JP2023097825A - Ｒｓウイルス検出用プローブ及びその用途 - Google Patents

Abstract

【課題】ＲＳウイルス検出用プローブを提供すること。【解決手段】以下の特徴（Ａ）及び（Ｂ）を有する、ＲＳウイルス検出用プローブが開示される：（Ａ）以下の（Ａ－１）又は（Ａ－２）の塩基配列を含む；（Ａ－１）配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列に相補的な塩基配列において連続する少なくとも１０塩基以上の塩基配列であって、配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列の４５番目～５２番目に対して相補的な塩基配列を少なくとも含む塩基配列、又は（Ａ－２）（Ａ－１）の塩基配列において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列；及び（Ｂ）５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。【選択図】なし

Description

本発明は、ＲＳウイルス検出用プローブ、該プローブを用いてＲＳウイルスを検出する方法及び当該方法に用いるための試薬・キット等に関する。

ＲＳウイルス（Ｈｕｍａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）による呼吸器感染症は特に初感染の乳児及び高齢者に高率に気管支炎や肺炎を引き起こす。ＲＳウイルスは、１１種類のタンパク質をコードするゲノムＲＮＡを有しており、これらのタンパク質のうちＧ蛋白の性状の差からサブグループとして大きくＡ型とＢ型に分類されている。

ＲＳウイルスの検査方法としては、これまでに遺伝子検査、抗原検査、抗体検査が開発されてきている。これらの内、抗原検査は、簡便に検査できるメリットがある一方、感度の点では難があるのが現状である。また抗体検査は、過去に罹患したかの確認ができるものの、現時点で感染しているかの検査には不向きである。これらに対し、遺伝子検査は、ＲＳウイルスを特異的に優れた感度で検出できる特徴がある。

ＲＳウイルスの遺伝子検査法では、まず逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃ
ｒｉｐｔａｓｅ）によりＲＳウイルスのゲノムＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写（ＲＴ：ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）した後、ＰＣＲ法等により核酸増幅して検出を行う方法がとられている。ＲＴ－ＰＣＲ法による検出では現在、ダブル標識核酸プローブ（Ｔａｑｍａｎプローブ、加水分解プローブ等とも呼ばれる）を用いたリアルタイムＰＣＲを行うことにより定量検出する方法が主に実施されている（非特許文献１）。本方法では、コントロールＲＮＡを基準にウイルス量を定量することが可能であるが、ＰＣＲのサイクル毎に測光する必要があるため、最も短い場合でも検出に約１時間を要する。

さらに、核酸増幅産物を検出する方法として、融解曲線解析法が知られている。融解曲線解析法は、核酸増幅と検出を別工程で実施することができ、最短３０分間程度で比較的簡便に測定が可能である。さらに蛍光標識核酸プローブを用いた融解曲線解析は、自動分析装置を利用した遺伝子検査にも適合させ易いという利点がある。しかし未だ、融解曲線解析法で高感度にＲＳウイルスを検出可能な核酸プローブは知られていない。

一般にはＡ型のＲＳウイルスの方が重症になり易いことが知られている。サブグループＡ型とＢ型は、塩基配列が一部異なることが知られているため、同一の反応系で両型を検出することは通常困難である。さらに、複数のプライマー・プローブセットを同一の反応系に入れることは、オリゴヌクレオチド間でダイマーを形成し易くなる等の相互作用を誘発する可能性が高くなり、最適なプライマー、プローブ配列を見出すためには多くの試行錯誤が必要である。また、ＲＳウイルスはゲノムＲＮＡ領域に変異を生じうる。従って、これらを可能な限り網羅的に検出できるプライマー、プローブの設計は容易でない。

国立感染症研究所、ヒトオルソニューモウイルス（RSウイルス）病原体検出マニュアル ２．０版（令和２年６月１２日）

本発明は、かかる従来技術の課題を背景になされたものである。すなわち、本発明の目的は、ＲＳウイルスの検出に有用なプローブ及びそれを用いたＲＳウイルスの検出方法等を提供することである。

本発明者らは、上記の目的を達成するため鋭意研究した結果、特定の塩基配列を有する標識プローブを用いることで、ＲＳウイルスを簡便、迅速、且つ高感度に検出できることを見出した。本発明者らは、当該知見を基に更に鋭意研究を重ねて本発明を完成させるに至った。

本発明は、以下の態様を包含する。
［項１］ 以下の特徴（Ａ）及び（Ｂ）を有する、ＲＳウイルス検出用プローブ：
（Ａ）以下の（Ａ－１）又は（Ａ－２）の塩基配列を含む；
（Ａ－１）配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列に相補的な塩基配列において連続する少なくとも１０塩基以上の塩基配列であって、配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列の４５番目～５２番目に対して相補的な塩基配列を少なくとも含む塩基配列、又は
（Ａ－２）（Ａ－１）の塩基配列において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列；及び
（Ｂ）５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
［項２］ 前記（Ａ）の塩基配列の長さが１４～２６塩基である、項１に記載のプローブ。
［項３］ 前記（Ａ）の塩基配列が、配列番号３～７のいずれかで示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む、項１又は２に記載のプローブ。
［項４］ 前記（Ｂ）の標識が蛍光色素標識である、項１～３のいずれかに記載のプローブ。
［項５］ 前記（Ｂ）の標識が、前記プローブの塩基配列に対して相補的な塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列を含む核酸と結合した場合に消光する蛍光消光色素による標識である、項１～４のいずれかに記載のプローブ。
［項６］ 前記（Ｂ）の標識が、グアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素による標識である、項１～５のいずれかに記載のプローブ。
［項７］ 前記（Ｂ）の標識が、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、並びにＢＯＤＩＰＹ及びその誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素による標識である、項１～６のいずれかに記載のプローブ。
［項８］ 前記（Ｂ）の標識が、４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ，ＴＡＭＲＡ，ローダミン６Ｇ，テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）、及び２－オキソ－６，８－ジフルオロ－７－ジヒドロキシ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－３－カルボン酸（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素による標識である、項１～７のいずれかに記載のプローブ。
［項９］ 前記（Ｂ）において、標識されている末端塩基がシトシンである、項１～８のいずれかに記載のプローブ。
［項１０］ 項１～９のいずれかに記載のプローブを用いて、検体試料中に含まれ得るＲＳウイルスを検出する方法。
［項１１］ 以下の工程（１）、（２）、及び（３）：
（１）前記検体試料中のターゲットのＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する工程、
（２）工程（１）のｃＤＮＡを鋳型として１又は複数の核酸増幅産物を生成する工程、及び
（３）工程（２）の１又は複数の核酸増幅産物を、１又は複数の前記プローブを用いて検出する工程
を含む、項１０に記載の方法。
［項１２］ 工程（２）がＰＣＲ反応により実施され、前記ＰＣＲ反応に用いる核酸増幅酵素が、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼである、項１１に記載の方法。
［項１３］ ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤ由来のＤＮＡポリメラーゼ又はその変異体である、項１２に記載の方法。
［項１４］ 工程（３）が融解曲線解析法により実施される、項１１～１３のいずれかに記載の方法。
［項１５］ 工程（１）の逆転写反応に用いる逆転写活性を有する酵素が、Ｍ－ＭＬＶ（Moloney Murine Leukemia Virus）由来のリバーストランスクリプターゼ又はその変異体である、項１１～１４のいずれかに記載の方法。
［項１６］ ＲＳウイルスのサブグループＡ型及びＢ型の両方を検出する、項１０～１５のいずれかに記載の方法。
［項１７］ ＲＳウイルスをサブグループＡ型及びサブグループＢ型のいずれであるかを判別して検出する、請求項１０～１６のいずれかに記載の方法。
［項１８］ 項１～９のいずれかに記載のプローブを含む、ＲＳウイルスを検出するための試薬キット。

本発明により、ＲＳウイルスを簡便、迅速、且つ高感度に検出することができる。また、本発明では、１種類のプローブを用いることにより、Ａ型及びＢ型の両方のＲＳウイルスを検出することも可能である。さらに、本発明では、ＲＳウイルスをＡ型及びＢ型のいずれであるかを判別して検出することも可能である。本発明のプローブ、それを用いた検出方法、試薬、又はキット等を使用することで、ＲＳウイルスの簡便、迅速、且つ高感度な検出が可能になり、臨床診断の分野に大きく貢献できる。

ＲＳウイルスのサブグループＡ型及びＢ型のＲＮＡゲノム配列を逆転写してＤＮＡとした配列の一部（ＲＳＶ Ａ、ＲＳＶ Ｂ）と、試験例で用いた各プローブとの対応関係を示す図である。二重下線を付した配列は、配列番号１又は２で示す塩基配列における４５番目～５２番目の８塩基の領域を示す。配列番号３～７及び１０～１４において四角で囲んだ部分は、配列番号１又は２で示される塩基配列又はそれに対して相補的な塩基配列とのミスマッチ塩基を示す。 実施例１の結果の代表例を示す図である（核酸プローブａを用いて融解曲線解析を行った場合の検出結果を示すグラフ。図中、ＲＳＶはＲＳウイルスの検出ピーク、及びＩＣはインターナルコントロールの検出を示す）。 実施例２の結果の代表例を示す図である（核酸プローブａを用いて融解曲線解析を行った場合の検出結果を示すグラフ。図中、ＲＳＶはＲＳウイルスの検出ピーク、及びＩＣはインターナルコントロールの検出を示す）。

以下、本発明の実施形態を示しつつ、本発明についてさらに詳説するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
なお、本明細書中に記載された非特許文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用され、その全体が明細書に組み込まれる。また、本明細書中の「～」は「以上、以下」を意味し、例えば明細書中で「Ｘ～Ｙ」と記載されていれば「Ｘ以上、Ｙ以下」を示す。本明細書中の「及び／又は」は、いずれか一方又は両方を意味する。本明細書中の「含む」は、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を包含する。

また、本明細書では、核酸プライマーを単にプライマーという場合があり、核酸プローブ及び標識プローブを単にプローブという場合があり、これらを総称してオリゴヌクレオチドともいう。

一つの実施形態において、本発明は、特定の塩基配列から構成される標識プローブを使用することで、ＲＳウイルスを検出する方法を提供する。この方法により、簡便、迅速、且つ高感度にＲＳウイルスを検出することができる。また、ＲＳウイルスのゲノムＲＮＡにおける特定領域をターゲットとして標識プローブを設計することで、一般に重症化し易いＲＳウイルスのサブグループＡ型を融解曲線解析等により確実に検出でき、更には１種類の標識プローブでＲＳウイルスのサブグループＡ型及びＢ型のどちらも検出できる。本明細書において、配列番号１及び配列番号２は、ＲＳウイルスのゲノムＲＮＡ配列の一部を逆転写しＤＮＡ配列としたものに相当する塩基配列（一本鎖マイナス鎖ＲＮＡウイルスであるＲＳウイルスのゲノム配列の順鎖に相当）である。配列番号１はＡ型ＲＳウイルスの塩基配列に対応し、配列番号２はＢ型ＲＳウイルスの塩基配列に対応する。本発明のプローブは、配列番号１又は配列番号２に示される塩基配列の領域をターゲットとし、特定の塩基配列で構成される標識プローブ（本明細書では、これを「核酸プローブ」等ともいう）であることが好ましい。

［ＲＳウイルスを検出する方法］
一つの実施形態において、検体試料中に含まれ得るＲＳウイルスを検出する方法は、後述の核酸プローブを用いる方法であることが好ましい。当該方法は、検体試料中にＲＳウイルスが存在するか又は存在しないかを判定する方法であってもよい。また、当該方法は、検体試料中に含まれるＲＳウイルスを定量する方法であってもよい。特定の実施形態では、１種類の核酸プローブを用いることで、例えばＲＴ－ＰＣＲ－融解曲線解析法等において、検体試料中に含まれ得るＲＳウイルスを、サブグループＡ型及びＢ型のどちらであっても高感度に検出することができる。更に特定の実施形態では、例えば、融解曲線解析法等における検出温度の差に基づいて、検体試料中に含まれ得るＲＳウイルスを、サブグループＡ型及びサブグループＢ型のいずれであるかを判別して検出することができる。

特定の実施形態では、検体試料中に含まれ得るＲＳウイルスを検出する方法は、少なくとも以下の工程（１）、（２）、及び（３）：
（１）検体試料中のターゲットのＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写（ＲＴ：reverse transcription）する工程；
（２）工程（１）のｃＤＮＡを鋳型として１又は複数の核酸増幅産物を生成する工程；及び
（３）工程（２）の１又は複数の核酸増幅産物を、１又は複数の後述の核酸プローブを用いて検出する工程
を含むことが好ましい。当該方法は、工程（２）をＰＣＲ反応により実施し、且つ、工程（３）を融解曲線解析法により実施すること（ＲＴ－ＰＣＲ－融解曲線解析法）が好ましい。工程（１）、（２）、及び（３）は同一の反応液中で行ってもよい。また、工程（１）、（２）、及び（３）のうち２つ以上の工程、例えば、工程（１）と工程（２）を連続して又は同時並行的に行ってもよい。

［工程（１）］
一つの実施形態において、工程（１）は、核酸プライマー及び逆転写酵素（reverse transcriptase）を用いて逆転写反応を行い、ターゲットのＲＮＡからｃＤＮＡを生成させる工程であることが好ましい。逆転写酵素としては、逆転写活性を有する酵素であれば特に限定されず、例えば、Ｍ－ＭＬＶ（Moloney Murine Leukemia Virus：モロニーマウス白血病ウイルス）、ＡＭＶ（トリ骨髄芽球症ウイルス）由来のリバーストランスクリプターゼ（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）、これらの変異体が挙げられる。当該変異体としては、例えば、野生型のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加した変異体或いは野生型のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上のアミノ酸配列同一性を示す変異体等が挙げられる。具体的には、ｃＤＮＡの合成効率を上げるために、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を欠失させた変異体等が挙げられる。また、特定の条件下ではＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼとその変異体も逆転写活性があることが知られており、本発明において逆転写酵素として使用することができる。

逆転写反応で使用される核酸プライマーは、工程（２）の核酸増幅反応で使用されるプライマーの一方を兼ねていてもよい。また、逆転写反応の条件は、反応が進行する限り特に限定されない。逆転写反応の温度及び時間（又は逆転写反応装置における設定温度及び設定時間）は、例えば、３７～５５℃で０秒～６０分が好ましく、４０～５２℃で１～３０分がより好ましく、４２～５０℃で２～１５分が特に好ましい。

［工程（２）］
一つの実施形態において、工程（２）は、核酸増幅法（１又は複数の核酸プライマーセットを用いて核酸増幅反応を行うこと）により、核酸増幅産物を生成させる工程であることが好ましい。核酸増幅法は数コピーの標的核酸を可視化可能なレベル、すなわち数億コピー以上に増幅する技術であり、生命科学研究分野のみならず、臨床診断、食品衛生検査、環境検査等の分野においても広く用いられている。そのような核酸増幅法としては、ＰＣＲ法、ＬＡＭＰ法、ＬＣＲ法、ＴＭＡ法、ＳＤＡ法、ＲＴ－ＰＣＲ法、ＲＴ－ＬＡＭＰ法、ＮＡＳＢＡ法、ＴＲＣ法、ＴＭＡ法等が挙げられる。これらの技術は既に当該技術分野において確立されており、目的に合わせて方法を選択することができる。核酸増幅法はＰＣＲ法（ＲＴ－ＰＣＲ法を含む）が好ましいが、これに限定されない。

（ＰＣＲ反応）
ＰＣＲ反応は、主にＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応である。ＰＣＲ反応は、通常、（i）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの乖離）、（ii）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（iii）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことを含む。ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｔａｑ、Ｔｔｈ、Ｂｓｔ、ＫＯＤ、Ｐｆｕ、Ｐｗｏ、Ｔｂｒ、Ｔｆｉ、Ｔｆｌ、Ｔｍａ、Ｔｎｅ、Ｖｅｎｔ、ＤＥＥＰＶＥＮＴ、これらの変異体が挙げられる。本発明では、簡便、迅速、高感度、且つ検体による増幅阻害耐性を有するという観点から、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。また、工程（３）を融解曲線解析法により実施する場合には、蛍光消光プローブを用いる観点からも、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有しないファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼを用いることが好ましい。

ＰＣＲ反応の条件は、反応が進行する限り特に限定されない。例えば、最初の工程（i）を８０～１００℃で０秒～３００秒程度（例えば０．５～３００秒程度）行ってもよく、２回目以降（繰り返し）の工程（i）を８０～１００℃で０．５～３００秒程度行ってもよく、工程（ii）を３５～８０℃で１～３００秒程度行ってもよく、工程（iii）を３５～８５℃で１～３００秒程度行ってもよい。工程（i）から（iii）までのサイクルは３０～７０回繰り返すことが好ましい。ここで繰り返し行うサイクルの温度及び時間は、１～３サイクル毎に変化させてもよい。

（ＤＮＡポリメラーゼ）
工程（２）で使用し得るＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが好ましいが、これに限定されない。前記ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼは、特に制限されないが、好ましくは古細菌（Archea）由来のＤＮＡポリメラーゼであり、より好ましくは、パイロコッカス（Pyrococcus）属及びサーモコッカス（Thermococcus）属の細菌に由来するＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。また、好適なＤＮＡポリメラーゼには、ファミリーＢに属する古細菌由来のＤＮＡポリメラーゼ活性を失っていないその変異体も含まれる。変異体としては、例えば、野生型のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が欠失、置換、挿入及び／又は付加した変異体或いは野生型のアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、更に好ましくは９８％以上のアミノ酸配列同一性を示す変異体等が挙げられる。具体的には、ＤＮＡポリメラーゼの変異体には、ポリメラーゼ活性の増強、エキソヌクレアーゼ活性の欠損、基質特異性の調整等を目的とした変異体が挙げられるが、これらに限定されない。

パイロコッカス属由来のＤＮＡポリメラーゼとしては、Pyrococcus furiosus、Pyrococcus sp.GB-D、Pyrococcus woesei、Pyrococcus abyssi、Pyrococcus horikoshiiから単離されたＤＮＡポリメラーゼ、及びこれらに由来するＤＮＡポリメラーゼ活性を失っていないその変異体を含むが、これらに限定されない。

サーモコッカス属に由来するＤＮＡポリメラーゼとしては、Thermococcus kodakaraensis、Thermococcus gorgonarius、Thermococcus litoralis、Thermococcus sp.JDF-3、Thermococcus sp.9degrees North-7（Thermococcus sp.9°N-7）、Thermococcus siculiから単離されたＤＮＡポリメラーゼ、及びこれらに由来するＤＮＡポリメラーゼ活性を失っていないその変異体を含むが、これらに限定されない。好ましくは、Thermococcus kodakaraensis由来のＤＮＡポリメラーゼ及びその変異体（例えば、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失させたＫＯＤ由来ＤＮＡポリメラーゼ等）が、伸長性や熱安定性に優れているという観点から、本発明においてとりわけ好適に用いることができる。

これらのＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ酵素は市販されており、Ｐｆｕ（Ｓｔａｒａｇｅｎｅ社）、ＫＯＤ（Ｔｏｙｏｂｏ社）、Ｐｆｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社）、Ｔｇｏ（Ｒｏｃｈｅ社）、Ｐｗｏ（Ｒｏｃｈｅ社）等が挙げられ、そのいずれもが本発明に用いられ得る。

（ＫＯＤ由来のＤＮＡポリメラーゼ）
本明細書において、ＫＯＤ由来のＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼともいう）とは、Thermococcus kodakaraensis由来のＤＮＡポリメラーゼ及びその変異体（例えば、天然由来のアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸を置換、欠失、挿入及び／又は付加することにより３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を欠失させたＫＯＤ由来ＤＮＡポリメラーゼ等）をいう。一つの好ましい実施形態において、工程（２）は、このようなＫＯＤ由来のＤＮＡポリメラーゼを使用して核酸増幅反応を行う。ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＡに属するＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼに比べて、正確性、増幅効率、伸長性、検体由来の阻害物質による増幅阻害耐性に優れている。本発明では、このようなＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを使用することが、後述の実施例に示すように、簡便でありながら、迅速、高感度でＲＳウイルスを検出する点でより好ましい。

（核酸プライマーセット）
工程（２）で使用し得る核酸プライマーセットは、後述のプローブが複合体を形成できるＲＳウイルス由来の核酸断片を増幅し得るものであれば、特に限定されない。より高感度な判定結果が得られ易いという観点から、核酸プライマーセットは、配列番号１又は２で示されるＲＳウイルスのゲノムＲＮＡの塩基配列の一部又は全部を含む塩基配列を増幅し得る核酸プライマーセットであることが好ましい。

例えば、核酸プライマーセットは、配列番号１又は２で示される塩基配列の１～４０番目の領域において連続する２０～３５塩基の塩基配列若しくは前記塩基配列と相補的な塩基配列を含むプライマーと、配列番号１又は２で示される塩基配列の５０～９１番目の領域において連続する２０～３５塩基の塩基配列若しくは前記塩基配列と相補的な塩基配列を含むプライマーとで構成され、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に相補的であるプライマーセットであることが好ましい。

より好ましくは、配列番号１又は２で示される塩基配列の１～３１番目の領域において連続する２０～３０塩基の塩基配列若しくは前記塩基配列と相補的な塩基配列を含むプライマーと、配列番号１又は２で示される塩基配列の６０～９１番目の領域において連続する２０～３０塩基の塩基配列若しくは前記塩基配列と相補的な塩基配列を含むプライマーとで構成され、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に相補的であるプライマーセットである。

更に好ましくは、配列番号８で示される塩基配列若しくは前記塩基配列と相補的な塩基配列からなるプライマーと、配列番号９で示される塩基配列若しくは前記塩基配列と相補的な塩基配列からなるプライマーとで構成され、一方のプライマーが他方のプライマーのＤＮＡ伸長生成物に相補的であるプライマーセットである。

また、前記プライマーセットは、前記各プライマーの塩基配列において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列からなるプライマーを含むものであってもよい。

［工程（３）］
工程（３）の実施態様は特に限定されず、当該分野で公知の任意の方法で実施することができる。検出対象のＲＳウイルスは変異し易く、様々な亜型のゲノム配列が存在する。ここで、プライマー又はプローブの塩基配列とターゲットのＲＳウイルス変異株の塩基配列とにミスマッチが生じると、ウイルスＲＮＡ又はそれに由来する核酸増幅産物（標的核酸）に対するプライマー又はプローブの結合力は低下することになり得る。とりわけ、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法において標的核酸とプローブとの間のミスマッチが多い場合は、標的核酸に十分にプローブが結合できなくなるため、見かけ上増幅曲線の立ち上がりが遅れる、或いは全く立ち上がりがなくなる場合があり、このような状況は偽陰性を誘発し得る。融解曲線解析法の場合はＲＴ－ＰＣＲを終えてから工程（３）を行うため、仮にプライマー又はプローブにミスマッチがあったとしても、最終的に核酸増幅産物が得られていれば検出は可能であるため、リアルタイムＲＴ－ＰＣＲ法よりもミスマッチの影響を抑えることできる。従って、工程（３）では、核酸増幅産物を融解曲線解析法で検出することが特に好ましい。また、核酸増幅産物を融解曲線解析法で検出することで、より短時間（例えば、逆転写反応開始から融解曲線解析完了まで４５分以下、好ましくは４０分以下、より好ましくは３５分以下）で検出することも可能となり得る。

一つの実施形態において、工程（３）は、以下の工程（３－１）及び（３－２）：
（３－１）工程（２）の核酸増幅産物と核酸プローブとをハイブリダイズさせ複合体を形成する工程；及び
（３－２）工程（３－１）の複合体を検出する工程
を含むことが好ましい。ＲＳウイルスの検出において、高感度な判定結果を得るために、工程（２）のＲＳウイルス由来の核酸増幅産物と特異的に反応して複合体を形成しうる後述の核酸プローブを用いることが好ましい。
工程（３－１）のハイブリダイズは、核酸増幅産物と核酸プローブが十分にハイブリダイズする温度条件下で実施されることが好ましい。このような温度条件としては、例えば、核酸プローブのＴｍ値より少なくとも５℃低い温度、より好ましくは少なくとも１０℃低い温度を挙げることができるが、これらに限定はされない。

（核酸プローブ）
本発明の核酸プローブは、少なくとも以下の（Ａ）及び（Ｂ）の特徴を有する、ＲＳウイルス検出用プローブであり得る：
（Ａ）以下の（Ａ－１）又は（Ａ－２）の塩基配列を含む；
（Ａ－１）配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列に相補的な塩基配列において連続する少なくとも１０塩基以上の塩基配列であって、配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列の４５番目～５２番目に対して相補的な塩基配列を少なくとも含む塩基配列、又は
（Ａ－２）（Ａ－１）の塩基配列において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列；及び
（Ｂ）５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
このような特徴を有する核酸プローブを用いることで、例えば、融解曲線解析においても高感度にＲＳウイルスを検出することができる。

本発明の核酸プローブは、（Ａ）の塩基配列を有するものであれば特に限定されないが、後述するグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素で標識した核酸プローブとする場合には、当該色素で標識される少なくとも一つの末端塩基がシトシンであることが好ましい。

一つの実施形態において、本発明の核酸プローブは、配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列と８５％以上の同一性を示す塩基配列をゲノム中に含むＲＳウイルス（ＲＳウイルスの変異株を含む）を検出でき、好ましくは、配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列と９０％以上、より好ましくは９３％以上、更に好ましくは９５％以上、更により好ましくは９８％以上の同一性を示す塩基配列をゲノム中に含むＲＳウイルスを検出できる核酸プローブであり得る。

特定の実施形態では、本発明の核酸プローブは、（Ａ－１）で示される塩基配列において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列（Ａ－２）を含むプローブであり得る。置換、欠失、挿入若しくは付加し得る塩基の数は、好ましくは１又は２個であり得る。このように塩基の置換、欠失、挿入若しくは付加を有する場合、該プローブはミスマッチ塩基を含むといい、本発明においてはこのようなミスマッチ塩基を含むプローブも好適に使用できる。このようなミスマッチ塩基を含むプローブを用いることにより、ＲＳウイルスのサブグループＡ型及びＢ型の両方を検出し易くなるという利点がある。

本明細書において、ミスマッチ塩基（又は単に「ミスマッチ」ともいう）を含むとは、標的核酸の塩基配列（標的核酸が核酸増幅反応後に二本鎖となる場合は、二本鎖が解離したいずれか一本鎖の核酸の塩基配列）と相補的ではない塩基を含むことをいう。例えば、標的核酸の塩基配列にシトシン塩基が存在する場合において、プローブにおける当該シトシン塩基に対応する位置の塩基がグアニン以外の塩基（例えば、アデニン塩基、シトシン塩基、チミン塩基、及びユニバーサル塩基）となっていることをいう。例えば、変異し易い標的核酸の領域を検出する場合には、変異し易い塩基に対応するプローブの位置にミスマッチ塩基（例えば、ユニバーサル塩基）を選択することができる。

本発明の核酸プローブがミスマッチ塩基を含む場合、ミスマッチ塩基の位置は、本発明の効果を阻害しない限り特に限定されない。より確実に核酸増幅産物を検出し易くなるという観点からは、ミスマッチ塩基は各プローブの末端塩基ではないことが好ましい。例えば、ミスマッチ塩基の位置は、プローブを構成する塩基配列全長ｎの中央（ｎが奇数の場合、(ｎ＋１)／２、ｎが偶数の場合、ｎ／２）から前後に８ｍｅｒ以内が好ましく、前後に７ｍｅｒ以内がより好ましく、前後に６ｍｅｒ以内が更に好ましく、前後に５ｍｅｒ以内が更により好ましい。

一つの好ましい実施形態において、本発明の核酸プローブは、配列番号１若しくは配列番号２に示される塩基配列の２７番目～６１番目に示される塩基配列に相補的な塩基配列において連続する少なくとも１０塩基以上の塩基配列であって、配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列の４５番目～５２番目に対して相補的な塩基配列を少なくとも含む塩基配列、又はその塩基配列において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列を含むプローブである。好ましくは配列番号１若しくは配列番号２に示される塩基配列の４０番目～６１番目に示される塩基配列に相補的な塩基配列において連続する少なくとも１０塩基以上の塩基配列であって、配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列の４５番目～５２番目に対して相補的な塩基配列を少なくとも含む塩基配列、又はその塩基配列において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列を含むプローブである。これらのプローブにおいて、配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列の４５番目～５２番目に対して相補的な塩基配列中の置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基の数は、０個、１個、又は２個が好ましく、０個又は１個であることがより好ましい。このようなプローブと核酸増幅産物とを反応させることで、より良好にＲＳウイルスを検出することができる。

本発明の核酸プローブの長さとしては、特に限定されないが、例えば、１０塩基以上、好ましくは１４塩基以上であり、通常、２６塩基以下、好ましくは２０塩基以下である。プローブの長さは、より好ましくは１４～２６塩基、更に好ましくは１４～２０塩基であり得る。このような長さのプローブを用いることで、より高感度にＲＳウイルスを検出することができる。

特定の好ましい実施形態において、本発明の核酸プローブの具体例としては、配列番号３～７のいずれかで示される塩基配列に対して相補的な塩基配列、或いはそれらの塩基配列において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列を含むプローブを挙げることができる。このような特定の塩基配列を有するプローブを用いることにより、より一層高感度にＲＳウイルスを検出することができる。

上記のプローブは、５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されていることを特徴とする。一つの実施形態において、本発明の核酸プローブは、該核酸プローブの塩基配列に対して相補的な塩基配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９３％以上、更に好ましくは９５％以上、更により好ましくは９８％以上の同一性を示す塩基配列を含む核酸と結合した場合に消光又は蛍光を生じるように標識されていることが好ましく、消光を生じるように標識されていることがより好ましい。標識物質としては特に制限はないが、蛍光色素であることがより好ましい。

蛍光色素としては特に標的の核酸増幅産物とハイブリダイズして複合体を形成することにより蛍光を生じる蛍光物質又は消光を生じる蛍光物質のいずれであってもよいが、好ましくは標的の核酸増幅産物とハイブリダイズした際に消光を生じる蛍光物質であり、特に好ましくは、標的の核酸増幅産物とハイブリダイズにおいてグアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素（例えば、グアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素）である。具体的には、フルオロセイン及びその誘導体（例えば、フルオロセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ））、ローダミン及びその誘導体（例えば、５－カルボキシローダミン６Ｇ（ＧＲ６Ｇ）、テトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、カルボキシローダミン、ｘ－ローダミン、スルホローダミン１０１酸クロリド）、並びにＢＯＤＩＰＹ及びその誘導体（例えば、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ／Ｃ３、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ／Ｃ６、ＢＯＤＩＰＹ－５－ＦＡＭ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ－ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ－Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ－５６４、ＢＯＤＩＰＹ－５８１、ＢＯＤＩＰＹ－５９１、ＢＯＤＩＰＹ－６３０、ＢＯＤＩＰＹ－６５０、ＢＯＤＩＰＹ－６６５）からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素が挙げられるが、これらに限定されない。

より具体的には、グアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素として、例えば、４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ（ＣＲ６Ｇ），ＴＡＭＲＡ，ローダミン６Ｇ，テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）、及び２－オキソ－６，８－ジフルオロ－７－ジヒドロキシ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－３－カルボン酸（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素を挙げることができ、本発明にはこれらの蛍光消光色素が好適に使用され得る。

特定の好ましい実施形態では、蛍光消光色素で標識されている末端塩基がシトシンであるプローブがより好ましい。このようなプローブは、核酸増幅産物にハイブリダイズした際に、核酸増幅産物中のグアニン塩基と塩基対を形成して相互作用することで消光できるため、非常に簡便に反応液の蛍光強度の変化を測定することができる。

なお、該プローブがハイブリダイズした際に、該プローブのシトシン塩基と核酸増幅産物中のグアニン塩基が塩基対を形成しなくとも、それらの塩基同士の距離が近ければ蛍光は消光できる。例えば、詳細は特許第５３５４２１６号公報に記載があり、本発明も該技術を参照できる。即ち、該プローブがハイブリダイズした際に、該プローブのシトシン塩基に対して、核酸増幅産物中のグアニン塩基が例えば１～３塩基の範囲内に存在すれば消光できる（シトシン塩基と塩基対を形成する塩基を１とする）。

従って、蛍光消光色素で標識されている少なくとも一つの末端塩基がシトシンでない核酸プローブであっても、反応液の蛍光強度の変化を測定できる。例えば、詳細は特許第５３５４２１６号公報に記載があり、本発明も該技術を参照できる。例えば、該プローブがハイブリダイズした際に、蛍光消光色素が標識されている末端塩基に対して、核酸増幅産物中のグアニン塩基が例えば１～３塩基の範囲内に存在すれば消光できる（末端塩基と塩基対を形成する塩基を１とする）。

特定の好ましい実施形態において、本発明の核酸プローブを工程（３）で用いる。このように本発明の核酸プローブを用いることでＲＳウイルスのサブグループＡ型及び／又はＢ型を検出できる。とりわけ、本発明の方法は、一般に重症化し易いとされているＲＳウイルスのサブグループＡ型の検出に優れている。また、本発明の方法は、本発明のプローブを１種類使用してもよいし、２種類以上組み合わせて使用してもよい。特定の好ましい実施形態では、本発明の方法は、１種類の標識プローブを使用するだけで、ＲＳウイルスのサブグループＡ型及びＢ型の両方を検出することができる。

一つの実施形態において、工程（３）は、以下の工程（３－ａ）、（３－ｂ）、及び（３－ｃ）の少なくとも一つを含む態様であり得る：
（３－ａ）工程（２）と同時に、反応液中の核酸増幅産物に本発明の核酸プローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度を測定することで、工程（２）の反応（核酸増幅反応）の進行をリアルタイムでモニターする工程。
（３－ｂ）工程（２）の終了後に、反応液中の核酸増幅産物に本発明の核酸プローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度を測定することで、工程（２）の反応（核酸増幅反応）の進行をエンドポイントでモニターする工程。
（３－ｃ）工程（２）の終了後に、反応液中の核酸増幅産物に本発明の核酸プローブをハイブリダイズさせ、該反応液の蛍光強度の温度依存性を測定する工程。
工程（３－ａ）、（３－ｂ）、又は（３－ｃ）により、簡便、迅速、且つ高感度に、核酸増幅産物と核酸プローブとで形成される複合体の生成を検出することができる。工程（３－ａ）、（３－ｂ）、及び（３－ｃ）は組み合わせて実施してもよく、例えば、工程（３－ａ）及び（３－ｂ）の両方、又は工程（３－ａ）及び（３－ｃ）の両方を行うこともできる。一つの実施形態では、より迅速に核酸増幅産物の検出を行う観点から、工程（３－ｂ）又は（３－ｃ）が好ましい。特に工程（３－ｃ）、すなわち融解曲線解析法が好ましい。

（工程（３－ａ））
工程（３－ａ）は、核酸増幅反応の進行をリアルタイムでモニターする方法（所謂、リアルタイムＰＣＲ法）であり、既知濃度のコントロール物質と比較することにより、定量解析が可能である。

（工程（３－ｂ））
工程（３－ｂ）は、核酸増幅反応の進行をエンドポイントでモニターすることで、検体試料中に含まれる標的核酸を迅速に検出することができる。さらに、エンドポイントでの蛍光強度等を比較することでおおよその標的核酸量も推定可能である。
例えば、蛍光消光色素で標識された核酸プローブを含む反応液の蛍光強度を測定することで、核酸増幅反応の進行をエンドポイントでモニターする。核酸増幅反応終了後に、反応液の蛍光強度を測定し、反応後の反応液の蛍光強度を反応前の反応液の蛍光強度と比較することで、標的核酸の増幅の有無を確認することができる。或いは、反応後の反応液の蛍光強度をコントロール反応液の蛍光強度と比較することでも検体試料中に含まれる標的核酸の有無を確認することができる。コントロール反応液とは、測定したい検体試料の代わりに陰性と判明している試料或いは陽性と判明している試料を加えた反応液である。
核酸増幅反応の進行は、一般的にリアルタイムでモニターする必要があるが、より迅速、簡便に検出する目的では、エンドポイントで測定することが好ましい。

（工程（３－ｃ））
工程（３－ｃ）において、蛍光強度の温度依存性を測定するとは、具体的には、反応液の温度を低温から高温に変化させながら、各温度における蛍光強度を測定することであり得る。得られた蛍光強度について温度で一次微分することにより、使用する核酸プローブに固有の融解温度（Ｔｍ値）を求めることができる。また、蛍光強度は目的に合わせて蛍光消光率等に変換してもよい。
Ｔｍ値を用いた標的核酸の検出、分析等を融解曲線分析という。一般的に、Ｔｍ値は、オリゴヌクレオチドがその相補鎖と二本鎖を形成している割合と二本鎖を形成せず一本鎖である割合が等しいときの温度をいう。Ｔｍ値は、塩基配列に固有の値であるため、融解曲線分析は標的核酸の塩基配列多型を分析する手法として使用できる。ここでいう塩基配列多型とは、一塩基多型、塩基置換、塩基欠損、塩基挿入等を含む。

一例として、融解曲線分析はＳＮＰ解析等にも応用されている。プローブに対して標的核酸の塩基配列に変異がある場合、プローブがハイブリダイズした際に塩基がミスマッチしているため、一般的にＴｍ値は低くなる。したがって、Ｔｍ値の大きさを比較することで一塩基多型の解析（ＳＮＰ解析）も行うことができる。

［検体試料］
本発明において使用できる検体試料はＲＳウイルスを含む可能性のあるものであれば特に限定されない。例えば、ＲＳウイルスへの感染が疑われる被験体から採取した、口腔内擦過物、咽頭拭い液、鼻咽頭拭い液、鼻腔拭い液、鼻腔吸引液、喀痰、気管支洗浄液、肺胞洗浄液、唾液等が挙げられるが、これらに限定されない。生体試料を測定対象の検体試料とする場合、各生体試料に応じて、特に制限はされないが、希釈又は懸濁、遠心、酵素処理等の前処理若しくは核酸抽出を行ってもよい。

検体試料の採取方法、調製方法等は、特に制限されず、検体試料の種類、目的に応じて公知の方法を用いることができる。特定の好ましい実施形態では、検体試料は、ＲＮＡを単離・精製した試料でなくてもよく、例えば、生体から採取した検体をタンパク質分解酵素（例えば、プロテイナーゼＫ）処理及び／又は熱処理（例えば、６０～１００℃で１秒～１０分間）によるタンパク分解変性処理をし、検体中に存在しているＲＮａｓｅ（リボヌクレアーゼ）及びＤＮａｓｅ（ＤＮＡ分解酵素）を予め分解除去した試料をそのまま用いてもよい。

核酸抽出の方法は、特に制限されないが、検体試料の種類、目的に応じて公知の方法を用いることができる。核酸抽出としては、主にＲＮＡを抽出するものであっても、ＲＮＡ及びＤＮＡを区別せずに核酸を抽出するものでもよい。核酸抽出には、例えば、各メーカーから販売されているキット等を使用してもよい。例えば、QIAamp Viral RNA Mini Kit（ＱＩＡＧＥＮ社）が挙げられる。また、自動抽出精製装置を用いてもよい。

特定の好ましい実施形態において、検体試料は、従来の核酸増幅反応において通常は必須と考えられていた核酸精製工程を省略したものであってもよい。核酸精製を行う場合、専用試薬が必要であることに加えて、作業が煩雑で手間と時間がかかるという問題がある。核酸精製工程を省略した検体試料を用いる場合、検体試料の採取から遺伝子検査結果を得るまでの時間を短縮することができ、例えば、検体試料の採取から遺伝子検査結果が得られるまでの時間を１日以内、好ましくは半日以内、より好ましくは６時間以内、更に好ましくは３時間以内、なかでも好ましくは２時間以内（例えば、１時間以内）とすることが可能となる。このように、核酸精製工程を経ていない検体試料を用いて本発明の方法を行う場合、核酸精製の手間を省くことができ、簡便且つ短時間でＲＳウイルスを検出することができる。

［ＲＳウイルスを検出するための試薬］
別の実施形態として、本発明は、ＲＳウイルスを検出するための試薬を提供する。試薬には、前述で説明した本発明の核酸プローブに加えて、逆転写反応、核酸増幅反応、及び検出に必要な成分を少なくとも含むことが好ましい。当該必要な成分は、それぞれ公知のものを用いることができる。例えば、本発明の試薬は、逆転写用核酸プライマー、ＰＣＲ用核酸プライマーセット、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、及びマグネシウム塩等の無機塩類を少なくとも含むことが好ましい。逆転写用核酸プライマーを兼ねたＰＣＲ用核酸プライマーセット及び検出用核酸プローブは、ＲＳウイルスの複数領域を増幅させるために複数セットを含むことができる。各成分の濃度は適宜調整できるが、例えば、核酸プローブは０．０１～１μＭが好ましく、０．０２～０．５μＭがより好ましい。核酸プローブセットとして使用する場合は、該プローブセットに含まれる各核酸プローブがそれぞれ上記濃度の範囲内であることが好ましい。核酸プライマーは０．０１～１０μＭが好ましい。逆転写酵素は０．０１～１０Ｕ／μＬが好ましく、０．０２～２Ｕ／μＬがより好ましい。ＤＮＡポリメラーゼは０．０１～１Ｕ／μＬが好ましく、０．０２～０．５Ｕ／μＬがより好ましい。デオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）は０．０２～１ｍＭが好ましく、０．１～０．５ｍＭがより好ましい。マグネシウム塩等の無機塩類は０．１～１０ｍＭが好ましく、１～５ｍＭがより好ましい。

さらに、非特異増幅の抑制や反応促進を目的として、本発明の試薬は、当該技術分野で知られる添加物等を含んでいてもよい。非特異増幅の抑制を目的とする添加物として、公知の抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体、リン酸等が挙げられる。反応促進を目的とする添加物として、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、プロテアーゼインヒビター、シングルストランド結合タンパク質（ＳＳＢ）、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ｔＲＮＡ、硫黄又は酢酸含有化合物類、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、トリメチレングリコール、ホルムアミド、アセトアミド、ベタイン、エクトイン、トレハロース、デキストラン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ゼラチン、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、水酸化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＨ）、酢酸テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＡ）、ポリエチレングリコール、カルニチン、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）、ツイーン（Ｔｗｅｅｎ２０）、ノニデットＰ４０等が挙げられる。また、ターゲットであるＲＳウイルスのゲノムＲＮＡの分解を低減させるため、本発明の試薬は、ＲＮＡ分解酵素の阻害剤又は抑制剤（例えば、ＲＮａｓｅインヒビター）を含んでいてもよい。また、偽陰性の判定を容易にするために、本発明の試薬は、当該分野で公知のインターナルコントロールを含むことも好ましい。本発明では、これらの添加物を１種類単独で又は２種類以上組み合わせて使用してもよい。

［ＲＳウイルスを検出するための試薬キット］
別の実施形態として、本発明は、ＲＳウイルスを検出するための試薬キットが提供される。本発明のキットは、前述で説明した本発明の核酸プローブ又は本発明の試薬を含み、ＲＳウイルスを検出（鑑別を含む）できるように構成されていれば特に限定されない。例えば、本発明のキットは、被検出対象の存在を検出又は定量することができる試薬、及び／又は、使用方法等を説明する使用説明書等を任意に含むことができる。例えば、本発明のキットは、前記核酸プローブ、逆転写反応に必要な成分、核酸増幅反応に必要な成分、及び増幅産物の検出に必要な成分を同じ容器に封入したもの又は別々の容器に封入したものを、例えば一つの包装体に梱包し、当該キットの使用方法に関する情報を含む態様で提供することができる。また、本発明のキットは、陽性コントロール液及び／又は陰性コントロール液を含めることもできる。

以下、本発明の実施例に基づき具体的に説明する。本発明は下記実施例に限定されるものではない。

〔試験例１：核酸プローブの評価１〕
（１）試料の調製
ＲＳウイルスのサブグループＡ型から粗抽出されたＲＮＡを滅菌水で段階希釈し、１００コピー／テストとなるように調製し、試料とした。
（２）逆転写、核酸増幅、融解曲線解析、及び判定
上記試料をそれぞれ下記試薬に添加して、下記条件によりＲＳウイルスのサブグループＡ型の検出を行った。逆転写、核酸増幅及び融解曲線解析には東洋紡製ＧＥＮＥＣＵＢＥ（登録商標）を使用した。判定は、融解曲線解析にてピークが得られた場合に陽性と判定した。

（試薬）
図１に示すように設計した各標識プローブａ～ｊの性能を比較するため、ジーンキューブ（登録商標）テストベーシック（東洋紡社製）及びReverTra Ace（登録商標）を使用して以下の溶液を調製した。ジーンキューブ（登録商標）テストベーシック（東洋紡社製）及びReverTra Ace（登録商標）は、それぞれの取扱説明書に記載の通りに使用量を調整して使用した（ReverTra Ace（登録商標）は０．１Ｕ／μＬで使用）。試薬には、核酸増幅が正常に行われたかを確認するための既知配列のインターナルコントロール（ＩＣ）も添加した。
３．０μＭ 配列番号８で示されるプライマー
０．５μＭ 配列番号９で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるプライマー
０．４μＭ 配列番号３～７、１３、１４で示される塩基配列に対して相補的な塩基配列、又は配列番号１０～１２で示される塩基配列からなる各プローブａ～ｊ（すべて３’末端をＣＲ６Ｇで標識）

（逆転写、核酸増幅及び融解曲線解析）
４２℃・２分
９７℃・１５秒
（以上１サイクル）
９７℃・１秒
５８℃・３秒
６３℃・５秒
（以上５０サイクル）
９４℃・３０秒
３９℃・３０秒
４０℃～７５℃（０．０９℃／秒で温度上昇）
上記の逆転写反応開始から融解曲線解析終了までに要した時間は、３５分間であった。

（３）結果
図２は、配列番号３に対して相補的な塩基配列からなるプローブａを用い、核酸増幅及び融解曲線解析によってＲＳウイルスサブグループＡ型ＲＮＡの検出を行った際に得られた検出グラフである。図２に示される通り、該プローブａでは４９℃付近で検出ピークが得られている。

試験例１で用いた核酸プローブによる測定結果を表１にまとめた。配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列の４５番目～５２番目の８塩基の塩基配列に相補的な塩基配列を含む核酸プローブ（プローブａ～ｅ）を選択することによってＲＳウイルスサブグループＡ型ＲＮＡを検出可能できた。しかし全く予想外のことに、配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列の４５番目～５２番目の８塩基に対応する領域を含んでいても、配列番号１又は２で示される順鎖の塩基配列において同様の核酸プローブを設計した場合には融解曲線解析で上手く検出できていない（プローブｆ～ｈ）。また、配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列に対して相補的な塩基配列において核酸プローブを設計しても、配列番号１又は２で示される塩基配列の４５番目～５２番目の８塩基に対応する領域を含まない場合は検出できないことが明らかになった（プローブｉ～ｊ）。

また、プローブａ、ｃ、ｄ、及びｅは、図１に示されるように、配列番号１又は２で示される塩基配列に対して相補的な塩基配列と完全に同一ではなくミスマッチ塩基を含むが、十分な感度でＲＳウイルスのサブグループＡ型を検出できることが示された。

〔試験例２：核酸プローブの評価２〕
（１）試料の調製
ＲＳウイルスのサブグループＢ型から粗抽出されたＲＮＡを滅菌水で段階希釈し、１００コピー／テストとなるように調製し、試料とした。
（２）逆転写、核酸増幅、融解曲線解析、及び判定
試験例１と同様にして、ＲＳウイルスサブグループＢ型の検出を行った。

（試薬）
試験例１において使用した、プローブａ、ｃ、ｄ、ｆ、及びｉの各プローブを用いて、ジーンキューブ（登録商標）テストベーシック（東洋紡社製）及びReverTra Ace（登録商標）を使用して以下の溶液を調製した。試験例１と同様に、ジーンキューブ（登録商標）テストベーシック（東洋紡社製）及びReverTra Ace（登録商標）は、それぞれの取扱説明書に記載の通りに使用量を調整して使用した（ReverTra Ace（登録商標）は０．１Ｕ／μＬで使用）。試薬には、核酸増幅が正常に行われたかを確認するための既知配列のインターナルコントロール（ＩＣ）も添加した。
３．０μＭ 配列番号８で示されるプライマー
０．５μＭ 配列番号９で示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるプライマー
０．４μＭ プローブａ、ｃ、ｄ、ｆ、又はｉの各プローブ（すべて３’末端をＣＲ６Ｇで標識）

（逆転写、核酸増幅及び融解曲線解析）
試験例１と同様の条件で実施した。

（３）結果
図３は、配列番号３に対して相補的な塩基配列からなるプローブａを用い、核酸増幅及び融解曲線解析によってＲＳウイルスサブグループＢ型ＲＮＡの検出を行った際に得られた検出グラフである。図３に示される通り、該プローブａでは５４℃付近で検出ピークが得られている。

試験例２で用いた核酸プローブによる測定結果を表２にまとめた。配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列の４５番目～５２番目の８塩基の塩基配列に相補的な塩基配列を含む核酸プローブ（プローブａ、ｃ、ｄ）を選択して使用することによってＲＳウイルスのサブグループＢ型ＲＮＡも検出可能であることが示された。一方、試験例１と同様に、配列番号１又は配列番号２で示される塩基配列の４５番目～５２番目の８塩基に対応する領域を含んでいても、配列番号１若しくは２で示される順鎖の塩基配列において同様の核酸プローブを設計した場合（プローブｆ）、又は、配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列に対して相補的な塩基配列において核酸プローブを設計しても、配列番号１又は２で示される塩基配列の４５番目～５２番目の８塩基に対応する領域を含まない場合（プローブｉ）はサブグループＢ型のＲＮＡも検出できないことが示された。

また、試験例１の結果と比べると、本発明のプローブ（プローブａ、ｃ、ｄ）によるＲＳウイルスのサブグループＡ型の検出温度とサブグループＢ型の検出温度は異なっていた。従って、この検出温度の差を利用することで、本発明のプローブは、ＲＳウイルスのサブグループＡ型とＢ型を判別することも可能であることが分かった。

本発明の核酸プローブを使用することで、例えば融解曲線解析法において、簡便、迅速、且つ高感度に試料中に含まれ得るＲＳウイルスを検出できる。本発明により、高い信頼性でＲＳウイルスを検出することを可能とし、臨床診断等等において大きく貢献することができる。

Claims (18)

1. 以下の特徴（Ａ）及び（Ｂ）を有する、ＲＳウイルス検出用プローブ：
   （Ａ）以下の（Ａ－１）又は（Ａ－２）の塩基配列を含む；
   （Ａ－１）配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列に相補的な塩基配列において連続する少なくとも１０塩基以上の塩基配列であって、配列番号１若しくは配列番号２で示される塩基配列の４５番目～５２番目に対して相補的な塩基配列を少なくとも含む塩基配列、又は
   （Ａ－２）（Ａ－１）の塩基配列において１～３個の塩基が置換、欠失、挿入若しくは付加した塩基配列；及び
   （Ｂ）５’末端又は３’末端のいずれか一方のみが標識されている。
2. 前記（Ａ）の塩基配列の長さが１４～２６塩基である、請求項１に記載のプローブ。
3. 前記（Ａ）の塩基配列が、配列番号３～７のいずれかで示される塩基配列に対して相補的な塩基配列を含む、請求項１又は２に記載のプローブ。
4. 前記（Ｂ）の標識が蛍光色素標識である、請求項１～３のいずれかに記載のプローブ。
5. 前記（Ｂ）の標識が、前記プローブの塩基配列に対して相補的な塩基配列と９０％以上の同一性を示す塩基配列を含む核酸と結合した場合に消光する蛍光消光色素による標識である、請求項１～４のいずれかに記載のプローブ。
6. 前記（Ｂ）の標識が、グアニンとの相互作用により消光する蛍光消光色素による標識である、請求項１～５のいずれかに記載のプローブ。
7. 前記（Ｂ）の標識が、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、並びにＢＯＤＩＰＹ及びその誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素による標識である、請求項１～６のいずれかに記載のプローブ。
8. 前記（Ｂ）の標識が、４，４－ジフルオロ－５，７－ジメチル－４－ボラ－３ａ，４ａ－ジアザ－ｓ－インダセン－３－プロピオン酸（ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ）、カルボキシローダミン６Ｇ，ＴＡＭＲＡ，ローダミン６Ｇ，テトラブロモスルホンフルオレセイン（ＴＢＳＦ）、及び２－オキソ－６，８－ジフルオロ－７－ジヒドロキシ－２Ｈ－１－ベンゾピラン－３－カルボン酸（Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ）からなる群より選択される少なくとも１つの蛍光消光色素による標識である、請求項１～７のいずれかに記載のプローブ。
9. 前記（Ｂ）において、標識されている末端塩基がシトシンである、請求項１～８のいずれかに記載のプローブ。
10. 請求項１～９のいずれかに記載のプローブを用いて、検体試料中に含まれ得るＲＳウイルスを検出する方法。
11. 以下の工程（１）、（２）、及び（３）：
    （１）前記検体試料中のターゲットのＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する工程、
    （２）工程（１）のｃＤＮＡを鋳型として１又は複数の核酸増幅産物を生成する工程、及び
    （３）工程（２）の１又は複数の核酸増幅産物を、１又は複数の前記プローブを用いて検出する工程
    を含む、請求項１０に記載の方法。
12. 工程（２）がＰＣＲ反応により実施され、前記ＰＣＲ反応に用いる核酸増幅酵素が、ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼである請求項１１に記載の方法。
13. ファミリーＢに属するＤＮＡポリメラーゼが、ＫＯＤ由来のＤＮＡポリメラーゼ又はその変異体である、請求項１２に記載の方法。
14. 工程（３）が融解曲線解析法により実施される、請求項１１～１３のいずれかに記載の方法。
15. 工程（１）の逆転写反応に用いる逆転写活性を有する酵素が、Ｍ－ＭＬＶ（Moloney Murine Leukemia Virus）由来のリバーストランスクリプターゼ又はその変異体である、請求項１１～１４のいずれかに記載の方法。
16. ＲＳウイルスのサブグループＡ型及びＢ型の両方を検出する、請求項１０～１５のいずれかに記載の方法。
17. ＲＳウイルスをサブグループＡ型及びサブグループＢ型のいずれであるかを判別して検出する、請求項１０～１６のいずれかに記載の方法。
18. 請求項１～９のいずれかに記載のプローブを含む、ＲＳウイルスを検出するための試薬キット。

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