BR112013017831B1 - método para a preparação de ácido nicotínico - Google Patents

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Abstract

MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DE ÁCIDO NICOTÍNICO Trata-se de um método para a preparação de ácido nicotínico que compreende a etapa de obter uma solução de cultura que contém ácido quinolínico incubando-se um microorganismo que tem uma habilidade para produzir ácido quinolínico e a etapa de adicionar um ácido à solução de cultura e conduzir uma reação de descarboxilação.

Description

CAMPO DA TÉCNICA
A presente invenção refere-se a um método para preparar ácido nicotinico por meio de incubação de micro- 5 organismos que têm capacidade de produzir ácidos quinolinicos e descarboxilação dos ácidos quinolinicos obtidos dos mesmos.
TÉCNICA ANTECEDENTE
O ácido nicotinico é um óxido de nicotina e está extensivamente presente em corpos de animais e plantas como 10 uma vitamina solúvel em água que é também chamada de complexo de vitamina B, vitamina B3 de niacina. A deficiência de ácido nicotinico pode resultar na doença de pelagra ou neuropatias. O ácido nicotinico está geralmente presente na forma de amida de coenzima de ácido nicotinico (NAD, NADP) no corpo vivo e 15 participa na reação de redução por oxidação.
O ácido nicotinico, conforme utilizado de forma útil em alimentos e produtos medicinais, pode ser preparado por meio de método sintético quimico ou método de produção biológica. A sintese quimica de ácido nicotinico foi 20 geralmente concluída através de oxidação com o uso de 3- picolne como um catalisador de oxidação. Especificamente, a 2-metilpentanediamina (MPDA) é submetida à reação hipertérmica (280 a 360 graus Celsius) por meio de um catalisador para sintetizar 3-picolina e então a 3-picolina é 25 submetida à amoxidação para produzir 3-cianoprina, que é então hidrolisada para sintetizar niacinamida ou ácido nicotinico. De forma alternativa, o ácido nicotinico pode ser diretamente sintetizado a partir de 3-picolina através da oxidação seletiva {Applied Catalysis A: General 280 (2005) 75 30 a 82) . No entanto, devido ao fato de que a síntese química resulta em grandes quantidades de resíduos tóxicos incluindo o catalisador, há uma necessidade de administração total e grandes gastos são exigidos para disposição de resíduos. De modo a resolver tal problema, o método para sintetizar niacina de 3-cianopiridina com o uso de uma enzima foi desenvolvido. No entanto, esse método também tem problemas similares devido ao uso de 3-cianoprina, que causa uma geração de resíduos em grandes quantidades. Além disso, devido ao fato de que a pirimidina usada como um precursor tem vários derivados e, desse modo, sofre de uma grande oscilação no abastecimento e preço dos mesmos, esse método pode causar instabilidade do preço de niacina.
Adicionalmente, outros métodos para produzir ácido nicotínico de ácido quinolínico foram revelados. 0 documento de patente chinesa n° CN101353322C revela o método para síntese de ácido nicotínico com o uso de ácido quinolínico como o substrato através de descarboxilação hidrotérmica. O método para produzir ácido nicotínico precede misturando o ácido quinolínico com água aquecida deionizada na razão de 2:1 a 5:1 e então, permitindo que a mistura reaja em uma alta temperatura de 150 a 250 graus Celsius e alta pressão de 1 a 2 MPa por 5 a 60 minutos (Ind. Eng. Chem. Res. 2009, 48, 10467-10471) . Esse método tem uma vantagem no fato de que nenhum produto secundário do catalisador é produzido, embora também haja os problemas de que as condições de reação são alta temperatura e alta pressão de 150 a 250 graus Celsius e 2 MPa requerem alta energia. Todos os métodos sintéticos químicos estabelecidos usam materiais não renováveis derivados de petróleo como o material bruto, e, portanto, são amplamente influenciados por problemas ambientais ou o preço de unidade de extração de petróleo.
De modo a resolver tais problemas envolvidos nos métodos de síntese química, os métodos para produzir biologicamente ácido nicotínico por meio de materiais derivados de carboidrato renovável foram estudados. A produção biológica de ácido nicotínico foi concluída principalmente através de dois tipos de via sintética. A primeira é uma via para produzir ácido quinolínico de triptofano como material inicial e então sintetizar biologicamente ácido nicotinico do ácido quinolínico e a 5 outra é uma via para produzir ácido quinolínico a partir de ácido aspártico como material inicial e então sintetizar biologicamente ácido nicotinico do ácido quinolínico. Em geral, eucariontes sintetizam biologicamente o ácido nicotinico através da via para sintetizar ácido nicotinico a 10 partir de triptofano como o material inicial, enquanto os procariontes utilizam a via para sintetizar ácido nicotinico de ácido aspártico como o material inicial como a via principal. Ambas as vias compreendem ácido quinolínico como o intermediário e sintetizam ácido nicotinico pela ação de 15 quinolinato fosforibosiltransferase (nadC), mononucleotideo de nicotinato adenililtransferase (nadD), NAD sintetase (nadE), NMN adenililtransferase (nadR) e ácido quinolínico nicotinamidase (pncA).
O método para produção biológica de ácido 20 nicotinico que utiliza Escherichia coli recombinante ou Corynebacterium glutamicum, que produz ácido nicotinico através da via de ácido aspártico, foi relatada. Os documentos de Patente n° U.S. 6,692,946 e 6,689,587 revelam os métodos para produzir ácido nicotinico separando o gene 25 nadA e gene nadC, que codifica quinolinato sintetase e quinolinato fosforibosiltransferase, respectivamente, a partir da cepa Corynebacterium glutamicum(ATCC 13032) e então, encubando células hospedeiras que aumentam a expressão de tais genes. A quantidade de ácido nicotinico produzido 30 pelos métodos para produção biológica de ácido nicotinico conforme revelado nos ditos Documentos de Patente U.S. é muito baixa, abaixo de 100 mg/1. Considera-se que as causas dessa baixa produção incluam supressão transcricional por NadR, que é um repressor transcricional relacionado à NAD de nadB como codificação de gene para aspartato oxidase e nadA como a codificação de gene para quinolinato sintetase (Gerasimova AV (2005). J Bioinform Comput Biol3(4);1007 a 19.), inibição de retorno de aspartato oxidase e sintetase de NAD com NAD (Biol Chem Hoppe Seyler. 1990 Mar; 371(3) :239- 48), complexidade da reação que inclui as etapas por NadB, NadA, NadC, assim como NadD, NadE, NadR e PncA e similares.
Os métodos para produção biológica de ácido nicotinico têm as desvantagens de que o rendimento de produção de ácido nicotinico é muito baixo devido à inibição da expressão de enzimas envolvidas na dita biovia sintéticas, inibição de retorno e complexidade de reação.
REVELAÇÃO DA INVENÇÃO PROBLEMA TÉCNICO
Em luz dos desafios técnicos mencionados acima, os presentes inventores conduziram um estudo para resolver os problemas envolvidos na sintese quimica e métodos de produção biológica para o ácido nicotinico e para aprimorar o rendimento de produção de ácido nicotinico e assim, completar o presente método para produzir ácido nicotinico em um alto rendimento através da combinação de um método de produção biológica e um método de sintese quimica.
SOLUÇÃO PARA O PROBLEMA
O propósito da presente invenção é fornecer um método para a preparação de ácido nicotinico, que compreende a etapa de obter uma solução de cultura que contém ácido quinolinico encubando-se um micro-organismo que tem capacidade de produzir ácido quinolinico e a etapa de adicionar um ácido à solução de cultura e conduzir uma reação de descarboxilação.
EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO
Substituindo o processo de técnica anterior para preparar o ácido nicotínico por meio de síntese química com o processo para produzir ácido quinolínico por meio de fermentação e fornecendo o processo para converter ácido quinolínico em ácido nicotínico através da adição de ácido à 5 solução de cultura que contém ácido quinolínico e reação de descarboxilação, a presente invenção pode resolver os problemas envolvidos nos métodos anteriores, incluindo os produtos de catalisador secundário, a exigência de alta energia e os problemas ambientais causados pelo uso de fontes 10 não renováveis na síntese química e o baixo rendimento in produção biológica, produzindo assim o ácido nicotínico de maneira mais eficiente e amigável ao ambiente.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 mostra uma via para a preparação de 15 ácido nicotínico no método para preparar ácido nicotínico, de acordo com uma modalidade da presente invenção.
A Figura 2 mostra a construção de pPro-nadBA como plasmídeo de expressão de codificação de genes para aspartato oxidase e quinolinato sintetase.
A Figura 3 mostra o resultado de HPLC para identificar o ácido quinolínico na solução de cultura e ácido nicotínico obtido após a reação de descarboxilação da dita solução de cultura, de acordo com uma modalidade da presente invenção.
MELHOR MODO DE REALIZAR A INVENÇÃO
Em um aspecto, a presente invenção fornece um método para a preparação de ácido nicotínico que compreende a etapa de obter uma solução de cultura que contém ácido quinolínico encubando-se um micro-organismo que tem capacidade de produzir ácido quinolínico e a etapa de adicionar um ácido à solução de cultura e conduzir uma reação de descarboxilação.
Conforme usado no presente documento, "micro-organismo que tem capacidade de produzir ácido quinolínico" indica micro-organismos que podem produzir ácido quinolínico a partir de uma fonte de carbono em um meio de cultura e acumula os mesmos.
Conforme usado no presente documento, o termo "descarboxilação" indica uma reação para produzir ácido nicotínico por meio de descarboxilação do reagente, isto é, ácido quinolínico.
Em uma modalidade da presente invenção, o micro- organismo que tem capacidade de produzir ácido quinolínico pode ser o micro-organismo cuja capacidade de produzir ácido quinolínico é aprimorada através do enfraquecimento ou remoção da atividade de quinolinato fosforibosiltransferase e intensificação de aspartato oxidase e atividades de quinolinato sintetase.
Em outra modalidade da presente invenção, a quinolinato fosforibosiltransferase pode ter a sequência de aminoácido equivalente à SEQ ID NO: 21 ou uma sequência que tem uma alta homologia ao mesmo; a aspartato oxidase pode ter a sequência de aminoácido equivalente à SEQ ID NO: 19 ou uma sequência que tem uma alta homologia ao mesmo; e a quinolinato sintetase pode ter a sequência de aminoácido equivalente à SEQ ID NO: 20 ou uma sequência que tem uma alta homologia ao mesmo.
Para aprimorar a capacidade de produzir ácido quinolínico, é exigido que os micro-organismos produzam grandes quantidades de ácido quinolínico e o ácido quinolínico produzido desse modo pode ser acumulado sem ser usado em outra via. Portanto, na presente invenção, o micro- organismo que tem uma capacidade aprimorada de produzir ácido quinolínico pode ser preparado pelo modo a remover ou enfraquecer da atividade de quinolinato fosforibosiltransferase, que atua na via de decomposição de ácido quinolínico, de modo a intensificar a expressão de aspartato oxidase e quinolinato sintetase, que atuam na via sintética de ácido quinolínico, ou a combinação dos mesmos.
Em ainda outra modalidade da presente invenção, o dito enfraquecimento ou remoção de atividade de quinolinato fosforibosiltransf erase pode ser alcançado por um ou mais modo selecionado a partir do modo para substituir uma codificação de gene endógeno para quinolinato fosforibosiltransferase com um gene modificado cuja atividade de enzima é enfraquecida ou removida, do modo para substituir um promotor endógeno para o dito gene com um promotor cuja atividade é mais fraca do que a do promotor endógeno, ou do modo a apagar o dito gene do cromossomo.
Em ainda outra modalidade da presente invenção, a dita intensificação de aspartato oxidase e atividades de quinolinato sintetase podem ser alcançadas por um ou mais modo selecionados pelo modo para aumentar a número de cópia genômica de codificação de genes intracelulares para aspartato oxidase e quinolinato sintetase, pelo modo para modificar as sequências reguladoras de expressão dos ditos genes e pelo modo para substituir o dito gene com um gene modificado cuja atividade de enzima é intensificada.
Em ainda outra modalidade da presente invenção, de modo que o ácido quinolínico possa ser acumulado na solução de cultura de micro-organismos, a porção de promotor de nadB como a codificação de gene para proteína de aspartato oxidase é substituída por um promotor constitutivo, pPro, de SEQ ID NO: 16 para construir o constitutivo com capacidade de expressão nadB gene, que não é suprimido por NadR como o repressor transcricional para suprimir a expressão de nadB gene com nível de NAD intracelular, na forma de um plasmídeo e o dito plasmídeo é então introduzido nos micro-organismos para induzir a sobre-expressão de aspartato oxidase.
Em outra modalidade da presente invenção, a aspartato oxidase pode ter a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 19. A sequência de gene nadB que codifica a dita enzima pode ser obtida a partir da sequência de genoma (gi: GI:89109380) de Escherichia coli, conforme revelado em Mol Syst Biol. 2006;2:2006.0007. Epub, 21 de fevereiro de 2006, ou no banco de dados disponível do Centro Nacional de Informações de Biotecnologia (NCBI) e o Banco de dados de DNA do Japão (DDBJ) .
A aspartato oxidase tem uma atividade para realizar oxidação do ácido aspártico para ácido iminosuccinico, conforme mostrado no seguinte esquema de reação: L-Aspartato + Fumarato <=> a-Iminosuccinato + Succinato + H+ L-Aspartato + Oxigênio <=> peróxido de hidrogênio + a-Iminosuccinato + H+
Portanto, se a atividade de aspartato oxidase for intensifiçada, o acúmulo de ácido iminosuccinico como o precursor de ácido quinolinico nas células pode ser aumentado, aumentando assim a produção de ácido quinolinico.
Em ainda outra modalidade da presente invenção, de modo a aumentar o acúmulo de ácido quinolinico, o promotor da codificação de gene para proteína de quinolinato sintetase é substituído por um promotor mais forte, pCysK de SEQ ID NO: 17, para construir o constitutivo com capacidade de expressão gene nadA,que não é suprimido por NadR, como o repressor transcricional para suprimir a expressão de gene nadA com nível de NAD intracelular, na forma de um plasmídeo e o dito plasmídeo é então introduzido nos micro-organismos para induzir a sobre-expressão de quinolinato sintetase.
Em ainda outra modalidade da presente invenção, a quinolinato sintetase pode ter a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 20. A sequência de gene nadAque codifica a dita enzima pode ser obtida a partir da sequência de genoma (gi: GI: 89107601) de Escherichia coli conforme publicado em Mol Syst Biol. 2006;2:2006.0007. Epub 21 de fevereiro de 2006, ou o banco de dados disponível do Centro Nacional de Informações de Biotecnologia (NCBI) e do Banco de dados de DNA do Japão (DDBJ) .
A quinolinato sintetase tem uma atividade para sintetizar ácido quinolínico do ácido iminosuccinico, conforme mostrado no seguinte esquema de reação: oí-Ácido Iminosuccinico + Fosfato de Didroxiacetona <=> Quinolinato + Fosfato + 2HzO
Portanto, se a expressão do quinolinato sintetase de intensificação de gene ou a atividade de dita enzima for intensificada, a produção de ácido quinolínico nas células pode ser aumentada.
No micro-organismo que tem a capacidade de produzir ácido quinolínico, as atividades de aspartato oxidase e quinolinato sintetase podem ser intensificadas substituindo os promotores endógenos de codificação de genes para aspartato oxidase e quinolinato sintetase com um promotor mais forte, ou introduzindo uma mutação nos promotores para aumentar a atividade da mesma ou aumentar o número de cópia dos ditos genes, respectivamente. Para a substituição pelo dito promotor mais forte, aqueles geralmente conhecidos como os promotores mais fortes que incluem pTac, pTrc, pPro, pR, pL, pCJl, pCysK, etc., podem ser usados.
Em ainda outra modalidade da presente invenção, os promotores de genes nadB e nadA que participam na biosintese de ácido quinolínico podem ser substituídos por um promotor mais forte pPro ou pCysK para preparar cepas de micro- organismo que aumentam a expressão dos ditos genes que tem desse modo uma capacidade aprimorada para produzir ácido quinolínico. Assim como o promotor que substitui o promotor endógeno para aumentar a expressão dos ditos genes, os promotores pPro e pCysK de SEQ ID NOs: 17 e 18, respectivamente, ou uma porção dos mesmos pode ser usada.
Adicionalmente, de modo que o micro-organismo possa acumular adicionalmente ácido quinolínico, a atividade de quinolinato fosforibosiltransferase, assim como a enzima para converter ácido quinolínico em mononucleotídeo de nicotinato, que está localizada no genoma de micro-organismos que têm a capacidade de produzir ácido quinolínico, pode ser removida. Para esse propósito, nadC como a codificação de gene para quinolinato fosforibosiltransferase pode ser removida do genoma de micro-organismo por meio de recombinação homóloga. A sequência do gene nadC pode ser obtida a partir da sequência de genoma (gi: GI: 89106990) de Escherichia coli as publicada em Mol Syst Biol. 2006; 2:2006.0007. Epub 21 de fevereiro de 2006, ou do banco de dados disponível do Centro Nacional de Informações de Biotecnologia (NCBI) e do Banco de dados de DNA do Japão (DDBJ).
Em ainda outra modalidade da presente invenção, a dita fosforibosiltransferase pode ter a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 21.
A quinolinato fosforibosiltransferase tem uma atividade para sintetizar mononucleotídeo de nicotinato a partir do ácido quinolínico, conforme mostrado no esquema de reação a seguir. Portanto, se o gene que tem a dita atividade for removido ou a expressão do mesmo for enfraquecida, a produção de ácido quinolínico nas células pode ser usada. 5-Fosfo-a-D-ribose 1-difosfato + Quinolinato + 2H+ <=> CO2+ difosfato + Mononucleotídeo de nicotinato
Em ainda outra modalidade da presente invenção, os micro-organismos que têm capacidade de produzir ácido quinolínico podem ser cepas de micro-organismo procariótico e eucariótico. Os ditos micro-organismos que têm capacidade de produzir ácido quinolinico podem incluir, porém, sem limitação, aqueles que pertencem ao gênero Enterbactergenus, gênero Escherichia,gênero Erwinia,gênero Serra tia, gênero Providencia,gênero Corynebacterium ou gênero Brevibacterium.
Preferencialmente, os micro-organismos que têm capacidade de produzir ácido quinolinico podem ser aqueles que pertencem ao gênero Escherichiae mais preferencialmente, Escherichia coli.
Em ainda outra modalidade da presente invenção, a cepa variante de E. coli, TF4076 (KFCC 10718, Pedido de patente n° KR 92-8365), que produzi L-treonina pode ser usada como a cepa parental para aprimorar a capacidade de produzir ácido quinolinico. Escherichia coli TF4076 exige metionina ou é resistente a análogos de treonina (AHV: ácido α-amino-β- hidróxi valérico), análogos de lisina (AEC: S-(2-aminoetila)- L-cisteina), análogos de isoleucina (ácido a-aminobutirico), análogos de metionina (etionina), etc.
A dita cepa de Escherichia coli TF4076 pode ser modificada para intensificar as atividades de aspartato oxidase e quinolinato sintetase e para remover a atividade de quinolinato fosforibosiltransferase, preparando assim o micro-organismo que tem uma capacidade aprimorada para produzir ácido quinolinico.
Em ainda outra modalidade da presente invenção, o micro-organismo que tem capacidade de produzir ácido quinolinico pode ser Escherichia coli, que tem a via intensificada para biosintese de ácido quinolinico, através de intensificação da expressão de codificação de genes para aspartato oxidase e quinolinato sintetase e remoção e redução da atividade de quinolinato fosforibosiltransferase da cepa que produz treonina, TF4076 (KFCC 10718, Pedido de patente n° KR No. 92-8365), que tem a via intensificada para biossintese de ácido aspártico.
Em ainda outra modalidade da presente invenção, os micro-organismos que têm capacidade de produzir ácido quinolínico podem ser cepas derivadas de lisina, treonina, isoleucina ou cepas de micro-organismo que produzem metionina cuja via de biossintese de ácido aspártico é intensificada.
Uma cepa que produz ácido quinolínico, a cepa Escherichia coli CV01-0009, que é preparada através de intensificação da expressão de codificação de genes para aspartato oxidase e quinolinato sintetase e da remoção e redução da atividade de quinolinato fosforibosiltransferase de cepa Escherichia coli TF4076, foi depositada sob o Tratado de Budapeste no Centro de Cultura Coreano de Micro-organismos (KCCM, localizados em Hongjae 1-Dong, Seodaemun-Gu, Seoul, Coréia) com Adesão n° KCCM11165P em 10 de janeiro de 2011.
O método para preparar ácido nicotínico, de acordo com a presente invenção, compreende a etapa de encubar o micro-organismo que tem capacidade de produzir ácido quinolínico para obter a solução de cultura que contém ácido quinolínico.
A incubação de micro-organismos que têm capacidade de produzir ácido quinolínico pode ser concluída com o uso de um meio de cultura adequado sob condições de cultura adequadas e é conhecida no campo da técnica relevante. Tais procedimentos de incubação podem ser usados por uma pessoa versada no campo da técnica relevante e é imediatamente ajustada de acordo com o micro-organismo selecionado. Os métodos de incubação incluem, porém, sem limitação, lote, culturas continuas e de lote alimentado. Vários métodos de incubação de micro-organismos foram revelados e, por exemplo, "Biochemical Engineering"por James M. Lee, Prentice-Hall International Editions, páginas 138 a 176.
O meio de cultura a ser usado precisa cumprir os requisitos das cepas particulares de maneira adequada. As descrições de meios de cultura para vários micro-organismos devem ser constatadas no guia ["Manual of Methods for General Bacteriology"pela Sociedade Americana de Bacteriologia (Washington D.C., EUA, 1981)]. Os ditos meios de cultura que 5 contém várias fontes de carbono, fontes de nitrogênio e microelemento.
A fonte de carbono útil pode incluir açúcares e . carboidratos tais como glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, amido e celulose, óleos e gorduras, tais como oleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoim e óleo de coco, ácidos graxos tais como ácido palmitico, ácido esteárico e ácido linoleico, álcoois, tais como glicerol e etanol e I ácidos orgânicos, tais como ácido acético. Essas substâncias podem ser usadas individualmente ou na forma de uma mistura.
A fonte de nitrogênio útil pode incluir compostos orgânicos que contêm nitrogênio, tais como peptonas, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, milhocina, farinha de soja e ureia, ou compostos inorgânicos, tais como sulfato de amónio, cloreto de amónio, fosfato de amónio, 20 carbonato de amónio e nitrato de amónio. As fontes de nitrogênio podem ser usadas individualmente ou na forma de uma mistura.
A fonte de fósforo útil pode incluir fosfato de hidrogênio de potássio ou fosfato de hidrogênio de dipotássio 25 ou os sais correspondentes que contêm sódio. O meio de cultura também pode conter sais de metal tais como sulfato de magnésio ou sulfato de ferro, que são necessários para o crescimento. Por fim, substâncias essenciais de crescimento, tais como os aminoácidos e vitaminas, podem ser usadas 30 adicionalmente às substâncias mencionadas acima. Os precursores adequados também podem ser adicionados ao meio de cultura. As substâncias mencionadas podem ser adicionadas à cultura por tipo continuo ou por lote de maneira adequada durante o cultivo.
Além disso, de modo a controlar o valor de pH da cultura, os compostos básicos tais como hidróxido de sódio, hidróxido de potássio e amónia ou compostos ácidos, tais como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico, são usados de maneira eficaz. De modo a controlar o desenvolvimento de espuma, um agente anti-espuma, tal como ésteres de poliglicol de ácidos graxos, pode ser usado. De modo a manter condições aeróbicas, o oxigênio ou gás que contém oxigênio, tal como ar é introduzido na cultura. A temperatura da cultura é normalmente de 20 graus Celsius a 45 graus Celsius e preferencialmente de 25 graus Celsius a 40 graus Celsius. A cultura é continuada até que a quantidade esperada do ácido quinolinico seja formada. O objetivo é normalmente alcançado dentro um periodo de 10 horas a 160 horas.
O método para preparar ácido nicotinico, de acordo com a presente invenção, compreende a etapa de conduzir descarboxilação adicionando o ácido à solução de cultura que contém ácido quinolinico.
Mais especificamente, a solução de cultura que contém ácido quinolinico obtido da incubação do micro- organismo que tem capacidade de produzir ácido quinolinico é submetida à centrifugação ou filtração de membrana para remover os micro-organismos. Então, para acelerar a reação de descarboxilação, o ácido a fornecer grupo de hidrogênio é adicionado à solução de cultura que contém ácido quinolinico. Qualquer ácido pode ser usado sem restrição ao tipo, desde que o mesmo possa fornecer o grupo de hidrogênio à solução de cultura.
Em uma modalidade da presente invenção, a solução de cultura que contém ácido quinolinico pode ser utilizada sem purificação.
Em outra modalidade da presente invenção, os ácidos adicionados à dita solução de cultura podem ser ácido clorídrico ou ácido sulfúrico.
Em uma ainda outra modalidade da presente invenção, após a adição do dito ácido, a solução de cultura pode ter o valor de pH de 5 ou menos.
Em uma ainda outra modalidade da presente invenção, após a adição do dito ácido, a solução de cultura pode ter o • valor de pH de 2 a 3.
Em uma ainda outra modalidade da presente invenção, 10 a descarboxilação da solução de cultura pode ser conduzida em faixas de temperatura de 100 °C a 150 °C.
Em uma ainda outra modalidade da presente invenção, a descarboxilação da solução de cultura pode ser conduzida a uma temperatura de 135 °C.
Em uma ainda outra modalidade da presente invenção, a descarboxilação da solução de cultura pode ser conduzida em faixas de pressão de 0,1 MPa a 0,5 MPa.
Em uma ainda outra modalidade da presente invenção, a descarboxilação da solução de cultura pode ser conduzida em 20 uma pressão de 0,2 MPa.
Mediante uma condução da descarboxilação sob as condições de alta temperatura e de alta pressão por 1 a 3 horas após adicionar o ácido à solução de fermentação que contém ácido quinolínico, sendo que o ácido quinolínico 25 presente na solução de cultura é convertido em ácido nicotínico conforme mostrado no esquema de reação a seguir: Quinolinato + 2H+<=> CO2 + Nicotinato
0 método para preparar ácido nicotínico de acordo com a presente invenção pode ainda compreender etapas para 30 recuperar e purificar ácido nicotínico.
Na presente invenção, a recuperação de ácido nicotínico pode ser alcançada através de qualquer método convencional conforme conhecido no campo técnico ao qual a presente invenção pertence e que compreende os procedimentos para filtragem e cristalização da solução de cultura.
MODO PARA A INVENÇÃO
Doravante no presente documento, pretende-se explicar mais especificamente a presente invenção através de exemplos e exemplos experimentais. No entanto, esses exemplos são fornecidos apenas para ilustrar a presente invenção mais em detalhes e o escopo da presente invenção não é limitado por esses exemplos.
Exemplo 1. Preparação de cepa de produção de ácido quinolinico 1-1. Construção de um plasmideo para expressão de aspartato oxidase
A codificação nadB de gene para aspartato oxidase foi obtida através de PCR com o uso de DNA de cromossomo de Escherichia coli W3110 como o modelo. Com base na sequência de base para o gene nadB (Registro de NCBI N2"GI:89109380") de SEQ ID N£: 13 obtida do GenBank do Instituto Nacional de Saúde (NIH GenBank) , a região ATG e a região ORF que contêm o TAA em um gene nadB podem ser amplificadas, e os iniciadores de SEQ ID N—: 1 e 2 que têm os locais de reconhecimento de enzimas de restrição Ndel e BamHI foram sintetizados.
O PCR foi conduzido com o uso de DNA de cromossomo de Escherichia coli W3110 como o modelo e oligonucleotideos de SEQ ID N—: 1 e 2 como o iniciador. PfuUltra™ DNA polymerase (Stratagene) foi usado como a polimerase e o PCR foi conduzido repetindo-se o ciclo 30 vezes que compreende desnaturação a 96 °C por 30 segundos, uma hibridação a 50 °C por 30 segundos e uma extensão a 72 °C por 2 minutos. Assim, um gene amplificado de cerca de 1,9 kb que contém um gene nadB e os locais de reconhecimento de enzimas de restrição Ndel e BamHI foi obtido.
O gene nadA obtido através dos ditos procedimentos de PCR foi tratado com enzimas de restrição Apal e NotI, e um fragmento de promotor cysK amplificado foi tratado com Apal e BamHI. 0 nadA tratado com enzima de restrição e fragmentos de promotor de cysK foram clonados ligando-se ao vetor pPro-nadB 20 tratado com NotI e BamHI obtido do 1-1 acima para finalmente construir um vetor recombinante pPro-nadBA no qual o gene nadB, cuja expressão é controlada sob um promotor pPro como o promotor constitutivo, e o gene nadA cuja expressão é controlada por um promotor de gene cysK, são clonados. 0 25 pPro-nadBA construído tem a sequência de SEQ ID N°: 18. A Figura 2 mostra a construção de pPro-nadBA como o plasmídeo de expressão de codificação de genes para aspartato oxidase e para quinolinato sintetase. 1-3. Construção de uma cepa deficiente de quinolinato fosforibosiltransferase
No presente exemplo, o gene nadC envolvido na via de decomposição de ácido quinolínico foi obtido através de PCR com o uso de DNA de cromossomo de Escheríchia coli TF4076 como o modelo. Com base nas informações de sequência de base do gene nadC (Registro de NCBI Nº "GI:89106990") obtido do GenBank do Instituto Nacional de Saúde (NIH GenBank), os iniciadores de SEQ ID NOS: 7 e 8 para amplificar a região a jusante de um gene nadC, os iniciadores de SEQ ID NOS: 9 e 10 para amplificar as regiões a montante e a jusante de um gene nadC e loxpCm, e os iniciadores de SEQ ID N°S: 11 e 12 para amplificar a região a montante de um gene nadC, foram sintetizados.
Um PCR foi conduzido com o uso de DNA de cromossomo de Escherichia coli TF4076 como o modelo e oligonucleotideos de SEQ ID N—: 7 e 8, e 11 e 12 como o iniciador para amplificar as regiões a jusante e a montante de um gene nadC de 0,5 kb e 0,3 kb, respectivamente. Além disso, um PCR foi conduzido com o uso do vetor de plasmideo que contém loxpCm, um vetor pLoxpCat2 como o modelo, e oligonucleotideos de SEQ ID N—: 9 e 10 como o iniciador para amplificar um gene loxpCm que tem a sequência homóloga a um gene nadC em ambas as extremidades de 1,0 kb. PfuUltra™ DNA polymerase (Stratagene) foi usado como a polimerase, e um PCR foi conduzido repetindo-se o ciclo 30 vezes que compreende uma desnaturação a 96 °C por 30 segundos, uma hibridação a 53°C por 30 segundos e uma extensão a 72 °C por 1 minuto. Então, um fragmento a montante de nadC, um fragmento a jusante de nadC e uma seção loxpCm obtidos a partir das ditas reações de PCR foram usados como modelo para conduzir um PCR sob condições de PCR que incluem 10 repetições do ciclo que compreende uma desnaturação a 96 °C for 60 segundos, uma hibridação a 50 °C for 60 segundos e uma extensão a 72 °C por 1 minuto, e 20 repetições do dito ciclo após uma adição dos iniciadores de SEQ ID N—: 7 e 12. Assim, um cassete deficiente de nadC que contém a região a montante de uma região a jusante loxpCm de um gene nadC de um gene nadC de 1,8 kb foi obtido.
Escherichia coli TF4076 que contém pKD46 como um vetor de expressão recombinase lambda vermelho foi transformado com o cassete deficiente de nadC por meio de eletroporação, e então a cepa foi untada em um meio de plaqueamento de LB (Luria-Bertani) (10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura, 10 g de NaCl e ágar a 1,5%/1) que contém cloramfenicol como o marcador seletivo e incubado a 37 °C de um dia para o outro para selecionar cepas de micro-organismo que exibem uma resistência contra cloramfenicol.
As cepas selecionadas como o modelo foram diretamente sujeitadas a PCR com o uso dos iniciadores de SEQ ID N-: 7 e 12 sob as mesmas condições, e então o apagamento de um gene nadC foi confirmado identificando-se o tamanho de gene em uma cepa selvagem e uma cepa deficiente em nadC para ser 1,0 kb e 1,8 kb, respectivamente, em 1,0% de gel de agarose. Além disso, um gene nadC foi também removido de E. coli W3110 como a cepa selvagem de acordo com o mesmo método conforme acima. 1-4. Preparação de uma cepa de produção de ácido quinolínico
O plasmídeo pPro-nadBA construído nos exemplos 1 a 3 foi usado através de um método de CaCl2 para transformar uma cepa TF4076ΔnadCe W311OΔnadC,as construído nos exemplos 1 a 3, que foram então untados em um meio de plaqueamento de LB-Km {10 g/1 de extrato de levedura, 5 g/1 de NaCl, 10 g/1 de triptona, 25 AP/l de canamicina) e incubado a 37 °C de um dia para o outro. Então, 10 colônias resistentes a canamicina foram selecionadas. A cepa preparada para produzir ácido quinolinic© assim construída foi designada como CV01-0009.
Exemplo 2. Preparação de ácido nicotínico 2-1. Produção de ácido quinolínico
A cepa que produz ácido quinolínico conforme preparado no exemplo 1 foi incubada em um meio de plaqueamento de LB-Km dentro do incubador a 37 °C de um dia para o outro para obter uma única colônia, que foi então inoculada em 25 ml de um meio de titulação de ácido quinolínico por 1 laço de platina e incubada a 250 rpm a 37 °C de 24 a 72 horas. A tabela 1 a seguir mostra a composição do meio para produzir ácido quinolínico. Tabela 1
Figure img0001
Um ácido quinolínico na solução de cultura foi analisado por HPLC. 0 resultado de análise é mostrado na tabela 2 a seguir e indica a habilidade da cepa para produzir ácido quinolínico. Tabela 2
Figure img0002
Conforme mostrado na tabela 2, quando a expressão de codificação de genes para aspartato oxidase e para quinolinato sintetase foi intensificada através de uma substituição de promotor TF4076 derivado de uma cepa de produção de treonina e uma cepa W3110 como E. coli selvagem, um ácido quinolinico não foi produzido em ambas as cepas. A razão para o mesmo é que todo o ácido quinolinico produzido é consumido na via de sintese de NAD devido à atividade de 10 quinolinato fosforibosiltransferase.
Ao contrário, a cepa W311θΔnadC,que foi produzida removendo-se quinolinato fosforibosiltransferase para inibir a decomposição de ácido quinolinico produzido em células com quinolinato fosforibosiltransferase e que intensifica a 15 expressão de aspartato oxidase e de quinolinato sintetase, produziu ácido quinolinico em uma quantidade de 0,4 g/1. E a TF4076ΔnadCderivada de uma cepa de produção de treonina, que foi produzida removendo-se quinolinato fosforibosiltransferase para inibir a decomposição de ácido quinolínico produzido em células com quinolinato 5 fosforibosiltransferase e que intensifica a expressão de aspartato oxidase e de quinolinato sintetase, produziu ácido quinolínico em uma quantidade de 5,5 g/1, que é 13 vezes maior do que a cepa selvagem W3110ΔnadC,devido à via biossintética intensificada para ácido aspártico, que é 10 inerente na própria cepa. Ou seja, foi confirmado que a cepa modificada pela combinação de uma intensificação da expressão de aspartato oxidase e de quinolinato sintetase, pela remoção da atividade de quinolinato fosforibosiltransferase, e por uma intensificação da via biossintética para produzir ácido 15 aspártico pode produzir ácido quinolínico a uma eficiência mais alta do que as cepas existentes. 2-2. Produção de ácido nicotinico através de descarboxilação
Uma reação de descarboxilação foi conduzida para 20 converter ácido quinolínico na solução de cultura uma cepa que produz ácido quinolínico, CV02-0009, que contém 5,5 g/1 de ácido quinolínico em ácido nicotinico sob condições de alta temperatura e alta pressão. Primeiro, a solução de cultura que contém ácido quinolínico foi centrifugada de 25 3.000 a 4.000 rpm por 10 a 30 minutos para remover células na solução de cultura. O sobrenadante que contém ácido quinolínico conforme obtido após uma centrifugação foi usado como a amostra para uma reação de descarboxilação. A reação de descarboxilação foi realizada sob as condições de 135 °C e 0,2 MPa por 3 horas e as condições da amostra conforme usada são conforme mostrado na tabela 3 a seguir. O ácido quinolínico compreendido em água deionizada como o experimento para o grupo de controle foi o padrão disponível de Sigma-Aldrich e o pH da solução aquosa de ácido quinolínico foi titulado com hidróxido de sódio, água de amónia, ácido clorídrico ou ácido sulfúrico. A tabela 3 a seguir mostra a taxa de conversão de ácido quinolínico em ácido nicotínico através da reação sob condições de alta temperatura e alta pressão. A Figura 3 mostra o resultado de HPLC para identificar ácido quinolínico na solução de cultura e ácido nicotínico obtido após a reação de descarboxilação da dita solução de cultura. Tabela 3
Figure img0003
O experimento para converter ácido quinolínico em ácido nicotínico com o uso de água deionizada como a solução aquosa sob as condições de temperatura e de pressão que incluem 135 °C e 0,2 MPa, que são menores do que condições de 150 a 250 °C e de 2 MPa conforme revelado no documento de patente n2 CN101353322C de referência anterior foi conduzido por 3 horas para obter o resultado conforme mostrado na tabela 3 acima. Isso demonstra que o ácido quinolinico foi convertido em ácido nicotinico em até 95% mesmo sob condições de menor temperatura e pressão do que as mesmas reveladas na dita referência anterior.
O experimento foi conduzido para converter ácido quinolinico em ácido nicotinico com o uso do mesmo método revelado na referência anterior com a exceção de que a solução de cultura de fermentação foi usada como a solução aquosa de ácido quinolinico. Como resultado, pode ser identificado que o ácido quinolinico foi convertido em ácido nicotinico em água deionizada, mas não convertido em ácido nicotinico na solução de cultura. A razão é que vários ions presentes na solução de cultura impedem a aproximação de um ion de hidrogênio ao grupo carboxila e o movimento de um ion de hidrogênio como as exigências para uma descarboxilação de ácido quinolinico. A fim de solucionar esse problema, pretende-se confirmar se a reação de descarboxilação ocorre ou não na solução de cultura de fermentação que contém ácido quinolinico através do método para aumentar as chances para colocar em contato um ion de hidrogênio com ácido quinolinico na solução de cultura de fermentação elevando-se o nivel de um ion de hidrogênio. Para essa finalidade, o valor de pH da solução de cultura que contém ácido quinolinico foi titulada de pH 6 a 7 para a faixa de pH 2 a 3 na qual um ion de hidrogênio pode ser mantido em nivel alto. A dita titulação foi conduzida com o uso de ácido clorídrico ou ácido sulfúrico.
Como resultado, a taxa de conversão de ácido quinolinico em ácido nicotinico foi de 85% a 99% quando o valor de pH da solução de cultura foi titulado de pH 2 a 3 com a adição de ácido clorídrico, e 75% a 90% com a adição de ácido sulfúrico. De acordo com o mesmo, o ácido nicotinico pode ser produzido de modo eficiente adicionando-se o ácido e descarboxilando-se sob condições brandas de temperatura e de pressão conforme comparado às referências anteriores, sem uma purificação adicional da solução de cultura obtida após a incubação das cepas de micro-organismo.
TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICRO-ORGANISMOS PARA OS PROPÓSITOS DE PROCESSOS DE PATENTES
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Claims (14)

1. MÉTODO PARA A PREPARAÇÃO DE ÁCIDO NICOTINICO, caracterizado por compreender as etapas de: a) obter uma solução de cultura contendo ácido quinolinico, incubando-se um micro-organismo que tem uma habilidade para produzir ácido quinolinico; e b) adicionar um ácido à solução de cultura para descarboxilar o ácido quinolinico, convertendo, desse modo, o ácido quinolinico em ácido nicotinico.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo micro-organismo dever ter sua atividade de quinolinato de fosforibosiltransferase enfraquecida ou removida e ter suas atividades de aspartato oxidase e quinolinato sintetase intensificadas.
3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo enfraquecimento ou a remoção de atividade de quinolinato fosforibosiltransferase ser alcançada por um ou mais meios selecionados dentre o meio para substituir um gene que codifica a fosforibosiltransferase de quinolinato com um gene modificado cuja atividade de enzima é enfraquecida ou removida, o meio para substituir um promotor endógeno para o gene com um promotor cuja atividade é mais fraca do que aquela do promotor endógeno, e o modo de eliminar o gene de um cromossomo.
4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pela intensificação das atividades de aspartato oxidase e quinolinato sintetase serem alcançadas por um ou mais meios selecionados dentre o meio aumentar o número de cópias genômicas de genes intracelulares que codificam aspartato oxidase e quinolinato sintetase, o meio para modificar as sequências regulatórias de expressão dos genes e o meio para substituir os genes por genes modificados cuja atividade enzimática é intensificada.
5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo microrganismo ser uma cepa que pertence ao gênero Escherichia.
6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo microrganismo ser Escherichia coli.
7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo microrganismo ser Escherichi a coli depositado sob o número de acesso KCCM11165P.
8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo ácido adicionado à solução de cultura ser ácido clorídrico ou ácido sulfúrico.
9. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, após a adição de um ácido, a solução de cultura ter o valor de pH de 5 ou menos.
10. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, na etapa b) , o ácido quinolínico ser descarboxilado a uma faixa de temperatura de 100°C a 150°C.
11. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por, na etapa b) , o ácido quinolínico ser descarboxilado a uma temperatura de 135°C.
12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, na etapa b) , o ácido quinolínico ser descarboxilado a uma faixa de pressão de 0,1 MPa a 0,5 MPa.
13. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por, na etapa b) , o ácido quinolínico ser descarboxilado a uma pressão de 0,2 MPa.
14. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender, ainda, a etapa de recuperar e purificar ácido nicotínico.
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Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 16/01/2012, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS.