DE19941478A1 - Neue für das thrE-Gen codierende Nukleotidsequenzen und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin mit coryneformen Bakterien - Google Patents
Neue für das thrE-Gen codierende Nukleotidsequenzen und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin mit coryneformen BakterienInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft in coryneformen Mikroorganismen replizierbare, bevorzugt rekombinante DNA mit der Herkunft Corynebacterium, die zumindest eine Nukleotidsequenz enthält, die für das thrE-Gen codiert, und ein Verfahren zur Herstellung von L-Threonin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man folgende Schritte durchführt: DOLLAR A a) Fermentation von Mikroorganismen, in denen zumindest das thrE-Gen verstärkt (überexprimiert) wird, ggf. in Kombination mit weiteren Genen, DOLLAR A b) Anreichung des L-Threonins im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen und DOLLAR A c) Isolieren des L-Threonins.
Description
Gegenstand der Erfindung sind für das thrE-Gen kodierende
Nukleotidsequenzen und Verfahren zur fermentativen
Herstellung von L-Threonin unter Verwendung von
coryneformen Bakterien, in denen das thrE-Gen verstärkt
wird.
L-Threonin findet in der Tierernährung, in der Humanmedizin
und in der pharmazeutischen Industrie Anwendung.
Es ist bekannt, daß L-Threonin durch Fermentation von
Stämmen coryneformer Bakterien insbesondere Corynebacterium
glutamicum hergestellt werden kann. Wegen der großen
Bedeutung wird ständig an der Verbesserung der
Herstellverfahren gearbeitet. Verfahrensbesserungen können
fermentationstechnische Maßnahmen wie z. B. Rührung und
Versorgung mit Sauerstoff, oder die Zusammensetzung der
Nährmedien wie z. B. die Zuckerkonzentration während der
Fermentation, oder die Aufarbeitung zur Produktform durch
z. B. Ionenaustauschchromatographie oder die intrinsischen
Leistungseigenschaften des Mikroorganismus selbst
betreffen.
Zur Verbesserung der Leistungseigenschaften dieser
Mikroorganismen werden Methoden der Mutagenese, Selektion
und Mutantenauswahl angewendet. Auf diese Weise erhält man
Stämme, die resistent gegen Antimetabolite wie z. B. das
Threonin-Analogon α-Amino-β-Hydroxyvaleriansäure (AHV) oder
auxotroph für regulatorisch bedeutsame Aminosäuren sind und
L-Threonin produzieren.
Seit einigen Jahren werden ebenfalls Methoden der
rekombinanten DNA-Technik zur Stammverbesserung L-Threonin
produzierender Stämme von Corynebacterium eingesetzt, indem
man einzelne Threonin-Biosynthesegene amplifiziert und die
Auswirkung auf die L-Threonin-Produktion untersucht.
Die Erfinder haben sich zur Aufgabe gestellt, neue
Maßnahmen zur verbesserten fermentativen Herstellung von L-
Threonin bereitzustellen.
L-Threonin findet in der Tierernährung, in der Humanmedizin
und in der pharmazeutischen Industrie Anwendung. Es besteht
daher ein allgemeines Interesse daran neue verbesserte
Verfahren zur Herstellung von L-Threonin bereitzustellen.
Gegenstand der Erfindung ist eine in coryneformen
Mikroorganismen replizierbare, bevorzugt rekombinante DNA
mit der Herkunft Corynebacterium, die zumindest die
Nukleotidsequenz enthält, die für das thrE-Gen, dargestellt
in der SEQ-ID-No. 1 und SEQ-ID-No. 3, codiert.
Gegenstand ist ebenfalls eine replizierbare DNA gemäß
Anspruch 1 mit:
- a) den Nukleotidsequenzen, gezeigt in SEQ-ID-No. 1 oder SEQ-ID-No. 3, die für das thrE-Gen codieren, oder
- b) mindestens einer Sequenz, die den Sequenzen (i) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes entspricht, oder
- c) mindestens einer Sequenz, die mit der zu den Sequenzen (i) oder (ii) komplementären Sequenz hybridisiert, und/oder gegebenenfalls
- d) funktionsneutralen Sinnmutationen in (i).
Ebenso sind coryneforme Mikroorganismen, insbesondere der
Gattung Corynebacterium, transformiert durch die Einführung
der genannten replizierbaren DNA Gegenstand der Erfindung.
Die Erfindung betrifft schließlich ein Verfahren zur
fermentativen Herstellung von L-Threonin unter Verwendung
von coryneformen Bakterien, die insbesondere bereits L-
Threonin produzieren und in denen die für das thrE-Gen
codierende(n) Nukleotidsequenz(en) verstärkt, insbesondere
überexprimiert werden.
Der Begriff "Verstärkung" beschreibt in diesem Zusammenhang
die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder
mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die
entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise
die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöht, einen starken
Promotor oder ein Gen verwendet, das für ein entsprechendes
Enzym mit einer hohen Aktivität kodiert und gegebenenfalls
diese Maßnahmen kombiniert.
Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden
Erfindung sind, können L-Threonin aus Glucose, Saccharose,
Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke, Cellulose oder
aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es kann sich um
Vertreter coryneformer Bakterien, insbesondere der Gattung
Corynebacterium handeln. Bei der Gattung Corynebacterium
ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu
nennen, die in der Fachwelt für ihre Fähigkeit bekannt ist,
L-Aminosäuren zu produzieren.
Geeignete Stämme der Gattung Corynebacterium, insbesondere
der Art Corynebacterium glutamicum, sind besonders die
bekannten Wildtypstämme:
Corynebacterium glutamicum ATCC13032,
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806,
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870,
Corynebacterium melassecola ATCC17965,
Corynebacterium thermoaminogenes FERM-BP-1539,
Brevibacterium flavum ATCC14067,
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Threonin produzierende Mutanten bzw. Stämme, wie beispielsweise
Corynebacterium glutamicum ATCC21649,
Brevibacterium flavum BB69,
Brevibacterium flavum DSM5399,
Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 269,
Brevibacterium lactofermentum TBB-10.
Corynebacterium glutamicum ATCC13032,
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806,
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870,
Corynebacterium melassecola ATCC17965,
Corynebacterium thermoaminogenes FERM-BP-1539,
Brevibacterium flavum ATCC14067,
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte L-Threonin produzierende Mutanten bzw. Stämme, wie beispielsweise
Corynebacterium glutamicum ATCC21649,
Brevibacterium flavum BB69,
Brevibacterium flavum DSM5399,
Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 269,
Brevibacterium lactofermentum TBB-10.
Den Erfindern gelang es, das thrE-Gen von Corynebacterium
glutamicum zu isolieren. Zur Isolierung des thrE-Gens wird
zunächst eine im thrE-Gen defekte Mutante von C. glutamicum
hergestellt. Hierzu wird ein geeigneter Ausgangsstamm wie
z. B. ATCC14752 oder ATCC13032 einem Mutagenese-Verfahren
unterworfen.
Klassische Mutagenese-Verfahren sind die Behandlung mit
Chemikalien wie z. B. N-Methyl-N-Nitro-N-Nitrosoguanidin
oder UV-Bestrahlung. Derartige Verfahren zur
Mutationsauslösung sind allgemein bekannt und können unter
anderem bei Miller (A Short Course in Bacterial Genetics, A
Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and
Related Bacteria (Cold Spring Harbor Laboratory Press,
1992)) oder im Handbuch "Manual of Methods for General
Bacteriology" der American Society for Bacteriology
(Washington D. C., USA, 1981) nachgelesen werden.
Ein anderes Mutagenese-Verfahren ist die Methode der
Transposonmutagenese, bei der die Eigenschaft eines
Transposons ausgenutzt wird, in DNA-Sequenzen zu "springen"
und dadurch die Funktion des betreffenden Gens zu stören
bzw. auszuschalten. Transposons coryneformer Bakterien sind
in der Fachwelt bekannt. So wurden aus Corynebacterium
xerosis Stamm M82B das Erythromycinresistenz-Transposon
Tn5432 (Tauch et al., Plasmid (1995) 33: 168-179) und das
Chloramphenicolresistenz-Transposon Tn5546 isoliert.
Ein anderes Transposon ist das Transposon Tn5531, das bei
Ankri et al. (Journal of Bacteriology (1996) 178: 4412-4419)
beschrieben wird und beispielhaft im Laufe der
vorliegenden Erfindung eingesetzt wurde. Das Transposon
Tn5531 enthält das aph3-Kanamycinresistenzgen und kann in
Form des Plasmidvektors pCGL0040 verabreicht werden, der in
Fig. 1 dargestellt ist. Die Nukleotidsequenz des
Transposons Tn5531 ist unter der Zugangsnummer (accession
number) U53587 bei dem National Center for Biotechnology
Information (NCBI, Bethesda, MD, USA) frei verfügbar.
Nach erfolgter Mutagenese, vorzugsweise Transposon-
Mutagenese, wird eine im thrE-Gen defekte Mutante gesucht.
Eine im thrE-Gen defekte Mutante wird daran erkannt, daß
sie auf Minimalagar gutes Wachstum, aber auf Minimalagar,
der mit Threonin haltigen Oligopeptiden wie z. B. dem
Tripeptid Threonyl-threonyl-Threonin supplementiert wurde,
schlechtes Wachstum zeigt.
Ein Beispiel für eine derartige Mutante ist der Stamm
ATCC14752ΔilvAthrE::Tn5531.
Ein auf die beschriebene Weise hergestellter Stamm kann
dann für die Isolierung und Klonierung des thrE-Gens
verwendet werden.
Hierzu kann eine Genbank des interessierenden Bakteriums
angelegt werden. Das Anlegen von Genbanken ist in allgemein
bekannten Lehrbüchern und Handbüchern niedergeschrieben.
Als Beispiel seien das Lehrbuch von Winnacker: Gene und
Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (Verlag
Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990) oder das Handbuch von
Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual
(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) genannt. Eine
sehr bekannte Genbank ist die des E.-coli-K-12-Stammes
W3110, die von Kohara et al. (Cell 50, 495-508 (1987)) in
λ-Vektoren angelegt wurde. Bathe et al. (Molecular and
General Genetics, 252: 255-265, 1996) beschreiben eine
Genbank von C. glutamicum ATCC13032, die mit Hilfe des
Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of
the National Academy of Sciences USA, 84: 2160-2164) im
E.-coli-K-12-Stamm NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic
Acids Research 16: 1563-1575) angelegt wurde. Für die
vorliegende Erfindung eignen sich solche Vektoren, die in
coryneformen Bakterien vorzugsweise Corynebacterium
glutamicum replizieren. Derartige Vektoren sind aus dem
Stand der Technik bekannt; als Beispiel sei der
Plasmidvektor pZ1 genannt, der bei Menkel et al. (Applied
and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554)
beschrieben ist. Die auf die beschriebene Weise erhaltene
Genbank wird anschließend mittels Transformation oder
Elektroporation in den im thrE-Gen defekten Indikatorstamm
überführt und solche Transformanten gesucht, die die
Fähigkeit besitzen, in Gegenwart Threonin-haltiger
Oligopeptide auf Minimalagar zu wachsen. Das klonierte DNA-
Fragment kann anschließend einer Sequenzanalyse unterzogen
werden.
Bei Verwendung einer durch Tn5531-Mutagenese erzeugten
Mutante eines coryneformen Bakteriums wie z. B. der Stamm
ATCC14752ΔilvAthrE::Tn5531 kann das thrE::Tn5531-Allel
direkt unter Ausnutzung des in ihm enthaltenen
Kanamycinresistenzgens aph3 kloniert und isoliert werden.
Hierzu verwendet man bekannte Kloniervektoren wie z. B.
pUC18 (Norrander et al., Gene (1983) 26: 101-106 und
Yanisch-Perron et al., Gene (1985) 33: 103-119). Als
Klonierwirte eignen sich besonders solche E.-coli-Stämme,
die restriktions- und rekombinationsdefekt sind. Ein
Beispiel hierfür ist der Stamm DHSαmcr, der von Grant et
al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA,
87 (1990) 4645-4649) beschrieben wurde. Die Selektion auf
Transformanten erfolgt in Gegenwart von Kanamycin. Die
Plasmid-DNA der erhaltenen Transformanten wird anschließend
sequenziert. Hierzu kann die von Sanger et al. (Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United States of
America USA (1977) 74: 5463-5467) beschriebene Dideoxy-
Kettenabbruchmethode verwendet werden. Hiernach erhält man
die stromaufwärts und stromabwärts des Tn5531-
Insertionsortes thrE-Gensequenzen. Die erhaltenen
Nukleotidsequenzen werden dann mit kommerziell erhältlichen
Sequenzanalyse-Programmen wie z. B. dem Programmpaket
Lasergene (Biocomputing Software for Windows, DNASTAR,
Madison, USA) oder dem Programmpaket HUSAR (Release 4.0,
EMBL, Heidelberg, Deutschland) analysiert und
zusammengefügt.
Auf diese Weise wurde die neue für das thrE-Gen kodierende
DNA-Sequenz von C. glutamicum erhalten, die als SEQ-ID No 1
Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist. Weiterhin wurde
aus der vorliegenden DNA-Sequenz mit den oben beschriebenen
Methoden die Aminosäuresequenz des entsprechenden Proteins
abgeleitet. In SEQ-ID No 2 ist die sich ergebende
Aminosäuresequenz des thrE-Genproduktes dargestellt.
Kodierende DNA-Sequenzen, die sich aus SEQ-ID No 1 durch
die Degeneriertheit des genetischen Codes ergeben, sind
ebenfalls Bestandteil der Erfindung. In gleicher Weise sind
DNA-Sequenzen, die mit SEQ-ID No 1 oder Teilen von SEQ-ID
No 1 hybridisieren, Bestandteil der Erfindung. In der
Fachwelt sind weiterhin konservative Aminosäureaustausche
wie z. B. Austausch von Glycin gegen Alanin oder von
Asparaginsäure gegen Glutaminsäure in Proteinen als
"Sinnmutationen" (sense mutations) bekannt, die zu keiner
grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins
führen, d. h. funktionsneutral sind. Weiterhin ist bekannt,
daß Änderungen am N- und/oder C-Terminus eines Proteins
dessen Funktion nicht wesentlich beeinträchtigen oder sogar
stabilisieren können. Angaben hierzu findet der Fachmann
unter anderem bei Ben-Bassat et al. (Journal of
Bacteriology 169: 751-757 (1987)), bei O'Regan et al. (Gene
77: 237-251 (1989)), bei Sahin-Toth et al. (Protein Sciences
3: 240-247 (1994)), bei Hochuli et al. (Bio/Technology
6: 1321-1325 (1988)) und in bekannten Lehrbüchern der
Genetik und Molekularbiologie. Aminosäuresequenzen, die
sich in entsprechender Weise aus SEQ-ID-No 2 ergeben sind
ebenfalls Bestandteil der Erfindung.
Unter Ausnutzung der in SEQ-ID-No. 1 dargestellten
Nukleotidsequenz können geeignete Primer synthetisiert und
diese dann dazu verwendet werden mit Hilfe der Polymerase-
Kettenreaktion (PCR) thrE-Gene verschiedener coryneformer
Bakterien und Stämme zu amplifizieren. Anleitungen hierzu
findet der Fachmann unter anderem beispielsweise im
Handbuch von Gait: Oligonukleotide synthesis: a practical
approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) und bei Newton und
Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg,
Deutschland, 1994). Alternativ können die in SEQ-ID-No. 1
dargestellte Nukleotidsequenz oder Teile davon als Sonde
zur Suche von thrE-Genen in Genbanken von insbesondere
coryneformen Bakterien verwendet werden. Anleitungen hierzu
findet der Fachmann unter anderem beispielsweise im
Handbuch "The DIG System Users Guide for Filter
Hybridization" der Firma Boehringer Mannheim GmbH,
(Mannheim, Deutschland, 1993) und bei Liebl et al.
(International Journal of Systematic Bacteriology (1991)
41: 255-260) Die auf diese Weise amplifzierten thrE-Gen-
haltigen DNA-Fragmente werden anschließend kloniert und
sequenziert.
Auf diese Weise wurde die in SEQ-ID-No. 3 dargestellte DNA-
Sequenz des thrE-Gens des Stammes ATCC13032 erhalten, die
ebenfalls Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist. In
SEQ-ID-No. 4 ist die sich ergebende Aminosäuresequenz
dargestellt.
Gegenstand der Erfindung ist ebenfalls ein Verfahren zur
Isolierung des thrE-Gens, dadurch gekennzeichnet, daß man
als Indikatorstämme im thrE-Gen defekte Mutanten,
vorzugsweise coryneformer Bakterien gewinnt, die auf einem
ein Threonin-haltiges Oligopeptid enthaltenden Nährmedium
nicht oder nur gering wachsen und:
- a) das thrE-Gen nach dem Anlegen einer Genbank identifiziert und isoliert oder
- b) im Fall der Transposon-Mutagenese auf das bevorzugt eine Antibiotikaresistenz enthaltende Transposon selektiert und so das thrE-Gen erhält.
Die Erfinder fanden heraus, daß coryneforme Bakterien nach
Überexpression des thrE-Gens in verbesserter Weise L-
Threonin produzieren.
Zur Erzielung einer Überexpression kann die Kopienzahl der
entsprechenden Gene erhöht werden, oder es kann die
Promotor- und Regulationsregion oder die
Ribosomenbindungsstelle, die sich stromaufwärts des
Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise
wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des
Strukturgens eingebaut werden. Durch induzierbare
Promotoren ist es zusätzlich möglich die Expression im
Verlaufe der fermentativen L-Threonin-Produktion zu
steigern. Durch Maßnahmen zur Verlängerung der Lebensdauer
der m-RNA wird ebenfalls die Expression verbessert.
Weiterhin wird durch Verhinderung des Abbaus des
Enzymproteins ebenfalls die Enzymaktivität verstärkt. Die
Gene oder Genkonstrukte können entweder in Plasmiden mit
unterschiedlicher Kopienzahl vorliegen oder im Chromosom
integriert und amplifiziert sein. Alternativ kann weiterhin
eine Überexpression der betreffenden Gene durch Veränderung
der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht
werden.
Anleitungen hierzu findet der Fachmann unter anderem bei
Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), bei
Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya und
Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), bei Eikmanns
et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), in der Europäischen
Patentschrift EPS 0 472 869, im US Patent 4,601,893, bei
Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), bei
Remscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology
60, 126-132 (1994)), bei LaBarre et al. (Journal of
Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), in der Patentanmeldung
WO 96/15246, bei Malumbres et al. (Gene 134, 15-24
(1993)), in der japanischen Offenlegungsschrift JP-A-10-
229891, bei Jensen und Hammer (Biotechnology and
Bioengineering 58, 191-195 (1998)), bei Makrides
(Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996)) und in
bekannten Lehrbüchern der Genetik und Molekularbiologie.
Ein Beispiel für ein Plasmid, mit Hilfe dessen das thrE-Gen
überexprimiert werden kann, ist pZ1thrE (Fig. 2), das in
dem Stamm DM368-2 pZ1thrE enthalten ist. Plasmid pZlthrE
ist ein auf Plasmid pZ1 beruhender C.-glutamicum-E.-coli-
Pendelvektor, der bei Menkel et al. (Applied and
Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554) beschrieben
ist. Andere in C. glutamicum replizierbare Plasmidvektoren
wie z. B. pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991))
oder pZ8-1 (EP-B-0 375 889) können in gleicher Weise
verwendet werden.
Zusätzlich kann es für die Produktion von L-Threonin
vorteilhaft sein, neben dem neuen thrE-Gen ein oder mehrere
Enzyme des bekannten Threonin-Biosyntheseweges oder Enzyme
des anaplerotischen Stoffwechsels oder Enzyme des
Zitronensäure-Zyklus zu überexprimieren. So kann
beispielsweise:
- - gleichzeitig das für die Homoserin-Dehydrogenase kodierende hom-Gen (Peoples et al., Molecular Microbiology 2, 63-72 (1988)) oder das für eine "feed back resistente" Homoserin-Dehydrogenase kodierende homdr-Allel (Archer et al., Gene 107, 53-59 (1991)) oder
- - gleichzeitig das für die Pyruvat-Carboxylase kodierende pyc-Gen (DE-A-198 31 609) oder
- - gleichzeitig das für die Malat:Chinon-Oxidoreduktase kodierende mqo-Gen (Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998))
überexprimiert werden.
Weiterhin kann es für die Produktion von L-Threonin
vorteilhaft sein, neben der Überexpression des thrE-Gens
unerwünschte Nebenreaktionen wie z. B. die Threonin-
Dehydrogenase auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino
Acid Producing Micro-organisms", in: Overproduction of
Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.),
Academic Press, London, UK, 1982 und Beil und Turner,
Biochemical Journal 156, 449-458 (1976)).
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können
kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren
(Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder
repeated fed batch-Verfahren (repetitives Zulaufverfahren)
zum Zwecke der Produktion von L-Threonin kultiviert werden.
Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden
sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1.
Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer-
Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas
(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg-Verlag,
Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den
Ansprüchen der jeweiligen Stämme genügen. Beschreibungen
von Kulturmedien verschiedenener Mikroorganismen sind im
Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der
American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA,
1981) enthalten. Als Kohlenstoffquelle können Zucker und
Kohlehydrate, wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose,
Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose; Öle und
Fette, wie z. B. Sojaöl, Sonnenblumenöl, Erdnussöl und
Kokosfett; Fettsäuren, wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure
und Linolsäure; Alkohole, wie z. B. Glycerin und Ethanol und
organische Säuren, wie z. B. Essigsäure verwendet werden.
Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet
werden. Als Stickstoffquelle können organische Stickstoff-
haltige Verbindungen, wie Peptone, Hefeextrakt,
Fleischextrakt, Malzextrakt, Maisquellwasser,
Sojabohnenmehl und Harnstoff oder anorganische Verbindungen,
wie Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat,
Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die
Stickstoffquellen können einzeln oder als Mischung
verwendet werden. Als Phosphorquelle können Phosphorsäure,
Kaliumdihydrogenphosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder
die entsprechenden Natrium-haltigen Salze verwendet werden.
Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Metallen enthalten,
wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das
Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle
Wuchsstoffe, wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den
oben genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium
können überdies geeignete Vorstufen zugesetzt werden. Die
genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines
einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise
während der Kultivierung zugefüttert werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen
wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw.
Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure
oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur
Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie
z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur
Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem
Medium geeignete, selektiv wirkende Stoffe, z. B. Antibiotika
hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen
aufrechtzuerhalten, werden Sauerstoff oder Sauerstoff-
haltige Gasmischungen, wie z. B. Luft in die Kultur
eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise
bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die
Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an L-
Threonin gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise
innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Die Analyse von L-Threonin kann durch
Anionenaustauschchromatographie mit anschließender
Ninhydrin-Derivatisierung erfolgen, so wie bei Spackman et
al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) beschrieben,
oder sie kann durch reversed phase HPLC erfolgen, so wie bei
Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174)
beschrieben.
Folgende Mikroorganismen wurden bei der Deutschen Sammlung
für Mikrorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig,
Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt:
- - Brevibacterium flavum Stamm DM368-2 pZ1thrE als DSM 12840,
- - Escherichia coli Stamm GM2929pCGL0040 als DSM 12839.
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von
Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli sowie
alle Techniken zur Restriktion, Klenow- und alkalische
Phosphatasebehandlung wurden nach Sambrook et al.
(Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring
Harbour Laboratory Press) durchgeführt. Die Transformation
von Escherichia coli wurde, wenn nicht anders beschrieben,
nach Chung et al. (Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America USA (1989) 86:
2172-2175) durchgeführt.
Der Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC14752ΔilvA wurde
einer Mutagenese mit dem Transposon Tn5531 unterworfen,
dessen Sequenz unter der Accession-Nummer U53587 in der
Nukleotid-Datenbank des National Center for Biotechnology
Information (Bethesda, USA) hinterlegt ist. Der Einbau
einer Deletion in das ilvA-Gen von Corynebacterium
glutamicum ATCC14752 wurde mit dem bei Schäfer et al. (Gene
(1994) 145: 69-73) beschriebenen System zum Genaustausch
durchgeführt. Dazu wurde der von Sahm et al. konstruierte
Inaktivierungsvektor pK19mobsacBΔilvA (Applied and
Environmental Microbiology (1999) 65: 1973-1979) zur
Deletion verwendet. Zunächst wurde der Methylase-defekte
Escherichia coli Stamm SCS110 (Jerpseth und Kretz,
STRATEGIES in molecular biology 6, 22, (1993)) der Firma
Stratagene (Heidelberg, Deutschland) mit 200 ng des Vektors
pK19mobsacBΔilvA transformiert. Transformanten wurden
anhand ihrer Kanamycinresistenz auf 50 µg/mL Kanamycin
enthaltenden LB-Agarplatten identifiziert. Aus einer der
Transformanten wurde das Plasmid pK19mobsacBΔilvA
präpariert. Mittels Elektroporation (Haynes et al., FEMS
Microbiology Letters (1989) 61: 329-334) wurde dieses
Inaktivierungsplasmid dann in den Stamm Corynebacterium
glutamicum ATCC14752 eingebracht. Klone, bei denen der
Inaktivierungsvektor im Genom integriert vorlag, wurden
anhand ihrer Kanamycinresistenz auf 15 µg/mL Kanamycin
enthaltenden LBHIS-Agarplatten identifiziert (Liebl et al.,
FEMS Microbiology Letters (1989) 65: 299-304). Um auf die
Excision des Vektors zu selektieren, wurden Kanamycin
resistente Klone auf Saccharose-haltigem LBG-Medium (LB-
Medium mit 15 g/L Agar, 2% Glucose und 10% Saccharose)
ausplattiert. Dabei wurden Kolonien erhalten, welche den
Vektor durch ein zweites Rekombinationsereignis wieder
verloren haben (Jäger et al.; Journal of Bacteriology
(1992) 174: 5462-5465). Durch Überimpfen auf
Minimalmediumplatten (CGXII-Medium mit 15 g/L Agar
(Keilhauer et al., Journal of Bacteriology (1993) 175:
5595-5603)) mit und ohne 300 mg/L L-Isoleucin, bzw. mit und
ohne 50 µg/mL Kanamycin wurden sechs Klone isoliert, die
durch Excision des Vektors Kanamycin sensitiv und Isoleucin
auxotroph waren, und bei denen nun das unvollständige ilvA-
Gen (ΔilvA-Allel) im Genom vorlag. Einer dieser Klone wurde
als Stamm ATCC14752ΔilvA bezeichnet und zur
Transposonmutagenese eingesetzt.
Aus dem Methylase-defekten E.-coli-Stamm GM2929pCGL0040 (E.
coli GM2929: Palmer et al., Gene (1994) 143: 1-12) wurde
das Plasmid pCGL0040 isoliert, welches das zusammengesetzte
Transposon Tn5531 enthält (Ankri et al., Journal of
Bacteriology (1996) 178: 4412-4419). Der Stamm
Corynebacterium glutamicum ATCC14752ΔilvA wurde mittels
Elektroporation (Haynes et al., FEMS Microbiology Letters
(1989) 61: 329-334) mit dem Plasmid pCGL0040 transformiert.
Klone, bei denen das Transposon Tn5531 ins Genom integriert
war, wurden anhand ihrer Kanamycinresistenz auf 15 µg/mL
Kanamycin enthaltenden LBHIS-Agarplatten identifiziert
(Liebl et al., FEMS Microbiology Letters (1989) 65: 299-304).
Auf diese Weise wurden 2000 Klone erhalten, welche
auf verzögertes Wachstum in Anwesenheit von Threonyl-
threonyl-threonin überprüft wurden. Dazu wurden alle Klone
einzeln auf CGXII-Minimalmedium-Agarplatten mit und ohne 2 mM
Threonyl-threonyl-threonin übertragen. Das Medium war
identisch mit dem bei Keilhauer et al. beschriebenen Medium
CGXII (Journal of Bacteriology (1993) 175: 5593-5603),
enthielt aber zusätzlich 25 µg/mL Kanamycin, 300 mg/L L-
Isoleucin und 15 g/L Agar. Die Zusammensetzung des von
Keilhauer et al. beschriebenen Mediums ist in Tabelle 1
dargestellt.
Die Agarplatten wurden bei 30°C inkubiert und das Wachstum
nach 12, 18 und 24 Stunden untersucht. Es wurde eine
Transposonmutante erhalten, die ohne Threonyl-threonyl-
threonin vergleichbar mit dem Ausgangsstamm Corynebacterium
glutamicum ATCC14752ΔilvA wuchs, in Anwesenheit von 2 mM
Threonyl-threonyl-threonin aber verzögertes Wachstum
zeigte. Diese wurde als ATCC14752ΔilvAthrE::Tn5531
bezeichnet.
Um den stromaufwärts des Transposons Tn5531 gelegenen
Insertionsort in der in Beispiel 1.1 beschriebenen Mutante
zu klonieren, wurde zunächst die chromosomale DNA dieses
Mutantenstammes, wie bei Schwarzer et al. (Bio/Technology
(1990) 9: 84-87) beschrieben, isoliert und 400 ng davon mit
der Restriktionsendonuklease EcoRI geschnitten. Der
vollständige Restriktionsansatz wurde in den ebenfalls mit
EcoRI linearisierten Vektor pUC18 (Norandex et al., Gene
(1983) 26: 101-106) der Firma Roche Diagnostics (Mannheim,
Deutschland) ligiert. Mit dem gesamten Ligationsansatz
wurde der E.-coli-Stamm DH5αmcr (Grant et al., Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United States of
America USA (1990) 87: 4645-4649) mittels Elektroporation
transformiert (Dower et al., Nucleic Acid Research (1988)
16: 6127-6145). Transformanten, bei denen auf dem Vektor
pUC18 die Insertionsorte des Transposons Tn5531 kloniert
vorlagen, wurden anhand ihrer Carbenicillin- und
Kanamycinresistenz auf 50 µg/mL Carbenicillin und 25 µg/mL
Kanamycin enthaltenden LB-Agarplatten identifiziert. Aus
drei der Transformanten wurden die Plasmide präpariert und
durch Restriktionsanalyse die Größen der klonierten Inserts
bestimmt. Die Nukleotidsequenz des Insertionsortes auf
einem der Plasmide mit einem ca. 5,7 kb großen Insert wurde
nach der Dideoxy-Kettenabbruchmethode von Sanger et al.
bestimmt (Proceedings of the National Academy of Sciences
of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467).
Hierzu wurden 2,2 kb des Inserts ausgehend von folgendem
Oligonukleotid-Primer sequenziert: 5'-CGG GTC TAC ACC GCT
AGC CCA GG-3'.
Zur Identifizierung des stromabwärts des Transposons
gelegenen Insertionsortes wurde die chromosomale DNA der
Mutante mit der Restriktionsendonuklease XbaI geschnitten
und in den mit XbaI linearisierten Vektor pUC18 ligiert.
Die weitere Klonierung wurde, wie oben beschrieben,
durchgeführt. Die Nukleotidsequenz des Insertionsortes auf
einem der Plasmide mit einem ca. 8,5 kb großen Insert wurde
nach der Dideoxy-Kettenabbruchmethode von Sanger et al.
bestimmt (Proceedings of the National Academy of Sciences
of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467).
Hierzu wurden 0,65 kb des Inserts, ausgehend von folgendem
Oligonukleotid-Primer, sequenziert: 5'-CGG TGC CTT ATC CAT
TCA GG-3'.
Die erhaltenen Nukleotidsequenzen wurde mit dem
Programmpaket Lasergene (Biocomputing Software for Windows,
DNASTAR, Madison, USA) analysiert und zusammengefügt. Diese
Nukleotidsequenz ist als SEQ-ID-No 1 wiedergegeben. Die
Analyse ergab die Identifizierung eines offenen Leserasters
von 1467 bp Länge. Das entsprechende Gen wurde als thrE-Gen
bezeichnet. Das dazugehörige Genprodukt umfasst 489
Aminosäuren und ist als SEQ-ID-No 2 wiedergegeben.
Das Gen thrE wurde in den E.-coli-Klonierungsvektor pUC18
(Norrander et al., Gene (1983) 26: 101-106, Roche
Diagnostics, Mannheim, Deutschland) kloniert. Die
Klonierung wurde in zwei Schritten durchgeführt. Zunächst
wurde durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) das Gen aus
Corynebacterium glutamicum ATCC13032 mittels folgender aus
SEQ-ID-No 1 abgeleiteter Oligonukleotid-Primer
amplifiziert.
thrE-forward:
5'-CCC CTT TGA CCT GGT GTT ATT G-3'
thrE-reverse:
5'-CGG CTG CGG TTT CCT CTT-3'
Die PCR-Reaktion wurde in 30 Zyklen in Gegenwart von 200 µM
Deoxynukleotid-triphosphaten (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), je 1 µM
des entsprechenden Oligonukleotids, 100 ng chromosomaler
DNA von Corynebacterium glutamicum ATCC13032, 1/10 Volumen
10-fach Reaktionspuffer und 2,6 Einheiten einer
hitzestabilen Taq-/Pwo-DNA-Polymerase-Mischung (Expand High
Fidelity PCR System der Firma Roche Diagnostics, Mannheim,
Deutschland) in einem Thermocycler (PTC-100, MJ Research,
Inc., Watertown, USA) unter folgenden Bedingungen
durchgeführt: 94°C für 30 Sekunden, 58°C für 30 Sekunden
und 72°C für 2 Minuten.
Das amplifizierte etwa 1,9 kb große Fragment wurde dann im
folgenden mit Hilfe des SureClone Ligation Kit (Amersham
Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) nach Angaben des
Herstellers in die SmaI-Schnittstelle des Vektors pUC18
ligiert. Mit dem gesamten Ligationsansatz wurde der E.-coli-
Stamm DH5αmcr (Grant et al., Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America USA
(1990) 87: 4645-4649) transformiert. Transformanten wurden
anhand ihrer Carbenicillinresistenz auf 50 µg/mL
Carbenicillin enthaltenden LB-Agarplatten identifiziert.
Aus 8 der Transformanten wurden die Plasmide präpariert und
durch Restriktionsanalyse auf das Vorhandensein des 1,9 kb-
PCR-Fragments als Insert überprüft. Das so entstandene
rekombinante Plasmid wird im folgenden mit pUC18thrE
bezeichnet.
Die Nukleotidsequenz des 1,9 kb-PCR-Fragments in Plasmid
pUC18thrE wurde nach der Dideoxy-Kettenabbruchmethode von
Sanger et al. bestimmt (Proceedings of the National Academy
of Sciences of the United States of America USA (1977) 74:
5463-5467). Hierzu wurde das vollständige Insert von
pUC18thrE mit Hilfe folgender Primer der Firma Roche
Diagnostics (Mannheim, Deutschland) sequenziert.
Universalprimer:
5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3'
Reverseprimer:
5'-GGA AAC AGC TAT GAC CAT G-3'
Die Nukleotidsequenz ist als SEQ-ID-No 3 wiedergegeben. Die
erhaltene Nukleotidsequenz wurde mit dem Programmpaket
Lasergene (Biocomputing Software for Windows, DNASTAR,
Madison, USA) analysiert. Die Analyse ergab die
Identifizierung eines offenen Leserasters von 1467 bp
Länge, das als thrE-Gen bezeichnet wurde. Dieses kodiert
für ein Polypeptid von 489 Aminosäuren, welches als SEQ-ID-
No 4 wiedergegeben ist.
Das unter Beispiel 2 beschriebene Gen thrE aus
Corynebacterium glutamicum ATCC13032 wurde zur Expression
in den Vektor pZ1 kloniert (Menkel et al., Applied and
Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554). Dazu wurde
aus dem Plasmid pUC18thrE mit den Restriktionsenzymen SacI
und XbaI ein 1881 bp großes, das Gen thrE enthaltendes DNA-
Fragment ausgeschnitten. Die 5'- und 3'-Enden dieses
Fragments wurden mit Klenow-Enzym behandelt. Das
resultierende DNA-Fragment wurde in den zuvor mit ScaI
linearisierten und dephosphorylierten Vektor pZ1 ligiert.
Mit dem gesamten Ligationsansatz wurde der E.-coli-Stamm
DH5αmcr (Grant et al., Proceedings of the National Academy
of Sciences of the United States of America USA (1990) 87:
4645-4649) transformiert. Transformanten wurden anhand
ihrer Kanamycinresistenz auf 50 µg/mL Kanamycin
enthaltenden LB-Agarplatten identifiziert. Aus 2
Transformanten wurden die Plasmide präpariert und durch
Restriktionsanalyse auf das Vorhandensein des 1881 bp-
ScaI/XbaI-Fragments als Insert überprüft. Das auf diese
Weise entstandene, rekombinante Plasmid wurde als pZ1thrE
bezeichnet (Fig. 2).
Mittels Elektroporation (Haynes et al., FEMS Microbiology
Letters (1989) 61: 329-334) wurden die Plasmide pZ1 und
pZ1thrE in den threoninbildenden Stamm Brevibacterium
flavum DM368-2 eingebracht. Der Stamm DM368-2 ist in der
EP-B-0 385 940 beschrieben und als DSM5399 hinterlegt.
Transformanten wurden anhand ihrer Kanamycinresistenz auf
15 µg/mL Kanamycin enthaltenden LBHIS-Agarplatten
identifiziert (Liebl et al., FEMS Microbiology Letters
(1989) 65: 299-304). Auf diese Weise entstanden die Stämme
Brevibacterium flavum DM368-2 pZ1 und DM368-2 pZ1thrE.
Zur Untersuchung ihrer Threoninbildung wurden die Stämme B.
flavum DM368-2 pZ1 und DM368-2 pZ1thrE in 100 mL Brain
Heart Infusion-Medium mit 50 µg Kanamycin/mL (Difco
Laboratories, Detroit, USA) für 14 Stunden bei 30°C
vorkultiviert. Anschließend wurden die Zellen einmal mit
0,9%(w/v) Natriumchloridlösung gewaschen und mit dieser
Suspension je 60 mL CgXII-Medium so angeimpft, daß die OD600
(optische Dichte bei 600 nm) 0,5 betrug. Das Medium war
identisch mit dem bei Keilhauer et al. beschriebenen Medium
(Journal of Bacteriology (1993) 175: 5593-5603), enthielt
aber zusätzlich 50 µg Kanamycin pro mL. Die Kultivierung
beider Stämme wurde bei 30°C über einen Zeitraum von 72
Stunden durchgeführt. Nach 0, 24, 48 und 72 Stunden wurden
jeweils Proben genommen und die Zellen kurz abzentrifugiert
(5 Minuten bei 13000 Umdrehungen pro Minute mit einer
Biofuge pico der Firma Heraeus, Osterode, Deutschland).
Die quantitative Bestimmung der extrazellulären
Aminosäurekonzentrationen aus dem Kulturüberstand erfolgte
mittels reversed phase HPLC (Lindroth et al., Analytical
chemistry (1979) 51: 1167-1174). Es wurde ein HPLC-Gerät
der Serie HP1100 (Hewlett-Packard, Waldbronn, Deutschland)
mit angeschlossenem Fluoreszenzdetektor (G1321A) verwendet;
die Systemsteuerung und die Auswertung der Daten erfolgte
mit einer HP-Chem-Station (Hewlett-Packard). 1 µL der zu
analysierenden Aminosäurelösung wurde in einer
automatischen Vorsäulenderivatisierung mit 20 µL ortho-
Phthalaldehyd/2-Mercaptoethanol-Fertigreagenz (Pierce
Europe BV, Oud-Beijerland, Niederlande) gemischt. Die dabei
entstehenden fluoreszierenden, thiosubstituierten Isoindole
(Jones et al., Journal of Chromatography (1983) 266: 471-482)
wurden über eine kombinierte Vorsäule (40 × 4 mm
Hypersil ODS 5) und Hauptsäule (Hypersil ODS 5, beide
Säulen von der Firma CS-Chromatographie-Service GmbH,
Langerwehe, Deutschland) mit einem Gradientenprogramm mit
zunehmend unpolarer Phase (Methanol) aufgetrennt. Das
polare Eluenz war Natriumacetat (0,1 Molar, pH 7,2); die
Flußrate betrug 0,8 mL pro Minute. Die Fluoreszenzdetektion
der derivatisierten Aminosäuren erfolgte bei einer
Anregungswellenlänge von 230 nm und einer
Emissionswellenlänge von 450 nm. Die
Aminosäurekonzentrationen wurden über einen Vergleich mit
einem externen Standard und Asparagin als zusätzlichem,
internem Standard berechnet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Folgende Figuren sind beigefügt:
Fig. 1 Karte des das Transposon Tn5531 enthaltenden
Plasmids pCGL0040. Das Transposon ist als nicht
schraffierter Pfeil gekennzeichnet.
Fig. 2 Karte des das thrE-Gen enthaltenden Plasmids
pZ1thrE.
Längenangaben sind als ca.-Angaben aufzufassen. Die
verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben folgende
Bedeutung:
- - BglII: Restriktionsendonuklease aus Bacillus globigii,
- - EcoRI: Restriktionsendonuklease aus Escherichia coli,
- - EcoRV: Restriktionsendonuklease aus Escherichia coli,
- - SacI: Restriktionsendonuklease aus Streptomyces achromogenes,
- - XbaI: Restriktionsendonuklease aus Xanthomonas badrii,
- - XhoI: Restriktionsendonuklease aus Xanthomonas holcicola,
- - Amp: Ampicillinresistenzgen,
- - Kan: Kanamycinresistenzgen,
- - 'amp: 3'-Teil des Ampicillinresistenzgens,
- - oriBR322: Replikationsregion des Plasmides pBR322.
Claims (15)
1. In coryneformen Mikroorganismen replizierbare,
bevorzugt rekombinante DNA mit der Herkunft
Corynebacterium, die zumindest eine Nukleotidsequenz
enthält, die für das thrE-Gen codiert.
2. Replizierbare DNA gemäß Anspruch 1 mit
- a) den Nukleotidsequenzen, gezeigt in SEQ-ID-No. 1, oder SEQ-ID-No. 3, die für das thrE-Gen codieren, oder
- b) mindestens einer Sequenz, die den Squenzen (i) innerhalb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes entspricht, oder
- c) mindestens einer Sequenz, die mit den zu den Sequenzen (i) oder (ii) komplementären Sequenzen hybridisiert, und/oder gegebenenfalls
- d) funktionsneutralen Sinnmutationen in (i).
3. Aminosäuresequenz des Proteins, abgeleitet aus den
Nukleotidsequenzen gemäß den Ansprüchen 1 oder 2,
dargestellt in der SEQ-ID-No. 2 und der SEQ-ID-No. 4.
4. Coryneforme Mikroorganismen, insbesondere der Gattung
Corynebacterium, transformiert durch die Einführung
einer oder mehrerer der replizierbaren DNA gemäß einem
der Ansprüche 1 oder 2.
5. Corynebacterium glutamicum DM368-2 pZ1thrE, hinterlegt
unter der Nummer DSM 12840.
6. Verfahren zur Herstellung von L-Threonin durch
Fermentation coryneformer Bakterien,
dadurch gekennzeichnet,
daß man Bakterien einsetzt, in denen
Nukleotidsequenzen, codierend für das thrE-Gen,
verstärkt, insbesondere überexprimiert werden.
7. Verfahren gemäß Anspruch 6,
dadurch gekennzeichnet,
daß man Bakterien einsetzt, in denen zusätzlich eines
oder mehrere Gene des Threonin-Biosyntheseweges
verstärkt.
8. Verfahren gemäß den Ansprüchen 6 und 7,
dadurch gekennzeichnet,
daß man einen mit einem Plasmidvektor transformierten
Stamm einsetzt und der Plasmidvektor die für das thrE-
Gen codierende Nucleotidsequenz trägt.
9. Verfahren gemäß den Ansprüchen 6 bis 8,
dadurch gekennzeichnet,
daß man das thrE-Gen in Mikroorganismen überexprimiert,
die weitere Metabolit- bzw. Antimetabolit-
Resistenzmutationen aufweisen.
10. Verfahren gemäß den Ansprüchen 6 bis 9,
dadurch gekennzeichnet,
daß man die Mikroorganismen zur Erzielung der
Überexpression in geänderten Kulturmedien fermentiert
und/oder die Fermentationsführung ändert.
11. Verfahren gemäß den Ansprüchen 6 bis 10,
dadurch gekennzeichnet,
daß man Mikroorganismen einsetzt, in denen die
Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet
sind, die die Threoninbildung verringern.
12. Verfahren gemäß den Ansprüchen 6 bis 11,
dadurch gekennzeichnet,
daß man Mikroorganismen einsetzt, in denen man
zusätzlich zum thrE-Gen die übrigen Gene des
Stoffwechselweges der Threoninbildung, einzeln oder
gemeinsam verstärkt (überexprimiert).
13. Verfahren zur Herstellung von L-Threonin,
dadurch gekennzeichnet,
daß man folgende Schritte durchführt:
- a) Fermentation von Mikroorganismen gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, in denen zumindest das thrE-Gen verstärkt (überexprimiert) wird, ggf. in Kombination mit weiteren Genen,
- b) Anreicherung des L-Threonins im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen und
- c) Isolieren des L-Threonins.
14. Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden
Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß man Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium
einsetzt.
15. Verfahren zur Isolierung des thrE-Gens,
dadurch gekennzeichnet,
daß man als Indikatorstämme im thrE-Gen defekte
Mutanten, vorzugsweise coryneformer Bakterien gewinnt,
die auf einem ein Threonin-haltiges Oligopeptid
enthaltenden Nährmedium nicht oder nur gering wachsen
und
- a) das thrE-Gen nach dem Anlegen einer Genbank identifiziert und isoliert oder
- b) im Fall der Transposon-Mutagenese auf das bevorzugt eine Antibiotikaresistenz enthaltende Transposon selektiert und so das thrE-Gen erhält.
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