KR20140093649A

KR20140093649A - Ｌ-라이신 생산능을 갖는 미생물을 이용하여 ｌ-라이신을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR20140093649A
Application number: KR1020140082102A
Authority: KR
Inventors: 박수진; 장재우; 문준옥; 박상희; 이광호; 임상조
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2011-12-21
Filing date: 2014-07-01
Publication date: 2014-07-28
Also published as: MX2014007385A; KR101483395B1; US9593354B2; KR20130072183A; MX353594B; DK2796555T3; CN105483145A; EP2796555B1; ES2696173T3; BR112014015215B1; CN109251934B; CN104334728B; US9938546B2; EP3404101A3; CN109251934A; CA2860252C; WO2013095071A3; IN2014MN01298A; US20150099281A1; CN105624175A

Abstract

본 발명은 아스파테이트 키나제(aspartate kinase; EC:2.7.2.4; 이하 LysC), 트랜스케토라제(transketolase; EC:2.2.1.1; 이하 Tkt) 또는 파이루베이트 카르복실라제(pyruvate carboxylase; EC:6.4.1.1; 이하 Pyc)를 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오티드의 개시코돈을 ATG로 치환시킨 변이형 폴리뉴클레오티드, 이들을 포함하는 벡터, 이들 벡터에 의해 형질전환된 미생물, 및 이를 이용하여 L-라이신을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

Ｌ-라이신 생산능을 갖는 미생물을 이용하여 Ｌ-라이신을 생산하는 방법 {Method of producing L-lysine using microorganism having ability to produce L-lysine}

본 발명은 개시코돈을 ATG로 치환시킨 변이형 폴리뉴클레오티드, 이들을 포함하는 벡터, 이들 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물 및 이를 이용하여 L-라이신을 생산하는 방법에 관한 것이다.

코리네박테리움 (Corynebacterium) 속 미생물, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)은 L-라이신 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성의 미생물이다. L-라이신은 동물사료, 사람의 의약품 및 화장품 산업에 사용되고 있으며 코리네박테리움 속 균주를 이용한 발효에 의해 생산되고 있다.

종래 라이신 생합성 관련 유전자가 강화된 코리네박테리움 속 균주 및 이를 이용한 L-라이신 생산방법이 알려져 있었다. 예를 들면, 미국특허 제6,746,855호에는 lysE 유전자 (라이신 배출 캐리어 유전자)가 강화되고, dapA 유전자, lysC 유전자, pyc 유전자 및 dapB 유전자로 구성되는 군으로부터 선택된 유전자가 추가적으로 도입된 코리네박테리움을 배양하여 L-라이신을 생산하는 방법이 개시되어 있다.

또 다른 방법으로, 라이신 생합성 경로 상의 유전자를 증폭시키거나 프로모터를 변형시키는 방법이 이용되어 왔다. 예를 들면, 국내공개특허 제2009-0082702호와 제2009-0084099호에서는 각각 ddh와 lysC - asd 오페론의 프로모터를 개량하고 코리네박테리움에 도입하여 L-라이신을 생산하는 방법이 개시되어 있고, 국내공개특허 제2008-0025355호에서는 라이신 생합성 경로 유전자인 aspB , lysC , asd , dapA, dapB , lysA , pyc를 염색체 내에 2개 카피로 증폭시켜 라이신 생산효율을 높이는 방법이 개시되어 있다.

한편, 일반적으로 염색체 내 유전자의 번역(translation)시 리보좀이 인식하여 번역을 개시하는 개시코돈은 ATG로서, 유전자의 개시코돈에 따라 번역의 수준이 다르게 조절될 수 있으므로 개시코돈의 염기서열이 단백질 활성 조절에 중요할 수 있다. 그러나, 일반적인 개시코돈인 ATG와 달리 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 라이신 생합성 관련 유전자 중 lysC와 pyc의 개시코돈이 GTG이고, 펜토스 포스페이트 경로상에 존재하는 tkt의 개시코돈이 TTG임을 확인하였다(참고문헌:J. Biotechnol., 104: 5-25, 2003).

이에, 본 발명자들은 라이신 생산 효율을 높이기 위한 방법을 찾기 위해 예의 노력한 결과, 야생형인 lysC , tkt 및 pyc 유전자의 개시코돈을 ATG로 교체함으로써 아스파테이트 키나제, 트랜스케토라제 및 파이루베이트 카르복실라제의 활성을 내재적 활성보다 증가시킬 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 아스파테이트 키나제(aspartate kinase; EC:2.7.2.4; 이하 LysC), 트랜스케토라제(transketolase; EC:2.2.1.1; 이하 Tkt) 또는 파이루베이트 카르복실라제(pyruvate carboxylase; EC:6.4.1.1; 이하 Pyc)를 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오티드의 개시코돈을 ATG로 치환한 변이형 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 ATG로 치환된 개시코돈을 가지는 아스파테이트 키나제, 트랜스케토라제 또는 파이루베이트 카르복실라제를 코딩하는 변이형 폴리뉴클레오티드들 중 하나 이상의 변이형 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 효소 중 하나 이상의 효소의 활성이 내재적 활성보다 증가된 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 미생물을 배양하는 단계 및 배양된 미생물 또는 배양 배지로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는, L-라이신을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 아스파테이트 키나제(aspartate kinase; EC:2.7.2.4; 이하 LysC), 트랜스케토라제(transketolase; EC:2.2.1.1; 이하 Tkt) 또는 파이루베이트 카르복실라제(pyruvate carboxylase; EC:6.4.1.1; 이하 Pyc)를 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오티드의 개시코돈을 ATG로 치환한 변이형 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

상기 아스파테이트 키나제, 트랜스케토라제 또는 파이루베이트 카르복실라제를 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오티드는 각각의 효소 활성을 가지는 한 일부 뉴클레오티드가 치환, 결실, 삽입 및 부가된 것도 포함하며 70% 이상, 바람직하게 80% 이상, 더욱 바람직하게 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95%이상, 가장 바람직하게 100%의 상동성을 가질 수 있다.

본 발명에서 용어, "상동성(homologous)"이란 야생형의 lysC 유전자, tkt 유전자 및 pyc 유전자와 이에 대응하는 변이형 유전자들로서, 일부 뉴클레오티드가 치환, 결실, 삽입 및 부가된 lysC 유전자, tkt 유전자 및 pyc 유전자의 핵산 서열들과의 동일성 정도를 나타내는 것이다.

본 발명에서 용어, "개시코돈(initiation codon)"이란 mRNA(messenger RNA)의 코딩 서열(coding sequence)이 단백질로 번역(translation)될 때 번역개시점에 해당하는 3개의 뉴클레오티드를 의미한다. 일반적으로 미생물의 염색체 상에서 발견되는 개시코돈들로는 ATG(mRNA 상에서는 AUG), GTG(mRNA 상에서는 GUG) 및 TTG(mRNA 상에서는 UUG)가 있으며 코리네박테리움 글루타미쿰의 전체 게놈염기서열 분석 결과에 의하면 이들은 각각 62.5%~66.5%, 23.1%~24.3% 및 10.3%~13.2%의 비율로 존재함을 알 수 있다 (참고문헌: Handbook of Corynebacterium glutamicum, 40p, Lothar Eggeling &　Michael Bott, 2005).

나아가, 현재까지 보고된 코리네박테리움 유래 라이신 생합성 관련 유전자 중 lysC와 pyc는 GTG를, tkt는 TTG를 개시코돈으로 사용한다. 즉, 상기 유전자들은 ATG를 개시코돈으로 하고 있지 않으며, 이는 코리네박테리움 고유의 특징으로 여겨지고 있다.

본 발명에 따른 변이형 폴리뉴클레오티드는 상기 lysC , tkt 또는 pyc 유전자의 개시코돈이 ATG로 치환된 것을 특징으로 하며, 이와 같은 개시코돈이 치환된 변이형 폴리뉴클레오티드들은 본 발명자들에 의해 최초로 규명된 것이다. 보다 구체적으로 본 발명을 통해 상기 아스파테이트 키나제(LysC) 및 파이루베이트 카르복실라제(Pyc)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드들의 개시코돈은 GTG에서 ATG로 치환되고, 상기 트랜스케토라제(Tkt)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 개시코돈은 TTG에서 ATG로 치환된다. 보다 바람직하게, 상기 lysC와 tkt , pyc 유전자 서열이 각각 서열번호 13, 14, 15일 때 개시코돈이 ATG로 치환된 유전자 서열은 각각 서열번호 16, 17, 18이다.

개시코돈의 염기치환은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 표적 특이적 돌연변이(site-specific mutagenesis), 상동 재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 양태로서, ATG로 치환된 개시코돈을 가지는 아스파테이트 키나제, 트랜스케토라제 또는 파이루베이트 카르복실라제를 코딩하는 변이형 폴리뉴클레오티드들 중 하나 이상의 변이형 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명의 벡터에 포함되는 ATG로 치환된 개시코돈을 가지는 아스파테이트 키나제, 트랜스케토라제 또는 파이루베이트 카르복실라제를 코딩하는 변이형 폴리뉴클레오티드에는 각각의 효소 활성을 가지는 한 유전자 중 일부 뉴클레오티드가 치환, 결실, 삽입 및 부가된 것도 포함되며 70% 이상, 바람직하게 80% 이상, 더욱 바람직하게 90% 이상, 더더욱 바람직하게 95% 이상, 가장 바람직하게 100%의 상동성을 가질 수 있다.

또한, 본 발명의 벡터에 포함되는 ATG로 치환된 개시코돈을 가지는 아스파테이트 키나제, 트랜스케토라제 또는 파이루베이트 카르복실라제를 코딩하는 변이형 폴리뉴클레오티드에는 ATG로 치환된 개시코돈이 포함되는 한 아스파테이트 키나제, 트랜스케토라제 또는 파이루베이트 카르복실라제를 코딩하는 유전자의 일부만을 포함하는 것도 포함된다.

본 발명에서 용어, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주 중에서 복제가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당 업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 예컨대 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있으며, 바람직하게는 pDZ (특허등록 제10-0924065호)를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 벡터는 적당한 숙주 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

구체적으로, lysC , tkt 또는 pyc 유전자 중 개시코돈 부위를 포함하는 염기서열(각각 서열번호 13, 14 및 15)을 확보하고 이에 근거하여 개시코돈이 ATG로 치환된 프라이머를 합성하였다. 이 프라이머를 이용하여 L-라이신 생산 균주의 염색체 DNA를 주형으로 하고 PCR을 수행하여 한쪽 말단이 ATG로 치환된 DNA를 수득하였다. 수득한 DNA 단편을 벡터에 클로닝하여 최종적으로 재조합 벡터를 수득하였다. 보다 구체적으로는, 본 발명에서는 각각 벡터 pDZ-lysC(ATG), pDZ-tkt(ATG) 및 pDZ-pyc(ATG)를 제작하고 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 ATG로 치환된 개시코돈을 가지는, 아스파테이트 키나제, 트랜스케토라제 및 파이루베이트 카르복실라제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 효소를 코딩하는 변이형 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 이들로부터 전사된 mRNA들의 단백질로의 번역수준이 향상된 결과로써 상기 효소 중 하나 이상의 효소의 활성이 내재적 활성보다 증가된 미생물을 제공한다. 본 발명의 미생물은 ATG로 치환된 개시코돈을 가지는 아스파테이트 키나제, 트랜스케토라제 및 파이루베이트 카르복실라제를 코딩하는 변이형 폴리뉴클레오티드들을 이용하여 각각 1종, 2종, 또는 3종의 조합을 통해 해당 효소들의 활성이 증가된 형태일 수 있다.

미생물의 염색체 상에서 목표 유전자들의 개시코돈을 ATG로 치환하기 위해서 당업계에 공지된 다양한 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어 미생물에 내재된 lysC , tkt 및 pyc의 개시코돈 서열을 염색체상에서 치환할 수 있으며, 다른 방법으로는 개시코돈 서열이 치환된 해당 유전자를 플라스미드 형태로 미생물 내에 도입할 수도 있다.

상기 미생물에는 L-라이신 생산능을 가지는 미생물이면 어느 것이나 포함될 수 있으나 코리네박테리움 속 또는 브레비박테리움 속 미생물인 것이 바람직하고 예를 들면, 상기 코리네박테리움 속 또는 브레비박테리움 속 미생물에는, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032, 코리네박테리움 써모아미노게네스 (Corynebacterium thermoaminogenes) FERM BP-1539, 브레비박테리움 플라붐 (Brevibacterium flavum) ATCC 14067, 브레비박테리움 락토페르멘툼 (Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869이 있다. 또한, 이들로부터 제조된 L-라이신 생산 돌연변이체 또는 균주, 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P(상기 미생물은 KFCC10881로 공개되었다가, 부다페스트 조약하인 국제기탁기관에 재기탁되어, KCCM11016P로 기탁번호를 부여받았음, 한국 등록특허 제10-0159812호, 한국 등록특허 제10-0397322호), 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC 11001이 포함되며, 가장 바람직하게는, 수탁번호 KCCM11016P인 코리네박테리움 글루타미쿰이다.

구체적으로, 수탁번호 KCCM11016P인 코리네박테리움 글루타미쿰에 각각 ATG로 치환된 개시코돈을 가지는 아스파테이트 키나제, 트랜스케토라제 또는 파이루베이트 카르복실라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환하여 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰을 수득하였고, 보다 구체적으로, 수탁번호가 KCCM11016P인 코리네박테리움 글루타미쿰에 각각 벡터 pDZ-lysC(ATG), pDZ-tkt(ATG) 또는 pDZ-pyc(ATG)를 도입하여 재조합 코리네박테리움 글루타미쿰을 수득하였다.

또한, ATG로 치환된 개시코돈을 가지는 아스파테이트 키나제, 트랜스케토라제 또는 파이루베이트 카르복실라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 중 조합에 의해 둘 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환할 수도 있다. 구체적으로, ATG로 치환된 개시코돈을 가지는 트랜스케토라제를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터인 pDZ-tkt(ATG) 벡터를 lysC의 개시코돈이 GTG에서 ATG로 교체된 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P-lysC에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거치면 염색체 상에 lysC와 tkt의 개시코돈이 ATG로 치환된 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P-lysC-tkt를 얻을 수 있었다. 또한, ATG로 치환된 개시코돈을 가지는 파이루베이트 카르복실라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터인 pDZ-pyc(ATG)벡터를 lysC의 개시코돈이 GTG에서 ATG로 교체된 KCCM11016P-lysC에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에 lysC와 pyc의 개시코돈이 ATG로 치환된 KCCM11016P-lysC-pyc를 얻을 수 있었다. 또한, pDZ-tkt(ATG)벡터를 상기 제작된 lysC와 pyc의 개시코돈이 GTG에서 ATG로 교체된 KCCM11016P-lysC-pyc에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에 lysC , pyc와 tkt의 개시코돈이 ATG로 치환된 KCCM11016P-lysC-pyc-tkt를 얻을 수 있었다. 마찬가지로, KFCC10750 (한국 등록특허 제 제10-0073610호), KCCM10770P (한국 등록특허 제10-0924065호), CJ3P (Genome Biology 2012, 13:R40)의 코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 또다른 라이신 생산균주에서도 동일한 방법으로 lysC , pyc와 tkt의 개시코돈이 ATG로 치환될 수 있음을 확인하였다. 이와 같은 결과는 본 발명의 변이형 폴리뉴클레오티드가 다양한 코리네박테리움 속 균주에 안정적으로 도입되어 L-라이신 생산량을 증가시킬 수 있음을 뒷받침한다.

특히 아스파테이트 키나제, 트랜스케토라제 및 파이루베이트 카르복실라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 pDZ-lysC(ATG), pDZ-tkt(ATG) 및 pDZ-pyc(ATG)을 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P에 도입하여 얻은 형질전환체 KCCM11016P-lysC-pyc-tkt를 코리네박테리움 글루타미쿰 CA01-2059로 명명하고, 2011년 5월 2일자로 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(Korean Culture center of Microorganisms, 이하, "KCCM"으로 약칭함)에 수탁번호 KCCM11188P 로 기탁하였다. 즉, 상기 기탁은 부다페스트 조약 하에 국제기탁기관에 기탁된 것이다.

본 발명에 따른 미생물은 상기와 같이 야생형의 개시코돈이 각각 ATG로 치환된 것을 특징으로 하며, 이에 따라 lysC, tkt 및 pyc 유전자들로부터 전사된 각 mRNA들의 단백질로의 번역수준이 월등히 증가한 결과로써 아스파테이트 키나제, 트랜스케토라제 및 파이루베이트 카르복실라제의 효소 활성이 야생 효소의 내재적 활성보다 증강된 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 용어, "내재적 활성"은 미생물이 천연의 상태로 가지고 있는 효소의 활성상태를 의미하는 것으로, 예를 들어 코리네박테리움 속 미생물이 천연적으로 가지고 있는 아스파테이트 키나제, 트랜스케토라제 또는 파이루베이트 카르복실라제의 효소 활성을 의미한다. "내재적 활성의 증가"란 천연상태의 효소 활성과 비교하였을 때 활성이 더 향상된 것을 의미한다.

구체적으로, lysC 유전자의 개시코돈이 ATG로 치환된 균주에서 나타내는 아스파테이트 키나제 효소 활성을 모균주인 KCCM11016P와 비교해본 결과 , 2.73배 증가된 아스파테이트 키나제 활성을 나타냄을 확인하였다 (표 4). 또한, tkt 유전자의 개시코돈이 ATG로 치환된 균주에서 나타내는 트랜스케토라제 효소 활성을 모균주인 KCCM11016P와 비교해본 결과 , 3.5배 증가된 트랜스케토라제 활성을 나타냄을 확인하였다 (표 5). 또한, pyc 유전자의 개시코돈이 ATG로 치환된 균주에서 나타내는 파이루베이트 카르복실라제 활성을 모균주인 KCCM11016P와 비교해본 결과, 1.89배 증가된 파이루베이트 카르복실라제 활성을 나타냄을 확인하였다 (표 6).

아스파테이트 키나제, 트랜스케토라제, 파이루베이트 카르복실라제 또는 그의 조합의 활성을 증가시킴으로써 미생물의 L-라이신 생산성이 증가하는 결과를 보인다.

본 발명에서 구체적으로 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P-lysC, KCCM11016P-tkt, KCCM11016P-pyc, KCCM11016P-lysC-tkt, KCCM11016P-lysC-pyc, KCCM11016P-lysC-pyc-tkt에서 생산된 L-라이신 생산량을 측정한 결과, 모균주인 KCCM11016P와 비교하여 현저히 향상된 L-라이신 생산량을 나타냄을 알 수 있었다 (표 7). 마찬가지로, lysC , pyc와 tkt의 개시코돈이 ATG로 치환된, KFCC10750 (한국 등록특허 제10-0073610호), KCCM10770P (한국 등록특허 제10-0924065호), CJ3P (Genome Biology 2012, 13:R40)의 코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 또다른 라이신 생산균주에서도 모균주와 비교하여 현저히 향상된 L-라이신 생산량을 나타냄을 알 수 있었다(표 8~10). 이와 같은 결과는 염색체 상에 ATG로 변이된 개시코돈을 가지는 LysC, Tkt, Pyc를 코딩하는 변이형 폴리뉴클레오티드들을 각각 1 종류씩 보유한 미생물, LysC 및 Tkt, LysC 및 Pyc, Tkt 및 Pyc를 코딩하는 변이형 폴리뉴클레오티드들을 각각 2 종류씩 보유한 미생물, LysC, Tkt 및 Pyc를 코딩하는 변이형 폴리뉴클레오티드들을 3 종류 모두 보유한 미생물들이 야생형인 GTG 또는 TTG 개시코돈을 가지는 미생물 보다 현저히 향상된 L-라이신 생산효율을 나타냄을 뒷받침하는 것이다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 기술된 미생물을 배양하는 단계 및 배양된 미생물 또는 배양 배지로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는, L-라이신을 생산하는 방법을 제공한다.

상기 배양은 미생물을 이용하여 L-라이신을 배양하는 당업계에 널리 알려져 있는 다양한 방법이 사용될 수 있다. 상기 배양은 널리 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있고, 배양 온도, 배양 시간 및 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다. 이들 공지된 배양 방법은 문헌[Chmiel; Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991), 및 Storhas; Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)]에 상세히 기술되어 있다. 또한, 배양 방법에는 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(cintinuous culture) 및 유가식 배양(fed-batch culture)이 포함되며, 바람직하게는 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정 (fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리움 속 미생물에 대한 배양 배지는 공지되어 있다 (예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Bacteriology. Washington D.C., USA, 1981). 사용될 수 있는 당원으로는 글루코즈, 사카로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유해야 한다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양은 원하는 L-라이신의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 160 시간에서 달성된다. L-라이신은 배양 배지 중으로 배출되거나, 미생물 중에 포함되어 있을 수 있다.

또한, 본 발명의 L-라이신을 생산하는 방법에는 배양된 미생물 또는 배양 배지로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함한다. 미생물 또는 배양 배지로부터 L-라이신을 회수하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있다. 상기 L-라이신 회수 방법에는, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따르면, 아스파테이트 키나제, 트랜스케토라제, 파이루베이트 카르복실라제를 코딩하는 유전자들 각각 또는 다양한 조합을 포함하는 전체 유전자들의 개시코돈을 교체함으로써 해당 효소들의 활성이 천연 미생물의 내재적 활성보다 증가되어 L-라이신의 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물을 제공할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 실시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 실시예에서는 라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P에서 유래한 아스파테이트 키나제의 유전자 lysC, 트랜스케토라제의 유전자 tkt 및 파이루베이트 카르복실라제의 유전자 pyc의 개시코돈을 GTG 또는 TTG에서 ATG로 치환시키기 위한 재조합 벡터를 제작하였다. 상기 벡터를 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P 균주에 형질전환시켜 염색체 상의 개시코돈이 교체된 균주를 얻음으로써, 라이신 생산 효율이 증가된 균주를 제조하였다.

본 발명에서 이용하는 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰 야생주(ATCC 13032)를 모균주로 하여 인공 변이법을 통해 제작된, S- (2-아미노에틸) 시스테인 (S-(2-aminoethyl) cysteine, 이하 AEC)에 대한 내성 및 호모세린 유출(homoserine leaky)의 특징을 갖는 균주이다(KFCC10881로 공개됨. 한국 등록특허 제10-0159812호, 한국 등록특허 제10-0397322호 참고). 또한, KFCC10750 균주는 인공변이법에 의하여 제작된, 호모세린 영양요구성과 L-루이신 유사체인 4-아자루이신 및 항생제의 일종인　리팜피신에 대하여 내성을 지닌 코리네박테리움 글루타미쿰 L-라이신 생산균주이고(한국 등록특허 제10-0073610호), KCCM10770P 균주는 라이신 생합성경로 구성 유전자들 중　6종을 염색체 상에　2 copy씩 보유한, KCCM11016P 유래의 L-라이신 생산균주이며(한국 등록특허 제10-0924065호), CJ3P 균주는 Binder 등이 보고한 기술(Genome Biology 2012, 13:R40)을 바탕으로　야생주에 pyc , hom , lysC 유전자 3종에 각각 P458S, V59A, T311I 변이를 도입하여 L-라이신 생산능을 갖게된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주이다.

실시예 1 : 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 lysC 의 개시코돈이 ATG 로 교체된 재조합벡터( pDZ - lysC ( ATG )) 제작 및 개시코돈 교체 균주 제작

재조합벡터는 pDZ(참고: 한국 등록특허 제10-0924065호 참고)를 기본 벡터로 사용하였으며, 제작 과정은 다음과 같다.

(1) pDZ - lysC ( ATG ) 재조합벡터 제작

코리네박테리움 글루타미쿰 유래 lysC 유전자를 확보하기 위하여 인공변이법에 의해 제작된 라이신 생산균주(코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P)의 염색체 DNA를 주형으로 이용하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행(NIH GenBank)을 근거로 하여 lysC 유전자(NCBI 등록번호 NC_003450, Ncgl0247)의 개시코돈 부위를 포함하는 염기서열을 확보하고(서열번호 13), 이에 근거하여 개시코돈을 GTG에서 ATG로 치환하기 위한 두 쌍의 프라이머 (표 1, 서열번호 1 ~ 4)를 합성하였다.

KCCM11016P의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 하기 표 1의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltra ^TM 고-신뢰 DNA 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 변성 96℃, 30초; 어닐링 55℃, 30초; 및 중합반응 72℃, 30초의 조건으로 30회 반복하였다. 이로부터 얻어진 두 조각의 DNA 단편을 제한효소 XbaI이 처리된 pDZ 벡터에 In-Fusion PCR cloning kit(Clontech)을 이용하여 클로닝함으로써, 최종적으로 pDZ-lysC(ATG) 재조합 벡터를 제작하였다.

(2) 균주 제작

제작된 pDZ-lysC(ATG)벡터를 KCCM11016P에 전기펄스법으로 형질전환한 후(Appl. Microbiol.Biotechnol. (1999) 52:541-545에 의한 형질전환법 이용), 카나마이신 (kanamycin) 25 mg/L를 함유한 선별 배지에서 염색체상의 동 유전자와 상동성에 의해 삽입된 균주를 선별하였다. 벡터의 성공적인 염색체 삽입은 X-gal (5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드)을 포함한 고체배지에서 푸른색을 나타내는가 여부를 확인함으로써 가능하였다. 1차 염색체 삽입된 균주를 영양 배지에서 진탕배양 (30℃, 8시간)한 후, 각각 10^-4으로부터 10^-10까지 희석하여, X-gal을 포함하고 있는 고체배지에 도말하였다. 대부분의 콜로니가 푸른색을 나타내는데 반해 낮은 비율로 나타나는 백색의 콜로니를 선별함으로써, 2차 교차 (crossover)에 의해 lysC의 개시코돈 부위에 염기서열이 치환된 균주를 선별하였다. 선별된 균주의 개시코돈 염기 치환 여부는 서열번호 1과 4의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 후, 목적부위에 대한 염기서열 분석과정을 거쳐 최종 확인하였다.

프라이머	염기서열	서열번호
lysC/ATG/FX	CCGGGGATCCTCTAGActtagggagccatcttttgg	1
lysC/ATG/R	CCAGGGCCATCTTTGTGC	2
lysC/ATG/F	GCACAAAGATGGCCCTGG	3
lysC/ATG/RX	GCAGGTCGACTCTAGAAGTGACATCAACAATGCGTG	4

실시예 2 : 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 tkt 의 개시코돈이 ATG 로 교체된 재조합벡터( pDZ - tkt ( ATG )) 제작 및 개시코돈 교체 균주 제작

tkt 유전자는 서열상에 개시코돈으로 예상되는 두 개의 코돈이 존재하는데, RBS(Ribosomal binding site)와의 거리와 proteomics 결과를 바탕으로 본 발명에서는 하위에 존재하는 코돈을 개시코돈으로 결정하였다.

(1) pDZ - tkt ( ATG ) 재조합벡터 제작

코리네박테리움 글루타미쿰 유래 tkt 유전자를 확보하기 위하여 KCCM11016P의 염색체 DNA를 주형으로 이용하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행(NIH GenBank) 을 근거로 하여 tkt 유전자(NCBI 등록번호 NC_003450, Ncgl1512)의 개시코돈 부위를 포함하는 염기서열을 확보하고(서열번호 14), 이에 근거하여 개시코돈을 TTG에서 ATG로 치환하기 위한 두 쌍의 프라이머 (표 2, 서열번호 5 ~ 8)를 합성하였다.

KCCM11016P의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 하기 표 2의 프라이머를 이용하여 실시예 1-1의 조건으로 PCR을 수행하였다. 이로부터 얻어진 두 조각의 DNA 단편을 제한효소 XbaI이 처리된 pDZ 벡터에 In-Fusion PCR cloning kit(Clontech)을 이용하여 클로닝함으로써, 최종적으로 pDZ-tkt(ATG) 재조합 벡터를 제작하였다.

(2) 균주 제작

제작된 pDZ-tkt(ATG) 벡터를 실시예 1-2와 동일한 과정으로 라이신 생산균주 KCCM11016P에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체상에 tkt의 개시코돈이 ATG로 치환된 KCCM11016P-tkt을 얻었다. 유전자의 개시코돈 염기 치환 여부는 서열번호 5와 8의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 후, 목적부위에 대한 염기서열 분석을 통하여 최종 확인하였다.

프라이머	염기서열	서열번호
tkt/ATG/FX	CCG GGG ATC CTC TAG A GAA ATA GAT GGG TGT AGA CG	5
tkt/ATG/R4	GTGACAGCGTCATGGTGGTCAAT	6
tkt/ATG/F4	ATTGACCACCATGACGCTGTCAC	7
tkt/ATG/RX	GCA GGT CGA CTC TAG A CGC AGA GCC TTC AGG TCA TC	8

실시예 3 : 코리네박테리움 글루타미쿰 유래 pyc 의 개시코돈이 ATG 로 교체된 재조합벡터 ( pDZ - pyc ( ATG )) 제작 및 개시코돈 교체 균주 제작

(1) pDZ - pyc ( ATG ) 재조합벡터 제작

코리네박테리움 글루타미쿰 유래 pyc 유전자를 확보하기 위하여 KCCM11016P의 염색체 DNA를 주형으로 이용하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행(NIH GenBank) 을 근거로 하여 pyc 유전자(NCBI 등록번호 NC_003450, Ncgl0659)중 개시코돈 부위를 포함하는 염기서열을 확보하고(서열번호 15), 이에 근거하여 개시코돈을 GTG에서 ATG로 치환하기 위한 두 쌍의 프라이머 (표 3, 서열번호 9 ~ 12)를 합성하였다.

KCCM11016P의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 하기 표 3의 프라이머를 이용하여 실시예 1-1의 조건으로 PCR을 수행하였다. 이로부터 얻어진 두 조각의 DNA 단편을 제한효소 XbaI이 처리된 pDZ 벡터에 In-Fusion PCR cloning kit(Clontech)을 이용하여 클로닝함으로써, 최종적으로 pDZ-pyc(ATG)재조합 벡터를 제작하였다.

(2) 균주 제작

제작된 pDZ-pyc(ATG)벡터를 실시예 1-2와 동일한 과정으로 라이신 생산균주 KCCM11016P에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에 pyc의 개시코돈이 ATG로 치환된 KCCM11016P-pyc을 얻었다. 유전자의 개시코돈 염기 치환 여부는 서열번호 9와 12의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행함으로써, 목적부위에 대한 염기서열 분석을 통하여 최종 확인하였다.

프라이머	염기서열	서열번호
pyc/ATG/FX	CCGGGGATCCTCTAGATTTTGGGGAAAA GTGCAAAG	9
pyc/ATG/R	GAGTCGACAtTAGAGTAAT	10
pyc/ATG/F	ATTACTCTAaTGTCGACTC	11
pyc/ATG/RX	GCAGGTCGACTCTAGAGGGCATTTTCAGACAGGAAG	12

실시예 4 : lysC 유전자의 개시코돈이 ATG 로 치환된 균주에서 아스파테이트 키나제 효소 활성 측정

*대수기의 균체를 원심분리(5,000 rpm, 15분)를 통하여 수거, 0.1% Tris.HCl (pH8.0) 완충용액으로 3회 세척한 후, 동 완충용액으로 610 nm의 탁도가 160 가량이 되도록 현탁하였다. 현탁액 1.5 ml당 1.25 g의 glass bead를 첨가한 후, bead beater를 이용, 6분간 균체를 파쇄하였다. 원심분리 (15,000 rpm, 20분)를 통하여 상층액을 수거, 브레드포드 방법(Bradford, M.M 1976. Anal. Biochem. 72:248-254)에 의해 단백질 농도를 정량한 후, 아스파테이트 키나제(LysC) 효소 활성 측정을 위한 조단백질 용액으로 사용하였다. LysC 효소활성의 측정은 0.1 M Tris.HCl(pH8.0), 0.01 M 염화마그네슘(MgCl₂), 0.6 M 하이드록시라민.염산(Hydroxylamine.HCl) (pH7.0), 4 mM ATP, 0.2 M 아스파테이트(Aspartate)를 포함하고 있는 반응액에 0.05 ml의 조단백질 용액을 첨가함으로써 반응을 개시하였다. 30℃에서 30분간 반응 후, Stop 용액 (10% FeCl₂, 3.3% TCA, 0.7N HCl)을 첨가하여, 반응을 종료하였으며, 원심분리를 통해 상층액을 수거하여, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. LysC 효소 활성 단위 (U)는 1분간 1 mg의 단백질이 생성한 아스파테이트 하이드록사메이트 nmole로 정의하였다.

KCCM11016P-lysC 균주가 나타내는 LysC 활성을 모균주인 KCCM11016P와 비교해본 결과, 2.73배 증가된 LysC 활성을 나타냄을 확인하였다 (표 4).

LysC 효소 활성

균주	효소 활성(Fold)
	LysC
KCCM11016P	1.00
KCCM11016P-lysC	2.73

실시예 5 : tkt 유전자의 개시코돈이 ATG 로 치환된 균주에서 트랜스케토라제 효소 활성 측정

대수기의 균체를 원심분리(5,000 rpm, 15분)를 통하여 수거, 0.1% Tris.HCl (pH7.5) 완충용액으로 3회 세척한 후, 동 완충용액으로 610 nm의 탁도가 160 가량이 되도록 현탁하였다. 현탁액 1.5 ml당 1.25 g의 glass bead를 첨가한 후, bead beater를 이용, 6분간 균체를 파쇄하였다. 원심분리(15,000 rpm, 20분)를 통하여 상층액을 수거, 브레드포드 방법에 의해 단백질 농도를 정량한 후, 트랜스케토라제(Tkt) 효소 활성 측정을 위한 조단백질 용액으로 사용하였다. Tkt 효소활성의 측정은 1 ml 당 0.1 M Tris.HCl(pH7.5), 10 mM D-R5P, 2 mM D-Xu5P, 10 μM ThDP, 1.2 mM MgCl₂, 100 μM NADH, 1 unit 트라이스포스페이트 아이소머레이즈(triosephosphate isomerase), 1 unit 글리세롤-3-포스페이트 디하이드로제네이즈(glycerol-3-phosphate dehydrogenase)를 포함하고 있는 반응액에 조단백질 용액을 첨가함으로써 반응을 개시하였다. 30℃에서 20~30분간 반응 진행하면서 340 nm에서 흡광도를 측정하였다. Tkt 효소 활성 단위 (U)는 1분간 1 μmol의 글리세르알데하이드 3-포스페이트(glyceraldehyde 3-phosphate) 형성을 촉진시키는 효소의 양(mg)으로 특이적 활성도(specific activity)는 units/mg으로 정의하였다(Biochem.J. (2004)382, 759-767).

KCCM11016P-tkt 균주가 나타내는 Tkt 활성을 모균주인 KCCM11016P와 비교해본 결과, 3.5배 증가된 Tkt 활성을 나타냄을 확인하였다 (표 5).

Tkt 효소 활성

균주	효소 활성(Fold)
	Tkt
KCCM11016P	1.00
KCCM11016P-tkt	3.5

실시예 6: pyc 유전자의 개시코돈이 ATG 로 치환된 균주에서 파이루베이트 카르복실라제 효소 활성 측정

대수기의 균체를 원심분리(5,000 rpm, 15분)를 통하여 수거, 50mM 염화나트륨(NaCl)이 포함된 50mM Tris.HCl (pH6.3) 완충용액으로 2회 세척한 후, 20% 글리세롤(glycerol)이 포함된 100mM HEPES(pH7.5) 완충용액으로 현탁하였다. 현탁액에 CTAB를 0.3%가 되도록 첨가한 후 얼음에서 1분간 방치하였다. 균체를 원심분리(5,000rpm, 10분)를 통하여 수거한 후 100mM Tris.HCl(pH7.3) 완충용액에 현탁 하였다. 브레드포드 방법에 의해 단백질 농도를 정량한 후, 파이루베이트 카르복실라제(Pyc) 효소 활성 측정을 위한 조단백질 용액으로 사용하였다. Pyc 효소 활성의 측정은 25 mM NaHCO₃, 5 mM MgCl₂, 3 mM 피루베이트(pyruvate), 4 mM ATP를 포함하고 있는 반응액에 조단백질을 첨가함으로써 반응을 개시하였다. 30℃에서 1.5분간 반응 후, 80 μl의 Stop 용액 (30% ο-phophoric acid)을 첨가, 반응을 종료하였으며, 원심분리(12,000 rpm, 15 min, 4℃)를 통해 상층액을 수거하였다. 1 ml 당 50μl 상층액, 150 mM Tris.HCl(pH7.8), 150 μM NADH, 2.5U 락테이트 디하이드로제네이즈(lactate dehyrogenase)를 첨가한 후, 37℃, 340 nm에서 흡광도를 측정하였다. Pyc 효소 활성 단위 (U)는 1분간 1 mg의 단백질이 생성한 락테이트 nmole로 정의하였다.

KCCM11016P-pyc 균주가 나타내는 Pyc 활성을 모균주인 KCCM11016P와 비교해본 결과, 1.89배 증가된 Pyc 활성을 나타냄을 확인하였다 (표 6).

Pyc 효소 활성

균주	효소 활성(Fold)
	Pyc
KCCM11016P	1.00
KCCM11016P-pyc	1.89

실시예 7: KCCM11016P 유래 lysC , tkt , pyc 유전자 중 조합에 의해 두 개 이상의 유전자의 개시코돈이 ATG 로 교체된 균주 개 발

재조합 벡터는 상기 실시예 1, 2, 3에서 제작된 pDZ-lysC(ATG) pDZ-tkt(ATG) pDZ-pyc(ATG)를 사용하였으며, 제작과정은 다음과 같다.

pDZ-tkt(ATG)벡터를 실시예 1에서 제작된 lysC의 개시코돈이 GTG에서 ATG로 교체된 KCCM11016P-lysC에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에 lysC와 tkt의 개시코돈이 ATG로 KCCM11016P-lysC-tkt를 얻었다. 유전자의 개시코돈 염기 치환 여부는 서열번호 5와 8의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 후, 목적부위에 대한 염기서열 분석을 통하여 최종 확인하였다.

실시예 1과 동일한 과정으로 pDZ-pyc(ATG)벡터를 실시예 1에서 제작된 lysC의 개시코돈이 GTG에서 ATG로 교체된 KCCM11016P-lysC에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에 lysC와 pyc의 개시코돈이 ATG로 치환된 KCCM11016P lysC-pyc를 얻었다. 유전자의 개시코돈 염기 치환 여부는 서열번호 9와 12의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 후, 목적부위에 대한 염기서열 분석을 통하여 최종 확인하였다.

pDZ-tkt(ATG)벡터를 본 실시예에서 제작된 lysC와 pyc의 개시코돈이 GTG에서 ATG로 교체된 KCCM11016P-lysC-pyc에 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에 lysC , pyc와 tkt의 개시코돈이 ATG로 치환된 KCCM11016P-lysC-pyc-tkt를 얻었다. 유전자의 개시코돈 염기 치환 여부는 서열번호 5와 8의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행한 후, 목적부위에 대한 염기서열 분석을 통하여 최종 확인하였다.

상기 유전자의 조합은 예시적으로 실시하기 위한 것으로 유전자 조합의 범위가 이들에 한정되는 것은 아니다.

실시예 8: 개시코돈 ATG 교체 균주에서의 라이신 생산

실시예 1, 2, 3, 7에서 최종적으로 제작된 KCCM11016P-lysC, KCCM11016P-tkt, KCCM11016P-pyc, KCCM11016P-lysC-tkt, KCCM11016P-lysC-pyc, KCCM11016P-lysC-pyc-tkt를 L-라이신 생산을 위해 아래와 같은 방법으로 배양하였다.

하기의 종 배지 25 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 모균주 KCCM11016P와 KCCM11016P-lysC, KCCM11016P-tkt, KCCM11016P-pyc, KCCM11016P-lysC-tkt, KCCM11016P-lysC-pyc, KCCM11016P-lysC-pyc-tkt를 접종하고 30℃에서 20 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 하기의 생산 배지 24 ml를 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 120 시간 동안 (200 rpm)으로 진탕 배양하였다.

배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 L-라이신의 생산량을 측정하였다. KCCM11016P와 KCCM11016P-lysC, KCCM11016P-tkt, KCCM11016P-pyc, KCCM11016P-lysC-tkt, KCCM11016P-lysC-pyc, KCCM11016P-lysC-pyc-tkt에 대한 배양액 중의 L-라이신 대한 결과는 아래 표 7과 같았다.

균주	라이신(g/l)
	뱃치 1	뱃치 2	뱃치 3
KCCM11016P	45.2	44.7	45.6
KCCM11016P-lysC	47.5	46.2	47.9
KCCM11016P-tkt	47.4	48.5	47.0
KCCM11016P-pyc	47.9	46.3	47.8
KCCM11016P-lysC-tkt	49.7	49.3	49.2
KCCM11016P-lysC-pyc	50.1	48.9	49.6
KCCM11016P -lysC-pyc-tkt	50.7	50.2	51.1

종배지 ( pH 7.0)

원당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH₂PO₄ 4 g, K₂HPO₄ 8 g, MgSO₄ 7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아마이드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)

생산배지 ( pH 7.0)

포도당 100 g, (NH₄)₂SO₄ 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분 (Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH₂PO₄ 1 g, MgSO₄ 7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아마이드 3000 ㎍, CaCO₃ 30 g (증류수 1리터 기준)

상기의 표 7에서 나타낸 바와 같이, 개시코돈이 ATG로 교체된 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11016P-lysC, KCCM11016P-tkt, KCCM11016P-pyc, KCCM11016P-lysC-tkt, KCCM11016P-lysC-pyc는 모균주인 KCCM11016P에 비하여 L-라이신 생산이 4~9%가 증가함을 확인하였고, 특히, 3종의 형질이 모두 도입된 KCCM11016P-lysC-pyc-tkt의 경우, 모균주 KCCM11016P에 비하여 L-라이신이 생산이 무려 12%나 증가되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 9: lysC , tkt , pyc 유전자 개시코돈이 ATG 로 교체된 KFCC10750 유래 균주 개발 및 라이신 생산능 비교

코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 다른 라이신 생산 균주들에서도 lysC , pyc, tkt 유전자 개시코돈을 ATG로 교체 시 라이신 생산능 증가 효과가 있는지를 확인하기 위하여 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10750(대한민국 등록특허 제10-0073610호)에 상기 실시예 8에서 가장 우수한 라이신 생산능 증가 효과가 있었던 3종의 형질을 모두 도입한 재조합 균주를 제작하였고, KFCC10750-lysC-pyc-tkt라고 명명하였다. 실시예 8과 동일한 방법으로 배양하여, 이로부터 L-라이신 농도를 분석하였다(표 8).

균주	라이신(g/l)
	뱃치 1	뱃치 2	뱃치 3
KFCC10750	38.3	38	38.5
KFCC10750-lysC-pyc-tkt	44.1	43.8	44.5

상기의 표 8에서 나타낸 바와 같이, 3종의 형질이 모두 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10750-lysC-pyc-tkt는 모균주 KFCC10750에 비하여 라이신 생산이 15% 증가되었다.

실시예 10: lysC , tkt , pyc 유전자 개시코돈이 ATG 로 교체된 KCCM10770P 유래 균주 개발 및 라이신 생산능 비교

또 다른 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P(대한민국 등록특허 제10-0924065호)에 상기 실시예 8에서 가장 우수한 라이신 생산능 증가 효과가 있었던 3종의 형질을 모두 도입한 재조합 균주를 제작하고, KCCM10770P-lysC-pyc-tkt라고 명명하였다. 실시예 8과 동일한 방법으로 배양하여, 이로부터 L-라이신 농도를 분석하였다(표 9).

균주	라이신(g/l)
	뱃치 1	뱃치 2	뱃치 3
KCCM10770P	47.8	47.2	47.5
KCCM10770P-lysC-pyc-tkt	52.8	52.8	52.4

상기의 표 9에서 나타낸 바와 같이, 3종의 형질이 모두 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10770P-lysC-pyc-tkt는 모균주 KCCM10770P 에 비하여 라이신 생산이 11% 증가되었다.

실시예 11: CJ3P 유래 lysC , tkt , pyc 유전자 개시코돈이 ATG 로 교체된 균주 개발 및 라이신 생산능 비교

또 다른 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P(Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40)에 상기 실시예 8에서 가장 우수한 라이신 생산능 증가 효과가 있었던 3종의 형질을 모두 도입한 재조합 균주를 제작하고, CJ3P -lysC-pyc-tkt라고 명명하였다. 실시예 8과 동일한 방법으로 배양하여, 이로부터 L-라이신 농도를 분석하였다(표 10).

균주	라이신(g/l)
	뱃치 1	뱃치 2	뱃치 3
CJ3P	8.3	8	8.4
CJ3P-lysC-pyc-tkt	9.7	9.6	10.0

상기의 표 10에서 나타낸 바와 같이, 3종의 형질이 모두 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P-lysC-pyc-tkt는 모균주 CJ3P 에 비하여 라이신 생산이 18% 이상 증가되었다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11188P

20110502

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11016P

19951218

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Method of producing L-lysine using microorganism having ability to produce L-lysine <130> PA121190-KR-D2 <150> KR10-2011-0139527 <151> 2011-12-21 <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer lysC/ATG/FX <400> 1 ccggggatcc tctagactta gggagccatc ttttgg 36 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer lysC/ATG/R <400> 2 ccagggccat ctttgtgc 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer lysC/ATG/F <400> 3 gcacaaagat ggccctgg 18 <210> 4 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer lysC/ATG/RX <400> 4 gcaggtcgac tctagaagtg acatcaacaa tgcgtg 36 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer tkt/ATG/FX <400> 5 ccggggatcc tctagagaaa tagatgggtg tagacg 36 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer tkt/ATG/R4 <400> 6 gtgacagcgt catggtggtc aat 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer tkt/ATG/F4 <400> 7 attgaccacc atgacgctgt cac 23 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer tkt/ATG/RX <400> 8 gcaggtcgac tctagacgca gagccttcag gtcatc 36 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pyc/ATG/FX <400> 9 ccggggatcc tctagatttt ggggaaaagt gcaaag 36 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pyc/ATG/R <400> 10 gagtcgacat tagagtaat 19 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pyc/ATG/F <400> 11 attactctaa tgtcgactc 19 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer pyc/ATG/RX <400> 12 gcaggtcgac tctagagggc attttcagac aggaag 36 <210> 13 <211> 1266 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum lysC <400> 13 gtggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 60 aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc 120 tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 180 ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 240 gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct 300 ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt 360 gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat 420 aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 480 ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 540 accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa 600 atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 660 cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 720 attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 780 gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg 840 aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc 900 tcttctgtag aagacggcac caccgacatc accttcacct gccctcgttc cgacggccgc 960 cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1020 gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt 1080 accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaatt gatttccacc 1140 tctgagattc gtatttccgt gctgatccgt gaagatgatc tggatgctgc tgcacgtgca 1200 ttgcatgagc agttccagct gggcggcgaa gacgaagccg tcgtttatgc aggcaccgga 1260 cgctaa 1266 <210> 14 <211> 2094 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum tkt <400> 14 ttgacgctgt cacctgaact tcaggcgctc actgtacgca attacccctc tgattggtcc 60 gatgtggaca ccaaggctgt agacactgtt cgtgtcctcg ctgcagacgc tgtagaaaac 120 tgtggctccg gccacccagg caccgcaatg agcctggctc cccttgcata caccttgtac 180 cagcgggtta tgaacgtaga tccacaggac accaactggg caggccgtga ccgcttcgtt 240 ctttcttgtg gccactcctc tttgacccag tacatccagc tttacttggg tggattcggc 300 cttgagatgg atgacctgaa ggctctgcgc acctgggatt ccttgacccc aggacaccct 360 gagtaccgcc acaccaaggg cgttgagatc accactggcc ctcttggcca gggtcttgca 420 tctgcagttg gtatggccat ggctgctcgt cgtgagcgtg gcctattcga cccaaccgct 480 gctgagggcg aatccccatt cgaccaccac atctacgtca ttgcttctga tggtgacctg 540 caggaaggtg tcacctctga ggcatcctcc atcgctggca cccagcagct gggcaacctc 600 atcgtgttct gggatgacaa ccgcatctcc atcgaagaca acactgagat cgctttcaac 660 gaggacgttg ttgctcgtta caaggcttac ggctggcaga ccattgaggt tgaggctggc 720 gaggacgttg cagcaatcga agctgcagtg gctgaggcta agaaggacac caagcgacct 780 accttcatcc gcgttcgcac catcatcggc ttcccagctc caactatgat gaacaccggt 840 gctgtgcacg gtgctgctct tggcgcagct gaggttgcag caaccaagac tgagcttgga 900 ttcgatcctg aggctcactt cgcgatcgac gatgaggtta tcgctcacac ccgctccctc 960 gcagagcgcg ctgcacagaa gaaggctgca tggcaggtca agttcgatga gtgggcagct 1020 gccaaccctg agaacaaggc tctgttcgat cgcctgaact cccgtgagct tccagcgggc 1080 tacgctgacg agctcccaac atgggatgca gatgagaagg gcgtcgcaac tcgtaaggct 1140 tccgaggctg cacttcaggc actgggcaag acccttcctg agctgtgggg cggttccgct 1200 gacctcgcag gttccaacaa caccgtgatc aagggctccc cttccttcgg ccctgagtcc 1260 atctccaccg agacctggtc tgctgagcct tacggccgta acctgcactt cggtatccgt 1320 gagcacgcta tgggatccat cctcaacggc atttccctcc acggtggcac ccgcccatac 1380 ggcggaacct tcctcatctt ctccgactac atgcgtcctg cagttcgtct tgcagctctc 1440 atggagaccg acgcttacta cgtctggacc cacgactcca tcggtctggg cgaagatggc 1500 ccaacccacc agcctgttga aaccttggct gcactgcgcg ccatcccagg tctgtccgtc 1560 ctgcgtcctg cagatgcgaa cgagaccgcc caggcttggg ctgcagcact tgagtacaag 1620 gaaggcccta agggtcttgc actgacccgc cagaacgttc ctgttctgga aggcaccaag 1680 gagaaggctg ctgaaggcgt tcgccgcggt ggctacgtcc tggttgaggg ttccaaggaa 1740 accccagatg tgatcctcat gggctccggc tccgaggttc agcttgcagt taacgctgcg 1800 aaggctctgg aagctgaggg cgttgcagct cgcgttgttt ccgttccttg catggattgg 1860 ttccaggagc aggacgcaga gtacatcgag tccgttctgc ctgcagctgt gaccgctcgt 1920 gtgtctgttg aagctggcat cgcaatgcct tggtaccgct tcttgggcac ccagggccgt 1980 gctgtctccc ttgagcactt cggtgcttct gcggattacc agaccctgtt tgagaagttc 2040 ggcatcacca ccgatgcagt cgtggcagcg gccaaggact ccattaacgg ttaa 2094 <210> 15 <211> 3423 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum pyc <400> 15 gtgtcgactc acacatcttc aacgcttcca gcattcaaaa agatcttggt agcaaaccgc 60 ggcgaaatcg cggtccgtgc tttccgtgca gcactcgaaa ccggtgcagc cacggtagct 120 atttaccccc gtgaagatcg gggatcattc caccgctctt ttgcttctga agctgtccgc 180 attggtaccg aaggctcacc agtcaaggcg tacctggaca tcgatgaaat tatcggtgca 240 gctaaaaaag ttaaagcaga tgccatttac ccgggatacg gcttcctgtc tgaaaatgcc 300 cagcttgccc gcgagtgtgc ggaaaacggc attactttta ttggcccaac cccagaggtt 360 cttgatctca ccggtgataa gtctcgcgcg gtaaccgccg cgaagaaggc tggtctgcca 420 gttttggcgg aatccacccc gagcaaaaac atcgatgaga tcgttaaaag cgctgaaggc 480 cagacttacc ccatctttgt gaaggcagtt gccggtggtg gcggacgcgg tatgcgtttt 540 gttgcttcac ctgatgagct tcgcaaatta gcaacagaag catctcgtga agctgaagcg 600 gctttcggcg atggcgcggt atatgtcgaa cgtgctgtga ttaaccctca gcatattgaa 660 gtgcagatcc ttggcgatca cactggagaa gttgtacacc tttatgaacg tgactgctca 720 ctgcagcgtc gtcaccaaaa agttgtcgaa attgcgccag cacagcattt ggatccagaa 780 ctgcgtgatc gcatttgtgc ggatgcagta aagttctgcc gctccattgg ttaccagggc 840 gcgggaaccg tggaattctt ggtcgatgaa aagggcaacc acgtcttcat cgaaatgaac 900 ccacgtatcc aggttgagca caccgtgact gaagaagtca ccgaggtgga cctggtgaag 960 gcgcagatgc gcttggctgc tggtgcaacc ttgaaggaat tgggtctgac ccaagataag 1020 atcaagaccc acggtgcagc actgcagtgc cgcatcacca cggaagatcc aaacaacggc 1080 ttccgcccag ataccggaac tatcaccgcg taccgctcac caggcggagc tggcgttcgt 1140 cttgacggtg cagctcagct cggtggcgaa atcaccgcac actttgactc catgctggtg 1200 aaaatgacct gccgtggttc cgactttgaa actgctgttg ctcgtgcaca gcgcgcgttg 1260 gctgagttca ccgtgtctgg tgttgcaacc aacattggtt tcttgcgtgc gttgctgcgg 1320 gaagaggact tcacttccaa gcgcatcgcc accggattca ttgccgatca cccgcacctc 1380 cttcaggctc cacctgctga tgatgagcag ggacgcatcc tggattactt ggcagatgtc 1440 accgtgaaca agcctcatgg tgtgcgtcca aaggatgttg cagctcctat cgataagctg 1500 cctaacatca aggatctgcc actgccacgc ggttcccgtg accgcctgaa gcagcttggc 1560 ccagccgcgt ttgctcgtga tctccgtgag caggacgcac tggcagttac tgataccacc 1620 ttccgcgatg cacaccagtc tttgcttgcg acccgagtcc gctcattcgc actgaagcct 1680 gcggcagagg ccgtcgcaaa gctgactcct gagcttttgt ccgtggaggc ctggggcggc 1740 gcgacctacg atgtggcgat gcgtttcctc tttgaggatc cgtgggacag gctcgacgag 1800 ctgcgcgagg cgatgccgaa tgtaaacatt cagatgctgc ttcgcggccg caacaccgtg 1860 ggatacaccc cgtacccaga ctccgtctgc cgcgcgtttg ttaaggaagc tgccagctcc 1920 ggcgtggaca tcttccgcat cttcgacgcg cttaacgacg tctcccagat gcgtccagca 1980 atcgacgcag tcctggagac caacaccgcg gtagccgagg tggctatggc ttattctggt 2040 gatctctctg atccaaatga aaagctctac accctggatt actacctaaa gatggcagag 2100 gagatcgtca agtctggcgc tcacatcttg gccattaagg atatggctgg tctgcttcgc 2160 ccagctgcgg taaccaagct ggtcaccgca ctgcgccgtg aattcgatct gccagtgcac 2220 gtgcacaccc acgacactgc gggtggccag ctggcaacct actttgctgc agctcaagct 2280 ggtgcagatg ctgttgacgg tgcttccgca ccactgtctg gcaccacctc ccagccatcc 2340 ctgtctgcca ttgttgctgc attcgcgcac acccgtcgcg ataccggttt gagcctcgag 2400 gctgtttctg acctcgagcc gtactgggaa gcagtgcgcg gactgtacct gccatttgag 2460 tctggaaccc caggcccaac cggtcgcgtc taccgccacg aaatcccagg cggacagttg 2520 tccaacctgc gtgcacaggc caccgcactg ggccttgcgg atcgtttcga actcatcgaa 2580 gacaactacg cagccgttaa tgagatgctg ggacgcccaa ccaaggtcac cccatcctcc 2640 aaggttgttg gcgacctcgc actccacctc gttggtgcgg gtgtggatcc agcagacttt 2700 gctgccgatc cacaaaagta cgacatccca gactctgtca tcgcgttcct gcgcggcgag 2760 cttggtaacc ctccaggtgg ctggccagag ccactgcgca cccgcgcact ggaaggccgc 2820 tccgaaggca aggcacctct gacggaagtt cctgaggaag agcaggcgca cctcgacgct 2880 gatgattcca aggaacgtcg caatagcctc aaccgcctgc tgttcccgaa gccaaccgaa 2940 gagttcctcg agcaccgtcg ccgcttcggc aacacctctg cgctggatga tcgtgaattc 3000 ttctacggcc tggtcgaagg ccgcgagact ttgatccgcc tgccagatgt gcgcacccca 3060 ctgcttgttc gcctggatgc gatctctgag ccagacgata agggtatgcg caatgttgtg 3120 gccaacgtca acggccagat ccgcccaatg cgtgtgcgtg accgctccgt tgagtctgtc 3180 accgcaaccg cagaaaaggc agattcctcc aacaagggcc atgttgctgc accattcgct 3240 ggtgttgtca ccgtgactgt tgctgaaggt gatgaggtca aggctggaga tgcagtcgca 3300 atcatcgagg ctatgaagat ggaagcaaca atcactgctt ctgttgacgg caaaatcgat 3360 cgcgttgtgg ttcctgctgc aacgaaggtg gaaggtggcg acttgatcgt cgtcgtttcc 3420 taa 3423 <210> 16 <211> 1266 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lysC with substituted start codon <400> 16 atggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 60 aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc 120 tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 180 ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 240 gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct 300 ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt 360 gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat 420 aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 480 ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 540 accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa 600 atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 660 cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 720 attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 780 gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg 840 aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc 900 tcttctgtag aagacggcac caccgacatc accttcacct gccctcgttc cgacggccgc 960 cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1020 gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt 1080 accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaatt gatttccacc 1140 tctgagattc gtatttccgt gctgatccgt gaagatgatc tggatgctgc tgcacgtgca 1200 ttgcatgagc agttccagct gggcggcgaa gacgaagccg tcgtttatgc aggcaccgga 1260 cgctaa 1266 <210> 17 <211> 2094 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tkt with substituted start codon <400> 17 atgacgctgt cacctgaact tcaggcgctc actgtacgca attacccctc tgattggtcc 60 gatgtggaca ccaaggctgt agacactgtt cgtgtcctcg ctgcagacgc tgtagaaaac 120 tgtggctccg gccacccagg caccgcaatg agcctggctc cccttgcata caccttgtac 180 cagcgggtta tgaacgtaga tccacaggac accaactggg caggccgtga ccgcttcgtt 240 ctttcttgtg gccactcctc tttgacccag tacatccagc tttacttggg tggattcggc 300 cttgagatgg atgacctgaa ggctctgcgc acctgggatt ccttgacccc aggacaccct 360 gagtaccgcc acaccaaggg cgttgagatc accactggcc ctcttggcca gggtcttgca 420 tctgcagttg gtatggccat ggctgctcgt cgtgagcgtg gcctattcga cccaaccgct 480 gctgagggcg aatccccatt cgaccaccac atctacgtca ttgcttctga tggtgacctg 540 caggaaggtg tcacctctga ggcatcctcc atcgctggca cccagcagct gggcaacctc 600 atcgtgttct gggatgacaa ccgcatctcc atcgaagaca acactgagat cgctttcaac 660 gaggacgttg ttgctcgtta caaggcttac ggctggcaga ccattgaggt tgaggctggc 720 gaggacgttg cagcaatcga agctgcagtg gctgaggcta agaaggacac caagcgacct 780 accttcatcc gcgttcgcac catcatcggc ttcccagctc caactatgat gaacaccggt 840 gctgtgcacg gtgctgctct tggcgcagct gaggttgcag caaccaagac tgagcttgga 900 ttcgatcctg aggctcactt cgcgatcgac gatgaggtta tcgctcacac ccgctccctc 960 gcagagcgcg ctgcacagaa gaaggctgca tggcaggtca agttcgatga gtgggcagct 1020 gccaaccctg agaacaaggc tctgttcgat cgcctgaact cccgtgagct tccagcgggc 1080 tacgctgacg agctcccaac atgggatgca gatgagaagg gcgtcgcaac tcgtaaggct 1140 tccgaggctg cacttcaggc actgggcaag acccttcctg agctgtgggg cggttccgct 1200 gacctcgcag gttccaacaa caccgtgatc aagggctccc cttccttcgg ccctgagtcc 1260 atctccaccg agacctggtc tgctgagcct tacggccgta acctgcactt cggtatccgt 1320 gagcacgcta tgggatccat cctcaacggc atttccctcc acggtggcac ccgcccatac 1380 ggcggaacct tcctcatctt ctccgactac atgcgtcctg cagttcgtct tgcagctctc 1440 atggagaccg acgcttacta cgtctggacc cacgactcca tcggtctggg cgaagatggc 1500 ccaacccacc agcctgttga aaccttggct gcactgcgcg ccatcccagg tctgtccgtc 1560 ctgcgtcctg cagatgcgaa cgagaccgcc caggcttggg ctgcagcact tgagtacaag 1620 gaaggcccta agggtcttgc actgacccgc cagaacgttc ctgttctgga aggcaccaag 1680 gagaaggctg ctgaaggcgt tcgccgcggt ggctacgtcc tggttgaggg ttccaaggaa 1740 accccagatg tgatcctcat gggctccggc tccgaggttc agcttgcagt taacgctgcg 1800 aaggctctgg aagctgaggg cgttgcagct cgcgttgttt ccgttccttg catggattgg 1860 ttccaggagc aggacgcaga gtacatcgag tccgttctgc ctgcagctgt gaccgctcgt 1920 gtgtctgttg aagctggcat cgcaatgcct tggtaccgct tcttgggcac ccagggccgt 1980 gctgtctccc ttgagcactt cggtgcttct gcggattacc agaccctgtt tgagaagttc 2040 ggcatcacca ccgatgcagt cgtggcagcg gccaaggact ccattaacgg ttaa 2094 <210> 18 <211> 3423 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pyc with substituted start codon <400> 18 atgtcgactc acacatcttc aacgcttcca gcattcaaaa agatcttggt agcaaaccgc 60 ggcgaaatcg cggtccgtgc tttccgtgca gcactcgaaa ccggtgcagc cacggtagct 120 atttaccccc gtgaagatcg gggatcattc caccgctctt ttgcttctga agctgtccgc 180 attggtaccg aaggctcacc agtcaaggcg tacctggaca tcgatgaaat tatcggtgca 240 gctaaaaaag ttaaagcaga tgccatttac ccgggatacg gcttcctgtc tgaaaatgcc 300 cagcttgccc gcgagtgtgc ggaaaacggc attactttta ttggcccaac cccagaggtt 360 cttgatctca ccggtgataa gtctcgcgcg gtaaccgccg cgaagaaggc tggtctgcca 420 gttttggcgg aatccacccc gagcaaaaac atcgatgaga tcgttaaaag cgctgaaggc 480 cagacttacc ccatctttgt gaaggcagtt gccggtggtg gcggacgcgg tatgcgtttt 540 gttgcttcac ctgatgagct tcgcaaatta gcaacagaag catctcgtga agctgaagcg 600 gctttcggcg atggcgcggt 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aaggatgttg cagctcctat cgataagctg 1500 cctaacatca aggatctgcc actgccacgc ggttcccgtg accgcctgaa gcagcttggc 1560 ccagccgcgt ttgctcgtga tctccgtgag caggacgcac tggcagttac tgataccacc 1620 ttccgcgatg cacaccagtc tttgcttgcg acccgagtcc gctcattcgc actgaagcct 1680 gcggcagagg ccgtcgcaaa gctgactcct gagcttttgt ccgtggaggc ctggggcggc 1740 gcgacctacg atgtggcgat gcgtttcctc tttgaggatc cgtgggacag gctcgacgag 1800 ctgcgcgagg cgatgccgaa tgtaaacatt cagatgctgc ttcgcggccg caacaccgtg 1860 ggatacaccc cgtacccaga ctccgtctgc cgcgcgtttg ttaaggaagc tgccagctcc 1920 ggcgtggaca tcttccgcat cttcgacgcg cttaacgacg tctcccagat gcgtccagca 1980 atcgacgcag tcctggagac caacaccgcg gtagccgagg tggctatggc ttattctggt 2040 gatctctctg atccaaatga aaagctctac accctggatt actacctaaa gatggcagag 2100 gagatcgtca agtctggcgc tcacatcttg gccattaagg atatggctgg tctgcttcgc 2160 ccagctgcgg taaccaagct ggtcaccgca ctgcgccgtg aattcgatct gccagtgcac 2220 gtgcacaccc acgacactgc gggtggccag ctggcaacct actttgctgc agctcaagct 2280 ggtgcagatg ctgttgacgg tgcttccgca ccactgtctg gcaccacctc ccagccatcc 2340 ctgtctgcca ttgttgctgc attcgcgcac acccgtcgcg ataccggttt gagcctcgag 2400 gctgtttctg acctcgagcc gtactgggaa gcagtgcgcg gactgtacct gccatttgag 2460 tctggaaccc caggcccaac cggtcgcgtc taccgccacg aaatcccagg cggacagttg 2520 tccaacctgc gtgcacaggc caccgcactg ggccttgcgg atcgtttcga actcatcgaa 2580 gacaactacg cagccgttaa tgagatgctg ggacgcccaa ccaaggtcac cccatcctcc 2640 aaggttgttg gcgacctcgc actccacctc gttggtgcgg gtgtggatcc agcagacttt 2700 gctgccgatc cacaaaagta cgacatccca gactctgtca tcgcgttcct gcgcggcgag 2760 cttggtaacc ctccaggtgg ctggccagag ccactgcgca cccgcgcact ggaaggccgc 2820 tccgaaggca aggcacctct gacggaagtt cctgaggaag agcaggcgca cctcgacgct 2880 gatgattcca aggaacgtcg caatagcctc aaccgcctgc tgttcccgaa gccaaccgaa 2940 gagttcctcg agcaccgtcg ccgcttcggc aacacctctg cgctggatga tcgtgaattc 3000 ttctacggcc tggtcgaagg ccgcgagact ttgatccgcc tgccagatgt gcgcacccca 3060 ctgcttgttc gcctggatgc gatctctgag ccagacgata agggtatgcg caatgttgtg 3120 gccaacgtca acggccagat ccgcccaatg cgtgtgcgtg accgctccgt tgagtctgtc 3180 accgcaaccg cagaaaaggc agattcctcc aacaagggcc atgttgctgc accattcgct 3240 ggtgttgtca ccgtgactgt tgctgaaggt gatgaggtca aggctggaga tgcagtcgca 3300 atcatcgagg ctatgaagat ggaagcaaca atcactgctt ctgttgacgg caaaatcgat 3360 cgcgttgtgg ttcctgctgc aacgaaggtg gaaggtggcg acttgatcgt cgtcgtttcc 3420 taa 3423

Claims

파이루베이트 카르복실라제(Pyc)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 개시코돈을 ATG로 치환한 변이형 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 상기 변이형 폴리뉴클레오티드는 서열번호 18의 염기서열로 표시되는 변이형 폴리뉴클레오티드.
ATG로 치환된 개시코돈을 가지는, 파이루베이트 카르복실라제의 효소를 코딩하는 변이형 폴리뉴클레오티드를 포함함으로써, 상기 효소의 활성이 내재적 활성보다 증가된 미생물.
제3항에 있어서, 상기 미생물은 파이루베이트 카르복실라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 개시코돈을 ATG로 치환한 변이형 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환된 미생물.
제3항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 속 미생물인 미생물.
제5항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인 미생물.
제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 배양하는 단계; 및 상기 배양된 미생물 또는 배양 배지로부터 L-라이신을 회수하는 단계를 포함하는, L-라이신을 생산하는 방법.