SK3022001A3 - Nucleotide sequences for the tal gene - Google Patents
Nucleotide sequences for the tal gene Download PDFInfo
- Publication number
- SK3022001A3 SK3022001A3 SK302-2001A SK3022001A SK3022001A3 SK 3022001 A3 SK3022001 A3 SK 3022001A3 SK 3022001 A SK3022001 A SK 3022001A SK 3022001 A3 SK3022001 A3 SK 3022001A3
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- gene
- polynucleotide
- gene encoding
- seq
- amino acid
- Prior art date
Links
- 101150106193 tal gene Proteins 0.000 title claims abstract description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims description 15
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 13
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 11
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 claims abstract 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 91
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 33
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 22
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 19
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 13
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 12
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 10
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 10
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 6
- 102100031126 6-phosphogluconolactonase Human genes 0.000 claims description 5
- 108010029731 6-phosphogluconolactonase Proteins 0.000 claims description 5
- 108010018962 Glucosephosphate Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 5
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 claims description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 5
- 101150110333 opcA gene Proteins 0.000 claims description 5
- 101150104606 pgl gene Proteins 0.000 claims description 5
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 5
- 108020001657 6-phosphogluconate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004567 6-phosphogluconate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010064711 Homoserine dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 4
- 108010053763 Pyruvate Carboxylase Proteins 0.000 claims description 4
- 102100039895 Pyruvate carboxylase, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 4
- 102000014701 Transketolase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010043652 Transketolase Proteins 0.000 claims description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 4
- 101150063051 hom gene Proteins 0.000 claims description 4
- 101150078419 zwf gene Proteins 0.000 claims description 4
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 claims description 3
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 3
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 claims description 3
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 claims description 3
- 101150024271 TKT gene Proteins 0.000 claims description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 3
- 241000186254 coryneform bacterium Species 0.000 claims description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 3
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 claims description 3
- 108091000044 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase Proteins 0.000 claims description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 2
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 claims description 2
- 102000005731 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 claims description 2
- 108010042687 Pyruvate Oxidase Proteins 0.000 claims description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 2
- 101150107963 eno gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150044424 lysE gene Proteins 0.000 claims description 2
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 claims description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 2
- 108010081616 FAD-dependent malate dehydrogenase Proteins 0.000 claims 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims 2
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L (R)-2-Hydroxy-3-(phosphonooxy)-propanal Natural products O=C[C@H](O)COP([O-])([O-])=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-L 0.000 claims 1
- LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N D-glyceraldehyde 3-phosphate Chemical compound O=C[C@H](O)COP(O)(O)=O LXJXRIRHZLFYRP-VKHMYHEASA-N 0.000 claims 1
- 101100174653 Dictyostelium discoideum g6pd-2 gene Proteins 0.000 claims 1
- 101100537319 Escherichia coli (strain K12) tktA gene Proteins 0.000 claims 1
- 101100170068 Mus musculus Ddr2 gene Proteins 0.000 claims 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 claims 1
- 101150085516 ZWF1 gene Proteins 0.000 claims 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 claims 1
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N phosphoenolpyruvic acid Chemical compound OC(=O)C(=C)OP(O)(O)=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 101150026856 zwf2 gene Proteins 0.000 claims 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 3
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 26
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 24
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 24
- 239000000047 product Substances 0.000 description 23
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 19
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical class NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 17
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 14
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 13
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 8
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 238000011160 research Methods 0.000 description 8
- 108020004530 Transaldolase Proteins 0.000 description 7
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 7
- -1 pentose phosphate Chemical class 0.000 description 7
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 6
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 6
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 5
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 5
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 5
- 102100028601 Transaldolase Human genes 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 4
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 3
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-MBOVONDJSA-N (2r,3r,4s,5r)-2-(hydroxymethyl)-6-propan-2-ylsulfanyloxane-3,4,5-triol Chemical compound CC(C)SC1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-MBOVONDJSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 101150073818 gap gene Proteins 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 101150014950 gnd gene Proteins 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 2
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 108010024995 quinoline 2-oxidoreductase Proteins 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- GHSJKUNUIHUPDF-UHFFFAOYSA-N s-(2-aminoethyl)-l-cysteine Chemical compound NCCSCC(N)C(O)=O GHSJKUNUIHUPDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- UKUVVAMSXXBMRX-UHFFFAOYSA-N 2,4,5-trithia-1,3-diarsabicyclo[1.1.1]pentane Chemical compound S1[As]2S[As]1S2 UKUVVAMSXXBMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100298079 African swine fever virus (strain Badajoz 1971 Vero-adapted) pNG2 gene Proteins 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- 241000908115 Bolivar Species 0.000 description 1
- 241000186146 Brevibacterium Species 0.000 description 1
- 244000060011 Cocos nucifera Species 0.000 description 1
- 235000013162 Cocos nucifera Nutrition 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 230000000970 DNA cross-linking effect Effects 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 101100465553 Dictyostelium discoideum psmB6 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 1
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 1
- BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N L-lysine hydrochloride Chemical compound Cl.NCCCC[C@H](N)C(O)=O BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241001625930 Luria Species 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100169519 Pyrococcus abyssi (strain GE5 / Orsay) dapAL gene Proteins 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 241001672648 Vieira Species 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 description 1
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 235000019728 animal nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 150000007514 bases Chemical class 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 101150011371 dapA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000003500 gene array Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003978 infusion fluid Substances 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 1
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 description 1
- KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N linolenic acid Natural products CC=CCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 101150035025 lysC gene Proteins 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940049920 malate Drugs 0.000 description 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-L malate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)C(O)CC([O-])=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000013586 microbial product Substances 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 101150094267 mqo gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 101150053253 pgi gene Proteins 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K phosphonatoenolpyruvate Chemical compound [O-]C(=O)C(=C)OP([O-])([O-])=O DTBNBXWJWCWCIK-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 229920001522 polyglycol ester Polymers 0.000 description 1
- 101150060030 poxB gene Proteins 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 101150096049 pyc gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N sodium 2-[[2-[[hydroxy-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyphosphoryl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound [Na+].C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NP(O)(=O)OC1OC(C)C(O)C(O)C1O IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1022—Transferases (2.) transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
- C12P13/227—Tryptophan
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Description
NUKLEOTIDOVÉ SEKVENCIE PRE TAL GÉN
Oblasť techniky
Vynález určuje nukleotidové sekvencie, ktoré kódujú tal gén a proces fermentačnej prípravy aminokyselín, predovšetkým L-lyzínu, L-treonínu, L-izoleucínu a Ltryptofánu s využitím patogénnych baktérií so zosileným tal génom.
Doterajší stav techniky
Aminokyseliny, predovšetkým L-lyzín, sa používajú v humánnej medicíne a vo farmaceutickom priemysle, ale hlavne ako súčasť potravy pre zvieratá.
Známy je spôsob prípravy aminokyselín fermentáciou kmeňov patogénnych baktérií, predovšetkým kmene Corynebacterium glutamicum. Vzhľadom k ich veľkému významu sa stále prejavuje snaha o zlepšenie procesu prípravy týchto látok. Zlepšenie môže nastať skvalitnením vlastnej fermentácie, napríklad miešaním a prídavkom kyslíka, alebo zložením živnej pôdy, napríklad správnou koncentráciou cukru počas fermentácie, prípadne tiež spracovaním produktu napríklad iónovymieňačovou chromatografiou alebo ovplyvnením výstupných vlastností mikroorganizmov.
Ku zlepšeniu výstupných vlastností týchto mikroorganizmov sa používajú metódy mutagenézy, selekcie a selekcie mutanta. Týmto spôsobom sa získavajú kmene rezistentné voči antimetabolitom, ako je napríklad analóg lyzínu S-(2-aminoetyl)cysteín, alebo kmene auxotrofné pre regulačné metabolity a produkujúce L-aminokyseliny, napríklad L-lyzín.
Už niekoľko. rokov sa k skvalitneniu kmeňov Corynebacterium produkujúcich aminokyseliny používa technika rekombinovanej DNA tak, že sa posilnia individuálne gény biosyntézy aminokyselín a skúma sa vplyv tejto metódy na produkciu príslušnej aminokyseliny.
K tejto problematike sa vzťahujú okrem iných aj nasledujúca publikácia: Kinoshita: „Glutamic Acid Bacteria z Biology of Industrial Microorganism, Demain and Solomon (Eds.), Benjamín Cummings, London, 1985, 115-142; Hilliger: BioTec 2, 1991, 40-44; Eggeling: Amino Acids 6, 1994, 261272; Jetten and Sinskey: Critical Reviews in Biotechnology 15, 1995, 73-103; Sahm et al: Annuals of the New York Academy of Science 782, 1996, 25-39.
Význam pentózového fosfátového cyklu z hľadiska biosyntézy a produkcie aminokyselín, predovšetkým L-lyzínu patogénnymi baktériami bol a je predmetom záujmu vela odborníkov.
Oishi a Aida uviedli v Agricultural and Biological Chemistry 29, 1965, 83-89, správu o „skrate monofosfátu hexózy Brevibacterium ammoniagenes. Sugimoto a Shio v Agricultural and Biological Chemistry 51, 1987, 101-108 píšu o regulácii dehydrogenázy glukózy 6-fosfátu v Brevibacterium flavum.
Podstata vynálezu
Autori predkladaného vynálezu prinášajú nové možnosti zlepšenia fermentační prípravy aminokyselín, predovšetkým Llyzínu, L-treonínu, L-izoleucínu a L-tryptofánu.
Popis vynálezu
Aminokyseliny, predovšetkým L-lyzín, sa využívajú v humánnej medicíne, farmaceutickom priemysle a prednostne vo výžive zvierat. Preto je všeobecný záujem o nové metódy zlepšujúce proces prípravy požadovaných aminokyselín, predovšetkým L-lyzínu.
Ak sa v nasledujúcom texte uvádza L-lyzín alebo lyzín, znamená to nielen základnú zlúčeninu, ale tiež jej sol, napríklad lyzín monohydrochlorid alebo lyzín sulfát.
Vynález uvádza polynukleotid izolovaný z patogénnych baktérií, obsahujúci jednu z nasledujúcich sekvencií
a) polynukleotid identický aspoň z 70 % s polynukleotidom kódujúcim polypeptid, ktorý obsahuje sekvenciu aminokyselín SEQ ID č. 2 alebo SEQ ID č. 4,
b) polynukleotid kódujúci polypeptid, ktorý obsahuje sekvenciu aminokyselín najmenej z 70 % identickú s SEQ ID č. 2 alebo SEQ ID č. 4,
c) polynukleotid komplementárny k polynukleotidu a) alebo b), a
d) polynukleotid obsahujúci aspoň 15 po sebe idúcich nukleotidov z polynukleotidovej sekvencie a), b) alebo c).
Vynález tiež uvádza polynukleotid nárokovaný v nároku 1, čo je predovšetkým DNA schopná replikácia, ktorá obsahuje:
(i) nukleotidovú sekvenciu zo skupiny tvorenej SEQ ID č. 1 a SEQ ID č. 3, alebo (ii) aspoň jednu sekvenciu odpovedajúcu sekvencii (i) stupňom degenerácie genetického kódu, alebo (iii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá sa zjednocuje so sekvenciou komplementárnou k (i) alebo (ii), a lubovolne tiež (iv) citlivé mutácie neutrálnej funkcie v (i).
Vynález ďalej uvádza polynukleotid nárokovaný v nároku 4 obsahujúci jednu zo sekvencii uvedenú v SEQ ID č.1 a SEQ ID č.3, polynukleotid nárokovaný v nároku 5, ktorý kóduje polypeptid obsahujúci sekvenciu aminokyselín uvedenú v SEQ ID č.2 a SEQ ID č.4, bacilonosič obsahujúci polynukleotid nárokovaný v nároku 1, patogénne baktérie, bacilonosiča.
ktoré slúžia ako hostiteľ r »·
Vynález ďalej uvádza polynukleotidy z podstatnej časti tvorenej sekvenciou, ktorou možno získať hybridizáciou odpovedajúceho génového radu obsahujúceho úplný gén s polynukleotidovou sekvenciou SEQ ID č. 1 alebo SEQ ID č. 3, s detekciou zahrnujúcou už uvedený polynukleotid podía SEQ ID č. 1 alebo SEQ ID č. 3, prípadne jeho časť, a tiež izoláciu uvedenej sekvencie DNA.
Polynuklotidové sekvencie uvádzané v predkladanom vynáleze sú vhodnými hybridizačnými detektormi RNA, cDNA a DNA k tomu, aby izolovali v plnej dĺžke cDNA kódujúcu transaldolázu a tie cDNA alebo gény, ktorých sekvencie je velmi podobná sekvencii génu transaldolázy.
Ďalej sú polynukleotidové sekvencie uvádzané v predkladanom vynáleze vhodným základom pre prípravu DNA génov transaldolázu reťazením polymerázy (PCR).
Oligonukleotidy, ktoré slúžia ako detektory alebo matrice, obsahujú aspoň 30, bežne aspoň 20 a najčastejšie aspoň 15 za sebou idúcich nukleotidov. Sú vhodné aj oligonukleotidy obsahujúce najmenej 40 až 50 nukleotidov.
Výraz „izolovaný znamená separovaný od svojho prírodného prostredia.
„Polynukleotid obecne znamená polynukleotidy a polydeoxyribonukleotidy vychádzajúce z nemodifikovaných alebo modofikovaných RNA, prípadne DNA.
„Polypeptidy sa rozumie peptidy alebo proteiny, ktoré obsahujú dve alebo viacej aminokyselín viazaných peptidovými väzbami.
r r
- 6 Polypeptidy v predkladanom vynáleze zahrnujú polypeptidy zo SEQ ID č. 2 alebo SEQ ID č. 4, predovšetkým tie, ktoré vykazujú biologickú aktivitu transaldolázy, a tiež tie, ktoré obsahujú najmenej 70 % polypeptidu z SEQ ID č. 2 alebo SEQ ID č. 4, pritom najvýznamnejšie sú tie, ktoré obsahujú najmenej 80 % alebo ešte lepšie 90 až 95 % polypeptidu z SEQ ID č. 2 alebo SEQ ID č. 4 a majú vyššie spomínanú aktivitu.
Vynález sa tiež zabýva procesom fermentačnej prípravy aminokyselín, predovšetkým L-lyzínu, L-treonínu, Lizoleucínu a L tryptofánu, za použitia korynoformných baktérií, ktoré predovšetkým už produkujú aminokyselinu a v ktorých sa zosilujú alebo dokonca prepisujú nukleotidové sekvencie pre talový gén.
Výraz „zosilenie v tejto súvislosti vyjadruje zvýšenie intracelulárnej aktivity jedného alebo viacej enzýmov v mikroorganizmu kódovanom odpovedajúcou DNA, napríklad zvýšením počtu kópií génu alebo génov za použitia účinného katalyzátora alebo použitím vysoko aktívneho génu, ktorý kóduje odpovedajúci enzým, prípadne lubovolné kombinácie týchto možností.
Mikroorganizmy uvádzané v predkladanom vynáleze pripravujú L-aminokyseliny, predovšetkým L-lyzín z glukózy, sacharózy, laktózy, fruktózy, maltózy, melasy, škrobu, celulózy, nebo z glycerolu a etanolu. Predstavujú je patogénne baktérie, predovšetkým typu Corynebac téri um, z ktorých sa najviac cituje druh Corynebacterium glutamicum známy medzi odborníkmi práve pre svoju schopnosť produkovať L-amino kys e1iny.
r p
Vhodnými reťazcami typu Corynebacterium, predovšetkým druhu Corynebacterium glutamicum, sú napríklad známe štandardné reťazce
Corynebacterium Corynebacteri um Corynebacterium Corynebacterium Corynebacterium Breviba c t eri um Brevibacterium Brevibacterium glutamicum ATCC13032 acetoglutamicum ATCC15806 acetoacidophilium ATCC13870 thermoaminogenes FERM BP-1539 melassecola ATCC17965 flavum ATCC14067 lactofermentum ATCC13869 a di var i cat umATCCl 4020 a L-lyzín produkujúci mutanty alebo z nich pripravené reťazce, ako napríklad
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709 Brevibacterium flavum FERM-P 1708 Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712 Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463 Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 a Corynebacterium glutamicum ATCC13032 Corynebacterium glutamicum DM58-1 Corynebacterium glutamicum DSM12866 a L-treonín produkujúci mutanty alebo z nich pripravené reťazce, ako napríklad
Corynebacterium glutamicum ATCC21649 Brevibacterium flavum BB69 Brevibacterium flavum DSM5399 pripravené
Brevibacterium lactofermentum FEBM-BP 269 Brevibacterium lactofermentum TBB-10 a L-izoleucín produkujúci mutanty alebo z nich reťazce, ako napríklad
Corynebacterium glutamicum ATCC 14309 Corynebacterium glutamicum ATCC 14310
Corynebacterium glutamicum ATCC 14311
Corynebacterium glutamicum ATCC 15168
Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6871 a L-tryptofán produkujúci mutanty alebo z nich pripravené reťazce, ako napríklad
Corynebacterium glutamicum ATCC21850 a Corynebacterium glutamicum KY9218 (pKW9901) .
Autorom predkladaného vynálezu sa podarilo izolovať nový ťal gén Corynebacterium glutamicum, ktorý kóduje transaldolázu (EC 2.2.1.2).
Izolácia talového génu a tiež iných génov Corynebacterium glutamicum, rovnako ako rad týchto mikroorganizmov sa prvýkrát uviedla v E. coli. Usporiadanie génových radov sa popisuje v bežných učebniciach a príručkách. Ako príklady sa môžu uviesť Winnacker: Gene und Clone, Eine Einftlhrung in die Gentechnologie (Genes and Clones, An Introduction to Genetic Engineering), Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990 alebo Sambrook et al.: Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. Známy génový rad z K-12 reťazca
W3110 z E. coli v Á vektoroch sa popisuje v Kohara et al. : Celí, 50 (1987), 495-508. Bathe et al.: Molecular and General Genetics, 252:255-256(1996) popisuje génový rad Corynebacterium glutamicum ATCC13032, ktorý bol zostavený pomocou bacilonosiča SuperCos I (Wahl et al.: Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84 (1987), 2160-2164) v E. coli K-12 reťazec NM554 (Raleigh et al.: Nucleic Acids Research, 16 (1988), 1563-1575). Bôrmann et al.: Molecular Microbiology, 6(3), (1992), 317-326, zasa popisujú génový rad Corynebacterium glutamicum ATCC13032 s použitím kozmidu pHC79 (Hohn and Collins, Gene 11, (1980), 291-298). O'Donohue: The Cloning and Molecular Analysis of Four Common Aromatic Amino Acid Biosynthetic Genes from Corynebacterium glutamicum, Ph.D. Thesis, National University of Ireland, Galway, 1997, popisuje klonovanie génov Corynebacterium glutamicum za použitia λ Zap systému popísaného v Short et al.: Nucleic Acid Research, 16, 7583. Génový rad Corynebacterium glutamicum v E. coli je tiež možné pripraviť za použitia plazmidov, ako napríklad pBR322 (Bolivar: Life Sciences, 25, (1979), 807-818) alebo pUC9 (Vieira et al.: Gene, 19, (1982), 259-268). Vhodnými hostiteľmi sú predovšetkým ty E. coli reťazce, ktoré sú reštrikčné a rekombinačne defektné. Príkladom takého reťazca je reťazec DH5amcr, ktorý sa popisuje v Grant et al.: Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87, (1990), 4645-4649. Dlhé fragmenty DNA klonované pomocou kozmidov sa potom môžu striedavo subklonovať a následne radiť v obvyklých smeroch vhodných pre radenie, ako sa popisuje napríklad v Sanger et al.: Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 74, (1977), 5463-5467.
Získané sekvencie DNA sa môžu skúmať známymi algoritmami alebo programami pre sekvenčnú analýzu, ako sa
- 10 /· r
Biologies
National popisuje napríklad v Staden.: Nucleic Acids Research, 14, (1986), 217-232, Butlerovým GCG programom (Butler.: Methods of Biochemical Analysis, 39 (1998), 74-97), FASTA algoritmom (Pearson and Lipman: Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 85, (1988), 2444-2448) alebo BLAST algoritmom (Altschul et al.: Náture Genetics, 6, (1994), 119-129), a tiež porovnaním so sekvenciami popísanými vo verejne prístupných databázach. Takými databázami nukleotidových sekvencií sú napríklad databázy od European Molecular Laboratories (EMBL, Heidelberg, Germany) nebo Center f or Biotechnology Information (NCBI,
Bethesda, MD, USA).
Vynález sa zabýva novou sekvenciou DNA z C. glutamicum, ktorá obsahuje časť DNA kódujúcu ťal gén, zobrazenú ako SEQ ID č. 1 a SEQ ID č. 3. Sekvencia aminokyseliny odpovedajúceho proteínu sa okrem toho získava zo stávajúcej sekvencie DNA už popísanými metódami. Výsledný produkt sekvencie aminokyseliny talového génu zobrazuje SEQ ID č. 2 a SEQ ID č. 4.
Génové zoskupenie získané vyššie uvedeným spôsobom sa môže ešte preveriť krížením so vzorkami nukleotidov známej sekvencie, ako napríklad so zwf génom (JP-A09224661). Klonovaná DNA z klonov vykazujúcich pri hybridizácii pozitívnu reakciu vedie striedavo na známu nukleotidovú sekvenciu použitej vzorky a na priľahlej novej sekvencie DNA.
Predmetom predkladaného vynálezu je tiež kódovanie DNA sekvencií vznikajúcich z SEQ ID č. 3 degeneráciou genetického kódu. Obdobne sú predmetom tohto vynálezu DNA sekvencie, ktoré sa krížia so SEQ ID č. 3 alebo jej r f r r ŕ r
- 11 - ľ 'r · ; : :
časťami. Tradičné zameniteľnosti aminokyseliny v proteínoch, ako napríklad zameniteľnosť glycínu za alanín alebo asparágovej kyseliny za glutámovú, sú medzi odborníkmi známe ako „citlivé mutácie, ktoré nevedú k zásadným zmenám v aktivite proteínov, tzn. majú neutrálnu funkciu. Je taktiež známe, že zmeny koncových N alebo C (prípadne oboch) u proteínov nemajú rušivý vplyv a dokonca môžu stabilizovať ich funkciu. Informácie o tejto problematike prináša okrem iného i Ben-Bassat et al.: Journal of Bacteriology ,169, 1987, 751-757; O'Regan et al.: Gene, 77, 1989, 237-251; Sahin-Toth et al.: Protein Sciences, 3, 1994, 240-247; Hochuli et al.: Bio/Technology, 6, 1988, 1321-1325, a tiež známe učebnice genetiky a molekulárnej biológie. Predkladaný vynález sa zabýva taktiež sekvenciami aminokyselín vznikajúcimi odpovedajúcim spôsobom zo SEQ ID č. 2 a SEQ ID č. 4.
Obdobne sú predmetom predkladaného vynálezu sekvencie DNA, ktoré sa krížia s SEQ ID NO 3 alebo časťami SEQ ID č. 3. Konečne sa vynález zabýva aj sekvenciami DNA, ktoré sa pripravujú polymerázovou reťazovou reakciou (PSR) s využitím primérov pochádzajúcich z SEQ ID č. 3. Pre také oligonukleotidy je typická dĺžka najmenej 15 nukleotidov.
Pokyny pre určenie DNA sekvencii krížením sú k nájdeniu okrem iné v príručke „The DIG System Users Guide for Filter Hybridization z nakladateľstva Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993) a v Liebl et al.: International Journal of Systematic Bacteriology, 41, 1991, 255-260.
Pokyny pre rozšírenie DNA sekvencii za pomoci polymerázovej reťazovej reakcie (PSR) sa uvádzajú okrem iného v príručke Gait: Oligonucleotide synthesis: a practical approach, IRL Press, Oxford, UK, 1984 a v Newton and Graham: PCR, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994.
Autori predkladaného vynálezu zistili, že korynoformné baktérie produkujú vo väčšej miere aminokyseliny po zmene charakteru tal génu. Aby sa dosiahlo zmeny, počet kópií odpovedajúcich génov sa zvýši alebo sa zmení promotór a regulačná oblasť, prípadne oblasť ribozómovej väzby protismerne štrukturálnemu génu. Na rovnakom princípe fungujú kazety, ktoré sa pripoja protismerne k štruktúrnemu génu. S indukovatelnými promotórmi je možné dodatočne zvýšiť expresiu počas vzniku fermentatívnej L-aminokyseliny. Expresie sa okrem iného zdokonalia pri predĺženie životnosti mRNA. Naviac sa aktivita enzýmov zvyšuje prevenciou rozkladu enzýmových proteínov. Gény alebo génové skladby sa vyskytujú v plazmidoch s kolísajúcim počtom kópií alebo sa začleňujú a integrujú v chromozóme. Inak sa spomínaného precharakterizovania génov môže dosiahnuť tiež zmenou zloženia média a kultivačného procesu.
Odborné pokyny týkajúce sa tohto problému sú okrem iného v publikáciách Martin et al.: Bio/Technology 5, 1987, 137-146; Guerrero et al.: Gene 138, 1994, 35-41; Tsuchiya and Morinaga: Bio/Technology 6, 1988, 428-430; Eikmanns et al.: Gene 102, 1991, 93-98; popis európskeho patentu EPS 0 472 869; US patent 4 601 893; Schwarzer and Puhler: Bio/Technology 9,1991 83-87; Reinscheid et al.: Applied and Environmental Microbiology 60, 1994, 126-132, La Barre et al.: Journal of Bacteriology 175, 1993, 1001-10077, patentová prihláška WO 96/15246; Malumbres et al: Gene 134, 1993, 15-24; popis Japonského patentu JP-A-10-229891; Jensen and Hammer: Biotechnology and Bioengineering 58, 1998, 191Ρ Γ
195; Makrides: Microbiological Reviews 60, 1996, 512-538, a tiež v známych učebniciach genetiky a molekulárnej biológie.
V praktickej časti s tal gén popisovaný v predkladanom vynálezu prepísal pomocou plazmidov. Vhodnými plazmidmi sú tie, ktoré sa replikujú v korynoformnej baktérii. Rad známych plazmidových bacilonosičov, ako napríklad pZl (Menkel et al.: Applied and Environmental Microbiology 64, 1989, 549-554), pEKExl (Eikmanns et al.: Gene 102, 1991, 9398) alebo pHS2-l (Sonnen et al.: Gene 107, 1991, 69-74) je založená na zakódovaných plazmidoch pHM1519, pBLl alebo pGAl. Obdobným spôsobom sa môžu použiť aj ďalšie plazmidové bacilonosiče, napríklad tie, ktoré sú založené na pCG4 (patent US-A 4,489,160) alebo na pNG2 (Serwold-Davis et al.: FEMS Microbiology Letters, 66, 1990, 119-124), prípadne na pAGl (patent US-A 5,158,891).
Vhodnými plazmidovými bacilonosičmi sú ešte také, ktoré umožňujú využitie procesu génovej amplifikácie integrácií do chromozómu, ako popisuje napríklad Reinscheid et al.: Applied and Environmental Microbiology, 60, 1994, 126-132, pre duplikáciu alebo rozšírenie hom-thrB operónu. Touto metódou sa kompletný gén klonuje na plazmidové bacilonosiče, ktoré sa môžu replikovať v tele hostiteľa (typický je E. coli), ale nie v C. glutamicum. Možnými bacilonosičmi sú napríklad pSUP301 (Šimon et al.: Bio/Technology 1, 1983, 784-791), pK18mob alebo pK19mob (Schäfer et al.: Gene, 145, 1994, 69-73), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman: Journal of biological Chemistry, 269, 1994, 32678-84; US-A 5,487,993), pCR®Blunt (Invitrogen, Groningen, Holland; Bernard et al.: Journal of Molecular Biology, 234, 1993, 534-541), pEMl (Schrumpf et al.: Journal of Bacteriology, 173, 1991, 4510-4516) alebo pBGS8 (Spratt et al.: Gene, 41, 1986, 337-342). Plazmidový bacilonosič, ktorý obsahuje zosilujúci gén, sa potom konjugáciou alebo transformáciou premenuje na požadovaný reťazec C. glutamicum. Konjugačnú metódu popisuje napríklad Schäfer et al.: Applied and Environmental Microbiology, 60, 1994, 756759. Transformačná metóda sa popisuje napríklad v publikáciách Thierbach et al.: Applied Microbiology and Biotechnology, 29, 1988, 356-362, Dunican and Shivnan: Bio/Technology, 7, 1989, 1067-1070 a Tauch et al.: FEMS Microbiological Letters, 123, 1994, 343-347. Po homologickej rekombinácii tzv. „cross over spôsobom výsledný reťazec obsahuje najmenej dve kópie spomínaného génu.
Príkladom plazmidového bacilonosiča, z ktorého pomocou prebieha proces amplifikácie integrácií, je pSUZl, ktorý ukazuje obrázok 1. Plazmid pSUZl sa skladá z bacilonosiča E. coli pBGS8 popisovaného v Spratt et al.: Gene, 41, 1986, 337-342, do ktorého sa inkorporuje talový gén.
Pre výrobu aminokyselín môže byť naviac výhodné zosilniť alebo zmeniť prioritu jedného alebo viacej enzýmov určitej biosyntetickej cesty, glykolýzy, anaplerózy, pentózového fosfátového cyklu alebo exportu aminokyselín, okrem talového génu.
Tak napríklad pre prípravu L-aminokyselín, predovšetkým L-lyzínu, jeden alebo viacej génov zo skupiny obsahujúcej • dapA gén kódujúci dihydrodipikolinát syntázu (EP-B 0 197 335), • lysC gén kódujúci k spätnej väzbe rezistentný aspartát kinázu (Kalinowski et al.: Molecular and General
Genetics, 224, 1990, 317-324), • gap gén kódujúci glycerolaldehyd 3-fosfát dehydrogenázu (Eikmanns: Journal of Bacteriology, 174, 1992, 6076-6086), • PYC gén kódujúci pyruvát karboxylázu (DE-A-198 31 609), • mqo gén kódujúci malát:chinolín oxidoreduktázu (Molenaar et al.: European Journal of Biochemistry, 254, 1998, 395-403), • tkt gén kódujúci transketolázu (zápis č. AB023377 v databáze European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Germany)), • gnd gén kódujúci 6-fosfoglukonát dehydrogenázu (JP-A224662), • zwf gén kódujúci glukózu 6-fosfát dehydrogenázu (JP-A224661), • lysE gén kódujúci export lyzínu (DE-A-195 48 222), • zwal gén (DE 199 59 328,0; DSM 13115), • eno gén kódujúci enolázu(DE: 19947791.4), • devB gén, • opcA gén (DSM 13264), sa posilnia a pokial možno súčasne prepíše.
Ďalej napríklad pre prípravu L-treonínu jeden alebo viacej génov zo skupiny obsahujúcej • súčasne hom gén kódujúci homoserín dehydrogenázu (Peoples et al.: Molecular Microbiology, 2, 1988, 6372) nebo homdr alelu kódujúcu „k spätnej väzbe rezistentné homoserín dehydrogenázu (Archer et al.: Gene, 107, 1991, 53-59), • gap gén kódujúci glycerolaldehyd 3-fosfát dehydrogenázu (Eikmanns: Journal of Bacteriology, 174, 1992, 60766086), • pyc gén kódujúci pyruvate karboxylázy (DE-A-198 31
609), • mgo gén kódujúci malat:chinolín oxidoreduktázu (Molenaar et al.: European Journal of Biochemistry, 254, 1998, 395-403), • tkt gén kódujúci transketolázu (zápis č. AB023377 v databáze European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Germany)), • gnd gén kódujúci 6-fosfoglukonát dehydrogenázu (JP-A-9224662), • zwf gén kódujúci glukózu 6-fosfát dehydrogenázu (JP-A17
9-224661), • thrE gén kódujúci prenos treonínu (DE 199 41 475.5; DSM 12840), • zwal gén (DE 199 59 328,0; DSM 13115), • eno gén kódujúci enolázu (DE: 19947791.4), • devB gén, • opcA gén (DSM 13264), sa zosilní, najlepšie súčasne prepíše.
Pre prípravu aminokyselín k zoslabeniu účinku sú ďalej výhodné • pck gén kódujúce fosfoenol pyruvát karboxykinázu(DE 199 50 409.1 DSM 13047) alebo • pgi gén kódujúci glukózu 6-fosfát izomerázu (US 09/396,478, DSM 12969), prípadne oba tieto gény, alebo • poxB gén kódujúci pyruvát oxidázu (DE 199 51 975.7; DSM 13114) alebo • zwa2 gén (DE 199 59 327.2; DSM 13113) súčasne s amplifikáciou tal génu.
Vedia prepisu tal génu tento proces môže priaznivo ovplyvniť produkciu aminokyselín eliminujúcich nežiadúce vedľajšie reakcie (Nakayama: „Breeding of Amino Acid Producing Micro-organism, v: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic
Press, London, UK, 1982).
Mikroorganizmy pripravované podía predkladaného vynálezu sa môžu kultivovať kontinuálne alebo diskontinuálne jednorázovým procesom (jednorazová kultivácia) alebo fermentáciou (dávkovanie), prípadne opakovanou fermentáciou (opakované dávkovanie) za účelom vzniku Laminokyselín. Súhrn známych kultivačných metód popisujú učebnice Chmiel: Bioprocess Technology 1. Introduction to Bioprocess Technology, Gustáv Fischer Verlag, Stuttgart, 1991 nebo Storhas: Bioreactors and Peripheral Equipment, Vieweg verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994).
Použitelné kultivačné médium musí obsahovať požadované reťazce vo vhodnom usporiadaní. Popis kultivačných médií pre rôzne mikroorganizmy je súčasťou príručky „Manual of Methods for General Bacteriology Americké bakteriologické spoločnosti, Washington D.C., USA, 1981. Ako zdroj uhlíka sa používajú sacharidy a uhlovodíky, ako sú glukóza, sacharóza, laktóza, fruktóza, maltóza, melasa, škrob a celulóza, oleje a tuky, ako sójový olej, slnečnicový olej, podzemnicový olej a kokosové maslo, ďalej mastné kyseliny, ako napríklad palmitová kyselina, stearová kyselina a linolenová kyselina, alkoholy, ako glycerol a etanol, a tiež organické kyseliny, ako napríklad octová kyselina. Tieto látky sa môžu použiť samostatne alebo vo zmesi. Ako zdroj dusíka sa môžu použiť dusík obsahujúci organické zlúčeniny, ako napríklad peptóny, kvasnicový extrakt, masový extrakt, sladový extrakt, výluh zo zrní, sójová múka a močovina, alebo anorganické zlúčeniny, ako síran amónny, chlorid amónny, fosforečnan amónny, uhličitan amónny, dusičnan amónny. Jednotlivé zdroje dusíka sa používajú buď samostatne alebo vo zmesi. Kyselina fosforečná, dihydrogenfosforečnan draselný alebo hydrogenfosforečnan didraselný, prípadne odpovedajúce sodné soli sa používajú ako zdroj fosforu. Kultivačné médium musí ďalej obsahovať soli kovov, ako napríklad síran horečnatý alebo síran železnatý, ktoré sú nezbytné k rastu. Nakoniec sa k vyššie uvedeným zložkám pridajú základné rastové látky, ako aminokyseliny alebo vitamíny. Do kultivačného média sa môžu pridať aj vhodné prekurzory. Spomínané východzie látky sa pridávajú do kultivácie vo forme jednotlivých dávok alebo sa môžu vhodným spôsobom dávkovať v priebehu kultivácie.
K úprave pH kultivácie sa používajú zásadité zlúčeniny, ako hydroxid sodný, hydroxid draselný, amoniak alebo hydroxid amónny, prípadne kyslé zlúčeniny, ako kyselina fosforečná alebo kyselina sírová. Ako protipeniace činidlo sa pridávajú napríklad polyglykolestery mastných kyselín. K udržaniu stability plazmidov sa do média pridávajú aj vhodné látky majúce selektívne účinky, ako napríklad antibiotiká. Pre zachovanie aerobných podmienok sa do kultivácie vháňa kyslík a alebo kyslík v plynnej zmesi, napríklad vzduch. Kultivácia prebieha obvykle pri teplote °C až 45 °C, najviac od 25 °C do 40 °C. Kultivácia prebieha až do vzniku maximálneho množstva Laminokyseliny. Toho sa docieli obvykle za 10 až 160 hodín.
Analýza L-aminokyselín sa prevádza chromatograficky aniónovou výmenou s následnou ninhydrínovou derivatizáciou, ako popisuje Spackman et al.: Analytical Chemistry, 30, 1958, 1190.
Nasledujúce mikroorganizmy sú uložené v Deutsche Sammlung fúr Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ = Germán
Collection of Microorganisms and Celí Cultures,
Braunschweig, Germany) v súlade s Budapest Treaty (budapešťanská dohoda):
• Escherichia coli JM109/pSUZl ako DSM 13263.
SEQ ID NO 1 tiež obsahuje nový gén devB. Proces uvádzaný v predkladanom vynáleze sa používa pre fermentačnú prípravu aminokyselín.
Prehľad obrázkov na výkresoch
K vynálezu sú pridané nasledujúce obrázky:
Obr. 1: Schéma plazmidu pSUZl
Skratky a značky použité v obrázku znamenajú:
lacZ: segmenty lacZa génového fragmentu kan r: rezistencie kanamycínu talí gén transaldolázy ori: pôvod replikácie plazmidu pBGS8
| Bell: | stepné | miesto | reštrikcie | enzýmu | Bell |
| EcoRI: | stepné | miesto | reštrikcie | enzýmu | EcoRI |
| HindlII: | stepné | miesto | reštrikcie | enzýmu | HindlII |
| PstI: | stepné | miesto | reštrikcie | enzýmu | PstI |
| Sací: | stepné | miesto | reštrikcie | enzýmu | Sací |
P P r p
Príklady prevedenia vynálezu
Nasledujúce príklady ilustrujú predkladaný vynález. Použité technológie molekulárnej biológie, napríklad izolácie plazmidovej DNA, liečba reštrikciou enzýmov, ligácie, štandardnej transformácie Escherichia coli atď., popisuje (pokial nie je uvedené inak) Sambrok et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 1989, Cold Spring Harbour Laboratories, USA.
Príklad 1
Príprava génomického radu kozmidového génu z Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Chromozomálna DNA z Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 sa izolovala podľa Tauch et al.: Plasmid, 33, 1995, 168179, a čiastočne štiepila reštrikciou enzýmu Sau3AI (Amersham Pharmacia, kód č. 27-0913-02) . Fragmenty DNA sa defosforylovali pomocou alkalickej fosfatázy z garnáta (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany, Popis produktu SAP, kód č. 1758250). DNA kozmidového bacilonosiča SuperCosl (Wahl et al.: Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84, 1987, 2160-2164), získaná zo Stratagenu (La Jolla, USA, Popis produktu SuperCosl Cosmid Vector Kit, kódové číslo 251301) sa štiepila reštrikciou enzýmu Xbal (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Popis produktu Xbal, kódové číslo 270948-02) a podobne sa defosforylovala pomocou alkalickej fosfatázy z garnáta. Kozmidová DNA sa ďalej štiepila reštrikciou enzýmu BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Popis produktu BamHI, kódové číslo 27-0868-04) . Takto upravená kozmidová DNA sa potom zmiešala s upravenou
ATCC13032 DNA a dávka sa zmiešala s T4 DNA ligázou (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Popis produktu T4DNA-Ligáza, kódové číslo 27-0870-04) . Viazaná zmes sa potom zbalila do fágov pomocou Gigapack II XL obalových extraktov (Stratagene, La Jolla, USA, Popis produktu Gigapack II XL obalový extrakt, kódové číslo 200217). K infikovaniu kmeňom E.coli NM554 (Raleigh et al.: Nucleic Acid Research, 16, 1988, 1563-1575) sa bunky zobrali do 10 mM roztoku MgSO4 a zmiešali sa s odpovedajúcom množstvom suspenzie fágu. Infikácia a titerink kozmidovej série sa previedli podlá popisu Sambrooka et al.: Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor, bunky sa natiahli na agár (Lenox: Virology, 1, 1955, 190) s 100 pg/ml ampicilínu. Po inkubácii cez noc pri 37 °C, sa vybrali rekombinované individuálne klony.
Príklad 2
Izolácia a usporiadanie tal génu
Kozmidová DNA individuálna kolónia sa izolovala Qiaprep Spin Miniprep Kit (Produkt č. 27106, Qiagen, Hilden, Germany) podía výrobných pokynov a čiastočne sa štiepila reštrikciou enzýmu Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, popis produktu Sau3AI, produkt č. 27-0913-02). Fragmenty DNA sa defosforylovali pomocou alkalickej fosfatázy z garnáta (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany, Popis produktu SAP, produkt č. 1758250). Po separácii gélovou elektroforézou sa kozmidové fragmenty veľkosti 1500 až 2000 bp izolovali QiaExII Gel Extraction Kit (produkt č. 20021, Qiagen, Hilden, Germany). DNA sekvenovaného bacilonosiča pZero-1 získaného z Invitrogenu (Groningen, Holland, Popis produktu Zero
Background Cloning Kit, produkt č. K2500-01) sa štiepila reštrikciou enzýmom BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, popis produktu BamHI, produkt č. 27-0868-04) . Prevážanie kozmidových fragmentov v sekvenovanom bacilonosiči sa previedlo podlá popisu uvádzaného v Sambrook et al.: Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor, 1989, zmes DNA inkubovala cez noc s T4 ligázou (Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany). Táto zmes sa potom vpravila do kmeňa E. coli DH5dMCR (Grant: Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87, 1990, 4645-4649) a naniesla sa na LB agár (Lenox:
Virology, 1, 1955, 190) s 50 pg/ml zeocínu. Plazmidová príprava rekombinovaných klonov sa previedla s Biorobotom (produkt číslo 900200, Qiagen, Holden, Germany). Radenie sa prevádzalo dideoxy metódou obmedzujúce reťazenia podlá Sangera et al.: Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 74, 1977, 5463-5467) modifikovanou podlá
Zimmermanna et al.: Nucleic Acids Research, 18, 1990, ’oužilo se „RR dRhodaminové radenie koncového z PE aplikovaných biosystémov (produkt číslo Weiterstadt, Germany). Separácia sa prevádzala gélovou elektroforézou a analýza sekvenčných reakcií prebiehala v „Rotiphoresis NF Acrylamide/Bisacrylamide gélu (29:1), (produkt číslo A124.1, Roth, Karlsruhe, Germany) s radičom „ABI Prism 377 z PE aplikovaných biosystémov (Weiterstadt, Germany).
1067). cyklu 403044,
Hrubé dáta sa ďalej spracovala pomocou balíku programov „Staden program, verzia 97-0 (Nucleic Acids Research, 14, 1986, 217-231). Jednotlivé sekvencie derivátov pZerol sa zostavili kontinuálne do tesnej blízkosti. Počítačom prevádzaná analýza kódovacej oblasti sa pripravila pomocou programu XNIP (Staden, Nucleic Acids Research, 14, 1986,
217-231). Ďalšie analýzy sa prevádzali programom „BLAST search program (Altschul et al.: Nucleic Acids Research/
25, 1997, 3389-3402) proti nepostradatelnej databáze „Národného centra biotechnologických informácií (NCBI,
Bethesda, MD, USA).
Získanú nukleotidovú sekvenciu ukazuje SEQ ID č. la SEQ ID č. 3.
Príklad 3
Klonovanie tal génu
PCR sa použili k zosilneniu fragmentov DNA obsahujúcich všetok tal gén C. glutamicum 13032 a bočných častí (vo smeru aj protismerných). Reakcie PCR sa prevádzali za použitia oligonukleotidových primérov vytvorených zo sekvencie podía popisu uvedeného v príkladoch 1 a 2. Genomická DNA sa izolovala z Corynebacterium glutamicum ATCC13032 podlá Heeryho a Dunicana, Applied and Environmental Microbiology, 59, 1993, 791-799, a použila sa ako šablóna. Použitými tal primérmi boli:
fwd. primér: 5' GGT ACA AAG GGT CTT AAG 3'C rev. primér: 5' GAT TTC ATG TCG CCG TTA 3'
Parametre PCR boli nasledujúce: 35 cyklov
| 95 °C | za 3 minúty |
| 94 °C | za 1 minútu |
| 47 °C | za 1 minútu |
| 72 °C | za 45 sekúnd |
2,0 mM MgCl2 približne 150 - 200 ng šablóny DNA
Získaný produkt PCR sa klonoval do komerčne dostupného bacilonosiča pGEM-T kúpeného od Promega Corp. (pGEM-T Easy Vector Systém 1, kat. č. A1360, promega UK, Southampton, UK) za použitia kmeňa E. coli JM109 (Yanisch-Perron et al.: Gene, 33, 1985, 103-119) ako hostiteľa. Všetok tal gén sa následne izoloval z pGEM-T bacilonosiča na Eco RI fragment a klonoval sa do lacZa EcoRI polohy bacilonosiča E. coli pBGS8 (Spratt et al.: Gene, 41(2-3), 1986, 337-342). Použité reštrikčné enzýmy sa získali od Boehringer Mannheim UK Ltd. (Bell Lane, Lewes East Sussex BN7, UK) a používali sa v súlade s výrobným návodom. E. coli JMI09 sa potom transformoval s touto ligačnou zmesou a produkty elektrotransformácie sa oddelili na Luria agáre s prídavkom izopropyl-tiogalaktopyranozidu (IPTG), 5bromo-4-chloro-3-indolyl-galaktopyranozidu (XGAL) a kanamycínu o koncentráciách lmM, 0,02 % a 50 mg/1. Agárové platne zreli dvanásť hodín pri teplote 37 °C. Plazmidová DNA sa izolovala z jedného transformantu charakterizovaného analýzou reštrikčného enzýmu za použitia Eco RI. Tento nový útvar sa označil pSUZ 1.
Príklad 4
Príprava kmeňa Corynebacterium glutamicum DSM715: :pSUZl
Kmeň DSM5715 sa transformoval s plazmidom pSUZl s použitím elektroporézy, ktorú metódu popísal Liebl et al.: FEMS Microbiology Letters, 53, 1989, 299-303. Delenie transformantov prebiehalo na LBHIS agáre obsahujúcom 18,5 g/1 základného infúzneho roztoku, 0,5 M sorbitol, 5 g/1
- 26 NaCl a 18 g/1 Bakto-agáre, ku ktorému sa pridalo 25 mg/1 kanamycínu. Zrenie prebiehalo 2 dni pri 33 °C.
Pretože bacilonosič pSUZl sa nemôže replikovať v kmeni DSM715, môžu rásť iba klony rezistentné na kanamycín, vznikajúce integráciou pSUZl.
Výsledný integrant sa označil DSM715: :pSUZl.
Príklad 5
Príprava lyzínu
Kmeň C. glutamicum DSM715/pSUZl získaný v príklade 4 sa kultivoval v živnom médiu vhodnom k tvorbe L-lyzínu a stanovil sa obsah L-lyzínu v kultivačnej kvapaline.
Za tým účelom kmeň najprv zrel 24 hodín pri 33 °C na agárovej platni s odpovedajúcim anibiotikom (základný agár s kanamycínom, 25 mg/1). Z kultúry na agárovej platni sa naočkovala predkultivácia (10 ml média v 100 ml kónickej banke). Celé médium CglII sa použilo ako médium pre predkultiváciu.
Médium CglII:
NaCl
2,5 g/1
Bakto-peptón g/1
P ·
P » r t I r r
- P Γ · · t i·
Bakto-kvasinkový extrakt g/l
Glukóza (spracovaná v autokláve samostatne) % (hm.) pH upravené na hodnotu 7,4
Do zmesi sa pridal kanamycín (25 mg/1). Predkultivácia zrela 16 hodín pri 33 °C, za stáleho miešania pri rýchlosti miešadla 240 ot/min. Hlavná kultivácia sa naočkovala z tejto predkultivácie tak, že počiatočný rozmer hlavnej kultivácie (pri 660 nm) bol 0,1. Pre hlavnú kultiváciu sa použilo médium MM.
Médium MM:
CSL (výluh pšeničných zŕn) g/l
MOPS (morfolinopropánsulfónová kyselina) g/l
Glukóza (spracovaná v autokláve samostatne) 50 g/l (NH4)2 SO4 KH2PO4
MgSO4.7 H2O CaCl2.2 H2O FeSO4.7HZO MnSO4. H2O Biotín g/l
0,1 g/l 1,0 g/l 10 mg/1 10 mg/1 5, 0 mg/1
0,3 mg/1 (sterilné filtrovaný) r r
Tiamín.HCl (sterilné filtrovaný) 0,2 mg/1 L-leucín 0,1 g/1 CaCO3 25 g/1
CSL, MOPS a roztok soli sa upravili na pH 7 hydroxidom amónnym a tepelne sa spracovali v autokláve až do vysušenia. Potom sa pridal sterilný substrát a vitamínové roztoky, pritom vzorky boli v autokláve až do vysušení CaCO3.
Kultivácia 10 ml vzorky prebiehala v 100 ml bankách so zarážkami. Pridalo sa 25 mg/1 kanamycínu. Kultivácia prebiehala pri 33 °C a 80% vzdušnej vlhkosti.
Po 24 a 48 hodinách sa zmeral rozmer pri vlnovej dĺžke 660 nm s Biomekom 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Munich) . Množstvo lyzínu sa stanovilo na analyzátore aminokyselín od firmy Eppendorf-BioTronic (Hamburg, Germany) iónovýmieňačovou chromatografiou a následnou derivatizáciou ninhydrínovou detekciou.
Výsledky experimentu ukazuje tabuľka 1.
Tabuľka 1:
| Druh | Čas [hod] | Lyzín-HCl [g/1] |
| DSM715 | 24 | 8,1 |
| DSM715:pSUZl | 24 | 8, 6 |
| DSM715 | 48 | 14,7 |
| DSM715:pSUZl | 48 | 15, 4 |
Polynukleotid izolovaný z koryneformnej baktérie vyznačujúci sa tým, že obsahuje polynukleotidovou sekvenciu vybranú zo skupiny
Claims (16)
- PATENTOVÉNÁROKYa) polynukleotid, ktorý je rozsahu aspoň zo 70 % kódujúcim polypeptid, sekvencie aminokyselín SEQ identický čo do s polynukleotidom ktorý obsahuje ID č. 2 a SEQ IDč. 4,b) polynukleotid kódujúci polypeptid, ktorý obsahuje sekvenciu aminokyselin aspoň zo 70 % identickú čo do rozsahu s aminokyselinovými sekvenciami SEQ ID č. 2 alebo SEQ ID č. 4,c) polynukleotid alebo b) a doplňujúci polynukleotidy a)d) polynukleotid obsahujúci aspoň 15 po sebe nasledujúcich nukleotidov polynukleotidových sekvencii a), b) alebo c).
- 2. Polynukleotid podía nároku 1 vyznačujúci sa tým, že polynukleotid je pokial možno rekombinovaná DNA, ktorá je schopná replikácia v koryneformnej baktérii, a okrem toho obsahuje aspoň jednu nukleotidovú sekvenciu kódujúcu gény tkt, zwf, opcA a devB.
- 3. Polynukleotid podía nároku 1 vyznačujúci sa tým, že polynukleotidom je RNA.
- 4. Polynukleotid podía nároku 2 vyznačujúci sa tým, že obsahuje jednu z nukleotidových sekvencii zobrazených v SEQ ID č. 3.
- 5. Polynukleotid podía nároku 2 vyznačujúci sa tým, že kóduje polypeptidy obsahujúce sekvenciu aminokyselín zobrazenú v SEQ ID č. 2 a SEQ ID č.4.
- 6. DNA podía nároku 2, ktorá je schopná replikácie, vyznačujúci sa tým, že obsahuje (i) nukleotidovú sekvenciu zobrazenú v SEQ ID č. 3, alebo (ii) aspoň jednu sekvenciu zhodujúcu sa so sekvenciami (i) rozsahom degenerácie genetického kódu, alebo (iii) aspoň jednu sekvenciu, ktorá sa kríži so sekvencenciami komplementárnymi k sekvenciam (i) alebo (ii), a konečne (iv) citlivé mutácie neutrálne funkcie v (i).
- 7. Koryneformné baktérie slúžiace ako hostiteľská bunka, vyznačujúci sa tým, že obsahuje bacilonosiča nesúceho polynukleotid podľa nároku1.
- 8. Spôsob prípravy L-aminokyselín vyznačujúci sa tým, že zahrnuje nasledujúce prevádzajúce kroky:a) fermentáciu baktérií produkujúcich požadovanú L-aminokyselinu, v ktorej aspoň tal gén a lubovolne jeden alebo viacej z génov tkt, zwt, devB alebo opcA amplifikujú súčasne,b) koncentráciu požadovaného produktu v médiu alebo v bunkách.baktérií ac) izoláciu požadovanej L-aminokyseliny.
- 9. Spôsob podľa nároku 8 vyznačujúci sa tým, že sa využívajú baktérie, v ktorých sa amplifikujú ďalšie gény z biosyntézy požadovanej Laminokyseliny.
- 10. Spôsob podľa nároku 8 vyznačujúci sa tým, že sa využívajú baktérie, u ktorých metabolické dráhy redukujúce tvorbu požadovanej L-aminokyseliny sa aspoň čiastočne eliminujú.
- 11. Spôsob podľa jedného alebo viacej nárokov 8 až 12 vyznačujúci sa tým, že sa používa koryneformnej baktérie produkujúcej jednu aminoskupinu zo skupiny, do ktorej patrí Llyzín, L-treonín, L-izoleucín alebo L-tryptofán.
- 12. Spôsob fermentačnej prípravy L-aminokyselín, predovšetkým lyzínu podľa nároku 8 vyznačujúci sa tým, že v koryneformných mikroorganizmoch, ktoré predovšetkým už produkujú L-aminokyseliny, sa pritom jeden alebo viacej génov vybraných zo skupiny12.1dapA gén kódujúci dihydrodipikolinát syntázu,12.21ysC gén kódujúci spätnú väzbu rezistentnej aspartát kinázy,12.3gap gén kódujúci glycerolaldehyd 3-fosfát dehydrogenázu,12.4pyc gén kódujúci pyruvát karboxylázu,12.5mqo gén kódujúci malát-chinón oxidoreduktázu,12.6tkt gén kódujúci transketolázu,12.7gnd gén kódujúci 6-fosfoglukonát dehydrogenázu,12.8zwf gén kódujúci glukóza 6-fosfát dehydrogenázu,12.9 lysE gén kódujúci export lyzínu,12.10 zwalgén,12.11 eno gén kódujúci enolázu,12.12 opcA gén amplifikuje alebo prepíše.
- 13. Spôsob fermentačnej prípravy L-treonínu podľa nároku 8 vyznačujúci sa tým, že v koryneformných mikroorganizmoch, ktoré predovšetkým už produkujú L-treonín, sa pritom jeden alebo viacej génov vybraných zo skupiny zahrnujúce13.1 súčasne hom gén kódujúci homoserín dehydrogenázu alebo homdr alela kódujúca „spätne viazanú rezistentnú homoserín dehydrogenázu,13.2gap gén kódujúci glyceraldehyd 3-fosfát dehydrogená zu,13.3pyc gén kódujúci pyruvát karboxylázu,13.4mqo gén kódujúci malát-chinón oxidoreduktázu,13.5tkt gén kódujúci transketolázu,13.6gnd gén kódujúci 6-fosfoglukonát dehydrogenázu,13.7zwf gén kódujúci glukóza 6-fosfát dehydrogenázu,13.8thrE gén kódujúci export treonínu,13.9zwal gén,13.10eno gén kódujúci enolázu, r r13.11opcA gén amplifikuje, predovšetkým prepíše.
- 14. Spôsob podlá nároku 10 vyznačujúci sa tým, že k príprave L-aminokyselín, predovšetkým Llyzínu, L-treonínu, L-izoleucínu alebo Ltryptofánu sa fermentujú baktérie, v ktorých sa jeden alebo viacej génov vybraných zo skupiny zahrnujúcej14.1pck gén kódujúci fosfoenol pyruvát karboxykinázu,14.2pgi gén kódujúci glukózu 6-fosfát izomerázu,14.3poxB gén kódujúci pyruvát oxidázu alebo14.4zwa2 gén súčasne oslabujú.
- 15. Spôsob využitia polynukleotidových sekvencií podlá nároku 1 ako hybridizačných detektorov vyznačujúci sa tým, že sa využíva pre izoláciu cDNA, ktorá kóduje produkt tal génu.
- 16. Spôsob využitia polynukleotidových sekvencií podía nároku 1 ako hybridizačných detektorov vyznačujúci sa tým, že sa využíva pre izoláciu cDNA alebo génov, ktoré sú velmi podobné sekvencií tal génu.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US14291599P | 1999-07-09 | 1999-07-09 | |
| US09/531,266 US6797509B1 (en) | 1999-07-09 | 2000-03-20 | Nucleotide sequences which code for the tal gene |
| PCT/EP2000/006304 WO2001004325A1 (en) | 1999-07-09 | 2000-07-05 | Nucleotide sequences for the tal gene |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK3022001A3 true SK3022001A3 (en) | 2002-04-04 |
Family
ID=26840528
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK302-2001A SK3022001A3 (en) | 1999-07-09 | 2000-07-05 | Nucleotide sequences for the tal gene |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6797509B1 (sk) |
| EP (1) | EP1109915B2 (sk) |
| JP (1) | JP2003504066A (sk) |
| KR (1) | KR100731524B1 (sk) |
| CN (1) | CN1317050A (sk) |
| AT (1) | ATE304596T1 (sk) |
| AU (1) | AU768599B2 (sk) |
| BR (1) | BRPI0006915B8 (sk) |
| CA (1) | CA2348448A1 (sk) |
| DE (1) | DE60022612T3 (sk) |
| ES (1) | ES2249293T5 (sk) |
| HU (1) | HUP0104450A3 (sk) |
| ID (1) | ID29968A (sk) |
| MX (1) | MXPA01002412A (sk) |
| PL (1) | PL202843B1 (sk) |
| RU (1) | RU2001108535A (sk) |
| SK (1) | SK3022001A3 (sk) |
| WO (1) | WO2001004325A1 (sk) |
Families Citing this family (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6822084B1 (en) * | 1999-06-25 | 2004-11-23 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding stress, resistance and tolerance proteins |
| US7270984B1 (en) | 1999-06-25 | 2007-09-18 | Basf Aktiengesellschaft | Polynucleotides encoding a 6-phosphogluconolactonase polypeptide from corynebacterium glutamicum |
| EP1225218A4 (en) * | 1999-09-21 | 2003-04-02 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | NEW TRANSALDOLASE GENE |
| US6713289B2 (en) | 1999-10-05 | 2004-03-30 | Degussa Ag | Nucleotide sequences which code for the eno gene |
| DE19947791A1 (de) * | 1999-10-05 | 2001-04-12 | Degussa | Neue für das eno-Gen codierende Nukleotidsequenzen |
| DE19959328A1 (de) * | 1999-12-09 | 2001-06-13 | Degussa | Neue für das zwa1-Gen codierende Nukleotidsequenzen |
| AU2001285878A1 (en) | 2000-09-12 | 2002-03-26 | Degussa A.G. | Nucleotide sequences which code for the roda gene |
| WO2002022670A1 (en) * | 2000-09-12 | 2002-03-21 | Degussa Ag | Nucleotide sequences coding for the ftsx gene |
| DE10046625A1 (de) * | 2000-09-20 | 2002-04-11 | Degussa | Neue für das ndkA-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
| US20030017554A1 (en) * | 2000-11-15 | 2003-01-23 | Mechthild Rieping | Process for the fermentative preparation of L-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family |
| DE60228715D1 (de) * | 2001-07-18 | 2008-10-16 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur herstellung von l-threonin durch enterobakteriaceae-stämmen mit verstärkter exprimierung der phob- und phor-gene |
| ATE423843T1 (de) | 2001-12-03 | 2009-03-15 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Mutierte 6-phosphogluconat-dehydrogenase |
| DE10219714A1 (de) * | 2002-05-02 | 2003-11-27 | Holland Sweetener Co | Verfahren zur mikrobielien Herstellung von aromatischen Aminosäuren und anderen Metaboliten des aromatischen Aminosäurebiosyntheseweges |
| DE102004003410A1 (de) * | 2004-01-23 | 2005-08-25 | Degussa Ag | Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae |
| US8647642B2 (en) | 2008-09-18 | 2014-02-11 | Aviex Technologies, Llc | Live bacterial vaccines resistant to carbon dioxide (CO2), acidic PH and/or osmolarity for viral infection prophylaxis or treatment |
| KR101335853B1 (ko) | 2011-12-01 | 2013-12-02 | 씨제이제일제당 (주) | Ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 생산하는 방법 |
| EP3404101A3 (en) * | 2011-12-21 | 2018-12-26 | Cj Cheiljedang Corporation | Method for producing l-lysine using microorganisms having ability to produce l-lysine |
| US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
| US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
Family Cites Families (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5835197A (ja) | 1981-08-26 | 1983-03-01 | Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd | プラスミドｐｃｇ２ |
| US4601893A (en) | 1984-02-08 | 1986-07-22 | Pfizer Inc. | Laminate device for controlled and prolonged release of substances to an ambient environment and method of use |
| GB2165546B (en) | 1984-08-21 | 1989-05-17 | Asahi Chemical Ind | A plasmid containing a gene for tetracycline resistance and dna fragments derived therefrom |
| JPH0655149B2 (ja) | 1985-03-12 | 1994-07-27 | 協和醗酵工業株式会社 | Ｌ―リジンの製造法 |
| JPH03147791A (ja) | 1989-11-01 | 1991-06-24 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | 新規ｄｎａ及び該ｄｎａを含有するプラスミド |
| JPH03147792A (ja) | 1989-11-01 | 1991-06-24 | Mitsubishi Petrochem Co Ltd | 新規ｄｎａ及び該ｄｎａを含有するプラスミド |
| DE4027453A1 (de) | 1990-08-30 | 1992-03-05 | Degussa | Neue plasmide aus corynebacterium glutamicum und davon abgeleitete plasmidvektoren |
| WO1992006189A1 (en) | 1990-09-27 | 1992-04-16 | Invitrogen Corporation | Direct cloning of pcr amplified nucleic acids |
| US5693781A (en) | 1991-06-03 | 1997-12-02 | Mitsubishi Chemical Corporation | Promoter DNA fragment from coryneform bacteria |
| JP3473042B2 (ja) | 1992-04-28 | 2003-12-02 | 味の素株式会社 | 変異型アスパルトキナーゼ遺伝子 |
| DE4440118C1 (de) | 1994-11-11 | 1995-11-09 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Die Genexpression in coryneformen Bakterien regulierende DNA |
| DE19548222A1 (de) | 1995-12-22 | 1997-06-26 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Aminosäuren durch gesteigerte Aktivität von Exportcarriern |
| JPH09224662A (ja) | 1996-02-23 | 1997-09-02 | Mitsubishi Chem Corp | ６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼおよびそれをコードするｄｎａ |
| JPH09224661A (ja) | 1996-02-23 | 1997-09-02 | Mitsubishi Chem Corp | グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよびそれをコードするｄｎａ |
| JP3147791B2 (ja) | 1996-10-22 | 2001-03-19 | 住友金属工業株式会社 | センサー追従装置 |
| JPH10229891A (ja) | 1997-02-20 | 1998-09-02 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | マロン酸誘導体の製造法 |
| DE19831609B4 (de) | 1997-10-04 | 2009-11-12 | Evonik Degussa Gmbh | Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren der Aspartat- und/oder Glutamatfamilie und im Verfahren einsetzbare Mittel |
| TR200103706T2 (tr) | 1999-06-25 | 2002-10-21 | Basf Aktiengesellschaft | Karbon metabolizma ve enerji üretimindeki proteinleri kodlayan corynebacterium glutamicum genleri. |
| US7270984B1 (en) * | 1999-06-25 | 2007-09-18 | Basf Aktiengesellschaft | Polynucleotides encoding a 6-phosphogluconolactonase polypeptide from corynebacterium glutamicum |
| EP1109913B1 (en) * | 1999-07-09 | 2006-08-30 | Degussa AG | Nucleotide sequences which code for the opca gene |
| DE19941478A1 (de) | 1999-09-01 | 2001-03-08 | Degussa | Neue für das thrE-Gen codierende Nukleotidsequenzen und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin mit coryneformen Bakterien |
| DE19947791A1 (de) | 1999-10-05 | 2001-04-12 | Degussa | Neue für das eno-Gen codierende Nukleotidsequenzen |
| DE19950409A1 (de) | 1999-10-20 | 2001-04-26 | Degussa | Neue für das pck-Gen codierende Nukleotidsequenzen |
| DE19951975A1 (de) | 1999-10-28 | 2001-05-03 | Degussa | Neue für das poxB-Gen codierende Nuleotidsequenzen |
| JP4623825B2 (ja) | 1999-12-16 | 2011-02-02 | 協和発酵バイオ株式会社 | 新規ポリヌクレオチド |
-
2000
- 2000-03-20 US US09/531,266 patent/US6797509B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-07-05 KR KR1020017003061A patent/KR100731524B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2000-07-05 PL PL346500A patent/PL202843B1/pl unknown
- 2000-07-05 WO PCT/EP2000/006304 patent/WO2001004325A1/en active IP Right Grant
- 2000-07-05 HU HU0104450A patent/HUP0104450A3/hu unknown
- 2000-07-05 CN CN00801335A patent/CN1317050A/zh active Pending
- 2000-07-05 AT AT00956165T patent/ATE304596T1/de not_active IP Right Cessation
- 2000-07-05 EP EP00956165.5A patent/EP1109915B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-07-05 CA CA002348448A patent/CA2348448A1/en not_active Abandoned
- 2000-07-05 BR BRPI0006915A patent/BRPI0006915B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-07-05 JP JP2001509529A patent/JP2003504066A/ja active Pending
- 2000-07-05 ID IDW20010558A patent/ID29968A/id unknown
- 2000-07-05 SK SK302-2001A patent/SK3022001A3/sk unknown
- 2000-07-05 AU AU68220/00A patent/AU768599B2/en not_active Ceased
- 2000-07-05 DE DE60022612.3T patent/DE60022612T3/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-07-05 ES ES00956165.5T patent/ES2249293T5/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-07-05 RU RU2001108535/13A patent/RU2001108535A/ru not_active Application Discontinuation
- 2000-07-05 MX MXPA01002412A patent/MXPA01002412A/es unknown
-
2004
- 2004-05-18 US US10/847,610 patent/US7901913B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-11-08 US US12/941,608 patent/US8445241B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1109915A1 (en) | 2001-06-27 |
| US20040214219A1 (en) | 2004-10-28 |
| DE60022612T2 (de) | 2006-06-29 |
| BR0006915A (pt) | 2001-07-31 |
| CN1317050A (zh) | 2001-10-10 |
| CA2348448A1 (en) | 2001-01-18 |
| AU768599B2 (en) | 2003-12-18 |
| ES2249293T5 (es) | 2014-09-17 |
| DE60022612T3 (de) | 2014-10-30 |
| HUP0104450A3 (en) | 2003-09-29 |
| US6797509B1 (en) | 2004-09-28 |
| BR0006915B1 (pt) | 2014-02-25 |
| ID29968A (id) | 2001-10-25 |
| AU6822000A (en) | 2001-01-30 |
| ES2249293T3 (es) | 2006-04-01 |
| US8445241B2 (en) | 2013-05-21 |
| BRPI0006915B8 (pt) | 2021-05-25 |
| RU2001108535A (ru) | 2003-06-20 |
| EP1109915B1 (en) | 2005-09-14 |
| PL202843B1 (pl) | 2009-07-31 |
| HUP0104450A2 (hu) | 2002-04-29 |
| EP1109915B2 (en) | 2014-05-28 |
| KR20010086395A (ko) | 2001-09-10 |
| MXPA01002412A (es) | 2003-09-10 |
| PL346500A1 (en) | 2002-02-11 |
| KR100731524B1 (ko) | 2007-06-25 |
| US20110117611A1 (en) | 2011-05-19 |
| DE60022612D1 (de) | 2005-10-20 |
| WO2001004325A1 (en) | 2001-01-18 |
| ATE304596T1 (de) | 2005-09-15 |
| US7901913B2 (en) | 2011-03-08 |
| JP2003504066A (ja) | 2003-02-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US8445241B2 (en) | Process for the preparation of L-amino acids | |
| US20060205046A1 (en) | Nucleotide sequences which code for the zwa1 gene | |
| SK3382001A3 (en) | Nucleotide sequences coding for the dapc gene and process for the preparation of l-lysine | |
| US20020055152A1 (en) | Nucleotide sequences which code for the 11dD2 gene | |
| KR100762112B1 (ko) | ｐｔｓＨ 유전자를 암호화하는 신규한 뉴클레오타이드 서열 | |
| US6913910B2 (en) | Nucleotide sequences coding for the glk-gene | |
| US6818432B2 (en) | Nucleotide sequences encoding the ptsH gene | |
| US20020094554A1 (en) | Nucleotide sequences encoding the ptsH gene | |
| US6806068B1 (en) | Nucleotide sequences which encode the pfk gene | |
| US7306939B2 (en) | Nucleotide sequences encoding the gpm gene | |
| SK17372000A3 (sk) | Nukleotidové sekvencie kódujúce gén pfka | |
| US20020055154A1 (en) | Nucleotide sequences which code for the acp gene | |
| US20020102668A1 (en) | Nucleotide sequences which code for the cobW gene | |
| KR20020097245A (ko) | ｃｄｓＡ 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 | |
| KR20020097250A (ko) | ｃｍａ 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 | |
| ZA200101703B (en) | Nucleotide sequences for the tal gene. | |
| KR20030024841A (ko) | ｌｙｓＲ2 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 | |
| KR20020097244A (ko) | ｐｇｓＡ2 유전자를 암호화하는 신규한 뉴클레오타이드 서열 |