CN116672316B - 一种核酸-脂质纳米颗粒冻干制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本公开涉及一种核酸‑脂质纳米颗粒冻干制剂及其制备方法，所述核酸‑脂质纳米颗粒冻干制剂，包括核酸‑脂质纳米颗粒和冷冻干燥保护剂，所述冷冻干燥保护剂包括蔗糖和甘露醇，其中，所述蔗糖与甘露醇的质量比为9~2.5：1~7.5。采用本公开冷冻干燥保护剂冻干的产品稳定性高，在2~40℃能稳定保存3个月以上；所述方法和使用的冻干保护剂能适用于不同种类的核酸‑脂质纳米颗粒；并且其冻干前后的颗粒均一性良好、包封率和完整率优异，能充分保证冻干前后的核酸不被降解；含水量低、复溶时间短，理化性能优异。

Description

一种核酸-脂质纳米颗粒冻干制剂及其制备方法

技术领域

本公开涉及药物制剂技术领域，尤其涉及一种核酸-脂质纳米颗粒（mRNA-LNP）冻干制剂及其制备方法。

背景技术

mRNA疫苗是将外源靶抗原的基因序列通过转录、合成等工艺制备的mRNA通过特定的递送系统导入机体细胞，通过在体内表达目的蛋白，刺激机体产生特异性免疫学反应，从而使机体获得免疫保护的一种核酸制剂，能实现体液与细胞的双重免疫，有效性高。mRNA疫苗作为一种平台型技术，在设计和构建上具有快速性、应变性以及简单的全合成制备等优势，随着Moderna和BioNtech公司的mRNA疫苗在临床上的安全性和保护效力得到进一步验证，使得mRNA疫苗技术得到广泛关注并推动了其快速发展。mRNA疫苗打破了传统灭活、减毒疫苗的免疫激活模式，创新性地利用人体本身细胞生产抗原，以此激活特异免疫。mRNA疫苗具有极高的有效保护率，同时相较于其他创新型疫苗（如：DNA疫苗、病毒载体疫苗）具有更高的安全性。研究发现由mRNA诱导的瞬时蛋白表达在其他传染病疫苗、癌症疫苗、心血管疾病、蛋白质替代疗法和遗传病等多领域均具有巨大的应用价值，甚至能够通过体内注射实现自主产生CAR-T效应。

证实，专利CN 114044741B记载包含一种或多种阳离子脂质（氨基（可离子化）脂质）、中性脂质、结构性脂质以及聚合物共轭脂质在内的脂质体及其的复合物（lipoplex）作为运输媒介物，可以有效地将生物活性物质如小分子药物、多肽、蛋白质和核酸运送至细胞和/或细胞内隔室中。

因此，在mRNA疫苗中为了提高mRNA作用效力，采用脂质纳米颗粒（LNP）对mRNA进行包封递送，不仅保护mRNA避免被体内RNase瞬时破坏，而且突破mRNA与细胞膜均带负电荷的静电排斥屏障，增强向抗原递呈细胞的递送，从而保护LNP中的mRNA。但是，与绝大多数疫苗的储存条件(2~8℃)不同，目前国际上mRNA-LNP产品的主流储藏方式为冷冻储存，已上市mRNA疫苗长期稳定性差，需超低温保存(-20℃，甚至-70℃)，Moderna和BioNTech/辉瑞的新冠疫苗分别需要在-15~-25℃和-60~-90℃储存；且有效期低于6个月。在面临数亿剂mRNA疫苗需要储存，运输和分发到世界各地的情况下，稳定性成为其应用的瓶颈问题。

冻干疫苗具有显著的优势，但是，冷冻干燥会对疫苗造成一定的影响，疫苗冻干过程的敏感性程度因疫苗而异。冷冻干燥是把含有大量水分的物料预先进行降温，冻结成冰点以下的固体，在真空条件下使冰直接升华，从而去除水分得到干燥产品的一种技术。因为是利用升华达到除水分的目的，所以也可称作升华干燥。冷冻干燥工艺主要包括冻干程序和保护剂两方面内容。

一方面，冻干程序是冻干过程中的温度、真空度及能量等随时间变化的曲线，一般包括三个阶段：预冻，升华干燥和解吸干燥。不同冻干条件制备的mRNA疫苗体内生物活性差异极大，不同的冻干程序以及冷冻干燥保护剂对于制剂性能也会造成很大影响。其中，冷却温度、升温速率及维持时长等均对冻干粉的外观、水分、粒径等有重要影响。

另一方面，冷冻干燥保护剂种类、用量、添加顺序，以及冻干程序均使其与mRNA-LNP的分子作用机制及微观空间作用不同，对冻干粉中的LNP膜结构，mRNA包封率，mRNA完整性等有很大的影响。目前冻干产品并不在少数，但是有关mRNA-LNP冻干条件的研究很少。

不同冻干保护剂中虽然都有涉及蔗糖、甘露醇等糖类，但是基于待冻干的主体药物成分物化性质、结构、用途等方面的差异，对于不同药物种类（mRNA-LNP、多肽、小核酸、普通化药等）的冻干保护剂，以及冻干保护剂对不同种类药物的保护机理具有明显差异。

比如对于多肽药物，关于冷冻干燥对蛋白质的变性机理目前普遍认为在冷冻干燥过程中冷冻和干燥都会引起蛋白质变性。Dean AS 等人认为在冷冻过程中缺少保护剂的情况下，蛋白质将失去活性；而脱水过程本身能使蛋白质损伤，从而使复水后的蛋白质失去活性。许多学者认为蛋白质分子周围分布着多层水分子，在降温过程中，蛋白质分子周围的水分子不断冻结，但只要蛋白质分子表面的单层水分子没有冻结，则蛋白质就不会变性；反之，蛋白质就会变性（Dean AS, Theodore W. Effects of drying methods andadditives on structure and function of actin: mechanisms of dehydrationinduced damage and its inhibition [J]. Archives of Biochemistry andBiophysics, 1998, 46 (1) :171 ）。Hanafusa N利用在冷冻干燥过程中把卵清蛋白(ovalbumin)和肌球蛋白(myosin)进行了冷冻干燥对比实验，表明正是由于蛋白质表面覆盖着没有冻结的单层水分子，才使蛋白质在冷冻过程中不发生变性作用。当蛋白质表面的单层水分子开始冻结时，蛋白质分子表面的氢键以及极性基团就会暴露在周围环境中而变性。同样，在干燥过程中也应保证蛋白质分子表面的单层水分子不受到破坏。因此，在冷冻干燥蛋白质药物的过程中，一般要加入保护剂，防止由于蛋白质表面的单层水分子破坏而引起蛋白质的变性（Hanafusa N. The behavior of hydration water of protein withthe protect actin the view of HNMR [J]. Development Biology Standard, 1991,74 (3) :241.）。

对于小分子化药，糖类等冻干保护剂主要起到赋形和支撑作用。而对于由脂质体包裹的核酸药物，冻融过程中存在脂质体融合过程，小粒径脂质体融合成粒径稍大的脂质体，随着冻融次数的增加脂质体粒径会变大。另外随着脂质体的融合，必然会导致分散系数一定程度的增加。因此，为了尽可能降低冻融过程中脂质体融合的风险，需加入冻干保护剂。同时随着脂质体悬浮液的冻结和冰晶的生长，保护剂逐渐浓缩，并分布在LNP周围，阻止LNP之间的融合和药物的泄漏。另外保护剂可以抑制冰晶的生长，从而减少冰晶对LNP的损伤。并且在脂质体悬浮液冻结过程中，糖类保护剂使溶液的黏性增加，从而弱化了水的结晶过程，达到了保护的目的。

LNP是阳离子脂质、中性脂质、PEG 修饰脂质、胆固醇等构成的多组分脂质系统。核酸与普通化学药物的一个明显区别是核酸带有数量庞大的磷酸根，因而呈负电。为了使其能够被脂质纳米粒更好地包裹，研究人员想到使用一类特殊的脂质——阳离子脂质。阳离子脂质往往具有一个带铵根的亲水端，在酸性环境下能够与氢离子结合呈正电。借助两者的静电吸附，就能够将溶解在酸性溶液中的核酸包裹在脂质纳米粒中。包裹后的结构外部因阳离子脂质的疏水端向外而呈疏水性，此时可以加入传统脂质体合成中常用的一端修饰有PEG的脂质——聚合物共轭脂质（PEG-脂质），使PEG-脂质的疏水端与阳离子脂质的疏水端结合，而PEG-脂质的亲水端（连有PEG）则向外形成核酸脂质纳米粒的外壳。为了增加核酸脂质纳米粒的稳定性，还可以添加适量的中性脂质（胆固醇等成分），使PEG-脂质的疏水端与阳离子脂质的疏水端结合更为紧密，最终得到溶解在酸性缓冲液中的脂质纳米粒。然后用中性缓冲液进行透析或超滤以置换出酸性缓冲液，产生不带电的、致密包裹mRNA的mRNA-LNP。mRNA-LNP为壳-核结构，外层为磷脂层，核心包载的mRNA不仅分子量大，且对于mRNA分子的完整性要求极高，mRNA-LNP需要在真空冷冻干燥的高强度压力变化过程中，保持其磷脂层和纳米结构不被破坏，保证mRNA的包载状态不发生变化，并在复水重构后恢复原液粒径分布及mRNA包封率，这些都具有很高的挑战性。而添加冷冻干燥保护剂，可于干燥脱水过程中取代脂质分子与水分子间的氢键来稳定LNP结构，并起到赋形剂的作用。

基于上述内容，冻干保护剂种类、用量，均使其与mRNA-LNP的分子作用机制及微观空间作用不同，对冻干粉中的LNP膜结构，mRNA包封率，mRNA完整性等有很大的影响，但是有关mRNA-LNP冻干条件的研究很少。

因此，为了改善mRNA-LNP在运输、储存和流通中的便利性，并且保证其长期稳定性，亟待提供一种能室温或低温条件保存、并且稳定性良好的mRNA-LNP冻干制剂及其制备方法。

发明内容

为了解决现在技术中存在的缺陷和补足，本公开提供一种核酸-脂质纳米颗粒冻干制剂及其制备方法。本公开所述核酸-脂质纳米颗粒冻干制剂具有以下特点：①在2~40℃条件下的稳定性良好，极大程度拓宽了保存条件，延长有效期（3个月以上）；②能适用于不同种类的核酸-脂质纳米颗粒（mRNA-LNP包括YK009、YK401、YK305、ALC0315、SM102、DLIN-MC3-DMA）样品；并且③能保持良好的细胞存活率和转染效率；④其制剂冻干前后的颗粒均一性良好（粒径变化低至20nm左右、PDI变化仅0.04）；⑤其制剂冻干前后的包封率（仅降低6.5%）和完整率（仅降低0.1%）优异、能充分保证冻干前后的核酸不被降解，维持总量；⑥其制剂冻干后的含水量低（低至0.697%），复溶时间短（＜10s）。

在一方面，本公开提供了一种核酸-脂质纳米颗粒冻干制剂，包括核酸-脂质纳米颗粒和冷冻干燥保护剂，所述冷冻干燥保护剂包括蔗糖。

在一些优选地实施方式中，所述冷冻干燥保护剂还包括甘露醇、海藻糖、麦芽糊精中的任意一种或多种；优选为甘露醇。

在一些优选地实施方式中，所述蔗糖与甘露醇的质量比为9~2.5：1~7.5。

在一些优选地实施方式中，所述蔗糖与甘露醇的质量比为7.5~2.5：2.5~7.5。

在一些更优选地实施方式中，所述蔗糖与甘露醇的质量比为7.5：2.5。

在一些优选地实施方式中，所述核酸-脂质纳米颗粒包括核酸（mRNA）和脂质纳米颗粒（LNP）。

在一些优选地实施方式中，所述核酸是核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)。

在一些优选地实施方式中，所述核糖核酸(RNA)选自由以下组成的组 ：小干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、Dicer-底物RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、信使RNA(mRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)、环状RNA（circRNA）、自扩增RNA(saRNA)、5’-pppRNA以及其混合物。

在一些优选地实施方式中，所述脂质纳米颗粒包括阳离子脂质、中性脂质、结构性脂质、聚合物共轭脂质。

在一些优选地实施方案中，所述阳离子脂质是式(I)结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中G₁为C_1～6亚烷基；G₂为C_2～8亚烷基；G₃为C_1～3亚烷基；L₁为C_6～15直链烷基；L₂为C_12～25支链烷基。例如，式(I-I)结构的YK-009（参见专利CN114044741B）。

(I)

(I-I)

在一些优选地实施方案中，所述阳离子脂质是式(II)结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中：G₁为C_2~8亚烷基；G₂为C_2~8亚烷基；L₁为-C(O)O-或-OC(O)-；L₂为-C(O)O-或-OC(O)-；R₁为C_6~25直链或支链烷基；R₂为C_6~25直链或支链烷基；G₃为HO(CH₂)₂-或HO(CH₂)₃-；G₄为HO(CH₂)₂-或HO(CH₂)₃-；L为(CH₂)₂-或-(CH₂)₃-或-(CH₂)₄-。例如，式(II-I)结构的YK-401，式(II-II)结构的YK-402（参见专利CN115784921B）。

(II)

(II-I)

(II-II)

在一些优选地实施方案中，所述阳离子脂质是式(III)结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中：G₁为C_1~6亚烷基；G₂为C_2~8亚烷基；R₁为C_6~20直链或支链烷基；R₂为C_12~25支链烷基；G₃为：HO(CH₂)₂N(CH₃)(CH₂)₂-，HO(CH₂)₂N(CH₂CH₃)(CH₂)₂-，(HO(CH₂)₂)₂N(CH₂)₂-，CH₃O(CH₂)₂N(CH₃)(CH₂)₂-，(CH₃)₂N(CH₂)₃SC(O)O(CH₂)₂-，(CH₃)₂N(CH₂)₃SC(O)-，CH₃NH(CH₂)₂N(CH₃)(CH₂)₂-或CH₃CH₂NH(CH₂)₂-。例如，式(III-I)结构的YK-201，式(III-II)结构的YK-202（参见专利CN115677518B）。

(III)

(III-I)

(III-II)

在一些优选地实施方案中，所述阳离子脂质是式(IV)结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中G₁为C_1~8亚烷基；G₂为C_2~8亚烷基；R₁为C_6~25直链或支链烷基；R₂为C_12~25直链或支链烷基；G₃为：HO(CH₂)₂N(R₃)CH₂CH(OH)CH₂-，其中R₃为-CH₃或-CH₂CH₃或-CH₂CH₂OH。例如，式(IV-I)结构的YK-305，式(IV-II)结构的YK-310（参见专利CN115745820B）。

(IV)

(IV-I)

(IV-II)

在一些优选地实施方案中，所述阳离子脂质是式(V)结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中，G¹和G²各自独立地为未取代的C₆-C₁₀亚烷基；G³为未取代的C₁-C₁₂亚烷基；R¹和R²各自独立地为C₆-C₂₄烷基或C₆-C₂₄烯基；R³为OR⁵、N、-C(＝O)OR⁴、-OC(＝O)R⁴或-NR⁵C(＝O)R⁴；R⁴为C₁-C₁₂烃基；并且R⁵为H或C₁-C₆烃基；例如，式(V-I)结构的ALC0315（参见专利CN108368028B）；

(V)

(V-I)

在一些优选地实施方案中，所述阳离子脂质是式(VI)结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体，其中，R4选自-(CH₂)_nQ和-(CH₂)_nCHQR；Q选自由以下组成的组：-OR、-OH、-O(CH₂)_nN(R)₂、-OC(O)R、-CX₃、-CN、-N(R)C(O)R、-N(H)C(O)R、-N(R)S(O)₂R、-N(H)S(O)₂R、-N(R)C(O)N(R)₂、-N(H)C(O)N(R)₂、-N(H)C(O)N(H)(R)、-N(R)C(S)N(R)₂、-N(H)C(S)N(R)₂、-N(H)C(S)N(H)(R)、-N(R)S(O)₂R₈和杂环；n是1、2或3；例如，式(VI-I)结构的SM102（参见专利CN110520409A）。

(VI)

(VI-I)

在一些优选地实施方案中，所述阳离子脂质是式(VII)结构的化合物，或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体（参见CN102625696B， DLIN-MC3-DMA），

(VII)。

在一些更优选地实施方式中，所述阳离子脂质包括YK-009、YK-401、YK-305、ALC0315、SM102、DLIN-MC3-DMA。

在一些优选地实施方式中，所述阳离子脂质与所述中性脂质的摩尔比为1:1～10:1。

在一些优选地实施方式中，所述阳离子脂质与所述结构性脂质的摩尔比为1:1～5:1。

在一些优选地实施方式中，所述阳离子脂质、所述中性脂质、所述结构性脂质、以及所述聚合物共轭脂质的摩尔比为(25～65):(5～25):(25～70):(0.5～5)。

在一些优选地实施方式中，所述阳离子脂质、所述中性脂质、所述结构性脂质、以及所述聚合物共轭脂质的摩尔比为(25～65):(5～25):(25～45):(0.5～5)。

在一些更优选地实施方式中，所述阳离子脂质、所述中性脂质、所述结构性脂质、以及所述聚合物共轭脂质的摩尔比为50:10:38.5:1.5或49:10:39.5:1.5。

在一些优选地实施方式中，所述中性脂质包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、神经酰胺、甾醇及其衍生物中的一种或多种。

在一些更优选地实施方式中，所述中性脂质选自以下中的一种或多种：1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-双十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0 Diether PC)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二硬脂酰基-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基-硬脂酰乙醇胺(SOPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱(SOPC)、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)以及其混合物。

在一些更优选地实施方式中，所述中性脂质是DOPE和/或DSPC。

在一些优选地实施方式中，所述结构性脂质选自以下中的一种或多种：胆固醇、非甾醇、谷固醇、麦角固醇、菜油甾醇、豆甾醇、芸苔甾醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚、皮质类固醇。

在一些更优选地实施方式中，所述结构性脂质是胆固醇。

在一些优选地实施方式中，所述聚合物共轭脂质选自以下中的一种或多种：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油。

在一些更优选地实施方式中，所述聚合物共轭脂质选自以下中的一种或多种：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)，二肉豆蔻酰甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG2000)和甲氧基聚乙二醇双十四烷基乙酰胺(ALC-0159)。

本公开还提供一种所述核酸-脂质纳米颗粒冻干制剂的制备方法，其步骤为：

1）配制冷冻干燥保护剂溶液以及配制核酸-脂质纳米颗粒溶液；

2）将冷冻干燥保护剂溶液与核酸-脂质纳米颗粒溶液混合，得到待冻干混合液，进行冷冻干燥；

所述待冻干混合液中冷冻干燥保护剂的质量百分含量为8~11%，优选为10%。

在一些优选地实施方式中，所述冷冻干燥包括以下步骤：预冻阶段、升华干燥阶段、解吸干燥阶段。

在一些优选地实施方式中，所述升华干燥阶段的温度为-40~0℃。

在一些优选地实施方式中，所述升华干燥阶段的时间为50~100 h。

在一些优选地实施方式中，所述升华干燥阶段分2~4段呈梯度升温。

在一些优选地实施方式中，所述升华干燥阶段中梯度升温的每段升温5~20℃。

在一些优选地实施方式中，所述升华干燥阶段中梯度升温的每段维持时间6~70h。

在一些更优选地实施方式中，所述升华干燥阶段的梯度升温过程依次为：-40℃50 h，-25℃ 20 h， -15℃ 6 h，-5℃ 6 h。

在一些优选地实施方式中，所述预冻阶段采用梯度降温或液氮降温。

在一些优选地实施方式中，所述预冻阶段中梯度降温的温度为-60~-40℃。

在一些优选地实施方式中，所述预冻阶段中梯度降温的时间为2~6 h。

在一些更优选地实施方式中，所述梯度降温过程依次为：-5℃ 0.5 h，-15℃ 0.5h，-25℃ 0.5 h，-35℃ 0.5 h，-45℃ 0.5 h。

在一些优选地实施方式中，所述液氮降温过程为采用液氮预冷2~6 h。

在一些优选地实施方式中，所述解吸干燥阶段：温度为15~30℃。

在一些优选地实施方式中，所述解吸干燥阶段的运行时间为1~3 h。

在一些更优选地实施方式中，所述解吸干燥阶段的过程依次为：15℃ 2 h，30℃1.5 h。

在一些优选地实施方式中，所述冷冻干燥过程中，保持真空压力控制 ≤ 0.05mbar。

本公开还提供所述核酸-脂质纳米颗粒冻干制剂在制备核酸药物中的用途。

本公开还提供治疗或预防疾病或病症的方法，包括向有需要的患者或受试者给药治疗或预防有效量的所述核酸-脂质纳米颗粒冻干制剂。

例如，所述疾病或病症选自由以下组成的组：感染性疾病、癌症和增生性疾病、遗传性疾病、自体免疫性疾病、糖尿病、神经退化性疾病、心血管和肾血管疾病以及代谢性疾病。例如，所述感染性疾病选自：由冠状病毒、流感病毒或HIV病毒引起的疾病，小儿肺炎，裂谷热，黄热病，狂犬病，或多种疱疹。

在一些优选地实施方式中，所述哺乳动物是人。

在一些优选地实施方式中，所述组合物经静脉内、肌肉内、皮内、皮下、鼻内或通过吸入施用。例如，所述组合物是皮下施用的。

在一些优选地实施方式中，将约0.001mg/kg至约10mg/kg剂量的所述治疗剂或预防剂施用给所述哺乳动物。

本公开所取得的有益效果至少如下：

一、稳定性

1、本公开的mRNA-LNP冻干制剂在2~40℃条件下放置三个月，其粒径、包封率和完整性无显著变化，稳定性良好。并且其稳定性显著优于不添加冻干保护剂的mRNA-LNP冻干制剂；具体来说：

本公开的mRNA-LNP冻干制剂在室温和2~8℃条件下，从0天到3个月，粒径增加在3nm以内，PDI无明显变化，包封率和完整性降低仅1%左右，变化不显著；在高温40℃的条件下，增加量也控制在6.5 nm以内，包封率降低1.9~5.6%，完整性降低2.8~3.6%，变化不大。在不同温度条件下保持理化特性以及mRNA包裹量和完整性无显著改变或少量改变，稳定性良好。

未添加冻干保护剂的mRNA-LNP冻干制剂，从0天到3个月，尽管在室温和2~8℃条件下也有少量改变，粒径增加6~7.5 nm，包封率和完整性降低3%左右；在高温40℃的条件下变化显著，粒径增加30.5 nm，PDI明显增加，包封率和完整性降低超过8%，不能保持mRNA-LNP理化特性，且裸露的mRNA比例增加导致发生降解的mRNA增多，稳定性差。

二、生物学特性

1、采用本公开的冻干保护剂和冷冻干燥程序进行冷冻干燥将不同种类LNP构成的mRNA-LNP样品制成冻干制剂，不影响其细胞毒性；因此本公开的冻干保护剂适用于不同种类的mRNA-LNP样品；具体来说：

YK009、YK401、YK305、ALC0315、SM102和DLIN-MC3-DMA包载mRNA组成的mRNA-LNP样品中添加本公开的冻干保护剂，配合冷冻干燥程序进行冻干，获得的冻干样品制剂，其细胞的存活率与加入未冻干mRNA-LNP样品的细胞溶液无明显差异。

2、采用本公开的冻干保护剂对不同种类的mRNA-LNP样品（例如，YK-009、YK-401、YK-305、ALC0315、SM102、DLIN-MC3-DMA）进行冷冻干燥制成的冻干制剂可成功转染细胞；细胞中S蛋白能良好表达，表达量与未冻干样品转染的细胞无明显差异。

3、采用本公开的冻干保护剂对不同LNP比例构成mRNA-LNP样品制成冻干制剂，不影响其细胞毒性；因此本公开的冻干保护剂适用于不同LNP比例的mRNA-LNP样品，且冻干前后差异不显著；具体来说：

当LNP中阳离子脂质：中性脂质：结构性脂质：聚合物共轭脂质的摩尔比为(25～65):(5～25):(25～70):(0.5～5)时，其包载mRNA组成的mRNA-LNP样品中添加本公开的冻干保护剂，配合冷冻干燥程序进行冻干，获得的冻干制剂，其细胞的存活率与加入mRNA-LNP样品的细胞溶液无明显差异。

4、采用本公开的冻干保护剂对不同LNP比例的mRNA-LNP样品（阳离子脂质：中性脂质：结构性脂质：聚合物共轭脂质=(25～65):(5～25):(25～70):(0.5～5)）进行冷冻干燥制成的冻干制剂可成功转染细胞，且冻干前后无显著差异，具体来说：

不同LNP比例制备的mRNA-LNP样品，测得细胞中S蛋白能良好表达，表达量与未冻干样品转染的细胞无明显差异。

其中，当LNP中，阳离子脂质：中性脂质：结构性脂质：聚合物共轭脂质=49:10:39.5:1.5，其冻干前后条带最清晰，颜色深浅变化最小，表明转染的细胞中S蛋白的表达最优。

三、理化特性

1、是否添加冻干保护剂以及其组分和含量影响

1-1、是否添加冻干保护剂的影响：

相较于不添加冻干保护剂制备mRNA-LNP冻干制剂，添加冻干保护剂能显著改善冻干制剂的粒径尺寸和均一性、包封率、完整性、以及复溶效果；具体来说：

其中，添加冻干保护剂对mRNA-LNP样品进行冷冻干燥时，相较于甘露醇、海藻糖或麦芽糊精等其他冻干保护剂，采用蔗糖作为冻干保护剂添加到mRNA-LNP样品溶液进行冷冻干燥，效果最好，具体来说：

mRNA-LNP样品中加入蔗糖作为冻干保护剂，进行冷冻干燥制备冻干制剂，其粒径增加36.6 nm、PDI无明显变化、包封率降低9.1%、完整性降低2.8%，且含水量最少，约1.4%，复溶时间小于10 s；

mRNA-LNP样品中分别加入甘露醇、海藻糖或麦芽糊精作为冻干保护剂，进行冷冻干燥制备冻干制剂，粒径增加260 nm~500 nm、PDI增加0.4左右，包封率降低11.9~42%、完整性降低6.6~15.2%，含水量超过2%，且添加甘露醇和海藻糖的冻干制剂复溶时间大于60 s，冻干效果较使用蔗糖溶液差；

不添加冻干保护剂，直接对mRNA-LNP样品进行冷冻干燥制备冻干制剂，粒径增加约750 nm、PDI增加0.5左右，包封率降低81%、完整性降低28.3%，且含水量3.8%，冻干效果最差。

1-2、单组分冻干保护剂的影响：

采用蔗糖作为冻干保护剂，对mRNA-LNP样品溶液进行冷冻干燥，控制待冻干混合液中冻干保护剂浓度为5~15%，其冻干效果良好；当浓度为10%时，冻干效果最好；具体来说：

采用蔗糖浓度为5~15%（例如，10%和15%）对mRNA-LNP样品进行冷冻干燥制得的冻干制剂粒径增加36.6~55.2 nm、PDI无明显变化，包封率降低约9~13%、完整性降低2.8~5.7%，含水量约1.3%，复溶时间小于10 s。

其中，蔗糖浓度为10%时粒径均一性最好（仅增加36.6 nm）、包封率（仅降低9.1%）和完整性（仅降低2.8%）最优。

反之，采用本公开范围之外的其他蔗糖浓度（例如，20%、2.5%）对mRNA-LNP样品进行冷冻干燥，制得的冻干制剂粒径增加较多，增加了82.6 nm（比蔗糖浓度为10%，增加量多46.0 nm），粒径均一性下降显著；包封率和完整性下降幅度大，分别下降19.3~21.6%（比蔗糖浓度为10%，下降量多10.2~12.5%）和10.3~11.8%（比蔗糖浓度为10%，下降量多7.5~9.0%），冻干效果差。

1-3、双组份冻干保护剂的影响：

采用蔗糖和甘露醇二者组成作为冻干保护剂制备的mRNA-LNP冻干制剂的粒度均一性、包封率、完整性和水分含量，优于蔗糖、甘露醇、海藻糖、麦芽糊精任意三者或四者组合；具体来说：

采用蔗糖和甘露醇二者组合配制成冻干保护剂加入到mRNA-LNP样品中，最终冻干保护剂浓度为10%，进行冷冻干燥制备冻干制剂，其粒径增加25.3 nm、PDI无明显变化，包封率降低7.2%、完整性降低0.6%，含水量约0.8%，复溶时间小于10 s。

采用蔗糖、甘露醇、海藻糖、麦芽糊精任意三者或四者组合作为冻干保护剂制备mRNA-LNP冻干制剂，其保护效果均显著差于采用蔗糖和甘露醇二者组合。其中，以实施例4-1变化最小的蔗糖、甘露醇和海藻糖为例，冻干制剂粒径增加35 nm（较蔗糖和甘露醇二者组合粒径增加量多9.7 nm以上），包封率降低9%（较蔗糖和甘露醇二者组合包封率降低量高1.8%以上），完整性减少1.5%（较蔗糖和甘露醇二者组合完整性减少量高0.9%以上），以及含水1.132%（是蔗糖和甘露醇二者组合含水量的近1倍）；仍差于蔗糖和甘露醇二者的效果。

1-4、冻干保护剂用量的影响

蔗糖和甘露醇配比为9~2.5 : 1~7.5的冻干保护剂，控制待冻干混合液中冻干保护剂的浓度为10%，冷冻干燥保护效果优于其他配比的组合，其中蔗糖和甘露醇配比为7.5: 2.5的溶液保护效果最优；具体来说：

采用蔗糖和甘露醇配比为9~2.5 : 1~7.5的冻干保护剂制备mRNA-LNP冻干制剂，其粒径增加25 nm左右、PDI无明显变化，包封率降低8%左右、完整性降低1%左右，含水量1%左右，复溶时间小于10 s。

采用配比为7.5 : 2.5的蔗糖和甘露醇制备的冻干制剂理化特性、mRNA包裹比例和完整性变化最小，其粒径仅增加22.5 nm、包封率降低仅6.5%、完整性减少0.1%，几乎可以忽略不计，含水量仅为0.697%。

采用本公开范围外的其他配比，如蔗糖占比小于2.5、甘露醇大于7.5、以及待冻干混合液中冻干保护剂的总浓度小于10%或超过10%的溶液添加到mRNA-LNP样品溶液中进行冷冻干燥制备冻干制剂，保护效果显著差于采用本公开用量比的冻干保护剂。其粒径增加60.3~280.6 nm（较7.5 : 2.5的蔗糖和甘露醇粒径增加量多37.8~258.1 nm），包封率下降12%左右（较7.5 : 2.5的蔗糖和甘露醇包封率下降量高5.5%左右），完整性下降3.2%~8.3%（较7.5 : 2.5的蔗糖和甘露醇完整性下降量高3.1~8.2%），含水量约1.3%（较7.5 : 2.5的蔗糖和甘露醇含水量多1倍以上）左右。

2、冻干过程的影响

2-1、升华干燥的升温方式影响

冻干过程中，采用不同的升温方式进行升华干燥，影响制剂的粒度均一性、包封率、完整性以及含水量。其中，当控制升温方式为梯度升温时，其冻干效果良好；具体来说：

采用梯度升温方式进行升华干燥，得到冻干制剂理化特性、mRNA包裹比例和完整性变化不显著，粒径增加22.5~33.3 nm、PDI无明显变化，包封率降低6.5~8.1%、完整性降低0.1~0.2%左右，含水量0.6~0.9%左右，复溶时间小于10 s。

其中，采用更低温度的梯度升温的升华干燥方式，得到的冻干制剂，其粒径仅增加22.5 nm、包封率降低仅6.5%、完整性减少0.1%，几乎可以忽略不计，含水量仅为0.697%，复溶时间小于10 s。

而使用普通升温方式进行升华干燥得到的冻干制剂，其粒度均一性、包封率、完整性以及含水量较梯度升温方式呈现显著降低，冻干效果差于采用梯度升温的升华干燥方式。其粒径增加42~56.2 nm（较7.5 : 2.5的蔗糖和甘露醇粒径增加量多19.5~33.7 nm），包封率下降约11~16%（较7.5 : 2.5的蔗糖和甘露醇包封率下降量高4.5~9.5%左右），完整性下降4.8~6.5%（较7.5 : 2.5的蔗糖和甘露醇完整性下降量高4.7~6.4%），含水量增加至1.1~1.4%（较7.5 : 2.5的蔗糖和甘露醇含水量多1倍以上）。

2-2、升华干燥的时间影响

对mRNA-LNP样品进行冷冻干燥，升华干燥阶段采用梯度升温，并控制时长在50~100 h，得到的冻干制剂冻干效果良好；具体来说：

采用升华干燥方式采用梯度升温50~100 h，粒径增加30 nm左右、PDI无明显变化，包封率降低不超过10%、完整性减少0.2%左右，含水量1%以内，复溶时间小于10 s。

升华干燥阶段采用普通升温，过程总时长82 h，对mRNA-LNP样品进行冷冻干燥，理化特性、mRNA包裹比例和完整性变化较大，冻干效果较采用阶梯升温式差。普通升温获得的冻干制剂粒径增加约50 nm、包封率降低大于10%、完整性减少5%左右，以及含水增加至1.2%左右。

反之，升华干燥过程总时长过短，冻干效果较差，无法作为合格的冻干产品使用。

即使采用梯度升温的升华干燥方式，但是总时长过短（例如，6 h）时，对mRNA-LNP样品进行冷冻干燥，获得的冻干制剂冻干效果差；粒径增加50 nm、包封率降低16.1%、完整性减少5%，以及含水15.8%。

2-3、预冻程序的影响

对mRNA-LNP样品进行冷冻干燥，预冻程序需采用梯度降温或液氮预冻的方式，得到的冻干制剂颗粒均一性、包封率、完整性以及含水量优异；具体来说：

预冻采用梯度降温方式，时长2.5 h，对mRNA-LNP样品进行冷冻干燥制备冻干制剂，粒径仅增加22.5 nm、粒径变化小；包封率降低6.5%、完整性减少0.1%，mRNA包封率和完整性变化不明显，表明冷冻干燥导致的mRNA暴露和破损的比例小，影响不明显；冻干样品含水小于1%，复溶时间小于10 s。

预冻采用液氮降温的方式，复溶后粒径增加15 nm、PDI无明显变化，包封率降低2.5%、完整性减少0.1%，冻干样品含水量1%以内，复溶时间小于10 s。

反之，采用普通降温的方式，得到的冻干制剂颗粒均一性、包封率、完整性以及含水量显著差于梯度降温和液氮预冻的方式。

预冻采用普通降温方式，对mRNA-LNP样品进行冷冻干燥，粒径、包封率和完整性变化较大，冻干效果差。获得的冻干制剂粒径增加35 nm左右（较梯度降温粒径增加量高13 nm左右）、包封率降低高达9%（较梯度降温包封率降低量高3%左右）、完整性减少均高于1%（梯度降温完整性仅变化0.1%），以及含水1.2%左右（是梯度降温含水量的1倍左右）。

附图说明

图1为实施例8不同种类LNP的细胞存活率图；

图2为实施例8不同种类LNP的细胞转染效率图；

图3为实施例9不同LNP比例的细胞存活率图；

图4为实施例9不同LNP比例的细胞转染效率图；

图5为实施例9不同LNP比例的细胞转染效率图。

具体实施方式

本公开下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学生物试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本公开所使用的所有的技术和科学术语与属于本公开的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本公开的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本公开。

本公开的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。

在本公开中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。同时，为了更好地理解本公开，下面提供相关术语地定义和解释。

术语“药学上可接受的”在本公开中是指化合物或组合物在化学上和/或在毒理学上与构成制剂的其它成分和/或与用其预防或治疗疾病或病症的人类或哺乳动物相容。

术语“受试者”或“患者”在本公开中包括人类和哺乳动物。

本文所用的术语“治疗”是指给患有疾病或者具有所述疾病的症状的患者或受试者施用一种或多种药物物质，用以治愈、缓解、减轻、改善或影响所述疾病或者所述疾病的症状。在本公开的上下文中，除非作出相反的具体说明，术语“治疗”也可包括预防。

术语“溶剂合物”在本公开中指的是通过组合化合物（例如式(I)）或其药学上可接受的盐和溶剂(例如乙醇或水)而形成的复合物。应理解的是，在治疗疾病或病症中使用的化合物的任何溶剂合物尽管可能提供不同的性质(包括药代动力学性质)，但是一旦吸收至受试者中，会得到化合物，使得化合物的使用分别涵盖化合物的任何溶剂合物的使用。

术语“水合物”指的是上述术语“溶剂合物”中溶剂为水的情形。

应进一步理解，化合物（例如式(I)）或其药学上可接受的盐可以溶剂合物形式分离，并且因此任何所述溶剂合物皆包括于本发明的范围内。例如，式(I)化合物或其药学上可接受的盐可以未溶剂化形式以及与药学上可接受的溶剂(诸如，水、乙醇等)形成的溶剂化形式存在。

术语“药学上可接受的盐”是指化合物的相对无毒、无机酸或有机酸加成盐。其中，无机酸例如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸或硝酸等；有机酸例如甲酸、乙酸、乙酰乙酸、丙酮酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、十一酸、月桂酸、苯甲酸、水杨酸、2-(4-羟基苯甲酰基)-苯甲酸、樟脑酸、肉桂酸、环戊烷丙酸、二葡萄糖酸、3-羟基-2-萘甲酸、烟酸、巴莫酸、果胶酯酸、3-苯基丙酸、苦味酸、特戊酸、2-羟基乙磺酸、衣康酸、胺基磺酸、三氟甲磺酸、十二烷基硫酸、乙磺酸、苯磺酸、对-甲苯磺酸、甲磺酸、2-萘磺酸、萘二磺酸、樟脑磺酸、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸、乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、己二酸、海藻酸、马来酸、富马酸、D-葡萄糖酸、扁桃酸、抗坏血酸、葡庚糖酸、甘油磷酸、天冬胺酸、磺基水杨酸等。例如，可使用HCl（或盐酸）、HBr（或氢溴酸溶液）、甲磺酸、硫酸、酒石酸或富马酸与化合物（例如式(I)）形成药学上可接受的盐。

本公开的含氮化合物可通过用氧化剂(例如间氯过氧苯甲酸、过氧化氢、臭氧)处理而转化成N-氧化物。因此，在价态和结构允许的条件下，化合物不但包括结构式所示的含氮化合物，而且还包括其N-氧化物衍生物。

本公开的某些化合物可以以一种或多种立体异构体的形式存在。立体异构体包括几何异构体、非对映异构体和对映异构体。因此，化合物还包括外消旋混合物、单一的立体异构体和具有光学活性的混合物。本领域技术人员应该理解的是，一种立体异构体可能比其它立体异构体具有更好的功效和/或更低的副作用。单一的立体异构体和具有光学活性的混合物可手性源合成法、手性催化、手性拆分等方法得到。消旋体可通过色谱拆分法或者化学拆分法进行手性拆分。例如，可通过加入手性酒石酸、手性苹果酸等手性酸类拆分试剂与本公开的化合物成盐，利用产物的物理化学性质例如溶解度不同进行分离。

本发明还包括本公开化合物所有适合的同位素变体。同位素变体定义为这样的化合物，其中至少一个原子被具有相同原子序数但其原子质量不同于自然界中常见的或主要存在的原子质量的原子替代。可以引入到本公开化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮和氧的同位素，分别例如²H(氘)、³H(氚)、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁷O和¹⁸O。

术语“烷基”在本公开中是指包括具有规定碳原子数的支链和直链饱和脂族一价烃基。术语“亚烷基”在本公开中是指包括具有规定碳原子数的支链和直链饱和脂族二价烃基。C_n~m是指包括具有n至m个碳原子数的基团。例如C_2~5亚烷基包括C₂亚烷基、C₃亚烷基、C₄亚烷基、C₅亚烷基。

烷基(或亚烷基)可未经取代，或烷基(或亚烷基)可经取代，其中至少一个氢被另一种化学基团代替。

“治疗有效量”为当给予患者时能改善疾病或症状的治疗剂的量。“预防有效量”为当给予受试者时能预防疾病或症状的预防剂的量。构成“治疗有效量”的治疗剂的量或“预防有效量”的预防剂的量随着治疗剂/预防剂、疾病状态及其严重性、待治疗/预防的患者/受试者的年龄、体重等而变化。本领域普通技术人员可根据其知识以及本公开常规地确定治疗有效量和预防有效量。

在本公开中，当化合物的名称与结构式不一致时，以结构式为准。

应理解，本公开所用的术语“本公开化合物”根据语境可包括：式(I)~式(VII)化合物、其N-氧化物、其溶剂合物、其药学上可接受的盐、其立体异构体、以及它们的混合物。

本文所用术语阳离子脂质是指在选定的pH值带正电荷的脂质。

阳离子脂质体易于与带负电荷的核酸结合，即通过静电力与核酸中存在的带负电的磷酸基团相互作用，形成脂质纳米颗粒(LNP)。LNP是目前主流的递送载体之一。

阳离子脂质

在本公开的实施方式中，所述阳离子脂质为选自YK-009、YK-401、YK-305、ALC0315、SM102、DLIN-MC3-DMA化合物或其N-氧化物、溶剂合物、药学上可接受的盐或立体异构体中的一种或多种。

中性脂质

中性脂质在本公开中是指在选定的pH值不带电荷或者以两性离子形式存在的起辅助作用的脂质。该中性脂质可能通过促进脂质相变来调节纳米颗粒流动性成脂质双层结构并提高效率，同时还可能影响靶器官的特异性。

在一些实施方案中，所述阳离子脂质与所述中性脂质的摩尔比为约1:1～10:1，例如约9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1。在一种优选的实施方案中，所述阳离子脂质与所述中性脂质的摩尔比为约5:1。

例如，中性脂质可包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、神经酰胺、甾醇及其衍生物中的一种或多种。

脂质纳米颗粒组分可以包括一种或多种中性脂质-磷脂，如一种或多种(多)不饱和脂质。磷脂可以组装成一个或多个脂质双层。一般来说，磷脂可以包括磷脂部分和一个或多个脂肪酸部分。

中性脂质部分可以选自由以下组成的非限制性组：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、2-溶血磷脂酰胆碱和鞘磷脂。脂肪酸部分可以选自由以下组成的非限制性组：月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻烯酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、芥酸、植烷酸、花生酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、山萮酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。还涵盖包括带有修饰和取代的天然物种的非天然物种，所述修饰和取代包括分支、氧化、环化和炔烃。例如，磷脂可以用一种或多种炔烃(例如一个或多个双键被三键置换的烯基)官能化或与该一种或多种炔烃交联。在适当反应条件下，炔基在暴露于叠氮化物时可能经历铜催化的环加成反应。这些反应可用于使组合物的脂质双层官能化以促进膜渗透或细胞识别，或将组合物与有用组分如靶向或成像部分(例如染料)偶联。

可用于这些组合物中的中性脂质可以选自由以下组成的非限制性组：1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-双十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0 Diether PC)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二硬脂酰基-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基-硬脂酰乙醇胺(SOPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱(SOPC)、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)以及其混合物。

在一些实施方案中，中性脂质包括DSPC。在某些实施方案中，中性脂质包括DOPE。

在一些实施方案中，中性脂质包括DSPC和DOPE两种。

结构性脂质

脂质纳米颗粒还可以包括一种或多种结构性脂质。结构性脂质在本公开中是指通过填充脂质之间的间隙来增强纳米颗粒的稳定性的脂质。

在一些实施方案中，所述阳离子脂质与所述结构性脂质的摩尔比为约1:1～5:1，例如，约1.0:1、1.1:1、1.2:1、1.3:1、1.4:1、1.5:1、1.6:1、1.7:1、1.8:1、1.9:1、2.0:1。

结构性脂质可以选自但不限于由以下组成的组：胆固醇、非甾醇、谷固醇、麦角固醇、菜油甾醇、豆甾醇、芸苔甾醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚、皮质类固醇以及其混合物。在一些实施方案中，结构性脂质是胆固醇。在一些实施方案中，结构性脂质包括胆固醇和皮质类固醇(如泼尼松龙(prednisolone)、地塞米松、泼尼松(prednisone)和氢化可的松(hydrocortisone))或其组合。

聚合物共轭脂质

脂质纳米颗粒还可以包括一种或多种聚合物共轭脂质。聚合物共轭脂质主要是指聚乙二醇(PEG)修饰的脂质。亲水性PEG稳定LNP，通过限制脂质融合来调节纳米颗粒大小，并通过减少与巨噬细胞的非特异性相互作用来增加纳米颗粒的半衰期。

在一些实施方案中，所述聚合物共轭脂质选自以下中的一种或多种：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油。PEG修饰的PEG分子量通常为350-5000Da。

例如，所述聚合物共轭脂质选自以下中的一种或多种：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺聚乙二醇2000(DSPE-PEG2000)，二肉豆蔻酰甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000(DMG-PEG2000)和甲氧基聚乙二醇双十四烷基乙酰胺(ALC-0159)。

在本公开的冻干制剂的一些实施方案中，所述聚合物共轭脂质是DMG-PEG2000。

在本公开的冻干制剂的一些实施方案中，脂质纳米颗粒包括中性脂质、结构性脂质以及聚合物共轭脂质，所述阳离子脂质、所述中性脂质、所述结构性脂质、以及所述聚合物共轭脂质的摩尔比为(25～65):(5～25):(25～70):(0.5～5)，例如(45～55):(9～11):(34～43):(0.5～2.5)。

在本公开的冻干制剂的一些实施方案中，脂质纳米颗粒包括中性脂质、结构性脂质以及聚合物共轭脂质，所述阳离子脂质、所述中性脂质、所述结构性脂质、以及所述聚合物共轭脂质的摩尔比为49:10:39.5:1.5。

本公开中使用的术语“制剂”即为药物制剂，是指为适应治疗或预防的需要，按照一定的剂型要求所制成的，可以最终提供给用药对象使用的药品。

本公开还提供所述核酸-脂质纳米颗粒冻干制剂在制备核酸药物中的用途。

本公开还提供所述核酸-脂质纳米颗粒冻干制剂在制备用于治疗有需要哺乳动物的疾病或病症的药物中的用途，其中所述疾病或病症选自由以下组成的组：感染性疾病、癌症和增生性疾病、遗传性疾病、自体免疫性疾病、糖尿病、神经退化性疾病、心血管和肾血管疾病以及代谢性疾病。

本公开所述感染性疾病选自：由冠状病毒、流感病毒或HIV病毒引起的疾病、小儿肺炎、裂谷热、黄热病、狂犬病或多种疱疹。

本公开所述哺乳动物是人。

本公开所述组合物经静脉内、肌肉内、皮内、皮下、鼻内或通过吸入施用。

本公开所述组合物是皮下施用的。

本公开将0.001mg/kg至10mg/kg剂量的所述药物施用给所述哺乳动物。

下面通过具体实施的方式来进一步说明本公开的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本公开，不应视为对本公开的具体限制。

实施例1

1）模型mRNA-LNP样品溶液制备：

样品1（mRNA-LNP（YK-009））

以编码SAR S-CoV-2棘突蛋白（S蛋白）的DNA（购自金斯瑞生物科技股份有限公司，名称：YKYY009-L01，批号：YKYY009(Bsa I) P220701）为模板，转录得到的mRNA作为模型mRNA，以未加入保护剂、未冷冻干燥的mRNA-脂质纳米颗粒(即mRNA-LNP)为模型样品。制备过程如下：

（i）制备mRNA

1-1）试剂解冻

a）室温解冻10×Transcription Buffer和4种核糖核苷酸（ATP、CTP、GTP、UTP），充分混匀后，短暂离心；10×Transcription Buffer置于室温，4种核糖核苷酸置于冰上，备用。

b）分别将T7 RNA Polymerase、Inorganic Pyrophosphatase和Murine RNaseInhibitor混匀后，短暂离心，置于冰上，备用。

1-2）转录

选择共转录法加帽，则按表1配制共转录加帽体系：

表1 共转录加帽体系

注：DNA模板需要后加入。由于10×Transcription Buffer中含有亚精胺，亚精胺浓度过高会引起DNA模板沉淀。

试剂信息：

无核酸酶水RNase-free H₂O，厂家：Solarbio Life Sciences；货号：R1600；

转录缓冲液Transcription Buffer，厂家：翌圣生物科技(上海)股份有限公司；货号：10627ES；

胞苷三磷酸溶液CTP Solution(规格100 mM)，厂家：翌圣生物科技(上海)股份有限公司；货号：10130ES；

鸟苷三磷酸溶液GTP Solution(规格100 mM)，厂家：翌圣生物科技(上海)股份有限公司；货号：10132ES；

腺苷三磷酸溶液ATP Solution(规格100 mM)，厂家：翌圣生物科技(上海)股份有限公司；货号：10129ES；

尿苷三磷酸溶液UTP Solution(规格100 mM)，厂家：翌圣生物科技(上海)股份有限公司；货号：10131ES；

Cap1-GAG m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG (规格100mM)，厂家：翌圣生物科技(上海)股份有限公司；货号：10678ES；

模板DNA：奥密克戎变异型新冠病毒株S蛋白线性化质粒DNA，厂家：金斯瑞生物科技有限公司；批号：YKYY009(Bsa I) P220701；

T7 RNA 聚合酶Polymerase，厂家：翌圣生物科技(上海)股份有限公司；货号：10625ES；

无机焦磷酸酶Pyrophosphatase,Inorganic，厂家：翌圣生物科技(上海)股份有限公司；货号：10620ES；

鼠源RNase抑制剂Murine RNase inhibitor，厂家：翌圣生物科技(上海)股份有限公司；货号：10621ES。

1-3）孵育

将上述反应液混合均匀，短暂离心，置于37℃孵育2h。

注：①若转录本长度小于100nt，增加反应时间至4-8 h。②建议在PCR仪中进行反应，热盖打开，防止长时间导致反应液蒸发。③反应产物可能有白色沉淀。这是反应过程中游离的焦磷酸与反应液中的镁离子形成焦磷酸镁，不影响后续实验。如想去除，添加EDTA即可消失。添加EDTA如果影响后续实验，也可以离心回收上清。

1-4）DNase Ⅰ处理

转录反应完成后，每管加入1μL DNase Ⅰ（RNase-free），混匀后，短暂离心，置于37℃孵育30min以去除模板DNA。

1-5）mRNA纯化

采用氯化锂沉淀法，RNA长度要大于300nt，且浓度不能低于100ng/μL。

i）向20μL反应混合物中，加入30μL RNase-free H₂O和30μL7.5M氯化锂。

ii）混合均匀后，置于-20℃至少30min，以最大转速，4℃离心15min，收集沉淀。

iii）加入500μL冰预冷的70%乙醇洗涤RNA沉淀。

iv）用20μL RNase-free H₂O溶解mRNA沉淀。纯化后的mRNA溶液于-80℃保存。

（ii）包封

将YK-009（参照CN114044741A制备，北京悦康药业集团股份有限公司）、DSPC（日本精化株式会社）、胆固醇（日本精化株式会社）和mPEG-DMG-2K（厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司）按照49 : 10 : 39.5 : 1.5的摩尔比溶于无水乙醇中制得有机相，将上述制备得到的mRNA溶于pH4.0枸橼酸盐缓冲液中制得水相，将有机相和水相在微流控设备中（厂家：Precision NanoSystems；）快速混合进行包封（有机相和水相进液速度比为1:3，进液总速度为12mL/min，芯片型号：Ignite NxGen）。包封结束后将样品放入透析盒（Slide-A-Lyzer®Dialysis Cassette G2）中，在DPBS缓冲液中进行透析过夜，得到使用阳离子脂质/DSPC/胆固醇/mPEG-DMG-2K包封的mRNA-LNP样品。

2）冷冻干燥保护剂的制备

将蔗糖和甘露醇以质量比7.5 : 2.5溶解在无核酸酶水中，配制成冷冻干燥保护剂溶液。

表2 处方成分和含量

3）采用冷冻干燥保护剂制备mRNA-LNP冻干制剂

将步骤2）配制的冷冻干燥保护剂（即，冻干保护剂）溶液，加入到模型mRNA-LNP样品1中，混合均匀，得到待冻干混合液；使得在待冻干混合液中蔗糖的质量浓度为7.5%，甘露醇为2.5%。之后分装至西林瓶中，每瓶0.5 mL，进行冷冻干燥。

冷冻干燥程序：

预冻阶段：-5℃ 0.5 h，-15℃ 0.5 h，-25℃ 0.5 h，-35℃ 0.5 h，-45℃ 0.5 h；

升华干燥阶段：-40℃ 50 h，-25℃ 20 h，-15℃ 6 h，-5℃ 6 h；

解吸干燥阶段：15℃ 2 h，30℃ 1.5 h；

全程真空压力控制 ≤ 0.05 mbar。

打开化霜阀门，打开UPS电源，打开自动程序，于冷冻干燥机中设定上述程序（厂家：东富龙科技集团股份有限公司；型号：LYO-0.5），待冷冻干燥程序结束后缓慢打开进气阀，使腔内压力缓慢上升，直至常压出箱即可。

实施例2 单组分冷冻干燥保护剂

2-1 单组分种类

在实施例1的基础上，将第2）部分“冷冻干燥保护剂的制备”中的双组分冷冻干燥保护剂蔗糖和甘露醇替换为浓度为以下单组分冷冻干燥保护剂成分或不添加：

2-1-1：蔗糖；

2-1-2：甘露醇；

2-1-3：海藻糖；

2-1-4：麦芽糖精；

2-1-5：不添加；

冻干保护剂在待冻干混合液中的质量浓度为10%，溶剂和其他步骤与实施例1保持一致。

2-2 单组分浓度

在实施例1的基础上，将双组分冷冻干燥保护剂的处方（待冻干混合液中，冻干保护剂的总浓度为10%，蔗糖和甘露醇的浓度分别为7.5%和2.5%）替换为以下单组分冷冻干燥保护剂处方：

2-2-1：待冻干混合液中蔗糖浓度为2.5%；

2-2-2：待冻干混合液中蔗糖浓度为5%；

2-2-3：待冻干混合液中蔗糖浓度为15%；

2-2-4：待冻干混合液中蔗糖浓度为20%；

其他步骤与实施例1保持一致。

实施例3 双组分冷冻干燥保护剂

在实施例1的基础上，将第2）部分“冷冻干燥保护剂的制备”中蔗糖：甘露醇 = 7.5: 2.5替换为：

3-1：蔗糖：甘露醇 = 5 : 5；

3-2：蔗糖：海藻糖 = 5 : 5；

3-3：蔗糖：麦芽糊精 = 5 : 5；

3-4：甘露醇：海藻糖 = 5 : 5；

3-5：甘露醇：麦芽糊精 = 5 : 5；

3-6：海藻糖：麦芽糊精 = 5 : 5；

冻干保护剂在待冻干混合液中的总浓度为10%，溶剂和其他步骤与实施例1保持一致。

实施例4 三组分或四组分冷冻干燥保护剂

在实施例1的基础上，将第2）部分“冷冻干燥保护剂的制备”中蔗糖：甘露醇 = 7.5: 2.5替换为：

4-1：蔗糖：甘露醇：海藻糖 = 5 : 5 : 5，待冻干混合液中冻干保护剂的总浓度为15%；

4-2：蔗糖：甘露醇：麦芽糊精 = 5 : 5 : 5待冻干混合液中冻干保护剂的总浓度为15%；

4-3：蔗糖：甘露醇：海藻糖：麦芽糖精 = 5 : 5 : 5 : 5，待冻干混合液中冻干保护剂的总浓度为20%；

溶剂和其他步骤与实施例1保持一致。

实施例5 甘露醇和蔗糖用量比影响

在实施例1的基础上，将第2）部分“冷冻干燥保护剂的制备”中蔗糖：甘露醇 = 7.5: 2.5（待冻干混合液中冻干保护剂的总浓度为10%）的用量比替换为：

5-1：待冻干混合液中冻干保护剂的总浓度为10%；其中，蔗糖：甘露醇 = 9 : 1；

5-2：待冻干混合液中冻干保护剂的总浓度为10%；其中，蔗糖：甘露醇 = 6.5 :3.5；

5-3：待冻干混合液中冻干保护剂的总浓度为10%；其中，蔗糖：甘露醇 = 3.5 :6.5；

5-4：待冻干混合液中冻干保护剂的总浓度为10%；其中，蔗糖：甘露醇 = 2.5 :7.5；

5-5：待冻干混合液中冻干保护剂的总浓度为10%；其中，蔗糖：甘露醇 = 1 : 9；

5-6：待冻干混合液中冻干保护剂的总浓度为5%；其中，蔗糖：甘露醇 = 1 : 4；

5-7：待冻干混合液中冻干保护剂的总浓度为5%；其中，蔗糖：甘露醇 = 4 : 1；

5-8：待冻干混合液中冻干保护剂的总浓度为16%；其中，蔗糖：甘露醇 = 15 : 1；

5-9：待冻干混合液中冻干保护剂的总浓度为16%；其中，蔗糖：甘露醇 = 1 : 15；

其他成分和步骤与实施例1保持一致。

实施例6 升华干燥

6-1 升华干燥方式的影响

在实施例1的基础上，将第3）部分“冷冻干燥程序”中升华干燥“-40℃ 50 h，-25℃20 h，-15℃ 6 h，-5℃ 6 h”替换为：

6-1：-40℃ 50 h，-35℃ 20 h，-15℃ 6 h，0℃ 6 h；

6-2：-35℃ 50 h，-25℃ 20 h，-10℃ 6 h，0℃ 6 h；

6-3：-35℃ 70 h，-15℃ 12 h；

6-4：-35℃ 82 h；

6-5：-25℃ 82 h；

其他成分和冷冻干燥步骤与实施例1保持一致。

6-2 升华干燥时间的影响

在实施例1的基础上，将第3）部分“冷冻干燥程序”中升华干燥“-40℃ 50 h，-25℃20 h，-15℃ 6 h，-5℃ 6 h”替换为：

6-6：-40℃ 20 h，-25℃ 20 h，-15℃ 5 h，-5℃ 5 h；

6-7：-45℃ 2 h，-25℃ 2 h，-5℃ 2 h；

其他成分和冷冻干燥步骤与实施例1保持一致。

实施例7 预冻

在实施例1的基础上，将第3）部分“冷冻干燥程序”中预冻“-5℃ 0.5 h，-15℃ 0.5h，-25℃ 0.5 h，-35℃ 0.5 h，-45℃ 0.5 h”替换为：

7-1：液氮2.5 h；

7-2：-45℃ 2.5 h；

7-3：-80℃ 4 h；

7-4：-60℃ 4 h；

7-5：-50℃ 4 h；

其他成分和冷冻干燥步骤与实施例1保持一致。

实施例8 不同mRNA-LNP的适用情况

在实施例1的基础上，将样品1（mRNA-LNP（YK-009））中包载的mRNA脂质替换为以下不同脂质，其他步骤与实施例1保持一致。其中，样品1中包载mRNA的脂质（YK-009）结构式如下：

(I-I)

8-1：样品2（mRNA-LNP（YK-401））（其中YK-401参照专利CN 115784921 A制备）；其中，样品2中包载mRNA的脂质（YK-401）结构式如下：

(II-I)

8-2：样品3（mRNA-LNP（YK-305））（其中YK-305参照专利CN 115745820 A制备）；其中，样品3中包载mRNA的脂质（YK-305）结构式如下：

(IV-I)

8-3：样品4（mRNA-LNP（ALC0315））；其中，样品4中包载mRNA的脂质（ALC0315购自厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司）结构式如下：

(V-I)

8-4：样品5（mRNA-LNP（SM102））；其中，样品5中包载mRNA的脂质（SM102购自厦门赛诺邦格生物科技股份有限公司）结构式如下：

(VI-I)

8-5：样品6（ mRNA-LNP（DLIN-MC3-DMA））；其中，样品4中包载mRNA的脂质（DLIN-MC3-DMA购自艾伟拓上海医药科技有限公司）结构式如下：

（VII）。

实施例9 mRNA-LNP中，LNP中不同阳离子脂质、中性脂质、结构性脂质、聚合物共轭脂质的摩尔比，对细胞毒性的影响

在实施例8的基础上，将样品1（mRNA-LNP（YK-009））中阳离子脂质、中性脂质、结构性脂质、以及聚合物共轭脂质的摩尔比49:10:39.5:1.5，替换为：

9-1：样品1（mRNA-LNP（YK-009）），阳离子脂质：中性脂质：结构性脂质：聚合物共轭脂质的摩尔比= 40:10:48.5:1.5；

9-2：样品1（mRNA-LNP（YK-009）），阳离子脂质：中性脂质：结构性脂质：聚合物共轭脂质的摩尔比=35:10:53.5:1.5；

9-3：样品1（mRNA-LNP（YK-009）），阳离子脂质：中性脂质：结构性脂质：聚合物共轭脂质的摩尔比=75:5:15:5；

9-4：样品1（mRNA-LNP（YK-009）），阳离子脂质：中性脂质：结构性脂质：聚合物共轭脂质的摩尔比=25:5:65:5；

9-5：样品2（mRNA-LNP（YK-401）），阳离子脂质：中性脂质：结构性脂质：聚合物共轭脂质的摩尔比= 40:10:48.5:1.5；

9-6：样品2（mRNA-LNP（YK-401）），阳离子脂质：中性脂质：结构性脂质：聚合物共轭脂质的摩尔比=35:10:53.5:1.5；

9-7：样品2（mRNA-LNP（YK-401）），阳离子脂质：中性脂质：结构性脂质：聚合物共轭脂质的摩尔比=75:5:15:5；

9-8：样品2（mRNA-LNP（YK-401）），阳离子脂质：中性脂质：结构性脂质：聚合物共轭脂质的摩尔比=25:5:65:5；

其他步骤与实施例8保持一致。

对比例1

采用本公开实施例1的样品1（mRNA-LNP（YK009）），采用专利CN 114557971 A公开的冷冻干燥保护剂和冷冻干燥方法进行冻干。

对比例2

采用本公开实施例1的样品1（mRNA-LNP（YK009）），采用专利CN 103690943 A公开的冷冻干燥保护剂和冷冻干燥方法进行冻干。

实验例1 理化特性

1-1 将mRNA-LNP样品及其冻干制剂进行如下检测：

1）粒径和粒径分布系数（PDI）：利用动态光散射法（DLS）于纳米激光粒度仪（厂家：MALVERN； 型号：ZSU3305）在25 ± 1℃进行粒径和PDI检测，取样品60 μL，放入石英微量样品池中进行检测，检测参数设置如下表：

表3 检测参数

粒径和PDI是表征脂质体的重要的特征，冻融过程中存在脂质体融合过程，小粒径脂质体融合成粒径稍大的脂质体，随着冻融次数的增加脂质体粒径会变大。在一定范围内，粒径越小，冻干后粒径变化越小，表明产品质量和工艺越好。PDI表示粒径的分布情况，其数值越小，表明脂质体颗粒大小越均一。

脂质体的粒径和粒径分布与其包封率和稳定性有关，直接影响脂质体在机体组织的行为，是评价其生物化学、生物物理学及药物传递系统的重要参数，影响着产品的体内生物分布和药物药代动力学等性质。

另外，研究表明，粒径在20~200 nm之间的脂质体是局部应用药物通过细胞间渗透途径进入活表皮的活性载体。因为，该范围的粒径大小既能承受血液和淋巴等流体的流动，同时能穿过细胞间质。mRNA-LNP的大小可能会影响LNP的内化、生物分布、降解和清除，且不同的应用可能需要不同的粒径大小。例如，在小鼠模型中，皮下给药时，45nm-siRNA-LNP的递送效率最好；而静脉给药时，80nm-siRNA-LNP则最有效。又如，在啮齿动物和非人灵长类动物中对不同mRNA-LNP粒径大小的比较表明，当采用肌肉注射时，啮齿动物对粒径大小的敏感程度高于非人灵长类动物。（Egbaria K, Weiner N. Liposomes as a topical drugdelivery system[J]. Adv Drug Del Rev 1990; 5: 287–300）。Desai MP, LabhasetwarV等人对于粒径与表面电荷影响脂质体体内药物靶向递送进行了相关的探讨，粒子大小在200 nm以内具有较高的透膜性，当控制在100 nm以内时透膜性更优（Desai MP,Labhasetwar V, Amidon GL, et al. Gastrointestinal uptake of biodegradablemicroparticles: effect of particle size[J]. Pharm Res, 1996, 13: 1838-1845）。纳米粒子的透膜性随其粒径的增加而减少，被动转运膜的粒径临界值为500 nm，大于500nm的粒子很难跨越极性上皮细胞进入循环系统。粒径为500 nm ~ 10 μm的固体颗粒均可被吞噬性细胞所摄取，且细胞吞噬作用随其粒径的增大而增强 （Groves E, Dart AE,Covarelli V, et al. Molecular mechanisms of phagocytic uptake in mammaliancells[J]. Cell Mol Life Sci, 2008, 65: 1957-1976） 、 （Champion JA, MitragotriS. Role of target geometry in phagocytosis[J]. Proc Natl USA, 2006, 103:4930-4934）。

2）包封率：将样品稀释到2.8 μg/mL，一部分与等体积（50 μL）Triton X-100混合，充分破乳，用于测定总mRNA浓度，另一部分与等体积（50 μL）TE（Tris-EDTA）混合，用于测定游离未包封的mRNA浓度。将分别加了TE（Tris-EDTA）和Triton X-100的样品于37℃孵育一定时间后，加入100 μL稀释200倍后的Ribogreen试剂，离心去除气泡后使用多功能酶标仪，选择激发波长485 nm、发射波长528 nm下测荧光值，读板。

mRNA药物在研发过程中，其稳定性和药物递送是需要面临的主要挑战。裸露的mRNA很容易受到体内RNA切割酶的攻击，导致mRNA在细胞内的翻译降低。因此，需要用载体（如脂质体）安全地递送。包封率是脂质体的关键质量属性，它指的是包封在脂质双分子层中的药物含量占总投药量的百分比，即被包裹物质（如某药物）占药物总量的百分量，能反映出脂质体中药物包封程度的高低，以指导制备工艺的改进。包封率越高代表被脂质体包裹的mRNA比例越大，裸露的mRNA比例越小。过低的包封率意味着未被包裹保护的mRNA比例过高，mRNA极不稳定，未被包裹的mRNA很容易被降解。

3）完整性：利用试剂盒将mRNA-LNP中mRNA提取，稀释后65℃变性，供试品制备完成后置于冰上。另外，配制凝胶缓冲液，将准备好的供试品溶液、凝胶缓冲液和无核糖核酸酶水依次加入样品盘中，用PA800 Plus凝胶电泳原理测定样品mRNA完整性谱图。

尽管mRNA被脂质体包封保护起来，可是在制剂制备、运输和长期储存过程中mRNA仍可能会发生降解，直接影响核酸药物在体内的表达效果。因此评价mRNA完整性，对于产品质量保证和优化制造工艺至关重要。mRNA完整性越高，表明产品质量和工艺越好。

4）水分：取待测样品约300 mg，精密称定，照水分测定法（中国药典2020年版四部通则0832第一法1）于卡尔费休水分测定仪V30s测定，供试品2份进行平行测定，根据水分含量平均值进行计算。

水分是评价冻干产品质量的关键指标，也是评价冻干工艺的关键指标，水分高说明冻干工艺未能除去产品中的水分，水分高会导致产品稳定性降低。

5）复溶时间：向冻干待测样品中加入0.5 mL的无核酸酶水进行复溶，观察并记录复溶所需时间。

复溶时间也是评价产品质量和冻干工艺的指标，复溶时间越短，越有利于临床使用。

1-2 稳定性检测

将上述实施例中进行冷冻干燥后得到的制剂产品分别在2~8℃、室温及40℃下各放置3个月，分别对放置0天、14天、1个月、2个月、3个月时的制剂样品进行粒径和PDI、包封率和完整性检测，衡量其稳定性。

实验例2 生物学特性

细胞毒性实验：将供试品按照每孔1μg加入96孔板的细胞培养液中，继续培养24小时后，向每孔中加入10 μL CCK-8溶液，将培养板放回培养箱中继续孵育1小时后，经酶标仪测定在450 nm处的吸光度。

转染效率实验：首先将供试品制剂按照每孔200 ng加入到24孔板的细胞培养液中，继续培养18~24小时。随后收集细胞提取蛋白，经过SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（硝酸纤维素薄膜）上。以固相载体上的蛋白质作为抗原，与特异性抗体起免疫反应，再与辣根过氧化酶标记的二抗反应，底物显色经多功能成像仪检测特异性目的基因表达的蛋白成分。

结论分析1：

（一）单组分种类：①与不添加冻干保护剂相比，添加冻干保护剂后进行冷冻干燥，能显著改善样品的粒径尺寸和均一性、包封率、完整性、以及复溶效果；②相较于甘露醇、海藻糖或麦芽糊精，采用蔗糖作为冻干保护剂，效果最好：

实施例2-1分别将蔗糖、甘露醇、海藻糖和麦芽糊精溶液作为冻干保护剂加入到样品1（mRNA-LNP（YK009））溶液中进行冷冻干燥，考察各成分对样品冷冻干燥效果的影响。 实验采用的冻干保护剂的处方如下：

表4 冻干保护剂处方

检测mRNA-LNP样品及其冻干制剂（室温25℃，冻干后0天）的粒径、PDI、包封率、完整性、含水量和复溶时间的结果如下：

粒径和PDI：

表5 粒径（nm）和PDI比较

包封率：

表6 包封率（%）比较

完整性：

表7 完整性（%）比较

含水量和复溶时间：

表8 冻干制剂水分和复溶时间比较

结论：

1）粒径和粒径分布系数PDI：

实施例2-1-5未添加冻干保护剂，粒径最大，为830.6 nm，较冻干前增加约750 nm；PDI增加了约0.52，呈现显著增加的趋势，表明mRNA-LNP大小均一度显著变差。

实施例2-1-2~2-1-4分别添加了甘露醇、海藻糖和麦芽糊精，粒径也呈现明显增加趋势，复溶后粒径增加了260~500 nm左右；PDI增加了0.38~0.45左右，表明mRNA-LNP大小均一度变差。

实施例2-1-1添加蔗糖作为冻干保护剂，粒径最小，为120.6 nm，仅增加了36 nm左右，且PDI无明显增加。冻干前后粒径变化小，表明产品质量和工艺越好。PDI无明显增加，表明mRNA-LNP大小均一性良好且显著。

实验结果表明，添加蔗糖、甘露醇、海藻糖或麦芽糊精作为冻干保护剂，相较于未加冻干保护剂的冻干制剂能起到改善产品颗粒大小以及均一性的作用；其中，在添加单组分蔗糖作为冻干保护剂的样品中，冻干后粒径和PDI变化最小，均一性最优。

2）包封率：

实施例2-1-5不采用冻干保护剂，包封率下降最多，由93.1%下降到12.1%，降低了81%。实施例2-1-3和2-2-4分别添加海藻糖和麦芽糊精，包封率分别下降了38%和42%。包封率下降显著，表明未被包裹保护的mRNA比例过高，由于mRNA极不稳定，未被包裹的mRNA很容易被降解。

实施例2-1-1添加蔗糖作为冻干保护剂，在冻干前后变化最小，包封率仅变化9.1%。其次是实施例2-1-2添加了甘露醇，包封率变化11.9%。包封率越高代表被脂质体包裹的mRNA比例越大，裸露的mRNA比例越小，发生mRNA降解越少。

实验结果表明，添加蔗糖、甘露醇、海藻糖或麦芽糊精作为冻干保护剂，相较于未加冻干保护剂的冻干制剂能起到改善包封率的作用；其中，添加单组分蔗糖作为冻干保护剂的冻干制剂，包封率最高，mRNA最稳定，不易被降解。

3）完整性：

实施例2-1-5不采用冻干保护剂，完整性降低最显著，由83.6%下降到55.3%，降低了28.3%。实施例2-1-3和2-2-4分别添加海藻糖和麦芽糊精，完整性分别降低了13.3%和15.2%，完整性也呈现显著降低的趋势。

实施例2-1-1和2-1-2分别添加蔗糖和甘露醇作为冻干保护剂，其完整性在冻干前后变化较小，仅下降2.8%和6.6%，其中实施例2-1-1完整性更优。

由实验结果表明，未加冻干保护剂的冻干制剂mRNA完整性减低最多，在只加一种冻干保护剂的冻干制剂中，以蔗糖为冻干保护剂的冻干制剂mRNA完整性变化最小。

4）含水量和复溶时间：

实施例2-1-5不采用冻干保护剂和实施例2-1-4添加麦芽糊精制备的冻干制剂含水量较高，超过了3%，可能会影响长期稳定保存；实施例2-1-2和2-1-3分别添加甘露醇溶液和海藻糖溶液，冻干制剂含水量未超过3%，但复溶时间较长，大于60 s。

实施例2-1-1添加蔗糖作为冻干保护剂，其含水量最低，约1.4%，复溶时间最短，小于10 s。

由以上结果可知，实施例2-1-5未添加冻干保护剂，粒径最大，包封率和完整性最低，可见不添加冻干保护剂冻干后效果最差。实施例2-1-1~2-1-4分别添加蔗糖、甘露醇、海藻糖和麦芽糊精作为冻干保护剂的情况下，添加蔗糖的冻干制剂结构变化最小，含水量最低，复溶时间短，冻干效果最好。

小结：

相较于不添加冻干保护剂制备mRNA-LNP冻干制剂，添加冻干保护剂能显著改善冻干制剂的粒径尺寸和均一性、包封率、完整性、以及复溶效果；

其中，添加冻干保护剂对mRNA-LNP样品进行冷冻干燥时，相较于甘露醇、海藻糖或麦芽糊精等其他冻干保护剂，采用蔗糖作为冻干保护剂添加到mRNA-LNP样品溶液进行冷冻干燥，效果最好，具体来说：

mRNA-LNP样品中加入蔗糖作为冻干保护剂，进行冷冻干燥制备冻干制剂（实施例2-1-1），其粒径增加36.6 nm、PDI无明显变化、包封率降低9.1%、完整性降低2.8%，且含水量最少，约1.4%，复溶时间小于10 s；

mRNA-LNP样品中分别加入甘露醇、海藻糖或麦芽糊精作为冻干保护剂，进行冷冻干燥制备冻干制剂（实施例2-1-2~2-1-4），粒径增加260 nm~500 nm左右、PDI增加0.4左右，包封率降低11.9~42%、完整性降低6.6~15.2%，含水量超过2%，且添加甘露醇和海藻糖的冻干制剂复溶时间大于60 s，冻干效果较使用蔗糖溶液差；

不添加冻干保护剂，直接对mRNA-LNP样品进行冷冻干燥制备冻干制剂（实施例2-1-5），粒径增加约750 nm、PDI增加0.5左右，包封率降低81%、完整性降低28.3%，且含水量3.8%，冻干效果最差。

（二）单组分浓度：采用蔗糖作为冻干保护剂，浓度为5~15%冻干效果良好；当浓度为10%时，冻干效果最好。

由实施例2-1结果可知，单组分冻干保护剂中蔗糖效果最好，因此实施例2-2改变蔗糖在待冻干混合液（冻干保护剂溶液和mRNA-LNP样品溶液的混合液）中的浓度，分别对样品进行冷冻干燥，比较不同浓度蔗糖的冻干保护效果。

待冻干混合液中蔗糖的浓度如下：

表9 蔗糖浓度

检测mRNA-LNP样品及其冻干制剂（室温25℃，冻干后0天）的粒径、PDI、包封率和完整性，含水量和复溶时间结果如下：

粒径和PDI：

表10 粒径（nm）和PDI比较

包封率：

表11 包封率（%）比较

完整性：

表12 完整性（%）比较

含水量和复溶时间：

表13 冻干制剂水分和复溶时间比较

结论：

1）粒径和PDI：无论何种冻干保护剂，其冻干制剂PDI均无明显增加。实施例2-1-1中蔗糖浓度为10%，粒径变化最小，仅增加了36.6 nm。其次是实施例2-2-2和2-2-3，蔗糖浓度分别为5%和15%，粒径增加了55.2 nm和52.6 nm。实施例2-2-1和2-2-4蔗糖浓度分别为2.5%和20%，两者粒径增加较明显，分别为81.8 nm和82.6 nm。综上所述，仅添加蔗糖作为冻干保护剂的情况下，10%浓度为最优，其次是5%和15%， 2.5%和20%最差。

2）包封率：实施例2-1-1（10%蔗糖）包封率下降最少，降低了9.1%，其次是实施例2-2-2（5%蔗糖）和2-2-3（15%蔗糖），为12.3%和13.6%，降低最多的是实施例2-2-1（2.5%蔗糖）和2-2-4（20%蔗糖），降低了21.6%和19.3%。

3）完整性：实施例2-1-1（10%蔗糖）完整性变化最小，降低了2.8%；实施例2-2-1（2.5%蔗糖）和2-2-4（20%蔗糖）完整性变化最大，分别为10.3%和11.8%。

4）含水量和复溶时间：所有组的冻干制剂含水量都较少，未超过3%，其中，实施例2-1-1（10%蔗糖）和2-2-1~2-2-3（2.5%、5%和15%蔗糖）含水量较低，约1.3%左右；实施例2-2-4（20%蔗糖）的含水量最高，约为1.6%。复溶时间均小于10 s。

由以上结果可知，实施例2-1-1、2-2-2和2-2-3对比冻干前样品，粒径、PDI、包封率和完整性变化较小，含水量较小，且复溶时间小于10 s。因此，蔗糖浓度应控制在5~15%，其冻干保护效果好，其中10%冻干效果最好。

小结：采用蔗糖作为冻干保护剂，对mRNA-LNP样品溶液进行冷冻干燥，控制待冻干混合液中冻干保护剂浓度为5~15%，其冻干效果良好；当浓度为10%时，冻干效果最好；具体来说：

采用蔗糖浓度为5~15%（例如，实施例2-2-2的10%和实施例2-2-3的15%）对mRNA-LNP样品进行冷冻干燥制得的冻干制剂粒径增加36.6~55.2 nm、PDI无明显变化，包封率降低约9~13%、完整性降低2.8~5.7%，含水量约1.3%，复溶时间小于10 s。

其中，蔗糖浓度为10%（例如，实施例2-1-1）时粒径均一性最好（仅增加36.6 nm）、包封率（仅降低9.1%）和完整性（仅降低2.8%）最优。

反之，采用本公开范围之外的其他蔗糖浓度（例如，实施例2-2-4的20%、实施例2-2-1的2.5%）对mRNA-LNP样品进行冷冻干燥，制得的冻干制剂粒径增加较多，增加了82.6 nm（比蔗糖浓度为10%，增加量多46.0 nm），粒径均一性下降显著；包封率和完整性下降幅度大，分别下降19.3~21.6%（比蔗糖浓度为10%，下降量多10.2~12.5%）和10.3~11.8%（比蔗糖浓度为10%，下降量多7.5~9.0%），冻干效果差。

结论分析2：采用蔗糖、甘露醇、海藻糖和麦芽糊精中任意两种组合作为冻干保护剂时，蔗糖和甘露醇组合的粒度均一性、包封率、完整性和水分含量最好，且优于蔗糖单一成分。

实施例3将蔗糖、甘露醇、海藻糖和麦芽糊精中两种组合成分作为冻干保护剂，加入到mRNA-LNP样品中进行冷冻干燥制备冻干制剂。采用成分和比例及在待冻干混合液中的浓度如下：

表14 冻干保护剂处方和浓度

检测mRNA-LNP样品及其冻干制剂（室温25℃，冻干后0天）的粒径、PDI、包封率和完整性，含水量和复溶时间，对比冻干效果结果如下：

粒径和PDI：

表15 粒径（nm）和PDI比较

包封率：

表16 包封率（%）比较

完整性：

表17 完整性（%）比较

含水量和复溶时间：

表18 冻干制剂水分和复溶时间比较

结论：

1）粒径和PDI：实施例3-1（蔗糖：甘露醇 = 5 : 5）粒径变化最小，较冻干前仅增大了25.3 nm，小于实施例2-1-1只使用蔗糖溶液的样品。与此同时，PDI无明显增加，表明mRNA-LNP冻干制剂颗粒大小均一性较好。其他组合如实施例3-2~3-6粒径变化明显增大，增加了336.8 nm~642 nm。粒径变化大，表明产品质量和工艺较差。

2）包封率：实施例3-1包封率变化最小，降低了7.2%，变化小于实施例2-1-1；实施例3-2~3-6变化较大，减少20~53.7%。

3）完整性：实施例3-1完整性变化最小，由82.7%下降到82.1%，仅下降0.6%，变化小于实施例2-1-1。实施例3-2~3-6变化较大，完整性减少了10.6~16.7%。

4）含水量和复溶时间：除实施例3-3（蔗糖：麦芽糊精 = 5 : 5）含水量超过3%外，添加其他组合的冻干制剂含水量都较少。其中，实施例3-1含水量最低，为0.857%，低于实施例2-1-1。

由以上结果可知，采用蔗糖、甘露醇、海藻糖和麦芽糊精中任意二者组合作为冻干保护剂时，蔗糖和甘露醇组合溶液作为冻干保护剂制备的mRNA-LNP冻干制剂相较于mRNA-LNP样品变化最小，且小于使用仅含有蔗糖的冻干制剂。表明蔗糖和甘露醇组合的保护效果好于其他两种成分组合或使用单一成分。

小结：采用蔗糖、甘露醇、海藻糖和麦芽糊精中任意两种成分组合作为冻干保护剂时，蔗糖和甘露醇组合的粒度均一性、包封率、完整性和水分含量最好，且优于蔗糖单一成分；具体来说：

采用蔗糖和甘露醇二者组合（例如，实施例3-1）配制成冻干保护剂加入到mRNA-LNP样品中，最终冻干保护剂浓度为10%，进行冷冻干燥制备冻干制剂（实施例3-1），粒径增加25.3 nm、PDI无明显变化，包封率降低7.2%、完整性降低0.6%，冻干样品含水量约0.8%，复溶时间小于10 s；

采用其他二者组合（例如，实施例3-2~3-6蔗糖和海藻糖、蔗糖和麦芽糊精、甘露醇和海藻糖、甘露醇和麦芽糊精、海藻糖和麦芽糊精），配制成冻干保护剂添加到mRNA-LNP样品中，进行冷冻干燥制备冻干制剂，粒径增加336.8~642 nm；包封率和完整性分别下降20~53.7%和10.6~16.7%；冻干制剂含水量约1.2~3.0%。mRNA-LNP理化特性、包裹mRNA比例和完整性变化程度显著高于蔗糖和甘露醇组合（粒径增加量相差311.5~616.7 nm、包封率下降量相差12.8~46.5%、完整性下降量相差10.0~16.1%），含水量也较添加蔗糖甘露醇二者组合显著增加（增加约0.4~2.2%）；

仅使用蔗糖单一组分作为冻干保护剂（实施例2-1-1、实施例2-2-1~2-2-4）制备的mRNA-LNP冻干制剂粒径最少增加36.6 nm（实施例2-1-1）、包封率降低最少9.1%（实施例2-1-1）、以及完整性变化2.8%（实施例2-1-1），含水量均超过1%。以上冻干制剂采用的冻干保护剂的保护效果均显著差于蔗糖和甘露醇组合的冻干保护剂（粒径增加量相差11.3 nm以上、包封率下降量相差1.9%以上、完整性下降量相差2.2%以上），含水量也较添加蔗糖甘露醇二者组合显著增加（增加0.5%以上）。

结论分析3：采用蔗糖和甘露醇二者组成作为冻干保护剂，冻干制剂的粒度均一性、包封率、完整性和水分含量，优于蔗糖、甘露醇、海藻糖、麦芽糊精任意三者或四者组合。

由实施例3对比结果可知，采用两种成分组合作为冻干保护剂，蔗糖和甘露醇的组合效果最好。因此，实施例4在蔗糖和甘露醇的基础上添加一种或两种成分配制成冻干保护剂对比冻干效果，明确增加一种或两种成分是否能够提高保护效果。本实施例处方选用的成分和比例及在待冻干混合液中的总浓度如下：

表19 冻干保护剂处方

检测样品冻干前和冻干复溶后（室温25℃，0天）的粒径、PDI、包封率和完整性，冻干后（室温25℃，0天）含水量和复溶时间。结果如下：

粒径和PDI：

表20 粒径（nm）和PDI比较

包封率：

表21 包封率（%）比较

完整性：

表22 完整性（%）比较

含水量和复溶时间：

表23 冻干制剂水分和复溶时间比较

结论：

1）粒径和PDI：实施例4-1（蔗糖：甘露醇：海藻糖 = 5 : 5 : 5）粒径变化最小，增加35 nm。对比实施例3-1（蔗糖：甘露醇 = 5 : 5）粒径增加25.3 nm，增加较多。

2）包封率：实施例4-1和4-3（蔗糖：甘露醇：海藻糖：麦芽糖 = 5 : 5 : 5 : 5）包封率变化较小，降低了9%，但较实施例3-1降低7.2%多。

3）完整性：完整性变化最小的是实施例4-1，下降1.5%，但较实施例3-1降低0.6%多。

4）含水量和复溶时间：实施例4-1含水量最少，为1.132%，但高于实施例3-1含水量0.857%。

由以上结果可知对比实施例3-1，实施例4-1~4-3粒径、包封率和完整性变化较大，即蔗糖和甘露醇的基础上增加另外成分组成冻干保护剂并不能提高保护效果，蔗糖和甘露醇两者组合的效果最好。

小结：采用蔗糖和甘露醇二者组成作为冻干保护剂制备的mRNA-LNP冻干制剂的粒度均一性、包封率、完整性和水分含量，优于蔗糖、甘露醇、海藻糖、麦芽糊精任意三者或四者组合；具体来说：

采用蔗糖和甘露醇二者组合（例如，实施例3-1）配制成冻干保护剂加入到mRNA-LNP样品中，最终冻干保护剂浓度为10%，进行冷冻干燥制备冻干制剂（实施例3-1），其粒径增加25.3 nm、PDI无明显变化，包封率降低7.2%、完整性降低0.6%，含水量约0.8%，复溶时间小于10 s。

采用蔗糖、甘露醇、海藻糖、麦芽糊精任意三者或四者组合（例如，实施例4-1~4-3）作为冻干保护剂制备mRNA-LNP冻干制剂，其保护效果均显著差于采用蔗糖和甘露醇二者组合。其中，以实施例4-1变化最小的蔗糖、甘露醇和海藻糖为例，冻干制剂粒径增加35 nm（较蔗糖和甘露醇二者组合粒径增加量多9.7 nm以上），包封率降低9%（较蔗糖和甘露醇二者组合包封率降低量高1.8%以上），完整性减少1.5%（较蔗糖和甘露醇二者组合完整性减少量高0.9%以上），以及含水1.132%（是蔗糖和甘露醇二者组合含水量的近1倍）；仍差于蔗糖和甘露醇二者的效果。

结论分析4：①蔗糖和甘露醇配比为9~2.5：1~7.5，并且待冻干混合液中冻干保护剂浓度为10%，冷冻干燥保护效果显著优于其他用量组合；②蔗糖和甘露醇配比为7.5 :2.5效果最好。

由实施例2~4的实验结果可知，蔗糖和甘露醇两种成分组合配制成的冻干保护剂保护效果最好。因此实施例5将蔗糖和甘露醇按不同比例组合配制成冻干保护剂加入到样品1溶液进行冷冻干燥，筛选出保护效果最好的成分配比。采用的处方成分配比如下：

表24 冻干保护剂处方

检测mRNA-LNP样品及其冻干制剂（室温25℃，冻干后0天）的粒径、PDI、包封率和完整性，含水量和复溶时间。结果如下：

粒径和PDI：

表25 粒径（nm）和PDI比较

包封率：

表26 包封率（%）比较

完整性：

表27 完整性（%）比较

含水量和复溶时间：

表28 冻干制剂水分和复溶时间比较

结论：

1）粒径和PDI：实施例1（蔗糖：甘露醇 = 7.5 : 2.5）、实施例3-1（蔗糖：甘露醇 =5 : 5）、实施例5-2~5-4（分别为蔗糖：甘露醇 = 6.5 : 3.5、蔗糖：甘露醇 = 3.5 : 6.5和蔗糖：甘露醇 = 2.5 : 7.5）粒径变化较小，约25 nm左右，其次是实施例5-1（蔗糖：甘露醇= 9 : 1）粒径增加32 nm，其他均超过50 nm。实施例1的粒径变化最小，为22.5 nm。

2）包封率：实施例1包封率变化最小，降低了6.5%，其次是实施例3-1、实施例5-1~5-4包封率降低较少，约8%左右。

3）完整性：实施例1、实施例3-1、实施例5-2~5-4完整性较好，减少了1%左右，其中实施例1完整性保持最好，仅减少了0.1%。其次是实施例5-1减少2.1%。

4）含水量和复溶时间：所有冻干制剂含水量均较少，约1%左右。其中，实施例1含水量最少，为0.697%，且复溶时间小于10 s。

由以上结果可知，实施例1、实施例3-1、实施例5-2~5-4的粒径、包封率和完整性变化较小，其中实施例1最小。表明蔗糖和甘露醇配比为9~2.5 : 1~7.5的组合的冻干保护剂且在待冻干混合液中总浓度为10%，保护效果优于其他配比的组合，其中蔗糖甘露醇配比为7.5 : 2.5的溶液保护效果最好。

小结：蔗糖和甘露醇配比为9~2.5 : 1~7.5的冻干保护剂，控制待冻干混合液中冻干保护剂的浓度为10%，冷冻干燥保护效果优于其他配比的组合，其中蔗糖和甘露醇配比为7.5 : 2.5的溶液保护效果最优。

采用蔗糖和甘露醇配比为9~2.5 : 1~7.5的冻干保护剂制备mRNA-LNP冻干制剂（实施例1、实施例3-1和实施例5-2~5-4），其粒径增加25 nm左右、PDI无明显变化，包封率降低8%左右、完整性降低1%左右，含水量1%左右，复溶时间小于10 s。

采用配比为7.5 : 2.5的蔗糖和甘露醇制备的冻干制剂（实施例1）理化特性、mRNA包裹比例和完整性变化最小，其粒径仅增加22.5 nm、包封率降低仅6.5%、完整性减少0.1%，几乎可以忽略不计，含水量仅为0.697%。

采用本公开范围外的其他配比，如蔗糖占比小于2.5（实施例5-5和5-6）、甘露醇大于7.5（实施例5-5）、以及待冻干混合液中冻干保护剂的总浓度小于10%（实施例5-6）或超过10%（实施例5-7~5-8）的溶液添加到mRNA-LNP样品溶液中进行冷冻干燥制备冻干制剂，保护效果显著差于采用本公开用量比的冻干保护剂。其粒径增加60.3~280.6 nm（较7.5 : 2.5的蔗糖和甘露醇粒径增加量多37.8~258.1 nm），包封率下降12%左右（较7.5 : 2.5的蔗糖和甘露醇包封率下降量高5.5%左右），完整性下降3.2%~8.3%（较7.5 : 2.5的蔗糖和甘露醇完整性下降量高3.1~8.2%），含水量约1.3%（较7.5 : 2.5的蔗糖和甘露醇含水量多1倍以上）左右。

结论分析5：

实施例6升华干燥程序中采用不同升温方式或时间对样品（mRNA-LNP（YK-009））进行冷冻干燥，分析制得的冻干制剂。

(一)升温方式的影响：冷冻干燥过程中，控制升华干燥方式为梯度升温时，冻干效果最好。

采用的升华干燥方式总时长相等，具体升温方式如下：

表29 升华干燥温度区别

检测mRNA-LNP样品及其冻干制剂（室温25℃，冻干后0天）的粒径、PDI、包封率和完整性，含水量和复溶时间。结果如下：

粒径和PDI：

表30 粒径（nm）和PDI比较

包封率：

表31 包封率（%）比较

完整性：

表32 完整性（%）比较

含水量和复溶时间：

表33 冻干制剂水分和复溶时间比较

结论一：

1）粒径和PDI：实施例1、实施例6-1和6-2，采用梯度升温方式进行升华干燥，粒径变化较小，分别为22.5 nm、33.3 nm和28.3 nm，且PDI无明显增加。冻干前后粒径变化小，表明产品质量和工艺越好。PDI无明显增加，表明mRNA-LNP大小均一性良好。其中采用实施例1的梯度升温模式，其粒径变化最小，均一度最优。

反之，实施例6-3~6-5，采用普通升温方式，未进行梯度温度的调控，粒径显著增加，增加了约40~60 nm，表明mRNA-LNP大小均一度显著变差。

2）包封率：实施例1、实施例6-1和6-2，采用梯度升温方式进行升华干燥，包封率在84.2~88.3%，降低程度控制在6.5~8.1%，包封率高，且冻干后降低不明显，表明被脂质体包裹的mRNA比例大，避免大量的mRNA被降解。反之，实施例6-3~6-5，采用普通升温方式，未进行梯度温度的调控，包封率较低，下降程度超过10%，高达15.5%。包封率下降显著，表明未被包裹的mRNA比例显著增加，被降解的mRNA显著增加。

3）完整性：采用梯度升温方式进行升华干燥的实施例1、实施例6-1和 6-2完整性基本没变，分别为83.2%、83.09%和83.1%，较mRNA-LNP样品仅减少0.2%左右。实施例6-3~6-5，采用普通升温方式，完整性均有减少，下降至80%以下。

4）含水量和复溶时间：虽然上述实施例的复溶时间均控制在10 s以内；但是，采用梯度升温方式的实施例1、实施例6-1和 6-2含水量较少，在1%以内。采用普通升温方式的实施例6-3 ~6-5含水均超过1%，可能会影响样品长期稳定保存。

小结：

冻干过程中，采用不同的升温方式进行升华干燥，影响制剂的粒度均一性、包封率、完整性以及含水量。其中，当控制升温方式为梯度升温时（例如，实施例1、实施例6-1和6-2），其冻干效果良好。

采用梯度升温方式进行升华干燥（例如，实施例1、实施例6-1、实施例6-2），得到冻干制剂理化特性、mRNA包裹比例和完整性变化不显著，粒径增加22.5~33.3 nm、PDI无明显变化，包封率降低6.5~8.1%、完整性降低0.1~0.2%左右，含水量0.6~0.9%左右，复溶时间小于10 s。

其中，采用更低温度的梯度升温的升华干燥方式，得到的冻干制剂（实施例1），其粒径仅增加22.5 nm、包封率降低仅6.5%、完整性减少0.1%，几乎可以忽略不计，含水量仅为0.697%，复溶时间小于10 s。

而使用普通升温方式（例如，实施例6-3~6-5）进行升华干燥得到的冻干制剂，其粒度均一性、包封率、完整性以及含水量较梯度升温方式呈现显著降低，冻干效果差于采用梯度升温的升华干燥方式。其粒径增加42~56.2 nm（较实施例1粒径增加量多19.5~33.7 nm），包封率下降约11~16%（较实施例1包封率下降量高4.5~9.5%左右），完整性下降4.8~6.5%（较实施例1完整性下降量高4.7~6.4%），含水量增加至1.1~1.4%（较实施例1含水量多1倍以上）。

(二)时长的影响：冷冻干燥时，升华干燥程序采用阶梯升温的总时长为50~100 h时，冻干效果良好。

均采用梯度升温的方式进行升华干燥，所用时长不同，具体如下：

表34 升华干燥时间区别

数据：

检测mRNA-LNP样品及其冻干制剂（室温25℃，冻干后0天）的粒径、PDI、包封率和完整性，含水量和复溶时间。结果如下：

粒径和PDI：

表35 粒径（nm）和PDI比较

包封率：

表36 包封率（%）比较

完整性：

表37 完整性（%）比较

含水量和复溶时间：

表38 冻干制剂水分和复溶时间比较

结论二

1）粒径和PDI：实施例1控制升华干燥时间达82h，粒径变化最小，增大了22.5 nm；实施例6-6控制升华干燥时间达50 h，粒径增大26 nm。当实施例6-7升华干燥时间仅为6 h时，粒径增加显著，增加了50 nm，颗粒均一性差。

2）包封率：实施例1和实施例6-6控制升华干燥时间在50~82 h时，包封率变化最小，降低了约6.5~9%，变化较小；而实施例6-7升华干燥时间仅为6 h时，变化较大，降低了16.1%，未被包裹的mRNA比例增加，导致被降解的mRNA显著增加。

3）完整性：实施例1和6-6控制升华干燥时间在50~82h时，完整性基本没变，仅减少0.1%和0.18%，几乎可以忽略不计；实施例6-7升华干燥时间仅为6 h时，有明显变化，减少了5%，完整性显著下降。

4）含水量和复溶时间：实施例1升华干燥时间为82 h时，含水量最少，为0.697%；其次是升华干燥时间为50 h的实施例6-6，含水0.942%；实施例6-7升华干燥时间仅为6 h，含水量最高，达15.8%，可能是未达到冻干时长所致，无法作为合格的冻干产品。

由以上结果可知实施例1理化特性、mRNA包裹比例和完整性变化最小，实施例6-6与实施例1相近，实施例6-7变化较大。三个方法都采用梯度升温的方式，但所用时长不同，分别为82 h、50 h和6 h。由此可见，升华干燥总时长达到50 h以上冻干效果较好。

小结：对mRNA-LNP样品进行冷冻干燥，升华干燥阶段采用梯度升温，并控制时长在50~100 h，得到的冻干制剂冻干效果良好。

采用升华干燥方式采用梯度升温50~100 h（实施例1、6-1、6-2和6-6），粒径增加30nm左右、PDI无明显变化，包封率降低不超过10%、完整性减少0.2%左右，含水量1%以内，复溶时间小于10 s。

升华干燥阶段采用普通升温，过程总时长82 h，对mRNA-LNP样品进行冷冻干燥（实施例6-3~6-5），理化特性、mRNA包裹比例和完整性变化较大，冻干效果较采用阶梯升温式差。普通升温获得的冻干制剂粒径增加约50 nm、包封率降低大于10%、完整性减少5%左右，以及含水增加至1.2%左右。

反之，升华干燥过程总时长过短，如6 h，冻干效果较差，无法作为合格的冻干产品使用。

即使采用梯度升温的升华干燥方式，但是总时长过短（实施例6-7的6 h）时，对mRNA-LNP样品进行冷冻干燥，获得的冻干制剂冻干效果差；粒径增加50 nm、包封率降低16.1%、完整性减少5%，以及含水15.8%。

结论分析6：冷冻干燥时，预冻程序需采用梯度降温或液氮预冻的方式，得到的冻干制剂颗粒均一性、包封率、完整性以及含水量良好，且显著优于普通降温。

实施例7对样品1（mRNA-LNP（YK-009））进行冷冻干燥，采用不同温度或时间进行预冻，分析制得的冻干制剂。

表39 预冻区别

检测mRNA-LNP样品及其冻干制剂（室温25℃，冻干后0天）的粒径、PDI、包封率和完整性，含水量和复溶时间。结果如下：

粒径和PDI：

表40 粒径（nm）和PDI比较

包封率：

表41 包封率（%）比较

完整性：

表42 完整性（%）比较

含水量和复溶时间：

表43 冻干制剂水分和复溶时间比较

结论：

1）粒径和PDI：实施例7-1采用液氮的方式进行预冻，粒径和PDI变化最小，为15 nm和0.0029；其次是实施例1采用梯度降温的方式进行预冻，为22.5 nm和0.0435，实施例7-2~7-5采用直接降温的方式进行预冻，得到的冻干制剂粒径和PDI变化较大，颗粒大小均一性变差。可见采用液氮预冻和梯度降温均能实现预冻效果，普通降温的方式效果较差。

2）包封率：实施例7-1和实施例1分别采用液氮预冻和梯度降温，包封率变化最小，控制在2.5~6.5%；实施例7-2~7-5采用普通降温的方式的包封率变化较大，下降约8%。

3）完整性：实施例7-1和实施例1的完整性变化最小，仅为0.1%，可以忽略不计；实施例7-2~7-5的完整性变化较大，变化量显著增加至约1~1.6%。可见液氮和梯度降温的冻干效果好于普通降温。

4）含水量和复溶时间：实施例7-1和实施例1的含水量最小（小于1%），实施例7-2~7-5的含水量均大于1%，含水量增加可导致不易储存。可见液氮和梯度降温的冻干效果好于普通降温。

小结：对mRNA-LNP样品进行冷冻干燥，预冻程序需采用梯度降温或液氮预冻的方式，得到的冻干制剂颗粒均一性、包封率、完整性以及含水量优异。

预冻采用梯度降温方式，时长2.5 h，对mRNA-LNP样品进行冷冻干燥制备冻干制剂（实施例1），粒径仅增加22.5 nm、粒径变化小；包封率降低6.5%、完整性减少0.1%，mRNA包封率和完整性变化不明显，表明冷冻干燥导致的mRNA暴露和破损的比例小，影响不明显；冻干样品含水小于1%，复溶时间小于10 s。

预冻采用液氮降温的方式（实施例7-1），复溶后粒径增加15 nm、PDI无明显变化，包封率降低2.5%、完整性减少0.1%，冻干样品含水量1%以内，复溶时间小于10 s。

反之，采用普通降温的方式，得到的冻干制剂颗粒均一性、包封率、完整性以及含水量显著差于梯度降温和液氮预冻的方式。

预冻采用普通降温方式（实施例7-2~7-5），对mRNA-LNP样品进行冷冻干燥，粒径、包封率和完整性变化较大，冻干效果差。获得的冻干制剂粒径增加35 nm左右（较梯度降温粒径增加量高13 nm左右）、包封率降低高达9%（较梯度降温包封率降低量高3%左右）、完整性减少均高于1%（梯度降温完整性仅变化0.1%），以及含水1.2%左右（是梯度降温含水量的1倍左右）。

结论分析7：本公开的冻干保护剂和冷冻干燥程序适用于不同种类的LNP（YK-009、YK401、YK305、ALC0315、SM102和DLIN-MC3-DMA）构成的mRNA-LNP样品。

为探究采用本公开的冻干保护剂及冷冻干燥程序对不同mRNA-LNP的适用效果，以及是否对其细胞毒性和转染效率有影响，进行了如下考察。样品及其冻干方法具体如下表：

表44 LNP和冻干保护剂及冷冻干燥程序

(一)理化特性

检测mRNA-LNP样品及其冻干制剂（室温25℃，冻干后0天）的粒径、PDI、包封率和完整性；基于不同LNP的类型不影响制剂的含水量，只与冻干工艺和冻干保护剂有关系，因此，此处不对含水量和复溶时间进行探究和比较。结果如下：

粒径和PDI：

表45 粒径（nm）和PDI比较

包封率：

表46 包封率（%）比较

完整性：

表47 完整性（%）比较

结论：

1）粒径和PDI：实施例1（YK-009）、实施例8-1（YK-401）和实施例8-2（YK-305）粒径变化最小（约22 nm）；实施例8-3（ALC0315）、实施例8-4（SM102）和实施例8-5（DLIN-MC3-DMA），粒径增加30 nm左右，略高于上述三个实施例，但变化幅度不大。PDI均无明显变化，颗粒均一性良好。

2）包封率：实施例1（YK-009）、实施例8-1（YK-401）和实施例8-2（YK-305）包封率变化最小（约6.2%）。实施例8-3（ALC0315）、实施例8-4（SM102）和实施例8-5（DLIN-MC3-DMA）包封率降低约11%，高于上述三个实施例，即裸露的mRNA比例较高。

3）完整性：实施例1（YK-009）、实施例8-1（YK-401）和实施例8-2（YK-305）完整性变化最小（0.1%）；实施例8-3（ALC0315）、实施例8-4（SM102）和实施例8-5（DLIN-MC3-DMA）完整性减少约1%，虽然略高于上述三个实施例，但变化不大。

以上结果表明，采用本公开的冻干保护剂对不同种类LNP（YK-009、YK-401、YK-305、ALC0315、SM102和DLIN-MC3-DMA）的mRNA-LNP样品进行冷冻干燥，获得的冻干制剂颗粒大小均一性良好，具有高的包封率和完整性，尤其对LNP为YK-009、YK401和YK305的mRNA-LNP样品冻干效果最好。

小结：采用本公开的冻干保护剂和冷冻干燥程序对不同种类LNP（例如，YK-009、YK-401、YK-305、ALC0315、SM102、DLIN-MC3-DMA）包载mRNA组成的mRNA-LNP样品进行冷冻干燥，均可获得粒度均一性、包封率、完整性良好的产品；具体来说：

采用YK-009、YK-401、YK-305、ALC0315、SM102和DLIN-MC3-DMA包载mRNA组成的mRNA-LNP样品（样品1~6）中添加本公开的冻干保护剂，配合冷冻干燥程序进行冻干，获得的冻干制剂（实施例1、实施例8-1~8-5），粒径增加20~30 nm左右、包封率降低6-10%左右，以及完整性减少0.1-1%左右。

其中，YK-009、YK-401和YK-305构成的mRNA-LNP冻干制剂（实施例1、实施例8-1~8-2）粒径变化最小（20 nm左右），包封率降低最少（约6.3%），以及完整性仅减少0.1%，冻干效果最好。

(二)生物学特性

细胞毒性

将样品1~6和样品1~6的冻干样品分别加入到细胞溶液中考察细胞毒性，结果如图1所示，图中，实施例1和实施例5-1为冻干制剂，样品1为对应的未添加冻干保护剂的未冻干试样；实施例8-1~8-5为冻干制剂，样品2~6为实施例8-1~8-5对应的未添加冻干保护剂的未冻干试样。其中，样品1~6为冻干前试样，实施例1和实施例5-1、实施例8-1~8-5为冻干后试样。

实施例1、实施例5-1为以样品1（即，mRNA-LNP（YK-009））制备的冻干样品，采用冻干效果最好以及略差的不同配比的蔗糖和甘露醇作为冻干保护剂中，加入到细胞溶液后细胞存活率无明显差别，相较于添加未冻干样品的细胞溶液也无明显差别，表明采用蔗糖和甘露醇组合作为冻干保护剂进行冷冻干燥不影响样品1的细胞毒性。

实施例8-1~8-5采用的冻干保护剂和冷冻干燥程序相同，其为以样品2~6（mRNA-LNP（YK-401）、mRNA-LNP（YK305）、mRNA-LNP（ALC0315）、mRNA-LNP（SM102）、mRNA-LNP（DLIN-MC3-DMA））制备的冻干制剂，分别加入到细胞溶液。一段时间后，添加样品2~ 6的细胞和添加实施例8-1~ 8-5冻干制剂的细胞存活率无明显差别，即样品2~6与其冻干制剂的细胞毒性无明显差别。因此，采用本公开的冻干保护剂和冷冻干燥程序制备样品2~6的冻干制剂，细胞毒性没有影响。

小结：采用本公开的冻干保护剂和冷冻干燥程序将不同种类LNP构成的mRNA-LNP样品制成冻干制剂，其细胞毒性没有变化，因此本公开的冻干保护剂适用于不同种类的mRNA-LNP样品；具体来说：

YK009、YK401、YK305、ALC0315、SM102和DLIN-MC3-DMA包载mRNA组成的mRNA-LNP样品（样品1~6）中添加本公开的冻干保护剂，配合冷冻干燥程序进行冻干，获得的冻干制剂（实施例1、实施例8-1~8-5），其细胞的存活率与加入mRNA-LNP样品的细胞溶液无明显差异。

转染效率

将样品1~6和实施例1、5-1以及实施例8-1~8-5的冻干制剂采用Western Blot的方法测定其转染效率，将不同的待测冻干前后的各个试样，按每孔200ng加入到24孔板的细胞培养液中，继续培养，随后收集细胞后提取蛋白，并转移至固相载体（硝酸纤维素薄膜）上，以固相载体上的蛋白质作为抗原，与特异性抗体起免疫反应，再与辣根过氧化酶标记的二抗反应，底物显色，产生条带，经多功能成像仪对条带进行检测。

结果如图2所示，图中，实施例1和实施例5-1为冻干制剂，样品1为对应的未添加冻干保护剂的未冻干试样；实施例8-1~8-5为冻干制剂，样品2~6为实施例8-1~8-5对应的未添加冻干保护剂的未冻干试样。

实施例1、实施例5-1的样品为以样品1（即，mRNA-LNP（YK-009））制备的冻干制剂，分别将待测未冻干样品以及冻干制剂转染细胞后，进行Western Blot检测，均可见清晰的条带，其中实施例5-1的条带较样品1和实施例1略浅。表明样品1、实施例1和实施例5-1转染的细胞中均有S蛋白的表达，其中，实施例1的转染效果与样品1相近，略好于实施例5-1。表明采用本公开蔗糖和甘露醇组合作为冻干保护剂进行冷冻干燥样品可成功转染细胞，与未冻干样品（样品1）无明显差异。

实施例8-1~8-5的样品分别为以样品2~6（mRNA-LNP（YK-401）、mRNA-LNP（YK305）、mRNA-LNP（ALC0315）、mRNA-LNP（SM102）、mRNA-LNP（DLIN-MC3-DMA））制备的冻干制剂，将其转染细胞后，进行Western Blot检测，均可见清晰条带，可成功转染细胞；S蛋白表达量略有差异，但差异不明显，细胞转染效率无明显改变；证明本公开的冷冻干燥保护剂能适用于不同种类的mRNA-LNP样品。

小结：采用本公开的冻干保护剂对不同种类的mRNA-LNP样品（YK-009、YK-401、YK-305、ALC0315、SM102、DLIN-MC3-DMA）进行冷冻干燥制成的冻干制剂可成功转染细胞。

测得细胞中S蛋白能良好表达，表达量与未冻干样品转染的细胞无明显差异。

结论分析8：在上述结论分析7不同种类的LNP的基础上，进一步探究了mRNA-LNP样品LNP中不同阳离子脂质、中性脂质、结构性脂质、以及聚合物共轭脂质的摩尔比，对其细胞毒性和转染效率的影响。

8-1、细胞毒性

将样品1和2，以及上述实施例对应的冻干样品分别加入到细胞溶液中考察细胞毒性，结果如下表所示：

表48 不同样品及LNP成分的细胞存活率

以YK-009和YK-401为例，考察LNP中，不同阳离子脂质、中性脂质、结构性脂质和聚合物共轭脂质的摩尔比的样品，分别加入到细胞溶液中考察细胞毒性，结果如图3所示，对比未添加冻干保护剂的未冻干样品与添加保护剂冻干后的冻干制剂的存活率：

实施例1、实施例8-1分别以mRNA-LNP（YK-009）和mRNA-LNP（YK-401）制备冻干样品，其中，阳离子脂质：中性脂质：结构性脂质：聚合物共轭脂质=49:10:39.5:1.5，以及实施例9-1和9-5、9-2和9-6、9-3和9-7、9-4和9-8分别以阳离子脂质：中性脂质：结构性脂质：聚合物共轭脂质=40:10:48.5:1.5、35:10:53.5:1.5、75:5:15:5、25:5:65:5的LNP制备冻干样品，上述实施例中随着阳离子脂质含量的增加，其细胞毒性逐渐增大，导致存活率呈现一定程度的降低（由98%左右降低至85%左右）；但是加入到细胞溶液后未冻干和冻干制剂的细胞存活率差别不显著（3%~6%），表明该比例的LNP进行冷冻干燥不影响细胞毒性或对细胞毒性影响不显著。

小结：采用本公开不同LNP比例构成的mRNA-LNP样品制成冻干制剂，其细胞毒性没有变化，因此本公开的冻干保护剂适用于不同LNP比例的mRNA-LNP样品；具体来说：

当LNP中阳离子脂质：中性脂质：结构性脂质：聚合物共轭脂质的摩尔比为(25～65):(5～25):(25～70):(0.5～5)时，其包载mRNA组成的mRNA-LNP样品中添加本公开的冻干保护剂，配合冷冻干燥程序进行冻干，获得的冻干制剂，其细胞的存活率与加入mRNA-LNP样品的细胞溶液无明显差异。

8-2、转染效率

以YK-009和YK-401为例，考察LNP中，不同阳离子脂质、中性脂质、结构性脂质和聚合物共轭脂质的摩尔比的样品，将实施例1、实施例8-1以及实施例9-1~9-8的冻干制剂，采用Western Blot的方法测定其转染效率，将不同的待测冻干前后的各个试样，按每孔200ng加入到24孔板的细胞培养液中，继续培养，随后收集细胞后提取蛋白，并转移至固相载体（硝酸纤维素薄膜）上，以固相载体上的蛋白质作为抗原，与特异性抗体起免疫反应，再与辣根过氧化酶标记的二抗反应，底物显色，产生条带，经多功能成像仪对条带进行检测。

结果如图4和图5所示，对比未添加冻干保护剂的未冻干样品与添加保护剂冻干后的冻干制剂：

实施例1、实施例8-1分别以mRNA-LNP（YK-009）和mRNA-LNP（YK-401）制备冻干样品，其中，阳离子脂质：中性脂质：结构性脂质：聚合物共轭脂质=49:10:39.5:1.5，对其冻干前后各个试样转染细胞进行Western Blot检测，均可见清晰的条带，表明转染的细胞中均有S蛋白的表达，该LNP比例下的转染效果冻干前后的条带清晰、颜色及深浅最相近，表明采用本公开蔗糖和甘露醇组合作为冻干保护剂进行冷冻干燥样品可成功转染细胞，表明采用本LNP比例下进行冷冻干燥样品可成功转染细胞，与未冻干样品无显著差异。

实施例9-1和9-5、9-2和9-6、9-3和9-7、9-4和9-8分别以阳离子脂质：中性脂质：结构性脂质：聚合物共轭脂质=40:10:48.5:1.5、35:10:53.5:1.5、75:5:15:5、25:5:65:5的LNP制备冻干样品，将其转染细胞后，对各个试样转染细胞进行Western Blot检测，均可见清晰的条带，但较实施例1和实施例8-1相比，条带颜色略有变浅，表明转染的细胞中S蛋白表达量略有差异，实施例1转染效率，略优于实施例9-3和9-1，而实施例9-2和9-4转染效率较前三者呈现一定程度的降低，但差异不显著，细胞转染效率无明显改变；证明本公开的不同LNP比例的mRNA-LNP样品进行冷冻干燥制成的冻干制剂可成功转染细胞，并且冻干前后无显著差异。

小结：采用本公开的冻干保护剂对不同LNP比例的mRNA-LNP样品（阳离子脂质：中性脂质：结构性脂质：聚合物共轭脂质=(25～65):(5～25):(25～70):(0.5～5)）进行冷冻干燥制成的冻干制剂可成功转染细胞，并且冻干前后无显著差异。

测得细胞中S蛋白能良好表达，表达量与未冻干样品转染的细胞无明显差异。

其中，当LNP中，阳离子脂质：中性脂质：结构性脂质：聚合物共轭脂质=49:10:39.5:1.5，其冻干前后条带最清晰，颜色深浅变化最小，表明转染的细胞中S蛋白的表达最优。

结论分析9：本公开的冻干制剂在低温2~8℃、室温25℃及高温40℃下放置3个月，稳定性良好。

将本公开制备得到的mRNA-LNP冻干制剂分别在低温2~ 8℃、室温25℃及高温40℃下各放置3个月检测粒径、包封率和完整性，考察其稳定性；基于稳定性期间的含水量变化与冻干工艺无关，只与包材密封性有关，因此稳定性实验阶段不对含水量和复溶时间进行检测。

表49 冻干保护剂成分和用量

表50 粒径（nm）和PDI比较（室温）

表51 粒径（nm）和PDI比较（2 ~ 8℃）

表52 粒径（nm）和PDI比较（40℃）

包封率：

表53 包封率（%）比较（室温）

表54 包封率（%）比较（2~8℃）

表55 包封率（%）比较（40℃）

完整性：

表56 完整性（%）比较（室温）

表57 完整性（%）比较（2~8℃）

表58 完整性（%）比较（40℃）

结论：

1）粒径和PDI：本公开实施例1、实施例3-1以及实施例5-4，分别在室温、2~8℃和40℃不同温度条件下，从0天到3个月，室温和2~8℃条件下粒径增加在3 nm以内；高温40℃粒径变化最明显的条件下，增加量也控制在6.5 nm以内；说明冻干制剂在不同温度条件下的稳定性良好。而实施例2-1-5未添加冻干保护剂，从0天到3个月，在室温和2 ~ 8℃条件下粒径增加6~7.5 nm，40℃条件下增加量为高达30.5 nm，粒径变化显著高于上述三个实施例，并且在室温和40℃条件下PDI也明显增加，稳定性较差。

2）包封率：本公开实施例1、实施例3-1以及实施例5-4，分别在室温和2~8℃温度条件下，从0天到3个月，包封率变化均控制在0.9~1.9%以内，变化不显著。在40℃条件下，放置3个月后，除实施例5-4包封率降低了5.6%，实施例1和实施例3-1降低程度在2%左右。而实施例2-1-5未添加冻干保护剂，在室温、2~8℃和40℃不同温度条件下，其包封率的变化量分别为：3.8%、2.9%和8.3%，降低程度都高于实施例1、实施例3-1以及实施例5-4，包裹的mRNA显著减少，稳定性低。

3）完整性：本公开实施例1、实施例3-1以及实施例5-4，分别在室温、2 ~ 8℃和40℃不同温度条件下，从0天到3个月，在室温和2~8℃条件下完整性降低0.2~1.6%，变化不显著；在40℃条件下完整性降低最高，但是也保持在2.8~3.6%，变化较少，完整性高，稳定性高。而实施例2-1-5未添加冻干保护剂，在室温和2~8℃条件下完整性降低3%左右，在40℃条件下，其完整性的降低量增加为8.2%，完整性显著降低，稳定性差。

以上结果表明实施例1、实施例3-1以及实施例5-4在不同温度条件下理化特性、包裹的mRNA比例和完整性没有显著改变或少量改变，稳定性好于实施例2-1-5不添加冻干保护剂制备的mRNA-LNP冻干制剂。

小结：本公开的mRNA-LNP冻干制剂在2~40℃条件下放置三个月，其粒径、包封率和完整性无显著变化，稳定性良好。并且其稳定性显著优于不添加冻干保护剂的mRNA-LNP冻干制剂。

本公开的mRNA-LNP冻干制剂（例如，实施例1、实施例3-1和实施例5-4）在室温和2~8℃条件下，从0天到3个月，粒径增加在3 nm以内，PDI无明显变化，包封率和完整性降低仅1%左右，变化不显著；在高温40℃的条件下，增加量也控制在6.5 nm以内，包封率降低1.9~5.6%，完整性降低2.8~3.6%，变化不大。在不同温度条件下保持理化特性以及mRNA包裹量和完整性无显著改变或少量改变，稳定性良好。

未添加冻干保护剂的mRNA-LNP冻干制剂（例如，实施例2-1-5），从0天到3个月，尽管在室温和2~8℃条件下也有少量改变，粒径增加6~7.5 nm，包封率和完整性降低3%左右；在高温40℃的条件下变化显著，粒径增加30.5 nm，PDI明显增加，包封率和完整性降低超过8%，不能保持mRNA-LNP理化特性，且裸露的mRNA比例增加导致发生降解的mRNA增多，稳定性差。

结论分析10：本公开冷冻干燥保护剂和冷冻干燥方法制备得到的冻干制剂，其稳定性显著优于其他冷冻干燥保护剂和冷冻干燥方法。

对比例1：采用参照专利CN114557971A（核酸-脂质纳米颗粒用的冷冻干燥保护剂）公开的冷冻干燥保护剂和冷冻干燥方法对本公开实施例1的样品1（mRNA-LNP（YK009））进行冻干制备冻干制剂。

对比例2：采用参照专利CN103690943 A（人用狂犬病疫苗的冷冻干燥保护剂）公开的冷冻干燥保护剂和冷冻干燥方法对本公开实施例1的样品1（mRNA-LNP（YK009））进行冻干制备冻干制剂。

以发明效果最好的实施例1以及效果较好的实施例5-4为例；与对比例1和对比例2进行比较，考察冻干制剂理化特性，并将冻干制剂在2~8℃、室温及40℃下各放置3个月，检测其稳定性。不同方法采用的冻干保护剂处方和冷冻干燥程序如下：

表59 冻干保护剂及冷冻干燥程序

检测不同方法制备的冻干制剂，其mRNA-LNP冻干前后的粒径、PDI、包封率和完整性，以及稳定性的结果如下：

结论：

1）冻干制剂（冻干后0天）：

对比例1和对比例2复溶后粒径增加40 nm左右，包封率降低超过10%，完整性减少2-4%左右。相较于本公开实施例1和实施例5-4，粒径增加多约22-26 nm，包封率降低程度大约6-8%，完整性减少多约0.1-0.9%，表明对比例1和对比例2理化特性变化较大，裸露的mRNA较多，mRNA完整性较差，冻干效果较差。

2）稳定性（冻干后0天到3个月）：

室温和2~8℃条件下实施例1粒径变化最小，不到1 nm，其次是实施例5-4粒径增加在3 nm以内，对比例1和对比例2粒径增加超过5 nm，变化显著；实施例1以及实施例5-4的包封率减少约0.9-1.8%左右，完整性减少约0.2-1.1%左右，变化不显著，对比例1和对比例2的包封率减少约1.8-2.4%，完整性减少约2.1-2.5%左右，略高于本公开实施例。

高温40℃条件下，实施例1和实施例5-4粒径增加量也控制在6.5 nm以内，对比例1和对比例2粒径增加10 nm左右，较前两者增加多5 nm左右；包封率降低最少的是实施例1，降低了1.9%，其次是实施例5-4降低了5.6%，对比例1和对比例2均超过7%，降低程度比实施例1多5.5%左右；实施例1和实施例5-4完整性减少2.8-3.5%左右，对比例1和对比例2减少超过6%，变化量约为前两者的两倍。

以上结果说明本公开实施例1和实施例5-4在不同温度条件下粒径、包裹mRNA比例及mRNA完整性变化小于对比例1和对比例2，即，稳定性好于对比例1和对比例2。

小结：本公开的mRNA-LNP冻干制剂冻干效果好于采用其他成分冻干保护剂及冷冻干燥程序制备的mRNA-LNP冻干制剂，且在不同温度下的稳定性更优。

相较于冻干前制剂，本公开的mRNA-LNP冻干制剂（例如，实施例1、实施例5-4）粒径变化小于30 nm，PDI无明显变化，包封率降低7%左右，以及完整性减少1%以内。相较于其他mRNA-LNP冻干制剂，添加其他成分或比例的冻干保护剂及冷冻干燥程序进行冻干的mRNA-LNP冻干制剂（例如，对比例1、对比例2），粒径增加少约20 nm，包封率降低少约3~5%，以及完整性降低少约2~4%。说明本公开的mRNA-LNP冻干制剂理化特性变化较其他mRNA-LNP冻干制剂小，包裹的mRNA比例更多，且mRNA完整性更好，即冻干效果更好。

室温和2~8℃条件下放置3个月，对比冻干后0天，本公开的mRNA-LNP冻干制剂粒径增加3 nm以内，最少增加0.1 nm，几乎没变；包封率和完整性减少约0.9-1.8%左右，变化不显著。其他mRNA-LNP冻干制剂（对比例1和对比例2），粒径增加超过5 nm，变化显著，包封率和完整性减少约1.8-2.4%左右，略高于本公开的mRNA-LNP冻干制剂；

高温40℃条件下放置3个月，对比冻干后0天，本公开的mRNA-LNP冻干制剂粒径增加量也控制在6.5 nm以内，包封率降低1.9~5.6%，完整性减少2.8-3.5%左右。相较于其他mRNA-LNP冻干制剂，粒径增加少5 nm左右，包封率和完整性降低少约2~6%，理化特性，包裹的mRNA比例和完整性变化均小于其他mRNA-LNP冻干制剂，稳定性更好。

Claims (37)

1. 一种核酸-脂质纳米颗粒冻干制剂，包括核酸-脂质纳米颗粒和冷冻干燥保护剂，所述冷冻干燥保护剂为蔗糖和甘露醇双组分冷冻干燥保护剂，其中，所述蔗糖与甘露醇的质量比为9~2.5：1~7.5，所述核酸-脂质纳米颗粒包括核酸和脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包括阳离子脂质、中性脂质、结构性脂质、聚合物共轭脂质，其中，所述阳离子脂质、所述中性脂质、所述结构性脂质、以及所述聚合物共轭脂质的摩尔比为(25～65):(5～25):(25～70):(0.5～5)；所述结构性脂质选自胆固醇、谷固醇、 麦角固醇、 菜油甾醇、 豆甾醇、芸苔甾醇、皮质类固醇以及其混合物；所述聚合物共轭脂质为聚乙二醇PEG修饰的脂质。

2.根据权利要求1所述的冻干制剂，其中，所述蔗糖与甘露醇的质量比为7.5~2.5：2.5~7.5。

3.根据权利要求2所述的冻干制剂，其中，所述蔗糖与甘露醇的质量比为7.5：2.5。

4.根据权利要求3所述的冻干制剂，其中，所述阳离子脂质选自以下化合物中的一种或多种：

（1）式(I) 所示的化合物，或其药学上可接受的盐，其中，G₁为C_1～6亚烷基；G₂为C_2～8亚烷基；G₃为C_1～3亚烷基；L₁为C_6～15直链烷基；L₂为C_12～25支链烷基；

(I)

（2）式(II) 所示的化合物，或其药学上可接受的盐，其中，G₁为C_2~8亚烷基；G₂为C_2~8亚烷基；L₁为-C(O)O-或-OC(O)-；L₂为-C(O)O-或-OC(O)-；R₁为C_6~25直链或支链烷基；R₂为C_6~25直链或支链烷基；G₃为HO(CH₂)₂-或HO(CH₂)₃-；G₄为HO(CH₂)₂-或HO(CH₂)₃-；L为(CH₂)₂-或-(CH₂)₃-或-(CH₂)₄-；

(II)

（3）式(III) 所示的化合物，或其药学上可接受的盐，其中：G₁为C_1~6亚烷基；G₂为C_2~8亚烷基；R₁为C_6~20直链或支链烷基；R₂为C_12~25支链烷基；G₃为：HO(CH₂)₂N(CH₃)(CH₂)₂-，HO(CH₂)₂N(CH₂CH₃)(CH₂)₂-，(HO(CH₂)₂)₂N(CH₂)₂-，CH₃O(CH₂)₂N(CH₃)(CH₂)₂-，(CH₃)₂N(CH₂)₃SC(O)O(CH₂)₂-，(CH₃)₂N(CH₂)₃SC(O)-，CH₃NH(CH₂)₂N(CH₃)(CH₂)₂-或CH₃CH₂NH(CH₂)₂-；

(III)

（4）式(IV) 所示的化合物，或其药学上可接受的盐，其中G₁为C_1~8亚烷基；G₂为C_2~8亚烷基；R₁为C_6~25直链或支链烷基；R₂为C_12~25直链或支链烷基；G₃为：HO(CH₂)₂N(R₃)CH₂CH(OH)CH₂-，其中R₃为-CH₃或-CH₂CH₃或-CH₂CH₂OH；

(IV)

（5）式(V) 所示的化合物，或其药学上可接受的盐，其中，G¹和G²各自独立地为未取代的C₆-C₁₀亚烷基；G³为未取代的C₁-C₁₂亚烷基；R¹和R²各自独立地为C₆-C₂₄烷基或C₆-C₂₄烯基；R³为OR⁵、N、-C(＝O)OR⁴、-OC(＝O)R⁴或-NR⁵C(＝O)R⁴；R⁴为C₁-C₁₂烃基；并且R⁵为H或C₁-C₆烃基；

(V)

（6）式(VI)所示的化合物，或其药学上可接受的盐，其中，R₄为-(CH₂)_nQ；Q选自：-OH和-CN；n是1、2或3；

(VI)

（7）式(VII)所示的化合物，或其药学上可接受的盐，

(VII)。

5.根据权利要求4所述的冻干制剂，其中，所述阳离子脂质选自YK-009、YK-401、YK-305、ALC0315、SM102、DLIN-MC3-DMA中的一种或多种；其中：

YK-009具有式(I-I)所示结构：

(I-I)

YK-401具有式(II-I) 所示结构：

(II-I)

YK-305具有式(IV-I) 所示结构：

(IV-I)

ALC0315具有式(V-I) 所示结构：

(V-I)

SM102具有式(VI-I) 所示结构：

(VI-I)

DLIN-MC3-DMA具有式(VII)结构：

(VII）。

6.根据权利要求1所述的冻干制剂，其中，所述核酸是核糖核酸或脱氧核糖核酸。

7. 根据权利要求6所述的冻干制剂，其中，所述核糖核酸选自由以下组成的组 ：小干扰RNA、不对称干扰RNA、微RNA、Dicer-底物RNA、小发夹RNA、信使RNA、长链非编码RNA、环状RNA、自扩增RNA、5’-pppRNA以及其混合物。

8.根据权利要求4所述的冻干制剂，其中，所述核酸是核糖核酸或脱氧核糖核酸。

9.权利要求1~8任一项所述冻干制剂的制备方法，其步骤为：

1）配制冷冻干燥保护剂溶液以及核酸-脂质纳米颗粒溶液；

2）将冷冻干燥保护剂溶液与核酸-脂质纳米颗粒溶液混合，得到待冻干混合液，进行冷冻干燥；

所述待冻干混合液中冷冻干燥保护剂的质量百分含量为8~11%。

10. 根据权利要求9所述的制备方法，其中， 所述待冻干混合液中冷冻干燥保护剂的质量百分含量为10%。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其中，所述冷冻干燥包括以下步骤：预冻阶段、升华干燥阶段、解吸干燥阶段。

12.根据权利要求11所述的制备方法，其中，所述升华干燥阶段的温度为-40~0℃。

13. 根据权利要求11或12所述的制备方法，其中，所述升华干燥阶段的时间为50~100h。

14.根据权利要求11或12所述的制备方法，其中，所述升华干燥阶段分2~4段呈梯度升温。

15.根据权利要求13所述的制备方法，其中，所述升华干燥阶段分2~4段呈梯度升温。

16.根据权利要求14所述的制备方法，其中，所述升华干燥阶段中梯度升温的每段升温5~20℃。

17.根据权利要求15所述的制备方法，其中，所述升华干燥阶段中梯度升温的每段升温5~20℃。

18. 根据权利要求14所述的制备方法，其中，所述升华干燥阶段中梯度升温的每段维持时间6~70 h。

19. 根据权利要求15所述的制备方法，其中，所述升华干燥阶段中梯度升温的每段维持时间6~70 h。

20. 根据权利要求11所述的制备方法，其中，所述升华干燥阶段的升温过程依次为：-40℃ 50 h，-25℃ 20 h， -15℃ 6 h，-5℃ 6 h。

21. 根据权利要求12所述的制备方法，其中，所述升华干燥阶段的升温过程依次为：-40℃ 50 h，-25℃ 20 h， -15℃ 6 h，-5℃ 6 h。

22. 根据权利要求13所述的制备方法，其中，所述升华干燥阶段的升温过程依次为：-40℃ 50 h，-25℃ 20 h， -15℃ 6 h，-5℃ 6 h。

23.根据权利要求14所述的制备方法，其中，所述升华干燥阶段的升温过程依次为：-40℃ 50 h，-25℃ 20 h， -15℃ 6 h，-5℃ 6 h。

24.根据权利要求11所述的制备方法，其中，所述预冻阶段采用梯度降温或液氮降温。

25.根据权利要求14所述的制备方法，其中，所述预冻阶段中降温的温度为-60~-40℃。

26. 根据权利要求11或24所述的制备方法，其中，所述预冻阶段中梯度降温的时间为2~6 h。

27. 根据权利要求24所述的制备方法，其中，所述预冻阶段中梯度降温过程依次为：-5℃ 0.5 h，-15℃ 0.5 h，-25℃ 0.5 h，-35℃ 0.5 h，-45℃ 0.5 h。

28. 根据权利要求24所述的制备方法，其中，所述液氮降温过程为采用液氮预冷2~6h。

29.根据权利要求11所述的制备方法，其中，所述解吸干燥阶段：温度为15~30℃。

30. 根据权利要求11所述的制备方法，其中，所述解吸干燥阶段的运行时间为1~3 h。

31. 根据权利要求29所述的制备方法，其中，所述解吸干燥阶段的过程依次为：15℃ 2h，30℃ 1.5 h。

32. 根据权利要求11所述的制备方法，其中，所述冷冻干燥过程中，保持真空压力控制≤ 0.05 mbar。

33.权利要求1~8任一项所述冻干制剂在制备核酸药物中的用途。

34.权利要求1~8任一项所述冻干制剂在制备用于治疗有需要哺乳动物的疾病或病症的药物中的用途，其中所述疾病或病症选自由以下组成的组：感染性疾病、增生性疾病、遗传性疾病、自体免疫性疾病、神经退化性疾病、心血管和肾血管疾病以及代谢性疾病。

35.权利要求34所述的用途，其中所述疾病为癌症。

36.权利要求34所述的用途，其中所述疾病为糖尿病。

37.根据权利要求34所述的用途，其中所述感染性疾病选自：由冠状病毒、流感病毒或HIV病毒引起的疾病、小儿肺炎、裂谷热、黄热病、狂犬病或多种疱疹。