KR20080113225A - β-리신의 생산 방법 - Google Patents
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Abstract
탈조절된 리신-2,3-아미노뮤타제 유전자, 및 (i) 아스파르토키나제, 아스파테이트세미알데히드 데하이드로게나제, 디하이드로디피콜리네이트 신타제, 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제, 테트라하이드로디피콜리네이트 숙시닐라제, 숙시닐-아미노-케토피멜레이트 트랜스아미나제, 숙시닐-디아미노-피멜레이트 데숙시닐라제, 디아미노-피멜레이트 에피머라제, 디아미노피멜레이트 데하이드로게나제, 아르기닐-tRNA 신테타제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제, 피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 6-포스포글루코노락토나제, 프럭토스 1,6-비포스파타제, 호모세린 데하이드로게나제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, 숙시닐-CoA 신테타제, 메틸말로닐-CoA 뮤타제로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 탈조절된 유전자(단, 아스파르토키나제가 유전자 (i)로서 탈조절된 것이라면, 아스파르토키나제 이외의 적어도 하나의 제2 유전자 (i)는 탈조절된 것이어야 함)를 갖는 재조합 미생물을 작제하고, 그리고 상기 미생물을 배양함으로써 β-리신을 생산하는 방법.
β-리신, 탈조절된 리신-2,3-아미노뮤타제, 재조합 미생물, β-아미노-ε-카프로락탐, ε-카프로락탐, ε-아미노카프로산
Description
본 발명은 β-리신 (베타-리신)의 생산 방법에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 β-리신 생산에 필수적인, 탈조절된(deregulated) 형태의 DNA 분자를 포함하는 재조합 미생물의 용도에 관한 것이다.
상응하는 α-아미노산보다 덜 풍부하기는 하지만, β-아미노산은 유리 형태 및 펩티드, 둘 모두로 자연계에 존재한다 (문헌 [Cardillo and Tomasini, Chem. Soc. Rev. 25:77 (1996)]; [Sewald, Amino Acids 11:397 (1996)]). β-아미노산은 α-아미노산 대응물보다 염기성이 더 강력하고, 산성은 더 약하기 때문에 α-아미노산 대신 β-아미노산을 함유하는 펩티드는 상이한 골격의 원자 패턴을 갖고, 이로써, 새로운 성질을 나타낸다.
1950년대에 스트렙토마이세스(Streptomyces)에 의해 생산된 수개의 강염기성 펩티드 항생제에서 L-β-리신이 확인되었다. 가수분해시에 L-β-리신을 생산하는 항생제로는 비오마이신, 스트렙톨린 A, 스트렙토스리신, 로제오트리신 및 게오마이신을 포함한다 (문헌 [Stadtman, Adv. Enzymol. Relat. Areas Molec. Biol. 38:413 (1973)]). β-리신은 또한 예로서, 미코마이신과 같이 진균 노카르디아(Nocardia)에 의해 생산되는 항생제의 구성 요소이며, β-리신은 생물학적으로 활성인 다른 화합물 생산에 사용될 수 있다. 그러나, β-리신을 화학적으로 합성하는데는 많은 시간이 소요되고, 값비싼 출발 물질을 필요로 하고, 결과적으로는 라세미 혼합물을 생산한다.
본 발명의 요약
하나의 측면에서, 본 발명은 탈조절된 리신-2,3-아미노뮤타제, 및 리신 생합성 경로에 필수적인 유전자들로부터 선택된 1 이상의 탈조절된 유전자를 갖는 재조합 미생물을 작제하고, 상기 미생물을 배양하여 β-리신을 생산하는 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 β-리신 생산을 위한, 상기 언급된 공정을 포함하는 β-아미노-ε-카프로락탐 생산 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 β-리신 생산을 위한, 상기 언급된 공정을 포함하는 ε-카프로락탐 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 상세한 설명
이하의 설명에서, 다수의 용어들이 광범위하게 사용된다. 본원에서 정의는 본 발명의 이해를 돕기 위해 제공된다.
β-리신이라는 용어는 L-β-리신을 의미한다.
프로모터. mRNA를 생산하도록 구조 유전자의 전사를 지시하는 DNA 서열. 전형적으로, 프로모터는 유전자의 5' 영역에, 구조 유전자의 개시 코돈에 인접하게 위치한다. 프로모터가 유도가능 프로모터일 경우, 이때 전사 속도는 유도제에 대해 반응하여 증가한다. 대조적으로, 프로모터가 구성 프로모터일 경우, 전사 속도는 유도제에 의해 조절되지 않는다.
인핸서. 프로모터 요소. 인핸서는 전사 개시 부위와 관련하여 인핸서와의 거리 또는 인핸서의 배향과는 상관없이 특정 유전자가 mRNA로 전사되는 효율을 증가시킬 수 있다.
발현. 발현은 구조 유전자로부터 폴리펩티드가 생산되는 과정이다. 상기 과정은 유전자가 mRNA로 전사되고, 그러한 mRNA가 폴리펩티드(들)로 번역되는 것을 포함한다.
클로닝 벡터. 숙주 세포에서 자율적으로 복제할 수 있는 능력을 갖고 있고, 유전자 조작을 위해 세포를 형질전환시키는데 사용되는 DNA 분자, 예로서, 플라스미드, 코스미드, 파지미드, 또는 박테리오 파지. 클로닝 벡터는 전형적으로 벡터의 필수적인 생물학적 기능은 손실시키지 않으면서 외래 DNA 서열이 판정가능한 양식으로 삽입될 수 있는, 하나의 또는 소수의 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위 뿐만 아니라, 클로닝 벡터로 형질전환된 세포의 동정 및 선별에 사용하기 적합한 마커 유전자를 함유한다. 마커 유전자는 전형적으로 테트라사이클린 내성 또는 암피실린 내성을 제공하는 유전자를 포함한다.
발현 벡터. 재조합 숙주에서 외래 단백질을 발현하는, 외래 단백질을 코딩하는 클로닝된 구조 유전자를 포함하는 DNA 분자. 전형적으로, 클로닝된 유전자의 발현은 특정 조절 서열, 예로서, 프로모터 및 인핸서 서열의 제어하에 (즉, 그에 작동가능하게 연결되어) 있다. 프로모터 서열은 구성 또는 유도가능 프로모터일 수 있다.
재조합 숙주. 재조합 숙주는 클로닝 벡터 또는 발현 벡터를 함유하는 임의의 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다. 상기 용어는 또한 숙주 세포의 염색체 또는 게놈내에 클로닝된 유전자(들)를 함유하도록 유전적으로 공학처리된 원핵세포 또는 진핵세포도 포함한다는 것을 의미한다. 적합한 숙주의 일례에 대해서는 문헌 [Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) ["Sambrook"]]을 참조한다.
본원에서 사용되는 바, 실질적으로 순수한 단백질은 폴리아크릴아미드-도데실 황산나트륨 겔 전기영동(SDS-PAGE) 후에 단일 밴드로서 증명되는 것으로서, 원하는 정제된 단백질에는 본질적으로 오염성의 세포 성분이 존재하지 않는다는 것을 의미한다. "실질적으로 순수한"이라는 용어는 추가로 당업자에 의해 사용되는 순도 또는 균질성 특성에 의해 균질성인 분자를 기술하는 것으로 의미된다. 예를 들면, 실질적으로 순수한 리신 2,3-아미노뮤타제는 파라미터, 예로서, 하기의 것: 분자량, 크로마토그래픽 이동, 아미노산 조성, 아미노산 서열, 차단 또는 비차단 N-말단, HPLC 용리 프로파일, 생물학적 활성, 및 기타 그러한 파라미터에 대한 표준 실험 편차 내의 일정하고 재현가능한 특징들을 나타낼 것이다. 그러나, 상기 용어는 리신 2,3-아미노뮤타제와 다른 화합물의 인공 또는 합성 혼합물을 배제시킨다는 것을 의미하는 것은 아니다. 추가로, 상기 용어는 재조합 숙주로부터 단리된 리신 2,3-아미노뮤타제 융합 단백질을 배제시킨다는 것을 의미하는 것은 아니다.
제1 측면에서, 본 발명은 탈조절된 리신-2,3-아미노뮤타제, 및 (i) 아스파르토키나제, 아스파테이트세미알데히드 데하이드로게나제, 디하이드로디피콜리네이트 신타제, 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제, 테트라하이드로디피콜리네이트 숙시닐라제, 숙시닐-아미노-케토피멜레이트 트랜스아미나제, 숙시닐-디아미노-피멜레이트 데숙시닐라제, 디아미노-피멜레이트 에피머라제, 디아미노피멜레이트 데하이드로게나제, 아르기닐-tRNA 신테타제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제, 피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 6-포스포글루코노락토나제, 프럭토스 1,6-비포스파타제, 호모세린 데하이드로게나제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, 숙시닐-CoA 신테타제, 메틸말로닐-CoA 뮤타제로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 탈조절된 유전자(단, 아스파르토키나제가 유전자 (i)로서 탈조절된 것이라면, 아스파르토키나제 이외의 적어도 하나의 제2 유전자 (i)는 탈조절된 것이어야 함)를 갖는 재조합 미생물을 작제하고, 그리고 상기 미생물을 배양함으로써 β-리신을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은, 바람직하게는 상기 기술된 벡터 또는 유전자 (예컨대, 야생형 및/또는 돌연변이화된 유전자)를 비롯한 재조합 미생물 및/또는 β-리신을 생산하는 방식으로 배양된 재조합 미생물을 특징으로 한다.
"재조합" 미생물이라는 용어는 그것이 유래된 천연적으로 발생된 미생물과 비교하였을 때 변경되었거나, 변형되었거나, 상이한 유전형 및/또는 표현형 (예컨대, 유전자 변형이 미생물의 핵산 서열을 코딩하는데 영향을 주었을 때)을 나타내도록 유전적으로 변경되었거나, 변형되었거나, 공학처리된 (예컨대, 유전적으로 공학처리된) 미생물 (예컨대, 세균, 효소 세포, 진균 세포 등)을 포함한다.
"탈조절된"이라는 용어는 미생물 조작 이전에 발현된 것 또는 조작되지 않은 비교 미생물에서 발현된 것보다 더 낮거나 더 높은 수준으로 유전자 산물 (예컨대, 리신-2,3-아미노뮤타제)이 발현되는 것을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 미생물 조작 이전에 발현된 것 또는 조작되지 않은 비교 미생물에서 발현된 것보다 더 적거나 높은 수준의 수준으로 유전자 산물을 발현하기 위해서 미생물은 유전적으로 조작 (예컨대, 유전적으로 공학처리)될 수 있다. 유전적 조작으로는 특정 유전자의 발현과 관련된 조절 서열 또는 부위를 변경 또는 변형시키는 것 (예컨대, 강력한 프로모터, 유도가능 프로모터 또는 다중 프로모터를 제거함으로써), 특정 유전자의 염색체 위치를 변형하는 것, 특정 유전자, 예로서, 리보좀 결합 부위 또는 전사 종결자에 인접한 핵산 서열을 변경하는 것, 특정 유전자의 카피 수를 감소시키는 것, 특정 유전자의 전사 및/또는 특정 유전자 산물의 번역에 관여하는 단백질 (예컨대, 조절 단백질, 서프레서, 인핸서, 전사 활성자 등)을 변형시키는 것, 또는 당업계에서 통상적인 특정 유전자의 발현을 탈조절시키는 임의의 다른 종래 수단 (안티센스 핵산 분자를 사용하는 것, 또는 표적 단백질의 발현을 넉-아웃시키거나 차단하는 다른 방법을 포함하나, 이에 한정되지 않음)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
"탈조절된 리신-2,3-아미노뮤타제"라는 용어는 또한 예컨대, 바람직하게는 유전공학 처리 수단에 의해 하나 이상의 카피로 이종성 리신-2,3-아미노뮤타제 유전자를 미생물 내로 도입시킴으로써 이전에는 리신-2,3-아미노뮤타제 활성이 관찰되지 않았던 미생물 내로 리신-2,3-아미노뮤타제 활성이 도입된 것을 의미한다.
리신 2,3-아미노뮤타제는 L-리신이 β-리신으로 가역적으로 이성체화되는 것을 촉진시킨다. 클로스트리디움 서브터미날레(Clostridium subterminale) 균주 SB4로부터 단리된 효소는 외관상 동일한 하위유니트로 이루어진 육합체 단백질이며, 확산 및 침강 계수로부터 측정된 바에 따르면 그의 분자량은 285,000이다 (문헌 [Chirpich et al., J. Biol. Chem. 245:1778 (1970)]; [Aberhart et al., J. Am. Chem. Soc. 105:5461 (1983)]; [Chang et al., Biochemistry 35:11081 (1996)]). 클로스트리디알 효소는 철-황 클러스터, 코발트 및 아연, 및 피리독살 5'-포스페이트를 함유하며, 이는 S-아데노실메티오닌에 의해 활성화된다. 전형적인 아데노실코발라민-의존성 아미노뮤타제와는 달리, 클로스트리디알 효소는 비타민 B12 조효소 중 어떤 종류도 함유하지 않거나 필요로 하지 않는다.
클로스트리디알 리신 2,3-아미노뮤타제의 뉴클레오티드 및 예상되는 아미노산 서열 (서열 번호: 1 및 2)은 US 6,248,874B1에 개시되어 있다.
클로스트리디알 리신 2,3-아미노뮤타제 유전자를 코딩하는 DNA 분자는 서열 번호: 1에 기초한 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 프로브로 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득할 수 있다. 예를 들면, 적합한 라이브러리는 클로스트리디움 서브터미날레 균주 SB4 (ATCC 번호 29748)로부터 게놈 DNA를 수득하고, 표준 방법에 따라 라이브러리를 작제함으로써 생산할 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Ausubel et al. (eds.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3rd Edition, pages 2-1 to 2-13 and 5-1 to 5-6 (John Wiley & Sons, Inc. 1995)]을 참조한다.
별법으로, 클로스트리디알 리신 2,3-아미노뮤타제 유전자는 상호 프라이밍성의 긴 올리고뉴클레오티드를 사용하여 DNA 분자를 합성함으로써 수득할 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Ausubel et al., (eds.), CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, pages 8.2.8 to 8.2.13 (1990) ["Ausubel"]]을 참조한다. 또한, 문헌 ([Wosnick et al., Gene 60:1 15 (1987)]; 및 [Ausubel et al. (eds.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3rd Edition, pages 8-8 to 8-9 (John Wiley & Sons, Inc. 1995)])을 참조한다. 중합효소 연쇄 반응을 이용하는 확립된 기술은 2 킬로베이스 이상의 길이를 갖는 DNA 분자를 합성하는 능력을 제공한다 (문헌 ([Adang et al., Plant Molec. Biol. 21:1131 (1993)]; [Bambot et al., PCR Methods and Applications 2:266 (1993)]; [Dillon et al., "Use of the Polymerase Chain Reaction for the Rapid Construction of Synthetic Genes," in METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 15: PCR PROTOCOLS: CURRENT METHODS AND APPLICATIONS, White (ed.), pages 263-268, (Humana Press, Inc. 1993)]; [Holowachuk et al., PCR Methods Appl. 4:299 (1995)]).
모체 효소와 비교하여 보존적 아미노산 변화를 함유하는 클로스트리디알 리신 2,3-아미노뮤타제의 변이체가 생산될 수 있다. 즉, 알킬 아미노산이 클로스트리디알 리신 2,3-아미노뮤타제 아미노산 서열내의 알킬 아미노산을 치환하거나, 방향족 아미노산이 클로스트리디알 리신 2,3-아미노뮤타제 아미노산 서열내의 방향족 아미노산을 치환하거나, 황-함유 아미노산이 클로스트리디알 리신 2,3-아미노뮤타제 아미노산 서열내의 황-함유 아미노산을 치환하거나, 하이드록시-함유 아미노산이 클로스트리디알 리신 2,3-아미노뮤타제 아미노산 서열내의 하이드록시-함유 아미노산을 치환하거나, 산성 아미노산이 클로스트리디알 리신 2,3-아미노뮤타제 아미노산 서열내의 산성 아미노산을 치환하거나, 염기성 아미노산이 클로스트리디알 리신 2,3-아미노뮤타제 아미노산 서열내의 염기성 아미노산을 치환하거나, 또는 이염기성 모노카르복실 아미노산이 클로스트리디알 리신 2,3-아미노뮤타제 아미노산 서열내의 이염기성 모노카르복실 아미노산을 치환한, 서열 번호: 2의 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하는 변이체를 수득할 수 있다.
통상의 아미노산들 중에서, 예컨대, "보존적 아미노산 치환"은 하기 군들 각각 내에 존재하는 아미노산들 중에서의 치환에 의해 예시된다: (1) 글리신, 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신, (2) 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판, (3) 시스테인 및 메티오닌, (4) 세린 및 트레오닌, (5) 아스파테이트 및 글루타메이트, (6) 글루타민 및 아스파라긴, 및 (7) 리신, 아르기닌 및 히스티딘.
클로스트리디알 리신 2,3-아미노뮤타제에서의 보존적 아미노산 변화는 서열 번호: 1에 인용된 뉴클레오티드를 뉴클레오티드로 치환함으로써 도입할 수 있다. 그러한 "보존적 아미노산" 변이체는, 예컨대, 올리고뉴클레오티드-지시된 돌연변이유발법, 링커-스캐닝 돌연변이유발법, 및 중합효소 연쇄 반응을 이용하는 돌연변이유발법 등에 의해 수득할 수 있다 (문헌 ([Ausubel et al., 상기 문헌, at pages 8.0.3-8.5.9]; [Ausubel et al. (eds.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3rd Edition, pages 8-10 to 8-22 (John Wiley & Sons, Inc. 1995)])). 또한, 일반적으로는 문헌 [McPherson (ed.), DIRECTED MUTAGENESIS: A PRACTICAL APPROACH, IRL Press (1991)]을 참조한다. L-리신을 L-β-리신으로 전환시킬 수 있는 상기 변이체의 능력은 표준 효소 활성 분석법, 예로서, 본원에 기술된 분석법을 이용하여 결정할 수 있다.
클로스트리디움 서브터미날레 이외의 다른 공급원, 예컨대, 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 또는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 리신-2,3-아미노뮤타제는 US 6,248,874B1에 개시되어 있다. 리신-2,3-아미노뮤타제의 단리, 서열 번호 및 발현에 관해 상기 US 특허의 일부가 본원에서 명확하게 참고로 인용된다.
본 발명에 따른 바람직한 리신-2,3-아미노뮤타제는 클로스트리디움 서브터미날레, 바실러스 섭틸리스 및 에스케리키아 콜라이로부터의 리신-2,3-아미노뮤타제 및 그와 등가인 유전자이며, 이는 상응하는 "원래의" 유전자 산물과 80% 이하, 바람직하게 90% 이하, 가장 바람직하게 95% 이하 및 98% 이하의 서열 동일성 (아미노산 서열에 기초)을 갖고, 리신 2,3-아미노뮤타제의 생물학적 활성을 여전히 갖고 있다. 이들 등가인 유전자는 당업계에 공지된 방법에 의해 뉴클레오티드 치환, 결실 또는 삽입을 도입함으로써 용이하게 작제될 수 있다.
본 발명의 또다른 바람직한 실시태양은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 코돈 선호도를 적용시킴으로써 DNA로 재번역된 클로스트리디움 서브터미날레 (US 6,248,874B1의 서열 번호: 2)로부터의 리신-2,3-아미노뮤타제이다. 이러한 리신-2,3-아미노뮤타제 폴리뉴클레오티드 서열은 코리네박테리움 속의 미생물, 특히, C. 글루타미쿰에서 리신 2,3-아미노뮤타제를 발현시키는데 유용하다.
탈조절된 리신 2,3-아미노뮤타제 유전자 이외에도, 본 발명에 따른 미생물은 군 (i)로부터 선택되는 적어도 하나의 탈조절된 유전자를 가져야 한다. 군 (i)은 리신 생합성에서 중요한 역할을 하는 유전자 군이며, 아스파르토키나제, 아스파테이트세미알데히드 데하이드로게나제, 디하이드로디피콜리네이트 신타제, 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제, 테트라하이드로디피콜리네이트 숙시닐라제, 숙시닐-아미노-케토피멜레이트 트랜스아미나제, 숙시닐-디아미노-피멜레이트 데숙시닐라제, 디아미노피멜레이트 에피머라제, 디아미노피멜레이트 데하이드로게나제, 아르기닐- tRNA 신테타제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제, 피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 6-포스포글루코노락토나제, 프럭토스 1,6-비포스파타제, 호모세린 데하이드로게나제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, 숙시닐-CoA 신테타제, 메틸말로닐-CoA 뮤타제 유전자로 구성된다.
군 (i)중 적어도 하나의 유전자는 본 발명의 공정에 따라 탈조절된 것이어야 한다. 바람직하게, 군 (i)중 1 초과의 유전자, 예컨대, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개의 유전자가 본 발명에 따른 미생물에서 탈조절된다.
군 (i)의 유전자 및 유전자 산물은 당업계에 공지되어 있다. EP 1108790은 리신 생산에 있어서 재조합 코리네박테리아의 생산성에 대하여 유익한 효과를 갖는 호모세린데하이드로게나제 및 피루베이트카르복실라제의 유전자내 돌연변이를 개시한다. WO 00/63388은 리신 생산에 있어서 재조합 코리네박테리아의 생산성에 대하여 유익한 효과를 갖는 아스파르토키나제의 유전자내 돌연변이를 개시한다. EP 1108790 및 WO 00/63388은 상기 기술된 이들 유전자내 돌연변이화와 관련하여 참고로 인용된다.
모든 유전자/유전자 산물에 관한 하기 표에는 각 유전자를 탈조절시킬 수 있는 가능한 방법을 언급한다. 표의 "탈조절"이라 표시된 열에서 인용된 문헌 및 문서는 유전자 탈조절과 관련하여 본원에서 참고로 인용된다. 표에서 언급된 방법은 각 유전자의 탈조절에 관한 바람직한 실시태양이다.
| 효소 (유전자 산물) | 유전자 | 탈조절 |
| 아스파르토키나제 | ask | 점 돌연변이에 의한 방출 피드백 저해 (문헌 [Eggeling et al., (eds.), Handbook of Corynebacterium glutamicum, pages 20.2.2 (CRC press,2005)]) 및 증폭 |
| 아스파테이트세미알데히드 데하이드로게나제 | asd | 증폭 |
| 디하이드로디피콜리네이트 신타제 | dapA | 증폭 |
| 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제 | dapB | 증폭 |
| 테트라하이드로디피콜리네이트 숙시닐라제 | dapD | 증폭 |
| 숙시닐-아미노-케토피멜레이트 트랜스아미나제 | dapC | 증폭 |
| 숙시닐-디아미노-피멜레이트 데숙시닐라제 | dapE | 증폭 |
| 디아미노피멜레이트 데하이드로게나제 | ddh | 증폭 |
| 디아미노피멜레이트 에피머라제 | dapF | 증폭 |
| 아르기닐-tRNA 신테타제 | argS | 증폭 |
| 디아미노피멜레이트 데카르복실라제 | lysA | 증폭 |
| 피루베이트 카르복실라제 | pycA | 점 돌연변이에 의한 방출 피드백 저해 (EP 1108790) 및 증폭 |
| 포스포에놀피루베이트 카르복실라제 | ppc | 증폭 |
| 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 | zwf | 점 돌연변이에 의한 방출 피드백 저해 (US2003/0175911) 및 증폭 |
| 트랜스케톨라제 | tkt | 증폭 |
| 트랜스알돌라제 | tal | 증폭 |
| 6-포스포글루코노락토나제 | pgl | 증폭 |
| 프럭토스 1,6-비포스파타제 | fbp | 증폭 |
| 호모세린 데하이드로게나제 | hom | 점 돌연변이에 의한 약독화 (EP 1108790) |
| 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 | pck | 돌연변이화 또는 기타의 것에 의한 넉-아웃 또는 침묵화 |
| 숙시닐-CoA 신테타제 | sucC | 점 돌연변이에 의한 약독화 (WO 05/58945) |
| 메틸말로닐-CoA 뮤타제 | 점 돌연변이에 의한 약독화 (WO 05/58945) |
아스파르토키나제, 아스파테이트세미알데히드 데하이드로게나제, 디하이드로디피콜리네이트 신타제, 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제, 테트라하이드로디피콜리네이트 숙시닐라제, 숙시닐-아미노-케토피멜레이트 트랜스아미나제, 숙시닐-디아미노-피멜레이트 데숙시닐라제, 디아미노피멜레이트 에피머라제, 디아미노피멜레이트 데하이드로게나제, 아르기닐-tRNA 신테타제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제, 피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 6-포스포글루코노락토나제, 프럭토스 1,6-비포스파타제의 유전자를 탈조절시키는 바람직한 방법은 예컨대, 강력한 발현 신호를 사용하는 유전잔 증폭에 의해 유전자 활성을 증가시키는 "상향"-돌연변이 및/또는 효소 활성을 증진시키는 점 돌연변이이다.
호모세린 데하이드로게나제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, 숙시닐-CoA 신테타제, 메틸말로닐-CoA 뮤타제의 유전자를 탈조절시키는 바람직한 방법은 예컨대, 약한 발현 신호를 사용하는 유전자 결실 또는 파괴에 의해 유전자 활성을 감소시키는 "하향"-돌연변이 및/또는 효소 활성을 파괴시키거나 감소시키는 점 돌연변이이다.
(i) 군 유전자의 일원으로서 아스파르토키나제가 탈조절된 것이라면, 아스파르토키나제 이외의 적어도 하나의 제2 유전자 (i) 일원 또한 탈조절된 것이어야 한다.
본 발명에 따른 탈조절된 유전자를 발현하기 위해서는 효소를 코딩하는 DNA 서열이 발현 벡터에서 전사 발현을 제어하는 조절 서열에 작동가능하게 연결되어야 하고, 이어서, 원핵 또는 진핵 숙주 세포 내로 도입되어야 한다. 전사 조절 서열, 예로서, 프로모터 및 인핸서 이외에도, 발현 벡터는 번역 조절 서열, 및 발현 벡터를 수반하는 세포의 선별에 적합한 마커 유전자를 포함할 수 있다.
원핵 숙주에서 발현하기에 적합한 프로모토는 억제성, 구성성, 또는 유도가능성인 것일 수 있다. 적합한 프로모터는 당업자에게 잘 알려져 있으며, T4, T3, Sp6 및 T7 폴리머라제를 인식할 수 있는 프로모터, 박테리오파지 람다의 PR 및 PL 프로모터, E. 콜라이의 trp, recA, 열 쇼크, lacUV5, tac, Ipp-lacλpr, phoA, gal, trc 및 lacZ 프로모터, B. 섭틸리스의 α-아밀라제 및 σ28-특이 프로모터, 바실러스의 박테리오파지의 프로모터, 스트렙토마이세스 프로모터, 박테리오파지 람다의 int 프로모터, pBR322의 β-락타마제 유전자의 bla 프로모터, 및 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 유전자의 CAT 프로모터를 포함한다. 원핵 프로모터에 관해서는 문헌 ([Glick, J. Ind. Microbiol. 1 :277 (1987)]; [Watson et al., MOLECULAR BIOLOGY OF THE GENE, 4th Ed., Benjamin Cummins (1987)]; [Ausubel et al., 상기 문헌], 및 [Sambrook et al., 상기 문헌])에 리뷰되어 있다.
리신-2,3-아미노뮤타제를 발현하는데 바람직한 프로모터는 C. 글루타미쿰의 sodA 프로모터이다. 발현을 개선시키기 위하여, 종결자, 예컨대, C. 글루타미쿰의 groEL 종결자를 리신-2,3-아미노뮤타제 유전자 하류에 삽입할 수 있다.
원핵 숙주에서 단백질을 발현시키는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들면, 문헌 [Williams et al., "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies," in DNA CLONING 2: EXPRESSION SYSTEMS, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), pages 15-58 (Oxford University Press 1995)]를 참조한다. 또한, 문헌 ([Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies," in MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, pages 137-185 (Wiley-Liss, Inc. 1995)]; 및 [Georgiou, "Expression of Proteins in Bacteria," in PROTEIN ENGINEERING: PRINCIPLES AND PRACTICE, Cleland et al. (eds.), pages 101-127 (John Wiley & Sons, Inc. 1996)])을 참조한다.
발현 벡터는 염화칼슘 형질전환, 전기천공 등을 비롯한 다양한 표준 기법을 사용하여 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Ausubel et al. (eds.), SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 3rd Edition, pages 1-1 to 1-24 (John Wiley & Sons, Inc. 1995)]을 참조한다.
본 발명의 중요한 측면은 상기 기술된 재조합 미생물을 배양(cultivating) 또는 배양(culturing)하여 원하는 화합물 β-리신이 생산되도록 하는 것을 포함한다. "배양한다"라는 용어는 본 발명의 살아있는 미생물을 유지하고/거나 성장시키는 것 (예컨대, 배양물 또는 균주를 유지하고/거나 성장시키는 것)을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 본 발명의 미생물을 액체 배지에서 배양한다. 또다른 실시태양에서, 본 발명의 미생물을 고체 배지 또는 반-고체 배지에서 배양한다. 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 미생물을 미생물의 유지 및/또는 성장에 필수적이거나 유익한 영양물질을 포함하는 배지 (예컨대, 멸균, 액체 배지)에서 배양한다.
사용될 수 있는 탄소 공급원은 당 및 당질, 예로서, 글루코스, 수크로스, 락토스, 프럭토스, 말토스, 당밀, 전분, 및 셀룰로스, 오일 및 지방, 예로서, 대두유, 해바라기 오일, 땅콩 오일 및 코코넛 오일, 지방산, 예로서, 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산, 알코올, 예로서, 글리세롤, 및 에탄올, 및 유기 산, 예로서, 아세트산을 포함한다. 바람직한 실시태양에서는, 글루코스, 프럭토스 또는 수크로스가 탄소 공급원으로서 사용된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
사용될 수 있는 질소 공급원은 질소를 함유하는 유기 화합물, 예로서, 펩톤, 효모 추출물, 육류 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두분 및 우레아 또는 무기 화합물, 예로서, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄을 포함한다. 질소 공급원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 인 공급원은 인산, 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨, 또는 상응하는 나트륨-함유 염이다. 배양 배지는 추가로 성장에 필요한, 예를 들면, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속 염을 함유하여야 한다. 마지막으로, 상기 언급된 물질 이외에도 필수적인 성장-촉진 물질, 예로서, 아미노산 및 비타민이 또한 사용될 수 있다. 적합한 전구체가 추가로 배양 배지에 첨가될 수 있다. 언급된 공급 물질은 단일 배치로 배양물에 첨가될 수 있거나, 배양하는 동안 적절하게 공급될 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 미생물은 조절된 pH하에서 배양된다. "조절된 pH"라는 용어는 원하는 정밀 화학물질, 예컨대, β-리신을 생산하는 임의의 pH를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 미생물은 pH 약 7에서 배양된다. 또다른 실시태양에서, 미생물은 pH 6.0 내지 8.5에서 배양된다. 원하는 pH는 당업자에게 공지된 임의의 많은 방법에 의해 유지될 수 있다. 예를 들면, 염기성 화합물, 예로서, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아, 또는 암모니아수, 또는 산성 화합물, 예로서, 인산, 또는 황산을 사용하여 배양물의 pH를 적절히 조절한다.
또한 바람직하게, 본 발명의 미생물은 조절된 폭기하에서 배양된다. "조절된 폭기"라는 용어는 원하는 정밀 화학물질, 예컨대, β-리신이 생산될 정도의 충분한 공기(예컨대, 산소) 공급을 포함한다. 하나의 실시태양에서, 폭기는 배양물 중의 산소 수준 조절을 통해, 예를 들면, 배양 배지에서 용존 산소량의 조절을 통해 제어한다. 바람직하게는, 배양물의 폭기는 배양물 교반을 통해 제어된다. 교반은 프로펠러 또는 유사한 기계적 교반 장치를 통해, 배양 용기 (예컨대, 발효기)를 회전 또는 진탕시키거나, 또는 다양한 펌핑 장치를 사용하여 제공할 수 있다. 폭기는 멸균된 공기 또는 산소를 배지를 통해 (예컨대, 발효 혼합물을 통해) 통과시킴으로써 추가로 제어될 수 있다. 또한 바람직하게는, 본 발명의 미생물은 과도한 거품생성이 없이 (예컨대, 소포제, 예로서, 지방산 폴리글리콜 에스테르의 첨가를 통해) 배양된다.
더욱이, 본 발명의 미생물은 제어된 온도하에서 배양할 수 있다. "제어된 온도"라는 용어는 원하는 정밀 화학물질, 예컨대, β-리신이 생산되는 임의의 온도를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 제어된 온도는 15℃ 내지 95℃ 사이의 온도를 포함한다. 또다른 실시태양에서, 제어된 온도는 15℃ 내지 70℃ 사이의 온도를 포함된다. 바람직한 온도는 20℃ 내지 55℃ 사이이며, 더욱 바람직하게는 30℃ 내지 45℃ 사이, 또는 30℃ 내지 50℃ 사이이다.
미생물은 액체 배지에서 배양 (예컨대, 유지 및/또는 성장)될 수 있으며, 바람직하게는 예로서, 정치 배양, 시험관 배양, 진탕 배양 (예컨대, 회전식 진탕 배양, 진탕 플라스크 배양 등), 폭기 스피너 배양 또는 발효와 같은 통상적인 배양 방법에 의해 연속적으로 또는 간헐적으로 배양된다. 바람직한 실시태양에서, 미생물은 진탕 플라스크에서 배양된다. 더욱 바람직한 실시태양에서, 미생물은 발효기 (예컨대, 발효 공정)에서 배양된다. 본 발명의 발효 공정에는 배치, 공급형-배치 및 연속 발효 방법을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. "배치 공정" 또는 "배치 발효"라는 어구는 배지, 영양물질, 보충 첨가물 등의 조성이 발효의 시작 시점에서 설정되어 발효 도중에 변경되지 않는 시스템을 지칭하지만, 배지의 과도한 산성화 및/또는 미생물 사멸 방지를 위해서 pH 및 산소 농도와 같은 인자들을 제어하기 위한 시도가 수행될 수 있다. "공급형-배치 공정" 또는 "공급형-배치" 발효라는 어구는 발효가 진행됨에 따라 하나 이상의 기질 또는 보충물을 첨가 (예컨대, 증량하여 첨가하거나 연속적으로 첨가)하는 것을 제외하고는 배치 발효와 동일하다. "연속 공정" 또는 "연속 발효"라는 어구는 정해진 발효 배지를 연속적으로 발효기에 첨가하는 동시에, 사용된 배지 또는 "조정" 배지를 동량만큼 분리하여 바람직하게는 원하는 β-리신을 회수하는 시스템을 지칭한다. 상기의 다양한 공정들이 개발되어 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 방법은 β-리신을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. β-리신을 "회수한다"라는 용어는 배양 배지로부터 상기 화합물의 추출, 수거, 단리 또는 정제하는 것을 포함한다. 화합물을 회수하는 것은 통상적인 수지 (예컨대, 음이온 또는 양이온 교환 수지, 비이온성 흡착 수지 등)로의 처리, 통상적인 흡착제 (예컨대, 활성 목탄, 규산, 실리카겔, 셀룰로스, 알루미나 등)로의 처리, pH의 변화, 용매 추출 (예컨대, 알콜, 에틸 아세테이트 및 헥산 등과 같은 통상적인 용매를 사용함), 증류, 투석, 여과, 농축, 결정화, 재결정화, pH 조정 및 동결건조 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 당업계에 공지된 임의의 통상적인 단리 또는 정제 방법에 따라 실시할 수 있다. 예를 들면, 먼저 배양 배지로부터 미생물을 제거하여 β-리신을 회수할 수 있다. 이어서, 바이오매스가 제거된 브로쓰를 양이온 교환 수지를 통해 또는 상기 수지상에 통과시켜 원치않는 양이온을 제거한 후, 음이온 교환 수지를 통해 또는 상기 수지상에 통과시켜 원치않는 무기 음이온 및 β-리신보다 산도가 더욱 강력한 유기산을 제거한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 β-리신 생산에 대하여 상기 언급된 것과 같은 단계를 포함하는 β-아미노-ε-카프로락탐 생산 방법을 제공한다. β-리신의 분자내 폐환화를 통해 β-아미노-ε-카프로락탐을 수득한다. 상기 폐환화 반응은 β-리신의 단리 및/또는 정제 직전에 실시될 수 있거나, 단리된 β-리신으로 실시될 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 β-리신 생산에 대하여 상기 언급된 것과 같은 단계를 포함하는 ε-카프로락탐 생산 방법을 제공한다. 상기 기술된 바와 같이, β-리신의 분자내 폐환화를 통해 β-아미노-ε-카프로락탐을 수득하고, ε-카프로락탐을 수득하기 위해 선택적으로 탈아미노화시킬 수 있다. 이러한 탈아미노화 공정은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 또다른 측면은 β-리신 생산에 대하여 상기 언급된 것과 같은 단계, 및 이어서, β-리신의 β-아미노관능기의 탈아미노화를 포함하는, 산을 생산하는 방법을 제공한다. 생성된 ε-아미노카프로산은 ε-카프로락탐으로 변환될 수 있거나, 공지된 중합체화 기법에 의해 락탐으로 폐환화되지 않고 직접 폴리아미드로 변환될 수 있다.
ε-카프로락탐은 폴리아미드, 특히, PA6의 생산에 매우 중요한 단량체이다.
1. C. 서브터미날레 리신 2,3-아미노뮤타제 유전자의 클로닝
퓨조박테리움 뉴클레툼(Fusobacterium nucleatum) 및 써모언에어로박터 텐그콘겐시스(Thermoanaerobacter tengcongensis) 리신 2,3-아미노뮤타제 유전자의 상류- 및 하류의 보존적 영역을 사용하여 C. 서브터미날레 리신 2,3-아미노뮤타제 유전자 (kamA)를 단리시키기 위한 한 세트의 올리고뉴클레오티드 프라이머를 디자인하였다. PCR 프라이머인 WKJ90/WKJ65 및 WKJ68/WKJ93을 주형인 C. 서브터미날레 염색체와 함께 사용하여 각각의 kamA 유전자의 N- 및 C-말단 서열을 포함하는 상류- 및 하류 영역의 DNA 단편을 증폭시켰다. 정제한 후에 증폭된 DNA 단편에 대한 서열 분석을 수행하고, kamA 구조 영역의 출발 및 종결 서열을 함유하는 산물을 수득하였다. 결정된 것에 기초하여, 상류- 및 하류 서열 PCR 프라이머, WKJ105/WKJ 106을 합성하고, C. 서브터미날레 kamA 유전자의 전장 서열을 단리시키는데 사용하였다. 증폭된 PCR 단편을 정제하고, 제한 효소 Xho I 및 Mlu I를 사용하여 분해하고, 동일 제한 효소로 분해된 pClik5aMCS 벡터에 결찰시켰다(pClik5aMCS kamA).
2. C. 서브터미날레 합성 리신 2,3-아미노뮤타제 유전자의 클로닝
C. 서브터미날레 kamA 유전자에 대한 코돈 선호도는 C. 글루타미쿰의 것과 매우 상이하며, 이는 C. 글루타미쿰 리신 생산 균주에서 유전자 발현을 감소시킬 수 있다. C. 글루타미쿰에서 유전자 발현을 증진시키기 위하여, C. 글루타미쿰 코돈 선호도로 적합화되고, 그의 자신의 것 대신 C. 글루타미쿰 sodA 프로모터 (Psod) 및 groEL 종결자를 갖는 합성 kamA 유전자를 생성하였다. 합성 kamA 유전자는 원래의 것과 비교하였을 때 뉴클레오티드 서열에 있어서 72%의 유사성을 나타내었다. 합성 kamA 유전자를 pClik5aMCS 벡터 내로 클로닝하였다 (pClik5aMCS syn_kamA).
3. B. 섭틸리스 리신 2,3-아미노뮤타제 유전자의 클로닝
PCR 프라이머, WKJ71/WKJ72를 사용하여 염색체 DNA로부터 B. 섭틸리스 리신 2,3-아미노뮤타제 유전자 (yodO)를 함유하는 DNA 단편을 증폭시켰다. 증폭된 DNA 단편을 정제하고, Xho I 및 Mlu I로 분해하고, pClik5aMCS 벡터의 Xho I와 Mlu I 절단 부위 사이로 삽입하였다 (pClik5aMCS yodO).
유전자 발현을 증가시키기 위하여, yodO 유전자의 코딩 영역 앞에서 C. 글루타미쿰 sodA 프로모터를 치환하였다. sodA 프로모터 및 yodO 유전자의 상류 영역을 함유하는 DNA 단편을, 각각 PCR 프라이머 WKJ75/WKJ78 및 WKJ73/WKJ76을 사용하여 각 염색체 DNA로부터 증폭시키고, 융합 PCR에 대한 주형으로서의 그를 프라이머 WKJ73/WKJ78과 함께 사용하여 yodO 상류-Psod 산물을 제조하였다. 이어서, 프라이머로서 WKJ73/WKJ74와, 프라이머 WKJ77/WKJ74로 증폭된 yodO 상류-Psod 및 yodO 코딩 영역을 주형으로서 사용하여 융합 PCR에 의해 Psod-제어형 yodO 유전자를 생성하였다. PCR 산물을 정제하고, Xho I 및 Mlu I로 분해하고, pClik5aMCS 벡터로 삽입하였다 (pClik5aMCS Psod yodO).
4. E. 콜라이 리신 2,3-아미노뮤타제 유전자의 클로닝
주형으로서 E. 콜라이 염색체와 함께 PCR 프라이머 WKJ29/WKJ30을 사용하여 리신 2,3-아미노뮤타제 유전자 (yjeK)를 증폭시켰다. 증폭된 PCR 단편을 정제하고, 제한 효소 Xho I 및 Nde I를 사용하여 분해하고, 동일 제한 효소로 분해된 pClik5aMCS 벡터에 결찰시켰다 (pClik5aMCS yjeK).
유전자 발현을 증가시키기 위하여, yjeK 유전자의 개시 코돈 앞에서 C. 글루타미쿰 sodA 프로모터를 치환하였다. sodA 프로모터 및 하류 영역을 포함하는 yjeK 유전자의 코딩 영역을 함유하는 DNA 단편을, 각각 PCR 프라이머 WKJ31/OLD47 및 WKJ32/WKJ30을 사용하여 각 염색체 DNA로부터 증폭시키고, 융합 PCR에 대한 주형으로서의 그를 프라이머 WKJ31/WKJ30과 함께 사용하여 Psod-yjeK 유전자를 제조하였다. PCR 단편을 정제하고, Xho I 및 Nde I로 분해하고, pClik5aMCS 벡터의 Xho I-Nde I 절단 부위 내로 삽입하였다 (pClik5aMCS Psod yjeK).
사용된 올리고뉴클레오티드 프라이머:
| 사용된 플라스미드 | |
| 플라스미드 | 특징 |
| pClik5aMCS | E. 콜라이/C. 글루타미쿰 셔틀 벡터, Kmr |
| pClik5aMCS kamA | C. 서브터미날레 리신 2,3-아미노뮤타제 유전자 (kamA)를 수반하는 pClik5aMCS |
| pClik5aMCS syn_kamA | sodA 프로모터, C. 글루타미쿰 코돈 선호도에 적합화된 kamA 유전자 및 groEL 종결자로 구성된 C. 서브터미날레 합성 kamA를 수반하는 pClik5aMCS |
| pClik5aMCS yodO | B. 섭틸리스 리신 2,3-아미노뮤타제 유전자 (yodO)를 수반하는 pClik5aMCS |
| pClik5aMCS Psod yodO | C. 글루타미쿰 sodA 프로모터와 융합된 B. 섭틸리스 yodO를 수반하는 pClik5aMCS |
| pClik5aMCS yjeK | E. 콜라이 리신 2,3-아미노뮤타제 유전자 (yjeK)를 수반하는 pClik5aMCS |
| pClik5aMCS Psod yjeK | C. 글루타미쿰 sodA 프로모터와 융합된 E. 콜라이 yjeK를 수반하는 pClik5aMCS |
5. C. 글루타미쿰의 β-리신 생산 균주 작제
재조합 β-리신 생산 균주를 작제하기 위하여, 아스파르토키나제 유전자 내로 점 돌연변이 T311I를 혼입시키고, 디아미노피멜레이트 데하이드로게나제 유전자를 복제하고, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제 유전자를 파괴시킴으로써 C. 글루타미쿰 야생형 균주 ATCC13032로부터 작제된 리신 생산자 LU11271을 리신 2,3-아미노뮤타제 유전자를 갖는 재조합 플라스미드로 형질전환시켰다.
6. 진탕 플라스크 배양물중 β-리신 생산
재조합 균주상에서 진탕 플라스크 실험을 실시하여 β-리신 생산에 대하여 시험하였다. WO2005059139에 기재되어 있는 바와 같이 리신 생산과 동일한 배양 배지 및 조건을 사용하였다. 대조군의 경우, 숙주 균주 및 pClik5aMCS를 갖는 재조합 균주를 동시에 시험하였다. CM 아가 상에서 균주를 30℃에서 밤새도록 예비 배양하였다. 1.5 ml의 0.9% NaCl을 함유하는 미세튜브에 배양된 세포를 수거하고, 와동시킨 후, 610 nm에서의 흡광도에 의해 세포 밀도를 측정하였다. 본 배양물의 경우, 현탁된 세포를 0.5 g의 CaCO3을 갖는, 오토클레이브된 100 ml의 삼각 플라스크에 함유된 10 ml의 생산 배지 내로 접종하여 초기 OD가 1.5에 도달하도록 하였다. 30℃에서 48-78시간 동안 200 rpm으로 회전식 진탕기 (인퍼스 AJ 118(Infers AJ 118), 스위스 보트민겐 소재) 상에서 본 배양을 실시하였다. 세포 성장 측정을 위해서 0.1 ml의 배양 브로쓰를 0.9 ml의 1 N HCl과 혼합하여 CaCO3을 제거하고, 적절히 희석시킨 후 610 nm에서의 흡광도를 측정하였다. HPLC 방법 (애질런트 1100 시리즈 LC 시스템(Agilent 1100 Series LC system))에 의해 β-리신, 리신 및 글루코스, 프럭토스 및 수크로스를 비롯한 잔류 당의 농도를 측정하였다.
하기 표에 나타낸 바와 같이, 대조군 균주와 비교하여 C. 서브터미날레 합성 kamA 유전자를 함유하는 재조합 균주를 사용하여 배양된 브로쓰에서 β-리신이 축적된 것이 관찰되었다. 이는 클로스트리디알 합성 kamA 유전자가 C. 글루타미쿰에서 작용한다는 것을 지시하는 것이다. 추가로, SDS-PAGE에 의해 합성 kamA 유전자의 발현을 확인하였다.
| C. 클로스트리디움 kamA 증폭된 균주를 사용한 진탕 플라스크 배양물 | ||
| β-리신(g/ℓ) | OD610 nm | |
| LU11271 | 0 | 46.9 |
| LU11271/pClik5aMCS | 0 | 47.8 |
| LU11271/pClik5aMCS syn_kamA | 0.2 | 44.3 |
Claims (9)
- 탈조절된 리신-2,3-아미노뮤타제 유전자, 및 (i) 아스파르토키나제, 아스파테이트세미알데히드 데하이드로게나제, 디하이드로디피콜리네이트 신타제, 디하이드로디피콜리네이트 리덕타제, 테트라하이드로디피콜리네이트 숙시닐라제, 숙시닐-아미노-케토피멜레이트 트랜스아미나제, 숙시닐-디아미노-피멜레이트 데숙시닐라제, 디아미노피멜레이트 에피머라제, 디아미노피멜레이트 데하이드로게나제, 아르기닐-tRNA 신테타제, 디아미노피멜레이트 데카르복실라제, 피루베이트 카르복실라제, 포스포에놀피루베이트 카르복실라제, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제, 트랜스케톨라제, 트랜스알돌라제, 6-포스포글루코노락토나제, 프럭토스 1,6-비포스파타제, 호모세린 데하이드로게나제, 포스포에놀피루베이트 카르복시키나제, 숙시닐-CoA 신테타제, 메틸말로닐-CoA 뮤타제로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 탈조절된 유전자(단, 아스파르토키나제가 유전자 (i)로서 탈조절된 것이라면, 아스파르토키나제 이외의 적어도 하나의 제2 유전자 (i)는 탈조절된 것이어야 함)를 갖는 재조합 미생물을 작제하고, 그리고 상기 미생물을 배양함으로써 β-리신을 생산하는 방법.
- 제1항에 있어서, 미생물이 코리네박테리움(Corynebacterium) 속에 속하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 미생물이 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인 방법.
- 제1항에 있어서, 탈조절된 리신-2,3-아미노뮤타제가 상기 미생물과 이종성인 리신-2,3-아미노뮤타제인 방법.
- 제1항에 있어서, 재조합 미생물이 클로스트리디움(Clostridium), 바실러스(Bacillus) 또는 에스케리키아(Escherichia)로부터의 리신-2,3-아미노뮤타제를 갖는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 리신-2,3-아미노뮤타제가 클로스트리디움 서브터미날레(Clostridium subterminale), 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis) 또는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 리신-2,3-아미노뮤타제의 폴리펩티드 서열, 또는 상응하는 원래의 폴리펩티드와 80% 이상 동일하며 리신 2,3-아미노뮤타제 활성을 갖는 폴리펩티드 서열을 갖는 것인 방법.
- 제1항의 단계를 포함하는 β-아미노-ε-카프로락탐의 생산 방법.
- 제1항의 단계를 포함하는 ε-카프로락탐의 생산 방법.
- 제1항의 단계를 포함하는 ε-아미노카프로산의 생산 방법.
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