JP6605446B2 - 形質移入用の脂質ナノ粒子および関連方法 - Google Patents
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Description
本出願は、2013年3月15日に出願された米国特許出願第61/798,495号の利益を主張するものであり、参照によりその全体が明示的に本明細書に組み込まれる。
本出願に添付されている配列表は、書面の代わりにテキスト形式で提供されており、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、43935_Sequence_Final_2014−03−14.txtである。このテキストファイルは748バイトであり、2014年3月14日に作成され、本明細書の出願と共にEFS−Webから提出されている。
(a)第1の溶媒中の核酸を含む第1のストリームをマイクロ流体デバイスに導入することであって、デバイスは、導入される1つ以上のストリームをデバイスに流すように構成された第1の領域、および1つ以上のストリームの内容物をマイクロ流体ミキサで混合するための第2の領域を有すること、
(b)第2の溶媒中の形質移入試薬組成物を含む第2のストリームをデバイスに導入することであって、デバイスは、導入される1つ以上のストリームをマイクロチャネルに流し、それらを1つ以上のストリームの内容物を混合するための第2の領域に向けるように構成されている第1の領域を有し、形質移入試薬組成物は、陽イオン性脂質を含み、第1および第2の溶媒は同じではないこと、
(c)1つ以上の第1のストリームおよび1つ以上の第2のストリームを、デバイスの第1の領域からデバイスの第2の領域に流すこと、および
(d)1つ以上の第1のストリームおよび1つ以上の第2のストリームの内容物を、デバイスの第2の領域で混合して、封入された核酸を有する脂質ナノ粒子を含む第3のストリームを提供することを含む方法を提供する。
(a)第1の溶媒中の核酸を含む第1のストリームをチャネルに導入することであって、デバイスは、導入される1つ以上のストリームをチャネルに流すように構成された第1の領域、および1つ以上のストリームの内容物を混合するための第2の領域を有すること、
(b)第2の溶媒中の形質移入試薬組成物を含む第2のストリームを導入することであって、チャネルは、導入される1つ以上のストリームをチャネルに流すように構成された第1の領域、および1つ以上のストリームの内容物を混合するための第2の領域を有すること、
(c)1つ以上の第1のストリームおよび1つ以上の第2のストリームを、2つのストリームの物理的分離を維持しつつ、チャネルの第1の領域からチャネルの第2の領域に流すことであって、1つ以上の第1のストリームおよび1つ以上の第2のストリームは、チャネルの第2の領域に到着するまで混合されないこと、および
(d)流れている1つ以上の第1のストリームおよび1つ以上の第2のストリームの内容物を、マイクロチャネルの第2の領域で混合して、封入された核酸を有する脂質ナノ粒子を含む第3のストリームを提供することを含む方法を提供する。
(a)第1の溶媒中の核酸を含む第1の溶液を受容するための第1の入口、
(b)第1の溶媒中の核酸を含む第1のストリームを提供するための、第1の入口と流体連通する第1の入口マイクロチャネル、
(c)第2の溶媒中の形質移入試薬組成物を含む第2の溶液を受容するための第2の入口、
(d)第2の溶媒中の形質移入試薬組成物を含む第2のストリームを提供するための、第2の入口と流体連通する第2の入口マイクロチャネル、および
(e)第1および第2のストリームを受容するための第3のマイクロチャネルを含み、第3のマイクロチャネルは、導入される第1および第2のストリームをマイクロチャネルに流すように構成された第1の領域、ならびに第1および第2のストリームの内容物を混合して、封入された核酸を有する脂質ナノ粒子を含む第3のストリームを提供するように構成された第2の領域を有するデバイスを提供する。
1つの側面では、本発明は、形質移入試薬組成物を提供する。形質移入試薬組成物は、1つ以上の陽イオン性脂質、1つ以上の第2の脂質、1つ以上のステロール、および1つ以上の界面活性剤を含む。
1つの側面では、本発明は、陰イオン性巨大分子を含有する脂質ナノ粒子を提供する。脂質ナノ粒子は、1つ以上の陽イオン性脂質、1つ以上の第2の脂質、および1つ以上の核酸を含む。
脂質ナノ粒子は、陽イオン性脂質を含む。本明細書で使用される場合、用語「陽イオン性脂質」は、pHが脂質のイオン化可能基のpKよりも低いと陽イオン性であるまたは陽イオン性になるが(プロトン化される)、より高いpH値では次第により中性になる脂質を指す。この脂質は、pK未満のpH値では、負に荷電した核酸(例えば、オリゴヌクレオチド)と結合することができる。本明細書で使用される場合、用語「陽イオン性脂質」は、pHが低下すると正電荷性になると推定される双性イオン性脂質を含む。本発明に有用な陽イオン性脂質には、PEGリン脂質(例えば、ポリエチレンオキシド含有リン脂質)が含まれない。
R3およびR4は、同じまたは異なっているのいずれかであり、独立して、任意に置換されていてもよいC1〜C6アルキル、任意に置換されていてもよいC2〜C6アルケニル、または任意に置換されていてもよいC2〜C6アルキニルであり、またはR3およびR4は、一緒になって、4〜6つの炭素原子、ならびに窒素および酸素から選択される1つまたは2つのヘテロ原子の、任意に置換されていてもよい複素環を形成してもよく、
R5は、存在していないまたは存在しているのいずれかであり、存在する場合は、水素またはC1〜C6アルキルであり、
m、n、およびpは、同じまたは異なっているのいずれかであり、独立して0または1のいずれかであり、ただし、m、n、およびpは、同時に0ではなく、
qは、0、1、2、3、または4であり、
YおよびZは、同じまたは異なっているのいずれかであり、独立して、O、S、またはNHである)。
R1およびR2は、各々独立して、H、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、およびヘテロシクリルであり、
ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、およびヘテロシクリルの各々は、H;ハロ;ヒドロキシ;シアノ;オキソ;ハロ、ヒドロキシ、またはアルコキシにより任意に置換されていてもよいC1〜C6アルキルにより任意に置換されていてもよく、
または、R1およびR2は、それらが両方とも結合するN原子と一緒になって、3〜8員環へテロアリールまたはヘテロシクリルを形成し、ここで、へテロアリールおよびヘテロシクリルの各々は、H;ハロ;ヒドロキシで;シアノ;オキソ;ニトロ;ハロ、ヒドロキシル、またはアルコキシにより任意に置換されていてもよい、C1〜C6アルキルにより任意に置換されていてもよく、
R3は、非存在、H、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、またはヘテロシクリルであり、
R4およびR5は、各々独立して、H、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、またはヘテロシクリルであり、
ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、およびヘテロシクリルの各々は、H;ハロ;ヒドロキシ;シアノ;オキソ;ハロ、ヒドロキシ、またはアルコキシにより任意に置換されていてもよいC1〜C6アルキルにより任意に置換されていてもよく、
Xは、−O−、−S−、−NR4−、−S−S−、−OC(=O)−、−、C(=O)O−、−OC(=O)O−、−NR4C(=O)−、C(=O)NR4−、−NR4C(=O)O−、−OC(=O)NR4−、−NR4C(=O)NR4−、−NR4C(=S)O−、OC(=S)NR4−、−NR4C(=S)NR4−、−CR4R5−であり、
YおよびZは、独立して、式L1−(CR6R7)α−[L2−(CR6R7)β]γ−L3−R8を有するC10〜C30基であり、式中、
L1は、結合、−(CR6R7)−、−O−、−CO−、−NR8−、−S−、またはそれらの組み合わせであり、
各R6およびR7は、独立して、H;ハロ;ヒドロキシル、シアノ;ハロ、ヒドロキシル、またはアルコキシにより任意に置換されていてもよいC1〜C6アルキルであり、
L2は、結合、−(CR6R7)−、−O−、−CO−、−NR8−、−S−、
L3は、結合、−(CR6R7)−、−O−、−CO−、−NR8−、−S−、
R8は、独立して、H;ハロ;ヒドロキシ;シアノ;ハロ、ヒドロキシ、またはアルコキシにより任意に置換されていてもよいC1〜C6アルキル;アリール;へテロアリール;もしくはヘテロシクリルであるか、またはR8は、下記式を有し、
αは、0〜6であり、
各βは、独立して、0〜6であり、
γは、0〜6である)。
ある態様では、形質移入試薬組成物は、1つ以上の中性脂質を含む。
ある態様では、形質移入試薬組成物は、1つ以上のステロールを含む。
ある態様では、形質移入試薬組成物は、1つ以上の界面活性剤を含む。
R1は、H、C1〜C6アルキルであり、
Xは、−O−、−S−、−NR2−、−S−S−、−OC(=O)−、−C(=O)O−、−OC(=O)O−、−NR2C(=O)−、C(=O)NR2−、−NR2C(=O)O−、−OC(=O)NR2−、−NR2C(=O)NR2−、−NR2C(=S)O−、OC(=S)NR2−、−NR2C(=S)NR2−、−CR2R3−であり、
R2およびR3は、各々独立して、H、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、またはヘテロシクリルであり、
ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、およびヘテロシクリルの各々は、H;ハロ;ヒドロキシ;シアノ;オキソ;ハロ、ヒドロキシ、またはアルコキシにより任意に置換されていてもよいC1〜C6アルキルにより任意に置換されていてもよく、
Yは、式L1−(CR4R5)α−[L2−(CR4R5)β]γ−L3−R6を有するC10〜C40基であり、式中、
L1は、結合、−(CR4R5)−、−O−、−CO−、−NR2−、−S−、またはそれらの組み合わせであり、各R4およびR5は、独立して、H;ハロ;ヒドロキシル、シアノ;ハロ、ヒドロキシル、またはアルコキシにより任意に置換されていてもよいC1〜C6アルキルであり、
L2およびL3は、各々独立して、結合、−(CR4R5)−、−O−、−CO−、−NR2−、−S−、
R6は、独立して、H;ハロ;ヒドロキシ;シアノ;ハロ、ヒドロキシ、またはアルコキシにより任意に置換されていてもよいC1〜C6アルキル;アリール;へテロアリール;もしくはヘテロシクリルであるか、またはR6は、下記式を有し、
αは、0〜6であり、
各βは、独立して、0〜6であり、
γは、0〜6である)。
x=1〜50、
y=1〜50、および
z=1〜50である)。
x=1〜50、
y=1〜50、および
z=1〜50である)。
(a)アミノ脂質である陽イオン性脂質またはその薬学的に許容される塩、
(b)リン脂質である中性脂質、
(c)コレステロールであるステロール、および
(d)ポリオキシエチレン(20)オレイルエーテル、ポリオキシエチレン(23)ラウリルエーテル、またはポリオキシエチレン(40)ステアレートから選択される界面活性剤を含む。
(a)1,17−ビス(2−オクチルシクロプロピル)ヘプタデカン−9−イル−4−(ジメチルアミノ)ブタノエートである陽イオン性脂質、またはその薬学的に許容される塩、
(b)1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DSPC)である中性脂質、
(c)コレステロールであるステロール、および
(d)ポリオキシエチレン(20)オレイルエーテル、ポリオキシエチレン(23)ラウリルエーテル、またはポリオキシエチレン(40)ステアレートから選択される界面活性剤を含む。
本発明の脂質ナノ粒子は、陰イオン性巨大分子の全身または局所送達に有用である。本明細書に記載のように、形質移入試薬組成物は、その結果生じる脂質ナノ粒子に組み込まれる陰イオン性巨大分子と混合される。
本発明の脂質ナノ粒子は、核酸の全身または局所送達に有用である。本明細書に記載のように、形質移入試薬組成物は、その結果生じる脂質ナノ粒子に組み込まれる核酸と混合される。
本発明の脂質ナノ粒子は、更に、封入効率が優れていてもよい。下記に記載されているように、本発明の脂質ナノ粒子は、形成プロセスで使用される核酸のほぼ100%(例えば、80〜100%)が、粒子に封入されるプロセスにより調製される。1つの態様では、脂質ナノ粒子は、形成プロセスで使用される核酸の約90から約95%までが粒子に封入されるプロセスにより調製される。
1つの態様では、本発明は、脂質形質移入試薬組成物を使用して、陰イオン性巨大分子を含有する脂質ナノ粒子を作製するための方法を提供する。1つの態様では、本方法は、
(a)第1の溶媒中の陰イオン性巨大分子(例えば、ポリ核酸)を含む第1のストリームをマイクロチャネルに導入することであって、マイクロチャネルは、導入される1つ以上のストリームをマイクロチャネルに流すように構成された第1の領域、および1つ以上のストリームの内容物を混合するための第2の領域を有すること、
(b)第2の溶媒中の形質移入試薬組成物を含む第2のストリームをマイクロチャネルに導入して、デバイスに流れる第1および第2のストリームを準備することであって、形質移入試薬組成物は、イオン化可能な陽イオン性脂質、中性脂質、ステロール、および界面活性剤を含み、第1および第2の溶媒は同じではないこと、
(c)1つ以上の第1のストリームおよび1つ以上の第2のストリームを、マイクロチャネルの第1の領域から、マイクロチャネルの第2の領域に流すこと、および
(d)流れている1つ以上の第1のストリームおよび1つ以上の第2のストリームの内容物を、マイクロチャネルの第2の領域で混合して、封入された陰イオン性巨大分子を有する脂質ナノ粒子を含む第3のストリームを提供することを含む。
別の側面では、本発明は、形質移入試薬組成物を使用して、陰イオン性巨大分子を封入している脂質ナノ粒子を生産するためのデバイスを提供する。1つの態様では、本デバイスは、
(a)第1の溶媒中の核酸を含む第1の溶液を受容するための第1の入口、
(b)第1の溶媒中の核酸を含む第1のストリームを提供するための、第1の入口と流体連通する第1の入口マイクロチャネル、
(c)第2の溶媒中の形質移入試薬組成物を含む第2の溶液を受容するための第2の入口、
(d)第2の溶媒中の形質移入試薬組成物を含む第2のストリームを提供するための、第2の入口と流体連通する第2の入口マイクロチャネル、および
(e)第1および第2のストリームを受容するための第3のマイクロチャネルを含み、第3のマイクロチャネルは、導入される第1および第2のストリームをマイクロチャネルに流すように構成された第1の領域、ならびに第1および第2のストリームの内容物を混合して、封入された核酸を有する脂質ナノ粒子を含む第3のストリームを提供するように構成された第2の領域を有する。
(a)第1の溶媒中の陰イオン性巨大分子を含む第1の溶液と、第2の溶媒中の形質移入試薬組成物を含む第2の溶液の両方を受容するための単一の入口マイクロチャネル、および
(b)第1および第2のストリームの内容物を混合して、封入された陰イオン性巨大分子を有する脂質ナノ粒子を含む第3のストリームを提供するように構成された第2の領域を含む。
本発明の形質移入試薬組成物を使用して、in vitroまたはin vivoで陰イオン性巨大分子を細胞に送達するための脂質ナノ粒子を調製してもよい。特定の態様では、陰イオン性巨大分子は核酸であり、それが、本発明の核酸−脂質ナノ粒子を使用して細胞に送達される。本方法および形質移入試薬組成物は、そのような治療から利益を得るであろう任意の疾患または障害を治療するための任意の好適な陰イオン性巨大分子を送達するように容易に構成することができる。
脂質ナノ粒子の配合物は、カオス的移流を誘発し、中間的なレイノルズ数(24<Re<240)に制御された混合環境を提供するように設計されたマイクロ流体ミキサ(図5)内で、脂質−エタノール溶液を水性緩衝液と迅速に混合することにより実施した。マイクロ流体チャネルは、周期半ばでヘリンボーン構造の配向性を変更することによりカオス的流れを生成し、局所的な回転および伸長流の中心に周期的変化を引き起こすヘリンボーンを含有する。
形質移入試薬組成物からsiRNA−LNP系を生産する際、ロバストなプロセスは、OGN産物の高い封入パーセントを必然的に提供することになる。siRNA封入は、界面活性剤の選択、および形質移入試薬組成物中の界面活性剤の関連割合の関数として評価した。siRNA−LNP配合物は、使用した界面活性剤および界面活性剤の相対的割合に関わらず、100パーセントに近い封入パーセントを達成した(表2)。
i.v.注射後にin vivoで遺伝子サイレンシングを誘導する、siRNA−LNP系の能力を、マウス第VII因子モデルを使用して調査した。siRNA対脂質比が0.06重量/重量の配合物1,17−ビス(2−オクチルシクロプロピル)ヘプタデカン−9−イル(4−(ジメチルアミノ)ブタノエート:DSPC:コレステロール:界面活性剤)(50:10:40−界面活性剤%:界面活性剤%)を、マイクロ流体手法を使用して生成した。1mg/kgのsiRNAと等しい単回用量を、マウス(n=3)に尾静脈注射した。注射の24時間後に血液採取を実施し、FVIIレベルを比色測定法により決定した。データ(図1)は、1mg/kgのsiRNA用量と等しい単回静脈注射の24時間後、血液中のFVIIレベルが、対照と比較して>95%低減したことを示す。
LNP構造は、イオン化可能な陽イオン性脂質形態がLNP内部に逆ミセル構造を形成することを示す限界サイズを示す。陽イオン性脂質が高電子密度LNPコアに寄与することは、そのようなLNP系の分子構造はどのようなものであり得るのかという疑問を呈示する。陽イオン性脂質は、対イオンと結合しており、逆ミセル等の逆構造を取ると提唱することは論理的であり、これは、これら脂質が、陰イオン性脂質を有する組成で六方晶HII相等の逆構造を取りやすい傾向があることと一致する。次いで、これは、純粋な陽イオン性脂質で構成されるLNP系は、本質的に、2〜3nmの直径を有する逆ミセル内部を取り囲む2つの二分子膜の厚さである10nmの範囲の直径を有する限界サイズを示すはずであるということを示唆するだろう。HII相中のホスファチジルエタノールアミンの場合に見出される水性チャネルの直径は、2.6nmである。マイクロ流体配合プロセスは、LNP系の限界サイズ系の生成を促進する迅速混合動力学を提供する。
(a)第1の溶媒を含む第1の溶液を受容するための第1のウェル、
(b)第1のウェルと流体連通する第1のチャネル、
(c)第2の溶媒を含む第2の溶液を受容するための第2のウェル、
(d)第2のウェルと流体連通する第2のチャネル、
(e)それぞれ、第1および第2のウェルから第1および2のチャネルへと流れる第1および第2のストリームを受容するための第3のチャネルであり、導入される第1および第2のストリームをチャネルに流すように構成された第1の領域、ならびに第1および第2のストリームの内容物を混合して、粒子を含む第3のストリームを提供するように構成された第2の領域を有する第3のチャネル、および
(f)粒子を含む第3のストリームを受容するための第3のウェルを含む。
(a)第1の溶媒を含む第1の溶液を受容するための第1のウェル、
(b)第1のウェルと流体連通する第1のチャネル、および
(c)第2の溶媒を含む第2の溶液を受容するための第2のウェルを含み、第2のウェルは、第1のウェルから第1のチャネルに流れる第1のストリームを更に受容し、第1のストリームおよび第2の溶液の内容物を第2のウェルで混合して、粒子を含む第3の溶液を提供するように構成されている。
(a)溶媒のみであるか溶媒と幾つかの溶液を含む第1の溶液、および第2の溶媒中の粒子成分を含む第2の溶液を受容するための単一の入口チャネル、および
(b)第1および第2のストリームの内容物を混合して、粒子を含む第3のストリームを提供するように構成された第2の領域を含む。
材料
1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DSPC)およびコレステロールは、Avanti Polar Lipids(アラバスター、アラバマ州)から入手した。4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−エタンスルホン酸(HEPES)、コレステロール、および界面活性剤は、Sigma(セントルイス、ミズーリ州)から入手した。(フェアローン、ニュージャージー州)。RNase Aは、Applied Biosystems/Ambion(オースティン、テキサス州)から入手した。第VII因子(FVII)標的および低GC陰性対照siRNAは、Invitrogen(カールズバッド、カリフォルニア州)から購入した。第VII因子siRNA:5’−GGAUCAUCUCAAGUCUUACTT−3’[配列番号1](FVIIセンス)、および5’−GUAAGACUUGAGAUGAUCCTT−3’[配列番号2](FVIIアンチセンス)。1,17−ビス(2−オクチルシクロプロピル)ヘプタデカン−9−イル−4−(ジメチルアミノ)ブタノエートは、AlCana Technologies Inc.(バンクーバー、ブリティッシュコロンビア州)により合成された。
LNP系の調製
この例には、事前形成小胞法を使用したsiRNA−LNP系の調製が記載されている。
LNP系の調製
この例では、マイクロ流体スタガードヘリンボーンミキサを使用して、本発明のsiRNA−LNP系を調製するために使用される代表的な形質移入試薬組成物が記載されている。
オリゴヌクレオチド(siRNA)溶液を、pH4.0の25mM酢酸緩衝液で調製した。所望のオリゴヌクレオチド対脂質比および配合物濃度に応じて、0.3mg/ml〜1.9mg/ml総脂質の目的濃度の溶液を調製した。1,17−ビス(2−オクチルシクロプロピル)ヘプタデカン−9−イル4(ジメチルアミノ)ブタノエート、DSPC、コレステロール、および界面活性剤を、適切なモル比で含有する脂質溶液を、エタノールで調製し、25mM酢酸緩衝液で希釈して、90%(容積/容積)のエタノール濃度を達成した。図5は、この例で使用したマイクロ流体装置の模式図である。デバイスは、2つの入口、上記で調製した溶液の各々に1つずつ、および1つの出口を有する。マイクロ流体デバイスは、ソフトリソグラフィー、微細加工された原型をエラストマーにレプリカ成形することにより生産した。デバイスは、2つの入口、上記で調製した溶液の各々に1つずつ、および1つの出口を有する。マイクロ流体デバイスは、ソフトリソグラフィー、微細加工された原型をエラストマーにレプリカ成形することにより生産した。デバイスは、高さがおよそ40μmで厚さが75μmの特徴によりチャネルの天井に形成されたヘリンボーン構造を有する、幅が300μmで高さがおよそ130μmの混合チャネルを特徴とする。デバイスは、デバイスの入口および出口ポートと一致するように穿孔された3つの1.5mm穴を有する40×36×2mmのスライドガラスに、酸素プラズマ処理を使用して密封した。接合したデバイスは、デバイスを機器に密封するためのO−リングを有する上部プレート、および試薬を注射器に負荷するためのルアーフィッティングを有する裏側プレートを有する特注機器に設置した。デバイスおよび試薬を負荷すると、機器は、流体を規定の速度でデバイスから分配するシリンジポンプとして作動する。各ストリームの流量は、0.1ml/分から20ml/分まで変化させた。機器は、2つの溶液をマイクロ流体デバイスに導入し、そこで、2つの溶液はY型接合部で接触する。この時点で、拡散による層流下でわずかな混合が生じるが、2つの溶液は、ヘリンボーン構造および屈曲したチャネルを通過する共に混合される。
粒径は、Nicomp370型サブミクロン粒径測定器(Particle Sizing Systems、サンタバーバラ、カリフォルニア州)を使用して、動的光散乱により決定した。数加重および強度加重分布データを使用した。脂質濃度は、Wako Chemicals USA(リッチモンド、バージニア州)のコレステロールE酵素アッセイを使用して、総コレステロールを測定することにより確認した。遊離siRNAの除去は、VivaPureDMiniHカラム(Sartorius Stedim Biotech GmbH、ゲッティンゲン、ドイツ)を用いて実施した。その後、75%エタノールで溶離物を溶解し、260nmの吸光度を測定することによりsiRNAを定量化した。封入効率は、遊離オリゴヌクレオチド内容物の除去前後のオリゴヌクレオチド比から決定し、脂質含有量に対して正規化した。
6〜8週齢の雌C57Bl/6マウスを、Charles River Laboratoriesから入手した。第VII因子siRNAを含有するsiRNA−LNPを、0.2μmフィルターでろ過し、使用前に無菌リン酸緩衝生理食塩水で必要な濃度に希釈した。配合物を、10ml/kgの容積で側尾静脈から静脈内投与した。24時間後、動物をケタミン/キシラジンで麻酔にかけ、心穿刺により血液を収集した。試料を、血清に加工し(マイクロティナ血清分離チューブ;Becton Dickinson、ニュージャージー州)、直ちに試験したか、または後の血清因子VIIレベル分析のために−70℃で保管した。手順は全て、該当する場合、地域、州、および連邦規則に従って実施し、組織内動物実験委員会(IACUC)により承認されていた。
形質移入試薬組成物を使用した代表的な脂質ナノ粒子の調製および特徴
この例では、本発明の代表的な形質移入試薬組成物を使用して、本発明の代表的なsiRNA−LNPを調製したことが記載される。
以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
[1]
形質移入試薬組成物であって、
(a)1つ以上の陽イオン性脂質またはその薬学的に許容される塩、
(b)1つ以上の中性脂質、
(c)1つ以上のステロール、および
(d)1つ以上の界面活性剤
を含む組成物。
[2]
前記陽イオン性脂質が、アミノ脂質またはその薬学的に許容される塩である、[1]に記載の組成物。
[3]
前記陽イオン性脂質が、DODAC、DOTMA、DDAB、DOTAP、DOTAP・Cl、DC−コレステロール、DOSPA、DOGS、DOPE、DODAP、DODMA、DODMA、DMRIE、およびそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される、[1]または[2]に記載の組成物。
[4]
前記陽イオン性脂質が、下記式またはその薬学的に許容される塩を有する
R 1 およびR 2 は、同じまたは異なっているのいずれかであり、独立して、任意に置換されていてもよいC 10 〜C 24 アルキル、任意に置換されていてもよいC 10 〜C 24 アルケニル、任意に置換されていてもよいC 10 〜C 24 アルキニル、または任意に置換されていてもよいC 10 〜C 24 アシルであり、
R 3 およびR 4 は、同じまたは異なっているのいずれかであり、独立して、任意に置換されていてもよいC 1 〜C 6 アルキル、任意に置換されていてもよいC 2 〜C 6 アルケニル、または任意に置換されていてもよいC 2 〜C 6 アルキニルであり、またはR 3 およびR 4 は、一緒になって、4〜6つの炭素原子ならびに窒素および酸素から選択される1つまたは2つのヘテロ原子の、任意に置換されていてもよい複素環を形成してもよく、
R 5 は、存在しいていないまたは存在しているのいずれかであり、存在する場合は、水素またはC 1 〜C 6 アルキルであり、
m、n、およびpは、同じまたは異なっているのいずれかであり、独立して0または1のいずれかであり、ただし、m、n、およびpは、同時に0ではなく、
qは、0、1、2、3、または4であり、
YおよびZは、同じまたは異なっているのいずれかであり、独立して、O、S、またはNHである)、[1]〜[3]のいずれか一に記載の組成物。
[5]
前記陽イオン性脂質が、下記式またはその薬学的に許容される塩を有する
R 1 およびR 2 は、各々独立して、H、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、およびヘテロシクリルであり、
ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、およびヘテロシクリルの各々は、H;ハロ;ヒドロキシ;シアノ;オキソ;ハロ、ヒドロキシ、またはアルコキシにより任意に置換されていてもよいC 1 〜C 6 アルキルにより任意に置換されていてもよく、
または、R 1 およびR 2 は、それらが両方とも結合するN原子と一緒になり、3〜8員環へテロアリールまたはヘテロシクリルを形成し、
ここで、へテロアリールおよびヘテロシクリルの各々は、H;ハロ;ヒドロキシ;シアノ;オキソ;ニトロ;ハロ、ヒドロキシ、またはアルコキシにより任意に置換されていてもよいC 1 〜C 6 アルキルにより任意に置換されていてもよく、
R 3 は、非存在、H、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、またはヘテロシクリルであり、
R 4 およびR 5 は、各々独立して、H、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、またはヘテロシクリルであり、
ここで、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、へテロアリール、およびヘテロシクリルの各々は、H;ハロ;ヒドロキシ;シアノ;オキソ;ハロ、ヒドロキシ、またはアルコキシにより任意に置換されていてもよいC 1 〜C 6 アルキルにより任意に置換されていてもよく、
Xは、O、S、−NR 4 −、−S−S−、−OC(=O)−、−C(=O)O−、−OC(=O)O−、−NR 4 C(=O)−、−C(=O)NR 4 −、−NR 4 C(=O)O−、−OC(=O)NR 4 −、−NR 4 C(=O)NR 4 −、−NR 4 C(=S)O−、−OC(=S)NR 4 −、−NR 4 C(=S)NR 4 −、または−CR 4 R 5 −であり、
YおよびZは、独立して、式L 1 −(CR 6 R 7 )α−[L 2 −(CR 6 R 7 ) β ]γ−L 3
−R 8 を有するC 10 〜C 30 基であり、式中、
L 1 は、結合、−(CR 6 R 7 )−、−O−、−CO−、−NR 8 −、−S−、またはそれらの組み合わせであり、
各R 6 およびR 7 は、独立して、H;ハロ;ヒドロキシル;シアノ;ハロ、ヒドロキシル、またはアルコキシにより任意に置換されていてもよいC 1 〜C 6 アルキルであり、
L 2 は、結合、−(CR 6 R 7 )−、−O−、−CO−、−NR 8 −、−S−、
L 3 は、結合、−(CR 6 R 7 )−、−O−、−CO−、−NR 8 −、−S−、
R 8 は、独立して、H;ハロ;ヒドロキシ;シアノ;アルコキシ;アリール;へテロアリール;またはハロ、ヒドロキシ、もしくはヘテロシクリルにより任意に置換されていてもよいC 1 〜C 6 アルキルであるか、またはR 8 は、下記式を有し、
αは、0〜6であり、
各βは、独立して、0〜6であり、
γは、0〜6である)、[1]〜[3]のいずれか一に記載の組成物。
[6]
前記陽イオン性脂質が、1,17−ビス(2−オクチルシクロプロピル)ヘプタデカン−9−イル−4−(ジメチルアミノ)ブタノエートまたはその薬学的に許容される塩である、[1]〜[5]のいずれか一に記載の組成物。
[7]
前記中性脂質が、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、ケファリン、およびセレブロシドからなる群から選択される、[1]〜[5]のいずれか一に記載の組成物。
[8]
前記中性脂質が、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DSPC)である、[1]〜[5]のいずれか一に記載の組成物。
[9]
前記ステロールがコレステロールである、[1]〜[5]のいずれか一に記載の組成物。
[10]
前記界面活性剤が、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ジブロックポリオキシエチレンエーテルコポリマー、トリブロックポリオキシエチレンアルキルエーテルコポリマー、および両親媒性分枝ポリマーからなる群から選択される、[1]〜[5]のいずれか一に記載の組成物。
[11]
前記界面活性剤が、ポリオキシエチレン(20)オレイルエーテル、ポリオキシエチレン(23)ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン(40)ステアレート、ポリ(プロピレングリコール) 11 −ブロック−ポリ(エチレングリコール) 16 −ブロック−ポリ(プロピレングリコール) 11 、ポリ(プロピレングリコール) 12 −ブロック−ポリ(エチレングリコール) 28 −ブロック−ポリ(プロピレングリコール) 12 からなる群から選択される、[1]〜[5]のいずれか一に記載の組成物。
[12]
前記界面活性剤が、ポリオキシエチレン(20)オレイルエーテルまたはポリオキシエチレン(23)ラウリルエーテルである、[1]〜[5]のいずれか一に記載の組成物。
[13]
前記界面活性剤が、ポリオキシエチレン(40)ステアレートである、[1]〜[5]のいずれか一に記載の組成物。
[14]
(a)前記陽イオン性脂質が、アミノ脂質またはその薬学的に許容される塩であり、
(b)前記中性脂質が、リン脂質であり、
(c)前記ステロールが、コレステロールであり、かつ
(d)前記界面活性剤が、ポリオキシエチレン(20)オレイルエーテル、ポリオキシエチレン(23)ラウリルエーテル、またはポリオキシエチレン(40)ステアレートから選択される、[1]に記載の組成物。
[15]
(a)前記陽イオン性脂質が、1,17−ビス(2−オクチルシクロプロピル)ヘプタデカン−9−イル−4−(ジメチルアミノ)ブタノエートまたはその薬学的に許容される塩であり、
(b)前記中性脂質が、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DSPC)であり、
(c)前記ステロールが、コレステロールであり、かつ
(d)前記界面活性剤が、ポリオキシエチレン(20)オレイルエーテル、ポリオキシエチレン(23)ラウリルエーテル、またはポリオキシエチレン(40)ステアレートから選択される、[1]に記載の組成物。
[16]
約20から約95モルパーセントまでの陽イオン性脂質を含む、[1]〜[5]、[15]、または[16]のいずれか一に記載の組成物。
[17]
約0.1から約20モルパーセントまでの界面活性剤を含む、[1]〜[5]、[15]、または[16]のいずれか一に記載の組成物。
[18]
[1]〜[17]のいずれか一に記載の組成物、および陰イオン性巨大分子を含む脂質ナノ粒子。
[19]
前記ナノ粒子が中実コアを有する、[18]に記載の粒子。
[20]
前記陰イオン性巨大分子が、核酸、陰イオン性タンパク質、および陰イオン性ペプチドからなる群から選択される、[18]に記載の粒子。
[21]
前記陰イオン性巨大分子が核酸である、[18]に記載の粒子。
[22]
[1]〜[17]のいずれか一に記載の組成物、および核酸を含む脂質ナノ粒子。
[23]
前記ナノ粒子が中実コアを有する、[22]に記載の粒子。
[24]
前記核酸が、DNA、RNA、ロックド核酸、核酸類似体、またはDNAもしくはRNAを発現可能なプラスミドである、[22]または[23]に記載の粒子。
[25]
前記核酸が、ssDNAまたはdsDNAである、[22]または[23]に記載の粒子。
[26]
前記核酸が、ssRNA、siRNA、マイクロRNA、またはmRNAである、[22]または[23]に記載の粒子。
[27]
前記核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、[22]または[23]に記載の粒子。
[28]
前記核酸が、ハイブリダイゼーションプローブである、[22]または[23]に記載の粒子。
[29]
前記ハイブリダイゼーションプローブが、分子ビーコンである、[28]に記載の粒子。
[30]
対象に核酸を投与する方法であって、[22]〜[27]のいずれか一に記載の脂質ナノ粒子を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
[31]
対象中でポリペプチドが過剰発現されることを特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、[22]〜[27]のいずれか一に記載の脂質ナノ粒子を前記対象に投与することを含み、前記核酸が、前記ポリペプチドの発現をサイレンシングまたは減少させることが可能である方法。
[32]
対象中でポリペプチドが過少発現されることを特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、[22]〜[27]のいずれか一に記載の脂質ナノ粒子を前記対象に投与することを含み、前記核酸が、前記ポリペプチドを発現または前記ポリペプチドの発現を増加させることが可能である方法。
[33]
核酸を細胞に導入する方法であって、細胞を、[22]〜[27]のいずれか一に記載の脂質ナノ粒子と接触させることを含む方法。
[34]
標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節する方法であって、細胞を、[22]〜[27]のいずれか一に記載の脂質ナノ粒子と接触させることを含み、前記核酸が、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節することが可能である方法。
[35]
核酸を含有する脂質ナノ粒子を作製する方法であって、
(a)第1の溶媒中の核酸を含む第1のストリームをデバイスに導入することであって、前記デバイスは、導入される1つ以上のストリームを前記デバイスに流すように構成された第1の領域、および前記1つ以上のストリームの内容物をミキサで混合するための第2の領域を有すること、
(b)第2の溶媒中の[1]〜[17]のいずれか一に記載の組成物を含む第2のストリームを前記デバイスに導入して、第1および第2のストリームを提供することであって、前記形質移入試薬組成物は陽イオン性脂質を含み、前記第1および第2の溶媒が同じではないこと、
(c)前記1つ以上の第1のストリームおよび前記1つ以上の第2のストリームを、前記デバイスの前記第1の領域から前記デバイスの前記第2の領域に流すことであって、前記第1のストリームと前記第2のストリームとの容積比が、1.0を超えること、および
(d)前記1つ以上の第1のストリームおよび前記1つ以上の第2のストリームを、前記デバイスの前記第2の領域で、約100μsから約10msまでの期間混合することであって、封入された核酸を有する脂質ナノ粒子を含む第3のストリームを提供することを含む方法。
[36]
前記1つ以上の第1のストリームおよび前記1つ以上の第2のストリームが、約1mL/分から約40mL/分まで流量で流される、[35]に記載の方法。
[37]
前記形質移入試薬組成物の濃度が、約10mMから約50mMまでである、[35]に記載の方法。
[38]
前記封入された核酸を有する脂質ナノ粒子が、約15nmから約300nmまでの直径を有する、[35]に記載の方法。
[39]
前記核酸が、前記脂質ナノ粒子に、約80から約100%までの効率で封入される、[35]に記載の方法。
[40]
前記ミキサが、約1000μm未満のサイズの特徴を有する、[35]に記載の方法。
[41]
前記ミキサが、マイクロ流体ミキサである、[35]に記載の方法。
[42]
[1]〜[17]のいずれか一に記載の形質移入試薬組成物を含む脂質ナノ粒子を調製するためのキット。
[43]
陰イオン性巨大分子を更に含む、[42]に記載のキット。
[44]
前記陰イオン性巨大分子が核酸である、[42]に記載のキット。
[45]
マイクロ流体ミキサを更に含む、[42]〜[44]のいずれか一に記載のキット。
[46]
[42]〜[45]のいずれか一に記載のキットを使用して、[18]〜[29]のいずれか一に記載の脂質ナノ粒子を調製する方法。
Claims (1)
- (i)1,17-ビス(2−オクチルシクロプロピル)ヘプタデカン−9−イル−4−(ジメチルアミノ)ブタノエート、またはその薬学的に許容される塩、
(ii)1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン(DSPC)、
(iii)コレステロール、および
(iv)ポリオキシエチレン(20)オレイルエーテル、ポリオキシエチレン(23)ラウリルエーテル、またはポリオキシエチレン(40)ステアレートからなる群より選択される1つ以上の界面活性剤
を含む形質移入試薬組成物;および
(a)第1の溶媒を含む第1の溶液を受容するための第1のウェル、
(b)第1のウェルと流体連通する第1のチャネル、
(c)第2の溶媒を含む第2の溶液を受容するための第2のウェル、
(d)第2のウェルと流体連通する第2のチャネル、
(e)それぞれ、第1および第2のウェルから第1および2のチャネルへと流れる第1および第2のストリームを受容するための第3のチャネルであり、導入される第1および第2のストリームをチャネルに流すように構成された第1の領域、ならびに第1および第2のストリームの内容物を混合して、粒子を含む第3のストリームを提供するように構成された第2の領域を有する第3のチャネル、および;
(f)粒子を含む第3のストリームを受容するための第3のウェル、
を含む脂質粒子を作製するためのデバイスであって、
ここで、前記第1のチャネルと前記第2のチャネルは異なったチャネルインピーダンスを有するデバイス、
を含む脂質ナノ粒子を調製するためのキット。
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EP3262424A4 (en) * | 2015-02-24 | 2019-03-13 | The University of British Columbia | MICROFLUIDIC SYSTEM WITH CONTINUOUS FLOW |
JP2018525209A (ja) * | 2015-04-28 | 2018-09-06 | ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア | 使い捨てマイクロ流体カートリッジ |
USD772427S1 (en) | 2015-04-28 | 2016-11-22 | University Of British Columbia | Microfluidic cartridge |
USD771833S1 (en) | 2015-04-28 | 2016-11-15 | University Of British Columbia | Microfluidic cartridge |
USD771834S1 (en) | 2015-04-28 | 2016-11-15 | University Of British Columbia | Microfluidic cartridge |
EP3736261B1 (en) | 2015-09-17 | 2023-10-11 | ModernaTX, Inc. | Compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents |
AU2016342045A1 (en) | 2015-10-22 | 2018-06-07 | Modernatx, Inc. | Human cytomegalovirus vaccine |
EP3364950A4 (en) | 2015-10-22 | 2019-10-23 | ModernaTX, Inc. | VACCINES AGAINST TROPICAL DISEASES |
SI3718565T1 (sl) | 2015-10-22 | 2022-08-31 | Modernatx, Inc. | Cepiva za respiratorni virus |
WO2017099823A1 (en) | 2015-12-10 | 2017-06-15 | Modernatx, Inc. | Compositions and methods for delivery of therapeutic agents |
HUE057877T2 (hu) | 2015-12-22 | 2022-06-28 | Modernatx Inc | Vegyületek és készítmények terápiás szerek intracelluláris bejuttatására |
CA3009691C (en) | 2016-01-06 | 2021-12-07 | The University Of British Columbia | Bifurcating mixers and methods of their use and manufacture |
CN105622473B (zh) * | 2016-02-06 | 2017-07-25 | 吴国球 | 一种阳离子氨基脂质及其合成方法和用途 |
CA3024507A1 (en) | 2016-05-18 | 2017-11-23 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding .alpha.-galactosidase a for the treatment of fabry disease |
JP2019525901A (ja) | 2016-06-14 | 2019-09-12 | モデルナティエックス インコーポレイテッドModernaTX,Inc. | 脂質ナノ粒子の安定化製剤 |
CA3027643C (en) | 2016-07-06 | 2021-01-19 | Precision Nanosystems Inc | Smart microfluidic mixing instrument and cartridges |
EP3519578B1 (en) * | 2016-10-03 | 2021-12-22 | Precision Nanosystems Inc | Compositions for transfecting resistant cell types |
JP6980780B2 (ja) | 2016-10-21 | 2021-12-15 | モデルナティーエックス, インコーポレイテッド | ヒトサイトメガロウイルスワクチン |
WO2018089540A1 (en) | 2016-11-08 | 2018-05-17 | Modernatx, Inc. | Stabilized formulations of lipid nanoparticles |
EP3538146A4 (en) | 2016-11-11 | 2020-07-15 | ModernaTX, Inc. | INFLUENZA VACCINE |
US11969506B2 (en) | 2017-03-15 | 2024-04-30 | Modernatx, Inc. | Lipid nanoparticle formulation |
ES2940259T3 (es) | 2017-03-15 | 2023-05-04 | Modernatx Inc | Compuesto y composiciones para la administración intracelular de agentes terapéuticos |
ES2911186T3 (es) | 2017-03-15 | 2022-05-18 | Modernatx Inc | Formas cristalinas de aminolípidos |
EP3595713A4 (en) | 2017-03-15 | 2021-01-13 | ModernaTX, Inc. | RESPIRATORY SYNCYTIAL VIRUS VACCINE |
EP3607074A4 (en) | 2017-04-05 | 2021-07-07 | Modernatx, Inc. | REDUCTION OR ELIMINATION OF IMMUNE RESPONSES TO NON-INTRAVENOUS THERAPEUTIC PROTEINS, FOR EXAMPLE SUBCUTANEOUSLY |
US11786607B2 (en) | 2017-06-15 | 2023-10-17 | Modernatx, Inc. | RNA formulations |
CN107488137B (zh) * | 2017-08-15 | 2019-03-29 | 浙江大学 | 一种小分子量的季铵盐及其制备方法和应用 |
WO2019046809A1 (en) * | 2017-08-31 | 2019-03-07 | Modernatx, Inc. | METHODS OF MANUFACTURING LIPID NANOPARTICLES |
CA3077413A1 (en) * | 2017-09-29 | 2019-04-04 | Intellia Therapeutics, Inc. | Formulations |
WO2019148101A1 (en) | 2018-01-29 | 2019-08-01 | Modernatx, Inc. | Rsv rna vaccines |
JP7379776B2 (ja) * | 2018-04-29 | 2023-11-15 | プレシジョン ナノシステムズ ユーエルシー | 耐性細胞型をトランスフェクトするための組成物 |
CA3113353A1 (en) * | 2018-09-19 | 2020-03-26 | Modernatx, Inc. | High-purity peg lipids and uses thereof |
PL3864163T3 (pl) | 2018-10-09 | 2024-05-20 | The University Of British Columbia | Kompozycje i układy zawierające pęcherzyki zdolne do transfekcji wolne od rozpuszczalników organicznych i detergentów oraz związane z nimi sposoby postępowania |
JP7447389B2 (ja) * | 2019-04-15 | 2024-03-12 | プレシジョン ナノシステムズ ユーエルシー | T細胞遺伝子発現の非ウイルス性改変 |
JP2022548304A (ja) | 2019-09-19 | 2022-11-17 | モデルナティエックス インコーポレイテッド | 治療薬の細胞内送達のための分岐状尾部脂質化合物及び組成物 |
CN115778904A (zh) * | 2019-10-29 | 2023-03-14 | 珠海丽凡达生物技术有限公司 | 一种用于体外转染和体内递送mRNA的制剂 |
US20230285297A1 (en) | 2020-01-31 | 2023-09-14 | Modernatx, Inc. | Methods of preparing lipid nanoparticles |
CN113521268A (zh) | 2020-04-22 | 2021-10-22 | 生物技术Rna制药有限公司 | 冠状病毒疫苗 |
GB202011367D0 (en) * | 2020-07-22 | 2020-09-02 | Micropore Tech Limited | Method of preparing liposomes |
CA3190790A1 (en) | 2020-08-06 | 2022-02-10 | Modernatx, Inc. | Methods of preparing lipid nanoparticles |
BR112023001955A2 (pt) | 2020-08-06 | 2023-04-11 | Modernatx Inc | Composições para a distribuição de moléculas de carga útil ao epitélio das vias aéreas |
US11406703B2 (en) | 2020-08-25 | 2022-08-09 | Modernatx, Inc. | Human cytomegalovirus vaccine |
CA3199784A1 (en) | 2020-11-13 | 2022-05-19 | Modernatx, Inc. | Polynucleotides encoding cystic fibrosis transmembrane conductance regulator for the treatment of cystic fibrosis |
DE102020214601A1 (de) | 2020-11-19 | 2022-05-19 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung eingetragener Verein | Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung einer Flüssigkeit enthaltend Liposomen und hergestellte Flüssigkeit |
US11524023B2 (en) | 2021-02-19 | 2022-12-13 | Modernatx, Inc. | Lipid nanoparticle compositions and methods of formulating the same |
CN118019527A (zh) | 2021-07-26 | 2024-05-10 | 摩登纳特斯有限公司 | 用于制备脂质纳米颗粒组合物的方法 |
EP4376815A1 (en) | 2021-07-26 | 2024-06-05 | ModernaTX, Inc. | Processes for preparing lipid nanoparticle compositions for the delivery of payload molecules to airway epithelium |
KR20230017730A (ko) | 2021-07-27 | 2023-02-06 | 에스케이바이오사이언스(주) | 단백질 발현을 위한 mRNA와 이를 위한 주형 |
TW202332467A (zh) | 2021-10-29 | 2023-08-16 | 美商現代公司 | 脂質胺 |
WO2023086465A1 (en) | 2021-11-12 | 2023-05-19 | Modernatx, Inc. | Compositions for the delivery of payload molecules to airway epithelium |
TW202345863A (zh) | 2022-02-09 | 2023-12-01 | 美商現代公司 | 黏膜投與方法及調配物 |
WO2023190170A1 (ja) * | 2022-03-28 | 2023-10-05 | 日油株式会社 | 核酸内封脂質ナノ粒子の製造方法及びこれを含む医薬品組成物の製造方法、並びに、核酸を細胞内又は標的細胞内に導入する方法 |
US11878055B1 (en) | 2022-06-26 | 2024-01-23 | BioNTech SE | Coronavirus vaccine |
WO2024028785A1 (en) * | 2022-08-02 | 2024-02-08 | Università Degli Studi Di Roma - La Sapienza | Multicomponent lipid nanoparticles with high cellular fusogenicity for the delivery of nucleic acids and related preparation process |
Family Cites Families (56)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7422902B1 (en) | 1995-06-07 | 2008-09-09 | The University Of British Columbia | Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer |
US5981501A (en) | 1995-06-07 | 1999-11-09 | Inex Pharmaceuticals Corp. | Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers |
US6267858B1 (en) | 1996-06-28 | 2001-07-31 | Caliper Technologies Corp. | High throughput screening assay systems in microscale fluidic devices |
US5921678A (en) | 1997-02-05 | 1999-07-13 | California Institute Of Technology | Microfluidic sub-millisecond mixers |
JP4656675B2 (ja) | 1997-05-14 | 2011-03-23 | ユニバーシティー オブ ブリティッシュ コロンビア | 脂質小胞への荷電した治療剤の高率封入 |
US6835395B1 (en) | 1997-05-14 | 2004-12-28 | The University Of British Columbia | Composition containing small multilamellar oligodeoxynucleotide-containing lipid vesicles |
JP2002529240A (ja) * | 1998-11-13 | 2002-09-10 | オプタイム セラピュウティクス, インコーポレイテッド | リポソーム生成のための方法および装置 |
EP1203614A1 (de) | 2000-11-03 | 2002-05-08 | Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH | Verfahren und Vorrichtung zur Herstellung von Lipidvesikeln |
US8137699B2 (en) | 2002-03-29 | 2012-03-20 | Trustees Of Princeton University | Process and apparatuses for preparing nanoparticle compositions with amphiphilic copolymers and their use |
WO2002087541A1 (en) | 2001-04-30 | 2002-11-07 | Protiva Biotherapeutics Inc. | Lipid-based formulations for gene transfer |
AU2002319668A1 (en) | 2001-07-27 | 2003-02-17 | President And Fellows Of Harvard College | Laminar mixing apparatus and methods |
US7252928B1 (en) | 2002-03-12 | 2007-08-07 | Caliper Life Sciences, Inc. | Methods for prevention of surface adsorption of biological materials to capillary walls in microchannels |
US7901939B2 (en) | 2002-05-09 | 2011-03-08 | University Of Chicago | Method for performing crystallization and reactions in pressure-driven fluid plugs |
EP1509203B1 (en) | 2002-05-15 | 2016-04-13 | California Pacific Medical Center | Delivery of nucleic acid-like compounds |
DE60334618D1 (de) | 2002-06-28 | 2010-12-02 | Protiva Biotherapeutics Inc | Verfahren und vorrichtung zur herstellung von liposomen |
JP2006507921A (ja) | 2002-06-28 | 2006-03-09 | プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ | 流体分散のための方法および装置 |
US7214348B2 (en) | 2002-07-26 | 2007-05-08 | Applera Corporation | Microfluidic size-exclusion devices, systems, and methods |
EP1613285A2 (en) | 2003-03-31 | 2006-01-11 | Alza Corporation | Lipid particles having asymmetric lipid coating and method of preparing same |
US7160025B2 (en) | 2003-06-11 | 2007-01-09 | Agency For Science, Technology And Research | Micromixer apparatus and methods of using same |
CA2536360C (en) | 2003-08-28 | 2013-08-06 | Celula, Inc. | Methods and apparatus for sorting cells using an optical switch in a microfluidic channel network |
JP4842821B2 (ja) | 2003-09-15 | 2011-12-21 | プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド | ポリエチレングリコール修飾脂質化合物およびその使用 |
EP1677765A1 (en) | 2003-10-24 | 2006-07-12 | Alza Corporation | Preparation of lipid particles |
EP1537858A1 (en) | 2003-12-04 | 2005-06-08 | Vectron Therapeutics AG | Drug delivery vehicles and uses thereof |
US7507380B2 (en) | 2004-03-19 | 2009-03-24 | State Of Oregon Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of Oregon State University | Microchemical nanofactories |
US7811602B2 (en) | 2004-05-17 | 2010-10-12 | Tekmira Pharmaceuticals Corporation | Liposomal formulations comprising dihydrosphingomyelin and methods of use thereof |
JP4764426B2 (ja) | 2004-06-07 | 2011-09-07 | プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド | カチオン性脂質および使用方法 |
US7871632B2 (en) | 2004-07-12 | 2011-01-18 | Adventrx Pharmaceuticals, Inc. | Compositions for delivering highly water soluble drugs |
EP1793804A2 (en) | 2004-09-09 | 2007-06-13 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Use of liposomal glucocorticoids for treating inflammatory states |
WO2006039568A1 (en) | 2004-10-01 | 2006-04-13 | Velocys Inc. | Multiphase mixing process using microchannel process technology |
EP1679115A1 (en) | 2005-01-07 | 2006-07-12 | Corning Incorporated | High performance microreactor |
WO2006102675A1 (en) | 2005-03-23 | 2006-09-28 | Velocys, Inc. | Surface features in microprocess technology |
US20060219307A1 (en) | 2005-03-31 | 2006-10-05 | National Taiwan University | Micromixer apparatus and method therefor |
CA2616877C (en) | 2005-07-27 | 2014-01-28 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Systems and methods for manufacturing liposomes |
CA2623531C (en) | 2005-10-07 | 2013-12-10 | Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P Angeletti Spa | Matrix metalloproteinase 11 vaccine |
US20070087045A1 (en) * | 2005-10-14 | 2007-04-19 | Industrial Technology Research Institute | Lipid carrier and method of preparing the same |
JP2007252979A (ja) | 2006-03-20 | 2007-10-04 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | マイクロリアクタによる化合物の製造方法、そのマイクロリアクタ、及びマイクロリアクタ用の分流器 |
US7794136B2 (en) | 2006-05-09 | 2010-09-14 | National Tsing Hua University | Twin-vortex micromixer for enforced mass exchange |
WO2007150030A2 (en) | 2006-06-23 | 2007-12-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Microfluidic synthesis of organic nanoparticles |
WO2008053988A1 (fr) | 2006-11-02 | 2008-05-08 | National University Corporation Nagoya University | Procédé de production de microcapsules |
CN101209243B (zh) | 2006-12-29 | 2010-12-08 | 石药集团中奇制药技术(石家庄)有限公司 | 一种脂质体药物及其制备方法 |
ES2660906T3 (es) | 2007-05-31 | 2018-03-26 | Anterios, Inc. | Nanopartículas de ácido nucleico y usos de las mismas |
EP2167233B1 (en) | 2007-06-26 | 2013-01-23 | Micronit Microfluidics B.V. | Device and method for fluidic coupling of fluidic conduits to a microfluidic chip, and uncoupling thereof |
WO2009086558A1 (en) | 2008-01-02 | 2009-07-09 | Tekmira Pharmaceuticals Corporation | Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids |
US8414182B2 (en) | 2008-03-28 | 2013-04-09 | State Of Oregon Acting By And Through The State Board Of Higher Education On Behalf Of Oregon State University | Micromixers for nanomaterial production |
CA2721333C (en) | 2008-04-15 | 2020-12-01 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Novel lipid formulations for nucleic acid delivery |
US8187554B2 (en) | 2008-04-23 | 2012-05-29 | Microfluidics International Corporation | Apparatus and methods for nanoparticle generation and process intensification of transport and reaction systems |
US20110182994A1 (en) | 2008-07-25 | 2011-07-28 | S.K. Pharmaceuticals, Inc. | Methods and systems for production of nanoparticles |
KR102042721B1 (ko) | 2008-11-10 | 2019-11-11 | 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 치료제 운반용 신규 지질 및 조성물 |
EP2391343B1 (en) * | 2009-01-29 | 2017-03-01 | Arbutus Biopharma Corporation | Improved lipid formulation for the delivery of nucleic acids |
KR20230098713A (ko) * | 2009-06-10 | 2023-07-04 | 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 향상된 지질 조성물 |
EP2810643A3 (en) * | 2009-08-14 | 2015-03-11 | Alnylam Pharmaceuticals Inc. | Lipid formulated compositions and mehods for inhibiting expression of a gene from the ebola virus |
EP2480208A1 (en) | 2009-09-23 | 2012-08-01 | Indu Javeri | Methods for the preparation of liposomes |
JP5823405B2 (ja) * | 2009-11-04 | 2015-11-25 | ザ ユニバーシティ オブ ブリティッシュ コロンビア | 核酸含有脂質粒子および関連方法 |
US9006417B2 (en) | 2010-06-30 | 2015-04-14 | Protiva Biotherapeutics, Inc. | Non-liposomal systems for nucleic acid delivery |
US20130323269A1 (en) * | 2010-07-30 | 2013-12-05 | Muthiah Manoharan | Methods and compositions for delivery of active agents |
US8361415B2 (en) | 2010-09-13 | 2013-01-29 | The Regents Of The University Of California | Inertial particle focusing system |
-
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US11938454B2 (en) | Continuous flow microfluidic system | |
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US20200269201A1 (en) | Bifurcating mixers and methods of their use and manufacture | |
BELLIVEAU et al. | Patent 2816925 Summary |
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