DE60022612T3

DE60022612T3 - Tal gen nukleotidsequenzen

Info

Publication number: DE60022612T3
Application number: DE60022612.3T
Authority: DE
Inventors: L. Dunican; Ashling McCormack; Cliona Stapelton; Kevin Burke; Bettina Möckel
Original assignee: Evonik Degussa GmbH; National University of Ireland
Current assignee: Evonik Operations GmbH; National University of Ireland Galway NUI
Priority date: 1999-07-09
Filing date: 2000-07-05
Publication date: 2014-10-30
Anticipated expiration: 2020-07-06
Also published as: BR0006915B1; US20040214219A1; EP1109915B1; CA2348448A1; BR0006915A; RU2001108535A; AU768599B2; EP1109915B2; US6797509B1; US20110117611A1; KR20010086395A; CN1317050A; US7901913B2; AU6822000A; JP2003504066A; ES2249293T5; PL346500A1; KR100731524B1; DE60022612T2; MXPA01002412A

Description

Gegenstand der Erfindung sind für das tal-Gen codierende Nukleotidsequenzen sowie ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Lysin, L-Threonin, L-Isoleucin, unter Verwendung coryneformer Bakterien, in denen das tal-Gen verstärkt wird.
Stand der Technik
Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, finden in der Humanmedizin und in der pharmazeutischen Industrie, insbesondere jedoch in der Tierernährung, Anwendung.
Es ist bekannt, dass Aminosäuren durch Fermentation von Stämmen coryneformer Bakterien, insbesondere Corynebacterium glutamicum, hergestellt werden. Wegen der grossen Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensverbesserungen können fermentationstechnische Maßnahmen wie zum Beispiel Rührung und Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der Nährmedien wie zum Beispiel die Zuckerkonzentration während der Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch zum Beispiel Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst betreffen.
Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man Stämme, die resistent gegen Antimetabolite wie zum Beispiel das Lysinanalog S-(2-Aminoethyl)cystein oder auxotroph für regulatorisch bedeutsame Metabolite sind und L-Aminosäuren wie zum Beispiel L-Lysin produzieren.
Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung von Aminosäuren produzierenden Stämmen von Corynebacterium eingesetzt, indem man einzelne Aminosäure-Biosynthesegene amplifiziert und die Auswirkung auf die Aminosäure-Produktion untersucht.
Übersichtsartikel finden sich in diesem Zusammenhang unter anderem bei Kinoshita (”Glutamic Acid Bacteria” in: Biology of Industrial Microorganisms, Demain und Solomon (Hrsg.), Benjamin Cummings, London, UK, 1985, 115–142), Hilliger (BioTec 2, 40–44 (1991)) Eggeling (Amino Acids 6: 261–272 (1994)) Jetten und Sinskey (Critical Reviews in Biotechnology 15, 73–103 (1995)) sowie Sahm et al. (Annuals of the New York Academy of Science 782, 25–39 (1996)).
Die Bedeutung des Pentosephosphatzyklus für die Biosynthese und Produktion von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, durch coryneforme Bakterien ist Gegenstand zahlreicher Bemühungen unter Fachleuten.
Somit wird von Oishi und Aida (Agricultural and Biological Chemistry 29, 83–89 (1965)) der ”Hexosemonophosphat-Shunt” von Brevibacterium ammoniagenes beschrieben. Von Sugimoto und Shio (Agricultural and Biological Chemistry 51, 101–108 (1987)) wird die Regulation der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase in Brevibacterium flavum beschrieben.
Aufgabe der Erfindung
Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von L-Lysin, L-Threonin, L-Isoleucin, bereitzustellen.
Beschreibung der Erfindung
Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, finden in der Humanmedizin, in der pharmazeutischen Industrie und insbesondere in der Tierernährung Anwendung. Es besteht daher allgemein ein Interesse daran, neue verbesserte Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren, insbesondere L-Lysin, bereitzustellen.
Wenn im folgenden L-Lysin oder Lysin erwähnt werden, sind damit nicht nur die Basen, sondern auch die Salze wie z. B. Lysin-Monohydrochlorid oder Lysin-Sulfat gemeint.
Gegenstand der Erfindung ist ein Polynukleotid aus coryneformen Bakterien mit der enzymatischen Aktivität einer Transaldolase, wobei das Polynukleotid ausgewählt ist unter:

(a) dem Polynukleotid, das für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die identisch mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 ist, codiert,
(b) dem Polynukleotid, das zu dem Polynukleotid aus (a) komplementär ist.

Gegenstand der Erfindung ist ebenso das Polynukleotid, bei dem es sich vorzugsweise um eine DNA handelt, die zur Replikation fähig ist, umfassend:

(i) eine aus der aus SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 3 bestehenden Gruppe gewählte Nukleotidsequenz oder
(ii) wenigstens eine Sequenz, die der Sequenz (i) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes entspricht, oder

Gegenstand der Erfindung ist ebenso
ein Polynukleotid, das eine der Nukleotidsequenzen, wie sie unter SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 3 dargestellt sind, umfasst,
ein Polynukleotid, das für ein Polypeptid codiert, das die Aminosäuresequenz, wie sie unter SEQ ID NO: 2 dargestellt ist, umfasst.
Gegenstand der Erfindung sind ebenso Polynukleotide, die im wesentlichen aus einer Polynukleotidsequenz bestehen, die erhältlich sind durch Screening mittels Hybridisierung einer entsprechenden Genbank, die das vollständige Gen mit der SEQ ID NO. 1 oder SEQ ID NO. 3 entsprechenden Polynukleotidsequenz enthält, mit einer Sonde, die die Sequenz des genannten Polynukleotids gemäss SEQ ID No. 1 oder SEQ ID NO. 3 oder ein Fragment davon enthält, und Isolierung der genannten DNA-Sequenz.
Polynukleotidsequenzen gemäß der Erfindung sind als Hybridisierungssonden für RNA, cDNA und DNA geeignet, um cDNA in voller Länge zu isolieren, die für Transaldolase codiert, oder um solche cDNA oder Gene zu isolieren, die eine hohe Ähnlichkeit der Sequenz mit der des Transaldolase-Gens aufweisen.
Polynukleotidsequenzen gemäß der Erfindung sind weiterhin als Primer zur Herstellung der DNA von für Transaldolase codierenden Genen mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) geeignet.
Solche als Sonden oder Primer dienende Oligonukleotide, enthalten mindestens 30, bevorzugt mindestens 20, ganz besonders bevorzugt mindestens 15 aufeinanderfolgende Nukleotide. Geeignet sind ebenfalls Oligonukleotide mit einer Länge von mindestens 40 oder 50 Nukleotiden.
”Isoliert” bedeutet aus seinem natürlichen Umfeld herausgetrennt.
”Polynukleotid” bezieht sich im allgemeinen auf Polyribonukleotide und Polydesoxyribonukleotide, wobei es sich um nicht modifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA handeln kann.
Unter ”Polypeptiden” versteht man Peptide oder Proteine, die zwei oder mehr über Peptidbindungen verbundene Aminosäuren enthalten.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide schließen ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer Transaldolase ein die identisch sind mit dem Polypeptid gemäß SEQ ID NO. 2.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren, das die folgenden Schritte umfasst:

a) Fermentation eines coryneformen Bakteriums mit einer erhöhten intrazellulären Aktivität einer Transaldolase, wobei die erhöhte intrazelluläre Aktivität durch Überexpression eines Polynukleotids erzielt wird, das für ein Polypeptid mit der enzymatischen Aktivität einer Transaldolase codiert, wobei das Polynukleotid ausgewählt ist aus:
a1) dem Polynukleotid, das für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die eine Identität von mindestens 90% mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist, codiert, in einem Medium, um so die L-Aminosäure zu produzieren,
b) Anreicherung der L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen des Bakteriums,
c) Isolierung der L-Aminosäure, wobei die L-Aminosäuren ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus L-Lysin, L-Threonin oder L-Isoleucin.

Das Verfahren verwendet coryneforme Bakterien, die insbesondere bereits eine Aminosäure produzieren.
Der Begriff ”Verstärkung” beschreibt in diesem Zusammenhang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA codiert werden, indem man beispielsweise die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken Promotor verwendet oder ein Gen verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer hohen Aktivität codiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein rekombinantes coryneformes Bakterium mit einer erhöhten intrazellulären Aktivität einer Transalsolase, wobei die erhöhte intrazelluläre Aktivität durch Überexpression eines Polynukleotids erzielt wird, das für ein Polypeptid mit der enzymatischen Aktivität einer Transaldolase codiert, wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die identisch mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No: 2 ist, codiert.
Die coryneformen Bakterien, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, können insbesondere L-Lysin aus Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um Vertreter der Gattung Corynebacterium handeln. Bei der Gattung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.
Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere der Art Corynebacterium glutamicum, sind besonders die bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
sowie daraus hergestellte L-Lysin produzierende Mutanten bzw. Stämme, wie beispielsweise
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 und
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium glutamicum DM58-1
Corynebacterium glutamicum DSM12866,
und daraus hergestellte L-Threonin produzierende Mutanten bzw. Stämme, wie beispielsweise
Corynebacterium glutamicum ATCC21649
Brevibacterium flavum BB69
Brevibacterium flavum DSM5399
Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 269
Brevibacterium lactofermentum TBB-10,
und daraus hergestellte L-Isoleucin produzierende Mutanten bzw. Stämme, wie beispielsweise
Corynebacterium glutamicum ATCC 14309
Corynebacterium glutamicum ATCC 14310
Corynebacterium glutamicum ATCC 14311
Corynebacterium glutamicum ATCC 15168
Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6871
Die Erfinder haben das für Transaldolase (EC 2.2.1.2) codierende tal-Gen aus C. glutamicum isoliert.
Zur Isolierung des tal-Gens oder auch anderer Gene von C. glutamicum wird zunächst eine Genbank dieses Mikroorganismus in Escherichia coli (E. coli) angelegt. Das Anlegen von Genbanken ist in allgemein bekannten Lehrbüchern und Handbüchern niedergeschrieben. Als Beispiel seien das Lehrbuch von Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990), oder das Handbuch von Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) genannt. Eine sehr bekannte Genbank ist die des E. coli K-12 Stammes W3110, die von Kohara et al. (Cell 50, 495–508 (1987)) in λ-Vektoren angelegt wurde. Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252: 255–265, 1996) beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032, die mit Hilfe des Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160–2164) im E. coli K-12 Stamm NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563–1575) angelegt wurde. Börmann et al. (Molecular Microbiology 6 (3), 317–326, (1992)) wiederum beschreiben eine Genbank von C. glutamicum ATCC13032 unter Verwendung des Cosmids pHC79 (Hohn und Collins, Gene 11, 291–298 (1980)). Von O'Donohue (The Cloning and Molecular Analysis of Four Common Aromatic Amino Acid Biosynthetic Genes from Corynebacterium glutamicum. Dissertation, National University of Ireland, Galway, 1997) wird die Klonierung von C. glutamicum-Genen unter Verwendung des von Short et al. (Nucleic Acids Research, 16: 7583) beschriebenen λ-Zap-Expressionssystems beschrieben. Zur Herstellung einer Genbank von C. glutamicum in E. coli können auch Plasmide, wie beispielsweise pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, 807–818 (1979)) oder pUC9 (Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259–268) eingesetzt werden. Als Wirtsstämme eignen sich insbesondere diejenigen E. coli-Stämme, die restriktions- und rekombinationsdefekt sind. Ein Beispiel hierfür ist der Stamm DH5αmcr, der von Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645–4649) beschrieben wurde. Die mit Hilfe von Cosmiden klonierten langen DNA-Fragmente können anschließend wiederum in gängige, für die Sequenzierung geeignete Vektoren subkloniert und anschließend sequenziert werden, so wie es z. B. bei Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74: 5463–5467, 1977) beschrieben ist.
Die erhaltenen DNA-Sequenzen können dann mit bekannten Algorithmen bzw. Sequenzanalyse-Programmen, wie z. B. dem von Staden (Nucleic Acids Research 14, 217–232 (1986)), dem GCG-Programm von Butler (Methods of Biochemical Analysis 39, 74–97 (1998)), dem FASTA-Algorithmus von Pearson und Lipman (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 85, 2444–2448 (1988)) oder dem BLAST-Algorithmus von Altschul et al. (Nature Genetics 6, 119–129 (1994)), untersucht und mit den Sequenzeinträgen, die in der Öffentlichkeit zugänglichen Datenbanken vorliegen, verglichen werden. Bei den der Öffentlichkeit zugänglichen Datenbanken für Nukleotidsequenzen handelt es sich beispielsweise um die der European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Deutschland) oder die des National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA).
Gegenstand der Erfindung ist die neue DNA-Sequenz von C.glutamicum, die den für das tal-Gen codierenden DNA-Abschnitt, dargestellt als SEQ ID NO 1 und SEQ ID NO 3, enthält. Weiterhin wurde die Aminosäuresequenz des zugehörigen Proteins von der vorliegenden DNA-Sequenz mit den oben beschriebenen Verfahren abgeleitet. Die erhaltene Aminosäuresequenz des tal-Genprodukts ist in SEQ ID NO 2 und SEQ ID NO 4 dargestellt.
Eine auf die oben beschriebene Weise produzierte Genbank läßt sich weiterhin mittels Hybridisierung mit Nukleotidsonden bekannter Sequenz, wie beispielsweise dem zwf-Gen ( JP-A-09224661 ), untersuchen. Die klonierte DNA der Klone, die eine positive Reaktion bei der Hybridisierung zeigen, wird wiederum sequenziert, so daß man einerseits die bekannte Nukleotidsequenz der eingesetzten Sonde und andererseits die benachbarten neuen DNA-Sequenzen erhält.
Codierende DNA-Sequenzen, die sich aus SEQ ID NO 3 durch die Degeneriertheit des genetischen Codes ergeben, sind ebenfalls Bestandteil der Erfindung. In der Fachwelt sind weiterhin konservative Aminosäureaustausche wie z. B. Austausch von Glycin gegen Alanin oder von Asparaginsäure gegen Glutaminsäure in Proteinen als ”Sinnmutationen” (”sense mutations”) bekannt, die zu keiner grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins führen, d. h. funktionsneutral sind. Weiterhin ist bekannt, dass Änderungen am N- und/oder C-Terminus eines Proteins dessen Funktion nicht wesentlich beeinträchtigen oder sogar stabilisieren können. Angaben hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Ben-Bassat et al. (Journal of Bacteriology 169: 751–757 (1987)), bei O'Regan et al. (Gene 77: 237–251 (1989)), bei Sahin-Toth et al. (Protein Sciences 3: 240–247 (1994)), bei Hochuli et al. (Bio/Technology 6: 1321–1325 (1988)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie. Aminosäuresequenzen, die sich in entsprechender Weise aus SEQ ID NO 2 oder SEQ ID NO 4 ergeben, sind ebenfalls Bestandteil der Beschreibung.
In gleicher Weise sind DNA-Sequenzen die mit oder SEQ ID NO 3 oder Teilen davon hybridisieren oder SEQ ID NO 3 ein Bestandteil der Beschreibung. Schließlich sind DNA-Sequenzen Bestandteil der Beschreibung, die durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung von Primern hergestellt werden, die sich aus SEQ ID NO 3 ergeben. Derartige Oligonukleotide haben typischerweise eine Länge von mindestens 15 Nukleotiden.
Anleitungen zur Identifizierung von DNA-Sequenzen mittels Hybridisierung findet der Fachmann unter anderem im Handbuch ”The DIG System Users Guide for Filter Hybridization” der Firma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255–260). Anleitungen zur Amplifikation von DNA-Sequenzen mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) findet der Fachmann unter anderem im Handbuch von Gait: Oligonukleotide synthesis: a practical approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994).
Es wurde gefunden, dass coryneforme Bakterien nach Überexpression des tal-Gens in verbesserter Weise L-Lysin, L-Threonin und L-Isoleucin produzieren.
Zur Erzielung einer Überexpression kann die Kopienzahl der entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die Promotor- und Regulationsregion oder die Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlaufe der fermentativen L-Aminosäure-Produktion zu steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert. Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden.
Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. (Bio/Technology 5, 137–146 (1987)), bei Guerrero et al. (Gene 138, 35–41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428–430 (1988)), bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93–98 (1991)), in der Europäischen Patentschrift 0 472 869 , im US-Patent 4,601,893 , bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84–87 (1991)), bei Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126–132 (1994)), bei LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001–1007 (1993)), in der Patentanmeldung WO 96/15246 , bei Malumbres et al. (Gene 134, 15–24 (1993)), in der japanischen Offenlegungsschrift JP-A-10-229891 , bei Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191–195 (1998)), bei Makrides (Microbiological Reviews 60: 512–538 (1996)) und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.
Das erfindungsgemäße tal-Gen wurde beispielhaft mit Hilfe von Plasmiden überexprimiert.
Als Plasmide eignen sich solche, die in coryneformen Bakterien repliziert werden. Zahlreiche bekannte Plasmidvektoren wie z. B. pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549–554), pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102: 93–98 (1991)) oder pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107: 69–74 (1991)) beruhen auf den kryptischen Plasmiden pHM1519, pBL1 oder pGA1. Andere Plasmidvektoren wie z. B. solche, die auf pCG4 ( US-A 4,489,160 ), oder pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119–124 (1990)), oder pAG1 ( US-A 5,158,891 ) beruhen, können in gleicher Weise verwendet werden.
Weiterhin eignen sich auch solche Plasmidvektoren mit Hilfe derer man das Verfahren der Genamplifikation durch Integration in das Chromosom anwenden kann, so wie es beispielsweise von Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126–132 (1994)) zur Duplikation bzw. Amplifikation des hom-thrB-Operons beschrieben wurde. Bei dieser Methode wird das vollständige Gen in einen Plasmidvektor kloniert, der in einem Wirt (typischerweise E. coli), nicht aber in C. glutamicum replizieren kann. Als Vektoren kommen beispielsweise pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1, 784–791 (1983)), pK18mob oder pK19mob (Schäfer et al., Gene 145, 69–73 (1994)), pGEM-T (Promega corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman (1994). Journal of Biological Chemistry 269: 32678–84; US-A 5,487,993 ), pCR^® Blunt (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534–541 (1993)), pEM1 (Schrumpf et al. 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510–4516) oder pBGS8 (Spratt et al., 1986, Gene 41: 337–342) in Frage. Der Plasmidvektor, der das zu amplifizierende Gen enthält, wird anschließend durch Konjugation oder Transformation in den gewünschten Stamm von C. glutamicum überführt. Die Methode der Konjugation ist beispielsweise bei Schäfer et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756–759 (1994)) beschrieben. Methoden zur Transformation sind beispielsweise bei Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356–362 (1988)), Dunican und Shivnan (Bio/Technology 7, 1067–1070 (1989)) und Tauch et al. (FEMS Microbiological Letters 123, 343–347 (1994)) beschrieben. Nach homologer Rekombination mittels eines ”cross over”-Ereignisses enthält der resultierende Stamm mindestens zwei Kopien des betreffenden Gens.
Ein Plasmidvektor, mit dessen Hilfe das Verfahren der Amplifikation mittels Integration durchgeführt werden kann, ist beispielsweise pSUZ1, der in 1 dargestellt ist. Das Plasmid pSUZ1 besteht aus dem von Spratt et al. (Gene 41: 337–342(1986)) beschriebenen E. coli-Vektor pBGS8, in den das tal-Gen eingebaut wurde.
Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Lysin, L-Threonin und L-Isoleucin vorteilhaft sein, neben dem tal-Gen eines oder mehrere Enzyme des jeweiligen Biosyntheseweges, der Glykolyse, der Anaplerotik, des Pentosephosphatwegs oder des Aminosäure-Exports zu verstärken oder überzuexprimieren.
So kann für die Herstellung von L-Lysin gleichzeitig eines oder mehrere Gene, ausgewählt aus der Gruppe

• das für die Dihydrodipicolinat-Synthase codierende Gen dapA ( EP-B 0 197 335 ),
• das für eine ”feed back”-resistente Aspartatkinase codierende Gen lysC (Kalinowski et al. (1990), Molecular and General Genetics 224: 317–324),
• das für die Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase codierende Gen gap (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076–6086),
• das für die Pyruvat-Carboxylase codierende Gen pyc ( DE-A-198 31 609 ),
• das für die Malat-Chinon-Oxidoreduktase codierende Gen mqo (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395–403 (1998)),
• das für die Transketolase codierende Gen tkt (Zugangsnummer AB023377 der Datenbank der European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Deutschland))
• das für die 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase codierende Gen gnd ( JP-A-9-224662 ),
• das für die Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase codierende Gen zwf ( JP-A-9-224661 ),
• das für ein Protein für den Lysin-Export codierende Gen lysE ( DE-A-195 48 222 ),
• das für die Enolase codierende Gen eno ( DE: 19947791.4 ),

So kann für die Herstellung von L-Threonin gleichzeitig eines oder mehrere Gene, ausgewählt aus der Gruppe

• gleichzeitig das für die Homoserin-Dehydrogenase codierende Gen hom (Peoples et al., Molecular Microbiology 2, 63–72 (1988) oder das für eine ”feedback-resistente” Homoserin-Dehydrogenase codierende Allel hom^dr (Archer et al., Gene 107, 53–59 (1991),
• das für die Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase codierende Gen gap (Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076–6086),
• das für die Pyruvat-Carboxylase codierende Gen pyc ( DE-A-198 31 609 ),
• das für die Malat-Chinon-Oxidoreduktase codierende Gen mqo (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395–403 (1998)),
• das für die Transketolase codierende Gen tkt (Zugangsnummer AB023377 der Datenbank der European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Deutschland))
• das für die 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase codierende Gen gnd ( JP-A-9-224662 ),
• das für die Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase codierende Gen zwf ( JP-A-9-224661 ),
• das für den Threonin-Export codierende Gen thrE ( DE 199 41 478.5 ; DSM 12840),
• das für die Enolase codierende Gen eno ( DE: 19947791.4 ),

Weiterhin kann es für die Produktion von L-Lysin, L-Threonin und L-Isoleucin vorteilhaft sein, ausgewählt aus der Gruppe

• das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase codierende Gen pck ( DE 199 50 409.1 ; DSM 13047) und/oder
• das für die Glucose-6-phosphat-Isomerase codierende Gen pgi ( US 09/396,478 ; DSM 12969) oder
• das für die Pyruvat-Oxidase codierende Gen poxB ( DE: 199 51 975.7 ; DSM 13114) oder

Weiterhin kann es neben der Überexpression des tal-Gens für die Produktion von Aminosäuren vorteilhaft sein, unerwünschte Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: ”Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms”, in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (Hrsg.), Academic Press, London, UK, 1982).
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Produktion von L-Aminosäuren kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen.
Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch ”Manual of Methods for General Bacteriology” der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B. Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Stickstoffquelle können organische stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. De Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Phosphorquelle können Phosphorsäure, Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muss weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie beispielsweise Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe wie z. B. Antibiotika hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum der L-Aminosäure gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Die Analyse von L-Lysin, L-Threonin und L-Isoleucin kann wie bei Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben durch Anionenonenaustausch-Chromatographie mit anschließender Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen.
Der folgende Mikroorganismus wurde bei der Deutschen Sammlung für Mikrorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß dem Budapester Vertrag hinterlegt:

• Escherichia coli JM109/pSUZ1 als DSM 13263.

SEQ ID NO 1 enthält auch das neue devB-Gen. Das erfindungsgemäße Verfahren wird zur fermentativen Herstellung von L-Lysin, L-Threonin und L-Isoleucin eingesetzt.
Die folgenden Figuren sind beigefügt:
1: Karte des Plasmids pSUZ1
Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben die folgende Bedeutung:

lacZ:: Segmente des lacZα-Genfragments
kan r:: Kanamycinresistenz
tal:: Transaldolase-Gen
ori:: Replikationsursprung des Plasmids pBGS8
BclI:: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BclI
EcoRI:: Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
HindIII:: Schnittstelle des Restriktionsenzyms HindIII
PstI:: Schnittstelle des Restriktionsenzyms PstI
SacI:: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SacI

Beispiele
Die folgenden Beispiele sollen diese Erfindung weiter veranschaulichen. Die verwendeten molekularbiologischen Techniken, z. B. Isolierung der Plasmid-DNA, Behandlung mit Restriktionsenzym, Ligationen, Standardtransformationen von Escherichia coli usw., sind (sofern nicht anders vermerkt) bei Sambrook et al. (Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratories, USA) beschrieben.
Beispiel 1
Herstellung einer genomischen Cosmid-Genbank aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Chromosomale DNA aus Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 wurde wie bei Tauch et al. (1995, Plasmid 33: 168–179) beschrieben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Code-Nr. 27-0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit alkalischer Phosphatase aus Shrimp (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Code-Nr. 1758250) dephosphoryliert. Die DNA des Cosmid-Vektors SuperCos1 (Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84: 2160–2164), bezogen von der Firma Stratagene (La Jolla, USA, Produktbeschreibung SuperCos1 Cosmid Vektor Kit, Code-Nr. 251301) wurde mit dem Restriktionsenzym XbaI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung XbaI, Code-Nr. 27-0948-02) gespalten und ebenfalls mit alkalischer Phosphatase aus Shrimp dephosphoryliert. Anschließend wurde die Cosmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code-Nr. 27-0868-04) gespalten. Die auf diese Weise behandelte Cosmid-DNA wurde mit der behandelten ATCC13032-DNA gemischt und der Ansatz mit T4-DNA-Ligase (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Code-Nr. 27-0870-04) behandelt. Das Ligationsgemisch wurde anschließend mit Hilfe des Gigapack II XL Packing Extract (Stratagene, La Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack II XL Packing Extract, Code-Nr. 200217) in Phagen verpackt. Zur Infektion des E. coli Stammes NM554 (Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Research 16: 1563–1575) wurden die Zellen in 10 mM MgSO₄ aufgenommen und mit einem Aliquot der Phagensuspension vermischt. Infektion und Titerung der Cosmidbank wurden wie bei Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei die Zellen auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 100 μg/ml Ampicillin ausplattiert wurden. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C wurden rekombinante Einzelklone selektioniert.
Beispiel 2
Isolierung und Sequenzierung des tal-Gens
Die Cosmid-DNA einer Einzelkolonie wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Produkt-Nr. 27106, Qiagen, Hilden, Deutschland) nach Herstellerangaben isoliert und mit dem Restriktionsenzym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Produkt-Nr. 27-0913-02) partiell gespalten. Die DNA-Fragmente wurden mit alkalischer Phosphatase aus Shrimp (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Produkt-Nr. 1758250) dephosphoryliert. Nach gelelektrophoretischer Auftrennung erfolgte die Isolierung der Cosmidfragmente im Größenbereich von 1500 bis 2000 bp mit dem QiaExII Gel Extraction Kit (Produkt-Nr. 20021, Qiagen, Hilden, Deutschland). Die DNA des Sequenziervektors pZero-I, bezogen von der Firma Invitrogen (Groningen, Niederlande, Produktbeschreibung Zero Background Cloning Kit, Produkt-Nr. K2500-01), wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Produkt-Nr. 27-0868-04) gespalten. Die Ligation der Cosmidfragmente in den Sequenziervektor pZero-1 wurde wie von Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor) beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit T4-Ligase (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) über Nacht inkubiert wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde anschließend in den E. coli Stamm DH5αMCR (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87: 4645–4649) elektroporiert (Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123: 343–7) und auf LB-Agar (Lennox, 1955, Virology, 1: 190) mit 50 μg/ml Zeocin ausplattiert. Die Plasmidpräparation der rekombinanten Klone erfolgte mit dem Biorobot 9600 (Produkt-Nr. 900200, Qiagen, Hilden, Deutschland). Die Sequenzierung erfolgte nach der Didesoxy-Kettenabbruchmethode von Sanger et al. (1977, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 74: 5463–5467) mit Modifikationen nach Zimmermann et al. (1990, Nucleic Acids Research, 18: 1067). Es wurde der ”RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit” von PE Applied Biosystems (Produkt-Nr. 403044, Weiterstadt, Deutschland) verwendet. Die gelelektrophoretische Auftrennung und Analyse der Sequenzierreaktion erfolgte in einem ”Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid” Gel (29:1) (Produkt-Nr. A124.1, Roth, Karlsruhe, Deutschland) mit dem ”ABI Prism 377” Sequenziergerät von PE Applied Biosystems (Weiterstadt, Deutschland).
Die erhaltenen Rohsequenzdaten wurden anschließend unter Anwendung des Staden-Programmpakets (1986, Nucleic Acids Research, 14: 217–231), Version 97-0 prozessiert. Die Einzelsequenzen der pZeroI-Derivate wurden zu einem zusammenhängenden Contig zusammengestellt. Die computergestützte Codierbereichsanalyse wurde mit dem Programm XNIP (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217–231) angefertigt. Weitere Analysen wurden mit dem ”BLAST search program” (Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research 25: 3389–3402) durchgeführt, und zwar gegen die nichtredundante Datenbank des ”National Center for Biotechnology Information” (NCBI, Bethesda, MD, USA).
Die erhaltene Nukleotidsequenz ist in SEQ ID NO 1 und SEQ ID NO 3 dargestellt.
Beispiel 3
3.1 Klonierung des tal-Gens
Zur Amplifikation von das gesamte tal-Gen von C. glutamicum 13032 sowie stromaufwärts und stromabwärts liegende flankierende Bereiche enthaltenden DNA-Fragmenten wurde die PCR verwendet. Dabei wurden die PCR-Reaktionen unter Verwendung von Oligonukleotidprimern, die von der Sequenz, wie sie in den Beispielen 1 und 2 bestimmt wurde, konstruiert wurden, durchgeführt. Genomische DNA wurde aus Corynebacterium glutamicum ATCC13032 nach Heery und Dunican (Applied and Environmental Microbiology 59: 791–799 (1993)) isoliert und als Matrize verwendet. Als tal-Primer wurden verwendet:
Vorwärtsprimer: 5' GGT ACA AAG GGT CTT AAG 3'C
Rückwärtsprimer: 5' GAT TTC ATG TCG CCG TTA 3'
Die PCR-Parameter waren wie folgt:
35 Zyklen
3 Minuten bei 95°C
1 Minute bei 94°C
1 Minute bei 47°C
45 Sekunden bei 72°C
2,0 mM MgCl2
ungefähr 150–200 ng DNA-Matrize.
Das erhaltene PCR-Produkt wurde in den kommerziell erhältlichen und von der Firma Promega Corp. bezogenen Vektor pGEM-T (pGEM-T Easy Vektor System 1, Kat.-Nr. A1360, Promega UK, Southampton, UK) unter Verwendung des Stamms E. coli JM109 (Yanisch-Perron et al., Gene, 33: 103–119 (1985)) als Wirt kloniert. Das gesamte tal-Gen wurde anschließend auf einem EcoRI-Fragment aus dem pGEM-T-Vektor isoliert und in die lacZα-EcoRI-Stelle des E. coli-Vektors pBGS8 (Spratt et al., Gene 41(2-3): 337–342 (1986)) kloniert. Die verwendeten Restriktionsenzyme wurden von Boehringer Mannheim UK Ltd. (Bell Lane, Lewes East Sussex BN7 1LG, UK) bezogen und gemäß den Herstellerangaben eingesetzt. E. coli JM109 wurde dann mit diesem Ligationsansatz transformiert, und Elektrotransformanten wurden auf mit Isopropylthiogalactopyranosid (IPTG), 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-galactopyranosid (XGAL) und Kanamycin in Konzentrationen von 1 mM, 0,02% bzw. 50 mg/l supplementiertem Luria-Agar selektioniert. Die Platten wurden zwölf Stunden bei 37°C inkubiert. Plasmid-DNA wurde aus einem Transformanten isoliert und mittels Restriktionsenzymanalyse unter Verwendung von Eco RI charakterisiert. Dieses neue Konstrukt wurde mit pSUZ 1 bezeichnet.
Beispiel 4
Herstellung des Stamms Corynebacterium glutamicum DSM5715::pSUZ1
Der Stamm DSM5715 wurde mit dem Plasmid pSUZ1 unter Verwendung des von Liebl et al., (FEMS Microbiology Letters, 53: 299–303 (1989)) beschriebenen Elektroporationsverfahrens transformiert. Die Selektion der Transformanten erfolgte auf LBHIS-Agar mit 18,5 g/l Hirn-Herz-Infusionsbrühe, 0,5 M Sorbitol, 5 g/l Bacto-Trypton, 2,5 g/l Bacto-Hefeextrakt, 5 g/l NaCl und 18 g/l Bacto-Agar, der mit 25 mg/l Kanamycin supplementiert worden war. Die Inkubation erfolgte über einen Zeitraum von 2 Tagen bei 33°C.
Da der Vektor pSUZ1 nicht im Stamm DSM5715 replizieren kann, waren nur Klone, die durch Integration von pSUZ1 verliehene Kanamycinresistenz zeigen, in der Lage zu wachsen.
Der erhaltene Integrant wurde mit DSM5715::pSUZ1 bezeichnet.
Beispiel 5
Herstellung von Lysin
Der in Beispiel 4 erhaltene C. glutamicum-Stamm DSM5715/pSUZ1 wurde in einem für die Produktion von L-Lysin geeigneten Nährmedium kultiviert und der L-Lysingehalt im Kulturüberstand bestimmt.
Hierzu wurde der Stamm zunächst 24 Stunden bei 33°C auf einer Agarplatte mit dem entsprechenden Antibiotikum (Hirn-Herz-Agar mit Kanamycin (25 mg/l)) inkubiert. Ausgehend von dieser Agarplattenkultur wurde eine Vorkultur angeimpft (10 ml Medium in einem 100-ml Erlenmeyerkolben). Als Medium für die Vorkultur wurde das Vollmedium CgIII verwendet. Medium Cg III:

NaCl 2,5 g/l

Bacto-Pepton 10 g/l

Bacto-Hefeextrakt 10 g/l

Glucose (getrennt autoklaviert) 2% (w/v)
Der pH-Wert wurde auf pH 7,4 eingestellt.

Hierzu wurde Kanamycin (25 mg/l) hinzugefügt. Die Vorkultur wurde 16 Stunden bei 33°C und 240 UpM auf einem Schüttelgerät inkubiert. Mit dieser Vorkultur wurde eine Hauptkultur angeimpft, so daß der Ausgangswert der OD (660 nm) der Hauptkultur bei 0,1 lag. Für die Hauptkultur wurde das Medium MM verwendet. Medium MM:

CSL (Maisquellwasser)	5 g/l
MOPS (Morpholinopropansulfonsäure)	20 g/l
Glucose (getrennt autoklaviert)	50 g/l

(NH₄)₂SO₄	25 g/l
KH₂PO₄	0,1 g/l
MgSO₄·7H₂O	1,0 g/l
CaCl₂·2H₂O	10 mg/l
FeSO₄·7H₂O	10 mg/l
MnSO₄·H₂O	5,0 mg/l
Biotin (sterilfiltriert)	0,3 mg/l
Thiamin·HCl (sterilfiltriert)	0,2 mg/l
L-Leucin (sterilfiltriert)	0,1 g/l
CaCO₃	25 g/l

CSL, MOPS und die Salzlösung wurden mit Ammoniakwasser auf pH 7 gebracht und autoklaviert. Anschließend wurden die sterilen Substrat- und Vitaminlösungen ebenso wie das in trockenem Zustand autoklavierte CaCO₃ zugegeben.
Die Kultivierung wurde in einem Volumen von 10 ml in einem 100-ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen durchgeführt. Nach Zugabe von Kanamycin (25 mg/l) wurde die Kultivierung bei 33°C und einer Luftfeuchtigkeit von 80% durchgeführt.
Nach 24 bzw. 48 Stunden wurde der OD-Wert bei einer Messwellenlänge von 660 nm mit dem Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, München) bestimmt. Die Menge an gebildetem Lysin wurde mit einem Aminosäureanalysegerät der Firma Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Deutschland) mittels Ionenaustauschchromatographie und Nachsäulenderivatisierung mit Ninhydrinnachweis bestimmt.
Das Ergebnis des Experiments ist in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1

Stamm Zeit (Stunden) Lysin-HCl g/l

DSM5715 24 8,1

DSM5715::pSUZ1 24 8,6

DSM5715 48 14,7

DSM5715::pSUZ1 48 15,4

Claims

Polynukleotid aus einem coryneformen Bakterium, codierend für ein Polypeptid mit der enzymatischen Aktivität einer Transaldolase, wobei das Polynukleotid ausgewählt ist unter: (a) dem Polynukleotid, das für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die identisch mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 ist, codiert, (b) dem Polynukleotid, das zu dem Polynukleotid aus (a) komplementär ist.
Polynukleotid nach Anspruch 1 mit der Nukleotidsequenz, wie sie unter SEQ ID NO: 3 dargestellt ist.
Polynukleotid nach Anspruch 1 oder 2, wobei es sich um eine RNA handelt.
Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Polynukleotid ausgewählt ist unter: (a) der Nukleotidsequenz, wie sie unter SEQ ID NO: 3 dargestellt ist, (b) der Nukleotidsequenz, wie sie unter SEQ ID NO: 1 dargestellt ist, (c) einem Fragment von SEQ ID NO: 1, (d) einer Nukleotidsequenz, die der Sequenz (a) bis (c) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes entspricht.
Polynukleotid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei es sich bei dem corneformen Bakterium um Corynebacterium glutamicum handelt.
Polynukleotid nach Anspruch 2, das für ein Polypeptid mit Transaldolaseaktivität codiert und auf dem im Stamm DSM 5715 unter der Nummer DSM 13263 hinterlegten Plasmid pSUZ1 enthalten ist.
Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 und einer enzymatischen Transaldolaseaktivität.
Polypeptid nach Anspruch 7, wobei das Polypeptid die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2, einschließlich konservativer Aminosäureaustausche, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem Austausch von Glycin gegen Alanin oder dem Austausch von Asparaginsäure gegen Glutaminsäure, aufweist.
Rekombinanter Vektor, wobei es sich um pSUZ1, hinterlegt im Stamm 5715 unter der Nummer DSM 13263, handelt.
Coryneformes Bakterium, transformiert mit dem Vektor nach Anspruch 9.
Rekombinantes coryneformes Bakterium mit einer erhöhten intrazellulären Aktivität einer Transaldolase, wobei die erhöhte intrazelluläre Aktivität durch Überexpression eines Polynukleotids erzielt wird, das für ein Polypeptid mit der enzymatischen Aktivität einer Transaldolase codiert, wobei das Polynukleotid für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die identisch mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No: 2 ist, codiert.
Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren, das die folgenden Schritte umfasst: a) Fermentation eines coryneformen Bakteriums mit einer erhöhten intrazellulären Aktivität einer Transaldolase, wobei die erhöhte intrazelluläre Aktivität durch Überexpression eines Polynukleotids, das für ein Polypeptid mit der enzymatischen Aktivität einer Transaldolase codiert, wobei das Polynukleotid ausgewählt ist aus: a1) dem Polynukleotid, das für ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die eine Identität von mindestens 90% mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 2 aufweist, codiert, in einem Medium, um so die L-Aminosäure zu produzieren. in einem Medium, um so die L-Aminosäure zu produzieren, b) Anreicherung der L-Aminosäure im Medium oder in den Zellen des Bakteriums, c) Isolierung der L-Aminosäure, wobei die L-Aminosäuren ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus L-Lysin, L-Threonin oder L-Isoleucin.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei es sich bei der L-Aminosäure um L-Lysin handelt und wobei ein oder mehrere Gene, gewählt aus der Gruppe bestehend aus a) dem für Dihydrodipicolinat-Synthase codierenden Gen dapA, b) dem für eine feedback resistente Aspartatkinase codierenden Gen lysC, c) dem für Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase codierenden Gen gap, d) dem für Pyruvat-Carboxylase codierenden Gen pyc, e) dem für Malat-Chinon-Oxidoredukase codierenden Gen mqo, f) dem für Transketolase codierenden Gen tkt, g) dem für 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase codierenden Gen gnd, h) dem für Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase codierenden Gen zwf, i) dem für ein Protein für den Lysin-Export codierenden Gen lysE, j) dem für Enolase codierenden Gen eno, gleichzeitig überexprimiert wird bzw. werden.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei es sich bei der L-Aminosäure um L-Threonin handelt und wobei ein oder mehrere Gene, gewählt aus der Gruppe bestehend aus a) dem für Homoserin-Dehydrogenase des hom^dr-Allels, das für eine ”Feedback-resistente” Homoserin-Dehydrogenase codiert, codierenden Gen hom, b) dem für Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase codierenden Gen gap, c) dem für Pyruvat-Carboxylase codierenden Gen pyc, d) dem für Malat-Chinon-Oxidoredukase codierenden Gen mqo, e) dem für Transketolase codierenden Gen tkt, f) dem für 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase codierenden Gen gnd, g) dem für Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase codierenden Gen zwf, h) dem für ein Protein für den Threonin-Export codierenden Gen thrE, i) dem für Enolase codierenden Gen eno, gleichzeitig überexprimiert wird bzw. werden.
Verfahren nach Anspruch 12, bei dem eines oder mehrere der Gene, gewählt aus der Gruppe bestehend aus a) dem für Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase codierenden Gen pck, b) dem für Glucose-6-phosphat-Isomerase codierenden Gen pgi, c) dem für Pyruvatoxidase codierenden Gen poxB, gleichzeitig abgeschwächt wird bzw. werden.