KR20120111807A

KR20120111807A - 에세리키아 속 균주에서 유래된 프락토키나제 유전자가 도입된 코리네박테리움 속 균주 및 상기 균주를 이용하여 ｌ-아미노산을 생산하는 방법

Info

Publication number: KR20120111807A
Application number: KR1020110030392A
Authority: KR
Inventors: 배현원; 김형준; 문준옥; 장재우; 김종철; 김태한; 성진석; 이경한; 김대철; 김효진; 배현애; 임상조
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2011-04-01
Filing date: 2011-04-01
Publication date: 2012-10-11
Also published as: CN103476922A; BR112013025358A2; JP2014510535A; EP2694638B1; WO2012134253A3; KR101294935B1; JP5814459B2; US20140099680A1; WO2012134253A2; CN106867951A; US9267161B2; EP2694638A2; EP2694638A4; BR112013025358B1

Abstract

본 발명은 에세리키아 속 균주에서 유래된 프락토키나제 유전자가 도입되어 프락토즈를 6-인산화-프락토즈로 전환시키기에 충분한 활성을 나타낼 수 있는 프락토키나제가 발현됨으로써, 에너지의 불필요한 소모를 방지할 수 있도록 형질전환된 코리네박테리움 속 균주 및 상기 균주를 이용하여 L-아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 형질전환된 코리네박테리움 속 균주는, 에세리키아 유래의 프락토키나제 유전자로부터 발현되는 프락토키나제에 의하여 프락토즈의 대사시 에너지의 불필요한 소모를 방지함으로써, 보다 경제적으로 L-아미노산을 생산할 수 있으므로, L-아미노산의 효과적인 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

에세리키아 속 균주에서 유래된 프락토키나제 유전자가 도입된 코리네박테리움 속 균주 및 상기 균주를 이용하여 Ｌ-아미노산을 생산하는 방법{Corynebaterium sp. Transformed with a Fructokinase Gene Derived from Escherichia sp. And Process for Preparing L-amino acid using the same}

본 발명은 에세리키아 속 균주에서 유래된 프락토키나제 유전자가 도입된 코리네박테리움 속 균주 및 상기 균주를 이용하여 L-아미노산을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 에세리키아 속 균주에서 유래된 프락토키나제 유전자가 도입되어 프락토즈를 6-인산화-프락토즈로 전환시키기에 충분한 활성을 나타낼 수 있는 프락토키나제가 발현됨으로써, 에너지의 불필요한 소모를 방지할 수 있도록 형질전환된 코리네박테리움 속 균주 및 상기 균주를 이용하여 L-아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

코리네박테리움 속 균주(Corynebacteria sp.), 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)은 L-아미노산 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성의 미생물이다. L-라이신과 같은 L-아미노산은 동물사료, 사람의 의약품 및 약제산업에 사용되고 있으며 코리네박테리아 균주를 이용한 유전공학적인 방법으로 대량생산되고 있으나, 산업의 발달에 따라 더욱 많은 량의 L-아미노산의 공급이 요구되고 있기 때문에, 코리네박테리아 균주를 개량하여 보다 효과적이고, 경제적으로 L-아미노산을 생산할 수 있는 방법을 개발하기 위한 노력이 계속되고 있다.

일반적으로, 가장 널리 사용되는 방법은 코리네박테리아 균주에 L-아미노산 생합성-관련 유전자와 같은 특정한 DNA를 도입하거나 또는 그의 활성을 향상시킴으로써, 코리네박테리아의 L-아미노산 생산성을 증대시키는 방법이다. 예를 들면, 대한민국 특허공개 제2001-51915호 및 제2001-62279호에는 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 유래된 sucC 및 sucD 유전자 및 zwa2 유전자를 감쇠발현시켜 코리네형 박테리아로부터 L-아미노산의 생산성을 증대시키는 방법이 개시되어 있고, 대한민국 특허공개 제 2001-62272호에는 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 유래된 zwa1 유전자를 과발현시킴으로써 코리네형 박테리아로부터 L-아미노산의 생산성을 증대시키는 방법이 기술되어 있으며, 일본 특허공고번호 제1995-121228호에는 에세리키아 콜리 (Escherichia coli) 유래의 시트르산 신타제를 코딩하는 유전자를 도입하는 방법이 개시되어 있다.

한편, 상기 코리네박테리움 속 균주는 탄소원으로서 수크로즈(sucrose), 글루코즈(glucose) 및 프락토즈(fructose)를 모두 사용할 수 있다. 이중에서 상기 수크로즈는 포스포트란스퍼라제 시스템(PTS)에 의해 인산화되어 세포 내로 유입되고, 인산화된 수크로즈는 인버타아제(invertase)에 의해 곧바로 분해되어 6-인산화-글루코즈와 프락토즈를 생성한다. 상기 생성된 6-인산화-글루코즈는 바로 해당과정(glcolysis)에 이용되지만, 인산화되지 못한 프락토즈는 세포 밖으로 배출된 후, 포스포트란스퍼라제 시스템에 의해 인산화된 후에 다시 세포내로 유입되어 해당과정에 이용된다. 이처럼 프락토즈는 탄소원으로서 사용되기 위하여 상대적으로 복잡한 경로를 거치게 되는데, 이러한 현상이 발생하는 원인은 코리네박테리움 속 균주가 프락토키나제(fructose kinase) 활성을 가지지 않기 때문인 것으로 분석되고 있다(Appl Environ Microbiol.(1996) 62:3878-3880). 단적으로, 프락토키나제를 발현하는 박테리아에서는, 수크로즈가 인버타아제에 의해 6-인산화-글루코즈와 프락토즈로 분해된 후, 프락토키나제에 의해 프락토즈가 인산화되고, 6-인산화-글루코즈와 인산화된 프락토즈가 해당과정에 이용된다.

이처럼, 프락토즈를 코리네박테리움 속 균주의 배양시 탄소원으로 이용할 경우, 복잡한 경로를 거치면서 에너지의 불필요한 소모가 발생한다는 문제점이 있기 때문에, 이를 극복하기 위한 다양한 연구가 수행되고 있다. 예를 들어, 본 출원인은 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) 또는 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilus)로부터 유래하는 프락토키나제 유전자를 코리네박테리움 속 균주에 도입하여 형질전환 균주를 제조하고, 이를 이용하여 L-라이신을 제조하는 방법을 개발하였다(대한민국 등록특허 제564805호). 그러나, 후속 연구를 통하여, 상기 프락토키나제 유전자가 도입되어 형질전환된 코리네박테리움 속 균주는 발현되는 프락토키나제의 활성이 매우 낮아, 수크로즈를 탄소원으로 이용하여 상기 균주를 배양할 경우, 수크로즈에서 유래되는 프락토즈의 생성량 중에서 일부만이 6-인산화-프락토즈로 전환되고, 나머지 프락토즈는 야생형 균주에서와 마찬가지로 세포 밖으로 배출된 후, 포스포트란스퍼라제 시스템에 의해 인산화된 후에 다시 세포내로 유입됨을 확인하여, 프락토키나제 유전자를 도입한 의도가 충분히 반영되지 못한다는 단점이 있음을 알 수 있었다. 따라서 코리네박테리움 속 균주에서 프락토즈를 6-인산화-프락토즈로 전환시키기에 충분한 활성을 나타낼 수 있는 다른 프락토키나제 유전자를 탐색할 필요성이 제기되었다.

상기, 프락토키나제 유전자는 수크로즈 자화능 부여를 위한 수크로즈 유입 및 분해 유전자에 관련된 연구의 결과로서 밝혀져 있는데, 주로 살모넬라(Salmonella), 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae) 및 어위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora)에 존재하는 scr 레귤론(J. Bacteriol., 151:68-76, 1982; Mol. Microbiol., 2:1-8, 1988; J. Bacteriol., 173:7464-7470, 1991; J. Gen. Microbiol., 134:1635-1644, 1988; J. Bacteriol., 182:5351-5358, 2000; USP 7,179,623), 에세리키아 속 균주로부터 유래된 csc 레귤론(Appl. Environ. Microbiol., 58:2081-2088, 1992; USP 6,960,455), 그람 양성 미생물인 스트렙토코코스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 유래의 scr 레귤론과 sac 오페론(J. Bacteriol., 171:263-271, 1989) 등이 밝혀져 있다. 이중에서, 에세리키아 속 균주로부터 두 종류의 프락토키나제 유전자(cscK 및 mak)가 발견되었는데, 상기 cscK는 csc 레귤론에 속하는 프락토키나제 유전자로서 cscB(proton symport-type sucrose permease) 및 cscA(sucrose hydolase)와 함께 수크로즈 대사에 관련되는 것으로 알려져 있고(J. Bacteriol., 184: 5307-5316, 2002), 상기 mak는 만노키나제를 코딩하는 유전자로서, 만노오즈, 프락토즈, 글루코즈 등을 포함한 헥소스(hexose)를 6-포스포-에스터(6-phospho-ester) 형태로 전환해주는 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다(Mol. Microbiol., 5:2913-2922, 1991).

이에, 본 발명자들은 에세리키아의 프락토키나제 유전자(cscK 및 mak)를 분리하여 이를 코리네박테리움 균주에 형질전환시켜 아미노산 생산능이 개선된 균주를 제공할 수 있게 됨으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 주된 목적은 에세리키아 속 균주에서 유래된 프락토키나제 유전자가 도입되어 프락토즈를 6-인산화-프락토즈로 전환시키기에 충분한 활성을 나타낼 수 있는 프락토키나제가 발현됨으로써, 에너지의 불필요한 소모를 방지할 수 있도록 형질전환된 코리네박테리움 속 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환된 코리네박테리움 속 균주를 배양하고, 이로부터 L-아미노산을 회수하는 단계를 포함하는 L-아미노산의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환된 코리네박테리움 속 균주를 수크로즈를 탄소원으로 포함하는 배지에서 배양하고, 이로부터 L-아미노산을 회수하는 단계를 포함하는 L-아미노산의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시양태에 의하면, 본 발명은 에세리키아 속 균주에서 유래된 프락토키나제 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 발현단위를 포함하는 L-아미노산 생산용 코리네박테리움 속 균주를 제공한다. 이때, 상기 프락토키나제 유전자는 특별히 이에 제한되지 않으나, cscK 또는 mak를 사용함이 바람직하고, 가장 바람직하게는 cscK를 사용한다. 본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 cscK는 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열을 갖고, 상기 mak는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

또한, 상기 유전자 발현단위는 벡터에 작동가능하게 연결되어 상기 코리네박테리움 미생물에 형질도입되어 포함되거나 상기 코리네박테리움 미생물의 염색체 내에 삽입되어 포함됨이 바람직하고, 상기 유전자는 개시코돈의 상류에 연결된 프로모터에 의해 과발현되도록 작동가능하게 연결됨이 바람직하다.

상기 유전자의 상류에 위치한 본래의 프로모터 대신 이종 프로모터가 연결될 수도 있는데, 상기 이종 프로모터의 예로는 pcj7 프로모터, lysCP1 프로모터, EF-Tu 프로모터, groEL 프로모터, aceA 프로모터, aceB 프로모터 등이 있으며, 코리네박테리움 유래의 프로모터인 pcj7 프로모터 또는 lysCP1 프로모터를 사용함이 바람직하고, 가장 바람직하게는 pcj7 프로모터를 사용할 수 있다.

본 발명의 “발현단위”는 프로모터와 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된 단편을 의미하며, 이에 3'-UTL, 5'-UTL, poly A tail 등이 추가로 포함될 수도 있다. 본 발명에서 용어 “발현단위”는 “발현카세트”와 혼용될 수 있다.

본 발명의 “pcj7 프로모터”는 코리네박테리움 암모니아게네스 및 에세리키아에서 발현가능하고, 우수한 프로모터 활성을 나타내며, 코리네박테리움 글루타미쿰에서도 역시 우수한 프로모터 활성을 나타내는 프로모터를 의미한다(대한민국 등록특허 제0620092호).

본 발명의 “lysCP1 프로모터”는 아스파테이트 키나제 및 아스파테이트 세미알데히드 디히드로게나제를 암호화 하는 유전자의 프로모터 부위 염기서열 치환을 통해 개량한 프로모터로서 아스파테이트 키나제 유전자의 발현량 증대를 통해 당 효소의 활성을 야생형 대비 약 5배 정도로 향상시킬 수 있는 강력한 프로모터를 의미한다(WO 2009/096689).

본 발명에서 상기 프락토키나제 유전자가 도입될 수 있는 코리네박테리움 속 균주는 코리네박테리움 속에 속하고, L-아미노산 생산능을 갖는 모든 균주를 포함하는데, 상기 균주는 특별히 이에 제한되지 않으나, 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum)(ATCC 13032), 코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes) (FERM BP-1539), 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum)(ATCC 14067), 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium fermentum)(ATCC 13869) 등을 사용함이 바람직하고, 보다 바람직하게는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) KFCC10881(대한민국 등록특허 제0159812호), KFCC-11074, KFCC110011을 사용할 수 있다.

본 발명의 "형질전환"이라는 용어는 상기 프락토키나제 유전자를 숙주세포인 코리네박테리움 속 균주 내로 도입하여 상기 숙주세포 내에서 발현될 수 있도록 하는 전반적인 행위를 의미한다. 이때, 상기 프락토키나제 유전자는 프락토키나제를 코딩할 수 있는 폴리뉴클레오티드로서 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 유전자는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로도 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 유전자는, 자체적으로 상기 유전자의 발현에 필요한 모든 요소(element)를 포함하는 폴리뉴클레오티드 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포 내로 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 유전자에 작동 가능하게 연결된 프로모터, 전사종결 신호, 리보좀 결합 부위 및 번역 종결 신호를 포함한다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터의 형태일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 그 자체 또는 폴리뉴클레오티드 구조체의 형태로 숙주세포로 도입되어, 숙주세포의 발현에 필요한 서열과 작동가능하게 연결되는 것일 수도 있다.

한편, 본 발명의 다른 실시양태에 의하면, 본 발명은 상기 에세리키아 속 균주에서 유래된 프락토키나제 유전자가 도입되어 형질전환된 코리네박테리움 속 균주를 배양하는 단계; 및, 상기 배양물로부터 L-아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, L-아미노산의 제조방법에 관한 것이다.

이때, L-아미노산은 모든 형태의 L-아미노산이 될 수 있고, 바람직하게는 L-라이신, L-트레오닌 또는 L-글루타메이트가 될 수 있다.

상기 코리네박테리움 종 미생물의 배양은 적당한 배지에서 당업계에서 알려진 다양한 배양 방법으로 수행될 수 있다(Chmiel, Bipprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik ,Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991; Storhas, Bioreaktoren und periphere Einrichtungen, Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994). 상기 배양 방법의 예에는, 회분식, 연속식 및 유가식 배양이 포함된다. 상기 유가식 배양에는 주입 배치 및 반복 주입 배치 배양이 포함되나, 여기에 한정되는 것은 아니다.

아울러, 배양에 사용될 수 있는 배지는 배양 방식과 균주에 따라, 당업계에 알려진 적당한 배지가 선택될 수 있다("Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., 미국, 1981). 본 발명에서 사용되는 배지는 다양한 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 코리네박테리움 미생물 배양을 위한 배지에서 탄소원으로는 수크로즈, 글루코즈, 프락토즈, 지방, 지방산, 알코올, 유기산 등을 모두 사용할 수 있다. 특히, 본원 발명의 코리네박테리움 미생물은 프락토키나제 활성을 가지므로, 인산화된 수크로즈의 분해를 통해 생성된 프락토즈를 세포 밖으로 배출 후 재유입시키는 과정을 거치지 않고, 세포 내에서 곧바로 프락토키나제에 의해 프락토즈가 인산화 되어 해당과정에 이용될 수 있으므로, 기존의 코리네박테리움 미생물보다 수크로즈 이용성이 더욱 증가할 수 있다. 이에, 사용될 수 있는 탄소원의 구체적인 예에는, 수크로즈를 다량으로 포함한 당밀, 글루코즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유와 같은 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤 및 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함되며, 적정량의 탄소원은 다양하게 이용될 수 있다. 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원이 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서, 인산이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 또한, 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있다. 그외에, 아미노산, 비타민, 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황산과 같은 화합물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배양물의 호기상태를 유지하기 위하여, 배양물내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20 ℃ 내지 45 ℃, 바람직하게는 25 ℃ 내지 40 ℃이다. 배양 기간은 원하는 L-아미노산의 생성량이 얻어질 때까지 계속할 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 160 시간이다.

배양물로부터의 L-아미노산의 분리는 당업계에 알려진 통상적인 방법에 의하여 분리될 수 있다. 이러한 분리 방법에는, 원심분리, 여과, 이온교환크로마토그래피,및 결정화 등의 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을, 이온교환크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있다.

본원의 다른 양태로서, 상기 기술된 코리네박테리움 속 균주를 수크로즈를 포함하는 배지에서 배양하는 단계, 및 상기 배양물로부터 L-아미노산을 분리하는 단계를 포함하는, L-아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다. 이때, 상기 L-아미노산 생산용 코리네박테리움 속 균주에 의하여 생산되는 L-아미노산은 특별히 이에 제한되지 않으나, L-라이신, L-트레오닌 또는 L-글루타메이트일 수 있다.

본 발명의 일 실시양태로서, 상기 L-라이신을 생산하는 방법은 상기 기술된 코리네박테리움 속 균주를 수크로즈를 포함하는 배지에서 배양하는 단계, 및 상기 배양물로부터 L-아미노산을 분리하는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 실시양태로서, 상기 L-트레오닌을 생산하는 방법은 cscK 프로모터가 연결된 프락토키나제 유전자 cscK를 포함하는 발현벡터와 트레오닌 생합성 및 배출관련 유전자를 포함하고 있는 플라스미드 벡터를 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881에 도입하여 형질전환 균주를 수득하고 이를 배양한 다음, 상기 배양물로부터 L-트레오닌을 회수하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 cscK 프로모터가 연결된 프락토키나제 유전자 cscK를 포함하는 발현벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나 pDZTn-pcj7_cscK 또는 pDZTn-lysCP1_cscK을 사용함이 바람직하고, 상기 트레오닌 생합성 및 배출관련 유전자를 포함하고 있는 플라스미드 벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, pECCG117-homthrBCE를 사용함이 바람직하다.

본 발명의 또 다른 실시양태로서, 상기 L-글루타메이트를 생산하는 방법은 상기 cscK 프로모터가 연결된 프락토키나제 유전자 cscK를 포함하는 발현벡터를 글루타메이트 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KTCC10774에 도입하여 형질전환 균주를 수득하고, 이를 배양한 다음, 상기 배양물로부터 L-글루타메이트를 회수하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 cscK 프로모터가 연결된 프락토키나제 유전자 cscK를 포함하는 발현벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, pDZTn-pcj7_cscK 또는 pDZTn-lysCP1_cscK를 사용함이 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 에세리키아에서 유래된 프락토키나제 유전자인 cscK 또는 mak이 도입된 경우, 종래의 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 유래의 프락토키나제 유전자인 CFK가 도입된 경우(대한민국 등록특허 제0564805호) 보다도 높은 수준으로 L-라이신을 생산할 수 있고, 특히 프락토키나제 유전자인 cscK를 자체의 프로모터가 아닌 외래의 프로모터인 pcj7 또는 lysCP1와 연결하여 도입할 경우, 그의 효과가 더욱 향상됨을 확인할 수 있었다(표 1). 또한, 프로모터인 pcj7와 연결된 프락토키나제 유전자 cscK가 도입된 형질전환 균주를 수크로즈를 탄소원으로 포함하는 배지에서 배양할 경우, 배지로 수크로즈의 분해산물인 프락토즈가 방출되지 않아, 배지에 존재하는 수크로즈를 세포내에서 분해하여 생성한 프락토즈를 모두 인산화시켜서, 해당과정에 이용되게 할 수 있게 함을 알 수 있었다(도 3). 뿐만 아니라, 프락토키나제 유전자가 도입되지 않은 경우에 비하여, 프락토키나제 유전자가 도입된 경우에는 프락토키나제의 활성도가 1.95 내지 4.24배 증가하고, 프락토키나제 유전자 중에서도 cscK가 도입된 경우에 종래의 프락토키나제 유전자가 도입된 경우 보다도 프락토키나제의 활성도가 1.80 내지 2.16배 증가됨을 확인할 수 있었다(표 3).

이러한 에세리키아에서 유래된 프락토키나제 유전자가 도입된 형질전환 균주는 단순히 L-라이신의 생산성을 증대시키는 것이 아니라, 다른 L-아미노산인 L-트레오닌(표 4) 및 L-글루타메이트(표 5)를 생산할 경우에도 그의 생산성을 증대시킬 수 있으므로, 본 발명의 에세리키아에서 유래된 프락토키나제 유전자가 도입된 형질전환 균주는 전반적인 L-아미노산의 생산에 활용될 수 있음을 확인하였다.

이에, 본 발명자들은 가장 효과가 우수한 pDZTn-pcj7_cscK를 형질전환하여 얻은 형질전환체(KFCC-10881-Pcj7_cscK)를 Corynebacterium glutamicum CA01-2012로 명명하고, 2011년 3월 28일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture center of Microorganisms, 이하, “KCCM”으로 약칭함)에 수탁번호 KCCM11183P로 기탁하였다.

본 발명의 형질전환된 코리네박테리움 속 균주는, 에세리키아 유래의 프락토키나제 유전자로부터 발현되는 프락토키나제에 의하여 프락토즈의 대사시 에너지의 불필요한 소모를 방지함으로써, 보다 경제적으로 L-아미노산을 생산할 수 있으므로, L-아미노산의 효과적인 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명의 발현벡터 pDZTn-pcj7_cscK의 유전자 지도를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 발현벡터 pDZTn-lysCP1_cscK의 유전자 지도를 나타낸다.
도 3은 프락토키나제 유전자가 도입되어 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 배양하고, 배지내에 존재하는 수크로즈 및 프락토즈의 양을 정량한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 발현벡터 pECCG117-homthrBC의 유전자 지도를 나타낸다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 에세리키아 유래 프락토키나제 유전자 획득 및 벡터 제작

에세리키아 유래의 프락토키나제 유전자의 염기서열은 이미 명백하게 밝혀져 있으며 공개되어 있다. 미국국립보건원 진뱅크 (NIH GenBank)로부터 에세리키아 콜리 (Echerichia coli) EC3231 (등록번호 X81461)로부터 cscK 유전자 (서열번호 17) 정보와 W3110 (등록번호 AC000091)으로부터 mak 유전자 (서열번호 18) 정보를 확보하였다.

보고된 염기서열에 근거하여 5’말단에 EcoRⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머와 3’ 말단에 SpeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머를 합성하고, 미국생물자원센터 (American Type Culture Collection)로부터 구매한 에세리키아 콜리 W 균주 (ATCC9637)의 염색체를 주형으로 한 PCR 법을 통하여 프로모터 부위를 포함한 약 1200 bp의 cscK 유전자 (서열번호 1과 2의 프라이머 이용) 및 mak 유전자(서열번호 3과 4의 프라이머 이용)를 증폭하였다. 이때, PCR법은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃/30초 변성, 56℃/30초 어닐링, 72℃/1분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응시켜서 수행되었다.

서열번호 1: 5’-gcgaattcgaaaatggggataga-3’

서열번호 2: 5’-gcactagtattacctgcctgtcg-3’

서열번호 3: 5’-cagaattcacgtgcgttaacgcatcg-3’

서열번호 4: 5’-ctactagtcaccttttgtaggcctga-3’

증폭된 2종의 프락토키나제 유전자 폴리뉴클레오티드를 제한효소 EcoRI과 SpeI으로 처리하여 각각의 DNA 절편을 획득한 후 에세리키아와 코리네박테리움의 셔틀 벡터인 pECCG117 벡터의 EcoRⅠ, SpeⅠ부위에 연결하여 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. PCR을 통해 유전자가 삽입된 벡터로 형질전환된 콜로니를 선별한 후 통상에 알려진 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하여 각각 pECCG117-cscK 및 pECCG117-mak 이라 명명하였다.

실시예 2: 프락토키나제 유전자의 라이신 생산 균주 도입 및 라이신 생산능 비교

전기펄스법을 통하여 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881를 pECCG117-cscK 혹은 pECCG117-mak 벡터로 형질전환하여 카나마이신 내성을 가지는 콜로니를 획득하였다.

2종의 에세리키아 유래 프락토키나제가 도입된 각각의 균주와 앞서 언급한 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 (Clostridium acetylbutylicum) 유래의 프락토키나제인 CFK (대한민국 등록특허 제 0564805)가 도입된 균주를 함께 아래와 같은 방법으로 배양하여 라이신 생산능을 비교하였다.

종 배지 25 ml(카나마이신 25μl/ml 첨가)을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30 ℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 이때, 종배지 (pH 7.0)의 조성은 다음과 같다: 원당 20g, 펩톤 10g, 효모추출물 10g, 요소 5g, KH₂PO₄ 4g, K₂HPO₄ 8g, MgSO₄ 7H₂O 0.5g, 바이오틴 100㎍, 티아민 HCl 1000㎍ (공정수 1 리터 기준).

그런 다음, 생산 배지 24 ml (카나마이신 25μl/ml 첨가)을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 접종하고 30 ℃에서 72시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 이때, 생산배지 (pH 7.0)의 조성은 다음과 같다: 원당 80g, 당밀 또는 전처리 당밀 (환원당으로서) 20g, 옥수수 침지액 (Corn Steep Liquor) 5g, (NH₄)₂SO₄ 40g, 요소 4g, KH₂PO₄ 1g, NaCl 2.5g, MgSO₄ 7H₂O 1g, FeSO₄ 7H₂O 10mg, MnSO₄ 5H₂O 10mg, 바이오틴 100㎍, 티아민 염산염 200㎍, CaCO₃ 40g, 필요시 L-루신 0.4g, 필요시 L-트레오닌 0.1g, 필요시 L-메티오닌 0.1g (공정수 1리터 기준).

끝으로, 배양을 종료한 다음, HPLC에 의해 L-라이신의 평균농도를 측정하였다(참조: 표 1).

프락토키나제 유전자의 도입에 따른 L-라이신의 농도비교(단위: g/L)

실험군	균주	L-라이신 평균농도
1	KFCC10881/pECCG117	32.9
2	KFCC10881/pECCG117-cscK	40.5
3	KFCC10881/pECCG117-mak	35.4
4	KFCC10881/pECCG-CFK	34.1

상기 표 1에서 실험군 1은 프락토키나제 유전자 없이 빈 벡터만 도입된 균주를 배양하고 이로부터 회수한 L-라이신의 평균농도를 나타내고, 실험군 2는 프락토키나제 유전자 cscK가 도입된 균주를 배양하고 이로부터 회수한 L-라이신의 평균농도를 나타내며, 실험군 3은 프락토키나제 유전자 mak가 도입된 균주를 배양하고 이로부터 회수한 L-라이신의 평균농도를 나타내고, 실험군 4는 종래의 프락토키나제 유전자인 CFK가 도입된 균주를 배양하고 이로부터 회수한 L-라이신의 평균농도를 나타낸다.

표 1의 결과에서 보듯이, 프락토키나제 유전자가 도입되지 않은 경우(실험군 1)에 비하여, 프락토키나제 유전자가 도입된 경우(실험군 2-4)에는 L-라이신의 평균농도가 증가하고, 프락토키나제 유전자 중에서도 cscK 또는 mak가 도입된 경우(실험군 2 및 3)에 종래의 프락토키나제 유전자가 도입된 경우(실험군 4) 보다도 높은 수준으로 L-라이신의 평균농도를 나타냄을 확인할 수 있었다.

따라서, 종래의 프락토키나제 유전자 보다는 에세리키아 속 균주에서 유래된 프락토키나제 유전자를 사용함이 바람직함을 알 수 있었다.

실시예 3: cscK 유전자의 프로모터 교체 및 염색체 도입용 재조합 벡터 제작

에세리키아 유래의 프락토키나제 유전자를 코리네박테리움의 염색체상에 삽입하기 위하여 코리네박테리움 속 미생물에서의 트랜스포존 유전자가 삽입된 벡터 pDZTn 벡터 (대한민국 공개특허 제 2009-0107665)를 기본 벡터로 사용하였다. 2종의 에세리키아 유래 프락토키나제 유전자 중 라이신 생산능의 증가 효과가 더욱 뛰어난 cscK 유전자를 선택하였고, 코리네박테리움 유래의 강력한 프로모터를 cscK 유전자 개시코돈 상단에 연결하여 발현량의 증가를 유도하였다.

서열번호 17에 근거하여 ORF 부위만을 증폭할 수 있으며 5’말단에 NdeⅠ 제한효소 부위와 3’ 말단에 SpeⅠ 제한효소 부위를 가지도록 고안한 프라이머를 합성하고(서열번호 5와 6) 에세리키아 콜리 W 균주 (ATCC9637)의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR법을 통하여 약 900 bp의 cscK 유전자 ORF 부위를 증폭하였다. 이때, PCR법은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃/30초 변성, 56℃/30초 어닐링, 72℃/1분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응시켜서 수행되었다.

서열번호 5: 5’-atgccatatgtcagccaaagtatg-3’

서열번호 6: 5’-atgcactagtattacctgcctgtcg-3’

코리네박테리움 암모니아게네스 유래의 pcj7 프로모터를 증폭할수 있으며 5’말단에 SpeⅠ 제한효소 부위와 3’말단에 NdeⅠ 제한효소 부위를 가지도록 고안한 프라이머 (서열번호 7 및 8)를 합성하고, 코리네박테리움 암모니아게네스 균주의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR법을 통하여 약 300 bp의 프로모터 부위를 증폭하였다. 이때, PCR법은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃/30초 변성, 56℃/30초 어닐링, 72℃/30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응시켜서 수행되었다.

서열번호 7: 5’-atgcactagtatagggagcgttgac-3’

서열번호 8: 5’-atgccatatgtgtttcctttcg-3’

또한 코리네박테리움 글루타미쿰 유래의 lysCP1 프로모터를 증폭할 수 있으며 5’말단에 SpeⅠ 제한효소 부위를 삽입한 프라이머와 3’말단에 NdeⅠ 제한효소 부위를 가지도록 고안한 프라이머 (서열번호 9 및 10)를 합성하고, 코리네박테리움 글루타미쿰 균주의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR법을 통하여 약 300 bp의 프로모터 부위를 증폭하였다. 이때, PCR법은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃/30초 변성, 56℃/30초 어닐링, 72℃/30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응시켜서 수행되었다.

서열번호 9: 5’-ttcatatgtgtgcacctttcgatcta-3’

서열번호 10: 5’-ttactagtgattgttaatgccgatgcta-3’

증폭된 프락토키나제 유전자 폴리뉴클레오티드와 프로모터 부위 폴리뉴클레오티드를 제한효소 SpeI과 NdeI로 처리하여 각각의 DNA 절편을 획득하였다. pDZTn을 제한효소 SpeI으로 처리하여 얻은 DNA 절편에 각각의 프로모터와 cscK 유전자 부위 DNA 절편을 DNA 접합 효소를 이용해서 연결하여 pDZTn-pcj7_cscK (도 1), pDZTn-lysCP1_cscK (도 2) 벡터를 제조하였다.

도 1은 본 발명의 발현벡터 pDZTn-pcj7_cscK의 유전자 지도를 나타내고, 도 2는 본 발명의 발현벡터 pDZTn-lysCP1_cscK의 유전자 지도를 나타낸다.

실시예 4: cscK 유전자 발현 증가 균주의 라이신 생산능 비교

상기 실시예 3에서 제조한 2종의 벡터 pDZTn-pcj7_cscK 및 pDZTn-lysCP1_cscK를 전기펄스법을 이용하여 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881에 각각 형질전환시키고, 염색체 상의 트랜스포존 부위에 프로모터가 치환된 프락토키나제 유전자를 갖는 균주를 선택적으로 분리하여 실시예 2와 동일한 방법으로 배양하고, 이로부터 회수된 L-라이신의 평균농도를 측정하였다(표 2).

프로모터의 도입에 따른 L-라이신의 농도비교(단위: g/L)

실험군	균주	L-라이신 평균농도
5	KFCC10881	33.2
6	KFCC10881::pcj7_cscK	42.1
7	KFCC10881::lysCP1_cscK	38.7

상기 표 2에서 실험군 5는 프락토키나제 유전자가 도입되지 않은 균주를 배양하고 이로부터 회수한 L-라이신의 평균농도를 나타내고, 실험군 6은 프로모터 pcj7와 연결된 프락토키나제 유전자 cscK가 도입된 균주를 배양하고 이로부터 회수한 L-라이신의 평균농도를 나타내며, 실험군 7은 프로모터 lysCP1와 연결된 프락토키나제 유전자 cscK가 도입된 균주를 배양하고 이로부터 회수한 L-라이신의 평균농도를 나타낸다.

표 2의 결과에서 보듯이, 프락토키나제 유전자가 도입되지 않은 경우(실험군 5)에 비하여, 프락토키나제 유전자가 도입된 경우(실험군 6 및 7)에는 L-라이신의 평균농도가 증가하고, 프락토키나제 유전자애 연결된 프로모터 중에서도 pcj7가 연결된 경우(실험군 6)에 다른 프로모터인 lysCP1가 연결된 경우(실험군 7) 보다도 높은 수준으로 L-라이신의 평균농도를 나타냄을 확인할 수 있었다.

따라서, 에세리키아 속 균주에서 유래된 프락토키나제 유전자를 도입할 경우, pcj7 프로모터를 연결하여 사용함이 바람직함을 알 수 있었다.

실시예 5: cscK 유전자 발현 증가 균주에서의 프락토즈 이용능 측정

본 실시예에서는 프락토키나제 유전자가 발현되도록 형질전환된 L-라이신 생산균주를 대상으로, 세포 내 프락토키나제 활성 증가와 동시에 프락토즈의 이용능이 증가되었는지를 확인하기 위하여 상기 실시예 2에 명시된 방법을 통해 생장속도 및 당 이용성을 측정하였다. 배양시간에 따른 562nm에서의 흡광도와 배지 내 잔여 수크로즈 및 프락토즈의 양을 측정하였다(도 3).

도 3은 프락토키나제 유전자가 도입되어 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주를 배양하고, 배지내에 존재하는 수크로즈 및 프락토즈의 양을 정량한 결과를 나타내는 그래프로서, A는 프락토키나제 유전자가 도입되지 않은 균주를 배양한 결과를 나타내고, B는 pcj7 프로모터가 연결된 종래의 프락토키나제 유전자 CFK가 도입된 균주를 배양한 결과를 나타내며, C는 pcj7 프로모터가 연결된 프락토키나제 유전자 cscK가 도입된 균주를 배양한 결과를 나타내고, D는 lysCP1 프로모터가 연결된 프락토키나제 유전자 cscK가 도입된 균주를 배양한 결과를 나타내며, 상기 A-D 에서 (●)는 OD₅₆₂ 측정값을 나타내고, (■)는 배지내에 잔류하는 수크로즈의 총량을 나타내며, (▲)는 배지내에 잔류하는 프락토즈의 총량을 나타낸다.

도 3에서 보듯이, KFCC10881(A) 및 KFCC10881::pcj7_CFK(B)를 도입한 균주에서는 배양이 진행됨에 따라 배지 내에 프락토즈가 균주간 상대적인 차이를 두고 일정량 축적되었다가 다시 소모되는 양상을 보인 반면, KFCC10881::pcj7_cscK(C) 및 KFCC10881::lysCP1_cscK(D)를 도입한 균주에서는 배양이 진행되는 동안 배지 내에서 프락토즈가 전혀 검출되지 않음을 확인하였다.

따라서, 본 발명에서 사용한 프락토키나제 유전자에 의해 발현되는 프락토키나제는 배지에 존재하는 수크로즈를 세포내에서 분해하여 생성한 프락토즈를 모두 인산화시켜서, 해당과정에 이용되게 할 수 있으므로, 코리네박테리움 글루타미쿰 내의 프락토즈 대사에 있어서 에너지의 불필요한 소모를 방지할 수 있게 함을 알 수 있었다.

실시예 6: cscK 유전자 발현 증가 균주에서의 프락토키나제 활성의 측정

본 실시예에서는 L-라이신 생산균주 염색체 상에서 코리네박테리움 유래의 강력한 발현유도활성을 갖는 프로모터에 의해, 프락토키나제 유전자가 세포 내에서 과발현되고, 당 효소활성이 존재하는지를 공지문헌에 기재된 방법으로 측정하였다 (Microbiology (2002) 148:843-852). 균주를 LB 배지에서 하루 정도 배양한 다음, 원심분리하여 세포만을 획득하였다. 얻은 세포를 적당한 버퍼에 현탁한 뒤 초음파 파쇄법으로 세포를 파괴하고, 다시 고속원심분리하여 상등액을 얻었다. 위 방법으로 얻어진 상등액을 프락토즈, 포스포글루코즈 이소머라제, 글루코즈-6-포스페이트 디히드로게나제, ATP 및 NADP+가 들어 있는 반응액과 반응시킨 후 생성되는 NADPH의 양을 파장 340 nm에서의 흡광도로 측정하여 간접적으로 프락토즈의 프락토즈 6-포스페이트로의 전환 정도를 계산하였다(표 3).

프로모터 또는 유전자의 도입에 따른 프락토키나제의 활성도 변화

실험군	균주	활성도^a
8	KFCC10881	11.90
9	KFCC10881::pcj7_cscK	50.55
10	KFCC10881::lysCP1_cscK	42.06
11	KFCC10881::pcj7_CFK	23.32

a): nmol (생성된 프락토즈-6-포스페이트)/min/mg (단백질)

상기 표 3에서 실험군 8은 프락토키나제 유전자가 도입되지 않은 균주를 배양하고 이로부터 회수한 프락토키나제의 활성도를 측정한 결과를 나타내고, 실험군 9는 프로모터 pcj7가 연결된 프락토키나제 유전자 cscK가 도입된 균주를 배양하고 이로부터 회수한 프락토키나제의 활성도를 측정한 결과를 나타내며, 실험군 10은 프로모터 lysCP1이 연결된 프락토키나제 유전자 cscK가 도입된 균주를 배양하고 이로부터 회수한 프락토키나제의 활성도를 측정한 결과를 나타내고, 실험군 11은 프로모터 pcj7가 연결된 종래의 프락토키나제 유전자인 CFK가 도입된 균주를 배양하고 이로부터 회수한 프락토키나제의 활성도를 측정한 결과를 나타낸다.

표 3의 결과에서 보듯이, 프락토키나제 유전자가 도입되지 않은 경우(실험군 8)에 비하여, 프락토키나제 유전자가 도입된 경우(실험군 9-11)에는 프락토키나제의 활성도가 1.95 내지 4.24배 증가하고, 프락토키나제 유전자 중에서도 cscK가 도입된 경우(실험군 9 및 10)에 종래의 프락토키나제 유전자가 도입된 경우(실험군 11) 보다도 프락토키나제의 활성도가 1.80 내지 2.16배 증가됨을 확인할 수 있었다.

상기 실시예 4-6의 결과에서 보듯이, 프로모터 pcj7가 연결된 프락토키나제 유전자 cscK가 도입된 균주는 모든 면에서 가장 우수한 활성을 나타냄을 확인할 수 있었는 바, 상기 pDZTn-pcj7_cscK를 형질전환하여 얻은 형질전환체(KFCC-10881-Pcj7_cscK)를 Corynebacterium glutamicum CA01-2012로 명명하고, 2011년 3월 28일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture center of Microorganisms, 이하, “KCCM”으로 약칭함)에 수탁번호 KCCM11183P로 기탁하였다.

실시예 7: cscK 유전자 발현 증가 균주를 이용한 트레오닌 생산

본 실시예에서는 KFCC10881과 KFCC10881::pcj7_cscK 균주에 트레오닌 생합성 및 배출관련 유전자를 포함하고 있는 플라스미드 벡터 pECCG117-homthrBCE를 도입하여 트레오닌 생산능을 비교하였다. 플라스미드 벡터 pECCG117-homthrBCE의 제작 과정은 다음과 같다. 일본 KEGG 사이트(www.genome.jp/kegg/)로부터 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 트레오닌 생합성 유전자 hom-thrB (NCgl1136, 1137, 서열번호 19), thrC (NCgl2139, 서열번호 20) 및 배출유전자 thrE (NCgl2533, 서열번호 21) 염기서열을 획득한 후, 이에 근거하여 각각의 오페론 혹은 유전자를 PCR 증폭하기 위한 프라이머를 제작하였다. PCR 증폭에 사용한 주형은, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 모균주로 NTG (N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)를 이용한 인공변이법을 통해 트레오닌 유사물질인 AHV (2-amino-3-hydroxy-valerate)에 대해 3 g/l 농도까지 내성을 부여한 균주로부터 추출한 염색체 DNA이다.

먼저, hom-thrB 오페론을 증폭하기 위하여 5'양쪽 말단에 XhoI 인식부위를 포함하고 있는 프라이머 (서열번호 11 및 12)를 사용하였으며, PCR 후 최종적으로 3 kb의 DNA 단편을 획득하였다. 이때, PCR법은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃/30초 변성, 56℃/30초 어닐링, 72℃/3분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응시켜서 수행되었다. DNA 단편을 XhoI으로 절단한 다음, 동 제한효소로 절단한 후 탈인산화한 플라스미드 벡터 pECCG117에 연결하여 pECCG117-homthrB 벡터를 제작하였다.

서열번호 11: 5’-ttcctcgaggaggggaacttgatcagagga-3’

서열번호 12: 5’-ttcctcgagctacacagctgcccatttgtg-3’

thrC 유전자의 경우, 5'양쪽 말단에 SalI 인식부위를 포함하고 있는 프라이머 (서열번호 13 및 14)를 사용하였으며, PCR 후 최종적으로 2.1 kb의 DNA 단편을 획득하였다. 이때, PCR법은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃/30초 변성, 56℃/30초 어닐링, 72℃/2분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응시켜서 수행되었다. DNA 단편을 SalI으로 절단한 다음, 동 제한효소로 절단 한 후 탈인산화한 플라스미드 벡터 pECCG117-homthrB에 클로닝하여 pECCG117-homthrBC 벡터를 제작하였다.

서열번호 13: 5’-ttcgtcgacgattaaggatttcaactgcgg-3’

서열번호 14: 5’-ttcgtcgacgcaacgagcaattccgagagc-3’

thrE 유전자의 경우, 5'양쪽 말단에 BamHI 인식부위를 포함하고 있는 프라이머(서열번호 15 및 16)를 사용하였으며, PCR 후 최종적으로 2.5 kb의 DNA 단편을 획득하였다. 이때, PCR법은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃/30초 변성, 56℃/30초 어닐링, 72℃/1분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 3분간 중합반응시켜서 수행되었다. DNA 단편을 BamHI으로 절단한 후, 동 제한효소로 절단 한 후, 탈인산화한 플라스미드 벡터 pECCG117-homthrBC에 클로닝하여 pECCG117-homthrBCE 벡터 (도 4)를 제작하였다. 도 4는 본 발명의 발현벡터 pECCG117-homthrBCE의 유전자 지도를 나타낸다.

서열번호 15: 5’-atcggatccaagatctagtcatcaatc-3’

서열번호 16: 5’-cggcaaggatcctcctgagtg-3’

상기의 벡터 pECCG117-homthrBCE를 전기펄스법을 이용하여 각각 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881 또는 KFCC10881::pcj7_cscK 균주에 도입한 후, 실시예 2에 명시된 방법으로 배양함으로써 cscK 유전자의 유무에 따른 L-트레오닌 생산량을 분석하였다(표 4).

프락토키나제 유전자의 도입에 따른 L-트레오닌의 평균농도 비교(단위: g/L)

실험군	균주	L-트레오닌의 평균농도
12	KFCC10881/pECCG117-homthrBCE	12.2
13	KFCC10881::pcj7_cscK/pECCG117-homthrBCE	14.0

상기 표 4에서 실험군 12는 프락토키나제 유전자가 도입되지 않은 균주를 배양하고 이로부터 회수한 L-트레오닌의 평균농도를 측정한 결과를 나타내고, 실험군 13은 프로모터 pcj7가 연결된 프락토키나제 유전자 cscK가 도입된 균주를 배양하고 이로부터 회수한 L-트레오닌의 평균농도를 측정한 결과를 나타낸다.

표 4의 결과에서 보듯이, 프락토키나제 유전자가 도입되지 않은 경우(실험군 12)에 비하여, 프락토키나제 유전자가 도입된 경우(실험군 13)에는 L-트레오닌의 농도가 증가됨을 확인할 수 있었다.

따라서, L-트레오닌의 제조시에도, 에세리키아 속 균주에서 유래된 프락토키나제 유전자가 도입된 균주를 사용함이 바람직함을 알 수 있었다.

실시예 8: cscK 유전자 발현 증가 균주의 글루타메이트 생산능 비교

본 실시예에서는 글루타메이트 생산 균주의 염색체 상에 cscK 유전자를 삽입한 균주를 제작하고 글루타메이트 생산능을 비교하였다. pDZTn-pcj7_cscK 벡터를 전기펄스법을 이용하여 글루타메이트 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KTCC10774 (대한민국 등록특허 제 0824457) 균주에 형질전환시키고, 염색체 상의 트랜스포존 부위에 프락토키나제 유전자가 삽입된 균주를 선택적으로 분리하였다.

종배지 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 균주를 접종용 루프로 한 루프 접종하고, 30 ℃에서 20 시간 동안, 220 rpm으로 진탕 배양하였다. 이때, 종배지(pH 7.0)의 조성은 다음과 같다: 원당 20g, 펩톤 10g, 효모추출물 10g, 요소 5g, KH₂PO₄ 4g, K₂HPO₄ 8g, MgSO₄ 7H₂O 0.5g, 바이오틴 100㎍, 티아민 HCl 1000㎍ (공정수 1 리터 기준).

이어, 생산 배지 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 접종하고 30 ℃에서 40시간 동안, 220 rpm에서 진탕 배양하였다. 이때, 생산배지(pH 7.1)의 조성은 다음과 같다: 원당 30g, 당밀 또는 전처리 당밀 (환원당으로서) 10g, MgSO₄ 7H₂O 0.4g, KH₂PO₄ 1g, (NH₄)₂SO₄ 3g, FeSO₄ 7H₂O 10mg, MnSO₄ 5H₂O 10mg, 비오틴 500㎍, 티아민 염산염 2mg, 요소 1g (공정수 1리터 기준).

끝으로, 배양을 종료한 다음, HPLC에 의해 L-글루타메이트의 생산량을 측정하였다(표 5).

프락토키나제 유전자의 도입에 따른 L-글루타메이트의 평균농도 비교(단위: g/L)

실험군	균주	L-글루타메이트의 평균농도
14	KFCC10774	11.2
15	KFCC10774::pcj7_cscK	15.8

상기 표 5에서 실험군 14는 프락토키나제 유전자가 도입되지 않은 균주를 배양하고 이로부터 회수한 L-글루타메이트의 평균농도를 측정한 결과를 나타내고, 실험군 15는 프로모터 pcj7가 연결된 프락토키나제 유전자 cscK가 도입된 균주를 배양하고 이로부터 회수한 L-글루타메이트의 평균농도를 측정한 결과를 나타낸다.

표 5의 결과에서 보듯이, 프락토키나제 유전자가 도입되지 않은 경우(실험군 14)에 비하여, 프락토키나제 유전자가 도입된 경우(실험군 15)에는 L-글루타메이트의 농도가 증가됨을 확인할 수 있었다.

따라서, L-글루타메이트의 제조시에도, 에세리키아 속 균주에서 유래된 프락토키나제 유전자가 도입된 균주를 사용함이 바람직함을 알 수 있었다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11183P

20110328

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Corynebaterium sp. Transformed with a Fructokinase Gene Derived from Escherichia sp. And Process for Preparing L-amino acid using the same <130> PA110179/KR <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gcgaattcga aaatggggat aga 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gcactagtat tacctgcctg tcg 23 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cagaattcac gtgcgttaac gcatcg 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ctactagtca ccttttgtag gcctga 26 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 atgccatatg tcagccaaag tatg 24 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 atgcactagt attacctgcc tgtcg 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 atgcactagt atagggagcg ttgac 25 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 atgccatatg tgtttccttt cg 22 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ttcatatgtg tgcacctttc gatcta 26 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ttactagtga ttgttaatgc cgatgcta 28 <210> 11 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ttcctcgagg aggggaactt gatcagagga 30 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 ttcctcgagc tacacagctg cccatttgtg 30 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 ttcgtcgacg attaaggatt tcaactgcgg 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 ttcgtcgacg caacgagcaa ttccgagagc 30 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 atcggatcca agatctagtc atcaatc 27 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 cggcaaggat cctcctgagt g 21 <210> 17 <211> 1285 <212> DNA <213> cscK <400> 17 gaaaatgggg atagaaagtg ttaccccggt 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gggggttttg gctgaattgg ctagcctgtt ctctgagcaa ggaatctccc 1680 tgcgtacaat ccgacaggaa gagcgcgatg atgatgcacg tctgatcgtg gtcacccact 1740 ctgcgctgga atctgatctt tcccgcaccg ttgaactgct gaaggctaag cctgttgtta 1800 aggcaatcaa cagtgtgatc cgcctcgaaa gggactaatt ttactgacat ggcaattgaa 1860 ctgaacgtcg gtcgtaaggt taccgtcacg gtacctggat cttctgcaaa cctcggacct 1920 ggctttgaca ctttaggttt ggcactgtcg gtatacgaca ctgtcgaagt ggaaattatt 1980 ccatctggct tggaagtgga agtttttggc gaaggccaag gcgaagtccc tcttgatggc 2040 tcccacctgg tggttaaagc tattcgtgct ggcctgaagg cagctgacgc tgaagttcct 2100 ggattgcgag tggtgtgcca caacaacatt ccgcagtctc gtggtcttgg ctcctctgct 2160 gcagcggcgg ttgctggtgt tgctgcagct aatggtttgg cggatttccc gctgactcaa 2220 gagcagattg ttcagttgtc ctctgccttt gaaggccacc cagataatgc tgcggcttct 2280 gtgctgggtg gagcagtggt gtcgtggaca aatctgtcta tcgacggcaa gagccagcca 2340 cagtatgctg ctgtaccact tgaggtgcag gacaatattc gtgcgactgc gctggttcct 2400 aatttccacg catccaccga agctgtgcgc cgagtccttc ccactgaagt cactcacatc 2460 gatgcgcgat 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Claims

에세리키아 속 균주에서 유래된 프락토키나제 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 발현단위를 포함하는 L-아미노산 생산용 코리네박테리움 속 균주.
제1항에 있어서,
상기 프락토키나제 유전자는 cscK 또는 mak인 L-아미노산 생산용 코리네박테리움 속 균주.
제1항에 있어서,
상기 프락토키나제 유전자는 서열번호 17 또는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 L-아미노산 생산용 코리네박테리움 속 균주.
제1항에 있어서,
상기 유전자 발현단위는 벡터에 작동가능하게 연결되어 상기 코리네박테리움 미생물에 형질도입되어 포함되거나 상기 코리네박테리움 미생물의 염색체 내에 삽입되어 포함되는 것인 L-아미노산 생산용 코리네박테리움 속 균주.
제1항에 있어서,
상기 유전자는 개시코돈의 상류에 연결된 프로모터에 의해 과발현되는 것인 L-아미노산 생산용 코리네박테리움 속 균주.
제5항에 있어서,
상기 프로모터는 cscK 프로모터, mak 프로모터, pcj7 프로모터, lysCP1 프로모터, EF-Tu 프로모터, groEL 프로모터 및 aceAB 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 L-아미노산 생산용 코리네박테리움 속 균주.
제1항에 있어서,
상기 L-아미노산은 L-라이신, L-트레오닌 또는 L-글루타메이트인 것인 L-아미노산 생산용 코리네박테리움 속 균주.
제1항에 있어서,
트레오닌 생합성 및 배출관련 유전자를 포함하고 있는 벡터를 추가로 형질전환시킨 것인 L-아미노산 생산용 코리네박테리움 속 균주.
제8항에 있어서,
상기 트레오닌 생합성 관련 유전자는 hom-thrB 또는 hom-thrC 이고, 트레오닌 배출 관련 유전자는 hom-thrE인 것인 L-아미노산 생산용 코리네박테리움 속 균주.
제1항에 있어서,
상기 코리네박테리움 속 균주는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes), 브리비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum), 및 브리비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium fermentum)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 L-아미노산 생산용 코리네박테리움 속 균주.
제10항에 있어서,
상기 코리네박테리움 속 균주는 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881인 것인 L-아미노산 생산용 코리네박테리움 속 균주.
제10항에 있어서,
상기 코리네박테리움 속 균주는 글루타메이트 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KTCC10774인 것인 L-아미노산 생산용 코리네박테리움 속 균주.
제1항에 있어서,
상기 형질전환 균주는 수탁번호 KCCM11183P인 L-아미노산 생산용 코리네박테리움 속 균주.
(i) 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 코리네박테리움 속 균주를 배양하는 단계; 및,
(ii) 상기 배양물로부터 L-아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, L-아미노산의 제조방법.
제14항에 있어서,
상기 L-아미노산은 L-라이신, L-트레오닌 또는 L-글루타메이트인 것인 L-아미노산의 제조방법.
(i) 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 코리네박테리움 속 균주를 수크로즈를 탄소원으로 포함하는 배지에서 배양하는 단계; 및,
(ii) 상기 배양물로부터 L-아미노산을 회수하는 단계를 포함하는, L-아미노산의 제조방법.