CN113981014A - 生产原儿茶酸的方法 - Google Patents

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程存照
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Abstract

本发明属于生物香料中间体发酵领域，具体涉及生产原儿茶酸的方法，该方法包括：在发酵生产3‑脱氢莽草酸的过程中，向发酵液中添加3‑脱氢莽草酸脱水酶，得到原儿茶酸。采用本发明的方法能够大大降低没食子酸的产量，甚至能够不产没食子酸；而且发酵结束后能够获得含高浓度原儿茶酸的发酵液(能达80g/L)，远高于直接使用原儿茶酸生产菌发酵生产原儿茶酸时的浓度。

Description

生产原儿茶酸的方法
技术领域
本发明属于生物香料中间体发酵领域，具体涉及一种生产原儿茶酸的方法。
背景技术
芳香族化合物应用广泛，原儿茶酸作为芳香族化合物的重要起始前体，是化工与药物合成的重要原料。针对目前化学合成法的环境污染问题以及植物提取法受限植物的品质和产量，通过构建微生物细胞工厂，实现生物发酵原儿茶酸和芳香族化合物是一种创新、绿色、可持续发展的工业路线。
生物发酵是近年来快速发展的工艺，特别是通过发酵方法，有效解决了三废和产量问题。目前生物发酵法制备原儿茶酸采用两步法，即第一步利用工程菌发酵生成3-脱氢莽草酸，第二步通过3-脱氢莽草酸脱水酶催化形成原儿茶酸。Jack E.Richman等(Reactionof 3-Dehydroshikimic Acid with Molecular Oxygen and Hydrogen Peroxide:Products,Mechanism,and Associated Antioxidant Activity)研究表明在有氧发酵下发酵液中无机磷酸盐会催化3-脱氢莽草酸转化成没食子酸，不可避免地产生没食子酸。原儿茶酸与没食子酸的结构非常相似，没食子酸与原儿茶酸极难分离，导致原儿茶酸纯度很难达到市场需求。因此如何建立一种原儿茶酸生物法制备过程中控制没食子酸形成的方法成为获得高纯度原儿茶酸的关键。
发明内容
本发明的目的是为了在原儿茶酸生产过程中尽可能降低没食子酸的产量，提供一种生产原儿茶酸的方法，该方法适合于生物法工业化生产原儿茶酸过程，能够大大降低没食子酸产量甚至避免没食子酸的形成，进而提高原儿茶酸的产量和纯度。
为了实现上述目的，本发明提供一种生产原儿茶酸的方法，该方法包括：在发酵生产3-脱氢莽草酸的过程中，向发酵液中添加3-脱氢莽草酸脱水酶，得到原儿茶酸。
优选地，所述3-脱氢莽草酸脱水酶的添加方式为至少一次添加或流加。
优选地，所述3-脱氢莽草酸脱水酶的添加时机为开始产生3-脱氢莽草酸的时段。
本发明在生物法制备原儿茶酸的过程中，通过添加3-脱氢莽草酸脱水酶，及时将生物合成的3-脱氢莽草酸经过酶催化为原儿茶酸，避免3-脱氢莽草酸在有氧的状态下被磷酸盐催化形成没食子酸，大大降低没食子酸的形成，甚至能基本不产生没食子酸，进而能够简化后续提纯环节，有利于提高原儿茶酸产品纯度。
此外，采用本发明的方法发酵结束后能够获得含高浓度的原儿茶酸的发酵液，发酵液中的原儿茶酸的浓度能达80g/L以上，远远高于直接使用原儿茶酸生产菌直接生产原儿茶酸时的浓度(CN 109943512 A中发酵结束后原儿茶酸的含量的浓度为33.3g/L)。
附图说明
图1是本发明实施例1中流加法生产原儿茶酸的上清液的HPLC检测图；
图2是本发明实施例2中发酵中前期一次性投加法生产原儿茶酸的上清液的HPLC检测图；
图3是本发明实施例2中发酵中期一次性投加法生产原儿茶酸的上清液的HPLC检测图；
图4是本发明实施例2中发酵中后期一次性投加法生产原儿茶酸的上清液的HPLC检测图；
图5是本发明对比例1中两步法生产原儿茶酸的上清液的HPLC检测图。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明提供了一种生产原儿茶酸的方法，该方法包括：在发酵生产3- 脱氢莽草酸的过程中，向发酵液中添加3-脱氢莽草酸脱水酶，得到原儿茶酸。
在本发明中，3-脱氢莽草酸脱水酶能够将3-脱氢莽草酸转化为原儿茶酸， 3-脱氢莽草酸脱水酶的酶活力的定义为：每小时3-脱氢莽草酸脱水酶转化1g 3-脱氢莽草酸的酶量。
测定3-脱氢莽草酸脱水酶的酶活力的条件可以包括：pH为6-8，温度为 30-40℃。应当理解的是，不同3-脱氢莽草酸脱水酶其最适的反应温度和pH 不同，本领域技术人员可以根据酶的种类，对酶活力测定的条件进行调整。
该酶可以通过发酵得到(可参见CN 110184288 A)，也可以通过商购获得。
优选地，所述3-脱氢莽草酸脱水酶的添加方式为至少一次添加或流加。
应当理解的是，所述至少一次添加可以是一次性投加，也可以是分两次或以上投加。
优选地，以发酵液的总体积为基准，所述3-脱氢莽草酸脱水酶的总添加量为10-500U/L发酵液(比如可以为10、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500U/L发酵液以及任意两个值之间组成的任意范围)。
所述3-脱氢莽草酸脱水酶可以以酶液的形式添加(比如发酵法制得的 3-脱氢莽草酸脱水酶)，或者是以酶制剂溶液的形式添加(比如将酶制剂用水溶解稀释后添加)。
在流加时，本领域技术人员可以根据实际情况调整酶液或酶制剂溶液的浓度，或者流加速度。
比如，以发酵周期为52h，酶液中酶的含量为40U/mL为例，一般在18h 左右开始生产3-脱氢莽草酸，在18-24h，酶液的流加速度为0.25-0.5L/h， 24-30h时为0.45-0.75L/h，30-36h时为0.5-0.95L/h，36-42h时为0.75-1.25L/h， 42-48h时为0.95-1.5L/h，48-52h时为0.95-1.25L/h。一般来说，随发酵的进行，以酶活力为基准，酶的流加速度是逐渐增加的。
所述3-脱氢莽草酸脱水酶可以在发酵的任意时段添加，优选地，所述 3-脱氢莽草酸脱水酶的添加时机为开始产生3-脱氢莽草酸的时段。
应当理解的是，对于至少一次添加来说，添加时机是指第一次添加时的时机，本领域技术人员可以根据情况选择后续添加的次数和时机；对于流加来说，添加时机是指开始流加的时机。
由于实际操作时，需要通过检测发酵液中的3-脱氢莽草酸的含量来判断是否开始产生3-脱氢莽草酸，因此，“开始产生3-脱氢莽草酸的时段”并非是实际开始产生3-脱氢莽草酸的时段，而是能够检测到开始产生3-脱氢莽草酸的时段。
在本发明中，用于发酵生产3-脱氢莽草酸的菌株可以是能够利用比如葡萄糖生产3-脱氢莽草酸的菌株，比如可以为CN 109943512 A中提到的菌株。 (比如保藏号为CGMCCNo.14602的大肠杆菌)。应当理解的是，也可以根据本领域的现有技术合成其他种属的工程菌株(比如枯草芽孢杆菌等)。
在本发明中，菌株在接种前还可以先进行活化和至少一级扩培，所述活化可以在摇瓶中进行，所述扩培可以在摇瓶和/或扩培罐中进行。比如，可以在摇瓶中分别进行活化和一级扩培，在扩培罐中进行二级扩培，得到种子液。
其中，活化和每级扩培的条件可以包括：pH值为6-8；温度为30-40℃；活化的时间为6-15h；每级扩培的时间为8-15h。
所述活化或扩培过程中使用的培养基可以相同或不同，可以根据菌株的种类选择合适的扩培培养基，比如菌株为大肠杆菌时，扩培培养基可以为含葡萄糖的LB培养基，其中，葡萄糖1-20g/L，酵母提取物3-7g/L，胰蛋白胨 5-15g/L，氯化钠5-15g/L。
在本发明中，所述菌种接种量可以在较宽的范围内进行选择，比如，以扩培培养基的体积为基准，所述菌种的接种量可以为0.05-15体积％，例如可以为0.05、0.1、0.5、1、2、5、10、15体积％以及任意两个值之间组成的任意范围。
在本发明中，所述菌种可以以种子液的形式接种到发酵培养基中，接种量可以在较宽的范围内进行选择，比如，以发酵培养基的体积为基准，所述菌种的种子液的接种量可以为0.05-15体积％，例如可以为0.05、0.1、0.5、 1、2、5、10、15体积％以及任意两个值之间组成的任意范围。
优选地，所述发酵的条件包括：pH为6-8，更优选为7-7.5；温度为30-40℃，更优选为32-37℃。
本领域技术人员可以根据实际情况调整发酵时间，比如可以为48-72h。
本领域技术人员可以根据菌株种类选择合适的发酵培养基，比如菌株为大肠杆菌时，发酵培养基包含葡萄糖和无机盐。
优选地，所述发酵培养基中葡萄糖的含量为1-60g/L，更优选为10-40g/L。应当理解的是，发酵过程中还可以流加葡萄糖用于发酵。
优选地，所述无机盐选自K2HPO4、MgSO4、(NH4)2SO4、FeSO4、柠檬酸、MnSO4、Na2SO4、ZnSO4、CoCl2和CuSO4中的至少一种。
应当理解的是，所述无机盐也可以是水合物，比如MgSO4·7H2O、 (NH4)2SO4、FeSO4·7H2O、一水柠檬酸、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、CoCl2·6H2O、 CuSO4·5H2O等。
在本发明的一种优选的实施方式中，所述发酵培养基包含葡萄糖、 K2HPO4、MgSO4·7H2O、(NH4)2SO4、一水柠檬酸、MnSO4·H2O、Na2SO4、 ZnSO4·7H2O、CoCl2·6H2O、CuSO4·5H2O和可选的FeSO4·7H2O。
优选地，以发酵培养基的总体积为基准，所述发酵培养基包含：葡萄糖 1-60g/L、K2HPO4 4-6g/L、MgSO4·7H2O 1-4g/L、(NH4)2SO4 1-3g/L、FeSO4·7H2O 0-2g/L、一水柠檬酸2-6g/L、MnSO4·H2O 0.1-1g/L、Na2SO4 0.1-1g/L、 ZnSO4·7H2O 0.1-1g/L、CoCl2·6H2O0.1-1g/L、CuSO4·5H2O 0.1-1g/L。
为了得到原儿茶酸产品，还可以对发酵液进行后处理，优选地，该方法还包括：对发酵结束时的物料进行分离、纯化和结晶，得到原儿茶酸。
本领域技术人员可以根据需要选择分离(比如为离心或过滤)、纯化(比如可以对清液进行浓缩)和结晶(比如可以为二次结晶)的方式和条件，在此不再赘述。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中，扩培培养基为LB培养基；包括：酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L。
以发酵培养基的总体积为基准，发酵培养基包括：葡萄糖20.0g/L， K2HPO4 5.0g/L、MgSO4·7H2O 2.5g/L、(NH4)2SO4 2.0g/L、FeSO4·7H2O 1.0g/L、一水柠檬酸4g/L、MnSO4·H2O 0.5g/L、Na2SO4 0.5g/L、ZnSO4·7H2O 0.5g/L、 CoCl2·6H2O 0.5g/L、CuSO4·5H2O0.5g/L。
3-脱氢莽草酸的含量测定，原儿茶酸的含量测定，没食子酸的含量测定与原儿茶酸同时进行按照液相检测方法进行检测。
3-脱氢莽草酸转化率的检测通过HPLC进行，检测的条件如下：仪器为安捷伦HPLC1100 Series、液相柱为菲罗门糖柱00D-0223-K0 100*7.8mm、流动相5mM硫酸(色谱纯)、柱温箱温度：左55℃、右20℃组合、流速0.6mL/min、检测波长210nm、进样量5uL。
3-脱氢莽草酸脱水酶酶活力：在温度为36℃，pH为7的条件下，每小时3-脱氢莽草酸脱水酶转化1g 3-脱氢莽草酸的酶量。
3-脱氢莽草酸脱水酶酶活力的测定方法：在恒温搅拌反应器中，温度 36℃，转速220r/min，间隔1小时取样。取2mL反应液12000rpm离心2分钟，上层清液稀释100倍，用0.22μm滤头过滤至液相检测瓶(500μL)，液相检测读取峰面积，对比标准曲线计算3-脱氢莽草酸的减少量。
制备例1
本制备例用于说明3-脱氢莽草酸脱水酶酶液的制备方法。
按照CN 110184288 A实施例1的方法构建原核表达菌株 aroZ-pET21a(+)/BL21(DE3)。
构建的表达菌株aroZ-pET21a(+)/BL21(DE3)在50μg/mL卡那霉素的500 mL LB液体培养基，于37℃、200rpm振荡培养。按接种量为1％(V/V)进入下一级发酵培养，同时加入终浓度为0.1mM的诱导剂IPTG，卡那霉素终浓度为50μg/mL，初始葡萄糖为0.8％，后期补加葡萄糖发酵培养。菌体在 4000rpm条件下离心收集，然后稀释4倍后，均质机均值破壁(90-110MPa， 30min)，即得酶液。
经测定，该酶液中3-脱氢莽草酸脱水酶的酶活力为40U/mL。
实施例1
本实施例用于说明本发明所述的流加法生产原儿茶酸的方法。
将CGMCC No.14602的大肠杆菌接种到扩培培养基中，在37℃，250rpm 摇床培养24小时，得到种子液。
将种子液按照1体积％的接种量接种于300L发酵罐(装液量80％体积) 中，在37±1℃，pH为7-7.5(通过浓氨水调控pH)的条件下发酵。发酵开始后，待发酵罐中葡萄糖浓度降低到1g/L以下时，开始用浓度为500g/L的葡萄糖溶液开始补料，控制补料速度使发酵罐中葡萄糖浓度小于1g/L。
在3-脱氢莽草酸的发酵过程中，定时取样分析发酵生产情况，在检测到开始生产3-脱氢莽草酸后，开始流加制备例1得到的3-脱氢莽草酸脱水酶酶液进行酶促反应，具体流速见表1。
发酵52h后，结束发酵，对发酵液离心取上清，HPLC法测定其中的原儿茶酸和没食子酸的含量。
表1
发酵时间(h) 3-脱氢莽草酸脱水酶酶液流加速率(mL/h)
0-18 0.00
18-24 12
24-30 16
30-36 18
36-42 21
42-48 21
48-52 18
HPLC检测图如图1所示，经计算，所述上清液中含有0.00g/L没食子酸和86.16g/L原儿茶酸(12.474min)，也即在该流加模式下，基本不产没食子酸。
实施例2
本实施例用于说明本发明所述的一次性投加法生产原儿茶酸的方法。
按照实施例1所述的方法进行操作，不同的是，所述酶液分别在发酵中前期(22h，开始产3-脱氢莽草酸)、发酵中期(36h)和发酵中后期(48h) 一次性投加至发酵罐中；所述酶液的体积为750mL。
发酵前期的HPLC检测图如图2所示，经计算，所述上清液中含有0.37 g/L没食子酸(7.566min)和82.65g/L原儿茶酸(12.417min)。
发酵中期的HPLC检测图如图3所示，经计算，所述上清液中含有7.35 g/L没食子酸(7.587min)和82.75g/L原儿茶酸(12.497min)。
发酵中后期的HPLC检测图如图4所示，经计算，所述上清液中含有 14.37g/L没食子酸(7.524min)和81.42g/L原儿茶酸(12.367min)。
对比例1
本对比例用于说明参比的两步法生产原儿茶酸的方法。
按照实施例1所述的方法进行3-脱氢莽草酸的发酵，但是发酵过程中不添加3-脱氢莽草酸脱水酶，发酵结束后，得到含有95.64g/L的3-脱氢莽草酸的料液。
向所述上清液中加入40U/mL的3-脱氢莽草酸脱水酶(以制备例1中的酶液的形式)进行酶促1反应，反应条件包括：温度为36℃，pH为7，反应时间为4h。
HPLC检测图如图5所示，经计算，得19.80g/L没食子酸(7.581min) 和84.16g/L原儿茶酸(12.498min)。
综合上述实施例可知，将常规两步法中无法避免形成的7.80-26.05g/L 没食子酸，通过在发酵生产3-脱氢莽草酸过程中，优选在开始生产3-脱氢莽草酸时一次性加入或流加3-脱氢莽草酸脱水酶能够使原儿茶酸浓度达到80g/L以上，同时将没食子酸浓度降低到1.00g/L以下，极大控制没食子酸的形成，且利于简化后续提纯环节，提高原儿茶酸产品的纯度，降低杂质(没食子酸)的含量。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种生产原儿茶酸的方法，其特征在于，该方法包括：在发酵生产3-脱氢莽草酸的过程中，向发酵液中添加3-脱氢莽草酸脱水酶，得到原儿茶酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述3-脱氢莽草酸脱水酶的添加方式为至少一次添加或流加。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，以发酵液的总体积为基准，所述3-脱氢莽草酸脱水酶的总添加量为10-500U/L发酵液。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，所述3-脱氢莽草酸脱水酶的添加时机为开始产生3-脱氢莽草酸的时段。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，所述发酵的条件包括：pH为6-8，温度为30-40℃。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中，发酵培养基包含葡萄糖和无机盐。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述无机盐选自K2HPO4、MgSO4、(NH4)2SO4、FeSO4、柠檬酸、MnSO4、Na2SO4、ZnSO4、CoCl2和CuSO4中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述发酵培养基包含葡萄糖、K2HPO4、MgSO4·7H2O、(NH4)2SO4、一水柠檬酸、MnSO4·H2O、Na2SO4、ZnSO4·7H2O、CoCl2·6H2O、CuSO4·5H2O和可选的FeSO4·7H2O。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，以发酵培养基的总体积为基准，所述发酵培养基包含：葡萄糖1-60g/L、K2HPO4 4-6g/L、MgSO4·7H2O 1-4g/L、(NH4)2SO4 1-3g/L、FeSO4·7H2O0-2g/L、一水柠檬酸2-6g/L、MnSO4·H2O 0.1-1g/L、Na2SO4 0.1-1g/L、ZnSO4·7H2O 0.1-1g/L、CoCl2·6H2O 0.1-1g/L、CuSO4·5H2O 0.1-1g/L。
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的方法，其中，该方法还包括：对发酵结束时的物料进行分离、纯化和结晶，得到原儿茶酸。
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