実施形態では、脂質粒子は、中性脂質、及び粒子凝集を低減することが可能な脂質をさらに含む。1つの実施形態では、脂質粒子は、(i)本発明の少なくとも1つの脂質、(ii)DSPC、DPPC、POPC、DOPE、及びSMから選択される中性脂質、(iii)ステロール、例えばコレステロール、及び(iv)peg-脂質、例えば、PEG-DMG又はPEG-DMAから本質的になり、モル比は、約20~60%陽イオン性脂質:5~25%中性脂質:25~55%ステロール;0.5~15%PEG-脂質である。1つの実施形態では、本発明の脂質は光学的に純粋である。
さらなる関連実施形態では、本発明は、治療薬をさらに含む本発明の脂質粒子を含む。1つの実施形態では、治療薬は核酸である。1つの実施形態では、核酸は、プラスミド、免疫賦活化オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴmir;二本鎖オリゴヌクレオチド、例えばsiRNA;アプタマー、又はリボザイムである。
さらに別の関連実施形態では、本発明は、本発明の脂質粒子及び薬学的に許容される賦形剤、希釈剤の担体を含む医薬組成物を含む。
本発明は、他の関連実施形態では、細胞における標的遺伝子の発現を調節する方法であって、細胞に本発明の脂質粒子又は医薬組成物を提供することを含む方法をさらに含む。標的遺伝子は、野生型遺伝子であってもよい。別の実施形態では、標的遺伝子は、1つ以上の突然変異を含有している。特定の実施形態では、本方法は、1つ以上の突然変異を含有する標的遺伝子の発現を特異的に調節することを含む。特定の実施形態では、脂質粒子は、免疫賦活化オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチド、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、アンタゴmir;二本鎖オリゴヌクレオチド、例えばsiRNA、アプタマー、リボザイムから選択される治療薬を含む。1つの実施形態では、核酸は、siRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー、又はリボザイムをコードするプラスミドである。
本発明の1つの態様では、標的遺伝子は、第VII因子、Eg5、PCSK9、TPX2、apoB、SAA、TTR、RSV、PDGFベータ遺伝子、Erb-B遺伝子、Src遺伝子、CRK遺伝子、GRB2遺伝子、RAS遺伝子、MEKK遺伝子、JNK遺伝子、RAF遺伝子、Erk1/2遺伝子、PCNA(p21)遺伝子、MYB遺伝子、JUN遺伝子、FOS遺伝子、BCL-2遺伝子、サイクリンD遺伝子、VEGF遺伝子、EGFR遺伝子、サイクリンA遺伝子、サイクリンE遺伝子、WNT-1遺伝子、ベータカテニン遺伝子、c-MET遺伝子、PKC遺伝子、NFKB遺伝子、STAT3遺伝子、サバイビン遺伝子、Her2/Neu遺伝子、SORT1遺伝子、XBP1遺伝子、トポイソメラーゼI遺伝子、トポイソメラーゼIIアルファ遺伝子、p73遺伝子、p21(WAF1/CIP1)遺伝子、p27(KIP1)遺伝子、PPM1D遺伝子、RAS遺伝子、カベオリンI遺伝子、MIB I遺伝子、MTAI遺伝子、M68遺伝子、腫瘍抑制遺伝子中の突然変異、p53腫瘍抑制遺伝子、及びそれらの組合せからなる群から選択される。
別の実施形態では、核酸は、ポリペプチド又はその機能的変異体若しくは断片をコードするプラスミドであり、そのためポリペプチド又はその機能的変異体若しくは断片の発現が増加される。
またさらなる関連実施形態では、本発明は、対象体でポリペプチドが過剰発現されることを特徴とする疾患又は障害を治療する方法であって、対象体に、本発明の脂質粒子又は医薬組成物を提供することを含み、治療薬が、siRNA、マイクロRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びsiRNA、マイクロRNA、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現可能なプラスミドから選択され、siRNA、マイクロRNA、又はアンチセンスRNAが、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと特異的に結合するポリヌクレオチド又はその相補体を含む方法を含む。
別の関連実施形態では、本発明は、対象体でポリペプチドが過小発現されることを特徴とする疾患又は障害を治療する方法であって、対象体に、本発明の医薬組成物を提供することを含み、治療薬が、ポリペプチド又はその機能的変異体若しくは断片をコードするプラスミドである方法を含む。
さらなる実施形態では、本発明は、対象体において免疫応答を誘導する方法であって、対象体に、本発明の医薬組成物を提供することを含み、治療薬が免疫賦活化オリゴヌクレオチドである方法を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、ワクチン又は抗原と組み合わせて患者に提供される。
関連実施形態では、本発明は、本発明の脂質粒子と、疾患又は病原体に関連する抗原とを含むワクチンを含む。1つの実施形態では、脂質粒子は、免疫賦活化核酸又はオリゴヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、抗原は、腫瘍抗原である。別の実施形態では、抗原は、ウイルス抗原、細菌抗原、又は寄生虫抗原である。
本発明は、本発明の脂質粒子及び医薬組成物を調製する方法、並びにこれらの脂質粒子及び医薬組成物の調製に有用なキットをさらに含む。
別の態様では、本発明は、作用剤、例えば治療薬又は診断薬、及び本発明の脂質を含む組成物を評価する方法を提供する。
本発明は、治療薬をインビボ送達するための脂質粒子で使用される際に利点を提供する陽イオン性脂質の発見に部分的に基づく。特に、添付の実施例により例示されているように、本発明は、本発明による陽イオン性脂質を含む核酸-脂質粒子組成物を提供する。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されている組成物は、核酸の活性亢進及び/又はインビボでの組成物の耐用性の向上を提供し、それにより、以前に記載されている脂質-核酸粒子組成物と比較して、治療指数の著しい増加をもたらすことができる。加えて、特定の治療用核酸-脂質粒子で観察される毒性の軽減を提供することができる組成物及び使用方法が開示される。
ある実施形態では、本発明は、siRNA分子を送達するための改良された組成物を提供する。本明細書では、これらの組成物は、タンパク質レベル及び/又は標的タンパク質のmRNAレベルを下方制御するのに有効であることが示される。さらに、これらの改良された組成物の活性は、特定の陽イオン性脂質の存在に依存し、製剤中の陽イオン性脂質のモル比は、活性に影響を及ぼす場合があることが示される。
本発明の脂質粒子及び組成物は、インビトロ及びインビボの両方で、結合された又は封入された治療薬を細胞に送達すること含む、様々な目的に使用することができる。したがって、本発明は、好適な治療薬に結合した本発明の脂質粒子と対象体を接触させることにより、その必要性のある対象体の疾患又は障害を治療する方法を提供する。
本明細書に記載されているように、本発明の脂質粒子は、例えば、siRNA分子及びプラスミドを含む核酸の送達に特に有用である。したがって、本発明の脂質粒子及び組成物は、標的遺伝子発現(例えば、siRNA)を低減させる核酸、又は所望のタンパク質の発現を増加させるために使用することができる核酸(例えば、所望のタンパク質をコードするプラスミド)に結合された本発明の脂質粒子を細胞と接触させることにより、インビトロ及びインビボの両方で、標的遺伝子及びタンパク質の発現を調節するために使用することができる。
本発明の陽イオン性脂質並びにそれを含む脂質粒子及び組成物、並びに治療薬を送達し遺伝子及びタンパク質発現を調節するためのそれらの使用に関する種々の例示的実施形態は、下記でさらに詳細に記載されている。
脂質
本発明は、ある設計特徴を有する新規な脂質を提供する。図2に示されているように、脂質の設計特徴には、以下のうちの少なくとも1つが含まれる:様々なpKaを有する頭部基、陽イオン性の一級、二級、及び三級モノアミン、ジアミン、及びトリアミン、オリゴアミン/ポリアミン、低pKaの頭部基-イミダゾール及びピリジン、グアニジウム、陰イオン性、双性イオン性、及び疎水性尾部は、対称鎖及び/又は非対称鎖、長鎖及びより短い鎖、飽和鎖及び不飽和鎖を含有していてもよく、骨格は、骨格グリセリド及び非環式類似体、エーテル、エステル、ホスフェート及び類似体、スルホネート及び類似体、ジスルフィド、アセタール及びケタールのようなpH感受性結合、イミン及びヒドラゾン、並びにオキシムとの環式、スピロ、二環式、及び多環式結合。
本発明は、ある設計特徴を有する新規な脂質を提供する。図2に示されているように、脂質の設計特徴には、以下のうちの少なくとも1つが含まれる:様々なpKaを有する頭部基、陽イオン性の一級、二級、及び三級モノアミン、ジアミン、及びトリアミン、オリゴアミン/ポリアミン、低pKaの頭部基-イミダゾール及びピリジン、グアニジウム、陰イオン性、双性イオン性、及び疎水性尾部は、対称鎖及び/又は非対称鎖、長鎖及びより短い鎖、飽和鎖及び不飽和鎖を含有していてもよく、骨格は、骨格グリセリド及び非環式類似体、エーテル、エステル、ホスフェート及び類似体、スルホネート及び類似体、ジスルフィド、アセタール及びケタールのようなpH感受性結合、イミン及びヒドラゾン、並びにオキシムとの環式、スピロ、二環式、及び多環式結合。
1つの実施形態では、本脂質は、以下の構造、又はその塩若しくは異性体のうちの1つを有する:
式中、
R1及びR2は、各存在において各々独立して、随意に置換されたC10~C30アルキル、随意に置換されたC10~C30アルケニル、随意に置換されたC10~C30アルキニル、随意に置換されたC10~C30アシル、又は-リンカー-リガンドであり、
R3は、各存在において独立して、H、随意に置換されたC1~C10アルキル、随意に置換されたC2~C10アルケニル、随意に置換されたC2~C10アルキニル、アルキルヘトロ環(alkylhetrocycle)、アルキルホスフェート、アルキルホスホロチオアート、アルキルホスホロジチオアート、アルキルホスホネート、アルキルアミン、ヒドロキシアルキル、ω-アミノアルキル、ω-(置換)アミノアルキル、ω-ホスホアルキル、ω-チオホスホアルキル、随意に置換されたポリエチレングリコール(PEG、分子量:100~40K)、随意に置換されたmPEG(分子量:120~40K)、へテロアリール、ヘテロ環、又はリンカー-リガンドであり、
X及びYは、各々独立して、O、S、アルキル、又はN(Q)であり、
Q1は、各存在において独立してO又はSであり、
Q2は、各存在において独立して、O、S、N(Q)、アルキル、又はアルコキシであり、
A1、A2、A4、及びA5は、各々独立して、O、S、CH2、CHR、又はCF2であり、
i及びjは、0~10である。
R1及びR2は、各存在において各々独立して、随意に置換されたC10~C30アルキル、随意に置換されたC10~C30アルケニル、随意に置換されたC10~C30アルキニル、随意に置換されたC10~C30アシル、又は-リンカー-リガンドであり、
R3は、各存在において独立して、H、随意に置換されたC1~C10アルキル、随意に置換されたC2~C10アルケニル、随意に置換されたC2~C10アルキニル、アルキルヘトロ環(alkylhetrocycle)、アルキルホスフェート、アルキルホスホロチオアート、アルキルホスホロジチオアート、アルキルホスホネート、アルキルアミン、ヒドロキシアルキル、ω-アミノアルキル、ω-(置換)アミノアルキル、ω-ホスホアルキル、ω-チオホスホアルキル、随意に置換されたポリエチレングリコール(PEG、分子量:100~40K)、随意に置換されたmPEG(分子量:120~40K)、へテロアリール、ヘテロ環、又はリンカー-リガンドであり、
X及びYは、各々独立して、O、S、アルキル、又はN(Q)であり、
Q1は、各存在において独立してO又はSであり、
Q2は、各存在において独立して、O、S、N(Q)、アルキル、又はアルコキシであり、
A1、A2、A4、及びA5は、各々独立して、O、S、CH2、CHR、又はCF2であり、
i及びjは、0~10である。
1つの実施形態では、X及びYは、独立して(CO)、O(CO)、O(CO)N、N(CO)O、(CO)O、O(CO)O、スルホネート、又はホスフェートであってもよい。
不飽和アルキル鎖を含む陽イオン性脂質が、膜流動性の増加した脂質核酸粒子を形成するのに特に有用であることを見出した。1つの実施形態では、R1又はR2の少なくとも1つは、少なくとも1つの、少なくとも2つの、又は少なくとも3つの、不飽和、例えば二重結合又は三重結合の部位を含む。
1つの実施形態では、R1又はR2の1つのみが、少なくとも1つの、少なくとも2つの、又は少なくとも3つの不飽和部位を含む。
1つの実施形態では、R1又はR2は両方とも、少なくとも1つの、少なくとも2つの、又は少なくとも3つの不飽和部位を含む。
1つの実施形態では、R1及びR2は、異なる数の不飽和を含み、例えば、R1及びR2のうちの1つは、1つの部位の不飽和を有し、他方は、2つ又は3つの不飽和部位を有する。
1つの実施形態では、R1及びR2は両方とも、同じ数の不飽和部位を含む。
1つの実施形態では、R1及びR2は、異なるタイプの不飽和を含み、例えば、R1及びR2のうちの1つの不飽和は二重結合であり、他方の不飽和は三重結合である。
1つの実施形態では、R1及びR2は両方とも、同じタイプの不飽和、例えば、二重結合又は三重結合を含む。
1つの実施形態では、R1又はR2のうちの少なくとも1つは、少なくとも1つの二重結合及び少なくとも1つの三重結合を含む。
1つの実施形態では、R1又はR2のうちの1つのみが、少なくとも1つの二重結合及び少なくとも1つの三重結合を含む。
1つの実施形態では、R1及びR2は両方とも、少なくとも1つの二重結合及び少なくとも1つの三重結合を含む。
1つの実施形態では、R1及びR2は両方とも同じであり、例えば、R1及びR2は両方とも、リノレイル(C18)であるか、又はR1及びR2は両方とも、ヘプタデカ-9-エニルである。
1つの実施形態では、R1及びR2は互いに異なる。
1つの実施形態では、R1及びR2のうちの少なくとも1つは、コレステロールである。
1つの実施形態では、R1及びR2のうちの1つは、-リンカー-リガンドである。
1つの実施形態では、R1及びR2のうちの1つは、-リンカー-リガンドであり、リガンドは脂肪親和性である。
1つの実施形態では、R1又はR2のうちの少なくとも1つは、1つ又は両方のHがFにより置換されている少なくとも1つのCH2基、例えばCHF又はCF2を含む。1つの実施形態では、R1及びR2は両方とも、1つ又は2つのHがFにより置換されている少なくとも1つのCH2基、例えばCHF又はCF2を含む。
1つの実施形態では、R1及びR2のうちの1つのみが、1つ又は両方のHがFにより置換されている少なくとも1つのCH2基を含む。
1つの実施形態では、R1又はR2のうちの少なくとも1つは、CH2F、CHF2、又はCF3が末端にある。1つの実施形態では、R1又はR2は両方とも、CH2F、CHF2、又はCF3が末端にある。
1つの実施形態では、R1又はR2のうちの少なくとも1つは、-(CF2)y-Z’’-(CH2)y-CH3であり、ここで各yは、独立して1~10であり、Z’’は、O、S、又はN(Q)である。
1つの実施形態では、R1及びR2は両方とも、-(CF2)y-Z’’-(CH2)y-CH3であり、ここで各yは、独立して1~10であり、Z’’は、O、S、又はN(Q)である。
1つの実施形態では、R1又はR2のうちの少なくとも1つは、-(CF2)y-Z’’-(CH2)y-CH3であり、ここで各yは、独立して1~10であり、Z’’は、O、S、又はN(Q)である。
1つの実施形態では、R1及びR2は両方とも、-(CF2)y-Z’’-(CH2)y-CH3であり、ここで各yは、独立して1~10であり、Z’’は、O、S、又はN(Q)である。
1つの実施形態では、R1又はR2のうちの少なくとも1つは、-(CF2)y-(CF2)y-CF3であり、ここで各yは独立して1~10である。
1つの実施形態では、R1又はR2は両方とも、-(CF2)y-(CF2)y-CF3であり、ここで各yは独立して1~10である。
1つの実施形態では、R3は、メチル、エチル、ポリアミン、-(CH2)h-へテロアリール、-(CH2)h-N(Q)2、-O-N(Q)2、-(CH2)h-Z’-(CH2)h-へテロアリール、リンカー-リガンド、-(CH2)h-ヘテル環(hetercycle)、及び-(CH2)h-Z’’-(CH2)h-ヘテロ環からなる群から選択され、ここで各hは、独立して0~13であり、Z’’は、O、S、又はN(Q)である。
1つの実施形態では、リガンドは、膜融合性ペプチドである。
1つの実施形態では、脂質は、ラセミ混合物である。
1つの実施形態では、脂質は、1つのジアステレオマーが濃縮されており、例えば脂質は、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも80%、又は少なくとも70%のジアステレオマー的過剰を示す。
1つの実施形態では、脂質は、1つの鏡像異性体が濃縮されており、例えば脂質は、少なくとも95%、少なくとも90%、少なくとも80%、又は少なくとも70%の鏡像異性体的過剰を示す。
1つの実施形態では、脂質はキラル的に純粋であり、例えば単一の光学異性体である。
1つの実施形態では、脂質は、1つの光学異性体が濃縮されている。
二重結合が存在する場合(例えば、炭素-炭素二重結合又は炭素-窒素二重結合)、二重結合に関する立体配置に異性が存在する場合がある(つまり、cis/trans又はE/Z異性)。二重結合の立体配置が化学構造に示される場合、対応する異性体も存在する場合があることが理解される。異性体が存在する量は、異性体の相対的安定性及び異性体間の変換に必要なエネルギーに依存して様々であり得る。したがって、幾つかの二重結合は、実用的な目的では、単一の立体配置だけで存在するが、他の二重結合は(例えば、相対的安定性が類似しており、変換エネルギーが低い場合)、不可分な立体配置の平衡混合物として存在する場合がある。
1つの態様では、本脂質は、式XXXIIIの化合物、又はその塩若しくは異性体である:
式中、
R1及びR2は、各存在において各々独立して、随意に置換されたC10~C30アルキル、随意に置換されたC10~C30アルケニル、随意に置換されたC10~C30アルキニル、随意に置換されたC10~C30アシル、又は-リンカー-リガンドであり、
R3は、H、随意に置換されたC1~C10アルキル、随意に置換されたC2~C10アルケニル、随意に置換されたC2~C10アルキニル、アルキルヘトロ環、アルキルホスフェート、アルキルホスホロチオアート、アルキルホスホロジチオアート、アルキルホスホネート、アルキルアミン、ヒドロキシアルキル、ω-アミノアルキル、ω-(置換)アミノアルキル、ω-ホスホアルキル、ω-チオホスホアルキル、随意に置換されたポリエチレングリコール(PEG、分子量:100~40K)、随意に置換されたmPEG(分子量:120~40K)、へテロアリール、ヘテロ環、又はリンカー-リガンドであり、
Eは、O、S、N(Q)、C(O)、N(Q)C(O)、C(O)N(Q)、(Q)N(CO)O、O(CO)N(Q)、S(O)、NS(O)2N(Q)、S(O)2、N(Q)S(O)2、SS、O=N、アリール、へテロアリール、環式、又はヘテロ環であり、及び
Qは、H、アルキル、ω-アミノアルキル、ω-(置換)アミノアルキル、ω-ホスホアルキル、又はω-チオホスホアルキルである。
R1及びR2は、各存在において各々独立して、随意に置換されたC10~C30アルキル、随意に置換されたC10~C30アルケニル、随意に置換されたC10~C30アルキニル、随意に置換されたC10~C30アシル、又は-リンカー-リガンドであり、
R3は、H、随意に置換されたC1~C10アルキル、随意に置換されたC2~C10アルケニル、随意に置換されたC2~C10アルキニル、アルキルヘトロ環、アルキルホスフェート、アルキルホスホロチオアート、アルキルホスホロジチオアート、アルキルホスホネート、アルキルアミン、ヒドロキシアルキル、ω-アミノアルキル、ω-(置換)アミノアルキル、ω-ホスホアルキル、ω-チオホスホアルキル、随意に置換されたポリエチレングリコール(PEG、分子量:100~40K)、随意に置換されたmPEG(分子量:120~40K)、へテロアリール、ヘテロ環、又はリンカー-リガンドであり、
Eは、O、S、N(Q)、C(O)、N(Q)C(O)、C(O)N(Q)、(Q)N(CO)O、O(CO)N(Q)、S(O)、NS(O)2N(Q)、S(O)2、N(Q)S(O)2、SS、O=N、アリール、へテロアリール、環式、又はヘテロ環であり、及び
Qは、H、アルキル、ω-アミノアルキル、ω-(置換)アミノアルキル、ω-ホスホアルキル、又はω-チオホスホアルキルである。
1つの実施形態では、R1及びR2は、各存在において各々独立して、随意に置換されたC10~C30アルキル、随意に置換されたC10~C30アルコキシ、随意に置換されたC10~C30アルケニル、随意に置換されたC10~C30アルケニルオキシ、随意に置換されたC10~C30アルキニル、随意に置換されたC10~C30アルキニルオキシ、又は随意に置換されたC10~C30アシルである。
別の実施形態では、R3は、H、随意に置換されたC1~C10アルキル、随意に置換されたC2~C10アルケニル、随意に置換されたC2~C10アルキニル、随意に置換されたアルキルヘテロ環、随意に置換されたヘテロ環アルキル、随意に置換されたアルキルホスフェート、随意に置換されたホスホアルキル、随意に置換されたアルキルホスホロチオアート、随意に置換されたホスホロチオアルキル、随意に置換されたアルキルホスホロジチオアート、随意に置換されたホスホロジチオアルキル、随意に置換されたアルキルホスホネート、随意に置換されたホスホノアルキル、随意に置換されたアミノ、随意に置換されたアルキルアミノ、随意に置換されたジ(アルキル)アミノ、随意に置換されたアミノアルキル、随意に置換されたアルキルアミノアルキル、随意に置換されたジ(アルキル)アミノアルキル、随意に置換されたヒドロキシアルキル、随意に置換されたポリエチレングリコール(PEG、分子量:100~40K)、随意に置換されたmPEG(分子量:120~40K)、随意に置換されたへテロアリール、随意に置換されたヘテロ環、又はリンカー-リガンドである。
さらに別の実施形態では、Eは、-O-、-S-、-N(Q)-、-C(O)-、-N(Q)C(O)-、-C(O)N(Q)-、-N(Q)C(O)O-、-OC(O)N(Q)-、S(O)、-N(Q)S(O)2N(Q)-、-S(O)2-、-N(Q)S(O)2-、-SS-、-O-N=、=N-O-、-C(O)-N(Q)-N=、-N(Q)-N=、-N(Q)-O-、-C(O)S-、アリーレン、ヘテロアリーレン、シクルアルキレン(cyclalkylene)、又はヘテロシクリレン(heterocyclylene)であり、及び
Qは、H、アルキル、ω-アミノアルキル、ω-(置換)アミノアルキル、ω-ホスホアルキル、又はω-チオホスホアルキルである。
Qは、H、アルキル、ω-アミノアルキル、ω-(置換)アミノアルキル、ω-ホスホアルキル、又はω-チオホスホアルキルである。
別の実施形態では、脂質は、式XXXIIIの化合物であり、式中Eは、O、S、N(Q)、C(O)、N(Q)C(O)、C(O)N(Q)、(Q)N(CO)O、O(CO)N(Q)、S(O)、NS(O)2N(Q)、S(O)2、N(Q)S(O)2、SS、O=N、アリール、へテロアリール、環式、又はヘテロ環である。
1つの実施形態では、脂質は、式XXXIIIの化合物であり、式中R3は、H、随意に置換されたC2~C10アルケニル、随意に置換されたC2~C10アルキニル、アルキルヘトロ環、アルキルホスフェート、アルキルホスホロチオアート、アルキルホスホロジチオアート、アルキルホスホネート、アルキルアミン、ヒドロキシアルキル、ω-アミノアルキル、ω-(置換)アミノアルキル、ω-ホスホアルキル、ω-チオホスホアルキル、随意に置換されたポリエチレングリコール(PEG、分子量:100~40K)、随意に置換されたmPEG(分子量:120~40K)、へテロアリール、ヘテロ環、又はリンカー-リガンドである。
さらに別の実施形態では、脂質は、式XXXIIIの化合物であり、式中R1及びR2は、各存在において各々独立して、随意に置換されたC10~C30アルキル、随意に置換されたC10~C30アルキニル、随意に置換されたC10~C30アシル、又は-リンカー-リガンドである。
1つの実施形態では、本発明は、式XXXVIIIの脂質、又はその塩若しくは異性体を特色とする:
式中、
Eは、O、S、N(Q)、C(O)、N(Q)C(O)、C(O)N(Q)、(Q)N(CO)O、O(CO)N(Q)、S(O)、NS(O)2N(Q)、S(O)2、N(Q)S(O)2、SS、O=N、アリール、へテロアリール、環式、又はヘテロ環であり、
Qは、H、アルキル、ω-アムニノアルキル(amnimoalkyl)、ω-(置換)アムニノアルキル、ω-ホスホアルキル、又はω-チオホスホアルキルであり、
R1、R2、及びRxは、各存在において各々独立して、H、随意に置換されたC1~C10アルキル、随意に置換されたC10~C30アルキル、随意に置換されたC10~C30アルケニル、随意に置換されたC10~C30アルキニル、随意に置換されたC10~C30アシル、又はリンカー-リガンドであり、ただしR1、R2、及びRxの少なくとも1つはHではなく、
R3は、H、随意に置換されたC1~C10アルキル、随意に置換されたC2~C10アルケニル、随意に置換されたC2~C10アルキニル、アルキルヘトロ環、アルキルホスフェート、アルキルホスホロチオアート、アルキルホスホロジチオアート、アルキルホスホネート、アルキルアミン、ヒドロキシアルキル、ω-アミノアルキル、ω-(置換)アミノアルキル、ω-ホスホアルキル、ω-チオホスホアルキル、随意に置換されたポリエチレングリコール(PEG、分子量:100~40K)、随意に置換されたmPEG(分子量:120~40K)、へテロアリール、ヘテロ環、又はリンカー-リガンドであり、
nは、0、1、2、又は3である。
Eは、O、S、N(Q)、C(O)、N(Q)C(O)、C(O)N(Q)、(Q)N(CO)O、O(CO)N(Q)、S(O)、NS(O)2N(Q)、S(O)2、N(Q)S(O)2、SS、O=N、アリール、へテロアリール、環式、又はヘテロ環であり、
Qは、H、アルキル、ω-アムニノアルキル(amnimoalkyl)、ω-(置換)アムニノアルキル、ω-ホスホアルキル、又はω-チオホスホアルキルであり、
R1、R2、及びRxは、各存在において各々独立して、H、随意に置換されたC1~C10アルキル、随意に置換されたC10~C30アルキル、随意に置換されたC10~C30アルケニル、随意に置換されたC10~C30アルキニル、随意に置換されたC10~C30アシル、又はリンカー-リガンドであり、ただしR1、R2、及びRxの少なくとも1つはHではなく、
R3は、H、随意に置換されたC1~C10アルキル、随意に置換されたC2~C10アルケニル、随意に置換されたC2~C10アルキニル、アルキルヘトロ環、アルキルホスフェート、アルキルホスホロチオアート、アルキルホスホロジチオアート、アルキルホスホネート、アルキルアミン、ヒドロキシアルキル、ω-アミノアルキル、ω-(置換)アミノアルキル、ω-ホスホアルキル、ω-チオホスホアルキル、随意に置換されたポリエチレングリコール(PEG、分子量:100~40K)、随意に置換されたmPEG(分子量:120~40K)、へテロアリール、ヘテロ環、又はリンカー-リガンドであり、
nは、0、1、2、又は3である。
幾つかの実施形態では、R1及びR2の各々は、各存在において独立して、随意に置換されたC10~C30アルキル、随意に置換されたC10~C30アルケニル、随意に置換されたC10~C30アルキニル、随意に置換されたC10~C30アシル、又はリンカー-リガンドである。
幾つかの実施形態では、Rxは、H又は随意に置換されたC1~C10アルキルである。
幾つかの実施形態では、Rxは、随意に置換されたC10~C30アルキル、随意に置換されたC10~C30アルケニル、随意に置換されたC10~C30アルキニル、随意に置換されたC10~C30アシル、又はリンカー-リガンドである。
1つの実施形態では、R1及びR2は、各存在において互いに独立して、随意に置換されたC10~C30アルキル、随意に置換されたC10~C30アルコキシ、随意に置換されたC10~C30アルケニル、随意に置換されたC10~C30アルケニルオキシ、随意に置換されたC10~C30アルキニル、随意に置換されたC10~C30アルキニルオキシ、又は随意に置換されたC10~C30アシル、又は-リンカー-リガンドである。
1つの実施形態では、R3は、各存在において独立して、H、随意に置換されたC1~C10アルキル、随意に置換されたC2~C10アルケニル、随意に置換されたC2~C10アルキニル、随意に置換されたアルキルヘテロ環、随意に置換されたヘテロ環アルキル、随意に置換されたアルキルホスフェート、随意に置換されたホスホアルキル、随意に置換されたアルキルホスホロチオアート、随意に置換されたホスホロチオアルキル、随意に置換されたアルキルホスホロジチオアート、随意に置換されたホスホロジチオアルキル、随意に置換されたアルキルホスホネート、随意に置換されたホスホノアルキル、随意に置換されたアミノ、随意に置換されたアルキルアミノ、随意に置換されたジ(アルキル)アミノ、随意に置換されたアミノアルキル、随意に置換されたアルキルアミノアルキル、随意に置換されたジ(アルキル)アミノアルキル、随意に置換されたヒドロキシアルキル、随意に置換されたポリエチレングリコール(PEG、分子量:100~40K)、随意に置換されたmPEG(分子量:120~40K)、随意に置換されたへテロアリール、又は随意に置換されたヘテロ環、又はリンカー-リガンドである。
1つの実施形態では、X及びYは、各々独立して、-O-、-S-、アルキレン、-N(Q)-、-C(O)-、-O(CO)-、-OC(O)N(Q)-、-N(Q)C(O)O-、-C(O)O、-OC(O)O-、-OS(O)(Q2)O-、又は-OP(O)(Q2)O-である。
1つの実施形態では、Qは、H、アルキル、ω-アミノアルキル、ω-(置換)アミノアルキル、ω-ホスホアルキル、又はω-チオホスホアルキルである。
1つの実施形態では、Q1は、各存在において独立して、O又はSである。
1つの実施形態では、Q2は、各存在において独立して、O、S、N(Q)(Q)、アルキル、又はアルコキシである。
1つの実施形態では、A1、A2、A4、及びA5は、各々独立して、-O-、-S-、-CH2-、-CHR5-、-CR5R5-、-CHF-、又は-CF2-である。
1つの実施形態では、Eは、-O-、-S-、-N(Q)-、-C(O)-、-C(O)N(Q)、-N(Q)C(O)-、-S(O)-、-S(O)2-、-SS-、-O-N=、=N-O-、アリーレン、ヘテロアリーレン、シクロアルキルエン、又はヘテロシクリレンである。
1つの実施形態では、i及びjは、各々独立して、0~10である。
幾つかの状況では、R3は、ω-アミノアルキル、ω-(置換)アミノアルキル、ω-ホスホアルキル、又はω-チオホスホアルキルであり、これらの各々は、随意に置換されている。ω-(置換)アミノアルキル基の例には、2-(ジメチルアミノ)エチル、3-(ジイソプロピルアミノ)プロピル、又は3-(N-エチル-N-イソプロピルアミノ)-1-メチルプロピルが含まれる。
1つの実施形態では、X及びYは、独立して-O-、-S-、アルキレン、又は-N(Q)-であってもよい。
脂質のジアステレオマーは全てが示されているとは限らないが、本発明の1つの態様は、全てのジアステレオマーを提供するものであり、したがって、キラル的に純粋な脂質及びジアステレオマー的に濃縮された脂質も、本発明の一部である。
1つの実施形態では、R3は、-リンカー-リガンドである。
特定の実施形態では、本発明の脂質は、陽イオン性脂質である。本明細書で使用されるとき、「陽イオン性脂質」という用語は、1つ又は2つの脂肪酸又は脂肪アルキル鎖及び生理学的なpHでプロトン化されて陽イオン性脂質を形成することができるアミノ頭部基(アルキルアミノ又はジアルキルアミノ基を含む)を有する脂質を含むことが意図されている。幾つかの実施形態では、陽イオン性脂質は、「アミノ脂質」と呼ばれる。
他の陽イオン性脂質には、アルキル置換基が異なるもの(例えば、N-エチル-N-メチルアミノ-、N-プロピル-N-エチルアミノ-など)を含む、代替的な脂肪酸基及び他のジアルキルアミノ基を有するものが含まれるだろう。R1及びR2が両方とも長鎖アルキル又はアシル基である実施形態の場合、それらは、同じであってもよく又は異なっていてもよい。一般的に、より低飽和のアシル鎖を有する脂質(例えば、陽イオン性脂質)は、特に複合体がろ過滅菌するために約0.3マイクロメートル未満にサイズ化される場合、より容易にサイズ化することができる。C10~C20の範囲の炭素鎖長を有する不飽和脂肪酸を含有する陽イオン性脂質が典型的である。他の骨格を使用して、アミノ基(例えば、陽イオン性脂質のアミノ基)と、陽イオン性脂質の脂肪酸又は脂肪アルキル部分とを分離することもできる。好適な骨格は当業者に公知である。
ある実施形態では、本発明の陽イオン性脂質は、少なくとも1つのプロトン化可能な基又は脱プロトン化可能な基を有しており、そのため脂質は、生理学的なpH(例えば、pH7.4)以下で正に荷電され、第2のpHで、好ましくは生理学的なpHで又はそれを超えたpHで中性である。そのような脂質も、陽イオン性脂質と呼ばれる。無論、pHの関数としてのプロトンの付加又は脱離が、平衡プロセスであり、荷電脂質又は中性脂質への言及は、支配的な種の性質を指し、脂質の全てが荷電形態又は中性形態にあることを必要としないことが理解されるだろう。複数のプロトン化可能な基又は脱プロトン化可能な基を有するか、又は双性イオンである脂質は、本発明における使用から除外されない。
ある実施形態では、本発明によるプロトン化可能な脂質(つまり、陽イオン性脂質)は、プロトン化可能な基のpKaが約4~約11の範囲である。典型的には、脂質は、脂質粒子に組み込まれた際に、約4~約7のpKa、例えば約5.5~6.8など、約4~約7のpKaを有するだろう。そのような脂質は、より低いpHの製剤段階では陽イオン性であるが、粒子は、pH7.4付近の生理学的なpHでは、表面がほとんど(完全でないが)中性化されるだろう。約4~7の範囲のpKaの有益性の1つは、粒子の外側表面に結合している少なくともある程度の核酸が、生理学的なpHでその静電的相互作用を喪失し、簡単な透析により除去されるということであり、したがってクリアランスに対する粒子の感受性が大幅に低減される。脂質粒子内の脂質のpKa測定は、例えば、Cullis et al., (1986) Chem Phys Lipids 40, 127-144に記載されている方法を使用して、蛍光プローブである2-(p-トルイジノ)-6-ナフタレンスルホン酸(TNS)を使用することにより実施することができる。
1つの実施形態では、本発明の製剤は、少なくとも75%、少なくとも80%、又は少なくとも90%が封入される。
1つの実施形態では、本発明の製剤は、アポリポタンパク質をさらに含む。本明細書で使用されるとき、「アポリポタンパク質」又は「リポタンパク質」という用語は、当業者に公知のアポリポタンパク質並びにその変異体及び断片、並びに下記に記載されているアポリポタンパク質アゴニスト、その類似体又は断片を指す。
好適なアポリポタンパク質には、これらに限定されないが、ApoA-I、ApoA-II、ApoA-IV、ApoA-V、及びApoE、並びに活性多形型形態、アイソフォーム、変異体、及び突然変異体、並びにそれらの断片又は切断型形態が含まれる。ある実施形態では、アポリポタンパク質は、チオール含有アポリポタンパク質である。「チオール含有アポリポタンパク質」は、少なくとも1つのシステイン残基を含有するアポリポタンパク質、変異体、断片、又はアイソフォームを指す。最も一般的なチオール含有アポリポタンパク質は、1つのシステイン残基を含有するApoA-I Milano(ApoA-IM)及びApoA-I Paris(ApoA-IP)である(Jia et al., 2002, Biochem. Biophys. Res. Comm. 297: 206-13;Bielicki and Oda, 2002, Biochemistry 41: 2089-96)。ApoA-II、ApoE2、及びApoE3も、チオール含有アポリポタンパク質である。その組換え的に産生された形態を含む単離されたApoE及び/又はその活性断片及びポリペプチド類似体は、米国特許第5,672,685号;同第5,525,472号;同第5,473,039号;同第5,182,364号;同第5,177,189号;同第5,168,045号;同第5,116,739号に記載されており、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ApoE3は、Weisgraber, et al., “Human E apoprotein heterogeneity: cysteine-arginine interchanges in the amino acid sequence of the apo-E isoforms,” J. Biol. Chem. (1981) 256: 9077-9083;及びRall, et al., “Structural basis for receptor binding heterogeneity of apolipoprotein E from type III hyperlipoproteinemic subjects,” Proc. Nat. Acad. Sci. (1982) 79: 4696-4700に記載されている。GenBank受入番号K00396も参照されたい。
ある実施形態では、アポリポタンパク質は、その成熟形態であってもよく、そのプレプロアポリポタンパク質形態であってもよく、又はそのプロアポリポタンパク質形態であってもよい。プロApoA-I及び成熟ApoA-I(可能な場合)(Duverger et al., 1996, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16(12):1424-29)、ApoA-I Milano(Klon et al. , 2000, Biophys. J. 79:(3)1679-87;Franceschini et al., 1985, J. Biol. Chem. 260: 1632-35)、ApoA-I Paris(Daum et al., 1999, J. Mol. Med. 77:614-22)、ApoA-II(Shelness et al., 1985, J. Biol. Chem. 260(14):8637-46; Shelness et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(15):9929-35)、ApoA-IV(Duverger et al., 1991, Euro. J. Biochem. 201(2):373-83)、及びApoE(McLean et al., 1983, J. Biol. Chem. 258(14):8993-9000)のホモダイマー及びヘテロダイマーも、本発明の範囲内で使用することができる。
ある実施形態では、アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質の断片、変異体、又はアイソフォームであってもよい。「断片」という用語は、天然アポリポタンパク質のアミノ酸配列よりも短いアミノ酸配列を有する任意のアポリポタンパク質を指し、断片は、脂質結合特性を含む天然アポリポタンパク質の活性を保持する。「変異体」とは、アポリポタンパク質のアミノ酸配列における置換又は変更を意味し、置換又は変更、例えばアミノ酸残基の付加及び欠失は、脂質結合特性を含む天然アポリポタンパク質の活性を消失させない。したがって、変異体は、1つ以上のアミノ酸残基が化学的に類似しているアミノ酸と保守的に置換された本明細書で提供される天然アポリポタンパク質と、実質的に同一のアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチドを含むことができる。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、又はメチオニンなどの少なくとも1つの疎水性残基を別の残基に置換することが含まれる。同様に、例えば、本発明は、例えばアルギニンとリジンとの間、グルタミンとアスパラギンとの間、及びグリシンとセリンとの間などの、少なくとも1つの親水性残基の置換を企図する(米国特許第6,004,925号、同第6,037,323号、及び同第6,046,166号を参照)。「アイソフォーム」という用語は、同じ機能、より大きな機能、又は部分的な機能、及び類似した配列、同一の配列、又は部分的な配列を有するタンパク質を指し、同じ遺伝子の産物であってもよいか、なくてもよい、通常は組織特異的である(Weisgraber 1990, J. Lipid Res. 31(8):1503-11;Hixson and Powers 1991, J. Lipid Res. 32(9):1529-35;Lackner et al., 1985, J. Biol. Chem. 260(2):703-6;Hoeg et al., 1986, J. Biol. Chem. 261(9):3911-4;Gordon et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(1):468-74;Powell et al., 1987, Cell 50(6):831-40;Aviram et al., 1998, Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 18(10):1617-24;Aviram et al., 1998, J. Clin. Invest. 101(8):1581-90;Billecke et al., 2000, Drug Metab. Dispos. 28(11):1335-42;Draganov et al., 2000, J. Biol. Chem. 275(43):33435-42;Steinmetz and Utermann 1985, J. Biol. Chem. 260(4):2258-64;Widler et al., 1980, J. Biol. Chem. 255(21):10464-71;Dyer et al., 1995, J. Lipid Res. 36(1):80-8; Sacre et al., 2003, FEBS Lett. 540(1-3):181-7;Weers, et al., 2003, Biophys. Chem. 100(1-3):481-92;Gong et al., 2002, J. Biol. Chem. 277(33):29919-26;Ohta et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(23):14888-93、及び米国特許第6,372,886号)。
ある実施形態では、本発明の方法及び組成物は、アポリポタンパク質のキメラ構築体の使用を含む。例えば、アポリポタンパク質のキメラ構築体は、虚血再灌流保護特性を有するアポリポタンパク質ドメインに結合している、高い脂質結合力を有するアポリポタンパク質ドメインで構成されていてもよい。アポリポタンパク質のキメラ構築体は、アポリポタンパク質内にある個別の領域を含む構築体(つまり、相同性構築体)であってもよく、又はキメラ構築体は、アポリポタンパク質間で異なる個別の領域を含む構築体(つまり、異種性構築体)であってもよい。キメラ構築体を含む組成物は、特定の特徴(例えば、脂質結合、受容体結合、酵素性、酵素活性化、抗酸化特性、又は酸化還元特性)を有するように設計されたアポリポタンパク質変異体又はセグメントであるセグメントを含むこともできる(Weisgraber 1990, J. Lipid Res. 31(8):1503-11;Hixson and Powers 1991, J. Lipid Res. 32(9):1529-35;Lackner et al., 1985, J. Biol. Chem. 260(2):703-6;Hoeg et al, 1986, J. Biol. Chem. 261(9):3911-4;Gordon et al., 1984, J. Biol. Chem. 259(1):468-74;Powell et al., 1987, Cell 50(6):831-40;Aviram et al., 1998, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 18(10):1617-24;Aviram et al., 1998, J. Clin. Invest. 101(8):1581-90;Billecke et al., 2000, Drug Metab. Dispos. 28(11):1335-42;Draganov et al., 2000, J. Biol. Chem. 275(43):33435-42;Steinmetz and Utermann 1985, J. Biol. Chem. 260(4):2258-64;Widler et al., 1980, J. Biol. Chem. 255(21):10464-71;Dyer et al., 1995, J. Lipid Res. 36(1):80-8;Sorenson et al., 1999, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 19(9):2214-25;Palgunachari 1996, Arterioscler. Throb. Vasc. Biol. 16(2):328-38:Thurberg et al., J. Biol. Chem. 271(11):6062-70;Dyer 1991, J. Biol. Chem. 266(23):150009-15;Hill 1998, J. Biol. Chem. 273(47):30979-84を参照)。
本発明で使用されるアポリポタンパク質には、組換え、合成、半合成、又は精製されたアポリポタンパク質も含まれる。本発明により使用されるアポリポタンパク質又はその等価物を取得するための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、アポリポタンパク質は、例えば密度勾配遠心分離又は免疫親和性クロマトグラフィーで血漿又は天然産物から分離してもよく、又は合成的に、半合成的に、若しくは当業者に公知の組換えDNA技術を使用して生成してもよい(例えば、Mulugeta et al., 1998, J. Chromatogr. 798(1-2): 83-90;Chung et al., 1980, J. Lipid Res. 21(3):284-91;Cheung et al., 1987, J. Lipid Res. 28(8):913-29;Persson, et al., 1998, J. Chromatogr. 711:97-109;米国特許第5,059,528号、同第5,834,596号、同第5,876,968号、及び同第5,721,114号;並びに国際公開第86/04920号及び国際公開第87/02062号を参照)。
本発明で使用されるアポリポタンパク質には、ApoA-I、ApoA-I Milano(ApoA-IM)、ApoA-I Paris(ApoA-IP)、ApoA-II、ApoA-IV、及びApoEの活性を模倣するペプチド及びペプチド類似体などのアポリポタンパク質アゴニストをさらに含む。例えば、アポリポタンパク質は、米国特許第6,004,925号、同第6,037,323号、同第6,046,166号、及び同第5,840,688号に記載されているもののいずれかであってもよく、それらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
アポリポタンパク質アゴニストペプチド又はペプチド類似体は、例えば、米国特許第6,004,925号、同第6,037,323号、及び同第6,046,166号に記載されている技術などの、当該技術分野で公知である任意のペプチド合成技術を使用して、合成又は製造することができる。例えば、ペプチドは、Merrifield(1963, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154)により最初に記載されている固相合成技術を使用して調製することができる。他のペプチド合成技術は、Bodanszky et al., Peptide Synthesis, John Wiley & Sons, 2d Ed., (1976)、及び当業者が容易に入手可能な他の文献に見出すことができる。ポリペプチド合成技術の要約は、Stuart and Young, Solid Phase Peptide. Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford, Ill., (1984)に見出すことができる。ペプチドは、The Proteins, Vol. II, 3d Ed., Neurath et. al., Eds., p. 105-237, Academic Press, New York, N.Y. (1976)に記載されているような溶液法により合成することもできる。様々なペプチド合成に使用するための適切な保護基は、前述の文献並びにMcOmie, Protective Groups in Organic Chemistry, Plenum Press, New York, N.Y. (1973)に記載されている。本発明のペプチドは、例えば、アポリポタンパク質A-Iのより大きな部分から、化学的に又は酵素的に切断することにより調製することもできる。
ある実施形態では、アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質の混合物であってもよい。1つの実施形態では、アポリポタンパク質は、均質な混合物、すなわち単一のタイプのアポリポタンパク質であってもよい。別の実施形態では、アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質の異種性混合物、すなわち2つ以上の異なるアポリポタンパク質の混合物であってもよい。アポリポタンパク質の異種性混合物の実施形態は、例えば、動物供給源に由来するアポリポタンパク質及び半合成的供給源に由来するアポリポタンパク質の混合物を含むことができる。ある実施形態では、異種性混合物は、例えば、ApoA-I及びApoA-I Milanoの混合物を含むことができる。ある実施形態では、異種性混合物は、例えば、ApoA-I Milano及びApoA-I Parisの混合物を含むことができる。本発明の方法及び組成物に使用するための好適な混合物は、当業者であれば明白であろう。
アポリポタンパク質が天然供給源から取得される場合、アポリポタンパク質は、植物又は動物供給源から取得することができる。アポリポタンパク質が動物供給源から取得される場合、アポリポタンパク質は、任意の種に由来してよい。ある実施形態では、アポリポタンパク質は、動物供給源から取得することができる。ある実施形態では、アポリポタンパク質は、ヒト供給源から取得することができる。本発明の好ましい実施形態では、アポリポタンパク質は、アポリポタンパク質が投与される個体と同じ種に由来する。
脂質粒子
本発明は、上述の陽イオン性脂質の1つ以上を含む脂質粒子も提供する。脂質粒子には、リポソームが含まれるが、これに限定されない。本明細書で使用されるとき、リポソームとは、水性の内部を取り囲む脂質含有膜を有する構造である。リポソームは、1つ以上の脂質膜を有していてもよい。本発明は、単層膜と呼ばれる単一層状リポソーム及び多重層膜と呼ばれる複数層状リポソームの両方を企図する。また、脂質粒子は、核酸と複合体化した際に、例えば、Felgner, Scientific Americanに記載されているような、DNA層の間に挟まれた陽イオン性脂質二分子膜で構成されるリポプレックスであってもよい。
本発明は、上述の陽イオン性脂質の1つ以上を含む脂質粒子も提供する。脂質粒子には、リポソームが含まれるが、これに限定されない。本明細書で使用されるとき、リポソームとは、水性の内部を取り囲む脂質含有膜を有する構造である。リポソームは、1つ以上の脂質膜を有していてもよい。本発明は、単層膜と呼ばれる単一層状リポソーム及び多重層膜と呼ばれる複数層状リポソームの両方を企図する。また、脂質粒子は、核酸と複合体化した際に、例えば、Felgner, Scientific Americanに記載されているような、DNA層の間に挟まれた陽イオン性脂質二分子膜で構成されるリポプレックスであってもよい。
本発明の脂質粒子は、1つ以上のさらなる脂質及び/又はコレステロールなどの他の成分をさらに含んでいてもよい。他の脂質が、脂質酸化を防止するため又はリポソーム表面にリガンドを結合させるためなどの様々な目的で、本発明のリポソーム組成物に含まれていてもよい。両親媒性、中性、陽イオン性、及び陰イオン性脂質を含む多数の脂質のいずれが、本発明のリポソーム中に存在していてもよい。そのような脂質は、単独で又は組合せで使用することができる。存在していてもよいさらなる脂質成分の特定の例は、下記に記載されている。
本発明の脂質粒子に存在していてもよいさらなる成分には、ポリアミドオリゴマーなどの二分子膜安定化成分(例えば、米国特許第6,320,017号を参照)、ペプチド、タンパク質、界面活性剤、ホスファチジルエタノールアミンに結合されたPEG及びセラミドに結合されたPEGなどの脂質誘導体(米国特許第5,885,613号を参照)が含まれる。
特定の実施形態では、脂質粒子には、第2のアミノ脂質又は陽イオン性脂質、中性脂質、ステロール、及び形成中の脂質粒子の凝集を低減するために選択される脂質のうちの1つ以上が含まれ、凝集の低減は、形成中の電荷誘導性凝集を防止する粒子の立体安定化の結果であり得る。
形成中の粒子の凝集を低減する脂質の例には、ポリエチレングリコール(PEG)修飾脂質、モノシアロガングリオシドGm1、及びポリアミドオリゴマー(「PAO」)(米国特許第6,320,017号に記載されているものなど)が含まれる。PEG、Gm1、又はATTAのような製剤中の凝集を防止する無荷電で親水性の立体障害部分を有する他の化合物を、本発明の方法及び組成物に使用するための脂質に結合させることもできる。ATTA脂質は、例えば米国特許第6,320,017号に記載されており、PEG脂質結合体は、例えば米国特許第5,820,873号、同第5,534,499号、及び同第5,885,613号に記載されている。典型的には、凝集を低減するために選択される脂質成分の濃度は、約1~15%である(脂質のモルパーセントによる)。
本発明に有用なPEG修飾脂質(又は脂質-ポリオキシエチレン結合体)の特定の例は、脂質小胞の表面にPEG部分を固定するための様々な「係留」脂質部分を有することができる。好適なPEG修飾脂質の例には、PEG修飾ホスファチジルエタノールアミン及びホスファチジン酸、参照により本明細書に組み込まれる同時係属の米国特許出願第08/486,214号に記載されているPEG-セラミド結合体(例えば、PEG-CerC14又はPEG-CerC20)、PEG修飾ジアルキルアミン、及びPEG修飾1,2-ジアシルオキシプロパン-3-アミンが含まれる。特に、PEG修飾ジアシルグリセロール及びジアルキルグリセロールが好ましい。
PEG又はATTAなどの立体的に大きな部分が、脂質アンカーに結合される実施形態では、脂質アンカーの選択は、結合体が脂質粒子と共に有することになる結合のタイプに依存する。mPEG(分子量2000)-ジアステアロイルホスファチジルエタノールアミン(PEG-DSPE)は、粒子が循環から排除されるまで、おそらくは数日間程度、リポソームと結合したままであることは周知である。PEG-CerC20などの他の結合体は、同様の滞留能力を有する。しかしながら、PEG-CerC14は、幾つかのアッセイでは、血清と接触した際に60分未満のT1/2で迅速に交換して製剤から外へと出ていく。米国特許出願第08/486,214号に例示されているように、少なくとも3つの特徴:アシル鎖の長さ、アシル鎖の飽和度、及び立体障害性頭部基のサイズが、交換速度に影響を及ぼす。これらの特徴の好適な変異を有する化合物は、本発明に有用であり得る。幾つかの治療用途の場合、PEG修飾脂質は、インビボで核酸-脂質粒子から迅速に失われることが好ましい場合があり、したがってPEG修飾脂質は比較的短い脂質アンカーを有するだろう。他の治療用途では、核酸-脂質粒子は、より長い血漿循環寿命を示すことが好まましい場合があり、したがってPEG修飾脂質は、比較的より長い脂質アンカーを有するだろう。
凝集防止化合物は、適切に機能するために脂質結合を必ずしも必要としないことに留意すべきである。溶液中の遊離PEG又は遊離ATTAは、凝集を防止するのに十分であり得る。粒子が製剤後に安定している場合、PEG又はATTAは、対象体に投与する前に透析して取り除くことができる。
中性脂質は、脂質粒子に存在する場合、生理学的なpHで無荷電の又は中性の双性イオン形態のいずれかで存在する多くの脂質種のいずれであってもよい。そのような脂質には、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、ケファリン、及びセレブロシドが含まれる。本明細書に記載されている粒子に使用するための中性脂質の選択は、一般的には、例えばリポソームのサイズ及び血流中のリポソームの安定性を考慮することにより導かれる。好ましくは、中性脂質成分は、2つのアシル基を有する脂質である(つまり、ジアシルホスファチジルコリン及びジアシルホスファチジルエタノールアミン)。様々な鎖長及び様々な飽和度のアシル鎖基を有する脂質は、入手可能であるか、又は周知の技術により単離又は合成することができる。1つの群の実施形態では、C10~C20の範囲の炭素鎖長を有する飽和脂肪酸を含有する脂質が好ましい。別の群の実施形態では、C10~C20の範囲の炭素鎖長を有するモノ飽和又はジ飽和脂肪酸を有する脂質が使用される。加えて、飽和及び不飽和脂肪酸鎖の混合物を有する脂質を使用することができる。好ましくは、本発明で使用される中性脂質は、DOPE、DSPC、POPC、DPPC、又は任意の関連ホスファチジルコリンである。本発明に有用な中性脂質は、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、又はセリン及びイノシトールなどの他の頭部基を有するリン脂質で構成されていてもよい。
脂質混合物のステロール成分は、存在する場合、リポソーム、脂質小胞、又は脂質粒子調製の分野で従来使用されているステロールのいずれであってもよい。好ましいステロールはコレステロールである。
具体的に上述されているものに加えて、生理学的pH付近で正味正電荷を担持する他の陽イオン性脂質も、本発明の脂質粒子に含まれ得る。そのような陽イオン性脂質には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる:N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロリド(「DODAC」);N-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル-N,N-N-トリエチルアンモニウムクロリド(「DOTMA」);N,N-ジステアリル-N,N-ジメチルアンモニウムブロミド(「DDAB」);N-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(「DOTAP」);1,2-ジオレイルオキシ-3-トリメチルアミノプロパンクロリド塩(「DOTAP.Cl」);3-(N-(N’,N’-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル)コレステロール(「DC-Chol」)、N-(1-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N-2-(スペルミンカルボキサミド)エチル)-N,N-ジメチルアンモニウムトリフルオルアセテート(「DOSPA」)、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン(「DOGS」)、1,2-ジレオイル-sn-3-ホスホエタノールアミン(「DOPE」)、1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウムプロパン(「DODAP」)、N、N-ジメチル-2,3-ジオレイルオキシ)プロピルアミン(「DODMA」)、及びN-(1,2-ジミリスチルオキシプロプ-3-イル)-N,N-ジメチル-N-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(「DMRIE」)。加えて、例えば、LIPOFECTIN(DOTMA及びDOPEを含む、GIBCO/BRL社から入手可能)、及びLIPOFECTAMINE(DOSPA及びDOPEを含む、GIBCO/BRL社から入手可能)などの、多くの市販の陽イオン性脂質調製物を使用することができる。特定の実施形態では、陽イオン性脂質は、アミノ脂質である。
本発明の脂質粒子に使用するのに好適な陰イオン性脂質には、これらに限定されないが、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、N-ドデカノイルホスファチジルエタノロアミン(N-dodecanoyl phosphatidylethanoloamine)、N-スクシニルホスファチジルエタノールアミン、N-グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、及び中性脂質に結合された他の陰イオン性修飾基が含まれる。
多くの実施形態では、両親媒性脂質が、本発明の脂質粒子に含まれる。「両親媒性脂質」は、脂質物質の疎水性部分が疎水性相に向けて配置され、親水性部分が水相に向けて配置されている任意の好適な物質を指す。そのような化合物には、これらに限定されないが、リン脂質、アミノ脂質、及びスフィンゴ脂質が含まれる。代表的なリン脂質には、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファトジルコリン(palmitoyloleoyl phosphatdylcholine)、リゾフォスファチジルコリン、リゾフォスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、又はジリノレオイルホスファチジルコリンが含まれる。スフィンゴ脂質、スフィンゴ糖脂質ファミリー、ジアシルグリセロール、及びδ-アシルオキシ酸などの他のリン欠失化合物を使用することもできる。加えて、そのような両親媒性脂質は、トリグリセリド及びステロールなどの他の脂質と、容易に混合することができる。
また、本発明の脂質粒子への包含に好適なのは、プログラム可能な融合脂質である。そのような脂質粒子は、所定のシグナル事象が生じるまで、細胞膜と融合してそれらのペイロードを送達する傾向をほとんど示さない。これにより、脂質粒子は、生物又は疾患部位に注射された後、細胞との融合を開始する前に、より均一に分布することが可能になる。シグナル事象は、例えば、pH、温度、イオン環境、又は時間の変化であってもよい。後者の場合、ATTA-脂質結合体又はPEG-脂質結合体などの、融合遅延成分又は「被覆(cloaking)」成分は、単に時間の経過と共に交換して脂質粒子膜から外に出ていくことができる。脂質粒子は、体内で適切に分布するまでに、十分な被覆剤を失って膜融合性になる。他のシグナル事象を用いる場合、炎症部位での温度上昇などの、疾患部位又は標的細胞に関連するシグナルを選択することが望ましい。
ある実施形態では、細胞タイプ又は組織に特異的な標的指向性部分を使用して、本発明の脂質粒子を標的指向性にすることが望ましい。リガンド、細胞表面受容体、糖タンパク質、ビタミン(例えば、リボフラビン)、及びモノクローナル抗体などの様々な標的指向性部分を使用して、脂質粒子を標的指向性にすることは、以前に記載されている(例えば、米国特許第4,957,773号及び同第4,603,044号を参照)。標的指向性部分は、タンパク質全体又はその断片を含むことができる。標的指向性機序では、一般的に、標的指向性物質は、標的部分が標的、例えば細胞表面受容体との相互作用に利用可能なように、脂質粒子の表面に配置されていることが必要である。様々な異なる標的指向性物質及び方法は、例えば、Sapra, P. and Allen, TM, Prog. Lipid Res. 42(5):439-62 (2003);及びAbra, RM et al., J. Liposome Res. 12:1-3, (2002)に記載されているものを含み、当該技術分野において公知であり、入手可能である。
ポリエチレングリコール(PEG)鎖などの親水性ポリマー鎖で表面がコーティングされている脂質粒子、つまりリポソームの使用が、提唱されている(Allen, et al., Biochimica et Biophysica Acta 1237: 99-108 (1995);DeFrees, et al., Journal of the American Chemistry Society 118: 6101-6104 (1996);Blume, et al., Biochimica et Biophysica Acta 1149: 180-184 (1993);Klibanov, et al., Journal of Liposome Research 2: 321-334 (1992);米国特許第5,013556号;Zalipsky, Bioconjugate Chemistry 4: 296-299 (1993);Zalipsky, FEBS Letters 353: 71-74 (1994);Zalipsky, in Stealth Liposomes Chapter 9 (Lasic and Martin, Eds) CRC Press, Boca Raton Fl (1995))。1つの手法では、脂質粒子を標的指向性にするための、抗体などのリガンドを、脂質粒子を形成する脂質の極性頭部基に結合させる。別の手法では、親水性ポリマーコーティングを形成するPEG鎖の遠位端部に標的指向性リガンドを結合させる(Klibanov, et al., Journal of Liposome Research 2: 321-334 (1992);Kirpotin et al., FEBS Letters 388: 115-118 (1996))。
標的指向性物質を結合させるためには、標準的方法を使用することができる。例えば、標的指向性物質を結合するために活性化することができるホスファチジルエタノールアミン、又は脂質誘導体化ブレオマイシンなどの誘導体化親油性化合物を使用することができる。抗体標的化リポソームは、例えば、プロテインAが組み込まれているポソームを使用して構築することができる(Renneisen, et al., J. Bio. Chem., 265:16337-16342 (1990) and Leonetti, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 87:2448-2451 (1990)を参照)。抗体結合の他の例は、米国特許第6,027,726号に開示されており、それらの教示は、参照により本明細書に組み込まれる。標的指向性部分の例には、新生物又は腫瘍に関連する抗原を含む細胞成分に特異的な他のタンパク質も含まれ得る。標的指向性部分として使用されるタンパク質は、共有結合によりリポソームに結合することができる(Heath, Covalent Attachment of Proteins to Liposomes, 149 Methods in Enzymology 111-119 (Academic Press, Inc. 1987)を参照)。他の標的指向化法には、ビオチン-アビジン系が含まれる。
1つの例示的な実施形態では、脂質粒子は、本発明の陽イオン性脂質、中性脂質(陽イオン性脂質以外)、ステロール(例えば、コレステロール)、及びPEG修飾脂質(例えば、PEG-DMG又はPEG-DMA)の混合物を含む。ある実施形態では、脂質混合物は、本発明の陽イオン性脂質、中性脂質、コレステロール、及びPEG修飾脂質からなるか、又は本質的にからなる。さらなる好ましい実施形態では、脂質粒子は、約20~70%アミノ脂質:5~45%中性脂質:20~55%コレステロール:0.5~15%PEG修飾脂質のモル比の上記脂質混合物からなるか、又は本質的にからなる。
1つの実施形態では、脂質粒子は、本明細書に開示されている少なくとも2つの脂質を含む。例えば、陽イオン性脂質の混合物を脂質粒子に使用することができ、混合物は、モルに基づき20~60%の総脂質含有量を含む。
特定の実施形態では、脂質粒子は、表1から選択される陽イオン性脂質、DSPC、Chol、及びPEG-DMG又はPEG-DMAのいずれかからなるか、又は本質的にからなり、モル比は、例えば約20~60%陽イオン性脂質:5~25%DSPC:25~55%Chol:0.5~15%PEG-DMG又はPEG-DMAである。特定の実施形態では、脂質モル比は、およそ40/10/40/10(モル% 陽イオン性脂質/DSPC/Chol/PEG-DMG又はPEG-DMA)、35/15/40/10(モル% 陽イオン性脂質/DSPC/Chol/PEG-DMG又はPEG-DMA)、又は52/13/30/5(モル% 陽イオン性脂質/DSPC/Chol/PEG-DMG又はPEG-DMA)である。別の群の実施形態では、これらの組成物中の中性脂質、DSPCは、POPC、DPPC、DOPE、又はSMと置換される。
治療薬-脂質粒子組成物及び製剤
本発明は、本発明の脂質粒子及び活性作用剤を含む組成物を含み、活性作用剤は脂質粒子に結合している。特定の実施形態では、活性作用剤は治療薬である。特定の実施形態では、活性作用剤は、脂質粒子の水性内部内に封入されている。他の実施形態では、活性作用剤は、脂質粒子の1つ以上の脂質層内に存在する。他の実施形態では、活性作用剤は、脂質粒子の外部又は内部脂質表面に結合している。
本発明は、本発明の脂質粒子及び活性作用剤を含む組成物を含み、活性作用剤は脂質粒子に結合している。特定の実施形態では、活性作用剤は治療薬である。特定の実施形態では、活性作用剤は、脂質粒子の水性内部内に封入されている。他の実施形態では、活性作用剤は、脂質粒子の1つ以上の脂質層内に存在する。他の実施形態では、活性作用剤は、脂質粒子の外部又は内部脂質表面に結合している。
本明細書で使用されるとき、「完全封入」とは、粒子中の核酸が、遊離核酸を著しく分解するであろう血清又はヌクレアーゼアッセイと接触した後で、著しくは分解されないことを示す。完全封入系では、好ましくは粒子核酸の25%未満が、通常は遊離核酸を100%分解する処理で分解され、より好ましくは粒子核酸の10%未満が分解され、最も好ましくは粒子核酸の5%未満が分解される。あるいは、完全封入化は、Oligreen(登録商標)アッセイにより決定することができる。Oligreen(登録商標)は、溶液中のオリゴヌクレオチド及び一本鎖DNAを定量化するための超高感度蛍光核酸染色法である(Invitrogen Corporation社、カールズバッド、カリフォルニア州から入手可能)。完全封入化は、粒子が、血清安定性であり、すなわちインビボ投与時にそれらの構成成分へと急速には分解しないことも示唆する。
活性作用剤には、本明細書で使用されるとき、細胞、組織、器官、又は対象体に所望の効果を及ぼすことができる任意の分子又は化合物が含まれる。そのような効果は、例えば、生物学的であってもよく、生理学的であってもよく、又は美容的であってもよい。活性作用剤は、任意のタイプの分子又は化合物であってもよく、それらには、例えば核酸、ペプチド、及びポリペプチドが含まれ、例えば、それらには、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体断片などの抗体;ヒト化抗体、組換え抗体、組換えヒト抗体、及びPrimatized(商標)抗体、サイトカイン、増殖因子、アポトーシス因子、分化誘導因子、細胞表面受容体、及びそれらのリガンド;ホルモン;及び有機低分子又は化合物を含む低分子が含まれる。
1つの実施形態では、活性作用剤は、治療薬、又はその塩若しくは誘導体である。治療薬誘導体は、それら自体が治療的に活性であってもよく、又はさらに修飾された際に活性となるプロドラッグであってもよい。したがって、1つの実施形態では、治療薬誘導体は、未修飾の作用剤と比較して治療活性の幾つか又は全てを保持し、別の実施形態では、治療薬誘導体は治療活性を欠如する。
種々の実施形態では、治療薬には、抗炎症化合物、抗うつ薬、刺激剤、鎮痛薬、抗生物質、避妊薬、解熱薬、血管拡張薬、抗血管新生薬、細胞血管薬(cytovascular agent)、シグナル伝達阻害剤、心血管薬、例えば抗不整脈薬、血管収縮薬、ホルモン、及びステロイドなどの、任意の治療上有効な作用剤又は薬物が含まれる。
ある実施形態では、治療薬は、抗腫瘍薬、抗癌薬、腫瘍薬、又は抗悪性腫瘍薬などとも呼ばれる腫瘍学的薬物である。本発明により使用することができる腫瘍学的薬物の例には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる:アドリアマイシン、アルケラン、アロプリノール、アルトレタミン、アミホスチン、アナストロゾール、araC、三酸化二砒素、アザチオプリン、ベキサロテン、biCNU、ブレオマイシン、静脈用ブスルファン、経口ブスルファン、カペシタビン(Xeloda)、カルボプラチン、カルマスティン、CCNU、セレコキシブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、サイクロスポリンA、シタラビン、サイトシンアラビノサイド、ダウノルビシン、シトキサン、ダウノルビシン、デキサメタゾン、デクスラゾキサン、ドデタキセル、ドキソルビシン、ドキソルビシン、DTIC、エピルビシン、エストラムスチン、エトポシドホスフェート、エトポシド及びVP-16、エキセメスタン、FK506、フルダラビン、フルオロウラシル、5-FU、ゲムシタビン(ジェムザール)、ジェムツツマブ-オゾガミシン、酢酸ゴセレリン、ハイドレア、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、メシル酸イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン(カンプトスター(Camptostar)、CPT-111)、レトロゾール、ロイコボリン、ロイスタチン、ロイプロリド、レバミソール、リトレチノイン、メガストロール(megastrol)、メルファラン、L-PAM、メスナ、メトトレキサート、メトキサレン、ミトラマイシン、ミトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、パクリタキセル、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペントスタチン、ポルフィマーナトリウム、プレドニゾン、リツキサン、ストレプトゾシン、STI-571、タモキシフェン、タキソテール、テモゾロルアミド(temozolamide)、テニポシド、VM-26、トポテカン(ハイカムチン)、トレミフェン、トレチノイン、ATRA、バルルビシン、ベルバン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、VP16、及びビノレルビン。本発明により使用することができる腫瘍学的薬物の他の例は、エリプチシン及びエリプチシン類似体又は誘導体、エポチロン、細胞内キナーゼ阻害剤、並びにカンプトテシン。
ある実施形態では、治療薬は、抗腫瘍薬、抗癌薬、腫瘍薬、又は抗悪性腫瘍薬などとも呼ばれる腫瘍学的薬物である。本発明により使用することができる腫瘍学的薬物の例には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる:アドリアマイシン、アルケラン、アロプリノール、アルトレタミン、アミホスチン、アナストロゾール、araC、三酸化二砒素、アザチオプリン、ベキサロテン、biCNU、ブレオマイシン、静脈用ブスルファン、経口ブスルファン、カペシタビン(Xeloda)、カルボプラチン、カルマスティン、CCNU、セレコキシブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、サイクロスポリンA、シタラビン、サイトシンアラビノサイド、ダウノルビシン、シトキサン、ダウノルビシン、デキサメタゾン、デクスラゾキサン、ドデタキセル、ドキソルビシン、ドキソルビシン、DTIC、エピルビシン、エストラムスチン、エトポシドホスフェート、エトポシド及びVP-16、エキセメスタン、FK506、フルダラビン、フルオロウラシル、5-FU、ゲムシタビン(ジェムザール)、ジェムツツマブ-オゾガミシン、酢酸ゴセレリン、ハイドレア、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、メシル酸イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン(カンプトスター(Camptostar)、CPT-111)、レトロゾール、ロイコボリン、ロイスタチン、ロイプロリド、レバミソール、リトレチノイン、メガストロール(megastrol)、メルファラン、L-PAM、メスナ、メトトレキサート、メトキサレン、ミトラマイシン、ミトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、パクリタキセル、パミドロネート、ペガデマーゼ、ペントスタチン、ポルフィマーナトリウム、プレドニゾン、リツキサン、ストレプトゾシン、STI-571、タモキシフェン、タキソテール、テモゾロルアミド(temozolamide)、テニポシド、VM-26、トポテカン(ハイカムチン)、トレミフェン、トレチノイン、ATRA、バルルビシン、ベルバン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、VP16、及びビノレルビン。本発明により使用することができる腫瘍学的薬物の他の例は、エリプチシン及びエリプチシン類似体又は誘導体、エポチロン、細胞内キナーゼ阻害剤、並びにカンプトテシン。
核酸-脂質粒子
ある実施形態では、本発明の脂質粒子は、核酸と結合しており、核酸-脂質粒子がもたらされる。特定の実施形態では、核酸は、脂質粒子に完全に封入されている。本明細書で使用されるとき、「核酸」という用語は、任意のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むことが意図されている。50個までのヌクレオチドを含有する断片は、一般的にオリゴヌクレオチドと呼ばれ、より長い断片はポリヌクレオチドと呼ばれる。特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、15~50個のヌクレオチドの長さである。
ある実施形態では、本発明の脂質粒子は、核酸と結合しており、核酸-脂質粒子がもたらされる。特定の実施形態では、核酸は、脂質粒子に完全に封入されている。本明細書で使用されるとき、「核酸」という用語は、任意のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含むことが意図されている。50個までのヌクレオチドを含有する断片は、一般的にオリゴヌクレオチドと呼ばれ、より長い断片はポリヌクレオチドと呼ばれる。特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、15~50個のヌクレオチドの長さである。
本発明の状況では、「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然塩基、糖、及び糖間(骨格)結合で構成されるヌクレオチド又はヌクレオシドモノマーのポリマー又はオリゴマーを指す。「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、同様に機能する非天然モノマー又はその部分を含むポリマー又はオリゴマーも指す。そのような修飾又は置換オリゴヌクレオチドは、例えば、細胞取り込みの増強及びヌクレアーゼの存在下での安定性の増加などの特性があるため、天然形態より好ましいことが多い。
本発明による脂質-核酸粒子に存在する核酸は、既知のあらゆる形態の核酸を含む。本明細書で使用される核酸は、一本鎖DNA若しくはRNA、又は二本鎖DNA若しくはRNA、又はDNA‐RNAハイブリッドであってもよい。二本鎖DNAの例には、構造遺伝子、制御領域及び終止領域を含む遺伝子、及びウイルスDNA又はプラスミドDNAなどの自己複製系が含まれる。二本鎖RNAの例には、siRNA及び他のRNA干渉試薬が含まれる。一本鎖核酸には、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、マイクロRNA、三重鎖形成オリゴヌクレオチドが含まれる。本発明の脂質-核酸粒子に存在する核酸は、下記に記載されているオリゴヌクレオチド修飾の1つ以上を含んでいてもよい。
本発明の核酸は、種々の長さであってもよく、一般的に核酸の特定形態に依存する場合がある。例えば、特定の実施形態では、プラスミド又は遺伝子は、約1,000~100,000個のヌクレオチド残基の長さであってもよい。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約10~100個のヌクレオチドの範囲の長さであってもよい。種々の関連実施形態では、一本鎖、二本鎖、三本鎖のオリゴヌクレオチドは、約10~約50個のヌクレオチド、約20~約50個のヌクレオチド、約15~約30個のヌクレオチド、約20~約30個のヌクレオチドの範囲の長さであってもよい。
特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド(又はその鎖)は、標的ポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズするか、又は相補的である。「特異的にハイブリダイズ可能な」及び「相補的な」とは、DNA又はRNA標的とオリゴヌクレオチドとの間に安定的で特異的な結合が生じるような、十分な度合いの相補性を示すために使用される用語である。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能なその標的核酸配列に100%相補的である必要はないことが理解される。標的に対するオリゴヌクレオチドの結合が、標的分子の正常機能を妨害して、有用性又は標的分子からの発現の喪失を引き起こし、特異的結合が望ましい条件化で、つまりインビボアッセイ又は治療的処置の場合は生理学的条件下で、又はインビトロアッセイの場合はアッセイが実施される状態下で、非標的配列に対するオリゴヌクレオチドの非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が存在する場合、オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズ可能である。したがって、他の実施形態では、このオリゴヌクレオチドは、それが標的とするか又はそれが特異的にハイブリダイズする遺伝子又はmRNA配列の領域と比較して、1、2、又は3塩基置換、例えばミスマッチを含む。
RNA干渉核酸
特定の実施形態では、本発明の核酸-脂質粒子は、RNA干渉(RNAi)分子と結合している。RNAi分子を使用するRNA干渉法は、目的の遺伝子又はポリヌクレオチドの発現を妨害するために使用することができる。低分子干渉RNA(siRNA)は、本質的に、開発中の次世代標的化オリゴヌクレオチド薬として、アンチセンスODN及びリボザイムに取って代わった。
特定の実施形態では、本発明の核酸-脂質粒子は、RNA干渉(RNAi)分子と結合している。RNAi分子を使用するRNA干渉法は、目的の遺伝子又はポリヌクレオチドの発現を妨害するために使用することができる。低分子干渉RNA(siRNA)は、本質的に、開発中の次世代標的化オリゴヌクレオチド薬として、アンチセンスODN及びリボザイムに取って代わった。
SiRNAsは、RNAi誘導サイレンシング複合体(RISC)として知られている細胞質多タンパク質複合体と結合することができる通常16~30個のヌクレオチド長のRNA二本鎖である。siRNAが負荷されたRISCは、相同性mRNA転写物の分解を媒介し、したがってsiRNAは、タンパク質発現を高度な特異性でノックダウンするように設計することができる。他のアンチセンスの技術とは異なり、siRNAは、非コードRNAによって遺伝子発現を制御するように進化した天然機序を介して機能する。これは、それらの活性が、インビトロ及びインビボで、アンチセンスODN又はリボザイムのいずれよりも強力である理由であると一般的に考えられている。臨床的に関連する標的を標的とするsiRNAsを含む様々なRNAi試薬が、例えば、de Fougerolles, A. et al., Nature Reviews 6:443-453 (2007)に記載されているように、現在医薬開発中である。
最初に記載されたRNAi分子は、RNAセンス鎖及びRNAアンチセンス鎖の両方を含むRNA:RNAハイブリッドであったが、DNAセンス:RNAアンチセンスのハイブリッド、RNAセンス:DNAアンチセンスのハイブリッド、及びDNA:DNAハイブリッドは、RNAiを媒介可能であることが、今では実証されている(Lamberton, J.S. and Christian, A.T., (2003) Molecular Biotechnology 24:111-119)。したがって、本発明は、これらの異なるタイプの二本鎖分子のいずれかを含むRNAi分子の使用を含む。加えて、RNAi分子は、様々な形態で使用及び細胞に導入することができることが理解される。したがって、本明細書で使用されるとき、RNAi分子は、これらに限定されないが以下のものを含む、細胞でのRNAi応答を誘導可能なありとあらゆる分子を包含する:2つの別々の鎖、つまりセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む二本鎖オリゴヌクレオチド、例えば低分子干渉RNA(siRNA);非ヌクレオチジルリンカーにより共に結合された2つの別々の鎖を含む二本鎖オリゴヌクレオチド;二本鎖領域を形成する相補的配列のヘアピンループを含むオリゴヌクレオチド、例えばshRNAi分子;及び単独で又は別のポリヌクレオチドと組み合わせて二本鎖ポリヌクレオチドを形成可能な1つ以上のポリヌクレオチドを発現する発現ベクター。
本明細書で使用されるとき、「一本鎖siRNA化合物」は、単一分子で構成されるsiRNA化合物である。一本鎖siRNA化合物は、鎖内対合により形成された二本鎖領域を含み、例えば、ヘアピン又はパンハンドル構造であってもよく、又は含んでいてもよい。一本鎖siRNA化合物は、標的分子に関してアンチセンスであってもよい。
一本鎖siRNA化合物は、RISCに進入し、RISC媒介性の標的mRNA切断に関与し得るのに十分な長さであり得る。一本鎖siRNA化合物は、少なくとも14個のヌクレオチドの長さであり、他の実施形態では、少なくとも15、20、25、29、35、又は50個のヌクレオチドの長さである。ある実施形態では、一本鎖siRNA化合物は、200、100、又は60個未満のヌクレオチドの長さである。
ヘアピンsiRNA化合物は、17、18、19、29、21、22、23、24、若しくは25個のヌクレオチド対と等しいか、又は少なくとも17、18、19、29、21、22、23、24、若しくは25個のヌクレオチド対である二本鎖領域を有するだろう。二本鎖領域は、200、100、又は50以下の長さであってもよいだろう。ある実施形態では、二本鎖領域の範囲は、15~30、17~23、19~23、及び19~21個のヌクレオチド対の長さである。ヘアピンは、一本鎖突出又は末端未対合領域を有してもよい。ある実施形態では、突出は、2~3個のヌクレオチドの長さである。幾つかの実施形態では、突出は、ヘアピンのセンス側にあり、幾つかの実施形態では、ヘアピンのアンチセンス側にある。
「二本鎖siRNA化合物」は、本明細書で使用されるとき、鎖間ハイブリダイゼーションが二本鎖構造の領域を形成することができる、複数の、幾つかの場合は2本の鎖を含むsiRNA化合物である。
二本鎖siRNA化合物のアンチセンス鎖は、14、15、16、17、18、19、25、29、40、若しくは60個のヌクレオチドの長さと等しいか、又は少なくとも14、15、16、17、18、19、25、29、40、若しくは60個のヌクレオチドであってもよい。二本鎖siRNA化合物のアンチセンス鎖は、200、100、又は50個以下のヌクレオチドの長さであってもよい。範囲は、17~25、19~23、及び19~21個のヌクレオチドの長さであってもよい。本明細書で使用されるとき、「アンチセンス鎖」という用語は、標的分子、例えば標的RNAに十分相補的なsiRNA化合物の鎖を意味する。
二本鎖siRNA化合物のセンス鎖は、14、15、16、17、18、19、25、29、40、若しくは60個のヌクレオチドの長さと等しいか、又は少なくとも14、15、16、17、18、19、25、29、40、若しくは60個のヌクレオチドであってもよい。二本鎖siRNA化合物のセンス鎖は、200、100、又は50個以下のヌクレオチドの長さであってもよい。範囲は、17~25、19~23、及び19~21個のヌクレオチドの長さであってもよい。
二本鎖siRNA化合物の二本鎖部分は、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、29、40、若しくは60個のヌクレオチドの長さと等しいか、又は少なくとも14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、29、40、若しくは60個のヌクレオチドであってもよい。二本鎖siRNA化合物の二本鎖部分は、200、100、又は50個以下のヌクレオチドの長さであってもよい。範囲は、15~30、17~23、19~23、及び19~21個のヌクレオチドの長さであってもよい。
多くの実施形態では、siRNA化合物は、十分に大きいため、内因性分子、例えばダイサーにより切断されて、より小さなsiRNA化合物、例えばsiRNAs作用剤を産生することができる。
センス鎖及びアンチセンス鎖は、二本鎖siRNA化合物が、分子の1つの末端又は両端で一本鎖又は未対合領域を含むように選択してもよい。したがって、二本鎖siRNA化合物は、対になって突出、例えば、1~3個のヌクレオチドの1つ若しくは2つの5’突出若しくは3’突出、又は3’突出を含有するセンス鎖及びアンチセンス鎖を含む。突出は、1本の鎖が他方より長いための結果であってもよく、又は同じ長さの2本の鎖がずれて配置された結果であってもよい。幾つかの実施形態は、少なくとも1つの3’突出を有するだろう。1つの実施形態では、siRNA分子の両端は3’突出を有するだろう。幾つかの実施形態では、突出は2個のヌクレオチドである。
ある実施形態では、二本鎖領域は、15~30、又は18、19、20、21、22、及び23個のヌクレオチドの長さ、例えば上記で考察されたssiRNA化合物の範囲にある。ssiRNA化合物は、天然ダイサーにより長鎖dsiRNAsからプロセスされた産物と長さ及び構造が類似している場合がある。ssiRNA化合物の2本の鎖が結合している、例えば共有結合で結合している実施形態も含まれる。必要な二本鎖領域及び3’突出を提供するヘアピン又は他の一本鎖構造も、本発明内にある。
二本鎖siRNA化合物及び一本鎖siRNA化合物を含む、本明細書に記載されているsiRNA化合物は、標的RNA、例えばmRNA、例えばタンパク質をコードする遺伝子の転写物のサイレンシングを媒介することができる。便宜上、そのようなmRNAも、本明細書ではサイレンシングされるmRNAと呼ばれる。そのような遺伝子も、標的遺伝子と呼ばれる。一般的に、サイレンシングされるRNAは、内因性遺伝子又は病原体遺伝子である。加えて、mRNA以外のRNA、例えばtRNA及びウイルスRNAも標的とすることができる。
本明細書で使用されるとき、「RNAiを媒介する」という語句は、配列特異的な様式で標的RNAをサイレンシングする能力を指す。理論により束縛されることは望まないが、サイレンシングでは、RNAi機構又はプロセス、及びガイドRNA、例えば21~23個のヌクレオチドのssiRNA化合物が使用されると考えられている。
1つの実施形態では、siRNA化合物は、標的RNA、例えば標的mRNAに対して「十分に相補的」であり、そのためsiRNA化合物は、標的mRNAによりコードされたタンパク質の産生をサイレンシングする。別の実施形態では、siRNA化合物は、標的RNA、例えば標的RNAに対して「正確に相補的」であり、siRNA化合物はアニーリングして、例えば、正確な相補性領域において排他的にワトソンクリック塩基対で作られているハイブリッドを形成する。「十分に相補的」な標的RNAは、標的RNAに対して正確に相補的な内部領域(例えば、少なくとも10個のヌクレオチド)を含むことができる。さらに、ある実施形態では、siRNA化合物は、単一ヌクレオチドの相違を特異的に識別する。この場合、siRNA化合物は、正確な相補性が、その領域(例えば、単一ヌクレオチド相違が7個のヌクレオチド以内)に見出される場合にのみRNAiを媒介する。
マイクロRNA
マイクロRNA(miRNA)は、動物及び植物のゲノムにあるDNAから転写されるが、タンパク質に翻訳されない高度に保存されたクラスの小型RNA分子である。プロセスされたmiRNAsは、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に組み込まれており、発生、細胞増殖、アポトーシス、及び分化の重要な調節因子であると特定された、一本鎖の約17~25個のヌクレオチド(nt)のRNA分子である。それらは、特定のmRNAの3’-非翻訳領域に結合することにより、遺伝子発現の制御に役割を果たすと考えられている。RISCは、翻訳阻害、転写物切断、又はその両方により、遺伝子発現の下方制御を媒介する。RISCは、広範囲の真核生物の核における転写サイレンシングにも関与している。
マイクロRNA(miRNA)は、動物及び植物のゲノムにあるDNAから転写されるが、タンパク質に翻訳されない高度に保存されたクラスの小型RNA分子である。プロセスされたmiRNAsは、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に組み込まれており、発生、細胞増殖、アポトーシス、及び分化の重要な調節因子であると特定された、一本鎖の約17~25個のヌクレオチド(nt)のRNA分子である。それらは、特定のmRNAの3’-非翻訳領域に結合することにより、遺伝子発現の制御に役割を果たすと考えられている。RISCは、翻訳阻害、転写物切断、又はその両方により、遺伝子発現の下方制御を媒介する。RISCは、広範囲の真核生物の核における転写サイレンシングにも関与している。
現在までに多数のmiRNA配列が特定され、その数は増加しており、それらの例示的な例は、例えば、“miRBase: microRNA sequences, targets and gene nomenclature” Griffiths-Jones S, Grocock RJ, van Dongen S, Bateman A, Enright AJ. NAR, 2006, 34, Database Issue, D140-D144;“The microRNA Registry” Griffiths-Jones S. NAR, 2004, 32, Database Issue, D109-D111に見出すことができ、http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/にも見出すことができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチド
1つの実施形態では、核酸は、標的ポリヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」又は単に「アンチセンス」という用語は、標的ポリヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドを含むことを意味する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、選択された配列、例えば標的遺伝子mRNAに相補的なDNA又はRNAの一本鎖である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的mRNAと結合することにより遺伝子発現を阻害すると考えられる。標的mRNAとの結合は、それに結合することにより相補的mRNAの翻訳を防止するか、又は標的mRNAの分解に結びつくかのいずれかにより、遺伝子発現の阻害に結びつく場合がある。アンチセンスDNAは、特定の相補的な(コード又は非コード)RNAを標的とするために使用することができる。結合が生じる場合、このDNA/RNAハイブリッドは、酵素RNaseHで分解することができる。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約10~約50個のヌクレオチド、より好ましくは約15~約30個のヌクレオチドを含む。この用語は、所望の標的遺伝子に正確には相補的でない場合があるアンチセンスオリゴヌクレオチドも包含する。したがって、本発明は、アンチセンスとの非標的特異的活性が見出される場合、又は標的配列との1つ以上のミスマッチを含有するアンチセンス配列が、特定の使用において最も好ましい場合、利用することができる。
1つの実施形態では、核酸は、標的ポリヌクレオチドに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドである。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」又は単に「アンチセンス」という用語は、標的ポリヌクレオチド配列に相補的なオリゴヌクレオチドを含むことを意味する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、選択された配列、例えば標的遺伝子mRNAに相補的なDNA又はRNAの一本鎖である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、相補的mRNAと結合することにより遺伝子発現を阻害すると考えられる。標的mRNAとの結合は、それに結合することにより相補的mRNAの翻訳を防止するか、又は標的mRNAの分解に結びつくかのいずれかにより、遺伝子発現の阻害に結びつく場合がある。アンチセンスDNAは、特定の相補的な(コード又は非コード)RNAを標的とするために使用することができる。結合が生じる場合、このDNA/RNAハイブリッドは、酵素RNaseHで分解することができる。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約10~約50個のヌクレオチド、より好ましくは約15~約30個のヌクレオチドを含む。この用語は、所望の標的遺伝子に正確には相補的でない場合があるアンチセンスオリゴヌクレオチドも包含する。したがって、本発明は、アンチセンスとの非標的特異的活性が見出される場合、又は標的配列との1つ以上のミスマッチを含有するアンチセンス配列が、特定の使用において最も好ましい場合、利用することができる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、タンパク質合成の有効な標的阻害剤であることが実証されており、結果的に、標的遺伝子によるタンパク質合成を特異的に阻害するために使用することができる。タンパク質合成を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの効力は、十分に確立されている。例えば、ポリガラクタウロナーゼ(polygalactauronase)の合成、及び2型ムスカリンアセチルコリン受容体は、それらのそれぞれのmRNA配列に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドにより阻害される(米国特許第5,739,119号及び米国特許第5,759,829号)。さらに、アンチセンス阻害の例は、核タンパク質サイクリン、多剤耐性遺伝子(MDG1)、ICAM-1、E-セレクチン、STK-1、線条体GABAA受容体、及びヒトEGFで実証されている(Jaskulski et al. , Science. 1988 Jun 10;240(4858):1544-6;Vasanthakumar and Ahmed, Cancer Commun. 1989;1(4):225-32;Peris et al., Brain Res Mol Brain Res. 1998 Jun 15;57(2):310-20;米国特許第5,801,154号;米国特許第5,789,573号;米国特許第5,718,709号、及び米国特許第5,610,288号)。さらに、アンチセンス構築体は、様々な異常細胞増殖(例えば、癌)を阻害及び治療するために使用できることも記載されている(米国特許第5,747,470号、米国特許第5,591,317号、及び米国特許第5,783,683号)。
アンチセンスオリゴヌクレオチドを生成する方法は、当該技術分野で公知であり、任意のポリヌクレオチド配列を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを生成するために容易に適用することができる。所与の標的配列に特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの選択は、選択された標的配列、及び二次構造の決定、Tm、結合エネルギー、及び相対的安定性の分析に基づく。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、宿主細胞中で標的mRNAに対する特異的結合を低減又は阻害することになる二量体、ヘアピン、又は他の二次構造を形成しないそれらの相対的能力に基づいて選択することができる。mRNAの高度に好ましい標的部位は、AUG翻訳開始コドンの領域又はその付近の領域、及びmRNAの5’領域に対して実質的に相補的な配列を含む。これらの二次構造の分析及び標的部位選択に関する考慮は、例えば、OLIGOプライマー分析ソフトウェア(Molecular Biology Insights社製)のv.4、及び/又はBLASTN 2.0.5アルゴリズムソフトウェア(Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997, 25(17):3389-402)を使用して実施することができる。
アンタゴmir
アンタゴmirは、RNAse保護、並びに組織及び細胞取り込みの増強などの薬理学的特性に関する種々の修飾を内包するRNA様オリゴヌクレオチドである。アンタゴmirは、例えば、糖の完全な2’-O-メチル化、ホスホロチオアート骨格、及び例えば3’末端のコレステロール部分により、通常のRNAと区別される。アンタゴmirは、アンタゴmir及び内因性miRNAを含む二本鎖を形成することにより内因性miRNAsを効率的にサイレンシングするために使用するができ、それによりmiRNA誘導性遺伝子サイレンシングを防止する。アンタゴmir媒介性miRNAサイレンシングの一例は、参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれるKrutzfeldt et al, Nature, 2005, 438: 685-689に記載されているmiR-122のサイレンシングである。アンタゴmir RNAは、標準的固相オリゴヌクレオチド合成プロトコールを使用して合成することができる。米国特許出願第11/502,158号、及び米国特許出願第11/657,341号を参照されたい(これらの各々の開示は、参照により本明細書に組み込まれる)。
アンタゴmirは、RNAse保護、並びに組織及び細胞取り込みの増強などの薬理学的特性に関する種々の修飾を内包するRNA様オリゴヌクレオチドである。アンタゴmirは、例えば、糖の完全な2’-O-メチル化、ホスホロチオアート骨格、及び例えば3’末端のコレステロール部分により、通常のRNAと区別される。アンタゴmirは、アンタゴmir及び内因性miRNAを含む二本鎖を形成することにより内因性miRNAsを効率的にサイレンシングするために使用するができ、それによりmiRNA誘導性遺伝子サイレンシングを防止する。アンタゴmir媒介性miRNAサイレンシングの一例は、参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれるKrutzfeldt et al, Nature, 2005, 438: 685-689に記載されているmiR-122のサイレンシングである。アンタゴmir RNAは、標準的固相オリゴヌクレオチド合成プロトコールを使用して合成することができる。米国特許出願第11/502,158号、及び米国特許出願第11/657,341号を参照されたい(これらの各々の開示は、参照により本明細書に組み込まれる)。
アンタゴmirは、オリゴヌクレオチド合成用のリガンド結合モノマーサブユニット及びモノマーを含んでいてもよい。例示的なモノマーは、2004年8月10日に出願された米国特許出願10/916,185号に記載されている。アンタゴmirは、2004年3月8日に出願されたPCT出願第PCT/US2004/07070号に記載されているものなどの、ZXY構造を有していてもよい。アンタゴmirは、両親媒性部分と複雑体化されていてもよい。オリゴヌクレオチド作用剤と共に使用するための例示的な両親媒性部分は、2004年3月8日に出願されたPCT出願第PCT/US2004/07070号に記載されている。
アプタマー
アプタマーは、高親和性及び高特異性で目的の特定分子と結合する核酸又はペプチド分子である(Tuerk and Gold, Science 249:505 (1990);Ellington and Szostak, Nature 346:818 (1990))。大型タンパク質から小さな有機分子までの多数の異なる物質に結合するDNA又はRNAアプタマーの生成が成功している。Eaton, Curr. Opin. Chem. Biol. 1:10-16 (1997)、Famulok, Curr. Opin. Struct. Biol. 9:324-9(1999)、及びHermann and Patel, Science 287:820-5 (2000)を参照されたい。アプタマーは、RNA又はDNAに基づていてもよく、リボスイッチを含んでいてもよい。リボスイッチは、小型標的分子に直接結合することができ、標的との結合が遺伝子活性に影響を及ぼすmRNA分子の一部である。したがって、リボスイッチを含有するmRNAは、その標的分子が存在するか又は存在しないかに応じて、それ自体の活性の制御に直接的に関与する。一般的に、アプタマーは、低分子、タンパク質、核酸などの種々の分子標的に、並びに細胞、組織、及び生物にさえ結合するように、インビトロ選択法の数巡の繰り返し、又は同様にSELEX(指数関数的な濃縮による系統的なリガンド進化)により操作される。アプタマーは、合成、組換え、及び精製法を含む任意の公知な方法により調製することができ、単独で又は同じ標的に特異的な他のアプタマーと組み合わせて使用することができる。さらに、本明細書により詳しく記載されているように、「アプタマー」という用語は、具体的には、所与の標識に対する複数の公知なアプタマーを比較することに由来するコンセンサス配列を含有する「第2のアプタマー」を含む。
アプタマーは、高親和性及び高特異性で目的の特定分子と結合する核酸又はペプチド分子である(Tuerk and Gold, Science 249:505 (1990);Ellington and Szostak, Nature 346:818 (1990))。大型タンパク質から小さな有機分子までの多数の異なる物質に結合するDNA又はRNAアプタマーの生成が成功している。Eaton, Curr. Opin. Chem. Biol. 1:10-16 (1997)、Famulok, Curr. Opin. Struct. Biol. 9:324-9(1999)、及びHermann and Patel, Science 287:820-5 (2000)を参照されたい。アプタマーは、RNA又はDNAに基づていてもよく、リボスイッチを含んでいてもよい。リボスイッチは、小型標的分子に直接結合することができ、標的との結合が遺伝子活性に影響を及ぼすmRNA分子の一部である。したがって、リボスイッチを含有するmRNAは、その標的分子が存在するか又は存在しないかに応じて、それ自体の活性の制御に直接的に関与する。一般的に、アプタマーは、低分子、タンパク質、核酸などの種々の分子標的に、並びに細胞、組織、及び生物にさえ結合するように、インビトロ選択法の数巡の繰り返し、又は同様にSELEX(指数関数的な濃縮による系統的なリガンド進化)により操作される。アプタマーは、合成、組換え、及び精製法を含む任意の公知な方法により調製することができ、単独で又は同じ標的に特異的な他のアプタマーと組み合わせて使用することができる。さらに、本明細書により詳しく記載されているように、「アプタマー」という用語は、具体的には、所与の標識に対する複数の公知なアプタマーを比較することに由来するコンセンサス配列を含有する「第2のアプタマー」を含む。
リボザイム
本発明の別の実施形態によると、核酸-脂質粒子は、リボザイムに結合している。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特異的触媒ドメインを有するRNA分子複合体である(Kim and Cech, Proc Natl Acad Sci U S A. 1987 Dec;84(24):8788-92;Forster and Symons, Cell. 1987 Apr 24;49(2):211-20)。例えば、多くのリボザイムは、高度な特異性でリン酸エステル転移反応を加速し、オリゴヌクレオチド基質にある幾つかのリン酸エステルのうちの1つのみを切断することが多い(Cech et al., Cell. 1981 Dec;27(3 Pt 2):487-96;Michel and Westhof, J Mol Biol. 1990 Dec 5;216(3):585-610;Reinhold-Hurek and Shub, Nature. 1992 May 14;357(6374):173-6)。この特異性は、化学反応の前に、基質が、特異的な塩基対合相互作用によりリボザイムの内部ガイド配列(「IGS」)に結合する必要があることに起因している。
本発明の別の実施形態によると、核酸-脂質粒子は、リボザイムに結合している。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特異的触媒ドメインを有するRNA分子複合体である(Kim and Cech, Proc Natl Acad Sci U S A. 1987 Dec;84(24):8788-92;Forster and Symons, Cell. 1987 Apr 24;49(2):211-20)。例えば、多くのリボザイムは、高度な特異性でリン酸エステル転移反応を加速し、オリゴヌクレオチド基質にある幾つかのリン酸エステルのうちの1つのみを切断することが多い(Cech et al., Cell. 1981 Dec;27(3 Pt 2):487-96;Michel and Westhof, J Mol Biol. 1990 Dec 5;216(3):585-610;Reinhold-Hurek and Shub, Nature. 1992 May 14;357(6374):173-6)。この特異性は、化学反応の前に、基質が、特異的な塩基対合相互作用によりリボザイムの内部ガイド配列(「IGS」)に結合する必要があることに起因している。
天然酵素性RNAの少なくとも6塩基多様性が、現在のところ知られている。各々は、生理学的条件下で、trans位にあるRNAリン酸ジエステル結合の加水分解を触媒することができる(したがって、他のRNA分子を切断することができる)。一般的に、酵素性核酸は、まず標的RNAと結合することにより作用する。そのような結合は、標的RNAを切断するように作用する分子の酵素性部分に近接近して保持される酵素性核酸の標的結合部分を介して生じる。したがって、酵素性核酸は、相補的塩基対合によりまず標的RNAを認識しその後標的RNAと結合し、正しい部位に結合すると酵素的に作用して標的RNAを切断する。このような標的RNAの戦略的切断により、コードされたタンパク質の合成を指図する標的RNAの能力が破壊されることになる。酵素性核酸は、そのRNA標的と結合しRNA標的を切断した後、そのRNAから放出されて別の標的を探索し、新しい標的への結合及び切断を繰り返すことができる。
酵素性核酸分子は、例えば、ハンマーヘッド、ヘアピン、肝炎δウイルス、グループIイントロン、又はRNaseP RNA(RNAガイド配列と結合する)、又はニューロスポラ VS RNAモチーフに形成されていてもよい。ハンマーヘッドモチーフの特定の例は、Rossi et al. Nucleic Acids Res. 1992 Sep 11; 20 (17):4559-65により記載されている。ヘアピンモチーフの例は、Hampelら(欧州特許出願公開第0360257号)、Hampel and Tritz, Biochemistry 1989 Jun 13;28(12):4929-33;Hampel et al., Nucleic Acids Res. 1990 Jan 25;18(2):299-304;及び米国特許第5,631,359号)により記載されている。肝炎δウイルスモチーフの例は、Perrotta and Been, Biochemistry. 1992 Dec 1;31(47):11843-52に記載されており;RNasePモチーフの例は、Guerrier-Takada et al., Cell. 1983 Dec;35(3 Pt 2):849-57に記載されており;ニューロスポラ VS RNAリボザイムモチーフは、Collins(Saville and Collins, Cell. 1990 May 18;61(4):685-96;Saville and Collins, Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Oct 1;88(19):8826-30;Collins and Olive, Biochemistry. 1993 Mar 23;32(11):2795-9)に記載されており;及びグループIイントロンの例は、米国特許第4,987,071号に記載されている。本発明により使用される酵素性核酸分子の重要な特徴は、酵素性核酸分子が、標的遺伝子DNA又はRNA領域の1つ以上に相補的な特異的基質結合部位を有し、分子にRNA切断活性を与えるヌクレオチド配列をその基質結合部位内又はその周囲に有するということである。したがって、リボザイム構築体は、本明細書で言及されている特定のモチーフに限定する必要はない。
任意のポリヌクレオチド配列に標的化されたリボザイムを生成する方法は、当該技術分野で公知である。リボザイムは、各々が参照により本明細書に具体的に組み込まれる国際公開第93/23569号及び国際公開第94/02595号に記載されているように設計することができ、インビトロ及びインビボで試験するためにそこに記載されているように合成することができる。
リボザイム活性は、リボザイム結合アームの長さを変更することにより又は血清リボヌクレアーゼによるそれらの分解を防止する修飾を有するリボザイムを化学的に合成することにより(国際公開第92/07065号;国際公開第93/15187号;国際公開第91/03162号;欧州特許出願公開第92110298.4号;米国特許第5,334,711号;及び国際公開第94/13688号、これらには、酵素性RNA分子の糖部分に行うことができる種々の化学的修飾が記載されている)、細胞でのそれらの効力を増強する修飾により、及びステムII塩基を取り除いてRNA合成時間を短縮し化学的必要性を低減することにより、最適化することができる。
免疫賦活化オリゴヌクレオチド
本発明の脂質粒子に結合された核酸は、免疫賦活性であってもよく、それらには、対象体に投与された際に免疫応答を誘導可能な免疫賦活化オリゴヌクレオチド(ISS;一本鎖又は二本鎖)が含まれ、対象体は哺乳動物であってもよく又は他の患者であってもよい。ISSには、例えば、ヘアピン二次構造に結びつくパリンドローム(Yamamoto S., et al. (1992) J. Immunol. 148: 4072-4076を参照)、又はCpGモチーフ、並びに他の公知のISS特徴(多重Gドメインなど、国際公開第96/11266号を参照)が含まれる。
本発明の脂質粒子に結合された核酸は、免疫賦活性であってもよく、それらには、対象体に投与された際に免疫応答を誘導可能な免疫賦活化オリゴヌクレオチド(ISS;一本鎖又は二本鎖)が含まれ、対象体は哺乳動物であってもよく又は他の患者であってもよい。ISSには、例えば、ヘアピン二次構造に結びつくパリンドローム(Yamamoto S., et al. (1992) J. Immunol. 148: 4072-4076を参照)、又はCpGモチーフ、並びに他の公知のISS特徴(多重Gドメインなど、国際公開第96/11266号を参照)が含まれる。
免疫応答は、先天性免疫応答であってもよく又は適応免疫応答であってもよい。免疫系は、より先天性の免疫系及び脊椎動物の後天性の適応免疫系に分類され、それらの後者は、さらに体液性細胞性要素に分類される。特定の実施形態では、免疫応答は粘膜性であってもよい。
特定の実施形態では、免疫賦活化核酸は、脂質粒子と組み合わせて投与された場合にのみ免疫賦活性であり、その遊離形態で投与された場合は免疫賦活性ではない。本発明によると、そのようなオリゴヌクレオチドは、免疫賦活性であるとみなされる。
免疫賦活化核酸は、免疫応答を誘発するために標的ポリヌクレオチドと特異的に結合して標的ポリヌクレオチドの発現を低減することが必要とされない場合、非配列特異的であるとみなされる。したがって、ある免疫賦活化核酸は、天然遺伝子又はmRNAの領域に対応する配列を含む場合があるが、それらは、依然として非配列特異的免疫賦活化核酸であるとみなされる。
1つの実施形態では、免疫賦活化核酸又はオリゴヌクレオチドは、少なくとも1つのCpGジヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチド又はCpGジヌクレオチドは、メチル化されていなくてもよく、又はメチル化されていてもよい。別の実施形態では、免疫賦活化核酸は、メチル化シトシンを有する少なくとも1つのCpGジヌクレオチドを含む。1つの実施形態では、核酸は、単一のCpGジヌクレオチドを含み、前記CpGジヌクレオチドのシトシンはメチル化されている。特定の実施形態では、核酸は、配列5’TAACGTTGAGGGGCAT3’を含む。代替的な実施形態では、核酸は、少なくとも2つのCpGジヌクレオチドを含み、前記CpGジヌクレオチドの少なくとも1つのシトシンは、メチル化されている。さらなる実施形態では、配列中にあるCpGジヌクレオチドの各シトシンはメチル化されている。別の実施形態では、核酸は、複数のCpGジヌクレオチドを含み、前記CpGジヌクレオチドの少なくとも1つは、メチル化されたシトシンを含む。
1つの特定の実施形態では、核酸は、配列5’TTCCATGACGTTCCTGACGT3’を含む。別の特定の実施形態では、核酸配列は、配列5’TCCATGACGTTCCTGACGT3’を含み、下線で示されている2つのシトシンはメチル化されている。特定の実施形態では、ODNは、下記に示されているODN#1、ODN#2、ODN#3、ODN#4、ODN#5、ODN#6、ODN#7、ODN#8、及びODN#9からなる群から選択される。
本発明の組成物及び方法で使用するのに好適なオリゴヌクレオチド(ODN)のさらなる特定の核酸配列は、Raney et al., Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 298:1185-1192 (2001)に記載されている。ある実施形態では、本発明の組成物及び方法で使用されるODNは、リン酸ジエステル(「PO」)骨格又はホスホロチオアート(「PS」)骨格、及び/又はCpGモチーフ中にある少なくとも1つのメチル化シトシン残基を有する。
デコイオリゴヌクレオチド
転写因子は、周囲のゲノムDNAが存在しない場合でさえ、比較的短い結合配列を認識するため、特定の転写因子のコンセンサス結合配列を保持する短鎖オリゴヌクレオチドを、生細胞の遺伝子発現を操作するためのツールとして使用することができる。この戦略には、そのような「デコイオリゴヌクレオチド」を細胞内に送達することが伴い、その後デコイオリゴヌクレオチドは、標的因子により認識及び結合される。デコイが転写因子のDNA結合部位を占有することにより、その後転写因子は標的遺伝子のプロモーター領域に結合できなくなる。デコイは、転写因子により活性化される遺伝子の発現を阻害するため、又は転写因子の結合により抑制される遺伝子を上方制御するためのいずれの治療薬としても使用することができる。デコイオリゴヌクレオチドの使用例は、Mann et al., J. Clin. Invest., 2000, 106: 1071-1075に見出すことができ、これは、参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれる。
転写因子は、周囲のゲノムDNAが存在しない場合でさえ、比較的短い結合配列を認識するため、特定の転写因子のコンセンサス結合配列を保持する短鎖オリゴヌクレオチドを、生細胞の遺伝子発現を操作するためのツールとして使用することができる。この戦略には、そのような「デコイオリゴヌクレオチド」を細胞内に送達することが伴い、その後デコイオリゴヌクレオチドは、標的因子により認識及び結合される。デコイが転写因子のDNA結合部位を占有することにより、その後転写因子は標的遺伝子のプロモーター領域に結合できなくなる。デコイは、転写因子により活性化される遺伝子の発現を阻害するため、又は転写因子の結合により抑制される遺伝子を上方制御するためのいずれの治療薬としても使用することができる。デコイオリゴヌクレオチドの使用例は、Mann et al., J. Clin. Invest., 2000, 106: 1071-1075に見出すことができ、これは、参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれる。
スーパーmir
スーパーmirは、リボ核酸(RNA)又はデオキシリボ核酸(DNA)又はその両方又はその修飾体の一本鎖、二本鎖、又は部分的に二本鎖のオリゴマー又はポリマーを指し、それは、miRNAと実質的に同一でり、その標的に関してアンチセンスであるヌクレオチド配列を有する。この用語は、天然核酸塩基、糖、及び共有結合のヌクレオシド(骨格)間結合で構成され、同様に機能する少なくとも1つの非天然部分を含有するオリゴヌクレオチドを含む。そのような修飾又は置換オリゴヌクレオチドは、例えば、細胞取り込みの増強、核酸標的に対する親和性の増強、及びヌクレアーゼの存在下における安定性の増加などの望ましい特性があるため、天然形態より好ましい。好ましい実施形態では、スーパーmirは、センスDNAを含んでおらず、別の好ましい実施形態では、スーパーmirは、それほど自己ハイブリダイズしない。本発明で特徴づけられているスーパーmirは、二次構造を有していてもよいが、生理学的条件下では実質的に一本鎖である。実質的に一本鎖であるスーパーmirは、スーパーmirの約50%未満(例えば、約40%、30%、20%、10%、又は5%未満)が、それ自体と二本鎖を形成する程度に一本鎖である。スーパーmirは、ヘアピンセグメントを含んでいてもよく、例えば、配列は、好ましくは3’末端で自己ハイブリダイズして二本鎖領域を形成することができ、例えば、二本鎖領域は、少なくとも1、2、3、又は4個のヌクレオチド、好ましくは8、7、6、又はn個未満のヌクレオチド、例えば5個のヌクレオチドである。二本鎖領域は、リンカー、例えばヌクレオチドリンカー、例えば3、4、5、又は6個のdT、例えば修飾dTにより結合されていてもよい。別の実施形態では、スーパーmirは、より短いオリゴ、例えば5、6、7、8、9、又は10個のヌクレオチドの長さと、例えば、3’及び5’末端の一方又は両方で、スーパーmirの非末端又は中間部で、二本鎖を形成する。
スーパーmirは、リボ核酸(RNA)又はデオキシリボ核酸(DNA)又はその両方又はその修飾体の一本鎖、二本鎖、又は部分的に二本鎖のオリゴマー又はポリマーを指し、それは、miRNAと実質的に同一でり、その標的に関してアンチセンスであるヌクレオチド配列を有する。この用語は、天然核酸塩基、糖、及び共有結合のヌクレオシド(骨格)間結合で構成され、同様に機能する少なくとも1つの非天然部分を含有するオリゴヌクレオチドを含む。そのような修飾又は置換オリゴヌクレオチドは、例えば、細胞取り込みの増強、核酸標的に対する親和性の増強、及びヌクレアーゼの存在下における安定性の増加などの望ましい特性があるため、天然形態より好ましい。好ましい実施形態では、スーパーmirは、センスDNAを含んでおらず、別の好ましい実施形態では、スーパーmirは、それほど自己ハイブリダイズしない。本発明で特徴づけられているスーパーmirは、二次構造を有していてもよいが、生理学的条件下では実質的に一本鎖である。実質的に一本鎖であるスーパーmirは、スーパーmirの約50%未満(例えば、約40%、30%、20%、10%、又は5%未満)が、それ自体と二本鎖を形成する程度に一本鎖である。スーパーmirは、ヘアピンセグメントを含んでいてもよく、例えば、配列は、好ましくは3’末端で自己ハイブリダイズして二本鎖領域を形成することができ、例えば、二本鎖領域は、少なくとも1、2、3、又は4個のヌクレオチド、好ましくは8、7、6、又はn個未満のヌクレオチド、例えば5個のヌクレオチドである。二本鎖領域は、リンカー、例えばヌクレオチドリンカー、例えば3、4、5、又は6個のdT、例えば修飾dTにより結合されていてもよい。別の実施形態では、スーパーmirは、より短いオリゴ、例えば5、6、7、8、9、又は10個のヌクレオチドの長さと、例えば、3’及び5’末端の一方又は両方で、スーパーmirの非末端又は中間部で、二本鎖を形成する。
miRNA模倣体
miRNA模倣体は、1つ以上のmiRNAsの遺伝子サイレンシング能力を模倣するために使用することができるクラスの分子を表す。したがって、「マイクロRNA模倣体」という用語は、RNAi経路に入ることが可能であり遺伝子発現を制御することが可能な合成非コードRNAを指す(つまり、miRNAは、内因性miRNAの供給源からの精製により得ることはできない)。miRNA模倣体は、成熟分子(例えば、一本鎖)又は模倣体前駆体(例えば、pri-又はPre-miRNA)として設計することができる。miRNA模倣体は、限定ではないが、RNA、修飾RNA、DNA、修飾DNA、ロックド核酸、又は2’-O、4’-Cエチレン架橋核酸(ENA)、又は上記の任意の組合せ(DNA‐RNAハイブリッドを含む)を含むオリゴヌクレオチドを含む核酸(修飾又は修飾核酸)で構成されていてもよい。加えて、miRNA模倣体は、送達、細胞内区画化、安定性、特異性、機能性、鎖の使用、及び/又は効力に影響を及ぼし得る結合体を含むことができる。1つの設計では、miRNA模倣体は、二本鎖分子(例えば、約16~約31個のヌクレオチドの長さの二本鎖領域を有する)であり、所与のmiRNAの成熟鎖と同一性を有する1つ以上の配列を含有する。修飾には、分子の一方又は両方の鎖における2’修飾(2’-Oメチル修飾及び2’F修飾を含む)、並びに核酸安定性及び/又は特異性を増強するヌクレオチド間修飾(例えば、ホルホルチオアート(phorphorthioate)修飾)が含まれていてもよい。加えて、miRNA模倣体は、突出を含んでいてもよい。突出は、いずれかの鎖の3’又は5’末端の1~6個のヌクレオチドで構成されていてもよく、安定性又は機能性を増強するために修飾されていてもよい。1つの実施形態では、miRNA模倣体は、16~31個のヌクレオチドの二本鎖領域、及び以下の化学修飾パターンの1つ以上を含む:センスDNAは、1位及び2位(センスオリゴヌクレオチドの5’末端から数えて)ヌクレオチド並びに全てのC及びUの2’-O-メチル修飾を含有し;アンチセンス鎖修飾には、全てのC及びUの2’F修飾、オリゴヌクレオチドの5’末端のリン酸化、及び2位ヌクレオチド3’突出に結合された安定化ヌクレオチド間結合が含まれていてもよい。
miRNA模倣体は、1つ以上のmiRNAsの遺伝子サイレンシング能力を模倣するために使用することができるクラスの分子を表す。したがって、「マイクロRNA模倣体」という用語は、RNAi経路に入ることが可能であり遺伝子発現を制御することが可能な合成非コードRNAを指す(つまり、miRNAは、内因性miRNAの供給源からの精製により得ることはできない)。miRNA模倣体は、成熟分子(例えば、一本鎖)又は模倣体前駆体(例えば、pri-又はPre-miRNA)として設計することができる。miRNA模倣体は、限定ではないが、RNA、修飾RNA、DNA、修飾DNA、ロックド核酸、又は2’-O、4’-Cエチレン架橋核酸(ENA)、又は上記の任意の組合せ(DNA‐RNAハイブリッドを含む)を含むオリゴヌクレオチドを含む核酸(修飾又は修飾核酸)で構成されていてもよい。加えて、miRNA模倣体は、送達、細胞内区画化、安定性、特異性、機能性、鎖の使用、及び/又は効力に影響を及ぼし得る結合体を含むことができる。1つの設計では、miRNA模倣体は、二本鎖分子(例えば、約16~約31個のヌクレオチドの長さの二本鎖領域を有する)であり、所与のmiRNAの成熟鎖と同一性を有する1つ以上の配列を含有する。修飾には、分子の一方又は両方の鎖における2’修飾(2’-Oメチル修飾及び2’F修飾を含む)、並びに核酸安定性及び/又は特異性を増強するヌクレオチド間修飾(例えば、ホルホルチオアート(phorphorthioate)修飾)が含まれていてもよい。加えて、miRNA模倣体は、突出を含んでいてもよい。突出は、いずれかの鎖の3’又は5’末端の1~6個のヌクレオチドで構成されていてもよく、安定性又は機能性を増強するために修飾されていてもよい。1つの実施形態では、miRNA模倣体は、16~31個のヌクレオチドの二本鎖領域、及び以下の化学修飾パターンの1つ以上を含む:センスDNAは、1位及び2位(センスオリゴヌクレオチドの5’末端から数えて)ヌクレオチド並びに全てのC及びUの2’-O-メチル修飾を含有し;アンチセンス鎖修飾には、全てのC及びUの2’F修飾、オリゴヌクレオチドの5’末端のリン酸化、及び2位ヌクレオチド3’突出に結合された安定化ヌクレオチド間結合が含まれていてもよい。
抗mir又はmiRNA阻害剤
「抗mir」、「マイクロRNA阻害剤」、「miR阻害剤」、又は「阻害剤」という用語は、同意語であり、特定のmiRNAsの能力を妨害するオリゴヌクレオチド又は修飾オリゴヌクレオチドを指す。一般的に、阻害剤は、本質的に、RNA、修飾RNA、DNA、修飾DNA、ロックド核酸(LNA)、又は上記の任意の組合せを含むオリゴヌクレオチドを含む核酸又は修飾核酸である。修飾には、2’修飾(2’-0アルキル修飾及び2’F修飾を含む)、及び送達、安定性、特異性、細胞内区画化、又は効力に影響を及ぼし得るヌクレオチド間修飾(例えば、ホスホロチオアート修飾)が含まれる。加えて、miRNA阻害剤は、送達、細胞内区画化、安定性、及び/又は効力に影響を及ぼし得る結合体を含むことができる。阻害剤は、一本鎖、二本鎖(RNA/RNA又はRNA/DNA二本鎖)、及びヘアピン構造を含む様々な配置をとることができ、一般的には、マイクロRNA阻害剤は、標的とされるmiRNAの成熟鎖(又は複数の鎖)と相補的な又は部分的に相補的な1つ以上の配列又は配列の部分を含み、加えて、miRNA阻害剤は、成熟miRNAの逆相補体である配列の5’及び3’に位置しているさらなる配列も含んでいてよい。さらなる配列は、成熟miRNAがそれに由来するpri-miRNA中の成熟miRNAに隣接している配列の逆相補体であってもよく、又はさらなる配列は、任意の配列(A、G、C、又はUの混合物を有する)であってもよい。幾つかの実施形態では、さらなる配列の1つ又は両方は、ヘアピンを形成可能な任意の配列である。したがって、幾つかの実施形態では、miRNAの逆相補体である配列は、5’側及び3’側でヘアピン構造により隣接される。マイクロRNA阻害剤は、二本鎖の場合、反対側の鎖にヌクレオチド間のミスマッチを含んでいてもよい。さらに、マイクロRNA阻害剤は、細胞内への阻害剤取り込みを促進するために、結合部分に結合されていてもよい。例えば、マイクロRNA阻害剤は、細胞内へのマイクロRNA阻害剤の受動取り込みを可能にするコレステリル5-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)-3ヒドロキシペンチルカルバメートに結合されていてもよい。ヘアピンmiRNA阻害剤を含むマイクロRNA阻害剤は、Vermeulen et al., “Double-Stranded Regions Are Essential Design Components Of Potent Inhibitors of RISC Function,” RNA 13: 723-730 (2007)、及び国際公開第2007/095387号、及び国際公開第2008/036825号に詳細に記載されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。当業者であれば、所望のmiRNAの配列をデータベースから選択し、本明細書で開示されている方法に有用な阻害剤を設計することができる。
「抗mir」、「マイクロRNA阻害剤」、「miR阻害剤」、又は「阻害剤」という用語は、同意語であり、特定のmiRNAsの能力を妨害するオリゴヌクレオチド又は修飾オリゴヌクレオチドを指す。一般的に、阻害剤は、本質的に、RNA、修飾RNA、DNA、修飾DNA、ロックド核酸(LNA)、又は上記の任意の組合せを含むオリゴヌクレオチドを含む核酸又は修飾核酸である。修飾には、2’修飾(2’-0アルキル修飾及び2’F修飾を含む)、及び送達、安定性、特異性、細胞内区画化、又は効力に影響を及ぼし得るヌクレオチド間修飾(例えば、ホスホロチオアート修飾)が含まれる。加えて、miRNA阻害剤は、送達、細胞内区画化、安定性、及び/又は効力に影響を及ぼし得る結合体を含むことができる。阻害剤は、一本鎖、二本鎖(RNA/RNA又はRNA/DNA二本鎖)、及びヘアピン構造を含む様々な配置をとることができ、一般的には、マイクロRNA阻害剤は、標的とされるmiRNAの成熟鎖(又は複数の鎖)と相補的な又は部分的に相補的な1つ以上の配列又は配列の部分を含み、加えて、miRNA阻害剤は、成熟miRNAの逆相補体である配列の5’及び3’に位置しているさらなる配列も含んでいてよい。さらなる配列は、成熟miRNAがそれに由来するpri-miRNA中の成熟miRNAに隣接している配列の逆相補体であってもよく、又はさらなる配列は、任意の配列(A、G、C、又はUの混合物を有する)であってもよい。幾つかの実施形態では、さらなる配列の1つ又は両方は、ヘアピンを形成可能な任意の配列である。したがって、幾つかの実施形態では、miRNAの逆相補体である配列は、5’側及び3’側でヘアピン構造により隣接される。マイクロRNA阻害剤は、二本鎖の場合、反対側の鎖にヌクレオチド間のミスマッチを含んでいてもよい。さらに、マイクロRNA阻害剤は、細胞内への阻害剤取り込みを促進するために、結合部分に結合されていてもよい。例えば、マイクロRNA阻害剤は、細胞内へのマイクロRNA阻害剤の受動取り込みを可能にするコレステリル5-(ビス(4-メトキシフェニル)(フェニル)メトキシ)-3ヒドロキシペンチルカルバメートに結合されていてもよい。ヘアピンmiRNA阻害剤を含むマイクロRNA阻害剤は、Vermeulen et al., “Double-Stranded Regions Are Essential Design Components Of Potent Inhibitors of RISC Function,” RNA 13: 723-730 (2007)、及び国際公開第2007/095387号、及び国際公開第2008/036825号に詳細に記載されており、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。当業者であれば、所望のmiRNAの配列をデータベースから選択し、本明細書で開示されている方法に有用な阻害剤を設計することができる。
U1アダプター
U1アダプターは、polyA部位を阻害し、標的遺伝子の末端エキソンの部位に相補的な標的ドメイン、及びU1 snRNPのU1核内低分子RNA成分に結合する「U1ドメイン」を有する二機能性オリゴヌクレオチドである(Goraczniak, et al., 2008, Nature Biotechnology, 27(3), 257-263、これは参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれる)。U1 snRNPは、pre-mRNAエキソン-イントロン境界に結合することにより、主としてスプライセオソーム形成の初期ステップを指図するように機能するリボ核タンパク質複合体である(Brown and Simpson, 1998, Annu Rev Plant Physiol Plant MoI Biol 49:77-95)。U1 snRNA塩基対の5’末端のヌクレオチド2~11は、pre mRNAの5’ssと結合する。1つの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、U1アダプターである。1つの実施形態では、U1アダプターは、少なくとも1つの他のiRNA作用剤と組み合わせて投与することができる。
U1アダプターは、polyA部位を阻害し、標的遺伝子の末端エキソンの部位に相補的な標的ドメイン、及びU1 snRNPのU1核内低分子RNA成分に結合する「U1ドメイン」を有する二機能性オリゴヌクレオチドである(Goraczniak, et al., 2008, Nature Biotechnology, 27(3), 257-263、これは参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれる)。U1 snRNPは、pre-mRNAエキソン-イントロン境界に結合することにより、主としてスプライセオソーム形成の初期ステップを指図するように機能するリボ核タンパク質複合体である(Brown and Simpson, 1998, Annu Rev Plant Physiol Plant MoI Biol 49:77-95)。U1 snRNA塩基対の5’末端のヌクレオチド2~11は、pre mRNAの5’ssと結合する。1つの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、U1アダプターである。1つの実施形態では、U1アダプターは、少なくとも1つの他のiRNA作用剤と組み合わせて投与することができる。
オリゴヌクレオチド修飾
未修飾オリゴヌクレオチドは、幾つかの用途では、最適ではない場合があり、例えば、未修飾オリゴヌクレオチドは、例えば細胞ヌクレアーゼにより分解され易い場合がある。ヌクレアーゼは、核酸リン酸ジエステル結合を加水分解することができる。しかしながら、オリゴヌクレオチドの化学的修飾は、特性の向上を付与することができ、例えば、オリゴヌクレオチドを、ヌクレアーゼに対してより安定的にすることができる
未修飾オリゴヌクレオチドは、幾つかの用途では、最適ではない場合があり、例えば、未修飾オリゴヌクレオチドは、例えば細胞ヌクレアーゼにより分解され易い場合がある。ヌクレアーゼは、核酸リン酸ジエステル結合を加水分解することができる。しかしながら、オリゴヌクレオチドの化学的修飾は、特性の向上を付与することができ、例えば、オリゴヌクレオチドを、ヌクレアーゼに対してより安定的にすることができる
オリゴヌクレオチドは、サブユニット又はモノマーのポリマーであるため、下記に記載されている修飾、例えば塩基、糖、ホスフェート部分、又はホスフェート部分の非架橋酸素の修飾の多くは、オリゴヌクレオチド内で繰り返される位置で生じる。所与のオリゴヌクレオチドの全ての位置が均一に修飾される必要はなく、実際、前述した複数の修飾は、単一のオリゴヌクレオチドに組み込むことができ、又はオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシドに組み込むことさえできる。
幾つかの場合、修飾は、オリゴヌクレオチドの対象位置の全てで生じることになるが、多くの場合、実際はほとんどの場合、修飾は対象位置の全てで生じるとは限らないだろう。例としては、修飾は、3’又は5’末端位置のみで生じてもよく、内部領域でのみ生じてもよく、末端領域、例えば末端ヌクレオチドの位置でのみ又はオリゴヌクレオチドの最後の2、3、4、5、又は10個のヌクレオチドでのみ生じてもよい。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、又はその両方で生じてもよい。修飾は、二本鎖オリゴヌクレオチドの二本鎖領域でのみ生じてもよく、又は二本鎖オリゴヌクレオチドの一本鎖領域でのみ生じてもよい。例えば、非架橋酸素位置でのホスホロチオアート修飾は、一方又は両方の末端でのみ生じてもよく、末端領域、例えば末端ヌクレオチドの位置でのみ又は鎖の最後の2、3、4、5、若しくは10個のヌクレオチドでのみ生じてもよく、又は二本鎖及び一本鎖領域、特に末端で生じてもよい。5’末端は、リン酸化することができる。
本明細書に記載されている修飾は、複数のヌクレオチドに含まれている唯一の修飾又は唯一のタイプの修飾であってもよく、又は修飾は、本明細書に記載されている1つ以上の他の修飾と組み合わせることができる。本明細書に記載されている修飾は、オリゴヌクレオチドにおいて組み合わせることもでき、例えば、あるオリゴヌクレオチドの異なるヌクレオチドは、本明細書に記載されている異なる修飾を有する。
幾つかの実施形態では、例えば、安定性を増強すること、突出に特定の核酸塩基を含めること、又は一本鎖突出、例えば5’突出若しくは3’突出若しくはその両方に修飾ヌクレオチド又はヌクレオチド代用物を含めることが、特に好ましい。例えば、突出にプリンヌクレオチドを含めることが望ましい場合がある。幾つかの実施形態では、3’又は5’突出の塩基の全て又は幾つかは、本明細書に記載されている修飾により修飾されているだろう。修飾には、例えばリボース糖の2’OH基における修飾の使用、例えばリボヌクレオチドの代りにデオキシリボヌクレオチド、例えばデオキシチミジンを使用すること、及びホスフェート基における修飾、例えばホスホチオアート修飾の使用が含まれる。突出は、標的配列と相同性である必要はない。
特定の修飾は、下記でより詳細に議論されている。
ホスフェート基
ホスフェート基は、負に荷電した種である。電荷は、2つの非架橋酸素原子に等しく分配されている。しかしながら、ホスフェート基は、酸素の1つを異なる置換基に置換することにより修飾することができる。RNAホスフェート骨格に対するこの修飾の1つの結果は、核酸分解に対するオリゴリボヌクレオチドの抵抗性の増加であり得る。したがって、理論により束縛されることは望まないが、幾つかの実施形態では、無荷電リンカー又は非対称電荷分布を有する荷電リンカーのいずれかをもたらす変更を導入することが望ましい場合がある。
ホスフェート基は、負に荷電した種である。電荷は、2つの非架橋酸素原子に等しく分配されている。しかしながら、ホスフェート基は、酸素の1つを異なる置換基に置換することにより修飾することができる。RNAホスフェート骨格に対するこの修飾の1つの結果は、核酸分解に対するオリゴリボヌクレオチドの抵抗性の増加であり得る。したがって、理論により束縛されることは望まないが、幾つかの実施形態では、無荷電リンカー又は非対称電荷分布を有する荷電リンカーのいずれかをもたらす変更を導入することが望ましい場合がある。
修飾ホスフェート基の例には、ホスホロチオアート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキル又はアリールホスホネート、及びホスホトリエステルが含まれる。ある実施形態では、ホスフェート骨格部分の非架橋ホスフェート酸素原子のうちの1つは、下記のいずれかと置換することができる:S、Se、BR3(Rは水素、アルキル、アリールである)、C(つまり、アルキル基、アリール基など)、H、NR2(Rは、水素、アルキル、アリール)、又はOR(Rは、アルキル又はアリールである)。未修飾ホスフェート基の亜リン酸原子は、アキラルである。しかしながら、非架橋酸素の1つを上記の原子又は原子群の1つと置換することは、亜リン酸原子にキラル性を付与し、言いかえれば、このように修飾されたホスフェート基の亜リン酸原子は不斉中心である。不斉亜リン酸原子は、「R」配置(本明細書では、Rp)又は「S」配置(本明細書では、Sp)のいずれかを有することができる。
ホスホロジチオアートは、両方の非架橋酸素が硫黄に置換されている。オリゴリボヌクレオチドジアステレオマーの形成を排除するホスホロジチオアートのリン中心は、アキラルである。したがって、理論により束縛されることは望まないが、キラル中心を排除する両非架橋酸素の修飾、例えばホスホロジチオアートの形成は、それらがジアステレオマー混合物を生成することができないという点で望ましい場合がある。したがって、非架橋酸素は、独立して、S、Se、B、C、H、N、又はOR(Rは、アルキル又はアリール)のいずれか1つであってもよい。
ホスフェートリンカーは、架橋酸素(つまり、ホスフェートをヌクレオシドに結合させる酸素)を、窒素(架橋ホスホロアミデート)、硫黄(架橋ホスホロチオアート)、及び炭素(架橋メチレンホスホネート)で置換することにより修飾することもできる。置換は、いずれの結合酸素で生じてもよく、又は結合酸素の両方で生じてもよい。架橋酸素が、ヌクレオシドの3’-酸素である場合、炭素との置換が好ましい。架橋酸素が、ヌクレオシドの5’-酸素である場合、窒素との置換が好ましい。
ホスフェート基の置換
ホスフェート基は、非リン含有連結部分と置換することができる。理論により束縛されることは望まないが、荷電ホスホジエステル基は、核酸分解の反応中心であるため、中性の構造模倣体と置換することにより、ヌクレアーゼ安定性の増強が付与されるはずであると考えられる。さらに、理論により束縛されることは望まないが、幾つかの実施形態では、荷電ホスフェート基が中性部分と置換される変更を導入することが望ましい場合がある。
ホスフェート基は、非リン含有連結部分と置換することができる。理論により束縛されることは望まないが、荷電ホスホジエステル基は、核酸分解の反応中心であるため、中性の構造模倣体と置換することにより、ヌクレアーゼ安定性の増強が付与されるはずであると考えられる。さらに、理論により束縛されることは望まないが、幾つかの実施形態では、荷電ホスフェート基が中性部分と置換される変更を導入することが望ましい場合がある。
ホスフェート基を置換することができる部分の例には、以下のものが含まれる:メチルホスホネート、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ、及びメチレンオキシメチルイミノ。好ましい置換には、メチレンカルボニルアミノ及びメチレンメチルイミノ基が含まれる。
ホスフェートに結合された酸素の少なくとも1つが置換されている、又はホスフェート基が非亜リン酸基により置換されている修飾ホスフェート結合は、「非ホスホジエステル骨格結合」とも呼ばれる。
リボホスフェート骨格の置換
ホスフェートリンカー及びリボース糖が、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド又はヌクレオチド代用物と置換されているオリゴヌクレオチド模倣骨格を構築することもできる。理論により束縛されることは望まないが、繰り返し荷電されている骨格が存在しないことにより、ポリアニオンを認識するタンパク質(例えば、ヌクレアーゼ)の結合が減少すると考えられる。さらに、理論により束縛されることは望まないが、幾つかの実施形態では、塩基が中性代用物骨格により置換される変更を導入することが望ましい場合がある。例としては、モフィリノ(mophilino)、シクロブチル、ピロリジン、及びペプチド核酸(PNA)ヌクレオシド代用物が含まれる。好ましい代用物は、PNA代用物である。
ホスフェートリンカー及びリボース糖が、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド又はヌクレオチド代用物と置換されているオリゴヌクレオチド模倣骨格を構築することもできる。理論により束縛されることは望まないが、繰り返し荷電されている骨格が存在しないことにより、ポリアニオンを認識するタンパク質(例えば、ヌクレアーゼ)の結合が減少すると考えられる。さらに、理論により束縛されることは望まないが、幾つかの実施形態では、塩基が中性代用物骨格により置換される変更を導入することが望ましい場合がある。例としては、モフィリノ(mophilino)、シクロブチル、ピロリジン、及びペプチド核酸(PNA)ヌクレオシド代用物が含まれる。好ましい代用物は、PNA代用物である。
糖修飾
修飾RNAは、リボ核酸の糖基の全て又は幾つかの修飾を含むことができる。例えば、2’ヒドロキシル基(OH)は、修飾されていてもよく、又は多くの異なる「オキシ」又は「デオキシ」置換基と置換されていてもよい。理論により束縛されないが、ヒドロキシルは、脱プロトン化して2’-アルコキシドイオンを形成することがもはやできないため、安定性の増強が予測される。2’-アルコキシドは、リンカーリン原子に対する分子内求核攻撃により、分解を触媒する場合がある。さらに、理論により束縛されることは望まないが、幾つかの実施形態では、2’位におけるアルコキシド形成が可能ではない変更を導入することが望ましい場合がある。
修飾RNAは、リボ核酸の糖基の全て又は幾つかの修飾を含むことができる。例えば、2’ヒドロキシル基(OH)は、修飾されていてもよく、又は多くの異なる「オキシ」又は「デオキシ」置換基と置換されていてもよい。理論により束縛されないが、ヒドロキシルは、脱プロトン化して2’-アルコキシドイオンを形成することがもはやできないため、安定性の増強が予測される。2’-アルコキシドは、リンカーリン原子に対する分子内求核攻撃により、分解を触媒する場合がある。さらに、理論により束縛されることは望まないが、幾つかの実施形態では、2’位におけるアルコキシド形成が可能ではない変更を導入することが望ましい場合がある。
「オキシ」-2’ヒドロキシル基修飾の例には、以下のものが含まれる:アルコキシ又はアリールオキシ(OR、例えば、R=H、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、へテロアリール、又は糖);ポリエチレングリコール(PEG)、(O(CH2CH2O)nCH2CH2OR);2’ヒドロキシルが、例えばメチレン架橋により、同じリボース糖の4’炭素に結合している「ロックド」核酸(LNA);O-アミン(アミン=NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、へテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ)、及びアミノアルコキシ、(O(CH2)nAMINE、(例えば、アミン=NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、へテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ)。メトキシエチル基(MOE)、(OCH2CH2OCH3、PEG誘導体)のみを含有するオリゴヌクレオチドが、ロバストなホスホロチオアート修飾で修飾されているものに匹敵するヌクレアーゼ安定性を示すことは注目に値する。
「デオキシ」修飾には、以下のものが含まれる:水素(つまり、部分的にds RNAの突出部分に特に関連するデオキシリボース糖);ハロ(例えば、フルオロ);アミノ(例えば、NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、へテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、又はアミノ酸);NH(CH2CH2NH)nCH2CH2-アミン(アミン=NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、へテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ)、-NHC(O)R(R=アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、へテロアリール、又は糖)、シアノ;メルカプト;アルキルチオアルキル;チオアルコキシ;並びにアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル、及びアルキニル、これらは、例えばアミノ官能性で随意に置換されていてもよい。好ましい置換基は、2’-メトキシエチル、2’-OCH3、2’-O-アリル、2’-C-アリル、及び2’-フルオロである。
糖基は、リボースの対応する炭素の立体化学配置とは反対の立体化学配置を有する1つ以上の炭素を含有することもできる。したがって、オリゴヌクレオチドは、例えばアラビノースを糖として含有するヌクレオチドを含んでいてもよい。モノマーは、糖の1’位にアルファ結合を有していてもよく、例えばアルファ-ヌクレオシドである。オリゴヌクレオチドは、C-1’の核酸塩基を欠如した「脱塩基」糖を含むこともできる。これらの脱塩基糖は、構成糖原子の1つ以上における修飾をさらに含有することもできる。オリゴヌクレオチドは、L型、例えばL-ヌクレオシドである1つ以上の糖を含有することもできる。
末端修飾
オリゴヌクレオチドの3’及び5’末端は、修飾されていてもよい。そのような修飾は、分子の3’末端、5’末端、又は両端であってもよい。それらは、末端ホスフェート全体の、又はホスフェート基の原子の1つ以上の修飾又は置換を含んでいてもよい。例えば、オリゴヌクレオチドの3’及び5’末端は、標識部分、例えば蛍光体(例えば、ピレン、TAMRA、フルオレセイン、Cy3、又はCy5染料)、又は保護基(例えば、硫黄、ケイ素、ホウ素、又はエステルに基づく)などの他の官能性分子実体に結合されていてもよい。官能性分子実体は、ホスフェート基及び/又はリンカーを介して糖に結合されていてもよい。リンカーの末端原子は、ホスフェート基の結合原子、又は糖のC-3’若しくはC-5’、O、N、S、若しくはC基の結合原子に接続するか又は置換してもよい。あるいは、リンカーは、ヌクレオチド代用物(例えば、PNA)の末端原子に接続するか又は置換してもよい。
オリゴヌクレオチドの3’及び5’末端は、修飾されていてもよい。そのような修飾は、分子の3’末端、5’末端、又は両端であってもよい。それらは、末端ホスフェート全体の、又はホスフェート基の原子の1つ以上の修飾又は置換を含んでいてもよい。例えば、オリゴヌクレオチドの3’及び5’末端は、標識部分、例えば蛍光体(例えば、ピレン、TAMRA、フルオレセイン、Cy3、又はCy5染料)、又は保護基(例えば、硫黄、ケイ素、ホウ素、又はエステルに基づく)などの他の官能性分子実体に結合されていてもよい。官能性分子実体は、ホスフェート基及び/又はリンカーを介して糖に結合されていてもよい。リンカーの末端原子は、ホスフェート基の結合原子、又は糖のC-3’若しくはC-5’、O、N、S、若しくはC基の結合原子に接続するか又は置換してもよい。あるいは、リンカーは、ヌクレオチド代用物(例えば、PNA)の末端原子に接続するか又は置換してもよい。
リンカー/ホスフェート官能性分子実体-リンカー/ホスフェート配列が、dsRNAの2本の鎖の間に挿入されている場合、この配列は、ヘアピン型RNA作用剤のヘアピンRNAループの代わりをすることができる。
調節活性に有用な末端修飾には、ホスフェート又はホスフェート類似体による5’末端の修飾が含まれる。例えば、好ましい実施形態では、dsRNAのアンチセンス鎖は、5’リン酸化されているか、又は5’プライム末端にホスホリル類似体を含む。5’-ホスフェート修飾には、RISC媒介性遺伝子サイレンシングと適合性をもつものが含まれる。好適な修飾には、以下のものが含まれる:5’-モノホスフェート((HO)2(O)P-O-5’);5’-ジホスフェート((HO)2(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’);5’-トリホスフェート((HO)2(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’);5’-グアノシンキャップ(7-メチル化又は非メチル化)(7m-G-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’;5’-アデノシンキャップ(Appp)、及び任意の修飾又は未修飾ヌクレオチドキャップ構造(N-O-5’-(HO)(O)P-O-(HO)(O)P-O-P(HO)(O)-O-5’);5’-モノチオホスフェート(ホスホロチオアート;(HO)2(S)P-O-5’);5’-モノジチオホスフェート(ホスホロジチオアート;(HO)(HS)(S)P-O-5’)、5’-ホスホロチオラート((HO)2(O)P-S-5’);酸素/硫黄で置換されたモノホスフェート、ジホスフェート、及びトリホスフェート(例えば、5’-アルファ-チオトリホスフェート、5’-ガンマ-チオトリホスフェートなど)、5’-ホスホルアミダート((HO)2(O)P-NH-5’、(HO)(NH2)(O)P-O-5’)、5’-アルキルホスホネート(R=アルキル=メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、RP(OH)(O)-O-5’-)、(OH)2(O)P-5’-CH2-)、5’-アルキルエーテルホスホネート(R=アルキルエーテル=メトキシメチル(MeOCH2-)、エトキシメチルなど、例えば、RP(OH)(O)-O-5’-)のさらなる任意の組合せ。
また、末端修飾は、分布を監視するのに有用であってもよく、そのような場合、付加される好ましい基には、蛍光体(例えば、フルオルセイン(fluorscein)、Alexa染料、例えばAlexa488が含まれる。また、末端修飾は、取り込みの増強に有用であってもよく、このための有用な修飾には、コレステロールが含まれる。また、末端修飾は、RNA作用剤を別の部分に架橋するのに有用であってもよく、このために有用な修飾には、マイトマイシンCが含まれる。
核酸塩基
アデニン、グアニン、シトシン、及びウラシルは、RNAに見出される最も一般的な塩基である。これらの塩基を修飾又は置換して、特性が向上したRNAを提供することができる。例えば、ヌクレアーゼ耐性オリゴリボヌクレオチドは、これらの塩基、又は合成及び天然核酸塩基(例えば、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン(nubularine)、イソグアニシン(isoguanisine)、又はツベルシジン(tubercidine))、並びに上記の修飾のいずれか1つを用いて調製することができる。あるいは、上記の塩基のいずれかの置換又は修飾類似体、例えば、本明細書に記載されている「異常塩基」、「修飾塩基」、「非天然塩基」、及び「ユニバーサル塩基」を使用することができる。例としては、限定ではないが、以下のものが含まれる:2-アミノアデニン、アデニン及びグアニンの6-メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの2-プロピル及び他のアルキル誘導体、5-ハロウラシル及びシトシン、5-プロピニルウラシル及びシトシン、6-アゾウラシル、シトシン、及びチミン、5-ウラシル(プソイドウラシル)、4-チオウラシル、5-ハロウラシル、5-(2-アミノプロピル)ウラシル、5-アミノアリルウラシル、8-ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシル、及び他の8-置換アデニン及びグアニン、5-トリフルオロメチル及び他の5-置換ウラシル及びシトシン、7-メチルグアニン、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン、並びに2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシル、及び5-プロピニルシトシンを含むN-2、N-6、及びO-6置換プリン、ジヒドロウラシル、3-デアザ-5-アザシトシン、2-アミノプリン、5-アルキルウラシル、7-アルキルグアニン、5-アルキルシトシン、7-デアザアデニン、N6、N6-ジメチルアデニン、2,6-ジアミノプリン、5-アミノアリルウラシル、N3-メチルウラシル、置換1,2,4-トリアゾール、2-ピリジノン、5-ニトロインドール、3-ニトロピロール、5-メトキシウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸、5-メトキシカルボニルメチルウラシル、5-メチル-2-チオウラシル、5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウラシル、5-メチルアミノメチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3カルボキシプロピル)ウラシル、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N4-アセチルシトシン、2-チオシトシン、N6-メチルアデニン、N6-イソペンチルアデニン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、N-メチルグアニン、又はO-アルキル化塩基。さらなるプリン及びピリミジンには、米国特許第3,687,808号で開示されているもの、the Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990で開示されているもの、及びEnglisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613で開示されているものが含まれる。
アデニン、グアニン、シトシン、及びウラシルは、RNAに見出される最も一般的な塩基である。これらの塩基を修飾又は置換して、特性が向上したRNAを提供することができる。例えば、ヌクレアーゼ耐性オリゴリボヌクレオチドは、これらの塩基、又は合成及び天然核酸塩基(例えば、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ヌブラリン(nubularine)、イソグアニシン(isoguanisine)、又はツベルシジン(tubercidine))、並びに上記の修飾のいずれか1つを用いて調製することができる。あるいは、上記の塩基のいずれかの置換又は修飾類似体、例えば、本明細書に記載されている「異常塩基」、「修飾塩基」、「非天然塩基」、及び「ユニバーサル塩基」を使用することができる。例としては、限定ではないが、以下のものが含まれる:2-アミノアデニン、アデニン及びグアニンの6-メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの2-プロピル及び他のアルキル誘導体、5-ハロウラシル及びシトシン、5-プロピニルウラシル及びシトシン、6-アゾウラシル、シトシン、及びチミン、5-ウラシル(プソイドウラシル)、4-チオウラシル、5-ハロウラシル、5-(2-アミノプロピル)ウラシル、5-アミノアリルウラシル、8-ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシル、及び他の8-置換アデニン及びグアニン、5-トリフルオロメチル及び他の5-置換ウラシル及びシトシン、7-メチルグアニン、5-置換ピリミジン、6-アザピリミジン、並びに2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシル、及び5-プロピニルシトシンを含むN-2、N-6、及びO-6置換プリン、ジヒドロウラシル、3-デアザ-5-アザシトシン、2-アミノプリン、5-アルキルウラシル、7-アルキルグアニン、5-アルキルシトシン、7-デアザアデニン、N6、N6-ジメチルアデニン、2,6-ジアミノプリン、5-アミノアリルウラシル、N3-メチルウラシル、置換1,2,4-トリアゾール、2-ピリジノン、5-ニトロインドール、3-ニトロピロール、5-メトキシウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸、5-メトキシカルボニルメチルウラシル、5-メチル-2-チオウラシル、5-メトキシカルボニルメチル-2-チオウラシル、5-メチルアミノメチル-2-チオウラシル、3-(3-アミノ-3カルボキシプロピル)ウラシル、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N4-アセチルシトシン、2-チオシトシン、N6-メチルアデニン、N6-イソペンチルアデニン、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、N-メチルグアニン、又はO-アルキル化塩基。さらなるプリン及びピリミジンには、米国特許第3,687,808号で開示されているもの、the Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990で開示されているもの、及びEnglisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613で開示されているものが含まれる。
陽イオン性基
オリゴヌクレオチドに対する修飾には、1つ以上の陽イオン性基を、ホスフェート又は修飾ホスフェート骨格部分の糖、塩基、及び/又はリン原子に結合させることが含まれていてもよい。陽イオン性基は、天然塩基、異常塩基、又はユニバーサル塩基の置換可能な任意の原子に結合させることができる。好ましい位置は、ハイブリダイゼーションを妨害しない、つまり塩基対合に必要とされる水素結合相互作用を妨害しない位置である。陽イオン性基は、例えば、糖のC2’位、又は環式又は非環式糖代用物の類似位置を介して結合させることができる。陽イオン性基には、以下のものが含まれていてもよい:例えば、O-アミン(アミン=NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、へテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ)に由来する、例えばプロトン化アミノ基;アミノアルコキシ、例えばO(CH2)nアミン)(例えば、アミン=NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、へテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ);アミノ(例えば、NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、へテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、又はアミノ酸);又はNH(CH2CH2NH)nCH2CH2-アミン(アミン=NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、へテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ)。
オリゴヌクレオチドに対する修飾には、1つ以上の陽イオン性基を、ホスフェート又は修飾ホスフェート骨格部分の糖、塩基、及び/又はリン原子に結合させることが含まれていてもよい。陽イオン性基は、天然塩基、異常塩基、又はユニバーサル塩基の置換可能な任意の原子に結合させることができる。好ましい位置は、ハイブリダイゼーションを妨害しない、つまり塩基対合に必要とされる水素結合相互作用を妨害しない位置である。陽イオン性基は、例えば、糖のC2’位、又は環式又は非環式糖代用物の類似位置を介して結合させることができる。陽イオン性基には、以下のものが含まれていてもよい:例えば、O-アミン(アミン=NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、へテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ)に由来する、例えばプロトン化アミノ基;アミノアルコキシ、例えばO(CH2)nアミン)(例えば、アミン=NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、へテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ);アミノ(例えば、NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、へテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、又はアミノ酸);又はNH(CH2CH2NH)nCH2CH2-アミン(アミン=NH2;アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、へテロアリールアミノ、又はジヘテロアリールアミノ)。
オリゴヌクレオチド内での配置
幾つかの修飾は、好ましくは、特定の位置で、例えば鎖の内部位置で又はオリゴヌクレオチドの5’又は3’末端で、オリゴヌクレオチドに含まれていてもよい。好ましい位置でのオリゴヌクレオチドの修飾は、作用剤に好ましい特性を付与することができる。例えば、好ましい位置での特定の修飾は、最適な遺伝子サイレンシング特性、又はエンドヌクレアーゼ若しくはエキソヌクレアーゼ活性に対する耐性の増加を付与することができる。
幾つかの修飾は、好ましくは、特定の位置で、例えば鎖の内部位置で又はオリゴヌクレオチドの5’又は3’末端で、オリゴヌクレオチドに含まれていてもよい。好ましい位置でのオリゴヌクレオチドの修飾は、作用剤に好ましい特性を付与することができる。例えば、好ましい位置での特定の修飾は、最適な遺伝子サイレンシング特性、又はエンドヌクレアーゼ若しくはエキソヌクレアーゼ活性に対する耐性の増加を付与することができる。
オリゴヌクレオチドの1つ以上のヌクレオチドは、2’-5’結合を有していてもよい。オリゴヌクレオチドの1つ以上のヌクレオチドは、逆の結合、例えば3’-3’、5’-5’、2’-2’、又は2’-3’結合を有していてもよい。
二本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも1つの、ウリジンが2’-修飾ヌクレオチドである5’-ウリジン-アデニン-3’(5’-UA-3’)ジヌクレオチド、又は5’-ウリジンが2’-修飾ヌクレオチドである末端5’-ウリジン-グアニン-3’(5’-UG-3’)ジヌクレオチド、又は5’-シチジンが2’-修飾ヌクレオチドである末端5’-シチジン-アデニン-3’(5’-CA-3’)ジヌクレオチド、又は5’-ウリジンが2’-修飾ヌクレオチドである末端5’-ウリジン-ウリジン-3’(5’-UU-3’)ジヌクレオチド、又は5’-シチジンが2’-修飾ヌクレオチドである末端5’-シチジン-シチジン-3’(5’-CC-3’)ジヌクレオチド、又は5’-シチジンが2’-修飾ヌクレオチドである末端5’-シチジン-ウリジン-3’(5’-CU-3’)ジヌクレオチド、又は5’-ウリジンが2’-修飾ヌクレオチドである末端5’-ウリジン-シチジン-3’(5’-UC-3’)ジヌクレオチドを含む。これらの修飾を含む二本鎖オリゴヌクレオチドは、特にエンドヌクレアーゼ活性に対して安定化される。
一般的な文献
本発明により使用されるオリゴリボヌクレオチド及びオリゴリボヌクレオシドは、固相合成で合成することができる。例えば、”Oligonucleotide synthesis, a practical approach”, Ed. M. J. Gait, IRL Press, 1984;”Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach”, Ed. F. Eckstein, IRL Press, 1991(特に、1章、Modern machine-aided methods of oligodeoxyribonucleotide synthesis、2章、Oligoribonucleotide synthesis、3章、2’-O--Methyloligoribonucleotide- s: synthesis and applications、4章、Phosphorothioate oligonucleotides、5章、Synthesis of oligonucleotide phosphorodithioates、6章、Synthesis of oligo-2’-deoxyribonucleoside methylphosphonates、及び7章、Oligodeoxynucleotides containing modified bases)を参照されたい。他の特に有用な合成手順、試薬、保護基、及び反応条件は、以下の文献に記載されている:Martin, P., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504;Beaucage, S. L. and Iyer, R. P., Tetrahedron, 1992, 48, 2223-2311、及びBeaucage, S. L. and Iyer, R. P., Tetrahedron, 1993, 49, 6123-6194、又はそこに引用されている文献。国際公開第00/44895号、国際公開第01/75164号、又は国際公開第02/44321号に記載されている修飾を、本明細書で使用することができる。本明細書で列挙されている全ての出版物、特許、及び公開特許出願の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明により使用されるオリゴリボヌクレオチド及びオリゴリボヌクレオシドは、固相合成で合成することができる。例えば、”Oligonucleotide synthesis, a practical approach”, Ed. M. J. Gait, IRL Press, 1984;”Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach”, Ed. F. Eckstein, IRL Press, 1991(特に、1章、Modern machine-aided methods of oligodeoxyribonucleotide synthesis、2章、Oligoribonucleotide synthesis、3章、2’-O--Methyloligoribonucleotide- s: synthesis and applications、4章、Phosphorothioate oligonucleotides、5章、Synthesis of oligonucleotide phosphorodithioates、6章、Synthesis of oligo-2’-deoxyribonucleoside methylphosphonates、及び7章、Oligodeoxynucleotides containing modified bases)を参照されたい。他の特に有用な合成手順、試薬、保護基、及び反応条件は、以下の文献に記載されている:Martin, P., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504;Beaucage, S. L. and Iyer, R. P., Tetrahedron, 1992, 48, 2223-2311、及びBeaucage, S. L. and Iyer, R. P., Tetrahedron, 1993, 49, 6123-6194、又はそこに引用されている文献。国際公開第00/44895号、国際公開第01/75164号、又は国際公開第02/44321号に記載されている修飾を、本明細書で使用することができる。本明細書で列挙されている全ての出版物、特許、及び公開特許出願の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
ホスフェート基の文献
ホスフィネートオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第5,508,270号に記載されている。アルキルホスホネートオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第4,469,863号に記載されている。ホスホラミダイトオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第5,256,775号又は米国特許第5,366,878号に記載されている。ホスホトリエステルオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第5,023,243号に記載されている。ボラノホスフェートオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第5,130,302号及び第5,177,198号に記載されている。3’-デオキシ-3’-アミノホスホルアミダートオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第5,476,925号に記載されている。3’-デオキシ-3’-メチレンホスホネートオリゴリボヌクレオチドは、An, H, et al. J. Org. Chem. 2001, 66, 2789-2801に記載されている。硫黄架橋ヌクレオチドの調製は、Sproat et al. Nucleosides Nucleotides 1988, 7,651及びCrosstick et al. Tetrahedron Lett. 1989, 30, 4693に記載されている。
ホスフィネートオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第5,508,270号に記載されている。アルキルホスホネートオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第4,469,863号に記載されている。ホスホラミダイトオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第5,256,775号又は米国特許第5,366,878号に記載されている。ホスホトリエステルオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第5,023,243号に記載されている。ボラノホスフェートオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第5,130,302号及び第5,177,198号に記載されている。3’-デオキシ-3’-アミノホスホルアミダートオリゴリボヌクレオチドの調製は、米国特許第5,476,925号に記載されている。3’-デオキシ-3’-メチレンホスホネートオリゴリボヌクレオチドは、An, H, et al. J. Org. Chem. 2001, 66, 2789-2801に記載されている。硫黄架橋ヌクレオチドの調製は、Sproat et al. Nucleosides Nucleotides 1988, 7,651及びCrosstick et al. Tetrahedron Lett. 1989, 30, 4693に記載されている。
糖基の文献
2’修飾に対する改変は、Verma, S. et al. Annu. Rev. Biochem. 1998, 67, 99-134及びその中の文献全てに見出すことができる。リボースに対する特定の修飾は、以下の文献に見出すことができる:2’-フルオロ(Kawasaki et. al., J. Med. Chem., 1993, 36, 831-841)、2’-MOE (Martin, P. Helv. Chim. Acta 1996, 79, 1930-1938)、「LNA」(Wengel, J. Acc. Chem. Res. 1999, 32, 301-310)。
2’修飾に対する改変は、Verma, S. et al. Annu. Rev. Biochem. 1998, 67, 99-134及びその中の文献全てに見出すことができる。リボースに対する特定の修飾は、以下の文献に見出すことができる:2’-フルオロ(Kawasaki et. al., J. Med. Chem., 1993, 36, 831-841)、2’-MOE (Martin, P. Helv. Chim. Acta 1996, 79, 1930-1938)、「LNA」(Wengel, J. Acc. Chem. Res. 1999, 32, 301-310)。
ポスフェート基置換の文献
本明細書ではMMI結合オリゴリボヌクレオシドとしても特定されているメチレンメチルイミノ結合オリゴリボヌクレオシド、本明細書ではMDH結合オリゴリボヌクレオシドとしても特定されているメチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴリボヌクレオシド、本明細書ではアミド-3結合オリゴリボヌクレオシドとしても特定されているメチレンカルボニルアミノ結合オリゴリボヌクレオシド、本明細書ではアミド-4結合のオリゴリボヌクレオシドとしても特定されているメチレンアミノカルボニル結合オリゴリボヌクレオシド、並びに例えばMMI及びPO又はPSが交互する結合を有する混合骨格化合物は、米国特許第5,378,825号、第5,386,023号、第5,489,677号、並びに国際出願第PCT/US92/04294号及び国際出願第PCT/US92/04305号(それぞれ国際公開第92/20822号及び国際公開第92/20823号として公開されている)に記載されているように調製することができる。ホルムアセタール及びチオホルムアセタール結合オリゴリボヌクレオシドは、米国特許第5,264,562号及び同第5,264,564号に記載されているように調製することができる。エチレンオキシド結合オリゴリボヌクレオシドは、米国特許第5,223,618号に記載されているように調製することができる。シロキサン置換は、Cormier,J.F. et al. Nucleic Acids Res. 1988, 16, 4583に記載されている。カルボネート置換は、Tittensor, J.R. J. Chem. Soc. C 1971, 1933に記載されている。カルボキシメチル置換は、Edge, M.D. et al. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 1972, 1991に記載されている。カルバメート置換は、Stirchak, E.P. Nucleic Acids Res. 1989, 17, 6129に記載されている。
本明細書ではMMI結合オリゴリボヌクレオシドとしても特定されているメチレンメチルイミノ結合オリゴリボヌクレオシド、本明細書ではMDH結合オリゴリボヌクレオシドとしても特定されているメチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴリボヌクレオシド、本明細書ではアミド-3結合オリゴリボヌクレオシドとしても特定されているメチレンカルボニルアミノ結合オリゴリボヌクレオシド、本明細書ではアミド-4結合のオリゴリボヌクレオシドとしても特定されているメチレンアミノカルボニル結合オリゴリボヌクレオシド、並びに例えばMMI及びPO又はPSが交互する結合を有する混合骨格化合物は、米国特許第5,378,825号、第5,386,023号、第5,489,677号、並びに国際出願第PCT/US92/04294号及び国際出願第PCT/US92/04305号(それぞれ国際公開第92/20822号及び国際公開第92/20823号として公開されている)に記載されているように調製することができる。ホルムアセタール及びチオホルムアセタール結合オリゴリボヌクレオシドは、米国特許第5,264,562号及び同第5,264,564号に記載されているように調製することができる。エチレンオキシド結合オリゴリボヌクレオシドは、米国特許第5,223,618号に記載されているように調製することができる。シロキサン置換は、Cormier,J.F. et al. Nucleic Acids Res. 1988, 16, 4583に記載されている。カルボネート置換は、Tittensor, J.R. J. Chem. Soc. C 1971, 1933に記載されている。カルボキシメチル置換は、Edge, M.D. et al. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 1972, 1991に記載されている。カルバメート置換は、Stirchak, E.P. Nucleic Acids Res. 1989, 17, 6129に記載されている。
ホスフェート-リボース骨格置換の文献
シクロブチル糖代用化合物は、米国特許第5,359,044号に記載されているように調製することができる。 ピロリジン糖代用物は、米国特許第5,519,134号に記載されているように調製することができる。モルホリノ糖代用物は、米国特許第5,142,047号及び第5,235,033号、並びに他の関連特許開示に記載されているように調製することができる。ペプチド核酸(PNA)は、それ自身公知であり、Peptide Nucleic Acids (PNA): Synthesis, Properties and Potential Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4, 5-23に引用されている種々の手順のいずれかに従って調製することができる。それらは、米国特許第5,539,083号に従って調製することもできる。
シクロブチル糖代用化合物は、米国特許第5,359,044号に記載されているように調製することができる。 ピロリジン糖代用物は、米国特許第5,519,134号に記載されているように調製することができる。モルホリノ糖代用物は、米国特許第5,142,047号及び第5,235,033号、並びに他の関連特許開示に記載されているように調製することができる。ペプチド核酸(PNA)は、それ自身公知であり、Peptide Nucleic Acids (PNA): Synthesis, Properties and Potential Applications, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 1996, 4, 5-23に引用されている種々の手順のいずれかに従って調製することができる。それらは、米国特許第5,539,083号に従って調製することもできる。
末端修飾の文献
末端修飾は、Manoharan, M. et al. Antisense and Nucleic Acid Drug Development 12, 103-128 (2002)及びその中の文献に記載されている。
末端修飾は、Manoharan, M. et al. Antisense and Nucleic Acid Drug Development 12, 103-128 (2002)及びその中の文献に記載されている。
核酸塩基の文献
N-2置換プリンヌクレオシドアミダイト(N-2 substitued purine nucleoside amidite)は、米国特許第5,459,255号に記載されているように調製することができる。 3-デアザプリンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第5,457,191号に記載されているように調製することができる。 5,6-置換ピリミジンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第5,614,617号に記載されているように調製することができる。 5-プロピニルピリミジンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第5,484,908号に記載されているように調製することができる。
N-2置換プリンヌクレオシドアミダイト(N-2 substitued purine nucleoside amidite)は、米国特許第5,459,255号に記載されているように調製することができる。 3-デアザプリンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第5,457,191号に記載されているように調製することができる。 5,6-置換ピリミジンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第5,614,617号に記載されているように調製することができる。 5-プロピニルピリミジンヌクレオシドアミダイトは、米国特許第5,484,908号に記載されているように調製することができる。
リンカー
「リンカー」という用語は、化合物の2つの部分を接続する有機部分を意味する。 リンカーは、典型的には、以下のものを含む;直接結合又は酸素若しくは硫黄などの原子、NR1、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH、又は置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換アルケニル、置換若しくは非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、へテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘレロシクリルアルキニル(alkylhererocyclylalkynyl)、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘレロアリール(alkynylhereroaryl)などの原子鎖などの単位、ここで1つ以上のメチレンは、O、S、S(O)、SO2、N(R1)2、C(O)、切断可能な結合部分、置換若しくは非置換アリール、置換若しくは非置換へテロアリール、又は置換若しくは非置換ヘテロ環式で中断又は終了されていてもよく、ここでR1は、水素、アシル、脂肪族、又は置換脂肪族である。
「リンカー」という用語は、化合物の2つの部分を接続する有機部分を意味する。 リンカーは、典型的には、以下のものを含む;直接結合又は酸素若しくは硫黄などの原子、NR1、C(O)、C(O)NH、SO、SO2、SO2NH、又は置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換アルケニル、置換若しくは非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、へテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘレロシクリルアルキニル(alkylhererocyclylalkynyl)、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘレロアリール(alkynylhereroaryl)などの原子鎖などの単位、ここで1つ以上のメチレンは、O、S、S(O)、SO2、N(R1)2、C(O)、切断可能な結合部分、置換若しくは非置換アリール、置換若しくは非置換へテロアリール、又は置換若しくは非置換ヘテロ環式で中断又は終了されていてもよく、ここでR1は、水素、アシル、脂肪族、又は置換脂肪族である。
1つの実施形態では、リンカーは、-[(P-Q-R)q-X-(P’-Q’-R’)q’]q’’-T-であり、式中、
P、R、T、P’、R’、及びTは、各存在において各々独立して、非存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH、CH2O;NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CH=N-O、
ヘテロシクリルであり、
Q及びQ’は、各存在において各々独立して、非存在、-(CH2)n-、-C(R1)(R2)(CH2)n-、-(CH2)nC(R1)(R2)-、-(CH2CH2O)mCH2CH2-、又は-(CH2CH2O)mCH2CH2NH-であり、
Xは、非存在であるか又は切断可能な結合基であり、
Raは、H又はアミノ酸側鎖であり、
R1及びR2は、各存在において各々独立して、H,CH3、OH,SH、又はN(RN)2であり、
RNは、各存在において独立して、H、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、又はベンジルであり、
q、q’、及びq’’は、各存在において各々独立して、0~20であり、反復単位は、同じであるか又は異なっていてもよく、
nは、各存在において独立して、1~20であり、及び
mは、各存在において独立して、0~50である。
P、R、T、P’、R’、及びTは、各存在において各々独立して、非存在、CO、NH、O、S、OC(O)、NHC(O)、CH2、CH2NH、CH2O;NHCH(Ra)C(O)、-C(O)-CH(Ra)-NH-、CH=N-O、
Q及びQ’は、各存在において各々独立して、非存在、-(CH2)n-、-C(R1)(R2)(CH2)n-、-(CH2)nC(R1)(R2)-、-(CH2CH2O)mCH2CH2-、又は-(CH2CH2O)mCH2CH2NH-であり、
Xは、非存在であるか又は切断可能な結合基であり、
Raは、H又はアミノ酸側鎖であり、
R1及びR2は、各存在において各々独立して、H,CH3、OH,SH、又はN(RN)2であり、
RNは、各存在において独立して、H、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、又はベンジルであり、
q、q’、及びq’’は、各存在において各々独立して、0~20であり、反復単位は、同じであるか又は異なっていてもよく、
nは、各存在において独立して、1~20であり、及び
mは、各存在において独立して、0~50である。
1つの実施形態では、リンカーは、少なくとも1つの切断可能な結合基を含む。
ある実施形態では、リンカーは、分岐リンカーである。分岐リンカーの分岐点は、少なくとも三価であってもよいが、四価、五価、又は六価の原子、又はそのような多重結合価を示す基であってもよい。ある実施形態では、分岐点は、-N、-N(Q)-C、-O-C、-S-C、-SS-C、-C(O)N(Q)-C、-OC(O)N(Q)-C、-N(Q)C(O)-C、又は-N(Q)C(O)O-Cであり、式中Qは、各存在において独立してH又は随意に置換されたアルキルである。他の実施形態では、分岐点は、グリセロール又はグリセロール誘導体である。
切断可能な結合基
切断可能な結合基は、細胞の外では十分に安定しているが、標的細胞に進入すると、切断されて、リンカーが一緒に保持する2つの部分を放出するものである。好ましい実施形態では、切断可能な結合基は、対象体の血液中又は第2の基準条件下より(例えば、血液又は血清に見出される条件を模倣又は表すために選択することができる)、標的細胞内で又は第1の基準条件下で(例えば、細胞内の条件を模倣又は表すために選択することができる)、少なくとも10倍以上、好ましくは少なくとも100倍、より急速に切断される。
切断可能な結合基は、切断作用剤、例えばpH、酸化還元電位、又は分解分子の存在に感受性である。一般的に、切断作用剤は、血清又は血液中よりも細胞内部で、より行き渡っているか、又はより高いレベル又は活性で見出される。そのような分解作用剤の例には、以下のものが含まれる:特定の基質のために選択される酸化還元剤又は基質特異性を有していない酸化還元剤、例えば、酸化若しくは還元酵素、又は還元により酸化還元的に切断可能な結合基を分解することができる、細胞に存在するメルカプタンなどの還元剤;エステラーゼ;エンドソーム又は酸性環境を作り出すことができる作用剤、例えば5以下のpHをもたらすもの;一般酸、ペプチダーゼ(基質特異的であり得る)、及びホスファターゼとして作用することにより、酸で切断可能な結合基を加水分解又は分解することができる酵素。
切断可能な結合基は、細胞の外では十分に安定しているが、標的細胞に進入すると、切断されて、リンカーが一緒に保持する2つの部分を放出するものである。好ましい実施形態では、切断可能な結合基は、対象体の血液中又は第2の基準条件下より(例えば、血液又は血清に見出される条件を模倣又は表すために選択することができる)、標的細胞内で又は第1の基準条件下で(例えば、細胞内の条件を模倣又は表すために選択することができる)、少なくとも10倍以上、好ましくは少なくとも100倍、より急速に切断される。
切断可能な結合基は、切断作用剤、例えばpH、酸化還元電位、又は分解分子の存在に感受性である。一般的に、切断作用剤は、血清又は血液中よりも細胞内部で、より行き渡っているか、又はより高いレベル又は活性で見出される。そのような分解作用剤の例には、以下のものが含まれる:特定の基質のために選択される酸化還元剤又は基質特異性を有していない酸化還元剤、例えば、酸化若しくは還元酵素、又は還元により酸化還元的に切断可能な結合基を分解することができる、細胞に存在するメルカプタンなどの還元剤;エステラーゼ;エンドソーム又は酸性環境を作り出すことができる作用剤、例えば5以下のpHをもたらすもの;一般酸、ペプチダーゼ(基質特異的であり得る)、及びホスファターゼとして作用することにより、酸で切断可能な結合基を加水分解又は分解することができる酵素。
ジスルフィド結合などの切断可能な結合基は、pHに感受性であってもよい。ヒト血清のpHは7.4であるが、平均細胞内pHは、わずかに低く、約7.1~7.3の範囲である。エンドソームは、5.5~6.0の範囲のより酸性のpHを有し、リソソームは、さらにより酸性である約5.0のpHを有する。幾つかのリンカーは、好ましいpHで切断される切断可能な結合基を有し、それにより陽イオン性脂質をリガンドから細胞内部に又は細胞の所望の区画に放出するだろう。
リンカーは、特定の酵素により切断可能である切断可能な結合基を含むことができる。リンカーに組み込まれた切断可能な結合基のタイプは、標的とされる細胞に依存する場合がある。例えば、肝臓標的指向性リガンドは、エステル基を含むリンカーを介して陽イオン性脂質に結合させることができる。肝細胞は、エステラーゼに富んでおり、したがってリンカーは、エステラーゼが豊富でない細胞タイプよりも肝細胞中でより効率的に切断されるだろう。エステラーゼが豊富な他の細胞タイプには、肺、腎皮質、及び精巣の細胞が含まれる。
肝細胞及び滑膜細胞などの、ペプチダーゼが豊富な細胞タイプを標的とする場合、ペプチド結合を含有するリンカーを使用することができる。
一般的に、切断可能な結合基候補の適合性は、切断可能な結合基候補を切断する分解作用剤(又は条件)の能力を試験することにより評価することができる。血液中での又は他の非標的組織と接触した際の切断耐性能力に関して、切断可能な結合基候補を試験することも望ましいだろう。したがって、第1の条件と第2の条件との間の切断に対する相対的感受性を決定することができ、この場合、第1は、標的細胞での切断を示すように選択され、第2は、他の組織又は生物学的液体、例えば血液又は血清での切断を示すように選択される。評価は、無細胞系中、細胞中、細胞培養中、器官若しくは組織培養中、又は動物全身で実施することができる。無細胞条件又は培養条件で初期評価を行い、動物全身でさらに評価することにより確認することが有用であり得る。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液又は血清(又は細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下)よりも、細胞において(又は細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で)少なくとも2、4、10、又は100倍、より急速に切断される。
酸化還元的に切断可能な結合基
切断可能な結合基の1つのクラスは、還元又は酸化時に切断される酸化還元的に切断可能な結合基である。還元的に切断可能な結合基の一例は、ジスルフィド結合基(-S-S-)である。切断可能な結合基候補が、好適な「還元的に切断可能な結合基」であるかどうか、又は例えば特定のiRNA部分及び特定の標的指向性作用剤と共に使用するのに好適であるかどうかを決定するためには、本明細書に記載されている方法を参考することができる。例えば、候補は、細胞、例えば標的細胞中で観察されるだろう切断速度を模倣する当該技術分野で公知の試薬を使用して、ジチオトレイトール(DTT)又は他の還元剤と共にインキュベーションすることにより評価することができる。候補は、血液又は血清条件を模倣するように選択される条件下で評価することもできる。好ましい実施形態では、候補化合物は、血液中で多くとも10%切断される。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液(又は細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下)よりも、細胞において(又は細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で)少なくとも2、4、10、又は100倍、より急速に分解される。候補化合物の切断速度は、標準的酵素反応速度アッセイを使用して、細胞内媒質を模倣するように選択された条件下で決定し、細胞外媒質を模倣するように選択された条件と比較することができる。
切断可能な結合基の1つのクラスは、還元又は酸化時に切断される酸化還元的に切断可能な結合基である。還元的に切断可能な結合基の一例は、ジスルフィド結合基(-S-S-)である。切断可能な結合基候補が、好適な「還元的に切断可能な結合基」であるかどうか、又は例えば特定のiRNA部分及び特定の標的指向性作用剤と共に使用するのに好適であるかどうかを決定するためには、本明細書に記載されている方法を参考することができる。例えば、候補は、細胞、例えば標的細胞中で観察されるだろう切断速度を模倣する当該技術分野で公知の試薬を使用して、ジチオトレイトール(DTT)又は他の還元剤と共にインキュベーションすることにより評価することができる。候補は、血液又は血清条件を模倣するように選択される条件下で評価することもできる。好ましい実施形態では、候補化合物は、血液中で多くとも10%切断される。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液(又は細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下)よりも、細胞において(又は細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で)少なくとも2、4、10、又は100倍、より急速に分解される。候補化合物の切断速度は、標準的酵素反応速度アッセイを使用して、細胞内媒質を模倣するように選択された条件下で決定し、細胞外媒質を模倣するように選択された条件と比較することができる。
ホスフェートに基づく切断可能な結合基
ホスフェートに基づく切断可能な結合基は、ホスフェート基を分解又は加水分解する作用剤により切断される。細胞のホスフェート基を切断する作用剤の例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。ホスフェートに基づく結合基の例は、-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-である。好ましい実施形態は、-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-である。好ましい実施形態は、-O-P(O)(OH)-O-である。これらの候補は、上記に記載されているものと同様な方法を使用して評価することができる。
ホスフェートに基づく切断可能な結合基は、ホスフェート基を分解又は加水分解する作用剤により切断される。細胞のホスフェート基を切断する作用剤の例は、細胞内のホスファターゼなどの酵素である。ホスフェートに基づく結合基の例は、-O-P(O)(ORk)-O-、-O-P(S)(ORk)-O-、-O-P(S)(SRk)-O-、-S-P(O)(ORk)-O-、-O-P(O)(ORk)-S-、-S-P(O)(ORk)-S-、-O-P(S)(ORk)-S-、-S-P(S)(ORk)-O-、-O-P(O)(Rk)-O-、-O-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-O-、-S-P(S)(Rk)-O-、-S-P(O)(Rk)-S-、-O-P(S)(Rk)-S-である。好ましい実施形態は、-O-P(O)(OH)-O-、-O-P(S)(OH)-O-、-O-P(S)(SH)-O-、-S-P(O)(OH)-O-、-O-P(O)(OH)-S-、-S-P(O)(OH)-S-、-O-P(S)(OH)-S-、-S-P(S)(OH)-O-、-O-P(O)(H)-O-、-O-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-O-、-S-P(S)(H)-O-、-S-P(O)(H)-S-、-O-P(S)(H)-S-である。好ましい実施形態は、-O-P(O)(OH)-O-である。これらの候補は、上記に記載されているものと同様な方法を使用して評価することができる。
酸で切断可能な結合基
酸で切断可能な結合基は、酸性条件下で切断される結合基である。好ましい実施形態では、酸で切断可能な結合基は、約6.5以下のpH(例えば、約6.0、5.5、又は5.0以下)を有する酸性環境中で、又は一般酸として作用することができる酵素などの作用剤により切断される。細胞では、エンドソーム及びリソソームなどの特定の低pH細胞小器官は、酸で切断可能な結合基に切断環境を供給することができる。酸で切断可能な結合基の例には、これらに限定されないが、ヒドラゾン、エステル、及びアミノ酸のエステルが含まれる。酸で切断可能な基は、一般式-C=NN-、C(O)O、又は-OC(O)を有していてもよい。好ましい実施形態は、エステル(アルコキシ基)の酸素に結合された炭素が、アリール基、置換アルキル基、又はジメチルペンチル若しくはt-ブチルなどの三級アルキル基である場合である。これらの候補は、上記に記載されているものと同様な方法を使用して評価することができる。
酸で切断可能な結合基は、酸性条件下で切断される結合基である。好ましい実施形態では、酸で切断可能な結合基は、約6.5以下のpH(例えば、約6.0、5.5、又は5.0以下)を有する酸性環境中で、又は一般酸として作用することができる酵素などの作用剤により切断される。細胞では、エンドソーム及びリソソームなどの特定の低pH細胞小器官は、酸で切断可能な結合基に切断環境を供給することができる。酸で切断可能な結合基の例には、これらに限定されないが、ヒドラゾン、エステル、及びアミノ酸のエステルが含まれる。酸で切断可能な基は、一般式-C=NN-、C(O)O、又は-OC(O)を有していてもよい。好ましい実施形態は、エステル(アルコキシ基)の酸素に結合された炭素が、アリール基、置換アルキル基、又はジメチルペンチル若しくはt-ブチルなどの三級アルキル基である場合である。これらの候補は、上記に記載されているものと同様な方法を使用して評価することができる。
エステルに基づく結合基
エステルに基づく切断可能な結合基は、細胞内のエステラーゼ及びアミダーゼなどの酵素により切断される。エステルに基づく切断可能な結合基の例には、これらに限定されないが、アルキレン、アルケニレン、及びアルキニレン基のエステルが含まれる。エステルの切断可能な結合基は、一般式-C(O)O-又は-OC(O)-を有する。これらの候補は、上記に記載されているものと同様な方法を使用して評価することができる。
エステルに基づく切断可能な結合基は、細胞内のエステラーゼ及びアミダーゼなどの酵素により切断される。エステルに基づく切断可能な結合基の例には、これらに限定されないが、アルキレン、アルケニレン、及びアルキニレン基のエステルが含まれる。エステルの切断可能な結合基は、一般式-C(O)O-又は-OC(O)-を有する。これらの候補は、上記に記載されているものと同様な方法を使用して評価することができる。
ペプチドに基づく切断基
ペプチドに基づく切断可能な結合基は、細胞内のペプチダーゼ及びプロテアーゼなどの酵素により切断される。ペプチドに基づく切断可能な結合基は、アミノ酸間で形成されて、オリゴペプチド(例えば、ジペプチド、トリペプチドなど)及びポリペプチドを産出するペプチド結合である。ペプチドに基づく切断可能な基は、アミド基(-C(O)NH-)を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレン、又はアルキニレン間で形成される場合がある。ペプチド結合は、アミノ酸間で形成されてペプチド及びタンパク質を産出する特別なタイプのアミド結合である。ペプチドに基づく切断基は、一般的に、アミノ酸間で形成されてペプチド及びタンパク質を産出するペプチドを産出するペプチド結合(つまり、アミド結合)に限定され、アミド官能基全体は含まない。ペプチドに基づく切断可能な結合基は、一般式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-を有し、RA及びRBは、2つの隣接したアミノ酸のR基である。これらの候補は、上記に記載されているものと同様な方法を使用して評価することができる。
ペプチドに基づく切断可能な結合基は、細胞内のペプチダーゼ及びプロテアーゼなどの酵素により切断される。ペプチドに基づく切断可能な結合基は、アミノ酸間で形成されて、オリゴペプチド(例えば、ジペプチド、トリペプチドなど)及びポリペプチドを産出するペプチド結合である。ペプチドに基づく切断可能な基は、アミド基(-C(O)NH-)を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレン、又はアルキニレン間で形成される場合がある。ペプチド結合は、アミノ酸間で形成されてペプチド及びタンパク質を産出する特別なタイプのアミド結合である。ペプチドに基づく切断基は、一般的に、アミノ酸間で形成されてペプチド及びタンパク質を産出するペプチドを産出するペプチド結合(つまり、アミド結合)に限定され、アミド官能基全体は含まない。ペプチドに基づく切断可能な結合基は、一般式-NHCHRAC(O)NHCHRBC(O)-を有し、RA及びRBは、2つの隣接したアミノ酸のR基である。これらの候補は、上記に記載されているものと同様な方法を使用して評価することができる。
リガンド
多種多様な実体を、本発明のオリゴヌクレオチド及び脂質に結合することができる。好ましい部分は、直接的に又は介在的テザーを介して間接的に、好ましくは共有結合で結合されるリガンドである。
多種多様な実体を、本発明のオリゴヌクレオチド及び脂質に結合することができる。好ましい部分は、直接的に又は介在的テザーを介して間接的に、好ましくは共有結合で結合されるリガンドである。
好ましい実施形態では、リガンドは、それが組み込まれる分子の分布、標的指向性、又は寿命を変更する。好ましい実施形態では、リガンドは、例えば、そのようなリガンドが存在しない種と比較して、選択された標的、例えば、分子、細胞若しくは細胞タイプ、区画、例えば細胞若しくは器官区画、組織、器官、又は身体の領域に対する親和性の増強を提供する。選択された標的に対する親和性の増強を提供するリガンドも、標的指向性リガンドと呼ばれる。本発明の脂質に結合するための好ましいリガンドは、標的指向性リガンドである。
幾つかのリガンドは、エンドソーム性特性を有していてもよい。エンドソーム性リガンドは、エンドソームの溶解、及び/又は本発明の組成物若しくはその成分をエンドソームから細胞の細胞質に輸送することを促進する。エンドソーム性リガンドは、pH依存性の膜活性及び膜融合性を示すポリアニオン性ペプチド又はペプチド模倣体であってもよい。ある実施形態では、エンドソーム性リガンドは、エンドソームのpHでその活性立体構造をとると推定される。「活性」立体構造とは、エンドソーム性リガンドが、エンドソームの溶解、及び/又は本発明の組成物若しくはその成分をエンドソームから細胞の細胞質に輸送することを促進する立体構造である。例示的なエンドソーム性リガンドには、GALAペプチド(Subbarao et al., Biochemistry, 1987, 26: 2964-2972)、EALAペプチド(Vogel et al., J. Am. Chem. Soc., 1996, 118: 1581-1586)、及びそれらの誘導体(Turk et al., Biochem. Biophys. Acta, 2002, 1559: 56-68)が含まれる。ある実施形態では、エンドソーム性成分は、pHの変化に応じて電荷又はプロトン化の変化を起こす化学基(例えば、アミノ酸)を含有していてもよい。エンドソーム性成分は、直鎖であってもよく又は分岐していてもよい。ペプチドに基づくエンドソーム性リガンドの例示的な一次配列は、表4に示されている。
好ましいリガンドは、輸送、ハイブリダイゼーション、及び特異性の特性を向上することができ、その結果生じる天然若しくは修飾オリゴリボヌクレオチド、あるいは本明細書に記載されているモノマー及び/又は天然若しくは修飾リボヌクレオチドの任意の組合せを含むポリマー分子のヌクレアーゼ耐性を向上することもできる。
リガンドは、一般的に、例えば取り込みを増強するための治療用修飾因子;診断用化合物又は例えば分布を監視するためのリポーター基;架橋剤;及びヌクレアーゼ耐性付与部分を含むことができる。一般的な例には、脂質、ステロイド、ビタミン、糖、タンパク質、ペプチド、ポリアミン、及びペプチド模倣体が含まれる。
リガンドには、タンパク質(例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)、低密度リポタンパク質(LDL)、高密度リポタンパク質(HDL)、又はグロブリン)などの天然物質;炭水化物(例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリン、又はヒアルロン酸);又は脂質が含まれていてもよい。また、リガンドは、合成ポリマー、例えば合成ポリアミノ酸、オリゴヌクレオチド(例えば、アプタマー)などの組換え又は合成分子であってもよい。ポリアミノ酸の例には、ポリリシン(PLL)、ポリL-アスパラギン酸、ポリL-グルタミン酸、スチレン-マレイン酸無水物コポリマー、ポリ(L-ラクチド-コ-グリコリエド(glycolied))コポリマー、ジビニルエーテル-無水マレイン酸コポリマー、(N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドコポリマー(HMPA)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリウレタン、ポリ(2-エチルアクリル酸)、N-イソプロピルアクリルアミドコポリマー、又はポリホスファジンが含まれる。ポリアミンの例には、ポリエチレンイミン、ポリリシン(PLL)、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬似ペプチド-ポリアミン、ペプチド模倣ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、陽イオン性脂質、陽イオン性ポルフィリン、ポリアミンの四級塩、又はアルファヘリックスペプチドが含まれる。
リガンドは、標的指向性基、例えば細胞又は組織標的指向性作用剤、例えば腎臓細胞などの指定された細胞タイプに結合するレクチン、糖タンパク質、脂質、又はタンパク質、例えば抗体を含むこともできる。標的指向性基は、チロトロピン、メラノトロピン、レクチン、糖タンパク質、サーファクタントタンパク質A、ムチン炭水化物、多価性ラクトース、多価性ガラクトース、N‐アセチルガラクトサミン、N-アセチル-グルコサミン(gulucosamine)多価性マンノース、多価性フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価性ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸エステル、ビタミンB12、ビオチン、RGDペプチド、RGDペプチド模倣体、又はアプタマーであってもよい。表5には、標的指向性リガンド及びそれらの関連受容体の幾つかの例が示されている。
リガンドの他の例には、以下のものが含まれる:染料、挿入剤(例えば、アクリジン)、架橋剤(例えば、プソラレン、マイトマイシンC)、ポルフィリン(TPPC4、テキサフィリン、サフィリン)、多環式芳香族炭化水素(例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン)、人工エンドヌクレアーゼ(例えば、EDTA)、親油性分子、例えばコレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、1-ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、1,3-ビス-O(ヘキサデシル)グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、1、3-プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、O3-(オレオイル)リトコール酸、O3-(オレオイル)コレン酸、ジメトキシトリチル、又はフェノキサジン)、及びペプチド結合体(例えば、アンテナペディアペプチド、Tatペプチド)、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、PEG(例えば、PEG-40K)、MPEG、[MPEG]2、ポリアミノ、アルキル置換アルキル、放射性同位体標識マーカー、酵素、ハプテン(例えば、ビオチン)、輸送/吸収促進剤(例えば、アスピリン、ビタミンE、葉酸)、合成リボヌクレアーゼ(例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン-イミダゾール結合体、テトラアザ大環状分子のEu3+複合体)、ジニトロフェニル、HRP、又はAP。
リガンドは、タンパク質、例えば糖タンパク質、又はペプチド、例えば共リガンドに対する特異的親和性を有する分子、又は抗体、例えば癌細胞、内皮細胞、若しくは骨細胞などの指定された細胞タイプに結合する抗体であってもよい。また、リガンドには、ホルモン及びホルモン受容体が含まれていてもよい。また、それらには、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、補助因子、多価性ラクトース、多価性ガラクトース、N‐アセチルガラクトサミン、N-アセチル-グルコサミン多価性マンノース、多価性フコース、又はアプタマーなどの非ペプチド種が含まれていてもよい。リガンドは、例えば、リポポリサッカリド、p38 MAPキナーゼの活性化因子、又はNF-κBの活性化因子であってもよい。
リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格を破壊することにより、例えば、細胞の微小管、微小繊維、及び/又は中間径フィラメントを破壊することにより、iRNA作用剤の細胞への取り込みを増加させることができる物質、例えば薬物であってもよい。薬物は、例えば、タキソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャプラキノリド(japlakinolide)、ラトランクリンA、ファロイジン、スインホリドA、インダノシン、又はミオセルビン(myoservin)であってもよい。
例えば、リガンドは、炎症反応を活性化することにより、iRNA作用剤の細胞への取り込みを増加させることができる。そのような効果有するだろう例示的なリガンドには、腫瘍壊死因子アルファ(TNFalpha)、インターロイキン-1ベータ、又はガンマインターフェロンが含まれる。
1つの態様では、リガンドは、脂質又は脂質に基づく分子である。そのような脂質又は脂質に基づく分子は、好ましくは血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)に結合する。HSA結合リガンドは、結合体が、標的組織、例えば体内の非腎臓標的組織に分布することを可能にする。例えば、標的組織は、肝臓の実質細胞を含む肝臓であってもよい。HSAに結合することができる他の分子を、リガンドとして使用することもできる。例えば、ネプロキシン(neproxin)又はアスピリンを使用することができる。脂質又は脂質に基づくリガンドは、(a)結合体の分解に対する耐性を増加させることができ、(b)標的細胞又は細胞膜に対する標的指向性及び輸送を増加させることができ、及び/又は(c)血清タンパク質、例えばHSAに対する結合を調節するために使用することができる。
脂質に基づくリガンドは、標的組織に対する結合体の結合を調節、例えば制御するために使用することができる。例えば、HSAにより強く結合する脂質又は脂質に基づくリガンドは、腎臓を標的とする可能性はそれほどなく、したがって体内から除去される可能性もそれほどないだろう。HSAにそれほど強く結合しない脂質又は脂質に基づくリガンドは、結合体を腎臓に標的化するために使用することができる。
好ましい実施形態では、脂質に基づくリガンドは、HSAに結合する。好ましくは、脂質に基づくリガンドは、結合体が好ましくは非腎臓組織に分布するように、十分な親和性でHSAに結合する。しかしながら、親和性は、HSA-リガンド結合が逆行できないほど強くないことが好ましい。
別の好ましい実施形態では、脂質に基づくリガンドは、HSAに対して弱く結合するか又は全く結合せず、そのため結合体は、好ましくは腎臓に分布するだろう。腎臓細胞を標的とする他の部分も、脂質に基づくリガンドの代わり又はそれに加えて使用することができる。
別の態様では、リガンドは、標的細胞、例えば増殖細胞によって取り込まれる部分、例えばビタミンである。これらは、例えば悪性又は非悪性タイプの望ましくない細胞増殖を特徴とする障害、例えば癌細胞を治療するのに特に有用である。例示的なビタミンには、ビタミンA、E、及びKが含まれる。他の例示的なビタミンには、ビタミンB、例えば葉酸、B12、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、又は癌細胞により取り込まれる他のビタミン又は栄養素が含まれる。HAS、低密度リポタンパク質(LDL)、及び高密度リポタンパク質(HDL)も含まれる。
別の態様では、リガンドは、細胞浸透剤、好ましくはヘリックス型の細胞浸透剤である。好ましくは、作用剤は、両親媒性である。例示的な作用剤は、tat又はアンテノペディア(antennopedia)などのペプチドである。作用剤がペプチドである場合、ペプチジル模倣物質、逆転異性体、非ペプチド又は擬似ペプチド結合、及びD-アミノ酸の使用を含む修飾を施すことができる。好ましくは、ヘリックス型作用剤は、好ましくは親油性相及び疎油性相を有するアルファヘリックス作用剤である。
リガンドは、ペプチド又はペプチド模倣物質であってもよい。ペプチド模倣物質(本明細書ではオリゴペプチド模倣物質とも呼ばれる)は、天然ペプチドに類似する明確な三次元構造にフォールディングすることが可能な分子である。ペプチド又はペプチド模倣部分は、約5~50個のアミノ酸の長さ、例えば約5、10、15、20、25、30、35、40、45、又は50個のアミノ酸の長さであってもよい(例えば、表6を参照)。
ペプチド又はペプチド模倣物質は、例えば、細胞浸透ペプチド、陽イオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、又は疎水性ペプチド(例えば、主としてTyr、Trp、又はPheで構成される)であってもよい。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、構造規制ペプチド、又は架橋ペプチドであってもよい。別の選択肢では、ペプチド部分は、疎水性膜移行配列(MTS)を含んでいてもよい。例示的な疎水性MTS含有ペプチドは、アミノ酸配列AAVALLPAVLLALLAPを有するRFGFである。疎水性MTSを含有するRFGF類似体(例えば、アミノ酸配列AALLPVLLAAP)も、標的指向性部分であり得る。ペプチド部分は、ペプチド、オリゴヌクレオチド、及びタンパク質を含む大型極性分子を、細胞膜の向こう側に運搬することができる「送達」ペプチドであってもよい。例えば、HIV Tatタンパク質に由来する配列(GRKKRRQRRRPPQ)及びショウジョウバエアンテナペディア(Drosophila Antennapedia)タンパク質に由来する配列(RQIKIWFQNRRMKWKK)は、送達ペプチドとして機能可能であることが見出されている。ペプチド又はペプチド模倣物質は、ファージディスプレイライブラリー又は1-ビーズ-1-化合物(OBOC)コンビナトリアルライブラリーから特定されたペプチドなどの、DNAのランダム配列によりコードされていてもよい。(Lam et al., Nature, 354:82-84, 1991)。好ましくは、組み込まれたモノマー単位によりiRNA作用剤に結合されたペプチド又はペプチド模倣物質は、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸(RGD)-ペプチド又はRGD模倣体などの細胞標的指向性ペプチドである。ペプチド部分は、約5個のアミノ酸~約40個のアミノ酸の長さの範囲であり得る。ペプチド部分は、安定性又は直接的な立体構造特性を増加させるなどの、構造修飾を有していてもよい。下記に記載されている構造修飾のいずれかを使用することができる。
RGDペプチド部分は、内皮系腫瘍細胞又は乳癌腫瘍細胞などの腫瘍細胞を標的とするために使用することができる(Zitzmann et al., Cancer Res., 62:5139-43, 2002)。RGDペプチドは、肺、腎臓、脾臓、又は肝臓を含む、様々な他の組織の腫瘍に対するiRNA作用剤の標的化を容易にすることができる(Aoki et al., Cancer Gene Therapy 8:783-787, 2001)。好ましくは、RGDペプチドは、腎臓に対するiRNA作用剤の標的化を容易にするだろう。RGDペプチドは、直鎖であってもよく又は環式であってもよく、修飾されていてもよく、例えば、特定の組織に対する標的化を容易にするためにグリコシル化又はメチル化されていてもよい。例えば、グリコシル化RGDペプチドは、αVβ3を発現する腫瘍細胞にiRNA作用剤を送達することができる(Haubner et al., Jour. Nucl. Med., 42:326-336, 2001)。
増殖細胞に豊富にあるマーカーを標的とするペプチドを使用することができる。例えば、RGD含有ペプチド及びペプチド模倣物は、癌細胞、特にαvβ3インテグリンを提示する細胞を標的とすることができる。したがって、RGDペプチド、RGDを含有する環状ペプチド、D-アミノ酸を含有するRGDペプチド、並びに合成RGD模倣体を使用することができる。RGDに加えて、αvβ3インテグリンリガンドを標的とする他の部分を使用することができる。一般的に、そのようなリガンドは、増殖細胞及び血管新生(angiogeneis)を制御するために使用することができる。PECAM-1、VEGF、又は他の癌遺伝子、例えば癌遺伝子を標的とするこのタイプのリガンドの好ましい結合体は、本明細書に記載されている。
「細胞浸透ペプチド」は、細胞、例えば細菌細胞又は真菌細胞などの微生物細胞、又はヒト細胞などの哺乳動物細胞に浸透することが可能である。微生物細胞浸透ペプチドは、例えば、α-ヘリックス直鎖ペプチド(例えば、LL-37又はセロピンP1(Ceropin P1))、ジスルフィド結合含有ペプチド(例えば、α-デフェンシン、β-デフェンシン、又はバクテネシン(bactenecin))、又は1つ又は2つの支配的なアミノ酸のみを含有するペプチド(例えば、PR-39又はインドリシジン)であってもよい。細胞浸透ペプチドは、核移行シグナル(NLS)を含むこともできる。例えば、細胞浸透ペプチドは、HIV-1 gp41の融合ペプチドドメイン及びSV40大型T抗原のNLSに由来する、MPGなどの二分両親媒性ペプチドであってもよい。
1つの実施形態では、iRNA作用剤及び/又は担体オリゴマーに結合された標的指向性ペプチドは、両親媒性α-ヘリックスペプチドであってもよい。例示的な両親媒性α-ヘリックスペプチドには、これらに限定されないが、以下のものが含まれる:セクロピン、リコトキシン(lycotoxin)、パラダキシン(paradaxin)、ブホリン、CPF、ボンビニン-様ペプチド(BLP)、カテリシジン、セラトトキシン(ceratotoxin)、S.クラバ(S.clava)ペプチド、メクラウナギ腸抗菌ペプチド(HFIAP)、マガイニン(magainine)、ブレビニン-2、デルマセプチン、メリチン、プレウロシジン、H2Aペプチド、ツメガエル(Xenopus)ペプチド、エスクレンチニス-1(esculentinis-1)、及びカエリン。好ましくは、多くの要因が、ヘリックス安定性の完全性を維持するとみななされるだろう。例えば、最大数のヘリックス安定化残基(例えば、leu、ala、又はlys)が使用され、最小数のヘリックス不安定化残基(例えば、プロリン、又は環状モノマー単位)が使用されるだろう。キャッピング残基が考慮されるだろう(例えば、Glyは、例示的なN-キャッピング残基であり、及び/又はC末端アミド化は、追加的なH-結合を提供してヘリックスを安定させるために使用することができる)。i±3又はi±4の位置で隔てられている反対の電荷を有する残基間の塩橋形成は、安定性を提供することができる。例えば、リジン、アルギニン、ホモアルギニン、オルニチン、又はヒスチジンなどの陽イオン性残基は、陰イオン性残基であるグルタメート又はアスパルテートと塩橋を形成することができる。
ペプチド及びペプチド模倣リガンドには、天然ペプチド又は修飾ペプチド、例えば、D又はLペプチド;α、β、又はγペプチド;N-メチルペプチド;アザペプチド;1つ以上の尿素、チオ尿素、カルバメート、又はスルホニル尿素結合で置換されている1つ以上のアミド結合、つまりペプチド結合を有するペプチド;又は環状ペプチドを有するリガンドが含まれる。
標的指向性リガンドは、特定の受容体を標的可能なあらゆるリガンドであり得る。その例は、葉酸エステル、GalNAc、ガラクトース、マンノース、マンノース-6P、GalNAcクラスター、マンノースクラスター、ガラクトースクラスターなどの糖クラスター、又はアパタマー(apatamer)である。クラスターは、複数の糖単位の組合せである。標的指向性リガンドには、インテグリン受容体リガンド、ケモカイン受容体リガンド、トランスフェリン、ビオチン、セロトニン受容体リガンド、PSMA、エンドセリン、GCPII、ソマトスタチン、LDL及びHDLリガンドも含まれる。また、リガンドは、核酸、例えばアプタマーに基づいていてもよい。アプタマーは、未修飾であってもよく、又は本明細書に開示されている修飾の任意の組合せを有していてもよい。
エンドソーム放出剤には、イミダゾール、ポリ又はオリゴイミダゾール、PEI、ペプチド、膜融合性ペプチド、ポリカボキシレート(polycaboxylate)、ポリアカチオン(polyacation)、マスクオリゴ又はポリカチオン又はアニオン、アセタール、ポリアセタール、ケタール/ポリケチアール(polyketyal)、オルトエステル、マスク又は非マスクカチオン又はアニオン電荷を有するポリマー、マスク又は非マスクカチオン又はアニオン電荷を有するデンドリマーが含まれる。
エンドソーム放出剤には、イミダゾール、ポリ又はオリゴイミダゾール、PEI、ペプチド、膜融合性ペプチド、ポリカボキシレート(polycaboxylate)、ポリアカチオン(polyacation)、マスクオリゴ又はポリカチオン又はアニオン、アセタール、ポリアセタール、ケタール/ポリケチアール(polyketyal)、オルトエステル、マスク又は非マスクカチオン又はアニオン電荷を有するポリマー、マスク又は非マスクカチオン又はアニオン電荷を有するデンドリマーが含まれる。
PKモジュレーターとは、薬物動態学的モジュレーターを表す。PKモジュレーターには、脂肪親和物、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、PEG、ビタミンなどが含まれる。例示的なPKモジュレーターには、これらに限定されないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンE、ビオチンなどが含まれる。多数のホスホロチオアート結合を含むオリゴヌクレオチドも、血清タンパク質に結合することが知られており、したがって、骨格に複数のホスホロチオアート結合を含む短鎖オリゴヌクレオチド、例えば約5塩基、10塩基、15塩基、又は20塩基のオリゴヌクレオチドも、リガンドとして(例えば、PK調節リガンドとして)本発明に適用可能である。
加えて、血清成分(例えば、血清タンパク質)に結合するアプタマーも、PK調節リガンドとして本発明に適用可能である。
本発明に適用可能な他のリガンドは、以下の文献に記載されている:2004年8月10日に出願された同時係属の米国特許出願第10/916,185号;2004年9月21日に出願された米国特許出願第10/946,873号;2007年8月3日に出願された米国特許出願第10/833,934号;2005年4月27日に出願された米国特許出願第11/115,989号、及び2007年11月21日に出願された米国特許出願第11/944,227号、これらは、あらゆる目的のために参照によりこれらの全体が組み込まれる。
複数のリガンドが存在する場合、リガンドは、全て同じ特性を有していてもよく、全てが異なる特性を有していてもよく、又は幾つかが異なる特性を有し、その一方で他のリガンドは同じ特性を有していてもよい。例えば、リガンドは、標的指向特性を有していてもよく、エンドソーム的活性を有していてもよく、又はPK調節特性を有していてもよい。
好ましい実施形態では、リガンドは全て異なる特性を有する。リガンドは、種々の場所で、例えば3’-末端、5’-末端、及び/又は内部位置で、オリゴヌクレオチドに結合させることができる。好ましい実施形態では、リガンドは、介在性テザーを介してオリゴヌクレオチドに結合している。成長しつつある鎖にモノマーが組み込まれる場合、リガンド又はテザーリガンドは、前記モノマーに存在してもよい。幾つかの実施形態では、リガンドは、「前駆体」モノマーが、成長しつつある鎖に組み込まれた後で、前記「前駆体」モノマーに結合されることにより組み込まれてもよい。例えば末端がアミノであるテザー(つまり、リガンドが結合されていない)、例えばTAP-(CH2)nNH2を有するモノマーを、成長しつつあるセンス又はアンチセンス鎖に組み込むことができる。その後の作業で、つまり前駆体モノマーが鎖に組み込まれた後で、リガンドの求電子基を前駆体モノマーのテザーの末端求核基と結合させることにより、その後求電子基、例えばペンタフルオロフェニルエステル又はアルデヒド基を有するリガンドを前駆体モノマーに結合させることができる。
二本鎖オリゴヌクレオチドの場合、リガンドは、一方又は両方の鎖に結合させることができる。幾つかの実施形態では、二本鎖iRNA作用剤は、センス鎖に結合されたリガンドを含有する。他の実施形態では、二本鎖iRNA作用剤は、アンチセンス鎖に結合されたリガンドを含有する。
幾つかの実施形態では、リガンドは、核酸分子の核酸塩基、糖部分、又はヌクレオシド間結合に結合させることができる。プリン核酸塩基又はその誘導体に対する結合は、環内及び環外原子を含む任意の位置に生じてもよい。幾つかの実施形態では、プリン核酸塩基の2-、6-、7-、又は8位が、結合部分に結合している。また、ピリミジン核酸塩基又はその誘導体に対する結合は、任意の位置で生じてもよい。幾つかの実施形態では、ピリミジン核酸塩基の2-、5-、及び6位を、結合部分と置換することができる。ヌクレオシドの糖部分に対する結合は、任意の炭素原子で生じてもよい。結合部分に結合させることができる糖部分の炭素原子の例には、2’、3’、及び5’炭素原子が含まれる。脱塩基残基などの1’位も、結合部分に結合させることができる。ヌクレオシド間結合も、結合部分を保持することができる。リン含有結合(例えば、ホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオタート(phosphorodithiotate)、及びホスホロアミデートなど)の場合、結合部分は、リン原子に直接結合させることができるか、又はリン原子に結合しているO、N、又はS原子に結合させることができる。アミン又はアミド含有ヌクレオシド間結合(例えば、PNA)の場合、結合部分は、アミン又はアミドの窒素原子に、又は隣接する炭素原子に結合させることができる。
オリゴマー化合物の結合体を調製するための多数の方法が存在する。一般的に、オリゴマー化合物は、オリゴマー化合物の反応基(例えば、OH、SH、アミン、カルボキシル、及びアルデヒドなど)を、結合部分の反応基と接触させることにより、結合部分に結合される。幾つかの実施形態では、1つの反応基は求電子性であり、他方は求核性である。
例えば、求電子基は、カルボニル含有官能性であってもよく、求核基は、アミン又はチオールであってもよい。核酸と、結合基を有する及び結合基を有しない関連オリゴマー化合物とを結合させるための方法は、例えば、Manoharan in Antisense Research and Applications, Crooke and LeBleu, eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1993, Chapter 17などの文献に詳細に記載されており、これは、参照により本明細書にその全体が組み込まれる。
オリゴヌクレオチド結合体の調製を教示する代表的な米国特許には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる:米国特許第4,828,979号;同第4,948,882号;同第5,218,105号;同第5,525,465号;同第5,541,313号;同第5,545,730号;同第5,552,538号;同第5,578,717,5,580,731号;同第5,580,731号;同第5,591,584号;同第5,109,124号;同第5,118,802号;同第5,138,045号;同第5,414,077号;同第5,486,603号;同第5,512,439号;同第5,578,718号;同第5,608,046号;同第4,587,044号;同第4,605,735号;同第4,667,025号;同第4,762,779号;同第4,789,737号;同第4,824,941号;同第4,835,263号;同第4,876,335号;同第4,904,582号;同第4,958,013号;同第5,082,830号;同第5,112,963号;同第5,214,136号;同第5,082,830号;同第5,112,963号;同第5,149,782号;同第5,214,136号;同第5,245,022号;同第5,254,469号;同第5,258,506号;同第5,262,536号;同第5,272,250号;同第5,292,873号;同第5,317,098号;同第5,371,241、同第5,391,723号;同第5,416,203号、同第5,451,463号;同第5,510,475号;同第5,512,667号;同第5,514,785号;同第5,565,552号;同第5,567,810号;同第5,574,142号;同第5,585,481号;同第5,587,371号;同第5,595,726号;同第5,597,696号;同第5,599,923号;同第5,599,928号;同第5,672,662号;同第5,688,941号;同第5,714,166号;同第6,153,737号;同第6,172,208号;同第6,300,319号;同第6,335,434号;同第6,335,437号;同第6,395,437号;同第6,444,806号;同第6,486,308号;同第6,525,031号;同第6,528,631号;同第6,559,279号;これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
核酸-脂質粒子の特徴
ある実施形態では、本発明は、核酸が脂質層内に封入されている脂質封入核酸粒子を生成するための方法及び組成物に関する。siRNAオリゴヌクレオチドを組込むそのような核酸-脂質粒子は、以下を含む様々な生物物理学的パラメーターを使用して特徴付けられる:(1)薬物対脂質比;(2)封入化効率;及び(3)粒径。高い薬物対脂質比、高い封入化効率、良好なヌクレアーゼ耐性及び血清安定性、並びに制御可能な粒径、一般的に200nm未満の直径が望ましい。加えて、ヌクレアーゼ耐性を付与するための核酸修飾は、多くの場合、限定的な耐性を提供するに過ぎないものの、治療薬の費用に追加されるため、核酸ポリマーの性質は重要である。別様の記載がない限り、これらの基準は、本明細書では以下のように計算される。
ある実施形態では、本発明は、核酸が脂質層内に封入されている脂質封入核酸粒子を生成するための方法及び組成物に関する。siRNAオリゴヌクレオチドを組込むそのような核酸-脂質粒子は、以下を含む様々な生物物理学的パラメーターを使用して特徴付けられる:(1)薬物対脂質比;(2)封入化効率;及び(3)粒径。高い薬物対脂質比、高い封入化効率、良好なヌクレアーゼ耐性及び血清安定性、並びに制御可能な粒径、一般的に200nm未満の直径が望ましい。加えて、ヌクレアーゼ耐性を付与するための核酸修飾は、多くの場合、限定的な耐性を提供するに過ぎないものの、治療薬の費用に追加されるため、核酸ポリマーの性質は重要である。別様の記載がない限り、これらの基準は、本明細書では以下のように計算される。
核酸対脂質比は、同じ容積中の脂質量で除算された明確な調製物容積中の核酸の量である。これは、1モル当たりのモル数、又は1重量当たりの重量、又は1モルあたりの重量に基づいていてもよい。最終的な投与準備済製剤の場合、核酸:脂質比は、透析、クロマトグラフィー、及び/又は酵素(例えば、ヌクレアーゼ)消化を使用して、外部核酸をできるだけ多く除去した後で計算される。
封入化効率とは、最終的投与適格製剤の薬物対脂質比で除算された、開始混合物の薬物対脂質比を指す。これは相対的効率の尺度である。絶対的効率の尺度の場合、最終的には投与適格製剤となる開始混合物に添加された核酸の総量を計算することもできる。製剤プロセス中に失われた脂質量を計算することもできる。効率は、製剤の廃棄物及び費用の尺度である。
サイズとは、形成された粒子のサイズ(直径)を示す。サイズ分布は、Nicomp社製370型サブマイクロメートル粒径測定器で準弾性光散乱(QELS)を使用して決定することができる。新生物及び炎症部位などの血管新生化組織(漏出)組織に分布させるためには、200nm未満の粒子が好ましい。
医薬組成物
本発明の脂質粒子は、特に治療薬と結合している場合、例えば、投与経路及び標準的薬務に従って選択される、生理食塩水又はリン酸緩衝液などの薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、又は担体をさらに含む医薬組成物として製剤化することができる。
本発明の脂質粒子は、特に治療薬と結合している場合、例えば、投与経路及び標準的薬務に従って選択される、生理食塩水又はリン酸緩衝液などの薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、又は担体をさらに含む医薬組成物として製剤化することができる。
特定の実施形態では、本発明の脂質-核酸粒子を含む医薬組成物は、標準的技術により調製され、薬学的に許容される担体をさらに含む。一般的に、通常の生理食塩水が、薬学的に許容される担体として使用されるだろう。他の好適な担体には、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどの、安定性の増強のための糖タンパク質を含む、例えば、水、緩衝化水、0.9%生理食塩水、及び0.3%グリシンなどが含まれる。生理食塩水又は他の塩含有担体を含む組成物では、担体は、好ましくは脂質粒子形成後に添加される。したがって、脂質-核酸組成物が形成された後、組成物は、通常の生理食塩水などの薬学的に許容される担体で希釈することができる。
その結果生じる医薬品は、従来の周知の滅菌技術により滅菌することができる。その後、水溶液を使用用に包装するか又は無菌条件下でろ過して凍結乾燥することができ、凍結乾燥された調製物は、投与前に無菌水溶液と混合される。組成物は、pH調整剤及び緩衝剤並びに浸透圧調整剤など、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどの、生理学的条件を近似するために必要とされる薬学的に許容される補助物質を含有していてもよい。加えて、脂質懸濁液は、保管時にフリーラジカル及び脂質過酸化損傷から脂質を保護する脂質保護剤を含んでいてもよい。α-トコフェロール、及びフェリオキサミンなどの水溶性鉄特異的キレート剤などの親油性フリーラジカル失活剤が好適である。
医薬製剤中の脂質粒子又は脂質-核酸粒子の濃度は、幅広く異なっていてもよく、つまり、約0.01%未満、通常は約0.05~5%又は少なくとも約0.05~5%から10~30重量%までであり、選択される特定の投与方法に従って、主として液量、粘性などにより選択されるだろう。例えば、濃度を増加させて、治療に伴う液体負荷を低下させることができる。これは、アテローム性動脈硬化に関連するうっ血性心不全又は重症高血圧有する患者に特に望ましい場合がある。あるいは、刺激性脂質で構成された複合体を低濃度に希釈して、投与部位の炎症を軽減することができる。1つの群の実施形態では、核酸には標識が結合されており、診断(相補的核酸の存在を示すことによる)に使用されるだろう。この場合、投与される複合体の量は、使用される特定の標識、診断する疾患状態、及び臨床医の判断に依存することになるが、一般的に、体重1キログラム当たり約0.01~約50mg、好ましくは体重1キログラム当たり約0.1~約5mgだろう。
上述のように、本発明の脂質-治療薬(例えば、核酸)粒子は、ポリエチレングリコール(PEG)修飾リン脂質、PEG-セラミド、又はガングリオシドGM1修飾脂質、又は凝集を防止若しくは制限するのに有効な他の脂質を含んでいてもよい。そのような成分の付加は、単に複合体凝集を防止するだけではない。むしろ、それは、循環寿命を増加させ、標的組織への脂質-核酸組成物の送達を増加させるための手段を提供することもできる。
本発明は、キットの形態の脂質-治療薬組成物も提供する。キットは、典型的には、キットの種々の構成要素を収納するために区画化された容器で構成されるだろう。キットは、本発明の粒子又は医薬組成物を、好ましくは脱水又は濃縮形態で、それらの再水和又は希釈及び投与に関する説明書と共に含有するだろう。ある実施形態では、粒子は活性薬剤を含むが、他の実施形態では、粒子は活性薬剤を含まない。
製造方法
本発明の方法及び組成物には、下記で又は添付の実施例に記載されている特定の陽イオン性脂質、合成、調製、及び特徴付けが使用される。加えて、本発明は、治療薬、例えば核酸に結合された脂質粒子を含む脂質粒子を調製する方法を提供する。本明細書に記載されている方法では、脂質の混合物を、核酸の緩衝水溶液と混合して、脂質粒子に封入された核酸を含有する中間混合物を生成し、封入された核酸は、約3重量%~約25重量%、好ましくは5~15重量%の核酸/脂質比で存在する。中間混合物は、随意にサイズ化されて、脂質部分が、好ましくは30~150nm、より好ましくは約40~90nmの直径を有する単層膜小胞である脂質-封入核酸粒子を取得することができる。その後、pHを上昇させて、脂質-核酸粒子の表面電荷の少なくとも一部を中和し、したがって少なくとも部分的に表面中和された脂質-封入核酸組成物を提供する。
本発明の方法及び組成物には、下記で又は添付の実施例に記載されている特定の陽イオン性脂質、合成、調製、及び特徴付けが使用される。加えて、本発明は、治療薬、例えば核酸に結合された脂質粒子を含む脂質粒子を調製する方法を提供する。本明細書に記載されている方法では、脂質の混合物を、核酸の緩衝水溶液と混合して、脂質粒子に封入された核酸を含有する中間混合物を生成し、封入された核酸は、約3重量%~約25重量%、好ましくは5~15重量%の核酸/脂質比で存在する。中間混合物は、随意にサイズ化されて、脂質部分が、好ましくは30~150nm、より好ましくは約40~90nmの直径を有する単層膜小胞である脂質-封入核酸粒子を取得することができる。その後、pHを上昇させて、脂質-核酸粒子の表面電荷の少なくとも一部を中和し、したがって少なくとも部分的に表面中和された脂質-封入核酸組成物を提供する。
上述のように、これらの陽イオン性脂質の幾つかは、アミノ基のpKa未満のpHで荷電され、アミノ基のpKaを超えたpHでは実質的に中性であるアミノ脂質である。これらの陽イオン性脂質は、滴定可能な陽イオン性脂質と名付けられており、二段階プロセスを使用して本発明の製剤に使用することができる。最初に、脂質小胞は、核酸の存在下で滴定可能な陽イオン性脂質及び他の小胞成分を用いて、より低いpHで形成することができる。このようにして、小胞は、核酸を封入及び捕捉するだろう。次に、新しく形成された小胞の表面電荷は、滴定可能な陽イオン性脂質が示すpKaを超えるレベルに、つまり生理学的なpH以上に、培地のpHを増加させることにより中和することができる。このプロセスの特に有利な態様には、あらゆる表面吸着核酸の容易な除去、及びその結果生じる中性表面を有する核酸送達媒体が両方とも含まれる。中性表面を有するリポソーム又は脂質粒子は、循環からの急速なクリアランスを回避し、陽イオン性リポソーム製剤に伴う特定の毒性を回避することが予測される。核酸-脂質粒子の製剤における、そのような滴定可能な陽イオン性脂質のこれらの使用に関するさらなる詳細は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第6,287,591号及び米国特許第6,858,225号に提供されている。
このようにして形成された小胞は、高含有量の核酸を有する均一小胞サイズの製剤を供給することがさらに注目される。加えて、小胞は、約30~約150nm、より好ましくは約30~約90nmの範囲のサイズを有する。
任意の特定の理論により束縛されることを意図していないが、高効率の核酸封入化は、低pHでの静電的相互作用の結果であると考えられる。酸性pH(例えば、pH4.0)では、小胞表面は、荷電されており、静電的相互作用により核酸の一部に結合する。外部酸性緩衝液が、より中性の緩衝液(例えば、pH7.5)と交換されると、脂質粒子又はリポソームの表面は中和され、あらゆる外部核酸の除去が可能になる。製剤プロセスに関するより詳細な情報は、種々の出版物に提供されている(例えば、米国特許第6,287,591号及び米国特許第6,858,225号)。
上記を考慮して、本発明は、脂質/核酸製剤を調製する方法を提供する。本明細書に記載されている方法では、脂質の混合物を、核酸の緩衝水溶液と混合して、脂質粒子に封入された核酸を含有する中間混合物を生成し、例えば、封入された核酸は、約10重量%~約20重量%の核酸/脂質比で存在する。中間混合物は、随意にサイズ化されて、脂質部分が、好ましくは30~150nm、より好ましくは約40~90nmの直径を有する単層膜小胞である脂質-封入核酸粒子を取得することができる。その後、pHを上昇させて、脂質-核酸粒子の表面電荷の少なくとも一部を中和し、したがって少なくとも部分的に表面中和された脂質-封入核酸組成物を提供する。
ある実施形態では、脂質の混合物は、少なくとも2つの脂質成分:脂質がそのpKa未満のpHで陽イオン性であり、そのpKaを超えるpHで中性であるようなpKaを有する脂質の中から選択される本発明の第1の脂質成分、及び脂質-核酸粒子形成中の粒子凝集を防止する脂質の中から選択される第2の脂質成分を含む。特定の実施形態では、アミノ脂質は、本発明の新規な陽イオン性脂質である。
本発明の核酸-脂質粒子を調製する際、脂質混合物は、典型的には有機溶媒中の脂質溶液である。その後、この脂質の混合物は、水性緩衝液で水和してリポソームを形成させる前に、乾燥して薄膜を形成させるか又は凍結乾燥して粉末を形成させことができる。あるいは、好ましい方法では、脂質混合物は、エタノールなどの水混和性アルコール中に可溶化することができ、このエタノール性溶液を水性緩衝液に添加することにより、自発的なリポソーム形成がもたらされる。ほとんどの実施形態では、アルコールは、市販されている形態で使用される。例えば、エタノールは、無水エタノール(100%)又は95%エタノールとして使用することができ、残りは水である。この方法は、米国特許第5,976,567号でより詳細に記載されている。
1つの例示的な実施形態では、脂質の混合物は、アルコール溶媒中の陽イオン性脂質、中性脂質(陽イオン性脂質以外)、ステロール(例えば、コレステロール)、及びPEG修飾脂質(例えば、PEG-DMG又はPEG-DMA)の混合物である。好ましい実施形態では、脂質混合物は、アルコール、より好ましくはエタノール中の陽イオン性脂質、中性脂質、コレステロール、及びPEG修飾脂質から本質的になる。さらなる好ましい実施形態では、第1の溶液は、上記脂質混合物からなり、モル比は、約20~70%陽イオン性脂質:5~45%中性脂質:20~55%コレステロール:0.5~15%PEG修飾脂質である。またさらなる好ましい実施形態では、第1の溶液は、表1から選択される脂質、DSPC、Chol、及びPEG-DMG又はPEG-DMAから本質的になり、モル比は、より好ましくは約20~60%陽イオン性脂質:5~25%DSPC:25~55%Chol:0.5~15%PEG-DMG又はPEG-DMAである。特定の実施形態では、脂質モル比は、およそ40/10/40/10(モル% 陽イオン性脂質/DSPC/Chol/PEG-DMG又はPEG-DMA)、35/15/40/10(モル% 陽イオン性脂質/DSPC/Chol/PEG-DMG又はPEG-DMA)、又は52/13/30/5(モル% 陽イオン性脂質/DSPC/Chol/PEG-DMG又はPEG-DMA)である。別の群の実施形態では、これらの組成物中の中性脂質は、POPC、DPPC、DOPE、又はSMと置換される。
本発明によると、脂質混合物は、核酸を含有している場合がある緩衝水溶液と混合される。緩衝水溶液は、典型的には、緩衝液が脂質混合物中のプロトン化可能な脂質のpKa未満のpHを有する溶液である。好適な緩衝剤の例には、クエン酸塩、リン酸塩、酢酸塩、及びMESが含まれる。特に好ましい緩衝液は、クエン酸緩衝液である。好ましい緩衝液では、核酸が封入される化学に応じて、陰イオンが1~1000mMの範囲にあり、緩衝液濃度の最適化は、高負荷レベルの達成に重要である場合がある(例えば、米国特許第6,287,591号及び米国特許第6,858,225号を参照)。あるいは、塩化物又は硫酸塩などでpH5~6に酸性化された純水が、有用である場合がある。この場合、粒子を透析してエタノールを除去するか、pHを増加させるか、又は通常の生理食塩水などの薬学的に許容される担体と混合した際に、粒子膜内外の浸透ポテンシャルの均衡を保つことになる5%グルコース又は別の非イオン性溶質を添加することが好適である場合がある。緩衝液中の核酸の量は異なっていてもよいが、典型的には、約0.01mg/mL~約200mg/mL、より好ましくは約0.5mg/mL~約50mg/mLだろう。
脂質の混合物及び治療用核酸の緩衝水溶液を混合して、中間混合物を提供する。中間混合物は、典型的には封入化核酸を有する脂質粒子の混合物である。加えて、中間混合物は、脂質粒子表面での負荷電核酸と正荷電脂質とのイオン引力により脂質粒子(リポソーム又は脂質小胞)の表面に結合される幾らかの核酸を含有している場合もある(アミノ脂質又はプロトン化可能な第1の脂質成分を構成する他の脂質は、脂質のプロトン化可能な基のpKa未満のpHを有する緩衝液中で正に荷電される)。1つの群の好ましい実施形態では、脂質の混合物は、脂質のアルコール溶液であり、溶液の各々の容積は、混合に際して、その結果生じるアルコール含有量が、約20容積%~約45容積%になるように調節される。混合物を混合する方法は、多様なプロセスのいずれかを含むことができ、生成される製剤の規模に依存することが多い。例えば、全容積が約10~20mL以下である場合、溶液は、試験管内で混合され、ボルテックスミキサーを使用して一緒に撹拌することができる。大規模プロセスは、好適な生産規模のガラス器具中で実施することができる。
随意に、脂質混合物及び治療薬(核酸)の緩衝水溶液を混合することにより生成される脂質-封入化治療薬(例えば、核酸)複合体は、所望のサイズ範囲及び比較的狭い脂質粒径分布を達成するためにサイズ化することができる。好ましくは、本明細書で提供される組成物は、約70~約200nm、より好ましくは約90~約130nmの平均直径にサイズ化することができるだろう。リポソームを所望のサイズにサイズ化するのには、幾つかの技術が使用可能である。1つのサイズ化法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第4,737,323号に記載されている。バス超音波処理又はプローブ超音波処理のいずれかによりリポソーム懸濁液を超音波処理することにより、約0.05マイクロメートル未満のサイズの小さな単層膜小胞(SUV)にまで斬新的にサイズを低減する。均質化は、大きなリポソームをより小さなものへと断片化するために煎断エネルギーに依存する別の方法である。典型的な均質化手順では、多重層膜小胞は、典型的には約0.1~0.5マイクロメートルの選択されたリポソームサイズが観察されるまで、標準的エマルジョンホモジナイザーをを再循環させる。両方法では、粒経分布は、従来のレーザー光線粒径決定法により監視することができる。本明細書のある方法の場合、均一小胞サイズを得るために押出法が使用される。
小細孔のポリカーボネート膜又は非対称性セラミック膜を通してリポソーム組成物を押出することにより、比較的明確な粒径分布がもたらされる。典型的には、懸濁液は、所望のリポソーム複合体粒径分布が達成されるまで、1回又は複数回膜を通して循環される。リポソームを、連続的により小さな細孔膜を通して押出して、リポソームサイズの段階的低減を達成することができる。幾つかの場合、形成される脂質-核酸組成物は、いかなるサイズ化をすることなく使用することができる。
特定の実施形態では、本発明の方法は、脂質-核酸組成物の脂質部分の表面電荷の少なくとも幾らかを中和するステップをさらに含む。少なくとも部分的に表面電荷を中和することにより、未封入化核酸は、脂質粒子表面から遊離し、従来技術を使用して組成物から除去することができる。好ましくは、未封入の表面吸着核酸は、その結果生じる組成物から緩衝液交換により除去される。例えば、クエン酸緩衝液(約pH4.0、組成物の形成に使用される)をHEPES緩衝生理食塩水(pHが約7.5のHBS)溶液に置換することにより、リポソーム表面の中和及び核酸の表面からの放出がもたらされる。その後、放出された核酸は、標準的方法を使用してクロマトグラフィーで除去することができ、その後使用される脂質のpKaを超えるpHを有する緩衝液へと切替えることができる。
随意に、脂質小胞(つまり、脂質粒子)を、水性緩衝液中での水和により形成し、核酸の添加前に上述の方法のいずれかを使用してサイズ化することができる。上述のように、水性緩衝液は、アミノ脂質のpKa未満のpHであるべきである。その後、これらのサイズ化され事前に形成された小胞に、核酸溶液を添加することができる。そのような「事前に形成された」小胞への核酸封入を可能にするために、混合物は、エタノールなどのアルコールを含有しているべきである。エタノールの場合、約20%(重量/重量)~約45%(重量/重量)の濃度で存在するべきである。加えて、事前に形成された小胞及び核酸の混合物を、水性緩衝液-エタノール混合物中で、脂質小胞の組成及び核酸の性質に応じて約25℃~約50℃の温度に加温することが必要な場合がある。当業者であれば、脂質小胞中に所望レベルの核酸を達成するための封入化プロセスの最適化には、エタノール濃度及び温度などの変数を操作することが必要であることは明白であろう。核酸封入化に好適な条件の例は、実施例において提供されている。核酸が事前に形成された小胞内に封入されれば、外部pHを上昇させて、表面電荷を少なくとも部分的に中和することができる。その後、未封入の表面吸着核酸を、上述のように除去することができる。
使用方法
本発明の脂質粒子は、インビトロ又はインビボで、治療薬を細胞に送達するために使用することができる。特定の実施形態では、治療薬は、本発明の核酸-脂質粒子を使用して、細胞に送達される核酸である。本発明の脂質粒子及び関連医薬組成物を使用する種々の方法に関する以下の記載は、核酸-脂質粒子に関する記載により例示されているが、これらの方法及び組成物は、そのような治療から利益を得る可能性のある任意の疾患又は障害を治療するための任意の治療薬の送達に容易に適合させることができることが理解される。
本発明の脂質粒子は、インビトロ又はインビボで、治療薬を細胞に送達するために使用することができる。特定の実施形態では、治療薬は、本発明の核酸-脂質粒子を使用して、細胞に送達される核酸である。本発明の脂質粒子及び関連医薬組成物を使用する種々の方法に関する以下の記載は、核酸-脂質粒子に関する記載により例示されているが、これらの方法及び組成物は、そのような治療から利益を得る可能性のある任意の疾患又は障害を治療するための任意の治療薬の送達に容易に適合させることができることが理解される。
ある実施形態では、本発明は、核酸を細胞に導入するための方法を提供する。細胞に導入するための好ましい核酸は、siRNA、免疫刺激オリゴヌクレオチド、プラスミド、アンチセンス、及びリボザイムである。これらの方法は、細胞内送達が生じるのに十分な期間、本発明の粒子又は組成物を細胞と接触させることにより実施することができる。
本発明の組成物は、ほとんど全ての細胞タイプに吸着することができる。吸着すると、核酸-脂質粒子は、細胞の部分によりエンドシトーシスされるか、又は脂質を細胞膜と交換するか、又は細胞と融合するかのいずれかであり得る。複合体の核酸部分の移行又は取り込みは、これらの経路のいずれか1つを介して生じる場合がある。本発明の範囲に関する限定を意図してないが、エンドサイトーシスにより細胞に取り込まれる粒子の場合、粒子は、その後エンドソーム膜と相互作用し、恐らくは非二分子膜相の形成によりエンドソーム膜の不安定化をもたらし、細胞質への封入化核酸の導入をもたらすと考えられる。同様に、粒子が細胞原形質膜と直接融合する場合、融合が生じる際に、リポソーム膜が細胞膜に統合され、リポソームの内容物は細胞内液と混合する。細胞と脂質-核酸組成物との接触は、インビトロで実施される場合、生物学的に適合する培地中で生じるだろう。組成物の濃度は、特定の用途に応じて幅広く異なっていてもよいが、一般的に約1μモル~約10ミリモルである。ある実施形態では、脂質-核酸組成物による細胞の処置は、一般的に、生理学的な温度(約37℃)で、約1~24時間の間、好ましくは約2~8時間実施されるだろう。インビトロ用途の場合、核酸の送達は、培養で増殖される任意の細胞に対してであってもよく、細胞は、植物由来又は動物由来でもよく、脊椎動物又は無脊髄動物由来でもよく、あらゆる組織又はタイプでもよい。好ましい実施形態では、細胞は、動物細胞であり、より好ましくは哺乳動物細胞であり、最も好ましくはヒト細胞であろう。
1つの群の実施形態では、脂質-核酸粒子懸濁液は、約103~約105細胞/mL、より好ましくは約2×104細胞/mLの細胞密度を有する、60~80%コンフルエントのプレーティングされた細胞に添加される。細胞に添加される懸濁液の濃度は、好ましくは約0.01~20μg/mL、より好ましくは約1μg/mLである。
別の実施形態では、本発明の脂質粒子は、細胞又は細胞系(例えば、腫瘍細胞系)に核酸を送達するために使用することができる。そのような細胞系の非限定的な例には、以下のものが含まれる:HELA(ATCC Cat N:CCL-2)、KB(ATCC Cat N:CCL-17)、HEP3B(ATCC Cat N:HB-8064)、SKOV-3(ATCC Cat N:HTB-77)、HCT-116(ATCC Cat N:CCL-247)、HT-29(ATCC Cat N:HTB-38)、PC-3(ATCC Cat N:CRL-1435)、A549(ATCC Cat N:CCL-185)、MDA-MB-231(ATCC Cat N:HTB-26)。
典型的な用途には、siRNAの細胞内送達を提供するための周知の手順を使用して、特定の細胞標的をノックダウン又はサイレンシングさせることが含まれる。あるいは、用途には、治療上有用なポリペプチドをコードするDNA又はmRNA配列の送達が含まれる。このようにして、欠損遺伝子産物を供給することによる遺伝病又は遺伝子産物を供給しないことによる遺伝病(つまり、デュシェンヌ型ジストロフィーについては、Kunkel, et al., Brit. Med. Bull. 45(3):630-643 (1989)を参照、及び嚢胞性線維症については、Goodfellow, Nature 341:102-103 (1989)を参照)の治療が提供される。本発明の組成物の他の使用には、細胞にアンチセンスオリゴヌクレオチドを導入することが含まれる(Bennett, et al., Mol. Pharm. 41:1023-1033 (1992)を参照)。
あるいは、本発明の組成物は、当業者に公知の方法を使用して、インビボで核酸を細胞に送達するために使用することもできる。DNA又はmRNA配列の送達に関しては、DOTMA-DOPE複合体を使用した、サイトメガロウイルス(CMV)-クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)発現プラスミドの静脈内送達が、参照により本明細書に組み込まれるZhu, et al., Science 261:209-211 (1993)に記載されている。参照により本明細書に組み込まれるHyde, et al., Nature 362:250-256 (1993)には、リポソームを使用した、マウスの肺気道上皮及び肺胞への嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子(CFTR)遺伝子送達が記載されている。参照により本明細書に組み込まれるBrigham, et al., Am. J. Med. Sci. 298:278-281 (1989)には、細胞内酵素であるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)をコードする機能性原核生物遺伝子によるマウス肺のインビボ形質移入が記載されている。したがって、本発明の組成物は、感染症の治療に使用することができる。
インビボ投与の場合、医薬組成物は、好ましくは非経口的に、つまり関節内、静脈内、腹腔内、皮下、又は筋肉内に投与される。特定の実施形態では、医薬組成物は、ボーラス注射により静脈内に又は腹腔内に投与される。一例としては、参照により本明細書に組み込まれるStadlerらの米国特許第5,286,634号を参照されたい。細胞内核酸送達は、Straubringer, et al., Methods in Enzymology, Academic Press, New York. 101:512-527 (1983);Mannino, et al., Biotechniques 6:682-690 (1988);Nicolau, et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 6:239-271 (1989)、及びBehr, Acc. Chem. Res. 26:274-278 (1993)でも考察されている。脂質に基づく治療薬を投与するさらに他の方法は、例えば、Rahmanら、米国特許第3,993,754号;Sears、米国特許第4,145,410号;Papahadjopoulosら、米国特許第4,235,871号;Schneider、米国特許第4,224,179号;Lenkら、米国特許第4,522,803号;及びFountainら、米国特許第4,588,578号に記載されている。
他の方法では、医薬品は、製剤を組織に直接適用することにより標的組織と接触させてもよい。適用は、局所的、「開放」、又は「閉鎖」術式でなされてもよい。「局所的」とは、皮膚、口腔咽頭、及び外耳道などの環境に曝されている組織に、医薬品を直接的に適用することを意味する。「開放」術式は、患者の皮膚を切開し、医薬品を適用する下層組織を直接視覚化することを含む術式である。これには、一般的に、肺に接近する開胸術、腹部臓器に接近する腹式開腹術、又は標的組織への他の直接的な外科的接近などの外科手術により達成される。「閉鎖」術式は、内部標的組織は直接視覚化されないが、皮膚の小さな創傷を通して器具を挿入することにより接近する侵襲的術式である。例えば、製剤は、針洗浄により腹膜に投与することができる。同様に、医薬品は、腰椎穿刺され、その後脊髄麻酔又は脊髄のメトラザミド(metrazamide)画像診断のために一般的に実施される患者の適切な体位取り中に、点滴により髄膜又は脊髄に投与することができる。あるいは、製剤は、内視鏡検査デバイスを通して投与することができる。
脂質-核酸組成物は、肺に吸入されるエアロゾルで(Brigham, et al., Am. J. Sci. 298(4):278-281 (1989)を参照)、又は疾患部位への直接注射により(Culver, Human Gene Therapy, MaryAnn Liebert, Inc., Publishers, New York. pp.70-71 (1994))投与することもできる。
本発明の方法は、様々な宿主で実施することができる。好ましい宿主には、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、及びヒツジなどの哺乳動物種が含まれる。
本発明の脂質-治療薬粒子の用量は、脂質対する治療薬の比率、及び患者の年齢、体重、状態に基づく投薬医師の見解に依存するだろう。
1つの実施形態では、本発明は、標的ポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現を調節する方法を提供する。これらの方法は、一般的に、標的ポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現を調節可能な核酸に結合している本発明の脂質粒子と細胞を接触させることを含む。本明細書で使用されるとき、「調節する」という用語は、標的ポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現を変更することを指す。異なる実施形態では、調節は、増加又は増強を意味していてもよく、又は減少若しくは低減を意味していてもよい。標的ポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現レベルを測定する方法は、当該技術分野において公知及び使用可能であり、それらには、例えば逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)及び免疫組織化学的技術を使用する方法が含まれる。特定の実施形態では、標的ポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現レベルは、適切な対照値と比較して、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、又は50%を超えて増加又は低減される。
例えば、ポリペプチド発現の増加が望ましい場合、核酸は、所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターであってもよい。他方で、ポリヌクレオチド又はポリペプチド発現の低減が望ましい場合、核酸は、例えば、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズし、それにより標的ポリヌクレオチド又はポリペプチドの発現を妨害するポリヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、又はマイクロRNAであってもよい。あるいは、核酸は、そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、又はマイクロRNAを発現するプラスミドであってもよい。
1つの特定の実施形態では、本発明は、細胞によるポリペプチドの発現を調節する方法であって、表1から選択される脂質、DSPC、Chol、及びPEG-DMG又はPEG-DMAからなる又は本質的にからなる、例えば、モル比が約20~60%陽イオン性脂質:5~25%DSPC:25~55%Chol:0.5~15%PEG-DMG又はPEG-DMAである脂質粒子を、細胞に提供することを含み、脂質粒子が、ポリペプチドの発現を調節可能な核酸と結合している方法を提供する。特定の実施形態では、脂質モル比は、およそ40/10/40/10(モル% 陽イオン性脂質/DSPC/Chol/PEG-DMG又はPEG-DMA)、35/15/40/10(モル% 陽イオン性脂質/DSPC/Chol/PEG-DMG又はPEG-DMA)、又は52/13/30/5(モル% 陽イオン性脂質/DSPC/Chol/PEG-DMG又はPEG-DMA)である。別の群の実施形態では、これらの組成物中の中性脂質は、POPC、DPPC、DOPE、又はSMと置換される。
特定の実施形態では、治療薬は、siRNA、マイクロRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びsiRNA、マイクロRNA、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現可能なプラスミドから選択され、siRNA、マイクロRNA、又はアンチセンスRNAは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと特異的に結合し、そのためポリペプチドの発現が低減されるポリヌクレオチド又はその相補体を含む。
他の実施形態では、核酸は、ポリペプチド又はその機能的変異体若しくは断片をコードするプラスミドであり、そのためポリペプチド又はその機能的変異体若しくは断片の発現が増加される。
関連実施形態では、本発明は、対象体でポリペプチドが過剰発現されることを特徴とする疾患又は障害を治療する方法であって、対象体に、本発明の医薬組成物を提供することを含み、治療薬が、siRNA、マイクロRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びsiRNA、マイクロRNA、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現可能なプラスミドから選択され、siRNA、マイクロRNA、又はアンチセンスRNAが、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと特異的に結合するポリヌクレオチド又はその相補体を含む方法を含む。
1つの実施形態では、医薬組成物は、表1から選択される脂質、DSPC、Chol、及びPEG-DMG又はPEG-DMAからなるか又は本質的にからなる、例えば、モル比が約20~60%陽イオン性脂質:5~25%DSPC:25~55%Chol:0.5~15%PEG-DMG又はPEG-DMAである脂質粒子を含み、脂質粒子は、治療用核酸と結合している。特定の実施形態では、脂質モル比は、およそ40/10/40/10(モル% 陽イオン性脂質/DSPC/Chol/PEG-DMG又はPEG-DMA)、35/15/40/10(モル% 陽イオン性脂質/DSPC/Chol/PEG-DMG又はPEG-DMA)、又は52/13/30/5(モル% 陽イオン性脂質/DSPC/Chol/PEG-DMG又はPEG-DMA)である。別の群の実施形態では、これらの組成物中の中性脂質は、POPC、DPPC、DOPE、又はSMと置換される。
別の関連実施形態では、本発明は、対象体でポリペプチドが過小発現されることを特徴とする疾患又は障害を治療する方法であって、対象体に、本発明の医薬組成物を提供することを含み、治療薬が、ポリペプチド又はその機能的変異体若しくは断片をコードするプラスミドである方法を含む。
1つの実施形態では、医薬組成物は、表1から選択される脂質、DSPC、Chol、及びPEG-DMG又はPEG-DMAからなるか又は本質的にからなる、例えば、モル比が約20~60%陽イオン性脂質:5~25%DSPC:25~55%Chol:0.5~15%PEG-DMG又はPEG-DMAである脂質粒子を含み、脂質粒子は、治療用核酸と結合している。特定の実施形態では、脂質モル比は、およそ40/10/40/10(モル% 陽イオン性脂質/DSPC/Chol/PEG-DMG又はPEG-DMA)、35/15/40/10(モル% 陽イオン性脂質/DSPC/Chol/PEG-DMG又はPEG-DMA)、又は52/13/30/5(モル% 陽イオン性脂質/DSPC/Chol/PEG-DMG又はPEG-DMA)である。別の群の実施形態では、これらの組成物中の中性脂質は、POPC、DPPC、DOPE、又はSMと置換される。
本発明は、対象体において免疫応答を誘導する方法であって、対象体に、本発明の医薬組成物を提供することを含み、治療薬が免疫賦活化オリゴヌクレオチドである方法をさらに提供する。ある実施形態では、免疫応答は、体液性又は粘膜性免疫応答である。1つの実施形態では、医薬組成物は、表1から選択される脂質、DSPC、Chol、及びPEG-DMG又はPEG-DMAからなるか又は本質的にからなる、例えば、モル比が約20~60%陽イオン性脂質:5~25%DSPC:25~55%Chol:0.5~15%PEG-DMG又はPEG-DMAである脂質粒子を含み、脂質粒子は、治療用核酸と結合している。特定の実施形態では、脂質モル比は、およそ40/10/40/10(モル% 陽イオン性脂質/DSPC/Chol/PEG-DMG又はPEG-DMA)、35/15/40/10(モル% 陽イオン性脂質/DSPC/Chol/PEG-DMG又はPEG-DMA)、又は52/13/30/5(モル% 陽イオン性脂質/DSPC/Chol/PEG-DMG又はPEG-DMA)である。別の群の実施形態では、これらの組成物中の中性脂質は、POPC、DPPC、DOPE、又はSMと置換される。
さらなる実施形態では、医薬組成物は、ワクチン又は抗原と組み合わせて対象体に提供される。したがって、本発明はそれ自体が、免疫賦活化オリゴヌクレオチドを含み、免疫応答が望まれる抗原に結合もされている本発明の脂質粒子を含むワクチンを提供する。特定の実施形態では、抗原は、腫瘍抗原であるか、又は感染体、例えばウイルス、細菌、又は寄生虫などに関連している。
様々な腫瘍抗原、感染体抗原、及び他の疾患に関連する抗原は、当該技術分野で周知であり、これらの例は、本明細書に引用されている文献に記載されている。本発明で使用するのに好適な抗原の例には、これらに限定されないが、ポリペプチド抗原及びDNA抗原が含まれる。抗原の具体的な例は、A型肝炎、B型肝炎、天然痘、ポリオ、炭疽菌、インフルエンザ、チフス、破傷風、麻疹、ロタウイルス、ジフテリア、百日咳、結核、及び風疹抗原である。好ましい実施形態では、抗原は、B型肝炎の組換え抗原である。他の態様では、抗原は、A型肝炎の組換え抗原である。別の態様では、抗原は、腫瘍抗原である。そのような腫瘍関連抗原の例は、MUC-1、EBV抗原、及びバーキットリンパ腫関連抗原である。さらなる態様では、抗原は、チロシナーゼ関連タンパク質腫瘍抗原組換え抗原である。当業者であれば、本発明で使用するのに好適な他の抗原を知っているだろう。
本主題発明で使用するのに好適な腫瘍関連抗原には、単一の腫瘍タイプを示す場合があり、幾つかのタイプの腫瘍に共有されている場合があり、及び/又は正常細胞と比較して腫瘍細胞で排他的に発現又は過剰表現される場合がある突然変異分子及び非突然変異分子が両方とも含まれる。タンパク質及び糖タンパク質に加えて、炭水化物、ガングリオシド、糖脂質、及びムチンの発現の腫瘍特異的パターンも記載されている。本主題癌ワクチンに使用するための例示的な腫瘍関連抗原には、腫瘍細胞に特有な突然変異又は再編成を有する癌遺伝子、癌抑制遺伝子、及び他の遺伝子のタンパク質産物、再活性化胚遺伝子産物、腫瘍胎児性抗原、組織特異的(しかし、腫瘍特異的ではない)分化抗原、成長因子受容体、細胞表面炭水化物残基、外来性ウイルスタンパク質、及び多数の他の自己タンパク質が含まれる。
腫瘍関連抗原の具体的な実施形態には、以下のものが含まれる:例えば、Ras p21癌原遺伝子、腫瘍抑制因子p53、及びBCR-abl癌遺伝子、並びにCDK4、MUM1、カスパーゼ8、及びベータカテニンのタンパク質産物などの突然変異抗原;ガレクチン4、ガレクチン9、炭酸脱水酵素、アルドラーゼA、PRAME、Her2/neu、ErbB-2、及びKSAなどの過剰発現抗原、アルファフェトプロテイン(AFP)、ヒト絨毛膜性生殖腺刺激ホルモン(hCG)などの腫瘍胎児性抗原;Mart 1/Melan A、gp100、gp75、チロシナーゼ、TRP1、及びTRP2などの癌胎児抗原(CEA)及びメラノサイト分化抗原などの自己抗原;PSA、PAP、PSMA、PSM-P1、及びPSM-P2などの前立腺関連抗原;MAGE1、MAGE3、MAGE4、GAGE1、GAGE2、BAGE、RAGE、及びNY-ESO1、SSX2、及びSCP1などの他の癌精巣抗原などの再活性化胚遺伝子産物;Muc-1及びMuc-2などのムチン;GM2、GD2、及びGD3などのガングリオシド、Lewis(y)及びglobo-Hなどの中性糖脂質及び糖タンパク質;並びにTn、Thompson-Freidenreich抗原(TF)、及びsTnなどの糖タンパク質。また、本明細書に腫瘍関連抗原として含まれるのは、全細胞及び腫瘍細胞溶解産物、並びにその免疫原性部分、並びにB細胞リンパ腫に対して使用するための、Bリンパ球の単クローン増殖で発現される免疫グロブリンイディオタイプである。
病原体には、これらに限定されないが、哺乳動物、より具体的にはヒトに感染する感染因子、例えばウイルスが含まれる。感染性ウイルスの例に、これらに限定されないが、以下のものが含まれる:レトロウイルス科(例えば、HIV-1などのヒト免疫不全ウイルス(HTLV-III、LAV、又はHTLV-III/LAV、又はHIV-IIIとも呼ばれる;及びHIV-LPなどの他の分離株);ピコルナウイルス科(例えば、ポリオウイルス、A型肝炎ウイルス;エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス);カルシウイルス科(例えば、胃腸炎を引き起こす菌株);トガウイルス科(例えば、ウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス);フラウイルス科(Flaviridae)(例えば、デング熱ウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス);コロノウイルス科(Coronoviridae)(例えば、コロナウイルス);ラブドウイルス科(Rhabdoviradae)(例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス);コロナウイルス科(例えば、コロナウイルス);ラブドウイルス科(例えば、水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス);フィロウイルス科(例えば、エボラウイルス);パラミクソウイルス科(例えば、パラインフルエンザウイルス、おたふくかぜウイルス、はしかウイルス、RSウイルス);オルトミクソウイルス科(例えば、インフルエンザウイルス);ブンガウイルス科(Bungaviridae)(例えば、ハンタウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルス、及びナイロウイルス);アレナウイルス科(出血熱ウイルス);レオウイルス科(例えば、レオウイルス、オルビウイルス、及びロタウイルス);ビルナウイルス科;ヘパドナウイルス科(B型肝炎ウイルス);パルボウイルス科(パルボウイルス);パポバウイルス科(パピローマウイルス、ポリオーマウイルス);アデノウイルス科(ほとんどのアデノウイルス);ヘルペスウイルス科単純ヘルペスウイルス(HSV)1及び2、帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス(CMV)、ヘルペスウイルス;ポックスウイルス科(痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス);及びイリドウイルス科(例えば、アフリカブタコレラウイルス);及び分類不能なウイルス(例えば、海綿状脳症の原因菌、デルタ肝炎(B型肝炎ウイルスの欠損付随体であると考えられる)の原因菌、非A型、非B型肝炎の原因菌(クラスI=内部的に伝染;クラス2=非経口的に伝染(つまり、C型肝炎));ノーウォーク及び関連ウイルス、並びにアストロウイルス)。
また、グラム陰性菌及びグラム陽性菌は、脊椎動物の抗原として役立つ。そのようなグラム陽性菌には、これらに限定されないが、パスツレラ(Pasteurella)種、ブドウ球菌(Staphylococci)種、及びストレプトコッカス(Streptococcus)種が含まれる。グラム陰性細菌には、これらに限定されないが、大腸菌(Escherichia coli)、シュードモナス(Pseudomonas)種、及びサルモネラ(Salmonella)種が含まれる。感染性細菌の具体的な例には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる:ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacterpyloris)、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borelia burgdorferi)、レジュネラ・ニューモフィラ菌(Legionella pneumophilia)、ミコバクテリア(Mycobacteria)種(例えば、結核菌(M. tuberculosis)、M.アビウム(M. avium)、M.イントラセルラーレ(M. intracellulare)、M.カンサイ(M. kansaii)、M.ゴルドナエ(M. gordonae))、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)、ナイセリア・メニンギティディス(Neisseria meningitidis)、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)、化膿連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)(A群ストレプトコッカス属)、ストレプトコッカス・アガラクティエ(Streptococcus agalactiae)(B群ストレプトコッカス属)、ストレプトコッカス属(Streptococcus)(ビリダンス(viridans)群)、糞便連鎖球菌(Streptococcusfaecalis)、ストレプトコッカス・ボビス(Streptococcus bovis)、ストレプトコッカス属(嫌気性種)、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、病原性カンピロバクター(Campylobacter)種)、エンテロコッカス種(Enterococcus)、ヘモフィルス・インフルエンザ(Haemophilus infuenzae)、バチルス・アントラシス(Bacillus antracis)、コリネバクテリウム・ジフテリエ(corynebacterium diphtheriae)、コリネバクテリウム種、ブタ丹毒菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、クロストリジウム・パーフリンガース(Clostridium perfringers)、破傷風菌(Clostridium tetani)、エンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、パスツレラ・マルトシダ(Pasturella multocida)、バクテロイデス(Bacteroides)種、フソバクテリウム・ヌクレアタム(Fusobacterium nucleatum)、ストレプトバシラス-モリニフオルミス(Streptobacillus moniliformis)、トレポネーマ・パリジウム(Treponema pallidium)、フランベジアトレポネーマ(Treponema pertenue)、レプトスピラ(Leptospira)、リケッチア(Rickettsia)、及びアクチノミセス・イスラエリ(Actinomyces israelli)。
病原体のさらなる例には、これらに限定されないが、哺乳動物、より具体的にはヒトに感染する感染性真菌が含まれる。感染性真菌の例には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる:クリプトコックス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、ヒストプラスマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum)、コクシジオイデス・イミチス(Coccidioides immitis)、ブラストミセス・デルマティティディス(Blastomyces dermatitidis)、クラミジア・トラコマーティス(Chlamydia trachomatis)、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)。感染性寄生虫の例には、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)、四日熱マラリア原虫(Plasmodium malariae)、卵形マラリア原虫(Plasmodium ovale)、及び三日熱マラリア原虫(Plasmodium vivax)などのマラリア原虫が含まれる。他の感染性生物(つまり、原生生物)には、トキソプラズマ・ゴンディ(Toxoplasma gondii)が含まれる。
1つの実施形態では、本発明の製剤は、これらに限定されないが、以下のものを含む標的遺伝子をサイレンシング又は調節するために使用することができる:FVII、Eg5、PCSK9、TPX2、apoB、SAA、TTR、RSV、PDGFベータ遺伝子、Erb-B遺伝子、Src遺伝子、CRK遺伝子、GRB2遺伝子、RAS遺伝子、MEKK遺伝子、JNK遺伝子、RAF遺伝子、Erk1/2遺伝子、PCNA(p21)遺伝子、MYB遺伝子、JUN遺伝子、FOS遺伝子、BCL-2遺伝子、サイクリンD遺伝子、VEGF遺伝子、EGFR遺伝子、サイクリンA遺伝子、サイクリンE遺伝子、WNT-1遺伝子、ベータ-カテニン遺伝子、c-Met遺伝子、PKC遺伝子、NFKB遺伝子、STAT3遺伝子、サバイビン遺伝子、Her2/Neu遺伝子、SORT1遺伝子、XBP1遺伝子、トポイソメラーゼI遺伝子、トポイソメラーゼIIアルファ遺伝子、p73遺伝子、p21(WAF1/CIP1)遺伝子、p27(KIP1)遺伝子、PPM1D遺伝子、RAS遺伝子、カベオリンI遺伝子、MIB I遺伝子、MTAI遺伝子、M68遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、p53腫瘍抑制遺伝子、p53ファミリーメンバーDN-p63、pRb腫瘍抑制遺伝子、APC1腫瘍抑制遺伝子、BRCA1腫瘍抑制遺伝子、PTEN腫瘍抑制遺伝子、mLL融合遺伝子、BCR/ABL融合遺伝子、TEL/AML1融合遺伝子、EW/FLI1融合遺伝子、TLS/FUS1融合遺伝子、PAX3/FKHR融合遺伝子、AML1/ETO融合遺伝子、アルファv-インテグリン遺伝子、Flt-1受容体遺伝子、チューブリン遺伝子、ヒトパピローマウイルス遺伝子、ヒトパピローマウイルス複製に必要な遺伝子、ヒト免疫不全ウイルス遺伝子、ヒト免疫不全ウイルス複製に必要な遺伝子、A型肝炎ウイルス遺伝子、A型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、B型肝炎ウイルス遺伝子、B型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、C型肝炎ウイルス遺伝子、C型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、D型肝炎ウイルス遺伝子、D型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、E型肝炎ウイルス遺伝子、E型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、F型肝炎ウイルス遺伝子、F型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、G型肝炎ウイルス遺伝子、G型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、H型肝炎ウイルス遺伝子、H型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、RSウイルス遺伝子、RSウイルス複製に必要な遺伝子、単純ヘルペスウイルス遺伝子、単純ヘルペスウイルス複製に必要な遺伝子、ヘルペスサイトメガロウイルス遺伝子、ヘルペスサイトメガロウイルス複製に必要な遺伝子、ヘルペスエプスタインバーウイルス遺伝子、ヘルペスエプスタインバーウイルス複製に必要な遺伝子、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス遺伝子、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス複製に必要な遺伝子、JCウイルス遺伝子、JCウイルス複製に必要なヒト遺伝子、ミクソウイルス遺伝子、ミクソウイルス遺伝子複製に必要な遺伝子、ライノウイルス遺伝子、ライノウイルス複製に必要な遺伝子、コロナウイルス遺伝子、コロナウイルス複製に必要な遺伝子、西ナイルウイルス遺伝子、西ナイルウイルス複製に必要な遺伝子、セントルイス脳炎遺伝子、セントルイス脳炎複製に必要な遺伝子、ダニ媒介性脳炎ウイルス遺伝子、ダニ媒介性脳炎ウイルス複製に必要な遺伝子、マリーバレー脳炎ウイルス遺伝子、マリーバレー脳炎ウイルス複製に必要な遺伝子、デング熱ウイルス遺伝子、デング熱ウイルス遺伝子複製に必要な遺伝子、シミアンウイルス40遺伝子、シミアンウイルス40複製に必要な遺伝子、ヒトT細胞リンパ球向性ウイルス遺伝子、ヒトT細胞リンパ球向性ウイルス複製に必要な遺伝子、モロニー-マウス白血病ウイルス遺伝子、モロニー-マウス白血病ウイルス複製に必要な遺伝子、脳心筋炎ウイルス遺伝子、脳心筋炎ウイルス複製に必要な遺伝子、はしかウイルス遺伝子、はしかウイルス複製に必要な遺伝子、水痘帯状疱疹(Vericella zoster)ウイルス遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルス複製に必要な遺伝子、アデノウイルス遺伝子、アデノウイルス複製に必要な遺伝子、黄熱病ウイルス遺伝子、黄熱病ウイルス複製に必要な遺伝子、ポリオウイルス遺伝子、ポリオウイルス複製に必要な遺伝子、ポックスウイルス遺伝子、ポックスウイルス複製に必要な遺伝子、プラスモジウム遺伝子、プラスモジウム遺伝子複製に必要な遺伝子、ミコバクテリア・ウルセランス遺伝子、ミコバクテリア・ウルセランス複製に必要な遺伝子、結核菌遺伝子、結核菌遺伝子に必要な遺伝子、癩菌遺伝子、癩菌複製に必要な遺伝子、黄色ブドウ球菌遺伝子、黄色ブドウ球菌複製に必要な遺伝子、肺炎連鎖球菌遺伝子、肺炎連鎖球菌複製に必要な遺伝子、化膿連鎖球菌遺伝子、化膿連鎖球菌複製に必要な遺伝子、クラミジア・ニューモニエ遺伝子、クラミジア・ニューモニエ複製に必要な遺伝子、肺炎ミコプラズマ遺伝子、肺炎ミコプラズマ複製に必要な遺伝子、インテグリン遺伝子、セレクチン遺伝子、補体系遺伝子、ケモカイン遺伝子、ケモカイン受容体遺伝子、GCSF遺伝子、Gro1遺伝子、Gro2遺伝子、Gro3遺伝子、PF4遺伝子、MIG遺伝子、前血小板塩基性タンパク質遺伝子、MIP-1I遺伝子、MIP-1J遺伝子、RANTES遺伝子、MCP-1遺伝子、MCP-2遺伝子、MCP-3遺伝子、CMBKR1遺伝子、CMBKR2遺伝子、CMBKR3遺伝子、CMBKR5v、AIF-1遺伝子、I-309遺伝子、イオンチャネルの構成要素の遺伝子、神経伝達物質受容体の遺伝子、神経伝達物質リガンドの遺伝子、アミロイドファミリー遺伝子、プレセニリン遺伝子、HD遺伝子、DRPLA遺伝子、SCA1遺伝子、SCA2遺伝子、MJD1遺伝子、CACNL1A4遺伝子、SCA7遺伝子、SCA8遺伝子、LOH細胞に見出される対立遺伝子、又は多形型遺伝子のうちの1つの対立遺伝子。
1つの実施形態では、本発明の製剤は、これらに限定されないが、以下のものを含む標的遺伝子をサイレンシング又は調節するために使用することができる:FVII、Eg5、PCSK9、TPX2、apoB、SAA、TTR、RSV、PDGFベータ遺伝子、Erb-B遺伝子、Src遺伝子、CRK遺伝子、GRB2遺伝子、RAS遺伝子、MEKK遺伝子、JNK遺伝子、RAF遺伝子、Erk1/2遺伝子、PCNA(p21)遺伝子、MYB遺伝子、JUN遺伝子、FOS遺伝子、BCL-2遺伝子、サイクリンD遺伝子、VEGF遺伝子、EGFR遺伝子、サイクリンA遺伝子、サイクリンE遺伝子、WNT-1遺伝子、ベータ-カテニン遺伝子、c-Met遺伝子、PKC遺伝子、NFKB遺伝子、STAT3遺伝子、サバイビン遺伝子、Her2/Neu遺伝子、SORT1遺伝子、XBP1遺伝子、トポイソメラーゼI遺伝子、トポイソメラーゼIIアルファ遺伝子、p73遺伝子、p21(WAF1/CIP1)遺伝子、p27(KIP1)遺伝子、PPM1D遺伝子、RAS遺伝子、カベオリンI遺伝子、MIB I遺伝子、MTAI遺伝子、M68遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、p53腫瘍抑制遺伝子、p53ファミリーメンバーDN-p63、pRb腫瘍抑制遺伝子、APC1腫瘍抑制遺伝子、BRCA1腫瘍抑制遺伝子、PTEN腫瘍抑制遺伝子、mLL融合遺伝子、BCR/ABL融合遺伝子、TEL/AML1融合遺伝子、EW/FLI1融合遺伝子、TLS/FUS1融合遺伝子、PAX3/FKHR融合遺伝子、AML1/ETO融合遺伝子、アルファv-インテグリン遺伝子、Flt-1受容体遺伝子、チューブリン遺伝子、ヒトパピローマウイルス遺伝子、ヒトパピローマウイルス複製に必要な遺伝子、ヒト免疫不全ウイルス遺伝子、ヒト免疫不全ウイルス複製に必要な遺伝子、A型肝炎ウイルス遺伝子、A型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、B型肝炎ウイルス遺伝子、B型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、C型肝炎ウイルス遺伝子、C型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、D型肝炎ウイルス遺伝子、D型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、E型肝炎ウイルス遺伝子、E型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、F型肝炎ウイルス遺伝子、F型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、G型肝炎ウイルス遺伝子、G型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、H型肝炎ウイルス遺伝子、H型肝炎ウイルス複製に必要な遺伝子、RSウイルス遺伝子、RSウイルス複製に必要な遺伝子、単純ヘルペスウイルス遺伝子、単純ヘルペスウイルス複製に必要な遺伝子、ヘルペスサイトメガロウイルス遺伝子、ヘルペスサイトメガロウイルス複製に必要な遺伝子、ヘルペスエプスタインバーウイルス遺伝子、ヘルペスエプスタインバーウイルス複製に必要な遺伝子、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス遺伝子、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス複製に必要な遺伝子、JCウイルス遺伝子、JCウイルス複製に必要なヒト遺伝子、ミクソウイルス遺伝子、ミクソウイルス遺伝子複製に必要な遺伝子、ライノウイルス遺伝子、ライノウイルス複製に必要な遺伝子、コロナウイルス遺伝子、コロナウイルス複製に必要な遺伝子、西ナイルウイルス遺伝子、西ナイルウイルス複製に必要な遺伝子、セントルイス脳炎遺伝子、セントルイス脳炎複製に必要な遺伝子、ダニ媒介性脳炎ウイルス遺伝子、ダニ媒介性脳炎ウイルス複製に必要な遺伝子、マリーバレー脳炎ウイルス遺伝子、マリーバレー脳炎ウイルス複製に必要な遺伝子、デング熱ウイルス遺伝子、デング熱ウイルス遺伝子複製に必要な遺伝子、シミアンウイルス40遺伝子、シミアンウイルス40複製に必要な遺伝子、ヒトT細胞リンパ球向性ウイルス遺伝子、ヒトT細胞リンパ球向性ウイルス複製に必要な遺伝子、モロニー-マウス白血病ウイルス遺伝子、モロニー-マウス白血病ウイルス複製に必要な遺伝子、脳心筋炎ウイルス遺伝子、脳心筋炎ウイルス複製に必要な遺伝子、はしかウイルス遺伝子、はしかウイルス複製に必要な遺伝子、水痘帯状疱疹(Vericella zoster)ウイルス遺伝子、水痘帯状疱疹ウイルス複製に必要な遺伝子、アデノウイルス遺伝子、アデノウイルス複製に必要な遺伝子、黄熱病ウイルス遺伝子、黄熱病ウイルス複製に必要な遺伝子、ポリオウイルス遺伝子、ポリオウイルス複製に必要な遺伝子、ポックスウイルス遺伝子、ポックスウイルス複製に必要な遺伝子、プラスモジウム遺伝子、プラスモジウム遺伝子複製に必要な遺伝子、ミコバクテリア・ウルセランス遺伝子、ミコバクテリア・ウルセランス複製に必要な遺伝子、結核菌遺伝子、結核菌遺伝子に必要な遺伝子、癩菌遺伝子、癩菌複製に必要な遺伝子、黄色ブドウ球菌遺伝子、黄色ブドウ球菌複製に必要な遺伝子、肺炎連鎖球菌遺伝子、肺炎連鎖球菌複製に必要な遺伝子、化膿連鎖球菌遺伝子、化膿連鎖球菌複製に必要な遺伝子、クラミジア・ニューモニエ遺伝子、クラミジア・ニューモニエ複製に必要な遺伝子、肺炎ミコプラズマ遺伝子、肺炎ミコプラズマ複製に必要な遺伝子、インテグリン遺伝子、セレクチン遺伝子、補体系遺伝子、ケモカイン遺伝子、ケモカイン受容体遺伝子、GCSF遺伝子、Gro1遺伝子、Gro2遺伝子、Gro3遺伝子、PF4遺伝子、MIG遺伝子、前血小板塩基性タンパク質遺伝子、MIP-1I遺伝子、MIP-1J遺伝子、RANTES遺伝子、MCP-1遺伝子、MCP-2遺伝子、MCP-3遺伝子、CMBKR1遺伝子、CMBKR2遺伝子、CMBKR3遺伝子、CMBKR5v、AIF-1遺伝子、I-309遺伝子、イオンチャネルの構成要素の遺伝子、神経伝達物質受容体の遺伝子、神経伝達物質リガンドの遺伝子、アミロイドファミリー遺伝子、プレセニリン遺伝子、HD遺伝子、DRPLA遺伝子、SCA1遺伝子、SCA2遺伝子、MJD1遺伝子、CACNL1A4遺伝子、SCA7遺伝子、SCA8遺伝子、LOH細胞に見出される対立遺伝子、又は多形型遺伝子のうちの1つの対立遺伝子。
定義
「アルキル」は、1~24個の炭素原子を含有する直鎖又は分岐の非環式又は環式飽和脂肪族炭化水素を意味する。代表的な飽和直鎖アルキルには、メチル、エチル、n-プロピル、n-ブチル、n-ペンチル、及びn-ヘキシルなどが含まれ;飽和分岐アルキルには、イソプロピル、sec-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、及びイソペンチルなどが含まれる。代表的な飽和環式アルキルには、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、及びシクロヘキシルなどが含まれ;不飽和環式アルキルには、シクロペンテニル及びシクロヘキセニルなどが含まれる。
「アルキル」は、1~24個の炭素原子を含有する直鎖又は分岐の非環式又は環式飽和脂肪族炭化水素を意味する。代表的な飽和直鎖アルキルには、メチル、エチル、n-プロピル、n-ブチル、n-ペンチル、及びn-ヘキシルなどが含まれ;飽和分岐アルキルには、イソプロピル、sec-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、及びイソペンチルなどが含まれる。代表的な飽和環式アルキルには、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、及びシクロヘキシルなどが含まれ;不飽和環式アルキルには、シクロペンテニル及びシクロヘキセニルなどが含まれる。
「アルケニル」は、隣接した炭素原子間に少なくとも1つの二重結合を含有する、上記に定義されているようなアルキルを意味する。アルケニルには、cis及びTrans異性体の両方が含まれる。代表的な直鎖及び分岐アルケニルには、エチレニル、プロピレニル、1-ブテニル、2-ブテニル、イソブチレニル、1-ペンテニル、2-ペンテニル、3-メチル-1-ブテニル、2-メチル-2-ブテニル、及び2,3-ジメチル-2-ブテニルなどが含まれる。
「アルキニル」は、隣接した炭素間に少なくとも1つの三重結合をさらに含有する、上記に定義されているような任意のアルキル又はアルケニルを意味する。代表的な直鎖及び分岐アルキニルには、アセチレニル、プロピニル、1-ブチニル、2-ブチニル、1-ペンチニル、2-ペンチニル、及び3-メチル-1ブチニルなどが含まれる。
「アシル」という用語は、水素、アルキル、部分的に飽和した又は完全に飽和したシクロアルキル、部分的に飽和した又は完全に飽和したヘテロ環、アリール、及びへテロアリールで置換されたカルボニル基を指す。例えば、アシルには、(C1~C20)アルカノイル(例えば、ホルミル、アセチル、プロピオニル、ブチリル、バレリル、カプロイル、t-ブチルアセチルなど)、(C3~C20)シクロアルキルカルボニル(例えば、シクロプロピルカルボニル、シクロブチルカルボニル、シクロペンチルカルボニル、シクロヘキシルカルボニルなど)、ヘテロ環式カルボニル(例えば、ピロリジニルカルボニル、ピロリド-2-オン-5-カルボニル、ピペリジニルカルボニル、ピペラジニルカルボニル、テトラヒドロフラニルカルボニルなど)、アロイル(例えば、ベンゾイル)、及びヘテロアロイル(例えば、チオフェニル-2-カルボニル、チオフェニル-3-カルボニル、フラニル-2-カルボニル、フラニル-3-カルボニル、lH-ピロイル-2-カルボニル、lH-ピロイル-3-カルボニル、ベンゾ[b]チオフェニル-2-カルボニルなど)などの基が含まれる。
「アリール」という用語は、芳香族単環式、二環式、又は三環式炭化水素環系を指し、そこでは任意の環原子が置換されていてもよい。アリール部分の例には、これらに限定されないが、フェニル、ナフチル、アントラセニル、及びピレニルが含まれる。
「ヘテロ環」は、飽和、不飽和、又は芳香族のいずれかであり、窒素、酸素、及び硫黄から独立して選択される1個又は2個のヘテロ原子を含有する7~10員の単環式、又は7~10員の二環式、ヘテロ環式環を意味し、そこでは、窒素及び硫黄ヘテロ原子は、随意に酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は、随意に四級化されており、上記ヘテロ環のいずれかがベンゼン環に融合されている二環式環を含む。ヘテロ環は、任意のヘテロ原子又は炭素原子を介して結合されていてもよい。ヘテロ環には、下記で定義されているへテロアリールが含まれる。ヘテロ環には、モルフォリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペリジニル(piperizynyl)、ヒダントイニル、バレロラクトンバレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロプリミジニル(tetrahydroprimidinyl)、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、及びテトラヒドロチオピラニルなどが含まれる。
「へテロアリール」という用語は、単環式の場合は1~3個のヘテロ原子、二環式の場合は1~6個のヘテロ原子、三環式の場合は1~9個のヘテロ原子を有する芳香族5~8員単環式、8~12員二環式、又は11~14員三環式環系を指し、前記ヘテロ原子は、O、N、又はSから選択され(例えば、炭素原子、及び単環式、二環式、又は三環式の場合、それぞれ1~3、1~6、又は1~9個のN,O、又はSのヘテロ原子)を指し、そこでは任意の環原子が置換されていてもよい。本明細書に記載されているへテロアリール基は、共通の炭素間結合を共有する融合環を含有することもできる。「アルキルヘテロシル(alkylheterocyle)」という用語は、環原子の少なくとも1つが、アルキル、アルケニル、又はアルキニルと置換されているへテロアリールを指す。
「置換された」という用語は、所与の構造の1つ以上の水素ラジカルが、以下のものを含むがそれらに限定されない指定された置換基のラジカルと置換されることを指す:ハロ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール基、ヘテロシクリル、チオール、アルキルチオ、オキソ、チオキシ、アリールチオ、アルキルチオアルキル、アリールチオアルキル、アルキルスルホニル、アルキルスルホニルアルキル、アリールスルホニルアルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アラルコキシ(aralkoxy)、アミノカルボニル、アルキルアミノカルボニル、アリールアミノカルボニル、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ハロアルキル、アミノ、トリフルオロメチル、シアノ、ニトロ、アルキルアミノ、アリールアミノ、アルキルアミノアルキル、アリールアミノアルキル、アミノアルキルアミノ、ヒドロキシ、アルコキシアルキル、カルボキシアルキル、アルコキシカルボニルアルキル、アミノカルボニルアルキル、アシル、アラルコキシカルボニル(aralkoxycarbonyl)、カルボン酸、スルホン酸、スルホニル、ホスホン酸、アリール、へテロアリール、ヘテロ環式、及び脂肪族。置換基はさらに置換されてもよいことが理解される。例示的な置換基には、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、及び環式アミノ化合物が含まれる。
「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨードを意味する。
「アルキルアミン」及び「ジアルキルアミン」という用語は、それぞれ-NH(アルキル)及び-N(アルキル)2ラジカルを指す。
「アルキルホスフェート」という用語は、-O-P(Q’)(Q’’)-O-Rを指し、式中Q’及びQ’’は、各々独立してO、S、N(R)2、随意に置換されたアルキル又はアルコキシであり、Rは、随意に置換されたアルキル、ω-アミノアルキル、又はω-(置換)アミノアルキルである。
「アルキルホスホロチオアート」という用語は、Q’又はQ’’の少なくとも1つがSであるアルキルホスフェートを指す。
「アルキルホスホネート」という用語は、Q’又はQ’’の少なくとも1つがアルキルであるアルキルホスフェートを指す。
「ヒドロキシアルキル」という用語は、-O-アルキルラジカルを意味する。
「アルキルヘテロ環」という用語は、少なくとも1つのメチレンがヘテロ環と取替されているアルキルを指す。
「ω-アミノアルキル」という用語は、-アルキルNH2ラジカルを指す。及び「ω-(置換)アミノアルキル」という用語は、H又はNの少なくとも1つがアルキルと置換されているω-アミノアルキルを指す。
「ω-ホスホアルキル」という用語は、-アルキル-O-P(Q’)(Q’’)-O-Rを指し、式中Q’及びQ’’は、各々独立してO又はSであり、Rは随意に置換されたアルキルである。
「ω-チオホスホアルキル」という用語は、Q’又はQ’’の少なくとも1つがSであるω-ホスホアルキルを指す。
幾つかの実施形態では、本発明の方法は、保護基の使用を必要とする場合がある。保護基法は、当業者に周知である(例えば、Protective Groups in Organic Synthesis, Green, T. W. et. al., Wiley-Interscience, New York City, 1999を参照)。手短に言えば、本発明の状況内の保護基は、官能基の望ましくない反応性を低減又は除去する任意の基である。保護基は、官能基に付加されて、特定の反応中にその反応性を遮蔽し、その後取り除かれて元の官能基に戻すことができる。幾つかの実施形態では、「アルコール保護基」が使用される。「アルコール保護基」は、アルコール官能基の望ましくない反応性を低減又は除去する任意の基である。保護基は、当該技術分野で周知の技術を使用して、付加及び除去することができる。
本発明の化合物は、実施例でより詳細に記載されている方法を含む公知の有機合成技術により調製することができる。
実施例 実施例1 メタンスルホン酸オクタデカ-9,12-ジエニルエステル2の合成
スキーム1
ジクロロメタン(100mL)中のアルコール1(26.6g、100ミリモル)溶液に、トリエチルアミン(13.13g、130ミリモル)を添加し、この溶液を氷浴で冷却した。この冷却溶液に、ジクロロメタン(60mL)中の塩化メシル(12.6g、110ミリモル)溶液を滴加し、添加の完了後、反応混合物を周囲温度に加温し、オーバーナイトで撹拌した。反応混合物のTLCは、反応の完了を示した。反応混合物をジクロロメタン(200mL)で希釈し、水(200mL)、飽和NaHCO3(200mL)、ブライン(100mL)で洗浄し、乾燥した(NaSO4)。有機層を濃縮して粗生成物を得、それを、ヘキサン中0~10%Et2Oを使用したカラムクロマトグラフィー(シリカゲル)で精製した。純粋な生成物画分を混合及び濃縮し、無色油状物として純粋な生成物2を得た(30.6g、89%)。1H NMR(CDCl3、400MHz)δ=5.42~5.21(m、4H)、4.20(t、2H)、3.06(s、3H)、2.79(t、2H)、2.19~2.00(m、4H)、1.90~1.70(m、2H)、1.06~1.18(m、18H)、0.88(t、3H)。13C NMR(CDCl3)δ=130.76、130.54、128.6、128.4、70.67、37.9、32.05、30.12、29.87、29.85、29.68、29.65、29.53、27.72、27.71、26.15、25.94、23.09、14.60。MS:C19H36O3Sの分子量計算値:計算値344.53、実測値343.52(M-H-)。
スキーム1
18-ブロモオクタデカ-6,9-ジエン3の合成
メシレート2(13.44g、39ミリモル)を無水エーテル(500mL)に溶解し、それに、MgBr.Et2O錯体(30.7g、118ミリモル)をアルゴン下で添加し、混合物を26時間アルゴン下で還流し、その後TLCは反応の完了を示した。反応混合物をエーテル(200mL)で希釈し、氷水(200mL)をこの混合物に添加し、層を分離した。有機層を1%K2CO3水溶液(100mL)、ブライン(100mL)で洗浄し、乾燥した(無水Na2SO4)。有機層を濃縮して粗生成物を得、それを、ヘキサン中0~1%Et2Oを使用したカラムクロマトグラフィー(シリカゲル)により精製し、無色油状物としてブロモ3(12.6g、94%)を単離した。1H NMR(CDCl3、400MHz)δ=5.41~5.29(m、4H)、4.20(d、2H)、3.40(t、J=7Hz、2H)、2.77(t、J=6.6Hz、2H)、2.09~2.02(m、4H)、1.88~1.00(m、2H)、1.46~1.27(m、18H)、0.88(t、J=3.9Hz、3H)。13C NMR(CDCl3)δ=130.41、130.25、128.26、128.12、34.17、33.05、31.75、29.82、29.57、29.54、29.39、28.95、28.38、27.42、27.40、25.84、22.79、14.28。
メシレート2(13.44g、39ミリモル)を無水エーテル(500mL)に溶解し、それに、MgBr.Et2O錯体(30.7g、118ミリモル)をアルゴン下で添加し、混合物を26時間アルゴン下で還流し、その後TLCは反応の完了を示した。反応混合物をエーテル(200mL)で希釈し、氷水(200mL)をこの混合物に添加し、層を分離した。有機層を1%K2CO3水溶液(100mL)、ブライン(100mL)で洗浄し、乾燥した(無水Na2SO4)。有機層を濃縮して粗生成物を得、それを、ヘキサン中0~1%Et2Oを使用したカラムクロマトグラフィー(シリカゲル)により精製し、無色油状物としてブロモ3(12.6g、94%)を単離した。1H NMR(CDCl3、400MHz)δ=5.41~5.29(m、4H)、4.20(d、2H)、3.40(t、J=7Hz、2H)、2.77(t、J=6.6Hz、2H)、2.09~2.02(m、4H)、1.88~1.00(m、2H)、1.46~1.27(m、18H)、0.88(t、J=3.9Hz、3H)。13C NMR(CDCl3)δ=130.41、130.25、128.26、128.12、34.17、33.05、31.75、29.82、29.57、29.54、29.39、28.95、28.38、27.42、27.40、25.84、22.79、14.28。
18-シアノオクタデカ-6,9-ジエン4の合成
エタノール(90mL)中のメシレート(3.44g、10ミリモル)溶液に、水(10mL)中のKCN(1.32g、20ミリモル)溶液を添加し、混合物を30分間還流し、その後反応混合物のTLCは反応の完了を示し、その後エーテル(200mL)を反応混合物に添加し、その後で水を添加した。反応混合物をエーテルで抽出し、混合した有機層を水(100mL)、ブライン(200mL)で洗浄し、乾燥した。有機層を濃縮することにより粗生成物がもたらされ、それをカラムクロマトグラフィー(ヘキサン中0~10%Et2O)で精製した。純粋な生成物4を、無色油状物として単離した(2g、74%)。1H NMR(CDCl3、400MHz)δ=5.33~5.22(m、4H)、2.70(t、2H)、2.27~2.23(m、2H)、2.00~1.95(m、4H)、1.61~1.54(m、2H)、1.39~1.20(m、18H)、0.82(t、3H)。13C NMR(CDCl3)δ=130.20、129.96、128.08、127.87、119.78、70.76、66.02、32.52、29.82、29.57、29.33、29.24、29.19、29.12、28.73、28.65、27.20、27.16、25.62、25.37、22.56、17.10、14.06。MS:C19H33Nの分子量計算値:計算値275.47、実測値276.6(M-H-)。
エタノール(90mL)中のメシレート(3.44g、10ミリモル)溶液に、水(10mL)中のKCN(1.32g、20ミリモル)溶液を添加し、混合物を30分間還流し、その後反応混合物のTLCは反応の完了を示し、その後エーテル(200mL)を反応混合物に添加し、その後で水を添加した。反応混合物をエーテルで抽出し、混合した有機層を水(100mL)、ブライン(200mL)で洗浄し、乾燥した。有機層を濃縮することにより粗生成物がもたらされ、それをカラムクロマトグラフィー(ヘキサン中0~10%Et2O)で精製した。純粋な生成物4を、無色油状物として単離した(2g、74%)。1H NMR(CDCl3、400MHz)δ=5.33~5.22(m、4H)、2.70(t、2H)、2.27~2.23(m、2H)、2.00~1.95(m、4H)、1.61~1.54(m、2H)、1.39~1.20(m、18H)、0.82(t、3H)。13C NMR(CDCl3)δ=130.20、129.96、128.08、127.87、119.78、70.76、66.02、32.52、29.82、29.57、29.33、29.24、29.19、29.12、28.73、28.65、27.20、27.16、25.62、25.37、22.56、17.10、14.06。MS:C19H33Nの分子量計算値:計算値275.47、実測値276.6(M-H-)。
ヘプタトリアコンタ-6,9,28,31-テトラエン-19-オン7の合成
火炎乾燥した500mL 2NRBフラスコに、新しく活性化したMg削屑(0.144g、6ミリモル)を添加し、磁気撹拌子及び還流冷却器をフラスコに取り付けた。この装置をアルゴンで脱気及び通気し、10mLの無水エーテルを注射器でフラスコに添加した。ブロミド3(1.65g、5ミリモル)を無水エーテル(10mL)に溶解し、注射器でフラスコに滴加した。発熱反応が認められ(グリニャール試薬形成を確認/加速するために、2mgのヨウ素を添加し、即時脱色が観察され、グリニャール試薬の形成が確認された)、エーテルの還流を開始した。添加の完了後、反応混合物を35℃で1時間維持し、その後氷浴で冷却した。シアン化物4(1.38g、5ミリモル)を無水エーテル(20mL)に溶解し、撹拌しながら反応物に滴加した。発熱反応が観察され、反応混合物を周囲温度でオーバーナイトで撹拌した。10mLのアセトン、その後氷冷水(60mL)を滴加することにより、反応を停止させた。溶液が均質になり層が分離されるまで、反応混合物をH2SO4水溶液(10容積%、200mL)で処理した。水相をエーテル(2×100mL)で抽出した。混合したエーテル層を乾燥(Na2SO4)及び濃縮して粗生成物を得、それをカラム(シリカゲル、ヘキサン中0~10%エーテル)クロマトグラフィーで精製した。純粋な生成物画分を蒸発させて、純粋なケトン7を無色油状物(2g、74%)として得た。1H NMR(CDCl3、400MHz)δ=5.33~5.21(m、8H)、2.69(t、4H)、2.30(t、4H)、2.05~1.95(m、8H)、1.55~1.45(m、2H)、1.35~1.15(m、18H)、0.82(t、3H)。13C NMR(CDCl3)δ=211.90、130.63、130.54、128.47、128.41、43.27、33.04、32.01、30.93、29.89、29.86、29.75、29.74、27.69、26.11、24.35、23.06、14.05。MS:C37H66Oの分子量計算値:計算値526.92、実測値528.02(M+H+)。
火炎乾燥した500mL 2NRBフラスコに、新しく活性化したMg削屑(0.144g、6ミリモル)を添加し、磁気撹拌子及び還流冷却器をフラスコに取り付けた。この装置をアルゴンで脱気及び通気し、10mLの無水エーテルを注射器でフラスコに添加した。ブロミド3(1.65g、5ミリモル)を無水エーテル(10mL)に溶解し、注射器でフラスコに滴加した。発熱反応が認められ(グリニャール試薬形成を確認/加速するために、2mgのヨウ素を添加し、即時脱色が観察され、グリニャール試薬の形成が確認された)、エーテルの還流を開始した。添加の完了後、反応混合物を35℃で1時間維持し、その後氷浴で冷却した。シアン化物4(1.38g、5ミリモル)を無水エーテル(20mL)に溶解し、撹拌しながら反応物に滴加した。発熱反応が観察され、反応混合物を周囲温度でオーバーナイトで撹拌した。10mLのアセトン、その後氷冷水(60mL)を滴加することにより、反応を停止させた。溶液が均質になり層が分離されるまで、反応混合物をH2SO4水溶液(10容積%、200mL)で処理した。水相をエーテル(2×100mL)で抽出した。混合したエーテル層を乾燥(Na2SO4)及び濃縮して粗生成物を得、それをカラム(シリカゲル、ヘキサン中0~10%エーテル)クロマトグラフィーで精製した。純粋な生成物画分を蒸発させて、純粋なケトン7を無色油状物(2g、74%)として得た。1H NMR(CDCl3、400MHz)δ=5.33~5.21(m、8H)、2.69(t、4H)、2.30(t、4H)、2.05~1.95(m、8H)、1.55~1.45(m、2H)、1.35~1.15(m、18H)、0.82(t、3H)。13C NMR(CDCl3)δ=211.90、130.63、130.54、128.47、128.41、43.27、33.04、32.01、30.93、29.89、29.86、29.75、29.74、27.69、26.11、24.35、23.06、14.05。MS:C37H66Oの分子量計算値:計算値526.92、実測値528.02(M+H+)。
実施例2:ケトン7の別途合成
化合物6bの合成
火炎乾燥した500mL RBフラスコに、新しく活性化したMg削屑(2.4g、100ミリモル)を添加し、磁気撹拌子、添加用漏斗、及び還流冷却器をフラスコに取り付けた。この装置をアルゴンで脱気及び通気し、10mLの無水エーテルを注射器でフラスコに添加した。ブロミド3(26.5g、80.47ミリモル)を無水エーテル(50mL)に溶解し、添加用漏斗に加えた。約5mLのこのエーテル溶液を、勢い良く撹拌しながらMg削屑に添加した。発熱反応が認められ(グリニャール試薬形成を確認/加速するために、5mgのヨウ素を添加し、即時脱色が観察され、グリニャール試薬の形成が確認された)、エーテルの還流を開始した。水中でフラスコを冷却することによる穏やかな還流下で反応を維持しながら、ブロミド溶液の残りを滴加した。添加の完了後、反応混合物を35℃で1時間維持し、その後氷浴で冷却した。ギ酸エチル(2.68g、36.2ミリモル)を無水エーテル(40mL)に溶解し、添加用漏斗に移し、撹拌しながら反応混合物に滴加した。発熱反応が観察され、反応混合物の還流を開始した。反応の開始後、エーテル性蟻酸溶液の残りを流動として迅速に添加し、反応混合物を周囲温度でさらに1時間撹拌した。10mLのアセトン、その後氷冷水(60mL)を滴加することにより、反応を停止させた。溶液が均質になり層が分離されるまで、反応混合物をH2SO4水溶液(10容積%、300mL)で処理した。水相をエーテル(2×100mL)で抽出した。混合したエーテル層を乾燥(Na2SO4)及び濃縮して粗生成物を得、それをカラム(シリカゲル、ヘキサン中0~10%エーテル)クロマトグラフィーで精製した。わずかにより極性でない画分を濃縮して蟻酸エステル6a(1.9g)を得、純粋な生成物画分を蒸発させて、純粋な生成物6bを無色油状物として得た(14.6g、78%)。
火炎乾燥した500mL RBフラスコに、新しく活性化したMg削屑(2.4g、100ミリモル)を添加し、磁気撹拌子、添加用漏斗、及び還流冷却器をフラスコに取り付けた。この装置をアルゴンで脱気及び通気し、10mLの無水エーテルを注射器でフラスコに添加した。ブロミド3(26.5g、80.47ミリモル)を無水エーテル(50mL)に溶解し、添加用漏斗に加えた。約5mLのこのエーテル溶液を、勢い良く撹拌しながらMg削屑に添加した。発熱反応が認められ(グリニャール試薬形成を確認/加速するために、5mgのヨウ素を添加し、即時脱色が観察され、グリニャール試薬の形成が確認された)、エーテルの還流を開始した。水中でフラスコを冷却することによる穏やかな還流下で反応を維持しながら、ブロミド溶液の残りを滴加した。添加の完了後、反応混合物を35℃で1時間維持し、その後氷浴で冷却した。ギ酸エチル(2.68g、36.2ミリモル)を無水エーテル(40mL)に溶解し、添加用漏斗に移し、撹拌しながら反応混合物に滴加した。発熱反応が観察され、反応混合物の還流を開始した。反応の開始後、エーテル性蟻酸溶液の残りを流動として迅速に添加し、反応混合物を周囲温度でさらに1時間撹拌した。10mLのアセトン、その後氷冷水(60mL)を滴加することにより、反応を停止させた。溶液が均質になり層が分離されるまで、反応混合物をH2SO4水溶液(10容積%、300mL)で処理した。水相をエーテル(2×100mL)で抽出した。混合したエーテル層を乾燥(Na2SO4)及び濃縮して粗生成物を得、それをカラム(シリカゲル、ヘキサン中0~10%エーテル)クロマトグラフィーで精製した。わずかにより極性でない画分を濃縮して蟻酸エステル6a(1.9g)を得、純粋な生成物画分を蒸発させて、純粋な生成物6bを無色油状物として得た(14.6g、78%)。
化合物7の合成
CH2Cl2(60mL)中のアルコール6b(3g、5.68ミリモル)溶液に、新しく活性化した4Aモレキュラーシーブ(50g)を添加し、この溶液に粉末PCC(4.9g、22.7ミリモル)を、20分間にわたって数回に分けて添加し、混合物をさらに1時間撹拌し(注:長期にわたる反応時間はより低い収率に結びつくため、良好な収率を得るためには反応を注意深く監視することが必要である)、その後反応混合物のTLCを10分毎に実施した(ヘキサン中5%エーテル)。反応の完了後、反応混合物をシリカゲルのパッドでろ過し、残渣をCH2Cl2(400mL)で洗浄した。ろ過液を濃縮し、このようにして得た粗生成物を、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル、ヘキサン中1%Et2O)でさらに精製して、純粋な生成物7(2.9g、97%)を無色油状物として単離した。1H NMR(CDCl3、400MHz)δ=5.33~5.21(m、8H)、2.69(t、4H)、2.30(t、4H)、2.05~1.95(m、8H)、1.55~1.45(m、2H)、1.35~1.15(m、18H)、0.82(t、3H)。13C NMR(CDCl3)δ=211.90、130.63、130.54、128.47、128.41、43.27、33.04、32.01、30.93、29.89、29.86、29.75、29.74、27.69、26.11、24.35、23.06、14.05。MS:C37H66Oの分子量計算値:計算値526.92、実測値528.02(M+H+)。
CH2Cl2(60mL)中のアルコール6b(3g、5.68ミリモル)溶液に、新しく活性化した4Aモレキュラーシーブ(50g)を添加し、この溶液に粉末PCC(4.9g、22.7ミリモル)を、20分間にわたって数回に分けて添加し、混合物をさらに1時間撹拌し(注:長期にわたる反応時間はより低い収率に結びつくため、良好な収率を得るためには反応を注意深く監視することが必要である)、その後反応混合物のTLCを10分毎に実施した(ヘキサン中5%エーテル)。反応の完了後、反応混合物をシリカゲルのパッドでろ過し、残渣をCH2Cl2(400mL)で洗浄した。ろ過液を濃縮し、このようにして得た粗生成物を、カラムクロマトグラフィー(シリカゲル、ヘキサン中1%Et2O)でさらに精製して、純粋な生成物7(2.9g、97%)を無色油状物として単離した。1H NMR(CDCl3、400MHz)δ=5.33~5.21(m、8H)、2.69(t、4H)、2.30(t、4H)、2.05~1.95(m、8H)、1.55~1.45(m、2H)、1.35~1.15(m、18H)、0.82(t、3H)。13C NMR(CDCl3)δ=211.90、130.63、130.54、128.47、128.41、43.27、33.04、32.01、30.93、29.89、29.86、29.75、29.74、27.69、26.11、24.35、23.06、14.05。MS:C37H66Oの分子量計算値:計算値526.92、実測値528.02(M+H+)。
実施例3:非対称ケトン25及び27の合成
スキーム3
ヘプタトリアコンタ-6,9,28-トリエン-19-オン25の合成
乾燥した50mL 2NRBフラスコに、新しく活性化したMg削屑(132mg、0.0054ミリモル)を添加し、磁気撹拌子及び還流冷却器をフラスコに取り付けた。この装置を窒素で脱気及び通気し、10mLの無水エーテルを注射器でフラスコに添加した。ブロミド24(1.8g、0.0054ミリモル)を無水エーテル(10mL)に溶解し、注射器でフラスコに滴加した。発熱反応が認められ(反応はジブロモエタンで開始された)、エーテルの還流を開始した。添加の完了後、反応混合物を35℃で1時間維持し、その後氷浴で10~15℃に冷却した。シアン化物4(0.5g、0.0018ミリモル)を乾燥THF(5mL)に溶解し、撹拌しながら反応物に滴加した。発熱反応が観察され、反応混合物を12時間還流し(70℃で)、塩化アンモニウム溶液で反応を停止させた。その後、溶液が均質になり層が分離されるまで、溶液を25%HCl溶液で処理した。水相をエーテル(2×100mL)で抽出した。混合したエーテル層を乾燥及び濃縮して粗生成物を得、それをカラムクロマトグラフィーで精製した。純粋な生成物画分を蒸発させて、純粋なケトン25を無色油状物として得た。
収量:0.230g(24%)。1H-NMR(CDCl3、400MHz):δ=5.37~5.30(m、6H)、2.77~2.74(t、2H)、2.38~2.34(t、4H)、2.05~1.95(m、8H)、1.56~1.52(m、4H)、1.35~1.25(m、脂肪族プロトン)、0.89~0.85(t、6H)。IR(cm-1):2924、2854、1717、1465、1049、721。
スキーム3
乾燥した50mL 2NRBフラスコに、新しく活性化したMg削屑(132mg、0.0054ミリモル)を添加し、磁気撹拌子及び還流冷却器をフラスコに取り付けた。この装置を窒素で脱気及び通気し、10mLの無水エーテルを注射器でフラスコに添加した。ブロミド24(1.8g、0.0054ミリモル)を無水エーテル(10mL)に溶解し、注射器でフラスコに滴加した。発熱反応が認められ(反応はジブロモエタンで開始された)、エーテルの還流を開始した。添加の完了後、反応混合物を35℃で1時間維持し、その後氷浴で10~15℃に冷却した。シアン化物4(0.5g、0.0018ミリモル)を乾燥THF(5mL)に溶解し、撹拌しながら反応物に滴加した。発熱反応が観察され、反応混合物を12時間還流し(70℃で)、塩化アンモニウム溶液で反応を停止させた。その後、溶液が均質になり層が分離されるまで、溶液を25%HCl溶液で処理した。水相をエーテル(2×100mL)で抽出した。混合したエーテル層を乾燥及び濃縮して粗生成物を得、それをカラムクロマトグラフィーで精製した。純粋な生成物画分を蒸発させて、純粋なケトン25を無色油状物として得た。
収量:0.230g(24%)。1H-NMR(CDCl3、400MHz):δ=5.37~5.30(m、6H)、2.77~2.74(t、2H)、2.38~2.34(t、4H)、2.05~1.95(m、8H)、1.56~1.52(m、4H)、1.35~1.25(m、脂肪族プロトン)、0.89~0.85(t、6H)。IR(cm-1):2924、2854、1717、1465、1049、721。
ヘプタトリアコンタ-6,9-ジエン-19-オン27の合成
火炎乾燥した500mL 2NRBフラスコに、新しく活性化したMg削屑(0.144g、6ミリモル)を添加し、磁気撹拌子及び還流冷却器をフラスコに取り付ける。この装置をアルゴンで脱気及び通気し、10mLの無水エーテルを注射器でフラスコに添加する。市販のブロミド26(2.65g、5ミリモル)を無水エーテル(10mL)に溶解し、注射器でフラスコに滴加する。添加の完了後、反応混合物を35℃で1時間維持し、その後氷浴で冷却する。シアン化物4(1.38g、5ミリモル)を無水エーテル(20mL)に溶解し、撹拌しながら反応物に滴加する。発熱反応が観察され、反応混合物を周囲温度でオーバーナイトで撹拌する。10mLのアセトン、その後氷冷水(60mL)を滴加することにより、反応を停止させる。溶液が均質になり層が分離されるまで、反応混合物をH2SO4水溶液(10容積%、200mL)で処理する。水相をエーテル(2×100mL)で抽出する。混合したエーテル層を乾燥(Na2SO4)及び濃縮して粗生成物を得、それをカラムクロマトグラフィーで精製して、純粋なケトン27を無色油状物として得る。1H-NMR(CDCl3、400MHz):δ=5.42~5.30(m、4H)、2.79~2.78(t、2H)、2.40~2.37(t、4H)、2.08~2.03(m、4H)、1.58~1.54(m、4H)、1.36~1.26(br m、脂肪族プロトン)、0.91~0.87(t、6H)。IR(cm-1):2924、2854、1716、1465、1375、721。
火炎乾燥した500mL 2NRBフラスコに、新しく活性化したMg削屑(0.144g、6ミリモル)を添加し、磁気撹拌子及び還流冷却器をフラスコに取り付ける。この装置をアルゴンで脱気及び通気し、10mLの無水エーテルを注射器でフラスコに添加する。市販のブロミド26(2.65g、5ミリモル)を無水エーテル(10mL)に溶解し、注射器でフラスコに滴加する。添加の完了後、反応混合物を35℃で1時間維持し、その後氷浴で冷却する。シアン化物4(1.38g、5ミリモル)を無水エーテル(20mL)に溶解し、撹拌しながら反応物に滴加する。発熱反応が観察され、反応混合物を周囲温度でオーバーナイトで撹拌する。10mLのアセトン、その後氷冷水(60mL)を滴加することにより、反応を停止させる。溶液が均質になり層が分離されるまで、反応混合物をH2SO4水溶液(10容積%、200mL)で処理する。水相をエーテル(2×100mL)で抽出する。混合したエーテル層を乾燥(Na2SO4)及び濃縮して粗生成物を得、それをカラムクロマトグラフィーで精製して、純粋なケトン27を無色油状物として得る。1H-NMR(CDCl3、400MHz):δ=5.42~5.30(m、4H)、2.79~2.78(t、2H)、2.40~2.37(t、4H)、2.08~2.03(m、4H)、1.58~1.54(m、4H)、1.36~1.26(br m、脂肪族プロトン)、0.91~0.87(t、6H)。IR(cm-1):2924、2854、1716、1465、1375、721。
実施例4:C12鎖を有する非対称ケトンの合成
スキーム4
乾燥した50mL 2NRBフラスコに、新しく活性化したMg削屑(175mg、0.0072ミリモル)を添加し、磁気撹拌子及び還流冷却器をフラスコに取り付けた。この装置を窒素で脱気及び通気し、10mLの無水エーテルを注射器でフラスコに添加した。ブロミド28(1.5g、0.006ミリモル)を無水エーテル(7mL)に溶解し、注射器でフラスコに滴加した。発熱反応が認められ(反応はジブロモエタンで開始された)、エーテルの還流を開始した。添加の完了後、反応混合物を35℃で1時間維持し、その後氷浴で10~15℃に冷却した。シアン化物4(1g、0.0036ミリモル)を無水エーテル(7mL)に溶解し、撹拌しながら反応物に滴加した。発熱反応が観察され、反応混合物を12時間還流し、塩化アンモニウム溶液で反応を停止させた。その後、溶液が均質になり層が分離されるまで、溶液を25%HCl溶液で処理した。水相をエーテルで抽出した。混合したエーテル層を乾燥及び濃縮して粗生成物を得、それをカラムクロマトグラフィーで精製した。純粋な生成物画分を蒸発させて、純粋なケトン29を無色油状物として得た。収量:0.65g(26%)。1H~NMR(δppm):5.388~5.302(m、4H)、2.77~2.74(t、2H)、2.38~2.34(t、4H)、2.04~2.01(m、4H)、1.34~1.18(m、36H)、0.89~0.85(m、6H)。IR(cm-1):3009、2920、2851、1711(C=O)、1466、1376、1261。
スキーム4
実施例5:C10鎖を有する非対称ケトン31の合成
スキーム5
乾燥した50mL 2NRBフラスコに、新しく活性化したMg削屑(266mg、0.0109ミリモル)を添加し、磁気撹拌子及び還流冷却器をフラスコに取り付けた。この装置を窒素で脱気及び通気し、10mLの無水エーテルを注射器でフラスコに添加した。ブロミド(2.43g、0.0109ミリモル)を無水エーテル(7mL)に溶解し、注射器でフラスコに滴加した。発熱反応が認められ(反応はジブロモエタンで開始された)、エーテルの還流を開始した。添加の完了後、反応混合物を35℃で1時間維持し、その後氷浴で10~15℃に冷却した。シアン化物(1g、0.0036ミリモル)を無水エーテル(7mL)に溶解し、撹拌しながら反応物に滴加した。発熱反応が観察され、反応混合物を周囲温度で2時間撹拌した。THF(4mL)を反応混合物に添加し、シアノ誘導体が完全に消費されるまで、それを4時間45~50℃に加温した。3mLのアセトン、その後氷冷水を滴加することにより、反応を停止させた。その後、溶液が均質になり層が分離されるまで、25%HCl溶液で反応混合物を処理した。水相をエーテルで抽出した。混合したエーテル層を乾燥及び濃縮して粗生成物を得、それをカラムクロマトグラフィーで精製した。純粋な生成物画分を蒸発させて、純粋なケトンを無色油状物として得た。収量:0.93g(61%)。1H-NMR(δppm):5.37~5.302(m、4H)、2.77~2.74(t、2H)、2.38~2.34(t、4H)、2.05~2.00(m、4H)、1.55~1.52(m、2H)、1.35~1.24(m、34H)、0.89~0.84(m6H)。IR(cm-1):3009、2925、2854、1717(C=O)、1465、1376。
スキーム5
実施例6:コレステロールを有する非対称ケトン33の合成
スキーム6
ケトン31の合成に使用された手順と同様の手順を使用して、塩化コレステリルを対応する塩化マグネシウムに変換し、その後シアン化リノレイルに添加することにより、ケトン33を得た。
スキーム6
実施例7:コレステロールを有する非対称ケトン35の合成
スキーム7
クロロギ酸コレステロールを3-ブロモプロピルアミンで処理することによりブロミド34を得、それを、対応するグリニャール試薬34aに変換し、それをシアン化リノレイルで処理することにより、対応する非対称ケトン35を良好な収率で得た。
スキーム7
化合物37の合成
LiAlH4(1.02g、0.0269モル)を含有する500mL 二つ口RBFに、無水THF(20mL)を窒素雰囲気下、室温で添加した。懸濁液を室温で1時間撹拌し、その後0℃に冷却した。この混合物に、無水THF(50mL)中の化合物1(5g、0.01798モル)溶液を、内部温度を0℃に維持しながらゆっくりと添加した。添加の完了後、反応混合物を周囲温度に加温し、1時間撹拌した。反応の進行は、TLCで監視した。反応が完了したら、混合物を0℃に冷却し、飽和Na2SO4水溶液で反応を停止させた。反応混合物を30分間撹拌し、形成された固形物をセライト床でろ過し、酢酸エチル(100mL)で洗浄した。ろ過液及び洗浄液を混合しロータリーエバポレータで蒸発させて、化合物37を無色液体として得、それをいかなる精製もせずにそのまま次の段階で使用した。収量:(4.5g、95%)。1H NMR(400MHz、CDCl3)δ=5.39~5.28(m、6H)、3.64~3.61(t、2H)、2.81~2.78(t、4H)、2.10~2.01(m、4H)、1.59~1.51(m、2H)、1.29~1.22(m、脂肪族プロトン)、0.98~0.94(t、3H)。
LiAlH4(1.02g、0.0269モル)を含有する500mL 二つ口RBFに、無水THF(20mL)を窒素雰囲気下、室温で添加した。懸濁液を室温で1時間撹拌し、その後0℃に冷却した。この混合物に、無水THF(50mL)中の化合物1(5g、0.01798モル)溶液を、内部温度を0℃に維持しながらゆっくりと添加した。添加の完了後、反応混合物を周囲温度に加温し、1時間撹拌した。反応の進行は、TLCで監視した。反応が完了したら、混合物を0℃に冷却し、飽和Na2SO4水溶液で反応を停止させた。反応混合物を30分間撹拌し、形成された固形物をセライト床でろ過し、酢酸エチル(100mL)で洗浄した。ろ過液及び洗浄液を混合しロータリーエバポレータで蒸発させて、化合物37を無色液体として得、それをいかなる精製もせずにそのまま次の段階で使用した。収量:(4.5g、95%)。1H NMR(400MHz、CDCl3)δ=5.39~5.28(m、6H)、3.64~3.61(t、2H)、2.81~2.78(t、4H)、2.10~2.01(m、4H)、1.59~1.51(m、2H)、1.29~1.22(m、脂肪族プロトン)、0.98~0.94(t、3H)。
化合物38の合成
化合物37(14g、0.0530モル)を、500mL 二つ口RBF中のDCM(300mL)に溶解し、0℃に冷却した。この溶液に、トリエチルアミン(29.5mL、0.2121モル)を不活性雰囲気下でゆっくりと添加した。その後、反応混合物を、10~15分間撹拌し、それに、塩化メシル(6.17のmL、0.0795モル)をゆっくりと添加した。添加の完了後、反応混合物の周囲温度に加温させ、20時間撹拌した。反応は、TLCで監視した。完了したら、反応混合物を水(200mL)で希釈し、数分間撹拌し、有機層を分離した。有機相をブライン(1×70mL)でさらに洗浄し、Na2SO4で乾燥し、溶媒をロータリーエバポレータで除去して、粗化合物38を褐色油状物として得、それを次の反応にそのまま使用した。収量:(17g、93%)。1H NMR(400MHz、CDCl3)δ=5.39~5.31(m、6H)、4.22~4.19(t、2H)、2.99(s、3H)、2.81~2.78(m、4H)、2.08~2.01(m、4H)、1.75.1.69(m、2H)、1.39~1.29(m、脂肪族プロトン)、0.98~0.94(t、3H)。
化合物37(14g、0.0530モル)を、500mL 二つ口RBF中のDCM(300mL)に溶解し、0℃に冷却した。この溶液に、トリエチルアミン(29.5mL、0.2121モル)を不活性雰囲気下でゆっくりと添加した。その後、反応混合物を、10~15分間撹拌し、それに、塩化メシル(6.17のmL、0.0795モル)をゆっくりと添加した。添加の完了後、反応混合物の周囲温度に加温させ、20時間撹拌した。反応は、TLCで監視した。完了したら、反応混合物を水(200mL)で希釈し、数分間撹拌し、有機層を分離した。有機相をブライン(1×70mL)でさらに洗浄し、Na2SO4で乾燥し、溶媒をロータリーエバポレータで除去して、粗化合物38を褐色油状物として得、それを次の反応にそのまま使用した。収量:(17g、93%)。1H NMR(400MHz、CDCl3)δ=5.39~5.31(m、6H)、4.22~4.19(t、2H)、2.99(s、3H)、2.81~2.78(m、4H)、2.08~2.01(m、4H)、1.75.1.69(m、2H)、1.39~1.29(m、脂肪族プロトン)、0.98~0.94(t、3H)。
化合物39の合成
メシレート38(10g、0.2923モル)を、1000mL 二つ口RBF及びMgBr2中の無水エーテル(300mL)に溶解した。Et2O錯体(22.63g、0.0877モル)を、窒素雰囲気下でそれに添加した。その後、その結果生じた混合物を加熱して26時間還流した。反応の完了後(TLCによる)、反応混合物をエーテル(300mL)及び氷水(200mL)で希釈し、エーテル層を分離した。その後、有機層を1%K2CO3水溶液(100mL)で、その後ブライン(80mL)で洗浄した。その後、有機相を無水Na2SO4で乾燥し、溶媒を減圧下で蒸発させて粗物質を得、それを、溶出系としてヘキサン中0~1%酢酸エチルを使用したシリカゲル(60~120メッシュ)でクロマトグラフィー分離し、所望の化合物39を油状物として得た。収量:(7g、73%)。1H NMR(400MHz、CDCl3)δ=5.39~5.31(m、6H)、3.41~3.37(t、2H)、2.81~2.78(m、4H)、2.08~2.02(m、4H)、1.86~1.80(m、2H)、1.42~1.29(m、脂肪族プロトン)、0.98~0.94(t、3H)。
メシレート38(10g、0.2923モル)を、1000mL 二つ口RBF及びMgBr2中の無水エーテル(300mL)に溶解した。Et2O錯体(22.63g、0.0877モル)を、窒素雰囲気下でそれに添加した。その後、その結果生じた混合物を加熱して26時間還流した。反応の完了後(TLCによる)、反応混合物をエーテル(300mL)及び氷水(200mL)で希釈し、エーテル層を分離した。その後、有機層を1%K2CO3水溶液(100mL)で、その後ブライン(80mL)で洗浄した。その後、有機相を無水Na2SO4で乾燥し、溶媒を減圧下で蒸発させて粗物質を得、それを、溶出系としてヘキサン中0~1%酢酸エチルを使用したシリカゲル(60~120メッシュ)でクロマトグラフィー分離し、所望の化合物39を油状物として得た。収量:(7g、73%)。1H NMR(400MHz、CDCl3)δ=5.39~5.31(m、6H)、3.41~3.37(t、2H)、2.81~2.78(m、4H)、2.08~2.02(m、4H)、1.86~1.80(m、2H)、1.42~1.29(m、脂肪族プロトン)、0.98~0.94(t、3H)。
非対称ケトン40の合成
火炎乾燥した500mL 二つ口RBFに磁気撹拌子及び還流冷却器を取り付け、新しく活性化したMg削屑(0.88g、0.03636モル)を添加した。この装置をアルゴンで脱気し、通気し、それにエーテル(150mL)を添加した。50mLエーテル中のブロモ化合物4(11.89g、0.03636モル)を、始めに数滴添加して反応を開始させた(注:グリニャール試薬の形成を加速するために、触媒量の1,2-ジブロモエタンも添加した)。開始時に、ブロモ化合物の残りの溶液を、還流しているエーテル溶液にゆっくりと添加した。添加の完了後、反応混合物を1.5時間40℃で還流した。その後、それを10℃に冷却し、30mL乾燥エーテル中のシアン化リノレイル4(5g、0.01818モル)を滴加し、その後その結果生じた混合物を加熱して40℃で20時間還流した。反応の進行は、TLCで監視した。シアノ誘導体40が完全に消費された後(TLCによる)、混合物を室温に冷却し、30mLのアセトン、その後氷水(50mL)で反応を停止させた。この溶液を、10%HCl溶液でさらに酸性化し、エーテル層を分離させた。水相をジエチルエーテル(2×100mL)でさらに抽出した。無水Na2SO4で乾燥した後で溶媒を除去することにより粗ケトンを得、それを、溶出系としてヘキサン中0~5%エーテルを使用したシリカゲルカラムクロマトグラフィー(100~200メッシュ)で精製し、淡黄色油状物として表題化合物40を得た。収量:(4.8g、50.5%)。1H NMR(400MHz、CDCl3)δ=5.38~5.28(m、10H)、2.80~2.74(m、6H)、2.38~2.34(t、4H)、2.08~2.00(m、8H)、1.55~1.52(m、4H)、1.35~1.26(m、脂肪族プロトン)、0.98~0.94(t、3H)、0.89~0.85(t、3H)。HPLC-98.04%。
火炎乾燥した500mL 二つ口RBFに磁気撹拌子及び還流冷却器を取り付け、新しく活性化したMg削屑(0.88g、0.03636モル)を添加した。この装置をアルゴンで脱気し、通気し、それにエーテル(150mL)を添加した。50mLエーテル中のブロモ化合物4(11.89g、0.03636モル)を、始めに数滴添加して反応を開始させた(注:グリニャール試薬の形成を加速するために、触媒量の1,2-ジブロモエタンも添加した)。開始時に、ブロモ化合物の残りの溶液を、還流しているエーテル溶液にゆっくりと添加した。添加の完了後、反応混合物を1.5時間40℃で還流した。その後、それを10℃に冷却し、30mL乾燥エーテル中のシアン化リノレイル4(5g、0.01818モル)を滴加し、その後その結果生じた混合物を加熱して40℃で20時間還流した。反応の進行は、TLCで監視した。シアノ誘導体40が完全に消費された後(TLCによる)、混合物を室温に冷却し、30mLのアセトン、その後氷水(50mL)で反応を停止させた。この溶液を、10%HCl溶液でさらに酸性化し、エーテル層を分離させた。水相をジエチルエーテル(2×100mL)でさらに抽出した。無水Na2SO4で乾燥した後で溶媒を除去することにより粗ケトンを得、それを、溶出系としてヘキサン中0~5%エーテルを使用したシリカゲルカラムクロマトグラフィー(100~200メッシュ)で精製し、淡黄色油状物として表題化合物40を得た。収量:(4.8g、50.5%)。1H NMR(400MHz、CDCl3)δ=5.38~5.28(m、10H)、2.80~2.74(m、6H)、2.38~2.34(t、4H)、2.08~2.00(m、8H)、1.55~1.52(m、4H)、1.35~1.26(m、脂肪族プロトン)、0.98~0.94(t、3H)、0.89~0.85(t、3H)。HPLC-98.04%。
実施例9:オリゴヌクレオチド合成:
オリゴヌクレオチドは全て、AKTAoligopilot合成機で合成した。細孔が制御されている市販のガラス固体支持体(dT-CPG、500Å、Prime Synthesis社製)、及び以下の標準的保護基を有するRNAホスホラミダイトを使用してオリゴヌクレオチドを合成した:5’-O-ジメトキシトリチルN6-ベンゾイル-2’-t-ブチルジメチルシリル-アデノシン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホラミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N4-アセチル-2’-t-ブチルジメチルシリル-シチジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホラミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N2--イソブトリル(isobutryl)-2’-t-ブチルジメチルシリル-グアノシン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホラミダイト、及び5’-O-ジメトキシトリチル-2’-t-ブチルジメチルシリル-ウリジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホラミダイト(Pierce Nucleic Acids Technologies社製)。2’-Fホスホラミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N4-アセチル-2’-フルロ-シチジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチル-ホスホラミダイト、及び5’-O-ジメトキシトリチル-2’-フルロ-ウリジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチル-ホスホラミダイトは、(Promega社)から購入した。ホスホラミダイトは全て、10%THF/ANC(容積/容積)中0.2M濃度で使用されたグアノシンを除いて、アセトニトリル(CH3CN)中0.2M濃度で使用した。16分間の結合/再利用時間を使用した。活性化剤は、5-エチルチオテトラゾール(0.75M、American International Chemicals社製)であり、PO酸化の場合、ヨウ素/水/ピリジンを使用し、2,6-ルチジン/ACN(1:1 容積/容積)中でのPS酸化PADS(2%)を使用した。
オリゴヌクレオチドは全て、AKTAoligopilot合成機で合成した。細孔が制御されている市販のガラス固体支持体(dT-CPG、500Å、Prime Synthesis社製)、及び以下の標準的保護基を有するRNAホスホラミダイトを使用してオリゴヌクレオチドを合成した:5’-O-ジメトキシトリチルN6-ベンゾイル-2’-t-ブチルジメチルシリル-アデノシン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホラミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N4-アセチル-2’-t-ブチルジメチルシリル-シチジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホラミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N2--イソブトリル(isobutryl)-2’-t-ブチルジメチルシリル-グアノシン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホラミダイト、及び5’-O-ジメトキシトリチル-2’-t-ブチルジメチルシリル-ウリジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチルホスホラミダイト(Pierce Nucleic Acids Technologies社製)。2’-Fホスホラミダイト、5’-O-ジメトキシトリチル-N4-アセチル-2’-フルロ-シチジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチル-ホスホラミダイト、及び5’-O-ジメトキシトリチル-2’-フルロ-ウリジン-3’-O-N,N’-ジイソプロピル-2-シアノエチル-ホスホラミダイトは、(Promega社)から購入した。ホスホラミダイトは全て、10%THF/ANC(容積/容積)中0.2M濃度で使用されたグアノシンを除いて、アセトニトリル(CH3CN)中0.2M濃度で使用した。16分間の結合/再利用時間を使用した。活性化剤は、5-エチルチオテトラゾール(0.75M、American International Chemicals社製)であり、PO酸化の場合、ヨウ素/水/ピリジンを使用し、2,6-ルチジン/ACN(1:1 容積/容積)中でのPS酸化PADS(2%)を使用した。
3’-リガンド結合鎖を、対応するリガンドを含有する固体支持体を使用して合成した。例えば、配列へのコレステロール単位の導入は、ヒドロキシプロリノール-コレステロールホスホラミダイトから実施した。コレステロールを、6-アミノヘキサノアート結合によりtrans-4-ヒドロキシプロリノールに結合させて、ヒドロキシプロリノール-コレステロール部分を得た。5’-末端Cy-3及びCy-5.5(蛍光体)標識siRNAを、Biosearch Technologies社から購入した対応するQuasar-570(Cy-3)ホスホラミダイトから合成した。5’-末端又は内部位置へのリガンドの結合は、適切に保護されたリガンド-ホスホラミダイト基本単位を使用して、5-(エチルチオ)-1H-テトラゾール活性化剤の存在下で、無水CH3CN中の0.1Mホスホラミダイト溶液を、固体に結合しているオリゴヌクレオチドに、15分間の長期にわたって結合させることにより達成する。ヌクレオチド間亜リン酸エステルのリン酸エステルへの酸化は、報告されている(1)標準的なヨウ素-水を使用するか、又はtert-ブチルヒドロペルオキシド/アセトニトリル/水(10:87:3)を用いて10分間の酸化待機時間で、結合されたオリゴヌクレオチドを処理することにより実施した。ホスホロチオアートは、DDTT(AM Chemicals社から購入)、PADS、又はBeaucage試薬などの硫黄転移試薬を使用することにより、亜リン酸エステルをホスホロチオアートに酸化することによって導入した。コレステロールホスホラミダイトは、施設内で合成し、ジクロロメタン中0.1Mの濃度で使用した。コレステロールホスホラミダイトの結合時間は16分間だった。
合成の完了後、支持体を100mLのガラスボトル(VWR社製)に移し換えた。80mLのエタノール性アンモニア混合物[アンモニア:エタノール(3:1)]を55℃で6.5時間用いて、オリゴヌクレオチドを支持体から切断し、同時に塩基及びホスフェート基を脱保護した。ボトルを氷上で短時間冷却し、その後エタノール性アンモニア混合物を新しい250mLボトルにろ過した。CPGを、2×40mL量のエタノール/水(1:1 容積/容積)で洗浄した。その後、混合物の容積を、roto-vapで約30mLに減少させた。その後混合物を、dyinceで凍結させ、減圧下でspeed vacを用いて乾燥した。
乾燥残渣を、26mLのトリエチルアミン、トリエチルアミントリヒドロフルオリド(TEA.3HF)、又はピリジン-HF、及びDMSO(3:4:6)中に再懸濁し、90分間60℃に加熱して、2’位のtert-ブチルジメチルシリル(TBDMS)基を取り除いた。その後、50mLの20mM酢酸ナトリウムで反応を停止させ、pHを6.5に調整し、精製するまで冷凍庫で保管した。
オリゴヌクレオチドは、精製する前に高速液体クロマトグラフィー(HPLC)で分析し、緩衝液及びカラムの選択は、配列及び/又は結合されたリガンドの性質に依存する。
リガンド結合オリゴヌクレオチドは、調製用逆相HPLCで精製した。未結合オリゴヌクレオチドは、施設内で充填したTSKゲルカラムの陰イオン交換HPLCで精製した。緩衝液は、10%CH3CN中の20mMリン酸ナトリウム(pH8.5)(緩衝液A)、及び10%CH3CN、1M NaBr中の20mMリン酸ナトリウム(pH8.5)(緩衝液B)だった。全長オリゴヌクレオチドを含有する画分を貯溜し、脱塩し、凍結乾燥した。およそ0.15ODの脱塩オリゴヌクレオチドを水で希釈して150μlにし、その後CGE及びLC/MS解析用の特殊バイアルにピペットで移した。化合物は、最終的にLC-ESMS及びCGEで分析した。
実施例10:siRNAの血清安定性アッセイ
初期の配列に基づく安定性選択の中程度スループットアッセイを、「完全染色」法により実施した。アッセイを実施するために、siRNA二本鎖を、90%ヒト血清中37℃でインキュベートした。反応混合物の試料を、種々の時点(0分、15、30、60、120、及び240分)で反応停止させ、電気泳動分析にかけた(図1)。経時的なRNA切断により、血清ヌクレアーゼ分解に対するsiRNA二本鎖の感受性に関する情報がもたらされた。
初期の配列に基づく安定性選択の中程度スループットアッセイを、「完全染色」法により実施した。アッセイを実施するために、siRNA二本鎖を、90%ヒト血清中37℃でインキュベートした。反応混合物の試料を、種々の時点(0分、15、30、60、120、及び240分)で反応停止させ、電気泳動分析にかけた(図1)。経時的なRNA切断により、血清ヌクレアーゼ分解に対するsiRNA二本鎖の感受性に関する情報がもたらされた。
放射性同位体標識dsRNA及び血清の安定性アッセイを使用して、siRNA切断事象をさらに特徴付けた。最初に、siRNA二本鎖のセンス又はアンチセンス鎖のいずれかを、32Pで5’末端標識した。標識siRNA二本鎖を、90%ヒト血清と共に37℃でインキュベートし、溶液の試料を、少しずつ時間をおいた時点で取り出して反応停止させた。試料を電気泳動により分析した。
実施例11:陽イオン性脂質由来のリポソームを使用したFVIIのインビボ評価
インビボげっ歯動物第VII因子及びApoBサイレンシング実験。
C57BL/6マウス(Charles River Labs社製、マサチューセッツ州)及びSprague-Dawleyラット(Charles River Labs社製、マサチューセッツ州)は、0.01mL/gの容積の生理食塩水又は所望の製剤中のsiRNAのいずれかを、尾部静脈注射により受容した。投与後の種々の時点で、イソフルオラン吸入により動物に麻酔をかけ、後眼窩出血により血液を血清分離管に収集した。試料中の第VII因子タンパク質の血清レベルを、製造業者プロトコールに従って発色性アッセイ(Coaset第VII因子、DiaPharma Group社製、オハイオ州、又はBiophen FVII、Aniara Corporation社製、オハイオ州)を使用して決定した。生理食塩水処置された動物から収集した血清を使用して、標準曲線を生成した。肝臓mRNAレベルを評価した実験では、投与後の種々の時点で、動物を犠牲にして肝臓を回収し、液体窒素で瞬間凍結した。凍結肝臓組織を粉砕して粉末にした。組織溶解生成物を調製し、第VII因子及びapoBの肝臓mRNAレベルを、分岐DNAアッセイを使用して決定した(QuantiGene Assay、Panomics社製、カリフォルニア州)。
インビボげっ歯動物第VII因子及びApoBサイレンシング実験。
C57BL/6マウス(Charles River Labs社製、マサチューセッツ州)及びSprague-Dawleyラット(Charles River Labs社製、マサチューセッツ州)は、0.01mL/gの容積の生理食塩水又は所望の製剤中のsiRNAのいずれかを、尾部静脈注射により受容した。投与後の種々の時点で、イソフルオラン吸入により動物に麻酔をかけ、後眼窩出血により血液を血清分離管に収集した。試料中の第VII因子タンパク質の血清レベルを、製造業者プロトコールに従って発色性アッセイ(Coaset第VII因子、DiaPharma Group社製、オハイオ州、又はBiophen FVII、Aniara Corporation社製、オハイオ州)を使用して決定した。生理食塩水処置された動物から収集した血清を使用して、標準曲線を生成した。肝臓mRNAレベルを評価した実験では、投与後の種々の時点で、動物を犠牲にして肝臓を回収し、液体窒素で瞬間凍結した。凍結肝臓組織を粉砕して粉末にした。組織溶解生成物を調製し、第VII因子及びapoBの肝臓mRNAレベルを、分岐DNAアッセイを使用して決定した(QuantiGene Assay、Panomics社製、カリフォルニア州)。
実施例12:1,2-ジ-O-アルキル-sn3-カルボモイルグリセリド(Carbomoylglyceride)(PEG-DMG)の調製
IVaの調製
1,2-ジ-O-テトラデシル-sn-グリセリドIa(30g、61.80ミリモル)及びN,N’-スクシンイミジルカルボアント(succinimidylcarboante)(DSC、23.76g、1.5当量)をジクロロメタン(DCM、500mL)中で一緒にし、氷水混合物上で撹拌した。トリエチルアミン(TEA、25.30mL、3当量)を撹拌溶液に添加し、その後反応混合物を周囲温度でオーバーナイトで撹拌させた。反応の進行は、TLCで監視した。反応混合物をDCM(400mL)で希釈し、有機層を、水(2×500mL)、NaHCO3水溶液(500mL)で洗浄し、その後標準的処理をした。得られた残渣を、高真空下、周囲温度でオーバーナイトで乾燥した。このようにして得られた粗カルボネートIIaを乾燥した後、ジクロロメタン(500mL)に溶解し、氷浴上で撹拌した。この撹拌溶液に、mPEG2000-NH2(III、103.00g、47.20ミリモル、NOF Corporation社、日本から購入)及び無水ピリジン(Py、80mL、過剰量)を、アルゴン下で添加した。その後、反応混合物を周囲温度でオーバーナイトで撹拌させた。溶媒及び揮発物を減圧下で除去し、残渣をDCM(200mL)に溶解し、酢酸エチルで充填したシリカゲルカラムに負荷した。カラムを、まず酢酸エチルで、その後ジクロロメタン中5~10%メタノール勾配で溶出して、所望のPEG-脂質IVaを白色固形物(105.30g、83%)として得た。1H NMR(CDCl3、400MHz)δ=5.20~5.12(m、1H)、4.18~4.01(m、2H)、3.80~3.70(m、2H)、3.70~3.20(m、-O-CH2-CH2-O-、PEG-CH2)、2.10~2.01(m、2H)、1.70~1.60(m、2H)、1.56~1.45(m、4H)、1.31~1.15(m、48H)、0.84(t、J=6.5Hz、6H)。MS実測値範囲:2660~2836。
1,2-ジ-O-テトラデシル-sn-グリセリドIa(30g、61.80ミリモル)及びN,N’-スクシンイミジルカルボアント(succinimidylcarboante)(DSC、23.76g、1.5当量)をジクロロメタン(DCM、500mL)中で一緒にし、氷水混合物上で撹拌した。トリエチルアミン(TEA、25.30mL、3当量)を撹拌溶液に添加し、その後反応混合物を周囲温度でオーバーナイトで撹拌させた。反応の進行は、TLCで監視した。反応混合物をDCM(400mL)で希釈し、有機層を、水(2×500mL)、NaHCO3水溶液(500mL)で洗浄し、その後標準的処理をした。得られた残渣を、高真空下、周囲温度でオーバーナイトで乾燥した。このようにして得られた粗カルボネートIIaを乾燥した後、ジクロロメタン(500mL)に溶解し、氷浴上で撹拌した。この撹拌溶液に、mPEG2000-NH2(III、103.00g、47.20ミリモル、NOF Corporation社、日本から購入)及び無水ピリジン(Py、80mL、過剰量)を、アルゴン下で添加した。その後、反応混合物を周囲温度でオーバーナイトで撹拌させた。溶媒及び揮発物を減圧下で除去し、残渣をDCM(200mL)に溶解し、酢酸エチルで充填したシリカゲルカラムに負荷した。カラムを、まず酢酸エチルで、その後ジクロロメタン中5~10%メタノール勾配で溶出して、所望のPEG-脂質IVaを白色固形物(105.30g、83%)として得た。1H NMR(CDCl3、400MHz)δ=5.20~5.12(m、1H)、4.18~4.01(m、2H)、3.80~3.70(m、2H)、3.70~3.20(m、-O-CH2-CH2-O-、PEG-CH2)、2.10~2.01(m、2H)、1.70~1.60(m、2H)、1.56~1.45(m、4H)、1.31~1.15(m、48H)、0.84(t、J=6.5Hz、6H)。MS実測値範囲:2660~2836。
IVbの調製
1,2-ジ-O-ヘキサデシル-sn-グリセリドIb(1.00g、1.848ミリモル)及びDSC(0.710g、1.5当量)を、ジクロロメタン(20mL)中で一緒にし、氷水混合物で0℃に冷却した。トリエチルアミン(1.00mL、3当量)を添加し、反応物をオーバーナイトで撹拌した。反応をTLCで追跡し、DCMで希釈し、水(2回)、NaHCO3溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、その結果生じたIIbの残渣を高真空下でオーバーナイトで維持した。この化合物を、さらなる精製をせずに次の反応に直接使用した。MPEG2000-NH2 III(1.50g、0.687ミリモル、NOF Corporation社、日本から購入)及びIIb(0.702g、1.5当量)を、アルゴン下でジクロロメタン(20mL)に溶解した。反応物を0℃に冷却した。ピリジン(1mL、過剰量)を添加し、反応物をオーバーナイトで撹拌した。反応は、TLCで監視した。溶媒及び揮発物を減圧下で除去し、残渣を、クロマトグラフィー(最初は酢酸エチル、その後勾配溶出として5~10%MeOH/DCM)で精製して、所望の化合物IVbを白色固形物(1.46g、76%)として得た。1H NMR(CDCl3、400MHz)δ=5.17(t、J=5.5Hz、1H)、4.13(dd、J=4.00Hz、11.00Hz、1H)、4.05(dd、J=5.00Hz、11.00Hz、1H)、3.82~3.75(m、2H)、3.70~3.20(m、-O-CH2-CH2-O-、PEG-CH2)、2.05~1.90(m、2H)、1.80~1.70(m、2H)、1.61~1.45(m、6H)、1.35~1.17(m、56H)、0.85(t、J=6.5Hz、6H)。MS実測値範囲:2716~2892。
1,2-ジ-O-ヘキサデシル-sn-グリセリドIb(1.00g、1.848ミリモル)及びDSC(0.710g、1.5当量)を、ジクロロメタン(20mL)中で一緒にし、氷水混合物で0℃に冷却した。トリエチルアミン(1.00mL、3当量)を添加し、反応物をオーバーナイトで撹拌した。反応をTLCで追跡し、DCMで希釈し、水(2回)、NaHCO3溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、その結果生じたIIbの残渣を高真空下でオーバーナイトで維持した。この化合物を、さらなる精製をせずに次の反応に直接使用した。MPEG2000-NH2 III(1.50g、0.687ミリモル、NOF Corporation社、日本から購入)及びIIb(0.702g、1.5当量)を、アルゴン下でジクロロメタン(20mL)に溶解した。反応物を0℃に冷却した。ピリジン(1mL、過剰量)を添加し、反応物をオーバーナイトで撹拌した。反応は、TLCで監視した。溶媒及び揮発物を減圧下で除去し、残渣を、クロマトグラフィー(最初は酢酸エチル、その後勾配溶出として5~10%MeOH/DCM)で精製して、所望の化合物IVbを白色固形物(1.46g、76%)として得た。1H NMR(CDCl3、400MHz)δ=5.17(t、J=5.5Hz、1H)、4.13(dd、J=4.00Hz、11.00Hz、1H)、4.05(dd、J=5.00Hz、11.00Hz、1H)、3.82~3.75(m、2H)、3.70~3.20(m、-O-CH2-CH2-O-、PEG-CH2)、2.05~1.90(m、2H)、1.80~1.70(m、2H)、1.61~1.45(m、6H)、1.35~1.17(m、56H)、0.85(t、J=6.5Hz、6H)。MS実測値範囲:2716~2892。
IVcの調製
1,2-ジ-O-オクタデシル-sn-グリセリドIc(4.00g、6.70ミリモル)及びDSC(2.58g、1.5当量)を、ジクロロメタン(20mL)中で一緒にし、氷水混合物で0℃に冷却した。トリエチルアミン(2.75mL、3当量)を添加し、反応物をオーバーナイトで撹拌した。反応をTLCで追跡し、DCMで希釈し、水(2回)、NaHCO3溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を高真空下でオーバーナイトで維持した。この化合物を、さらなる精製をせずに次の反応に直接使用した。MPEG2000-NH2 III(1.50g、0.687ミリモル、NOF Corporation社、日本から購入)及びIIc(0.760g、1.5当量)を、アルゴン下でジクロロメタン(20mL)に溶解した。反応物を0℃に冷却した。ピリジン(1mL、過剰量)を添加し、反応物をオーバーナイトで撹拌した。反応は、TLCで監視した。溶媒及び揮発物を減圧下で除去し、残渣を、クロマトグラフィー(酢酸エチル、その後勾配溶出として5~10%MeOH/DCM)で精製して、所望の化合物IVcを白色固形物(0.92g、48%)として得た。1H NMR(CDCl3、400MHz)δ=5.22~5.15(m、1H)、4.16(dd、J=4.00Hz、11.00Hz、1H)、4.06(dd、J=5.00Hz、11.00Hz、1H)、3.81~3.75(m、2H)、3.70~3.20(m、-O-CH2-CH2-O-、PEG-CH2)、1.80~1.70(m、2H)、1.60~1.48(m、4H)、1.31~1.15(m、64H)、0.85(t、J=6.5Hz、6H)。MS実測値範囲:2774~2948。
1,2-ジ-O-オクタデシル-sn-グリセリドIc(4.00g、6.70ミリモル)及びDSC(2.58g、1.5当量)を、ジクロロメタン(20mL)中で一緒にし、氷水混合物で0℃に冷却した。トリエチルアミン(2.75mL、3当量)を添加し、反応物をオーバーナイトで撹拌した。反応をTLCで追跡し、DCMで希釈し、水(2回)、NaHCO3溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を高真空下でオーバーナイトで維持した。この化合物を、さらなる精製をせずに次の反応に直接使用した。MPEG2000-NH2 III(1.50g、0.687ミリモル、NOF Corporation社、日本から購入)及びIIc(0.760g、1.5当量)を、アルゴン下でジクロロメタン(20mL)に溶解した。反応物を0℃に冷却した。ピリジン(1mL、過剰量)を添加し、反応物をオーバーナイトで撹拌した。反応は、TLCで監視した。溶媒及び揮発物を減圧下で除去し、残渣を、クロマトグラフィー(酢酸エチル、その後勾配溶出として5~10%MeOH/DCM)で精製して、所望の化合物IVcを白色固形物(0.92g、48%)として得た。1H NMR(CDCl3、400MHz)δ=5.22~5.15(m、1H)、4.16(dd、J=4.00Hz、11.00Hz、1H)、4.06(dd、J=5.00Hz、11.00Hz、1H)、3.81~3.75(m、2H)、3.70~3.20(m、-O-CH2-CH2-O-、PEG-CH2)、1.80~1.70(m、2H)、1.60~1.48(m、4H)、1.31~1.15(m、64H)、0.85(t、J=6.5Hz、6H)。MS実測値範囲:2774~2948。
実施例13:
2005の合成:Ar雰囲気下のDCM(400mL)中2004(50g、95ミリモル)溶液に、TEA(53mL、378ミリモル)及びDMAP(1.2g、9.5ミリモル)を添加し、Ar雰囲気下、室温で撹拌した。反応物を-5℃に冷却し、DCM(100mL)中の塩化メシル(15mL、190ミリモル)溶液を-5℃未満の温度でゆっくりと添加し、添加後、室温に加温させた。30分後(TLC)、反応物を氷冷水(20mL)で反応停止させた。有機層を分離し、1N HCl(30mL)、水、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で蒸発させて純粋な生成物(55g、95.5%)を黄色液体として得た。1H NMR(400MHz、CDCl3):δ0.89(t、6H、J=6.8)、1.2~1.5(m、36H)、1.67(m、4H)、2.05(q、8H、J1=6.8、J2=6.8)、2.77(t、4H、J=6.4)、2.99(s、3H)、4.71(m、1H)、及び5.36(m、8H)。
合成2006:アルゴン雰囲気下のDMF(500mL)中2005(50g、82ミリモル)溶液に、NaN3(27g、410ミリモル)を添加し、70℃に加熱し、その温度を4時間維持した(TLC)。混合物を水で希釈し、酢酸エチル(3×250mL)で抽出した。有機層を、水、ブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥し、減圧下で蒸発させて粗生成物を得、それを、溶出液としてヘキサン/酢酸エチルを使用したシリカゲルクロマトグラフィーで精製した。生成物をヘキサン中2%エーテルで溶出して、2006(36g、86%)を淡黄色液体として得た。1H NMR(400MHz、CDCl3):δ0.90(t、8H)、1.30(m、36H)、1.49(t、4H、J=6.4Hz)、2.04(q、8H、J1=7.6、J2=14Hz)、2.77(t、4H、J=6.4Hz)、3.22(m、1H)、5.34(m、8H)。13C NMR(400MHz、CDCl3):δ14.1、22.5、25.6、26.1、27.2、29.2、29.3、29.45、29.65、31.5、34.1、63.1、127.9、及び130.1。IR(KBr):2098。
実施例14:
2007の合成:ジメチルホルムアミド(500mL)中の2005(76g、125ミリモル)溶液に、水硫化ナトリウム水和物(35g、625ミリモル)を室温で添加した。反応混合物を2時間70℃に加熱した(TLC)。その後、それを室温に冷却し、水(7V)で希釈し、エーテル(3×5V)で抽出した。混合したエーテル層を、水(2×3V)、ブライン溶液(2×3V)で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で蒸発させて粗生成物を得、それを、溶出液としてヘキサンを使用したシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、生成物2007(43.6g、64%)を得た。MS:C37H68Sの分子量計算値544.50、実測値:545.51(M+H)。
2008の合成:ジクロロメタン(400mL)中のアルドリチオール(20.2g、92ミリモル)溶液に、臭化ベンジル(11mL、92ミリモル)を0℃で添加した。0℃で15分間撹拌した後、それを室温に加温し、15分間撹拌した。反応混合物を0℃に冷却しなおし、ジクロロメタン(100mL)中の2007(50g、92ミリモル)溶液、その後ジイソプロピルエチルアミン(16mL、92ミリモル)を添加した。添加後、それを加熱して2時間還流した(TLC)。その後、それを、ジクロロメタン(10V)で希釈し、水(2×10V)、ブライン溶液(2×10V)で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で蒸発させて粗生成物を得、それを、3%エーテル/ヘキサンを使用したシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、純粋な生成物を淡黄色液体として得た。(35g、58%) 1H NMR(400MHz、CDCl3):δ0.89(t、6H、J1=6.4Hz、J2=7.2Hz)、1.25~1.42(m、38H)、1.56~1.63(m、2H)、2.05(q、8H、J1=6.4Hz、J2=14Hz)、2.78(t、5H、J1=6.4Hz、J2=6Hz)、5.30~5.42(m、8H)、7.06(t、1H、J1=5.2Hz、J2=6.8Hz)、7.62(t、1H、J1=7.6Hz、J2=7.6Hz)、7.76(d、1H、J=8Hz)、8.42(d、1H、J=4.4Hz)。13C NMR(100MHz、CDCl3):δ22.6、25.6、26.7、27.2、29.2、29.3、29.5、29.6、31.5、33.74、52.9、119.9、120.4、127.9、128、130.1、130.2、136.7、149.3、161.5。MS:C42H71NS2の分子量計算値653.50、実測値:654.49(M+H)。
実施例15:
2009(ALNY-138)の合成:DMF及びジメチルアミン中の2005(5g、8ミリモル)溶液-40%水溶液を封管にいれた。反応混合物を20時間90℃に加熱した(TLC)。その後、それを室温に冷却し、水に注ぎ、酢酸エチル(3×50mL)で抽出した。有機層を水及びブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥し、蒸発させて、純粋な生成物を薄褐色液体(2.00g、45%)として得た。1H NMR(400MHz、CDCl3):δ0.89(t、6H、j=6.8)、1.2~1.4(m、40H)、2.05(q、8H、J1=6.8Hz、J2=6.8Hz)、2.2(s、6H)、2.77(t、4H、j=6.4Hz)、5.35(m、8H)。13C NMR(400MHz、CDCl3):δ14.1、22.5、22.6、27.1、27.2、29.3、29.5、29.57、29.63、29.67、30.0、31.5、32.5、40.5、64.0、127.9、及び130.1 MS:C39H73Nの分子量計算値555.57、実測値:556.55(M+H)。
実施例16:
2010の合成:トルエン中の2004(30g、56.8ミリモル)溶液に、N-ヒドロキシフタルイミド(13.9g、85ミリモル)及びTPP(22.30g、85ミリモル)を、アルゴン下で添加した。反応物を-5℃に冷却し、これに、TEA(11.84mL)、その後DEAD(13.14mL)を添加した。反応物を室温で12時間撹拌させた(TLC)。その後、それをセライトパッドでろ過した。ろ過液を減圧下で蒸発させて粗生成物を得、それをシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、純粋な生成物を得、それを3%ジエチルエーテル及びヘキサンで溶出して、生成物2010(22.90g、60.50%)を淡黄色液体として得た。 1HNMR(400MHz、CDCl3、):δ0.90(6H、t、J=7.2Hz)、1.2~1.4(34H、m)、1.66~1.70(4H、m)、2.03~2.08(8H、m)、2.78(4H、t、J=12.8Hz)、4.22(1H、m)、5.29~5.43(8H、m)、7.74~7.76(2H、m)、7.83~7.85(2H、m)。13C NMR(100MHz、CDCl3、):δ14.3、22.5、24.9、25.6、27.2、27.20、29.3、29.3、29.5、29.5、29.6、29.7、31.5、32.4、88.3、123.3、127.9、129.0、130.1、134.3、164.3。MS:C45H71NO3の分子量計算値673.54、実測値674.55(M+H)。
実施例19:3-(ジメチルアミノ)-N-((11Z,14Z)-2-((9Z,12Z)-オクタデカ-9,12-ジエニル)イコサ-11,14-ジエニル)プロパンアミド(ALNY-201)の合成
スキーム1
DCM中のN,N-ジメチルアミノプロピオン酸塩酸塩(1、0.198g、1.3ミリモル、1.0当量)撹拌懸濁液に、HBTU(0.59g、1.56ミリモル、1.2当量)及びDIPEA(0.71mL、3.9ミリモル、3.0当量)を室温で添加した。10分間撹拌した後、DCM中のアミン(2、0.7g.1.3ミリモル、1.0当量)溶液を室温で滴加し、反応が完了するまで撹拌を継続した。反応混合物をDCMで希釈し、飽和NaHCO3溶液、その後ブラインで洗浄し、有機層を分離し、MgSO4で乾燥し、濃縮し、DCM:MeOH(5%)を勾配として使用したシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、70%の収率で純粋な油状化合物3を得た。1H NMR(400MHz、CDCl3)δ7.18(brs、1H)、5.47~5.19(m、8H)、3.18~3.07(m、4H)、2.76(t、J=6.5、4H)、2.70(s、6H)、2.60(t、J=6.0、2H)、2.04(q、J=6.8、9H)、1.48(brs、1H)、1.40~1.14(m、43H)、0.88(t、J=6.8、6H)。C43H80N2Oの質量計算値:640.6、実測値:641.5。
スキーム1
実験の詳細
化合物1(ALNY-192)
CH2Cl2(200mL)中のN,N’-ジサクシニミジルカルボネート(5.50g、21.5ミリモル)溶液に、3-ジメチルアミノ-1-プロパノール(2.43g、23.6ミリモル)を滴加した。その結果生じた混合物を、室温でオーバーナイトで撹拌した。50mLの溶液を取り出し、Et3N(0.822mL、5.90ミリモル)及びALN-SAN-30(2.08g、3.93ミリモル)を添加し、反応混合物を室温でオーバーナイトで撹拌した。反応混合物をCH2Cl2で希釈し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。有機層を無水MgSO4で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中0~5%MeOH)で精製して、化合物1を得た(1.66g、2.53ミリモル、64%、CH2Cl2中5%MeOHでRf=0.22)。1H NMR(CDCl3、400MHz)δ5.30~5.41(m、8H)、4.37(d、J=8.0Hz、1H)、4.09(t、J=6.0Hz、2H)、3.57(brs、1H)、2.78(t、J=6.0Hz、4H)、2.33(t、J=8.0Hz、2H)、2.23(s、6H)、2.02~2.06(m、8H)、1.76~1.80(m、2H)、1.27~1.45(m、40H)、0.89(t、J=8.0Hz、6H)。13C NMR(CDCl3、100MHz)δ156.5、130.4、130.3、128.2、128.1、63.2、56.6、51.4、45.7、35.7、31.7、29.9、29.8、29.7、29.6、29.5、27.7、27.5、27.4、26.0、25.8、22.8、14.3。C43H81N2O2の分子量(M+H)+ 計算値657.63、実測値657.5。
化合物1(ALNY-192)
CH2Cl2(200mL)中のN,N’-ジサクシニミジルカルボネート(5.50g、21.5ミリモル)溶液に、3-ジメチルアミノ-1-プロパノール(2.43g、23.6ミリモル)を滴加した。その結果生じた混合物を、室温でオーバーナイトで撹拌した。50mLの溶液を取り出し、Et3N(0.822mL、5.90ミリモル)及びALN-SAN-30(2.08g、3.93ミリモル)を添加し、反応混合物を室温でオーバーナイトで撹拌した。反応混合物をCH2Cl2で希釈し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。有機層を無水MgSO4で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中0~5%MeOH)で精製して、化合物1を得た(1.66g、2.53ミリモル、64%、CH2Cl2中5%MeOHでRf=0.22)。1H NMR(CDCl3、400MHz)δ5.30~5.41(m、8H)、4.37(d、J=8.0Hz、1H)、4.09(t、J=6.0Hz、2H)、3.57(brs、1H)、2.78(t、J=6.0Hz、4H)、2.33(t、J=8.0Hz、2H)、2.23(s、6H)、2.02~2.06(m、8H)、1.76~1.80(m、2H)、1.27~1.45(m、40H)、0.89(t、J=8.0Hz、6H)。13C NMR(CDCl3、100MHz)δ156.5、130.4、130.3、128.2、128.1、63.2、56.6、51.4、45.7、35.7、31.7、29.9、29.8、29.7、29.6、29.5、27.7、27.5、27.4、26.0、25.8、22.8、14.3。C43H81N2O2の分子量(M+H)+ 計算値657.63、実測値657.5。
化合物2(ALNY-200)
CH2Cl2(200mL)中のN,N’-ジサクシニミジルカルボネート(5.50g、21.5ミリモル)溶液に、3-ジメチルアミノ-1-プロパノール(2.43g、23.6ミリモル)を滴加した。その結果生じた混合物を、室温でオーバーナイトで撹拌した。50mLの溶液を取り出し、Et3N(0.697mL、5.00ミリモル)及びALN-SAN-033(1.71g、3.15ミリモル)を添加し、反応混合物を室温でオーバーナイトで撹拌した。反応混合物をCH2Cl2で希釈し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。有機層を無水MgSO4で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中0~5%MeOH)で精製して、化合物2を得た(1.14g、1.70ミリモル、54%、CH2Cl2中5%MeOHでRf=0.13)。C44H83N2O2の分子量(M+H)+ 計算値:671.65、実測値:671.5。
CH2Cl2(200mL)中のN,N’-ジサクシニミジルカルボネート(5.50g、21.5ミリモル)溶液に、3-ジメチルアミノ-1-プロパノール(2.43g、23.6ミリモル)を滴加した。その結果生じた混合物を、室温でオーバーナイトで撹拌した。50mLの溶液を取り出し、Et3N(0.697mL、5.00ミリモル)及びALN-SAN-033(1.71g、3.15ミリモル)を添加し、反応混合物を室温でオーバーナイトで撹拌した。反応混合物をCH2Cl2で希釈し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。有機層を無水MgSO4で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中0~5%MeOH)で精製して、化合物2を得た(1.14g、1.70ミリモル、54%、CH2Cl2中5%MeOHでRf=0.13)。C44H83N2O2の分子量(M+H)+ 計算値:671.65、実測値:671.5。
化合物3(ALNY-175)
EtOH(50mL)を含有するフラスコに、ジメチルアミノエチルヒドラジン二塩酸塩(1.00g、5.70ミリモル)及びALNY-SAN-003(2.00g、3.80ミリモル)を添加した。混合物を16時間60℃に加熱した。Et3N(0.5mL)の添加後、反応混合物を蒸発させた。残渣をEt2O及び飽和NaHCO3水溶液で抽出し、有機層を無水MgSO4で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2:MeOH:NH3水溶液=95:5:0.5、Rf=0.29)で精製して、化合物3を得た(1.78g、2.91ミリモル、76%)。C41H78N3の分子量(M+H)+ 計算値:612.62、実測値:612.5。
EtOH(50mL)を含有するフラスコに、ジメチルアミノエチルヒドラジン二塩酸塩(1.00g、5.70ミリモル)及びALNY-SAN-003(2.00g、3.80ミリモル)を添加した。混合物を16時間60℃に加熱した。Et3N(0.5mL)の添加後、反応混合物を蒸発させた。残渣をEt2O及び飽和NaHCO3水溶液で抽出し、有機層を無水MgSO4で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2:MeOH:NH3水溶液=95:5:0.5、Rf=0.29)で精製して、化合物3を得た(1.78g、2.91ミリモル、76%)。C41H78N3の分子量(M+H)+ 計算値:612.62、実測値:612.5。
化合物4(ALNY-187)
EtOH(10mL)中の3-ジメチルアミノ-プロピオン酸ヒドラジド(Ryan Scientific社製、500mg、3.89ミリモル)及びEtOH(20mL)中のジリノレイルケトン(1.74g、3.31ミリモル)を一緒に混合した。この溶液に、酢酸(0.038mL、0.662ミリモル)を添加し、反応混合物を65℃で5時間加熱した。Et3N(0.5mL)の添加後、反応混合物を蒸発させた。残渣をCH2Cl2及び飽和NaHCO3水溶液で抽出し、有機層を無水MgSO4で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2:MeOH:NH3水溶液=95:5:0.5、Rf=0.30)で精製して、化合物4を得た(1.40g、2.19ミリモル、66%)。C42H78N3Oの分子量(M+H)+ 計算値640.61、実測値640.5。
EtOH(10mL)中の3-ジメチルアミノ-プロピオン酸ヒドラジド(Ryan Scientific社製、500mg、3.89ミリモル)及びEtOH(20mL)中のジリノレイルケトン(1.74g、3.31ミリモル)を一緒に混合した。この溶液に、酢酸(0.038mL、0.662ミリモル)を添加し、反応混合物を65℃で5時間加熱した。Et3N(0.5mL)の添加後、反応混合物を蒸発させた。残渣をCH2Cl2及び飽和NaHCO3水溶液で抽出し、有機層を無水MgSO4で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2:MeOH:NH3水溶液=95:5:0.5、Rf=0.30)で精製して、化合物4を得た(1.40g、2.19ミリモル、66%)。C42H78N3Oの分子量(M+H)+ 計算値640.61、実測値640.5。
化合物5(ALNY-149)
ALY-SAN-031(2.36g、3.50ミリモル)を、CH2Cl2(36mL)及びEtOH(4mL)中のヒドラジン一水和物(0.424mL、5.60ミリモル)で2時間処理した。その結果生じた白色析出物をろ過した後、ろ過液を濃縮した。残渣をEt2O及び飽和NaHCO3水溶液で抽出し、有機層をMgSO4で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗生成物を、さらなる精製をせずに次のステップで使用した。Rf:0.44(ヘキサン中10%EtOAC)。C37H70NOの分子量(M+H)+ 計算値544.55、実測値544.2。
ALY-SAN-031(2.36g、3.50ミリモル)を、CH2Cl2(36mL)及びEtOH(4mL)中のヒドラジン一水和物(0.424mL、5.60ミリモル)で2時間処理した。その結果生じた白色析出物をろ過した後、ろ過液を濃縮した。残渣をEt2O及び飽和NaHCO3水溶液で抽出し、有機層をMgSO4で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗生成物を、さらなる精製をせずに次のステップで使用した。Rf:0.44(ヘキサン中10%EtOAC)。C37H70NOの分子量(M+H)+ 計算値544.55、実測値544.2。
アミノオキシ化合物を、EtOH(30mL)に溶解し、4-(ジメチルアミノ)ブタン-2-オン(Matrix Scientific社製、500mg、4.34ミリモル)及び酢酸(0.040mL、0.70ミリモル)を、その溶液に添加した。反応混合物を室温で14時間撹拌した。Et3N(0.5mL)の添加後、反応混合物を蒸発させた。残渣をEt2O及び飽和NaHCO3水溶液で抽出し、有機層をMgSO4で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:EtOAc=1:1)で精製して、化合物5をE/Z異性体の混合物として得た(1.90g、2.96ミリモル、85%、2ステップ、ヘキサン:EtOAc=1:1で展開してRf=0.39及び0.21)。C43H81N2Oの分子量(M+H)+ 計算値641.63、実測値641.5。
化合物6(ALNY-202)
CH2Cl2(200mL)中のN,N’-ジサクシニミジルカルボネート(5.50g、21.5ミリモル)溶液に、3-ジメチルアミノ-1-プロパノール(2.37mL、23.6ミリモル)を滴加した。その結果生じた混合物を、室温でオーバーナイトで撹拌した。50mLの溶液を取り出し、Et3N(0.822mL、5.90ミリモル)及びALN-SAN-30(2.07g、3.93ミリモル)を添加し、反応混合物を室温でオーバーナイトで撹拌した。反応混合物をCH2Cl2で希釈し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。有機層を無水MgSO4で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中0~5%MeOH)で精製して、化合物6を得た。C42H79N2O2の分子量(M+H)+ 計算値643.61、実測値643.5。
CH2Cl2(200mL)中のN,N’-ジサクシニミジルカルボネート(5.50g、21.5ミリモル)溶液に、3-ジメチルアミノ-1-プロパノール(2.37mL、23.6ミリモル)を滴加した。その結果生じた混合物を、室温でオーバーナイトで撹拌した。50mLの溶液を取り出し、Et3N(0.822mL、5.90ミリモル)及びALN-SAN-30(2.07g、3.93ミリモル)を添加し、反応混合物を室温でオーバーナイトで撹拌した。反応混合物をCH2Cl2で希釈し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。有機層を無水MgSO4で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗生成物を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中0~5%MeOH)で精製して、化合物6を得た。C42H79N2O2の分子量(M+H)+ 計算値643.61、実測値643.5。
本発明の化合物は、それらの全体が本明細書に組み込まれる以下の論文に記載されている手順によりさらに合成することができる:
1.Schlueter, Urs; Lu, Jun; Fraser-Reid, Bert. Synthetic Approaches To Heavily Lipidated Phosphoglyceroinositides. Organic Letters (2003), 5(3), 255-2572
2.King, J. F.; Allbutt, A. D. Can. J. Chem. 1970, 48, 1754-17693
3.Mach, Mateusz; Schlueter, Urs; Mathew, Felix; Fraser-Reid, Bert; Hazen, Kevin C. Comparing n-pentenyl orthoesters and n-pentenyl glycosides as alternative glycosyl donors. Tetrahedron (2002), 58(36), 7345-7354
1.Schlueter, Urs; Lu, Jun; Fraser-Reid, Bert. Synthetic Approaches To Heavily Lipidated Phosphoglyceroinositides. Organic Letters (2003), 5(3), 255-2572
2.King, J. F.; Allbutt, A. D. Can. J. Chem. 1970, 48, 1754-17693
3.Mach, Mateusz; Schlueter, Urs; Mathew, Felix; Fraser-Reid, Bert; Hazen, Kevin C. Comparing n-pentenyl orthoesters and n-pentenyl glycosides as alternative glycosyl donors. Tetrahedron (2002), 58(36), 7345-7354
実施例20:インビボげっ歯動物第VII因子サイレンシングモデルを使用した、種々の陽イオン性脂質を含有する脂質粒子製剤の効力の決定。
第VII因子(FVII)は、凝血カスケードにおいて顕著なタンパク質であり、肝臓(肝細胞)で合成され、血漿へと分泌される。血漿中のFVIIレベルは、単純なプレートに基づく比色アッセイにより決定することができる。そのため、FVIIは、肝細胞由来タンパク質のsirna媒介性下方制御を決定するための便利なモデルであり、並びに核酸脂質粒子及びsiRNAの血漿中濃度及び組織分布を監視するための便利なモデルである。
第VII因子(FVII)は、凝血カスケードにおいて顕著なタンパク質であり、肝臓(肝細胞)で合成され、血漿へと分泌される。血漿中のFVIIレベルは、単純なプレートに基づく比色アッセイにより決定することができる。そのため、FVIIは、肝細胞由来タンパク質のsirna媒介性下方制御を決定するための便利なモデルであり、並びに核酸脂質粒子及びsiRNAの血漿中濃度及び組織分布を監視するための便利なモデルである。
上記に示されている陽イオン性脂質を使用して、米国特許仮出願第61/228,373号に記載されているようなインライン混合法を使用して、AD-1661二本鎖を含有するリポソームを製剤化した。脂質粒子を、以下のモル比を使用して製剤化した:50%陽イオン性脂質/10%ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)/38.5%コレステロール/1.5% PEG-DMG(平均PEG分子量が2000の(1-(モノメトキシ-ポリエチレングリコール)-2,3-ジミリストイルグリセロール)。
C57BL/6マウス(Charles River Labs社製、マサチューセッツ州)は、生理食塩水又は製剤化したsiRNAのいずれかを、尾部静脈注射により受容した。投与後の種々の時点で、血清試料を後眼窩出血により収集した。試料中の第VII因子タンパク質の血清レベルを、発色アッセイ(Biophen FVII、Aniara Corporation社製、オハイオ州)を使用して決定した。第VII因子の肝臓mRNAレベルを決定するために、動物を犠牲にして肝臓を回収し、液体窒素で瞬間凍結した。組織溶解生成物を凍結組織から調製し、第VII因子の肝臓mRNAレベルを、分岐DNAアッセイを使用して定量化した(QuantiGene Assay、Panomics社製、カリフォルニア州)。
FVII siRNA処置動物のFVII活性を、C57BL/6マウスに静脈内(ボーラス)注射した48時間後に評価した。FVIIを、血清又は組織中のタンパク質レベルを決定するための市販キットを使用し、製造業者の説明書に従って、マイクロプレート規模で測定した。FVIIの低減を未処理対照マウスに対して決定し、結果を残留FVII%として表した。2用量レベル(0.05及び0.005mg/kgのFVII siRNA)を、各新規リポソーム組成物のスクリーニングに使用した。図3は、様々な陽イオン性脂質を含有する0.05又は0.005mg/kgの脂質粒子を投与した動物中の相対的FVIIタンパク質レベルを例示するグラフを示す。
実施例21 事前に形成された小胞を使用したsiRNA製剤
陽イオン性脂質を含有する粒子を、事前形成小胞法を使用して製作した。陽イオン性脂質、DSPC、コレステロール、及びPEG脂質を、それぞれ40/10/40/10のモル比でエタノールに可溶化した。脂質混合物を緩衝水溶液(50mMクエン酸、pH4)に添加して、それぞれ30%(容積/容積)及び6.1mg/mLの最終エタノール及び脂質濃度に混合し、押出前に室温で2分間平衡化させた。水和脂質を、Nicomp分析により決定して70~90nmの小胞直径が得られるまで、Lipex Extruder(Northern Lipids社製、バンクーバー、ブリティッシュコロンビア州)を使用して、22℃で、2つの積層型80nm細孔サイズフィルター(Nuclepore社製)を通して押し出した。これには、一般的に1~3回の通過が必要だった。小さな小胞を形成しなかった幾つかの陽イオン性脂質混合物の場合、より低いpH緩衝液(50mMクエン酸、pH3)で脂質混合物を水和して、DSPC頭部基のホスフェート基をプロトン化することが、安定した70~90nm小胞の形成に役立った。
陽イオン性脂質を含有する粒子を、事前形成小胞法を使用して製作した。陽イオン性脂質、DSPC、コレステロール、及びPEG脂質を、それぞれ40/10/40/10のモル比でエタノールに可溶化した。脂質混合物を緩衝水溶液(50mMクエン酸、pH4)に添加して、それぞれ30%(容積/容積)及び6.1mg/mLの最終エタノール及び脂質濃度に混合し、押出前に室温で2分間平衡化させた。水和脂質を、Nicomp分析により決定して70~90nmの小胞直径が得られるまで、Lipex Extruder(Northern Lipids社製、バンクーバー、ブリティッシュコロンビア州)を使用して、22℃で、2つの積層型80nm細孔サイズフィルター(Nuclepore社製)を通して押し出した。これには、一般的に1~3回の通過が必要だった。小さな小胞を形成しなかった幾つかの陽イオン性脂質混合物の場合、より低いpH緩衝液(50mMクエン酸、pH3)で脂質混合物を水和して、DSPC頭部基のホスフェート基をプロトン化することが、安定した70~90nm小胞の形成に役立った。
FVII siRNA(30%エタノールを含有する50mMクエン酸、pH4水溶液に可溶化)を、予め35℃に平衡化された小胞に、約5mL/分の速度で混合しながら添加した。0.06(重量/重量)の最終標的siRNA/脂質比が達成された後、FVII siRNAの小胞再構成及び封入化を可能にするために、混合物を35℃でさらに30分間インキュベートした。その後、エタノールを除去し、外部緩衝液を、透析又は接線流ダイアフィルトレーションのいずれかにより、PBS(155mM NaCl、3mM Na2HPO4、1mM KH2PO4、pH7.5)に置換した。最終封入化siRNA対脂質比は、サイズ排除スピンカラム又はイオン交換スピンカラムを使用して、未封入siRNAを除去した後に決定した。
実施例22:新規な脂質製剤の効力のインビボ決定
試験製剤は、治療群当たり3匹のマウスを用いて、0.1、0.3、1.0、及び5.0mg/kgで、雌の7~9週齢、15~25gの雌C57Bl/6マウスのFVIIノックダウンについて初期評価した。研究には全て、リン酸緩衝生理食塩水(PBS、対照群)又はベンチマーク製剤のいずれかを受容する動物が含まれていた。製剤を、試験の直前にPBSで適切な濃度に希釈した。マウスを計量し、適切な投与容積を計算した(10μl/g体重)。試験及びベンチマーク製剤並びにPBS(対照動物用)を、側尾静脈に静脈内投与した。24時間後、ケタミン/キシラジンを腹膜腔内注射して動物に麻酔をかけ、500~700μlの血液を、心穿刺により血清分離チューブ(BD Microtainer)に収集した。血液を15℃で10分間2,000×gで遠心分離し、血清を収集し、分析するまで-70℃で保管した。血清試料を37℃で30分間解凍し、PBSで希釈し、96穴アッセイプレートに等分した。第VII因子レベルは、製造業者の説明書に従った発色アッセイ(Biophen FVIIキット、Hyphen BioMed社製)、及び405nm波長フィルターを装備したマイクロプレートリーダーで測定した吸光度を使用して評価した。血漿FVIIレベルを定量し、対照動物の血清貯留試料から生成した検量線を使用して、ED50(対照動物と比較して血漿FVIIレベルの50%低減をもたらす用量)を計算した。高レベルのFVIIノックダウン(ED50<<0.1mg/kg)を示す目的の製剤を、より低い用量範囲の独立した研究で再試験して効力を確認し、ED50を確立した。
試験製剤は、治療群当たり3匹のマウスを用いて、0.1、0.3、1.0、及び5.0mg/kgで、雌の7~9週齢、15~25gの雌C57Bl/6マウスのFVIIノックダウンについて初期評価した。研究には全て、リン酸緩衝生理食塩水(PBS、対照群)又はベンチマーク製剤のいずれかを受容する動物が含まれていた。製剤を、試験の直前にPBSで適切な濃度に希釈した。マウスを計量し、適切な投与容積を計算した(10μl/g体重)。試験及びベンチマーク製剤並びにPBS(対照動物用)を、側尾静脈に静脈内投与した。24時間後、ケタミン/キシラジンを腹膜腔内注射して動物に麻酔をかけ、500~700μlの血液を、心穿刺により血清分離チューブ(BD Microtainer)に収集した。血液を15℃で10分間2,000×gで遠心分離し、血清を収集し、分析するまで-70℃で保管した。血清試料を37℃で30分間解凍し、PBSで希釈し、96穴アッセイプレートに等分した。第VII因子レベルは、製造業者の説明書に従った発色アッセイ(Biophen FVIIキット、Hyphen BioMed社製)、及び405nm波長フィルターを装備したマイクロプレートリーダーで測定した吸光度を使用して評価した。血漿FVIIレベルを定量し、対照動物の血清貯留試料から生成した検量線を使用して、ED50(対照動物と比較して血漿FVIIレベルの50%低減をもたらす用量)を計算した。高レベルのFVIIノックダウン(ED50<<0.1mg/kg)を示す目的の製剤を、より低い用量範囲の独立した研究で再試験して効力を確認し、ED50を確立した。
図4は、この方法を使用して試験された例示的な化合物のEC50を示す表を提供する。
実施例22A:製剤化脂質のpKaの決定
様々なイオン化可能な陽イオン性脂質のpKaは、水中では非蛍光性であるが、膜に結合すると検知可能に蛍光性となる蛍光プローブである2-(p-トルイジノ)-6-ナフタレンスルホン酸(TNS)を使用して、本質的に(Eastman et al 1992 Biochemistry 31:4262-4268)に記載されているように決定した。陽イオン性脂質/DSPC/CH/PEG-c-DOMG(40:10:40:10モル比)で構成される小胞を、2~11の範囲の種々のpHの緩衝液(130mM NaCl、10mM CH3COONH4、10mM ME、10mM HEPES)で0.1mMに希釈した。等量のTNS水溶液(最終1μM)を希釈小胞に添加し、30秒間の平衡化期間後、TNS含有溶液の蛍光を、それぞれ321nm及び445nmの励起及び発光波長で測定した。陽イオン性脂質含有小胞のpKaは、測定された蛍光を溶液のpHに対してプロットし、市販グラフプログラムIgorProを使用して、データをシグモイド曲線にフィッティングすることにより決定した。
様々なイオン化可能な陽イオン性脂質のpKaは、水中では非蛍光性であるが、膜に結合すると検知可能に蛍光性となる蛍光プローブである2-(p-トルイジノ)-6-ナフタレンスルホン酸(TNS)を使用して、本質的に(Eastman et al 1992 Biochemistry 31:4262-4268)に記載されているように決定した。陽イオン性脂質/DSPC/CH/PEG-c-DOMG(40:10:40:10モル比)で構成される小胞を、2~11の範囲の種々のpHの緩衝液(130mM NaCl、10mM CH3COONH4、10mM ME、10mM HEPES)で0.1mMに希釈した。等量のTNS水溶液(最終1μM)を希釈小胞に添加し、30秒間の平衡化期間後、TNS含有溶液の蛍光を、それぞれ321nm及び445nmの励起及び発光波長で測定した。陽イオン性脂質含有小胞のpKaは、測定された蛍光を溶液のpHに対してプロットし、市販グラフプログラムIgorProを使用して、データをシグモイド曲線にフィッティングすることにより決定した。
図4は、この方法を使用して試験された例示的な化合物のEC50を示す表を提供する。
実施例23:アミド結合脂質の合成
DCM中のN,N-ジメチルアミノプロピオン酸塩酸塩(1、0.198g、1.3ミリモル、1.0当量)撹拌懸濁液に、HBTU(0.59g、1.56ミリモル、1.2当量)及びDIPEA(0.71mL、3.9ミリモル、3.0当量)を室温で添加した。10分間撹拌した後、DCM中のアミン(2、0.7g.1.3ミリモル、1.0当量)溶液を室温で滴加し、反応が完了するまで撹拌を継続した。反応混合物をDCMで希釈し、飽和NaHCO3溶液、その後ブラインで洗浄し、有機層を分離し、MgSO4で乾燥し、濃縮し、DCM:MeOH(5%)を勾配として使用したシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製して、純粋な油状化合物3(ALNY-201)を70%の収率で得た。
1H NMR(400MHz、CDCl3)δ7.18(brs、1H)、5.47~5.19(m、8H)、3.18~3.07(m、4H)、2.76(t、J=6.5、4H)、2.70(s、6H)、2.60(t、J=6.0、2H)、2.04(q、J=6.8、9H)、1.48(brs、1H)、1.40~1.14(m、43H)、0.88(t、J=6.8、6H)。13C NMR(101MHz、CDCl3)δ172.26、130.41、130.36、128.17、128.15、77.54、77.22、76.90、55.70、43.85、43.02、37.90、31.99、31.74、30.25、29.92、29.86、29.81、29.57、27.47、27.42、26.84、25.85、22.79、14.29。C43H80N2Oの計算質量値:640.6、実測値641.5。
1H NMR(400MHz、CDCl3)δ7.18(brs、1H)、5.47~5.19(m、8H)、3.18~3.07(m、4H)、2.76(t、J=6.5、4H)、2.70(s、6H)、2.60(t、J=6.0、2H)、2.04(q、J=6.8、9H)、1.48(brs、1H)、1.40~1.14(m、43H)、0.88(t、J=6.8、6H)。13C NMR(101MHz、CDCl3)δ172.26、130.41、130.36、128.17、128.15、77.54、77.22、76.90、55.70、43.85、43.02、37.90、31.99、31.74、30.25、29.92、29.86、29.81、29.57、27.47、27.42、26.84、25.85、22.79、14.29。C43H80N2Oの計算質量値:640.6、実測値641.5。
Ar雰囲気下のDCM(400mL)中アルコール1030溶液に、TEA及びDMAPを添加し、Ar雰囲気下、室温で撹拌した。反応物を-5℃に冷却し、DCM(100mL)中の塩化メシル溶液を-5℃未満の温度でゆっくりと添加し、添加後、室温に加温させた。30分後(TLC)、反応物を氷冷水(20mL)で反応停止させた。有機層を分離し、1N HCl(30mL)、水、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で蒸発させて純粋な生成物1031(55g、収率95.5%)を黄色液体として得た。HPLC:99.8%;1H NMR(400MHz、CDCl3):δ0.89(t、6H、J=6.8Hz)、1.2~1.5(m、36H)、1.67(m、4H)、2.05(q、8H、J=6.8Hz)、2.77(t、4H、J=6.4Hz)、2.99(s、3H)、4.71(m、1H)、及び5.36(m、8H)。13CNMR(100MHz、CDCl3):δ14.0、22.5、24.9、25.6、27.2、29.2、29.3、29.4、29.5、29.6、31.5、34.4、38.6、45.9、84.3、127.9、128.0、130.0、130.1。
Ar雰囲気下のDMF中シアン化ナトリウム溶液に、DMF中の段階-1生成物をゆっくりと添加し、その後24時間55℃に加熱した(HPLC)。その後、それを室温に冷却し、水で希釈し、酢酸エチル(数回)で抽出した。混合した有機層を、水、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で蒸発させて粗生成物を得、それを、溶出液として1%エーテル/ヘキサンを使用したシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、純粋な生成物1032(5.8g、収率:62%)を淡黄色液体として得た。1H NMR(400MHz、CDCl3):δ0.87(t、6H、J=6.8Hz)、1.25(m、38H)、1.52(m、4H)、2.03(q、8H、J=6.8Hz)、2.47(m、1H)、2.76(t、4H、J=6.4Hz)、5.32(m、8H)。
Ar雰囲気下の乾燥THF中水素化アルミニウムリチウム懸濁液に、THF中の段階-2生成物を0℃で滴加した。その後、それを室温(RT)に加温させ、RTで20時間撹拌した(TLC)。それを0℃に冷却し、硫酸ナトリウムの飽和溶液で反応停止させた。反応停止させた物質を、セライト床でろ過し、酢酸エチルで洗浄した。混合したろ過液を減圧下で蒸発させて粗生成物を得、それを、ヘキサン中10%酢酸エチルを使用したシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、純粋な生成物1033(3.7g、収率:71%)を薄褐色液体として得た。1H NMR(400MHz、CDCl3):δ0.87(t、6H、J=6.8Hz)、1.27(m、48H)、2.03(q、8H、J=6.8Hz)、2.60(d、2H、J=4.0Hz)、2.76(t、4H、J=6.4Hz)、5.31(m、8H)。13CNMR(100MHz、CDCl3):δ14.1、22.6、25.6、26.8、27.1、27.2、29.3、29.5、29.6、30.1、31.5、40.9、45.2、128.0、130.1。LC-MS:543(M+)。
スキーム2
化合物1003(ALNY-192)
CH2Cl2(200mL)中のN,N’-ジサクシニミジルカルボネート(5.50g、21.5ミリモル)溶液に、3-ジメチルアミノ-1-プロパノール(1001、2.43g、23.6ミリモル)を滴加した。その結果生じた混合物を、室温でオーバーナイトで撹拌した。50mLの溶液を取り出し、Et3N(0.822mL、5.90ミリモル)及びALN-SAN-30(2.08g、3.93ミリモル)を添加し、反応混合物を室温でオーバーナイトで撹拌した。反応混合物をCH2Cl2で希釈し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。有機層を無水MgSO4で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中0~5%MeOH)で精製して、化合物1003を得た(1.66g、2.53ミリモル、64%、CH2Cl2中5%MeOHでRf=0.22)。1H NMR(CDCl3、400MHz)δ5.30~5.41(m、8H)、4.37(d、J=8.0Hz、1H)、4.09(t、J=6.0Hz、2H)、3.57(brs、1H)、2.78(t、J=6.0Hz、4H)、2.33(t、J=8.0Hz、2H)、2.23(s、6H)、2.02~2.06(m、8H)、1.76~1.80(m、2H)、1.27~1.45(m、40H)、0.89(t、J=8.0Hz、6H)。13C NMR(CDCl3、100MHz)δ156.5、130.4、130.3、128.2、128.1、63.2、56.6、51.4、45.7、35.7、31.7、29.9、29.8、29.7、29.6、29.5、27.7、27.5、27.4、26.0、25.8、22.8、14.3。C43H81N2O2の分子量(M+H)+ 計算値657.63、実測値657.5。
CH2Cl2(200mL)中のN,N’-ジサクシニミジルカルボネート(5.50g、21.5ミリモル)溶液に、3-ジメチルアミノ-1-プロパノール(1001、2.43g、23.6ミリモル)を滴加した。その結果生じた混合物を、室温でオーバーナイトで撹拌した。50mLの溶液を取り出し、Et3N(0.822mL、5.90ミリモル)及びALN-SAN-30(2.08g、3.93ミリモル)を添加し、反応混合物を室温でオーバーナイトで撹拌した。反応混合物をCH2Cl2で希釈し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。有機層を無水MgSO4で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中0~5%MeOH)で精製して、化合物1003を得た(1.66g、2.53ミリモル、64%、CH2Cl2中5%MeOHでRf=0.22)。1H NMR(CDCl3、400MHz)δ5.30~5.41(m、8H)、4.37(d、J=8.0Hz、1H)、4.09(t、J=6.0Hz、2H)、3.57(brs、1H)、2.78(t、J=6.0Hz、4H)、2.33(t、J=8.0Hz、2H)、2.23(s、6H)、2.02~2.06(m、8H)、1.76~1.80(m、2H)、1.27~1.45(m、40H)、0.89(t、J=8.0Hz、6H)。13C NMR(CDCl3、100MHz)δ156.5、130.4、130.3、128.2、128.1、63.2、56.6、51.4、45.7、35.7、31.7、29.9、29.8、29.7、29.6、29.5、27.7、27.5、27.4、26.0、25.8、22.8、14.3。C43H81N2O2の分子量(M+H)+ 計算値657.63、実測値657.5。
化合物1004(ALNY-200)
CH2Cl2(200mL)中のN,N’-ジサクシニミジルカルボネート(5.50g、21.5ミリモル)溶液に、3-ジメチルアミノ-1-プロパノール(1001、2.43g、23.6ミリモル)を滴加した。その結果生じた混合物を、室温でオーバーナイトで撹拌した。50mLの溶液を取り出し、Et3N(0.697mL、5.00ミリモル)及びアミン1033(1.71g、3.15ミリモル)を添加し、反応混合物を室温でオーバーナイトで撹拌した。反応混合物をCH2Cl2で希釈し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。有機層を無水MgSO4で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中0~5%MeOH)で精製して、化合物1004を得た(1.14g、1.70ミリモル、54%、CH2Cl2中5%MeOHでRf=0.13)。C44H83N2O2の分子量(M+H)+ 計算値671.65、実測値671.5。
CH2Cl2(200mL)中のN,N’-ジサクシニミジルカルボネート(5.50g、21.5ミリモル)溶液に、3-ジメチルアミノ-1-プロパノール(1001、2.43g、23.6ミリモル)を滴加した。その結果生じた混合物を、室温でオーバーナイトで撹拌した。50mLの溶液を取り出し、Et3N(0.697mL、5.00ミリモル)及びアミン1033(1.71g、3.15ミリモル)を添加し、反応混合物を室温でオーバーナイトで撹拌した。反応混合物をCH2Cl2で希釈し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。有機層を無水MgSO4で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中0~5%MeOH)で精製して、化合物1004を得た(1.14g、1.70ミリモル、54%、CH2Cl2中5%MeOHでRf=0.13)。C44H83N2O2の分子量(M+H)+ 計算値671.65、実測値671.5。
スキーム3
化合物1007
CH2Cl2(200mL)中のN,N’-ジサクシニミジルカルボネート(5.50g、21.5ミリモル)溶液に、2-ジメチルアミノエタノール(1005、2.37mL、23.6ミリモル)を滴加した。その結果生じた混合物を、室温でオーバーナイトで撹拌した。50mLの溶液を取り出し、Et3N(0.822mL、5.90ミリモル)及びALN-SAN-30(2.07g、3.92ミリモル)を添加し、反応混合物を室温でオーバーナイトで撹拌した。反応混合物をCH2Cl2で希釈し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。有機層を無水MgSO4で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中0~5%MeOH)で精製して、化合物1007を得た(1.78g、2.77ミリモル、71%、2ステップ、CH2Cl2中5%MeOHで展開してRf=0.26)。C42H79N2O2の分子量(M+H)+ 計算値643.61、実測値643.5。
CH2Cl2(200mL)中のN,N’-ジサクシニミジルカルボネート(5.50g、21.5ミリモル)溶液に、2-ジメチルアミノエタノール(1005、2.37mL、23.6ミリモル)を滴加した。その結果生じた混合物を、室温でオーバーナイトで撹拌した。50mLの溶液を取り出し、Et3N(0.822mL、5.90ミリモル)及びALN-SAN-30(2.07g、3.92ミリモル)を添加し、反応混合物を室温でオーバーナイトで撹拌した。反応混合物をCH2Cl2で希釈し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。有機層を無水MgSO4で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中0~5%MeOH)で精製して、化合物1007を得た(1.78g、2.77ミリモル、71%、2ステップ、CH2Cl2中5%MeOHで展開してRf=0.26)。C42H79N2O2の分子量(M+H)+ 計算値643.61、実測値643.5。
化合物1008
CH2Cl2(200mL)中のN,N’-ジサクシニミジルカルボネート(5.50g、21.5ミリモル)溶液に、2-ジメチルアミノエタノール(1005、2.37mL、23.6ミリモル)を滴加した。その結果生じた混合物を、室温でオーバーナイトで撹拌した。50mLの溶液を取り出し、Et3N(0.697mL、5.00ミリモル)及び1033(440mg、0.812ミリモル)を添加し、反応混合物を室温でオーバーナイトで撹拌した。反応混合物をCH2Cl2で希釈し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。有機層を無水MgSO4で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中0~5%MeOH)で精製して、化合物8を得た(332mg、0.505ミリモル、62%、CH2Cl2中5%MeOHでRf=0.30)。C43H81N2O2の分子量(M+H)+ 計算値657.63、実測値657.5。
CH2Cl2(200mL)中のN,N’-ジサクシニミジルカルボネート(5.50g、21.5ミリモル)溶液に、2-ジメチルアミノエタノール(1005、2.37mL、23.6ミリモル)を滴加した。その結果生じた混合物を、室温でオーバーナイトで撹拌した。50mLの溶液を取り出し、Et3N(0.697mL、5.00ミリモル)及び1033(440mg、0.812ミリモル)を添加し、反応混合物を室温でオーバーナイトで撹拌した。反応混合物をCH2Cl2で希釈し、飽和NaHCO3水溶液で洗浄した。有機層を無水MgSO4で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2中0~5%MeOH)で精製して、化合物8を得た(332mg、0.505ミリモル、62%、CH2Cl2中5%MeOHでRf=0.30)。C43H81N2O2の分子量(M+H)+ 計算値657.63、実測値657.5。
実施例25:グアニジウム結合脂質の合成
グアニジウム類似体
2064の合成
2063の合成:DMF/酢酸エチル混合物中の2058(6.7g、0.0112モル)溶液に、ビス-Boc-S-メチルイソチオ尿素(3.4g、0.0118モル)及びトリエチルアミン(3.5mL、0.246モル)を0℃で添加した。均質な溶液に、HgCl2(3.3g、0.0123モル)を0℃で添加し、1時間室温で撹拌した。TLCは、出発物質が存在しないことを示した。その後、反応物を酢酸エチル(100mL)で希釈した。セライトのパッドでろ過し、酢酸エチルで洗浄した。ろ過液を水洗浄(2×150mL)及びブライン洗浄(200mL)した。濁った有機層を、セライト/230~400メッシュシリカゲル/セライトのパッドで再度ろ過した。ろ過液を減圧で蒸発させて粗生成物を得、それを、溶出液としてDCM/ヘキサンを使用した中性アルミナのクロマトグラフィーで精製した。生成物をヘキサン中40%DCMで溶出し、黄色液体を得た(収量5.2g、55%)。1H NMR(400MHz、CDCl3):0.89(t、6H、J=6.8Hz)、1.27~1.46(m、43H)、1.49(s、9H)、1.50(s、9H)、2.02(q、8H、J1=6.8Hz、J2=6.8Hz)、2.12(d、2H、J=7.2Hz)、2.16(s、3H)、2.46(t、2H、J=5.6Hz)、2.77(t、4H、J=6Hz)、3.47(m、2H)、5.30(m、8H)、8.67(s、1H)、11.48(9s、1H)。
グアニジウム類似体
2064の合成
2064(ALNY-139)の合成:0℃の10mL DCM中2063(5.2g、0.0062モル)溶液に、60mL DCM中の10mL TFAをゆっくりと添加した。添加後、反応物を室温で3時間撹拌した。TLCは、出発物質が存在しないことを示した。過剰TFAを減圧下で除去し、必要な生成物を褐色粘性液体として得た(5.3g、78%)。1H NMR(400MHz、CDCl3):0.89(t、6H、J=6.8Hz)、1.27~1.46(m、44H)、1.78(s、1H)、2.02(q、8H、J1=6.4Hz、J2=6.8Hz)、2.77(t、4H、J=6.4Hz)、2.86(s、3H)、2.92~3.01(m、2H)、3.27~3.39(m、2H)、3.76~3.9(m、2H)、5.30(m、8H)、7.12(m、2H)、8.41(m、1H)、10.02(m、3H)。13C NMR(100MHz、CDCl3):14.0、22.5、25.6、25.8、26.0、27.17、27.19、27.6、29.3、29.33、29.5、29.6、31.0、31.5、33.9、36.3、41.0、54.1、55.2、62.0、62.19、111.4、114.3、117.1、119.9、127.9、127.95、130.1、130.2、152.1、155.0、157.4、161.2、161.6、161.96、162.3。MS:1093(テトラTFA塩)。
実施例26:オキシム-及びヒドラゾン結合脂質の合成:
スキーム1
実験の詳細
化合物5006(ALNY-175):EtOH(50mL)を含有するフラスコに、ジメチルアミノエチルヒドラジン二塩酸塩(1.00g、5.70ミリモル)及びケトン5005(2.00g、3.80ミリモル)を添加した。混合物を60℃で16時間加熱した。Et3N(0.5mL)の添加後、反応混合物を蒸発させた。残渣をEt2O及び飽和NaHCO3水溶液で抽出し、有機層をMgSO4で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2:MeOH:NH3水溶液=95:5:0.5、Rf=0.29)で精製して、化合物3を得た(1.78g、2.91ミリモル、76%)。C41H78N3の分子量(M+H)+ 計算値612.62、実測値612.5。
スキーム1
化合物5006(ALNY-175):EtOH(50mL)を含有するフラスコに、ジメチルアミノエチルヒドラジン二塩酸塩(1.00g、5.70ミリモル)及びケトン5005(2.00g、3.80ミリモル)を添加した。混合物を60℃で16時間加熱した。Et3N(0.5mL)の添加後、反応混合物を蒸発させた。残渣をEt2O及び飽和NaHCO3水溶液で抽出し、有機層をMgSO4で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2:MeOH:NH3水溶液=95:5:0.5、Rf=0.29)で精製して、化合物3を得た(1.78g、2.91ミリモル、76%)。C41H78N3の分子量(M+H)+ 計算値612.62、実測値612.5。
化合物5007(ALNY-187):EtOH(10mL)中の3-ジメチルアミノ-プロピオン酸ヒドラジド(Ryan Scientific社製、500mg、3.89ミリモル)及びEtOH(20mL)中のジリノレイルケトン5005(1.74g、3.31ミリモル)を、一緒に混合した。この溶液に、酢酸(0.038mL、0.662ミリモル)を添加し、反応混合物を65℃で5時間加熱した。Et3N(0.5mL)の添加後、反応混合物を蒸発させた。残渣をCH2Cl2及び飽和NaHCO3水溶液で抽出し、有機層をMgSO4で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2:MeOH:NH3水溶液=95:5:0.5、Rf=0.30)で精製して、化合物5007を得た(1.40g、2.19ミリモル、66%)。C42H78N3Oの分子量(M+H)+ 計算値640.61、実測値640.5。
スキーム2
5008b:トルエン中の5008a(30g、56.8ミリモル)溶液に、N-ヒドロキシフタルイミド(13.9g、85ミリモル)及びTPP(22.30g、85ミリモル)を、アルゴン下で添加した。反応物を-5℃に冷却し、これに、TEA(11.84mL)、その後DEAD(13.14mL)を添加した。反応物を室温で12時間撹拌させた(TLC)。その後、それをセライトパッドでろ過した。ろ過液を減圧下で蒸発させて粗生成物を得、それをシリカゲルクロマトグラフィーで精製して純粋な生成物を得、それを3%ジエチルエーテル及びヘキサンで溶出して、生成物5008b(22.90g、60.50%)を淡黄色液体として得た。1HNMR(400MHz、CDCl3、):δ0.90(6H、t、J=7.2Hz)、1.2~1.4(34H、m)、1.66~1.70(4H、m)、2.03~2.08(8H、m)、2.78(4H、t、J=12.8Hz)、4.22(1H、m)、5.29~5.43(8H、m)、7.74~7.76(2H、m)、7.83~7.85(2H、m)。13CNMR(100MHz、CDCl3、):δ14.3、22.5、24.9、25.6、27.2、27.20、29.3、29.3、29.5、29.5、29.6、29.7、31.5、32.4、88.3、123.3、127.9、129.0、130.1、134.3、164.3。MS:C45H71NO3の分子量計算値673.54、実測値674.55(M+H)。
化合物5010:ALY-SAN-031(2.36g、3.50ミリモル)を、CH2Cl2(36mL)及びEtOH(4mL)中のヒドラジン一水和物(0.424mL、5.60ミリモル)で2時間処理した。その結果生じた白色析出物をろ過した後、ろ過液を濃縮した。残渣をEt2O及び飽和NaHCO3水溶液で抽出し、有機層をMgSO4で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗物質5008を、さらなる精製をせずに次のステップで使用した。Rf=0.44(ヘキサン中10%EtOAC)。C37H70NOの分子量(M+H)+ 計算値544.55、実測値544.2。
化合物5008をEtOH(30mL)に溶解し、4-(ジメチルアミノ)ブタン-2-オン(Matrix Scientific社製、500mg、4.34ミリモル)及び酢酸(0.040mL、0.70ミリモル)を、その溶液に添加した。反応混合物を室温で14時間撹拌した。Et3N(0.5mL)の添加後、反応混合物を蒸発させた。残渣をEt2O及び飽和NaHCO3水溶液で抽出し、有機層をMgSO4で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗物質を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:EtOAc=1:1)で精製して、化合物5010をE/Z異性体の混合物として得た(1.90g、2.96ミリモル、85%、2ステップ、ヘキサン:EtOAc=1:1で展開してRf=0.39、0.21)。C43H81N2Oの分子量(M+H)+ 計算値641.63、実測値641.5。
化合物5009:化合物5006(800mg、1.47ミリモル)をEtOH(15mL)に溶解し、その溶液に(ジメチルアミノ)アセトン(Aldrich社製、0.220mL、1.91ミリモル)及び酢酸(0.017mL、0.294ミリモル)を添加し、反応混合物を14時間室温で撹拌した。Et3N(0.5mL)の添加後、反応混合物を蒸発させた。残渣をEt2O及び飽和NaHCO3水溶液で抽出し、有機層をMgSO4で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗物質を、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(ヘキサン:EtOAc=9:1)で精製して、化合物5009を得た(868mg、1.38ミリモル、94%、ヘキサン:EtOAc=9:1で展開してRf=0.22)。C42H79N2Oの分子量(M+H)+ 計算値627.62、実測値627.5。
化合物5011:化合物5006(1.09g、2.00ミリモル)をEtOH(20mL)に溶解した。その溶液に、1-メチル-4-ピペリドン(Aldrich社製、0.320mL、2.60ミリモル)及び酢酸(0.40mL、0.400ミリモル)を添加し、反応混合物を14時間室温で撹拌した。Et3N(0.5mL)の添加後、反応混合物を蒸発させた。残渣をEt2O及び飽和NaHCO3水溶液で抽出し、有機層をMgSO4で乾燥し、ろ過し、濃縮した。粗物質をシリカゲルカラムクロマトグラフィー(CH2Cl2:MeOH:NH4OH=97:3:0.3)で精製して、化合物5011を得た(1.11g、1.74ミリモル、87%、CH2Cl2:MeOH:NH4OH=97:3:0.3で展開してRf=0.20)。C43H79N2Oの分子量(M+H)+ 計算値639.62、実測値639.5。
実施例27:他の脂質の合成:
化合物2056(ALNY-181)の合成
2051の合成:Ar雰囲気下のDCM(400mL)中2004(50g、95ミリモル)溶液に、TEA(53mL、378ミリモル)及びDMAP(1.2g、9.5ミリモル)を添加し、Ar雰囲気下、室温で撹拌した。反応物を-5℃に冷却し、DCM(100mL)中の塩化メシル(15mL、190ミリモル)溶液を-5℃未満の温度でゆっくりと添加し、添加後、室温に加温させた。30分後(TLC)、反応物を氷冷水(20mL)で反応停止させた。有機層を分離し、1N HCl(30mL)、水、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で蒸発させて純粋な生成物(55g、95.5%)を黄色液体として得た。1H NMR(400MHz、CDCl3):δ0.89(t、6H、J=6.8)、1.2~1.5(m、36H)、1.67(m、4H)、2.05(q、8H、J1=6.8、J2=6.8)、2.77(t、4H、J=6.4)、2.99(s、3H)、4.71(m、1H)、及び5.36(m、8H)。
化合物2056(ALNY-181)の合成
2052の合成:DMF中のシアン化ナトリウム(1.70g、0.0330モル)撹拌溶液に、DMF(100mL)中の化合物2051(10g、0.0165モル)をゆっくりと添加し、24時間55℃に加熱した(TLC)。その後、それを室温に冷却し、水で希釈し、酢酸エチルで数回抽出した。混合した有機層を、水、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で蒸発させて粗生成物を得、それを、1%エーテル/ヘキサンを使用したシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、生成物を淡黄色液体として得た(5.80g、62%)。1H NMR(400MHz、CDCl3):δ0.87(t、6H、J=6.8Hz)、1.25(m、38H)、1.52(m、4H)、2.03(q、8H、J=6.8Hz、J=6.8Hz)、2.47(m、1H)、2.76(t、4H、J=6.4Hz)、5.32(m、8H)。
2053の合成:アルゴン雰囲気下、0℃のTHF(52mL)中LAH(1.50g、0.0387モル)冷却懸濁液に、THF中の化合物2052(5.2g、0.0097モル)を滴加した。添加後、それを室温に加温させ、20時間撹拌した(TLC)。それを、0℃に冷却し、硫酸ナトリウムの飽和溶液(10mL)、その後酢酸エチルで反応停止させた。セライト床でろ過し、酢酸エチルで洗浄した。混合したろ過液を減圧下で蒸発させて粗生成物を得、それを、ヘキサン中10%酢酸エチルを使用したシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、生成物を薄褐色液体として得た(3.70g、71%)。1H NMR(400MHz、CDCl3):δ0.87(t、6H、J=6.8Hz)、1.27(m、48H)、2.03(q、8H、6.8Hz、6.8Hz)、2.60(d、2H、J=4.0Hz)、2.76(t、4H、J=6.4Hz)、5.31(m、8H)。13C NMR(100MHz、CDCl3):δ14.1、22.6、25.6、26.8、27.1、27.2、29.3、29.5、29.6、30.1、31.5、40.9、45.2、128.0、130.1。質量543(M+)。
2054の合成:アルゴン雰囲気下、0℃のDCM(450mL)中の化合物2053(45g、0.083モル)溶液に、2,6-ルチジン(19.3mL、0.166モル)、その後クロロギ酸ベンジル(12.1mL、0.0847モル)を滴加した。その後、それを20℃に加温し、その温度で1時間撹拌した(TLC)。その後、それを、DCM(200mL)で希釈し、10%クエン酸(2×200mL)、水、ブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で蒸発させて粗生成物を得、それを、3%エーテル/ヘキサンを使用したシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、最終生成物を薄褐色液体として得た(36g、64%)。1H NMR(400MHz、CDCl3):δ0.87(t、6H、J=6Hz)、1.28(m、44H)、2.02(q、8H、J1=6.8Hz、J2=6.8Hz)、2.76(t、4H、J=6.4Hz)、3.11(t、2H、J=5.6Hz)、4.67(s、1H)、5.18(s、2H)、5.30(m、8H)、7.31(m、4H)。
2055の合成:アルゴン雰囲気下、0℃のTHF(360mL)中水素化アルミニウムリチウム(4.05g、0.1066モル)懸濁液に、THF中の化合物2054(36g、0.0533モル)を滴加した。添加後、それを室温に加温させ、15時間撹拌した(TLC)。反応物を0℃に冷却し、硫酸ナトリウムの飽和溶液、その後酢酸エチルで反応停止させた。それをセライト床でろ過し、酢酸エチルで洗浄した。混合したろ過液を蒸発させ、100%メタノールを使用したシリカゲルで精製して、最終生生成物を得た(26g、87%)。1H NMR(400MHz、CDCl3):δ0.87(t、6H、J=6.8Hz)、1.27(m、42H)、2.03(q、8H、J1=6.8Hz、J2=6.8Hz)、2.45(s、3H)、2.49(d、2H、J=6Hz)、2.76(t、4H、J=6.4Hz)、5.30(m、8H)。
2055aの合成:化合物2055(4g、0.0072モル)をアルゴン雰囲気下でDCM(40mL)に溶解し、0℃に冷却した。この溶液に、2,6-ルチジン(1.7mL、0.0144モル)、その後クロロギ酸ベンジル(1.0mL、0.0074モル)を滴加した。その後、それを、20℃に加温させ、1時間撹拌した(TLC)。その後、それをDCM(200mL)で希釈し、10%クエン酸(2×200mL)、水、及びブラインで洗浄した。混合した有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で蒸発させて粗生成物を得、それを、3%エーテル/ヘキサンを使用したシリカゲルで精製して、最終生成物を得た(3.80g、76%)。1H NMR(400MHz、CDCl3):δ0.87(t、6H、J=6.8Hz)、1.20(m、44H)、2.02(q、8H、J1=6.8Hz、J2=6.8Hz)、2.76(t、4H、J=6.4Hz)、2.89(d、3H、J=6Hz)、3.14(m、2H)、5.12(s、2H)、5.30(m、8H)、7.26(m、4H)。
2056の合成:アルゴン雰囲気下、0℃のTHF中水素化アルミニウムリチウム(0.52g、0.0138モル)懸濁液に、THF(38mL)中の化合物2055a(3.80g、0.0055モル)を滴加した。添加後、それを室温に加温させ、15時間撹拌した(TLC)。反応物を0℃に冷却し、硫酸ナトリウムの飽和溶液、その後酢酸エチルで反応停止させた。全物質をセライト床でろ過し、酢酸エチルで洗浄した。混合したろ過液を減圧下で蒸発させて粗生成物を得、それを、100%メタノールを使用したシリカゲルクロマトグラフィーで精製して、最終生成物を無色液体として得た(2.20g、70%)。1H NMR(400MHz、CDCl3):δ0.87(t、6H、J=6.8Hz)、1.21(m、44H)、2.03(q、8H、J=6.8Hz、J=6.4Hz)、2.18(s、6H)、2.76(t、4H、J=6.4Hz)、5.30(m、8H)。13C NMR(100MHz、CDCl3):δ14.0、22.4、25.5、26.5、27.0、27.1、29.2、29.4、29.6、30.0、31.4、32.1、35.6、45.9、64.8、127.8、130.0。ELSD:99.0% 質量:570.2(M+)
2062(ALNY-141)の合成:
2061の合成:アルゴン下、0℃の100mL DCM中2055(5g、0.0089モル)溶液に、NaBH(OAc)3(2.30g、0.0106モル)を添加し、20分間撹拌した。700mL DCM中のアルデヒド(1.70g、0.0082モル)を、45分間の期間にわたって反応物にゆっくりと添加した。添加した後、反応物を室温で15~20分間撹拌させた。TLCは、出発物質が存在しないことを示した。反応を飽和NaHCO3(2×500mL)及び水(500mL)で洗浄した。水層をDCM(500mL)で再度抽出した。混合した有機層を、ブライン(500mL)で洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥し、ろ過し、濃縮した。得られた粗生成物を、シリカゲルクロマトグラフィー及び溶出液としてのヘキサン/ジエチルエーテルにより精製した。生成物をヘキサン中8%エーテルで溶出し、褐色液体を得た(収量6.40g、96%)。1H NMR:(400MHz、CDCl3):0.89(t、6H、J=7.2Hz)、1.26~1.43(m、40H)、1.85(m、1H)、2.06(q、8H、J1=6.8Hz、J2=6.8Hz)、2.15(s、2H)、2.20(s、3H)、2.45(m、2H)、2.77(t、4H、J=6Hz)、2.95(s、3H)、3.35(m、2H)、5.12(s、2H)、5.32(m、8H)、7.35(m、5H)。
2062の合成:アルゴン雰囲気下、0℃のTHF中水素化アルミニウムリチウム(0.751g、0.0198モル)懸濁液に、THF中の化合物2061(5.7g、0.0076モル)を滴加した。添加後、それを室温に加温させ、15時間撹拌した(TLC)。反応物を0℃に冷却し、硫酸ナトリウム(50mL)の飽和溶液、その後酢酸エチル(100mL)で反応停止させた。それをセライト床でろ過し、酢酸エチルで洗浄した。混合したろ過液を減圧下で蒸発させて粗生成物を得、それを、溶出液としてDCM/酢酸エチル/クロロホルム/メタノールを使用したシリカゲルクロマトグラフィーで精製した。生成物を、メタノール中3%クロロホルムで褐色液体として溶出した(3.80g、80%)。1H NMR:(400MHz、CDCl3):0.89(t、6H、J=6.8Hz)、1.26~1.37(m、40H)、1.42(m、1H)、2.06(q、8H、J1=6.8Hz、J2=6.8Hz)、2.15(d、2H、J=7.2Hz)、2.20(s、3H)、2.29(s、6H)、2.45(s、4H)、2.78(t、4H、J=6.4Hz)、5.36(m、8H)。13C NMR:(100MHz、CDCl3):14.1、22.6、25.6、26.6、27.2、27.22、28.9、29.3、29.6、29.7、30.1、31.5、32.2、35.8、43.2、45.7、56.2、57.2、63.3、127.9、130.2。HPLC ELSD:100% 質量:627.53
上記に記載されている種々の実施形態を組み合わせて、さらなる実施形態を提供することができる。本明細書で参照されている及び/又は出願データシートに列挙されている米国特許、米国特許出願公開、外国特許、外国特許出願、及び非特許文献には、これらに限定されないが、以下のものが含まれる:[挿入リスト]、これらは参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。実施形態の態様は、必要に応じて、またさらなる実施形態を提供するために種々の特許、出願、及び文献の概念を使用して改変することができる。
実施形態に対するこれら及び他の改変を、上記の詳細な記載に照らして行うことができる。一般的に、添付の特許請求の範囲では、使用される用語は、本明細書及び特許請求の範囲で開示された特定の実施形態に、特許請求の範囲を限定するように解釈されるべきでないが、そのような特許請求の範囲に与えられる等価物の完全な範囲と共にあらゆる考え得る実施形態を含むと解釈されるべきである。したがって、特許請求の範囲は本開示により限定されない。
Claims (25)
- 下記構造を有し、
R1及びR2は、各存在において各々独立して、随意に置換されたC10~C30アルキル、随意に置換されたC10~C30アルケニル、随意に置換されたC10~C30アルキニル、随意に置換されたC10~C30アシル、又は-リンカー-リガンドであり、
R3は、H、随意に置換されたC1~C10アルキル、随意に置換されたC2~C10アルケニル、随意に置換されたC2~C10アルキニル、アルキルヘトロ環、アルキルホスフェート、アルキルホスホロチオアート、アルキルホスホロジチオアート、アルキルホスホネート、アルキルアミン、ヒドロキシアルキル、ω-アミノアルキル、ω-(置換)アミノアルキル、ω-ホスホアルキル、ω-チオホスホアルキル、随意に置換されたポリエチレングリコール(PEG、分子量:100~40K)、随意に置換されたmPEG(分子量:120~40K)、へテロアリール、ヘテロ環、又はリンカー-リガンドであり、
Eは、O、S、N(Q)、C(O)、N(Q)C(O)、C(O)N(Q)、(Q)N(CO)O、O(CO)N(Q)、S(O)、NS(O)2N(Q)、S(O)2、N(Q)S(O)2、SS、O=N、アリール、へテロアリール、環式、又はヘテロ環であり、及び
Qは、H、アルキル、ω-アミノアルキル、ω-(置換)アミノアルキル、ω-ホスホアルキル、又はω-チオホスホアルキルである、脂質、又はその塩若しくは異性体。 - 下記構造を有し
Eは、O、S、N(Q)、C(O)、N(Q)C(O)、C(O)N(Q)、(Q)N(CO)O、O(CO)N(Q)、S(O)、NS(O)2N(Q)、S(O)2、N(Q)S(O)2、SS、O=N、アリール、へテロアリール、環式、又はヘテロ環であり、
Qは、H、アルキル、ω-アムニノアルキル、ω-(置換)アムニノアルキル、ω-ホスホアルキル、又はω-チオホスホアルキルであり、
R1、R2、及びRxは、各存在において各々独立して、H、随意に置換されたC1~C10アルキル、随意に置換されたC10~C30アルキル、随意に置換されたC10~C30アルケニル、随意に置換されたC10~C30アルキニル、又は随意に置換されたC10~C30アシル、又はリンカー-リガンドであり、ただしR1、R2、及びRxの少なくとも1つはHではなく、
R3は、H、随意に置換されたC1~C10アルキル、随意に置換されたC2~C10アルケニル、随意に置換されたC2~C10アルキニル、アルキルヘトロ環、アルキルホスフェート、アルキルホスホロチオアート、アルキルホスホロジチオアート、アルキルホスホネート、アルキルアミン、ヒドロキシアルキル、ω-アミノアルキル、ω-(置換)アミノアルキル、ω-ホスホアルキル、ω-チオホスホアルキル、随意に置換されたポリエチレングリコール(PEG、分子量:100~40K)、随意に置換されたmPEG(分子量:120~40K)、へテロアリール、ヘテロ環、又はリンカー-リガンドであり、
nは、1、2、又は3である、脂質、又はその塩若しくは異性体。 - 請求項1又は2に記載の脂質を含む脂質粒子。
- 請求項1に記載の脂質を含む、請求項3に記載の脂質粒子。
- 前記脂質粒子が、中性脂質、及び凝集を低減することが可能な脂質をさらに含む、請求項3に記載の脂質粒子。
- 前記脂質粒子が、
a.請求項1又は2に記載の脂質と、
b.DSPC、DPPC、POPC、DOPE、及びSMから選択される中性脂質と、
c.ステロールと
d.PEG-DMGとから本質的になり、
モル比が、約20~60%脂質:5~25%中性脂質:25~55%ステロール:0.5~15%PEG-DMG又はPEG-DMAである、請求項4に記載の脂質粒子。 - 治療薬をさらに含む、請求項3に記載の脂質粒子。
- 前記治療薬が核酸である、請求項7に記載の脂質粒子。
- 前記核酸がプラスミドである、請求項8に記載の脂質粒子。
- 前記核酸が、免疫賦活化オリゴヌクレオチドである、請求項8に記載の脂質粒子。
- 前記核酸が、siRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロRNA、アンタゴmir、アプタマー、及びリボザイムからなる群から選択される、請求項8に記載の脂質粒子。
- 前記核酸がsiRNAである、請求項11に記載の脂質粒子。
- 請求項8に記載の脂質粒子及び薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤を含む医薬組成物。
- 請求項7に記載の脂質粒子を細胞に提供することを含む、細胞の標的遺伝子の発現を調節する方法。
- 前記治療薬が、siRNA、アンタゴmir、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びsiRNA、リボザイム、アプタマー、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現可能なプラスミドから選択される、請求項14に記載の方法。
- 前記核酸が、前記ポリペプチド又はその機能的変異体若しくは断片をコードするプラスミドであり、そのため前記ポリペプチド又はその機能的変異体若しくは断片の発現が増加される、請求項14に記載の方法。
- 対象体でポリペプチドが過剰発現されることを特徴とする疾患又は障害を治療する方法であって、前記対象体に、請求項13に記載の医薬組成物を提供することを含み、前記治療薬が、siRNA、マイクロRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、及びsiRNA、マイクロRNA、又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現可能なプラスミドから選択され、前記siRNA、マイクロRNA、又はアンチセンスRNAが、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと特異的に結合するポリヌクレオチド又はその相補体を含む方法。
- 対象体でポリペプチドが過小発現されることを特徴とする疾患又は障害を治療する方法であって、前記対象体に、請求項13に記載の医薬組成物を提供することを含み、前記治療薬が、前記ポリペプチド又はその機能的変異体若しくは断片をコードするプラスミドである方法。
- 対象体において免疫応答を誘導する方法であって、前記対象体に、請求項13に記載の医薬組成物を提供することを含み、前記治療薬が免疫賦活化オリゴヌクレオチドである方法。
- 前記医薬組成物が、ワクチン又は抗原と組み合わせて前記患者に提供される、請求項19に記載の方法。
- 請求項9に記載の脂質粒子と、疾患又は病原体に関連する抗原とを含むワクチン。
- 前記抗原が腫瘍抗原である、請求項22に記載のワクチン。
- 前記抗原が、ウイルス抗原、細菌抗原、又は寄生虫抗原である、請求項22に記載のワクチン。
- 前記モル比が、52%脂質:5%中性脂質:30%ステロール:13%PEG-DMGである、請求項7に記載の脂質粒子。
- 前記標的遺伝子が、第VII因子、Eg5、PCSK9、TPX2、apoB、SAA、TTR、RSV、PDGFベータ遺伝子、Erb-B遺伝子、Src遺伝子、CRK遺伝子、GRB2遺伝子、RAS遺伝子、MEKK遺伝子、JNK遺伝子、RAF遺伝子、Erk1/2遺伝子、PCNA(p21)遺伝子、MYB遺伝子、JUN遺伝子、FOS遺伝子、BCL-2遺伝子、サイクリンD遺伝子、VEGF遺伝子、EGFR遺伝子、サイクリンA遺伝子、サイクリンE遺伝子、WNT-1遺伝子、ベータカテニン遺伝子、c-MET遺伝子、PKC遺伝子、NFKB遺伝子、STAT3遺伝子、サバイビン遺伝子、Her2/Neu遺伝子、SORT1遺伝子、XBP1遺伝子、トポイソメラーゼI遺伝子、トポイソメラーゼIIアルファ遺伝子、p73遺伝子、p21(WAF1/CIP1)遺伝子、p27(KIP1)遺伝子、PPM1D遺伝子、RAS遺伝子、カベオリンI遺伝子、MIB I遺伝子、MTAI遺伝子、M68遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、及びp53腫瘍抑制遺伝子からなる群から選択される、請求項15に記載の方法。
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