CN116056728A - 脂质组合物 - Google Patents

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铃木庆子
笠置典之
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Abstract

本发明的课题在于提供一种能够实现优异的核酸递送的脂质组合物。根据本发明，提供一种脂质组合物，其包括下述式(1)所表示的脂质或其盐、核酸、至少一种非阳离子性脂质及R51‑L‑(OCH2CH2)n‑O‑R52(式中，R51表示碳原子数6至30的烃基，L表示‑CO‑或单键，R52表示氢原子或碳原子数1至6的烷基，n表示10～150的整数)所表示的脂质。式中，各符号是指说明书中记载的定义。
Figure DDA0004123877880000011

Description

脂质组合物
技术领域
本发明涉及一种包含核酸与脂质的脂质组合物。
背景技术
核酸药物对疾病的作用机制明确，副作用也少，作为下一代的医药品而被受期待，核酸药物的开发正在积极进行。作为将核酸递送至细胞的技术之一，已知有将核酸内含于脂质体或脂质颗粒进行给药的方法。在该技术中，作为脂质，使用具有在氨基等低pH下成为阳离子的取代基的脂质，通过对颗粒赋予适当的电荷来实现核酸的递送。
作为含于脂质颗粒中的化合物，在专利文献1及专利文献2中公开有一种具有酯基、缩醛基等来作为连接脂肪族基团和氨基的连接基的化合物。在专利文献3中公开有一种具有乙烯氧基或酰胺基、肟基等来作为连接脂肪族基团和氨基的连接基的化合物。在专利文献4中，记载有包含作为阳离子性脂质的DLin-MC3-DMA的脂质纳米颗粒。在专利文献5中，记载有可用于将药物递送至细胞及组织的阳离子性脂质。
在专利文献6中，研究制造核酸含有颗粒时组合的脂质化合物的种类或组成比。
并且，在专利文献7中，记载有包含具有规定的结构的脂质化合物的脂质颗粒。而且，在专利文献8中，记载有包含聚乙二醇结构的脂质。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开WO2010/054401号小册子
专利文献2：国际公开WO2010/144740号小册子
专利文献3：国际公开WO2010/054405号小册子
专利文献4：美国专利公开2013/0245107号公报
专利文献5：国际公开WO2015/095340号小册子
专利文献6：国际公开WO2009/127060号小册子
专利文献7：国际公开WO2019/235635号小册子
专利文献8：日本特表2019-504002号公报
发明内容
发明要解决的技术课题
针对作为用于递送核酸的载体发挥功能的脂质组合物进行探索，依然期望开发能够实现优异的核酸递送的脂质组合物。本发明应要解决的课题在于提供一种能够实现优异的核酸递送的脂质组合物。
用于解决技术课题的手段
本发明人等为了解决上述课题而进行深入研究的结果确认到，表示通过使用式(1)所表示的脂质及键合烃链与聚乙二醇结构而成的脂质来制备而成的脂质组合物优异的核酸递送，从而完成了本发明。根据本发明，可提供以下发明。
＜1＞一种脂质组合物，其包括下述式(1)所表示的脂质或其盐、核酸、至少一种非阳离子性脂质及R51-L-(OCH2CH2)n-O-R52(式中，R51表示碳原子数6至30的烃基，L表示-CO-或单键，R52表示氢原子或碳原子数1至6的烷基，n表示10～150的整数)所表示的脂质。
[化学式1]
Figure BDA0004123877860000021
式中，X表示-NR1-或-O-，
R1表示氢原子、碳原子数6～24的烃基或R21-L1-R22-所表示的基团，R21表示碳原子数1～24的烃基，L1表示-O(CO)O-、-O(CO)-、-(CO)O-、-O-或
[化学式2]
Figure BDA0004123877860000031
R22为2价的连接基，表示碳原子数1～18的烃连接基，
R2及R3分别独立地表示氢原子、碳原子数3～24的烃基或R31-L2-R32-所表示的基团，R31表示碳原子数1～24的烃基，L2表示-O(CO)O-、-O(CO)-、-(CO)O-、-O-或
[化学式3]
Figure BDA0004123877860000032
R32为2价的连接基，表示碳原子数1～18的烃连接基，
R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11及R12分别独立地表示氢原子或可以被取代的碳原子数1～18的烷基，
R4与R5、R10与R5、R5与R12、R4与R6、R5与R6、R6与R7、R6与R10、R12与R7、以及R7与R8中的任意一组以上可以相互连接而形成可以包含O原子的4～7元环，
可以被取代的碳原子数1～18的烷基上的取代基为羟基、羧基、-NR45R46所表示的氨基、取代或未经取代的芳基、取代或未经取代的杂芳基、-O(CO)O-R41、-O(CO)-R42、-(CO)O-R43或-O-R44所表示的基团，R41、R42、R43、R44、R45及R46分别独立地表示碳原子数1～18的烃基，
取代或未经取代的芳基及取代或未经取代的杂芳基上的取代基为碳原子数1～18的烷基、羟基、羧基、-NR45R46所表示的氨基、-O(CO)O-R41、-O(CO)-R42、-(CO)O-R43或-O-R44所表示的基团，R41、R42、R43、R44、R45及R46分别独立地表示碳原子数1～18的烃基，
a、b、c及d分别独立地表示0～3的整数，其中，a+b为1以上，c+d为1以上。
＜2＞根据＜1＞所述的脂质组合物，其中，式(1)所表示的脂质为下述式(2)所表示的脂质。
[化学式4]
Figure BDA0004123877860000041
式中，
R2及R3分别独立地为包含1个以上的不饱和键的碳原子数3～24的烃基，或
R2及R3分别独立地为R31-L2-R32-所表示的基团，或
R2及R3中的一个为R31-L2-R32-所表示的基团，另一个为碳原子数3～24的烃基，
R31表示碳原子数1～24的烃基，
L2表示-O(CO)O-、-O(CO)-、-(CO)O-、-O-或
[化学式5]
Figure BDA0004123877860000042
R32为2价的连接基，表示碳原子数1～18的烃连接基，
R5表示-O(CO)-R42或可以被-(CO)O-R43取代的碳原子数1～18的烷基，R42及R43分别独立地表示碳原子数1～18的烃基，
R7及R8分别独立地表示碳原子数1～4的烷基，
e表示2或3。
＜3＞根据＜1＞或＜2＞所述的脂质组合物，其中，式(1)所表示的脂质的含有率相对于全脂质量为30～70摩尔％。
＜4＞根据＜1＞至＜3＞中任一项所述的脂质组合物，其中，非阳离子性脂质为选自非离子性脂质及两性离子性脂质的脂质。
＜5＞根据＜4＞所述的脂质组合物，其中，非阳离子性脂质分别包含至少一种非离子性脂质及两性离子性脂质。
＜6＞根据＜4＞或＜5＞所述的脂质组合物，其中，非离子性脂质为固醇类。
＜7＞根据＜6＞所述的脂质组合物，其中，固醇类为植物固醇或胆固醇。
＜8＞根据＜5＞至＜7＞中任一项所述的脂质组合物，其中，非离子性脂质的含有率相对于全脂质量为10～60摩尔％。
＜9＞根据＜4＞或＜5＞所述的脂质组合物，其中，两性离子性脂质为磷脂。
＜10＞根据＜4＞至＜9＞中任一项所述的脂质组合物，其中，两性离子性脂质的含有率相对于全脂质量为1～30摩尔％。
＜11＞根据＜1＞至＜10＞中任一项所述的脂质组合物，其中，R51表示碳原子数8至26的烃基。
＜12＞根据＜1＞至＜11＞中任一项所述的脂质组合物，其中，R51-L-(OCH2CH2)n-O-R52所表示的脂质的含有率相对于全脂质量为0.1～10摩尔％。
＜13＞根据＜1＞至＜12＞中任一项所述的脂质组合物，其中，脂质与核酸的重量比为5～100。
＜14＞根据＜1＞至＜13＞中任一项所述的脂质组合物，其还包含药学上可接受的载体。
＜15＞根据＜14＞所述的脂质组合物，其为用于将核酸导入细胞中的药用组合物。
＜16＞根据＜15＞所述的脂质组合物，其为用于体内中核酸递送的药用组合物。
＜17＞根据＜16＞所述的脂质组合物，其为用于通过体内局部给药进行核酸递送的药用组合物。
＜18＞根据＜17＞所述的脂质组合物，其中，体内局部给药为向中枢神经系统的给药。
＜19＞根据＜1＞至＜13＞中任一项所述的脂质组合物，其为核酸递送载体。
发明效果
本发明的脂质组合物能够实现优异的核酸递送。
附图说明
图1表示关于体外中PTEN mRNA降低评价，对变更了阳离子脂质的种类的情况进行了比较的结果。
图2表示关于体外中PTEN mRNA降低评价，对变更了磷脂的种类的情况进行了比较的结果。
图3表示关于体外中PTEN mRNA降低评价，对变更了PEG脂质的摩尔％的情况进行了比较的结果。
图4表示关于体外中PTEN mRNA降低评价，对变更了脂质/RNA的比率的情况进行了比较的结果。
图5表示脑室内给药中PTEN mRNA降低评价的结果。
图6表示脑室内给药中PTEN mRNA降低评价的结果。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细说明。
在本说明书中，“～”表示将记载于其前后的数值分别作为最小值及最大值而包含的范围。
本发明的脂质组合物包含下述式(1)所表示的脂质或其盐、核酸、至少一种非阳离子性脂质及R51-L-(OCH2CH2)n-O-R52(式中，R51表示碳原子数6至30的烃基，L表示-CO-或单键，R52表示氢原子或碳原子数1至6的烷基，n表示10～150的整数)所表示的脂质。通过组合使用式(1)所表示的脂质或其盐与上述的R51-L-(OCH2CH2)n-O-R52所表示的脂质，能够有效发挥向细胞导入引起的效果即能够实现优异的核酸递送，这是在本发明中首次发现的知识。在使用了DLin-MC3-DMA代替式(1)所表示的脂质或其盐时或在使用了除R51-L-(OCH2CH2)n-O-R52所表示的脂质以外的聚乙二醇脂质时，没有达到本发明的效果。在本发明中，通过同时使用上述的2种类的特定脂质，能够达到意想不到的效果。
＜式(1)所表示的脂质或其盐＞
在本发明中，使用下述式(1)所表示的脂质或其盐。
[化学式6]
Figure BDA0004123877860000071
式中，
X表示-NR1-或-O-，
R1表示氢原子、碳原子数6～24的烃基或R21-L1-R22-所表示的基团，R21表示碳原子数1～24的烃基，L1表示-O(CO)O-、-O(CO)-、-(CO)O-、-O-或
[化学式7]
Figure BDA0004123877860000072
R22为2价的连接基，表示碳原子数1～18的烃连接基，
R2及R3分别独立地表示氢原子、碳原子数3～24的烃基或R31-L2-R32-所表示的基团，R31表示碳原子数1～24的烃基，L2表示-O(CO)O-、-O(CO)-、-(CO)O-、-O-或
[化学式8]
Figure BDA0004123877860000073
R32为2价的连接基，表示碳原子数1～18的烃连接基，
R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11及R12分别独立地表示氢原子或可以被取代的碳原子数1～18的烷基，
R4与R5、R10与R5、R5与R12、R4与R6、R5与R6、R6与R7、R6与R10、R12与R7、以及R7与R8中的任意一组以上可以相互连接而形成可以包含O原子的4～7元环，
可以被取代的碳原子数1～18的烷基上的取代基为羟基、羧基、-NR45R46所表示的氨基、取代或未经取代的芳基、取代或未经取代的杂芳基、-O(CO)O-R41、-O(CO)-R42、-(CO)O-R43或-O-R44所表示的基团，R41、R42、R43、R44、R45及R46分别独立地表示碳原子数1～18的烃基，
取代或未经取代的芳基及取代或未经取代的杂芳基上的取代基为碳原子数1～18的烷基、羟基、羧基、-NR45R46所表示的氨基、-O(CO)O-R41、-O(CO)-R42、-(CO)O-R43或-O-R44所表示的基团，R41、R42、R43、R44、R45及R46分别独立地表示碳原子数1～18的烃基，
a、b、c及d分别独立地表示0～3的整数，其中，a+b为1以上，c+d为1以上。
作为R1中的碳原子数6～24的烃基以及R2及R3中的碳原子数3～24的烃基，优选为烷基、烯基或炔基，更优选为烷基或烯基。碳原子数6～24的烷基及碳原子数3～24的烷基可以为直链也可以为支链，且可以为链状也可以为环状。碳原子数6～24的烷基优选为碳原子数6～20的烷基，碳原子数3～24的烷基更优选为碳原子数6～20的烷基。具体而言，可以举出己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、三甲基十二烷基(优选3,7,11-三甲基十二烷基)、十四烷基、十五烷基、十六烷基、四甲基十六烷基(优选3,7,11,15-四甲基十六烷基)、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基等。碳原子数6～24的烯基及碳原子数3～24的烯基可以为直链也可以为支链，且可以为链状也可以为环状。碳原子数6～24的烯基优选为碳原子数6～20的烯基，碳原子数3～24的烯基更优选为碳原子数6～20的烯基。具体而言，可以举出己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基、十一碳烯基、十二碳烯基、十二碳二烯基、十三碳烯基、十四碳烯基、十五碳烯基、十六碳烯基(优选(Z)-十六碳-9-烯基)、十六碳二烯基、十七碳烯基(优选(Z)-十七碳-8-烯基)、十七碳二烯基(优选(8Z,11Z)-十七碳-8,11-二烯基)、十八碳烯基(优选(Z)-十八碳-9-烯基)、十八碳二烯基(优选(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)、十九碳烯基、二十碳烯基(优选(Z)-二十碳-11-烯基)、二十碳二烯基(优选(11,14)-二十碳-11,14-二烯基)等。碳原子数6～24的炔基优选为碳原子数6～20的炔基，碳原子数3～24的炔基更优选为碳原子数6～20的炔基。具体而言，可以举出己炔基、庚炔基、辛炔基、壬炔基、癸炔基、十一炔基、十二炔基、十四炔基、十五炔基、十六炔基、十七炔基、十八炔基等。上述烯基均优选具有1个或2个双键，炔基均优选具有1个或2个三键。
作为关于R21及R31的碳原子数1～24的烃基，优选为碳原子数10～24的烷基、碳原子数10～24的烯基或碳原子数10～24的炔基。碳原子数10～24的烷基可以为直链也可以为支链，且可以为链状也可以为环状。碳原子数10～24的烷基优选为碳原子数12～24的烷基。具体而言，可以举出癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、三甲基十二烷基(优选3,7,11-三甲基十二烷基)、十四烷基、十五烷基、十六烷基、四甲基十六烷基(优选3,7,11,15-四甲基十六烷基)、十七烷基、十八烷基、2-丁基己基、2-丁基辛基、1-戊基己基、2-戊基庚基、3-戊基辛基、1-己基庚基、1-己基壬基、2-己基辛基、2-己基癸基、3-己基壬基、1-庚基辛基、2-庚基壬基、2-庚基十一烷基、3-庚基癸基、1-辛基壬基、2-辛基癸基、2-辛基十二烷基、3-辛基十一烷基、2-壬基十一烷基、3-壬基十二烷基、2-癸基十二烷基、2-癸基十四烷基、3-癸基十三烷基、2-(4,4-二甲基戊烷-2-基)-5,7,7-三甲基辛基等。碳原子数10～24的烯基可以为直链也可以为支链，且可以为链状也可以为环状。具体而言，可以举出癸烯基、十一碳烯基、十二碳烯基、十二碳二烯基、十三碳烯基(优选(Z)-十三碳-8-烯基)、十四碳烯基(优选十四碳-9-烯基)、十五碳烯基(优选(Z)-十五碳-8-烯基)、十六碳烯基(优选(Z)-十六碳-9-烯基)、十六碳二烯基、十七碳烯基(优选(Z)-十七碳-8-烯基)、十七碳二烯基(优选(8Z,11Z)-十七碳-8,11-二烯基)、十八碳烯基(优选(Z)-十八碳-9-烯基)、十八碳二烯基(优选(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)等。碳原子数10～24的炔基可以为直链也可以为支链，且可以为链状也可以为环状。具体而言，可以举出癸炔基、十一炔基、十二炔基、十四炔基、十五炔基、十六炔基、十七炔基、十八炔基等。上述烯基均优选具有1个或2个双键，炔基均优选具有1个或2个三键。
作为关于R22及R32的2价的连接基且碳原子数1～18的烃连接基，优选为碳原子数1～18的亚烷基或碳原子数2～18的亚烯基。碳原子数1～18的亚烷基可以为直链也可以为支链，且可以为链状也可以为环状。碳原子数优选为1～12，更优选为碳原子数1～10，进一步优选为碳原子数2～10。具体而言，可以举出亚甲基、亚乙基、三亚甲基、四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基、七亚甲基、八亚甲基、九亚甲基、十亚甲基、十一亚甲基、十二亚甲基等。碳原子数2～18的亚烯基可以为直链也可以为支链，且可以为链状也可以为环状。碳原子数优选为1～12，更优选为碳原子数2～10。
作为L1的优选范围，优选为-O(CO)O-、-O(CO)-或-(CO)O-，更优选为-O(CO)-或-(CO)O-。
作为L2的优选范围，优选为-O(CO)O-、-O(CO)-或-(CO)O-，更优选为-O(CO)-或-(CO)O-。
关于R4、R6、R9、R10、R11及R12的可以被取代的碳原子数1～18的烷基的碳原子数1～18的烷基可以为直链也可以为支链，且可以为链状也可以为环状。碳原子数优选为1～12。具体而言，可以举出甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、丁基、异丁基、叔丁基、环丁基、戊基、环戊基、己基、环己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基等。烷基具有取代基时的取代基优选为羟基、羧基、-O(CO)O-R41、-O(CO)-R42、-(CO)O-R43或-O-R44所表示的基团，更优选为-O(CO)-R42或-(CO)O-R43所表示的基团。
关于R5、R7及R8的可以被取代的碳原子数1～18的烷基的碳原子数1～18的烷基可以为直链也可以为支链，且可以为链状也可以为环状。碳原子数优选为1～12，更优选为碳原子数1～8。具体而言，可以举出甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、丁基、异丁基、叔丁基、环丁基、戊基、环戊基、己基、环己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基等。烷基具有取代基时的取代基优选羟基、羧基、-O(CO)O-R41、-O(CO)-R42、-(CO)O-R43或-O-R44所表示的基团，更优选-O(CO)-R42、-(CO)O-R43所表示的基团。
作为可以包含O原子的4～7元环，可以举出吖丁啶环、吡咯烷环、哌啶环、吗啉环、环己亚胺环，优选为6元环，优选哌啶环、吗啉环。
关于R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11及R12，作为可以被取代的碳原子数1～18的烷基中的取代基为取代或未经取代的芳基时的芳基，优选为碳原子数6～22，更优选为碳原子数6～18，进一步优选为碳原子数6～10。具体而言，可以举出苯基、萘基、蒽基、菲基等。作为芳基上的取代基，优选为碳原子数1～18的烷基、羟基、羧基、-NR45R46所表示的氨基、-O(CO)O-R41、-O(CO)-R42、-(CO)O-R43或-O-R44所表示的基团，更优选为羟基或羧基。作为取代芳基，具体而言，可以举出羟基苯基、羧基苯基等。
关于R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11及R12，作为可以被取代的碳原子数1～18的烷基中的取代基为取代或未经取代的杂芳基时的杂芳基，优选为碳原子数1～12，更优选为碳原子数1～6。具体而言，可以举出吡啶基、吡唑基、咪唑基、苯并咪唑基、噻唑基、噁唑基等。作为杂芳基上的取代基，优选为碳原子数1～18的烷基、羟基、羧基、-NR45R46所表示的氨基、-O(CO)O-R41、-O(CO)-R42、-(CO)O-R43或-O-R44所表示的基团，更优选为羟基或羧基。作为取代或未经取代的杂芳基，具体而言，可以举出羟基吡啶基、羧基吡啶基、吡啶酮基(Pyridonylgroup)等。
作为关于R41、R42、R43、R44、R45及R46的碳原子数1～18的烃基，优选为碳原子数1～18的烷基、碳原子数2～18的烯基或碳原子数2～18的炔基，更优选为碳原子数1～18的烷基或碳原子数2～18的烯基。碳原子数1～18的烷基可以为直链也可以为支链，且可以为链状也可以为环状。碳原子数优选为3～18，更优选为碳原子数5～18。具体而言，可以举出丙基、异丙基、环丙基、丁基、异丁基、叔丁基、环丁基、戊基、环戊基、己基、环己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十一烷基、十二烷基、十三烷基、三甲基十二烷基(优选3,7,11-三甲基十二烷基)、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基等。碳原子数2～18的烯基可以为直链也可以为支链，且可以为链状也可以为环状。碳原子数优选为3～18，更优选为5～18。具体而言，可以举出烯丙基、异戊二烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基(优选(Z)-2-壬烯基或(E)-2-壬烯基)、癸烯基、十一碳烯基、十二碳烯基、十二碳二烯基、十三碳烯基(优选(Z)-十三碳-8-烯基)、十四碳烯基(优选十四碳-9-烯基)、十五碳烯基(优选(Z)-十五碳-8-烯基)、十六碳烯基(优选(Z)-十六碳-9-烯基)、十六碳二烯基、十七碳烯基(优选(Z)-十七碳-8-烯基)、十七碳二烯基(优选(8Z,11Z)-十七碳-8,11-二烯基)、十八碳烯基(优选(Z)-十八碳-9-烯基)、十八碳二烯基(优选(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯基)等。碳原子数2～18的炔基可以为直链也可以为支链，且可以为链状也可以为环状。碳原子数优选为3～18，更优选为碳原子数5～18。具体而言，可以举出炔丙基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基、壬炔基、癸炔基、十一炔基、十二炔基、十四炔基、十五炔基、十六炔基、十七炔基、十八炔基等。
当X表示-NR1-时，R1优选为碳原子数6～24的烃基或R21-L1-R22-所表示的基团。此时，优选为R2及R3中的一个为氢原子；R2及R3中的另一个为碳原子数6～24的烃基或R31-L2-R32-所表示的基团。
当X表示-O-时，R2及R3分别独立地优选为碳原子数6～24的烃基或R31-L2-R32-所表示的基团。
R4、R6、R9、R10、R11及R12优选为氢原子。
R5优选为氢原子、碳原子数1～18的烷基、可以被-O(CO)-R42或-(CO)O-R43取代的碳原子数1～18的烷基、可以被芳基取代的碳原子数1～18的烷基、可以被羟基取代的碳原子数1～18的烷基，当为烷基时，可以与R4、R6、R10及R12相互连接而形成可以包含O原子的环。其中，优选为碳原子数1～18的烷基、可以被-O(CO)-R42或-(CO)O-R43取代的碳原子数1～18的烷基、可以被芳基取代的碳原子数1～12的烷基、可以被羟基取代的碳原子数1～8的烷基，更优选为碳原子数1～18的烷基、可以被-O(CO)-R42或-(CO)O-R43取代的碳原子数1～18的烷基。
优选R7及R8分别独立地为氢原子、碳原子数1～18的烃基、可以被-O(CO)-R42或-(CO)O-R43取代的碳原子数1～18的烷基、可以被芳基取代的碳原子数1～8的烷基或可以被羟基取代的碳原子数1～8的烷基，或者R7与R8相互连接而形成可以包含O原子的4～7元环。
R5与R7或R8相互不连接，且不形成环。
a+b优选为1或2，更优选为1。c+d优选为1或2，更优选为1。
在优选的方式中，式(1)所表示的脂质为下述式(2)所表示的脂质。
[化学式9]
Figure BDA0004123877860000121
式中，
R2及R3分别独立地为包含1个以上的不饱和键的碳原子数3～24的烃基，或
R2及R3分别独立地为R31-L2-R32-所表示的基团，或
R2及R3中的一个为R31-L2-R32-所表示的基团，另一个为碳原子数3～24的烃基，
R31表示碳原子数1～24的烃基，
L2表示-O(CO)O-、-O(CO)-、-(CO)O-、-O-或
[化学式10]
Figure BDA0004123877860000131
R32为2价的连接基，表示碳原子数1～18的烃连接基，
R5表示-O(CO)-R42或可以被-(CO)O-R43取代的碳原子数1～18的烷基，R42及R43分别独立地表示碳原子数1～18的烃基，
R7及R8分别独立地表示碳原子数1～4的烷基，
e表示2或3。
在式(2)中，优选为R2及R3中的一个为R31-L2-R32-所表示的基团，另一个为碳原子数3～24的烃基。在式(2)中，优选为L2表示-O(CO)-或-(CO)O-。
式(1)所表示的脂质可以形成盐。
作为碱性基团中的盐，例如可以举出与盐酸、氢溴酸、硝酸及硫酸等无机酸的盐；与甲酸、乙酸、柠檬酸、草酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、天冬氨酸、三氯乙酸及三氟乙酸等有机羧酸的盐；以及与甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、均三甲苯磺酸及萘磺酸等磺酸的盐。
作为酸性基团中的盐，例如可以举出与钠及钾等碱金属的盐；与钙及镁等碱土金属的盐；铵盐；以及与三甲胺、三乙胺、三丁胺、吡啶、N,N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、二乙胺、二环己基胺、普鲁卡因、二苄基胺、N-苄基-β-苯乙基胺、1-二苯羟甲胺及N,N’-二苄基乙二胺等含氮有机碱的盐等。
在上述盐之中，作为优选的盐，可以举出药学上可接受的盐。
作为式(1)所表示的脂质的优选的具体例，能够举出以下所记载的化合物1～化合物10。
[化学式11]
Figure BDA0004123877860000141
[化学式12]
Figure BDA0004123877860000142
Figure BDA0004123877860000151
[化学式13]
Figure BDA0004123877860000152
在上述的中，更优选为化合物1、化合物2、化合物3、化合物5、化合物6、化合物7、化合物8、化合物9或化合物10，更优选为化合物5、化合物6、化合物8、化合物9或化合物10。
式(1)所表示的脂质及其制造方法记载于国际公开WO2019/235635。
在本发明的脂质组合物中，式(1)所表示的脂质或其盐的含有率相对于全脂质量优选为20摩尔％～80摩尔％，更优选为30摩尔％～70摩尔％，进一步优选为40摩尔％～60摩尔％。
＜非阳离子性脂质＞
本发明的脂质组合物包含至少一种非阳离子性脂质。
作为非阳离子性脂质，优选为选自非离子性脂质及两性离子性脂质的脂质。作为非阳离子性脂质，更优选分别包含至少一种非离子性脂质及两性离子性脂质。
作为非离子性脂质，优选为固醇类。通过在油相中包含固醇类，能够降低膜流动性而得到脂质组合物的稳定化效果。
作为固醇类并不受特别限定，能够举出胆固醇、植物甾醇(phytosterol)(谷甾醇、豆甾醇、岩藻甾醇、菠菜甾醇、菜籽甾醇等)、麦角固醇、胆甾烷酮、胆甾烯酮、粪甾醇、胆固醇基-2’-羟基乙醚、胆固醇基-4’-羟基丁醚等。其中，优选为植物固醇(谷甾醇)、胆固醇。在植物固醇(谷甾醇)中，优选使用β-谷甾醇。
本发明中，非离子性脂质的含有率相对于全脂质量优选为10摩尔％～60摩尔％，更优选为15摩尔％～45摩尔％，进一步优选为20摩尔％～35摩尔％。
作为两性离子性脂质，优选为磷脂，具体而言，优选为磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺或鞘磷脂。作为磷脂，优选为具有磷脂酰胆碱等的胆碱基的磷脂。作为两性离子性脂质，可以单独使用，也可以组合多种不同的中性脂质。
作为磷脂酰胆碱，并不受特别限定，可举出大豆卵磷脂(SPC)、氢化大豆卵磷脂(HSPC)、蛋黄卵磷脂(EPC)、氢化蛋黄卵磷脂(HEPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基卵磷脂(POPC)等。其中，优选为二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)及二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)，尤其优选为二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。
作为磷脂酰乙醇胺并不受特别限定，但可举出二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二亚油酰基磷脂酰乙醇胺(DLoPE)、二植烷酰基磷脂酰乙醇胺(D(Phy)PE)、1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、双十四烷基磷脂酰乙醇胺、双十六烷基磷脂酰乙醇胺、双十八烷基磷脂酰乙醇胺、二植烷基磷脂酰乙醇胺等。
作为鞘磷脂(SM)并不受特别限定，可以举出源自蛋黄的鞘磷脂、源自牛奶的鞘磷脂等。
本发明的脂质组合物中，两性离子性脂质的含有率相对于全脂质量优选为1摩尔％以上30摩尔％以下，更优选为5摩尔％以上25摩尔％以下，进一步优选为15摩尔％以上25摩尔％以下。
＜包含烃链与聚乙二醇鎖的脂质＞
本发明的脂质组合物包含R51-L-(OCH2CH2)n-O-R52(式中，R51表示碳原子数6至30的烃基，L表示-CO-或单键，R52表示氢原子或碳原子数1至6的烷基，n表示10～150的整数)所表示的脂质(也称为包含烃链与聚乙二醇鎖的脂质)。
R51优选表示碳原子数8至26的烃基，更优选表示碳原子数10至22的烃基，进一步优选表示碳原子数14至20的烃基。R51表示的烃基可以为飽和或不飽和中的任一种，并且可以为直链的烃基或支链的烃基中的任一种。作为直链的烃基，尤其优选为十八烷基、棕榈酰基或油烯基。
L优选表示-CO-。
R52优选表示氢原子。
n表示10～150的整数，优选表示15～80。-(OCH2CH2)n-所表示的聚乙二醇鎖的重均分子量优选为500～5000，更优选为750～3000。
并且，将包含支链烃链与聚乙二醇鎖的脂质的具体例示于以下。
[化学式14]
Figure BDA0004123877860000171
Figure BDA0004123877860000181
将包含烃链与聚乙二醇鎖的脂质的尤其优选的具体例示于以下。
[化学式15]
Figure BDA0004123877860000182
在本发明的脂质组合物中，包含烃链与聚乙二醇鎖的脂质的含有率相对于全脂质量优选为0.1摩尔％～10摩尔％，更优选为0.3摩尔％～8摩尔％，进一步优选为0.5摩尔％～5摩尔％。
＜核酸＞
本发明的脂质组合物包含核酸。作为核酸，可以举出质粒、单链DNA、双链DNA、siRNA(small interfering RNA：小干扰RNA)、miRNA(micro RNA：微RNA)、mRNA、反义寡核苷酸(也称ASO)、核酶等，可以包含其中任何一种。并且，也可以包含修饰的核酸。
在本发明的脂质组合物中，核酸为反义寡核苷酸的情况下，脂质与核酸的重量比优选为5～100，更优选为5～60，进一步优选为5～30，尤其优选为5～25。
＜脂质组合物的制造方法＞
对本发明的脂质组合物的制造方法进行说明。
脂质组合物的制造方法并不受特别限定，能够通过如下进行制造：将脂质组合物的构成成分的全部或一部分油溶性成分溶解于有机溶剂等而制成油相，并将水溶性成分溶解于水而制成水相，将油相和水相进行混合。混合中可以使用微混合器，也可以使用均质机等乳化机、超声波乳化机、高压喷射乳化机等进行乳化。
或者，也能够通过如下进行制造：通过将包含脂质的溶液供给至蒸发器等进行减压干固或供给至喷雾干燥机等进行喷雾干燥等来制备包含脂质的干燥的混合物，将该混合物添加到水类溶剂中，用前述乳化机等进一步进行乳化。
作为脂质组合物的制造方法的一例，可举出包括如下工序的方法：
将脂质成分溶解于有机溶剂而得到油相的工序(a)；
混合在工序(a)中得到的油相及包含核酸的水相的工序(b)；
稀释在工序(b)中得到的油相及包含水相的混合液而得到包含核酸的脂质组合物的分散液的工序(c)；及
从在工序(c)中得到的脂质组合物的分散液去除上述有机溶剂的工序(d)。
在工序(a)中，将脂质成分溶解于有机溶剂(乙醇等醇或酯等)中。总脂质浓度并不受特别限定，但通常为1mmol/L～100mmol/L，优选为5mmol/L～50mmol/L，更优选为10mmol/L～30mmol/L。
在工序(b)中，水相能够通过将核酸(例如，siRNA、反义寡核苷酸、mRNA等)溶解于水或缓冲液而得到。根据需要，能够添加抗氧化剂等成分。将水相和油相进行混合的比率(体积比)优选5:1～1:1，更优选4:1～2:1。
在工序(b)中，混合液能够用水或缓冲液(例如，磷酸缓冲生理盐水(PBS)等)稀释。
在工序(c)中，作为从脂质组合物的分散液中去除有机溶剂的方法并不受特别限定，能够使用通常的方法，例如能够通过使用磷酸缓冲生理盐水进行透析来去除有机溶剂。
根据需要，能够调整脂质组合物的大小。调整大小的方法并不受特别限定，但能够使用挤出机等来减小粒径。
＜关于脂质组合物＞
本发明的脂质组合物可以为脂质颗粒。脂质颗粒是指由脂质构成的颗粒，包括脂质聚集而成的脂质聚集体、胶束、具有选自脂质体中的任一种的结构的组合物，但只要为包含脂质的组合物，则脂质颗粒的结构并不限定于这些。作为脂质体，有如下：具有脂质双层结构，在内部具有水相，双重膜为单层的脂质体；以多层状重叠的多层脂质体。本发明中可以包括任何脂质体。
脂质组合物的形态能够通过电子显微镜观察或使用X射线的结构分析等来进行确认。例如，通过使用Cryo透射型电子显微镜观察(CryoTEM法)的方法，能够确认是否如脂质体那样，为脂质颗粒具有脂质双分子膜结构(薄片结构)及内水层的结构，或者，是否具有在颗粒内部具有电子密度高的芯部且填充有以脂质为首的构成成分的结构等。通过X射线小角散射(SAXS)测定，也能够对脂质颗粒确认有无脂质双分子膜结构(薄片结构)。
当本发明的脂质组合物为颗粒时，颗粒的粒径并不受特别限定，但优选为10～1000nm，更优选为30～500nm，进一步优选为50～250nm。脂质颗粒的粒径能够通过通常的方法(例如，动态光散射法、激光衍射法等)进行测定。
＜脂质组合物的利用＞
作为利用本发明中的脂质颗粒的一例，能够通过将包含核酸的脂质颗粒导入细胞中来向细胞中导入核酸(例如，基因等)。即，本发明的脂质组合物能够用作用于将核酸导入细胞的药用组合物。即，本发明的脂质组合物能够用作用于体内中核酸递送的药用组合物。
并且，当在本发明中的脂质颗粒中包含具有药物用途的核酸时，脂质颗粒能够作为核酸药物给药于活体。当将本发明中的脂质组合物用作核酸药物时，本发明的脂质组合物能够单独或与药学上可接受的载体(例如，生理盐水或磷酸缓冲液等给药介质)进行混合而给药于活体。即，本发明的脂质组合物可以进一步包含药学上可接受的载体。
在与药学上可接受的载体的混合物中的脂质组合物(脂质颗粒)的浓度并不受特别限定，通常能够设为0.05质量％至90质量％。并且，在包含本发明的脂质组合物的核酸药物中，还可以添加药学上可接受的其他添加物质，例如pH调节缓冲剂、渗透压调节剂等。
给药本发明的脂质组合物时的给药途径并不受特别限定，能够利用任意的方法进行给药。作为给药方法，可以举出口服给药、非口服给药(关节内给药、静脉内给药、动脉内给药、皮下给药、皮内给药、玻璃体内给药、腹膜内给药、肌肉内给药、阴道内给药、膀胱内给药、鞘内给药、肺部给药、直肠给药、结肠给药、颊部给药、鼻腔给药、脑池内给药、吸入等)。优选为非口服给药，作为给药方法，优选为静脉注射、皮下注射、皮内注射或肌肉内注射。作为给药，优选通过体内的局部给药进行核酸递送。关于本发明的脂质组合物，也能够通过直接注射到疾病部位来给药。并且，在体内进行局部给药时给药部位并不受特别限定，但作为一例为对中枢神经系统的给药。
本发明的脂质组合物的剂型并不受特别限定，当进行口服给药时，本发明的脂质组合物能够与适当的赋形剂组合而以片剂、含剂、胶囊剂、丸剂、悬浮剂、糖浆剂等形态使用。并且，在适用于非口服给药的制剂中，能够适当包含抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂及等渗无菌注射剂、悬浮剂、助溶剂、增稠剂、稳定化剂或防腐剂等添加剂。
＜核酸递送载体＞
本发明的脂质组合物能够以高内含率保持核酸，因此作为核酸递送载体非常有用。根据利用本发明的核酸递送载体，例如能够通过将所得到的脂质组合物与核酸进行混合在体外(in vitro)或体内(in vivo)进行转染来向细胞中导入核酸等。并且，利用本发明的核酸递送载体也作为核酸药物中的核酸递送载体而有用。即，本发明的脂质组合物作为用于体外或体内(优选体内)核酸递送的组合物而有用。
接着，举出实施例对本发明进行说明，但本发明并不限定于这些。
实施例
(PTEN反义寡核苷酸信息)
PTEN(Phosphatase and Tensin Homolog Deleted from Chromosome 10：人第10号染色体缺失的磷酸酶)为催化作为肌醇磷脂的磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸的脱磷酸化反应的酶。
从Hokkaido System Science CO,Ltd.购买了针对PTEN蛋白质的反义寡核苷酸核酸(PTEN ASO)。是包括20碱的寡核苷酸的磷酸二酯键，排列记载为以下。
5(m)^t(m)^g(m)^5(m)^t(m)^a^g^5c^5c^t^5c^t^g^g^a^t(m)^t(m)^t(m)^g(m)^a(m)
但是，小写字母(a、g、t)分别表示腺嘌呤、鸟嘌呤、胸苷，(m)表示2’MOE修饰。
5(m)表示2’-MOE 5-Me胞嘧啶，t(m)表示2’-MOE胸苷，g(m)表示2’-MOE鸟嘌呤，a(m)表示2’-MOE腺嘌呤，5c表示5-甲基-d胞嘧啶，^表示硫代磷酸酯。
2′-MOE表示2′-O-甲氧基乙基。
(PTEN ASO-LNP的制备)
使表1所示的第一脂质、磷脂、胆固醇及聚乙二醇脂质(PEG脂质)以表1中所记载的摩尔比溶解于乙醇，以使总脂质浓度成为20mmol/L，从而得到了油相。
以下示出所使用的成分。
DSPC(1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(1，2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)，产品名称：COATSOME MC-8080；NOF corporation)；
DMPC(1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱(1，2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)，产品名称：COATSOME MC-4040；NOF corporation)；
DLPC(1,2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(1，2-Dilauroyl-sn-glycero-3-phosphocholine)，产品名称：12：0PC(DLPC)；Avanti polar lipids)；、
SM(Egg sphingomyelin：鸡蛋鞘磷脂)，产品名称：COATSOME NM―10；NOFcorporation)
胆固醇(产品名称：Cholesterol HP；Nippon Fine Chemical)；
单硬脂PEG(产品名称：Polyethylene Glycol Monostearate：聚乙二醇硬脂酸酯(4E.O.)，FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation)、
DMG-PEG2000(1，2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethyleneglycol：1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇)(产品名称：SUNBRIGHT(注册商标)GM-020；NOF corporation)
以下示出单硬脂PEG(也标记为monoPEG)的结构。
[化学式16]
Figure BDA0004123877860000231
以下示出DMG-PEG2000(也标记为DMG-PEG)的结构。
[化学式17]
Figure BDA0004123877860000232
以下示出Dlin-MC3-DMA、DOTMA、及DODAP的结构。
[化学式18]
Dlin-MC3-DMA
Figure BDA0004123877860000233
[化学式19]
DOTMA：1，2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基铵丙烷(氯化物盐)
Figure BDA0004123877860000234
[化学式20]
DODAP：1，2-二油酰氧基-3-二甲氨基丙烷
Figure BDA0004123877860000241
将PTEN ASO 5mg溶解于无菌水1mL中，利用pH4的10mmol/L乙酸缓冲液稀释成使核酸浓度成为54.6μmol/L而得到了水相。随后，使用注射泵，用微混合器(参考日本专利第5288254号公报)混合成使水相与油相的体积比成为水相∶油相＝3∶1，并且用磷酸缓冲生理盐水(PBS)将混合液稀释2倍而得到了核酸脂质颗粒的分散物。
将脂质组合物中所占的第一脂质、磷脂、固醇、PEG脂质的摩尔比记载于表1及表2中。
混合时核酸相对于全体脂质的质量比也记载于表1及表2中。
[表1]
Figure BDA0004123877860000251
[表2]
Figure BDA0004123877860000252
＜粒径的测定＞
对脂质颗粒分散液，使用Zeta电位·粒径测定系统ELS-Z2(Otsuka ElectronicsCo.,Ltd.)，并利用磷酸缓冲生理盐水(PBS)稀释成10倍而测定了脂质颗粒的粒径及多分散指数。将测定结果示于表3。
＜PTEN ASO的内含率的评价＞
(总核酸浓度定量)
向保持核酸的脂质颗粒60μL中添加3mol/L乙酸钠水溶液30μL和糖原9μL，随后，添加乙醇1.5mL，由此溶解脂质，仅使核酸沉淀。然后，进行离心分离，去除了上清液。风干15分钟以上之后，加入水使其再溶解，并使用Nanodrop ND1000(Thermo Fisher Scientific)测定浓度，由此对总核酸浓度进行了定量。
(外水相中的核酸浓度的定量)
使用Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit(Thermo Fisher Scientific)，按照协议(protocol)进行了定量。首先，用水稀释上述试剂盒中所包含的20×TE缓冲液，将其制成1×TE缓冲液。另外，TE表示Tris/EDTA(乙二胺四乙酸)。为了仅对外水相的核酸进行定量，用1×TE缓冲液将保持核酸的脂质颗粒分散液稀释了10000倍。
将稀释了10000倍的脂质颗粒分散液100μL放入96孔板，随后，将用1×TE缓冲液稀释了2000倍的RiboGreen试剂(上述Quanti-iT Ribogreen RNA Assay Kit中所包含的试剂)100μL加入到样品中，通过使用酶标仪Infinite F200(TECAN)测定荧光(激发波长：485nm、荧光波长：535nm)来对外水相中的核酸浓度进行了定量。
(内含率的计算)
使用上述工序中所得到的总核酸浓度及外水相中的核酸浓度的定量结果，按照下述式计算出核酸脂质颗粒的核酸内含率。
核酸内含率(％)＝(总核酸浓度-外水相中的核酸浓度)÷总核酸浓度×100
将计算结果示于表3。
[表3]
累积粒径(nm) 多分散指数 内含率(％)
实施例1 77.7 0.087 90％
实施例2 83.6 0.166 86％
实施例3 85 0.175 86％
实施例4 85.7 0.164 93％
实施例5 96.5 0.174 68％
实施例6 68.7 0.192 60％
实施例7 62.6 0.191 51％
实施例8 64.6 0.179 85％
实施例9 64.2 0.166 86％
实施例10 72.1 0.049 98％
实施例11 60.4 0.067 98％
实施例T2 58.6 0.041 98％
实施例13 81.6 0.040 98％
实施例14 92.7 0.038 >98％
实施例T5 76.4 0.044 >98％
实施例16 72.1 0.049 98％
实施例T7 96.6 0.082 62％
比较例1 61.4 0.188 71％
比较例2 75.4 0.122 76％
比较例3 100.2 0.137 89％
比较例4 69.1 0.077 90％
比较例5 104.5 0.109 92％
比较例6 260.4 0.146 82％
比较例7 98.5 0.023 96％
＜体外PTEN mRNA降低评价＞
(用于评价的细胞)
在使用了A431细胞(American Type Culture Collection)的体外试验中，将分别以88：10：1：1的比例混合了E-MEM(gibco)、FBS(fetal bovine serum)(gibco)、Penicillin-streptomycin(gibco)、NEAA(Non-Essential Amino Acid)(FUJIFILM WakoPure Chemical Corporation)而得的物质用作培养基。
在使用了SH-SY5Y细胞(American Type Culture Collection)的体外试验中，分别以41.5：41.5：15：1：1的比例混合了E-MEM(gibco)、Ham’s F12(gibco)、FBS(gibco)，Penicillin-streptomycin(gibco)、NEAA(FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation)而得的物质用作培养基。
(通过PCR的PTEN mRNA的定量)
PTEN蛋白质mRNA测定遵循了TaqMan(注册商标)Fast Advanced Cells-to-CTTMKit(Thermo fisher scientific)的协议。对A431细胞或SH-SY5Y细胞添加核酸脂质颗粒的分散液、Naked ASO或PBS，以制备成最终浓度成为500nmol/L作为ASO浓度。在37℃、5％CO2管理下暴露24小时后，去除培养上清，用4℃的PBS清洗了1次。去除PBS后，以50μL/well添加Lysis solution，在室温下静放5分钟，由此得到了细胞裂解物。对细胞裂解物使用TaqMan(注册商标)Fast Advanced Cells-to-CTTMKit(Thermo fisher scientific)，Hs02621230_s1，FAM/MGB(Thermo fisher scientific)及Human GAPDH Endogenous Control、VIC(注册商标)/MGB(Thermo fisher scientific)作为PCR反应试剂实施了逆转录及PCR反应。
各样品的PTEN mRNA值是通过ΔΔCt法来计算。具体而言，从PTEN的Ct值减去GAPDH的Ct值，计算各样品的ΔCt值。从所计算出的ΔCt值减去PBS处置组的ΔCt值的平均值计算出ddCt值。关于各ΔΔCt值，取相对于作为比较对象的Naked ASO的相对值，作为PTEN mRNA相对值。
将对变更阳离子脂质的种类的情况进行比较的结果(实施例1及比较例1至7)示于图1中。图1是使用了A431细胞而得的试验结果。当使用了式(1)所表示的脂质时，确认了相乘效果。
将对变更磷脂的种类的情况进行比较而得的的结果(实施例1及3～5)示于图2中。图2是使用了A431细胞而得的试验结果。在实施例1及实施例3～5中，均确认到高药效。
将对变更了PEG脂质的摩尔％的情况进行比较而得的结果(实施例1、6及7)示于图3中。图3是使用了SH-SY5Y细胞而得的试验结果。在实施例1、6及7中，均确认到高药效。
将对变更脂质/RNA的比率的情况进行比较而得的结果(实施例1、8及9)示于图4中。图4是使用了SH-SY5Y细胞而得的试验结果。在实施例1、8及9中，均确认到高药效。
而且，将变更了式(1)中所包含的阳离子脂质的种类而得的结果(实施例10～实施例16)及变更了固醇而得的结果(实施例17)示于表4中。表4是使用了A431细胞及SH-SY5Y细胞而得的试验结果。在实施例10～17中，均确认到高药效。
[表4]
A431细胞 SH-SY5Y细胞
实施例10 0.87 0.34
实施例11 0.12 0.81
实施例12 0.17 1.22
实施例13 1.13 0.37
实施例14 0.86 0.36
实施例15 1.12 0.30
实施例16 1.04 0.14
实施例17 0.03 0.04
＜脑室内给药中的PTEN mRNA降低评价＞
(给药～样品制备)
将Crl：CD(SD)大鼠(Charles River Laboratories Japan,Inc.)按照体重的类别随机化进行了分组(n＝8)。作为ASO量以100μg/Head将实施例1的核酸脂质颗粒的分散液、实施例15的核酸脂质颗粒的分散液或Naked ASO10μL给药到侧脑室内。并且，将相同容量的10％蔗糖溶液给药到侧脑室内，作为对照组(中等组)。
给药14天后在麻醉下使大鼠安乐死，并摘除了大脑皮层。将所得到的大脑皮层浸渍于RNAlaterTM Stabilization Solution(Thermo Fischer Scientific)中。添加BufferRLT plus(RNeasy plus mini kit，QIAGEN)，使用了BioMasher将组织进行破碎之后，通过离心分离(4℃，10，000g，20分钟)得到了上清。使用离心柱(QIA shredder，QIAGEN)纯化上清之后，添加70％乙醇，并使用RNeasy离心柱提取了mRNA。使用Nanodrop ND-1000(ThermoFisher Scientific)测量了mRNA提取液的RNA浓度。
(通过PCR的PTEN mRNA的定量)
通过RNase free水进行稀释以使各样品的RNA浓度相等之后，使用High-CapacityRNA-to-cDNATM Kit(Thermo Fischer Scientific)进行了逆转录反应(37℃，30分钟)。作为反应试剂使用TaqMan Gene Expression Master Mix(Thermo Fischer Scientific)，Rn00477208_m1，VIC/MGB_PL(Thermo Fischer Scientific)，Rn01775763_g1，FAM/MGB(Thermo Fischer Scientific)，实施了逆转录样品的PCR反应。
通过ΔΔCt法计算出了各核酸脂质颗粒组及Naked ASO组的PTEN mRNA值。具体而言，从PTEN的Ct值减去GAPDH的Ct值，计算各样品的ΔCt值。根据从所计算出的ΔCt值减去介质组的ΔCt值的平均值而计算出的ΔΔCt值计算出了各样品的PTEN mRNA的KD率。将实施例1与Naked ASO的结果示于图5中，将实施例15与Naked ASO的结果示于图6中。本发明的核酸脂质颗粒与Naked ASO(比较例)相比显示出了更高的药效。

Claims (19)

1.一种脂质组合物，其包括下述式(1)所表示的脂质或其盐、核酸、至少一种非阳离子性脂质及R51-L-(OCH2CH2)n-O-R52所表示的脂质，式中，R51表示碳原子数6至30的烃基，L表示-CO-或单键，R52表示氢原子或碳原子数1至6的烷基，n表示10～150的整数，
[化学式1]
Figure FDA0004123877850000011
式中，X表示-NR1-或-O-，
R1表示氢原子、碳原子数6～24的烃基或R21-L1-R22-所表示的基团，R21表示碳原子数1～24的烃基，L1表示-O(CO)O-、-O(CO)-、-(CO)O-、-O-或
[化学式2]
Figure FDA0004123877850000012
R22为2价的连接基，表示碳原子数1～18的烃连接基，
R2及R3分别独立地表示氢原子、碳原子数3～24的烃基或R31-L2-R32-所表示的基团，R31表示碳原子数1～24的烃基，L2表示-O(CO)O-、-O(CO)-、-(CO)O-、-O-或
[化学式3]
Figure FDA0004123877850000013
R32为2价的连接基，表示碳原子数1～18的烃连接基，
R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11及R12分别独立地表示氢原子或可以被取代的碳原子数1～18的烷基，
R4与R5、R10与R5、R5与R12、R4与R6、R5与R6、R6与R7、R6与R10、R12与R7、以及R7与R8中的任意一组以上可以相互连接而形成可以包含O原子的4～7元环，
可以被取代的碳原子数1～18的烷基上的取代基为羟基、羧基、-NR45R46所表示的氨基、取代或未经取代的芳基、取代或未经取代的杂芳基、-O(CO)O-R41、-O(CO)-R42、-(CO)O-R43或-O-R44所表示的基团，R41、R42、R43、R44、R45及R46分别独立地表示碳原子数1～18的烃基，
取代或未经取代的芳基及取代或未经取代的杂芳基上的取代基为碳原子数1～18的烷基、羟基、羧基、-NR45R46所表示的氨基、-O(CO)O-R41、-O(CO)-R42、-(CO)O-R43或-O-R44所表示的基团，R41、R42、R43、R44、R45及R46分别独立地表示碳原子数1～18的烃基，
a、b、c及d分别独立地表示0～3的整数，其中，a+b为1以上，c+d为1以上。
2.根据权利要求1所述的脂质组合物，其中，
式(1)所表示的脂质为下述式(2)所表示的脂质，
[化学式4]
Figure FDA0004123877850000021
式中，
R2及R3分别独立地为包含1个以上的不饱和键的碳原子数3～24的烃基，或
R2及R3分别独立地为R31-L2-R32-所表示的基团，或
R2及R3中的一个为R31-L2-R32-所表示的基团，另一个为碳原子数3～24的烃基，
R31表示碳原子数1～24的烃基，
L2表示-O(CO)O-、-O(CO)-、-(CO)O-、-O-或
[化学式5]
Figure FDA0004123877850000031
R32为2价的连接基，表示碳原子数1～18的烃连接基，
R5表示-O(CO)-R42或可以被-(CO)O-R43取代的碳原子数1～18的烷基，R42及R43分别独立地表示碳原子数1～18的烃基，
R7及R8分别独立地表示碳原子数1～4的烷基，
e表示2或3。
3.根据权利要求1或2所述的脂质组合物，其中，
式(1)所表示的脂质的含有率相对于全脂质量为30～70摩尔％。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的脂质组合物，其中，
非阳离子性脂质为选自非离子性脂质及两性离子性脂质的脂质。
5.根据权利要求4所述的脂质组合物，其中，
非阳离子性脂质包含非离子性脂质及两性离子性脂质的至少各一种。
6.根据权利要求4或5所述的脂质组合物，其中，
非离子性脂质为固醇类。
7.根据权利要求6所述的脂质组合物，其中，
固醇类为植物固醇或胆固醇。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的脂质组合物，其中，
非离子性脂质的含有率相对于全脂质量为10～60摩尔％。
9.根据权利要求4或5所述的脂质组合物，其中，
两性离子性脂质为磷脂。
10.根据权利要求4至9中任一项所述的脂质组合物，其中，
两性离子性脂质的含有率相对于全脂质量为1～30摩尔％。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的脂质组合物，其中，
R51表示碳原子数8至26的烃基。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的脂质组合物，其中，
R51-L-(OCH2CH2)n-O-R52所表示的脂质的含有率相对于全脂质量为0.1～10摩尔％。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的脂质组合物，其中，
脂质与核酸的重量比为5～100。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的脂质组合物，其还包含药学上可接受的载体。
15.根据权利要求14所述的脂质组合物，其为用于将核酸导入细胞中的药用组合物。
16.根据权利要求15所述的脂质组合物，其为用于体内中核酸递送的药用组合物。
17.根据权利要求16所述的脂质组合物，其为用于通过体内局部给药进行核酸递送的药用组合物。
18.根据权利要求17所述的脂质组合物，其中，
体内局部给药为向中枢神经系统的给药。
19.根据权利要求1至13中任一项所述的脂质组合物，其为核酸递送载体。
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