CN1265702A - 温度敏感性dtsR基因 - Google Patents

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Abstract

编码参与棒状细菌对表面活性剂的温度敏感性的以下蛋白(A)或(B)的DNA:(A)具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质,或具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列但其中第139位亮氨酸残基已换成除脯氨酸残基以外的氨基酸残基的蛋白质,该蛋白质具有温度敏感性DTSR活性,或(B)包含SEQ ID NO:2所示氨基酸序列中除第139位氨基酸残基以外的一或多个氨基酸残基的置换、缺失、插入、增加或倒位的氨基酸序列的蛋白质,或具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列但其中第139位亮氨酸残基已换成除脯氨酸残基以外的氨基酸残基的蛋白质,该蛋白质具有温度敏感性DTSR活性。

Description

温度敏感性dtsR基因
技术领域
本发明涉及温度敏感性dtsR基因，特别是编码能使棒状细菌产生表面活性剂抗性并具有温度敏感性突变的蛋白的基因。本发明还涉及携带该基因并能产生L-赖氨酸和L-谷氨酸的棒状细菌，以及用该棒状细菌经发酵法生产L-赖氨酸和L-谷氨酸的方法。
技术背景
L-赖氨酸和L-谷氨酸迄今一直是用能产生这些氨基酸的短杆菌属或棒杆菌属的棒状细菌经发酵法进行工业化生产。在这些方法中，已知棒状细菌的生长需要生物素，但当培养基中有过量生物素时L-谷氨酸无法积累。因此，下述任一种方法都曾在传统的L-谷氨酸生产方法中采用。即，在限制生物素浓度的培养基中进行培养，或当使用含足量生物素的培养基时，在培养的起点或中间阶段使培养基中包含表面活性剂或内酰胺抗生素作为生物素作用的抑制剂。然而，当用诸如废糖蜜这样既便宜又含有过量生物素的物质作为培养基的碳源时，不得不补加的生物素作用抑制剂将增加生产的成本。
基于这一原因，发明人已揭示存在源自棒状细菌并编码使棒状细菌有表面活性剂抗性的蛋白(DTSR蛋白)的基因(dtsR基因)，并发现携带被破坏的该基因的棒状细菌L-谷氨酸生产菌株在有使野生型菌株几乎不产生L-谷氨酸的生物素浓度时，产生大量的L-谷氨酸，而具有L-赖氨酸生产能力的棒状细菌L-谷氨酸生产菌株在扩增dtsR基因后L-赖氨酸生产能力增强(国际专利公开号WO95/23224)。
发明人还发现，通过使棒状细菌L-谷氨酸生产菌株的生物素作用抑制剂具备温度敏感性，L-谷氨酸发酵生产也能在有生物素时稳定进行；通过使生物素作用抑制剂温度敏感型菌株具备生产L-谷氨酸的能力。即使有生物素时也能同时稳定地进行L-赖氨酸和L-谷氨酸的发酵生产。使棒状细菌的生物素作用抑制剂具备温度敏感性，可用编码温度敏感突变型DTSR蛋白的dtsR突变型基因进行基因置换(公布于国际专利公开号WO96/06180)。
发明内容
如上述，已开发出有效地利用dtsR基因进行棒状细菌氨基酸发酵生产的方法。本发明的目的是提供编码温度敏感突变型DTSR蛋白的新突变型dtsR基因，以更有效地利用dtsR基因。
本发明人通过将已有的dtsR基因经突变处理，成功地获得了编码温度敏感突变型DTSR蛋白的新突变型dtsR基因，并完成了本发明。
因此本发明提供了一种DNA，该DNA编码：
(A)具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质，或具有SEQ IDNO：2所示氨基酸序列但其中第139位亮氨酸残基已换成除脯氨酸残基以外的氨基酸残基的蛋白质，该蛋白质具有温度敏感性DTSR活性，或
(B)包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中除第139位氨基酸残基以外的一或多个氨基酸残基的置换、缺失、插入、增加或倒位的氨基酸序列的蛋白质，或具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列但其中第139位亮氨酸残基已换成除脯氨酸残基以外的氨基酸残基的蛋白质，该蛋白质具有温度敏感性DTSR活性。
具体而言，该DNA包括这样的DNA：
(a)包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中第359-1987位碱基的核苷酸序列的DNA，或
(b)与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中第359-1987位碱基的核苷酸序列在严紧条件下杂交、并编码具有温度敏感性DTSR活性的蛋白质的DNA。
后文中，上述DNA称为“本发明的基因”或“突变型dtsR基因”。该DNA编码的蛋白质称为“突变型DTSR蛋白”。
本发明还提供携带本发明之基因、不含野生型DTSR蛋白、能产生L-谷氨酸的棒状细菌，以及生产L-谷氨酸的方法，包括在液体培养基中培养棒状细菌以便在培养基中产生并积累L-谷氨酸，并从培养基中收集L-谷氨酸。
本发明还提供进一步具有产L-赖氨酸能力的棒状细菌，以及生产L-赖氨酸和L-谷氨酸的方法，包括在液体培养基中培养棒状细菌以便在培养基中产生并积累L-赖氨酸和L-谷氨酸，并从培养基中收集L-赖氨酸和L-谷氨酸。
在此所用DTSR活性指DTSR蛋白所具有的活性，具体是使棒状细菌产生表面活性剂抗性的活性。例如，当DTSR蛋白存在于棒状细菌表面活性剂敏感型突变株(在含有不影响野生型棒状细菌生长的表面活性剂浓度的培养基中生长退化的棒状细菌突变株)的细胞中时，DTSR蛋白有使棒状细菌失去对表面活性剂之敏感性的活性。
温度敏感型DTSR活性指DTSR活性在棒状细菌最适生长温度(31.5℃)时显示，但在高于33-37℃、尤其是34℃时DTSR活性降低。
在此所称棒状细菌为伯杰氏鉴定细菌学手册第8版，599页(1974)所规定的一组微生物。这组细菌为需氧、革兰阳性、非抗酸性、不能产生芽孢的杆菌，包括曾划归短杆菌属而现已归入棒杆菌属的细菌(参见Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255(1981))，还包括与棒杆菌属密切相关的短杆菌属和微杆菌属细菌。
发明详述
下文将仔细描述本发明。
要获得本发明的基因，可通过将含有源自野生型棒状细菌之dtsR基因的重组DNA经诱变剂处理，再将处理过的DNA导入棒状细菌表面活性剂敏感型突变株，选择在含有表面活性剂(在所含浓度下，未导入该重组DNA的突变株不能生长)的培养基中31.5℃能生长、但在较高温度如35℃不能生长的菌株，然后从所得菌株回收重组DNA。
源自野生型棒状细菌的dtsR基因可按国际专利公开号WO95/23224所述方法获得。用于利用棒状细菌表面活性剂敏感型突变株获得野生型dtsR基因的方法和利用野生型dtsR基因获得突变型dtsR基因的方法描述于下。
按Saito等的方法(H.Saito & K.Miura，Biochem.Biophys.Acta，72，619(1963))从棒状细菌野生型菌株回收染色体DNA。回收的染色体DNA用限制酶消化，再与在棒状细菌中有功能的载体连接以获得各种重组DNA。
在棒状细菌中有功能的载体如在棒状细菌中自我复制的质粒。载体的具体实例在以下提及。
(1)pAM 330参见日本专利申请公开号58-67669(1983)
(2)pHM 1519参见日本专利申请公开号58-77895(1983)
(3)pAJ 655参见日本专利申请公开号58-192900(1983)
(4)pAJ 611参见日本专利申请公开号58-192900(1983)
(5)pAJ 1844参见日本专利申请公开号58-192900(1983)
(6)pCG 1参见日本专利申请公开号57-134500(1982)
(7)pCG 2参见日本专利申请公开号58-35197(1983)
(8)pCG 4参见日本专利申请公开号57-183799(1982)
(9)pCG 11参见日本专利申请公开号57-183799(1982)
表面活性剂敏感型突变株是指在含有浓度为0.1-1mg/dl的表面活性剂如聚氧乙烯山梨糖醇棕榈酸单酯的培养基中不如相应的野生型菌株生长良好的突变株。棒状细菌野生型菌株的生长不受培养基中0.1-1mg/dl浓度的表面活性剂的影响。棒状细菌表面活性剂敏感型突变株的一个实例是谷氨酸棒状细菌AJ 11060。此突变株保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，保藏号FERM P-3678。
为了将各种重组DNA导入棒状细菌表面活性剂敏感型突变株，可按常规的和已报道的转化方法执行全过程。例如，可以采用这样一种方法，其中受体细胞用氯化钙处理以提高对DNA的通透性，如对大肠杆菌K-12的报道(Mandel，M. & Higa，A.，分子生物学杂志，53，159(1970))，和这样一种方法，其中感受态细胞从增殖期细胞制备以便导入DNA，如对枯草芽孢杆菌的报道(Duncan，C.H.，Wilson，G.A. & Yound，F.E.，基因，1，153(1977))。或者有可能应用这样一种方法，其中将DNA受体细胞转换成易于掺入重组DNA的原生质体或原生质球状态，以便向DNA受体中导入重组DNA，如在枯草芽孢杆菌、放线菌、和酵母菌中已知的那样(Chang，S & Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M. & Hopwood，O.A.，自然，274，398(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B. & Fink，G.R.，美国国家科学院学报，75，1929(1978))。本发明实施例中所用转化方法为电脉冲法(日本专利申请公开号2-207791(1990))。
然后将所获转化子一次性接种于不含表面活性剂的M-CM2G琼脂平板(葡萄糖5g，聚胨10g，酵母提取物10g，NaCl 5g，DL-甲硫氨酸0.2g，琼脂15g，和氯霉素4mg溶于1 l纯水，pH 7.2)以形成几万个菌落。将这些菌落影印于含表面活性剂(吐温40)30mg/ml的M-CM2G平板，获得在含表面活性剂的M-CM2G平板上表现良好生长的菌落。从而获得失去表面活性剂敏感性的菌株。
可用制备野生型棒状细菌染色体DNA的方法回收失去表面活性剂敏感性的转化菌株的重组DNA。对连接于载体的野生型棒状细菌染色体DNA片段进行测序以证实其中包含dtsR基因。
如上所述，可以获得dtsR基因。
也可经PCR扩增含有dtsR基因的DNA片段获得dtsR基因：根据已报道dtsR基因的核苷酸序列制备寡核苷酸为引物、棒状细菌染色体DNA为模板。还可以根据dtsR基因的核苷酸序列制备寡核苷酸为探针经杂交筛选棒状细菌染色体文库获得dtsR基因。
携有含dtsR基因的pDTR6的大肠杆菌菌株JM109/pDTR6(内部编号为AJ 12967)已于1994年2月22日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，保藏号FERM P-14168，1995年2月9日根据布达佩斯条约转为国际保藏，保藏号为FERM BP-4994。
突变型dtsR基因可通过诱变含野生型dtsR基因的DNA而获得。尤其可将含野生型dtsR基因的DNA用诸如次氯酸钠和羟胺这样的化学试剂处理(Shortle，D. & Nathans，D.，美国国家科学院学报，75，270(1978))。将已处理的重组DNA用上述方法导入棒状细菌表面活性剂敏感型突变株，获得转化体。从转化体中选出能在含有使未转化突变体无法生长的表面活性剂浓度的培养基(如含聚氧乙烯山梨醇棕榈酸单酯30mg/ml的培养基)上31.5℃时能生长，但在不低于33-37℃时不能生长的菌株。从选出的菌株中回收重组DNA，由此获得突变型dtsR基因。
作为如上述所获本发明的基因的一个实例，乳发酵短杆菌ATCC13869的dtsR基因经突变处理获得的dtsR基因核苷酸序列示于SEQ IDNO：1。该突变型dtsR基因编码的突变型DTSR蛋白示于SEQ ID NO：2。源自乳发酵短杆菌ATCC 13869的野生型DTSR蛋白具有一段氨基酸序列，其中第139位氨基酸残基为脯氨酸残基。源自乳发酵短杆菌ATCC13869的野生型dtsR基因具有一段核苷酸序列，其中第774位碱基为C。
既然具有温度敏感性的突变型DTSR蛋白的氨基酸序列和编码突变型DTSR蛋白的突变型dtsR基因的核苷酸序列已由本发明阐明，则也可用定向诱变法获得突变型dtsR基因(Kramer，W. & Frits，H.J.，酶学方法，154，350(1987))。具体而言，在野生型dtsR基因SEQ ID NO：1中编码氨基酸序列第139位脯氨酸的密码子可用编码除脯氨酸以外的其它氨基酸的密码子(优选亮氨酸残基的密码子)取代。除脯氨酸以外的其它氨基酸没有特别的限制，只要当它取代第139位脯氨酸时，突变型DTSR蛋白具有温度敏感型DTSR活性即可。除脯氨酸以外的其它氨基酸优选亮氨酸残基。
本发明的基因包括携带SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中第359-1987位碱基的核苷酸序列的DNA，也包括编码SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的DNA，还包括编码在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中第139位亮氨酸变成除脯氨酸以外的其它氨基酸的氨基酸序列的DNA。即使将SEQ IDNO：2所示氨基酸序列中除第139位以外的位点的导致一个或多个氨基酸残基置换、缺失、插入、增加或倒位的突变加入上述DNA中，只要由该DNA编码的蛋白质具有温度敏感型DTSR活性，该DNA还是包括在本发明的基因中。
可编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中除第139位以外其它位点的一个或多个氨基酸残基置换、缺失、插入、增加或倒位之氨基酸序列的蛋白质的DNA可通过以下方法获得：例如，对有dtsR基因(所编码的DTSR蛋白中第139位氨基酸残基变成除脯氨酸以外的其它氨基酸残基)、尤其是有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列的dtsR基因的棒状细菌进行突变处理，从所获突变体中分离可与含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中第359-1987位核苷酸序列的至少部分的DNA在严紧条件下杂交的DNA。该DNA也可以同源变异体或等位变异体的形式获得。
突变处理的实例包括紫外线照射和用诸如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)的诱变剂处理。
本文中“严紧条件”指在该条件下只形成特异性杂交，不形成非特异性杂交。很难用数字明确表示该条件。但可举例说明：在该条件下，具有高同源性(如不低于90％的同源性)的DNA相互杂交，而低于以上同源性的DNA之间不能杂交，或为自完全配对杂交体的解链温度(Tm)至(Tm-30)℃、优选自Tm至(Tm-20)℃的温度条件，和相应于1×SSC、优选0.1×SSC的盐浓度条件。
编码具有除第139位以外其它位点的一个或多个氨基酸残基置换、缺失、插入、增加或倒位之氨基酸序列的DTSR蛋白质的DNA，也可通过定向诱变对核苷酸序列进行修饰以在特殊位点产生一个或多个氨基酸残基的置换、缺失、插入、增加或倒位，从而获得该DNA。
突变导入位点或突变发生位点可从上述所获DNA中选择其编码的DTSR蛋白具有温度敏感型DTSR活性且其氨基酸序列在除第139位氨基酸以外的其它位点发生突变的DNA而进行测定。导入突变位点没有特别的限制，只要其对温度敏感型DTSR活性无实质性影响即可。根据蛋白质空间结构中突变氨基酸的位点或种类的不同，导入突变的数量有所不同，也没有特别的限制，只要其对温度敏感型DTSR活性无实质性影响即可。该数量通常为1至20，优选1至10。
本发明的基因可适用于L-谷氨酸的生产。例如，带有本发明基因和不含野生型DTSR蛋白的棒状细菌谷氨酸生产菌株具有对表面活性剂的温度敏感性。此棒状细菌在含过量生物素、不含表面活性剂的培养基中，当首先在31.5℃使棒状细菌生长后再将培养温度上升至33-37℃时，仍能产生L-谷氨酸。
故本发明提供带有本发明基因、不含野生型DTSR蛋白并能产生L-谷氨酸的棒状细菌(该棒状细菌可称为“本发明的L-谷氨酸生产菌”)，以及包括以下步骤的生产L-谷氨酸的方法：在液体培养基中培养棒状细菌以便在培养基中产生并积累L-谷氨酸，再从培养基中回收L-谷氨酸。
可应用已成熟的同源重组技术(分子遗传学实验，冷泉港实验室出版社(1972)；Matsuyama，S. & Mizushima，S.，细菌学杂志，162，1196(1985))或类似的技术，以含本发明基因的重组DNA置换能产生L-谷氨酸的棒状细菌染色体上野生型dtsR基因而获得本发明的L-谷氨酸生产菌。能产生L-谷氨酸的棒状细菌可能是已知的菌种(如，参见国际专利公开号WO96/06180)。
含碳源、氮源、无机盐、生长因子等的普通营养培养基可作为培养本发明上述L-谷氨酸生产菌的液体培养基。本发明L-谷氨酸生产菌具有在不含任何生物素作用抑制剂的培养基中生产L-谷氨酸的能力，即使在含过量生物素的液体培养基中培养时也是如此。
糖类如葡萄糖、果糖、蔗糖、废糖蜜、淀粉水解物；醇类如乙醇和甘油；有机酸如乙酸可作碳源。硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、磷酸铵、醋酸铵、氨、蛋白胨、肉浸出汁、酵母提取物、玉米浆等可作氮源。当利用营养缺陷型L-谷氨酸生产菌时，需加入必需物质制备物或含该必需物质的天然物质。
发酵在需氧条件下经振荡培养、通气和搅拌培养或诸如此类、同时将培养液的pH稳定在5-9而进行2-7天。pH用尿素、碳酸钙、氨气、氨水等调节。培养温度为24-37℃。但若首先于约31.5℃进行培养，然后当培养至中期时将温度提升至33-40℃，优选约37℃可获得更好的结果。即，在最佳生长温度附近使细菌充分增殖，然后提高培养温度。则无需加入任何生物素作用抑制剂便可启动L-谷氨酸的生产，而且L-谷氨酸将在培养液中产生并积累可观的量。
培养液中产生并积累的L-谷氨酸的收集可按常规方法进行。如可用离子交换树脂法、结晶法等。具体而言，L-谷氨酸可用阴离子交换树脂吸附及分离，或经中和作用结晶。
本发明之L-谷氨酸生产菌还可有产L-赖氨酸的能力。L-赖氨酸和L-谷氨酸的生产可以这样进行：在液体培养基中培养此棒状细菌(此棒状细菌可称为“本发明的L-赖氨酸生产菌”)以便在培养基中产生和积累L-谷氨酸，再从培养基中回收L-谷氨酸。
可用上述同源重组技术或类似技术，以含本发明基因的重组DNA置换既能产生L-赖氨酸又能产生L-谷氨酸的棒状细菌染色体上野生型dtsR基因而获得本发明的L-赖氨酸生产菌。既能产生L-赖氨酸又能产生L-谷氨酸的棒状细菌可为已知菌种(如参见国际专利公开号WO96/06180)。或者，可用日本专利公开号48-28078(1983)等所述方法赋予L-谷氨酸生产菌产生L-赖氨酸的能力，从而获得本发明的L-赖氨酸生产菌种。
含碳源、氮源、无机盐、生长因子等，类似于用来培养上述本发明之L-谷氨酸生产菌的普通营养培养基可作为培养本发明之L-赖氨酸生产菌的液体培养基。本发明之L-赖氨酸生产菌具有在不含任何生物素作用抑制剂的培养基中生产L-赖氨酸和L-谷氨酸的能力，即使在含过量生物素的液体培养基中培养时也是如此。
发酵在需氧条件下经振荡培养、通气和搅拌培养或诸如此类、同时将培养液的pH稳定在5-9而进行2-7天。pH用尿素、碳酸钙、氨气、氨水等调节。培养温度为24-37℃。但若首先于约31.5℃进行培养，然后当培养至中期时将温度提升至33-40℃，优选约37℃可获得更好的结果。即，L-赖氨酸主要在约31.5℃产生，但培养期间提升温度将提高L-谷氨酸的产率。通过利用这一现象，有可能控制培养液中L-赖氨酸对L-谷氨酸的比例最终达到期望值。
可用常规方法收集培养液中产生和积累的L-赖氨酸和L-谷氨酸。如可用离子交换树脂法、结晶法等。若用离子交换树脂法，可先用阳离子交换树脂从培养液中吸附并分离L-赖氨酸，然后用阴离子交换树脂吸附并分离、或经中和作用结晶L-谷氨酸。若L-赖氨酸和L-谷氨酸可混合应用，当然无需将它们互相分离。
本发明之L-谷氨酸生产菌和L-赖氨酸生产菌的L-谷氨酸生产力可通过增强谷氨酸生物合成系统的基因而得到改进。细胞中得到增强的谷氨酸生物合成系统基因包括，如糖酵解途径的磷酸果糖激酶(PFK，日本专利申请公开号63-102692(1988))、回补途径的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC，日本专利申请公开号60-87788(1985)和62-55089(1987))、TCA循环的柠檬酸合成酶(CS，日本专利申请公开号62-201585(1987)和63-119688(1988))、顺乌头酸水合酶(ACO，日本专利申请公开号62-294086(1987))、异柠檬酸脱氢酶(ICDH，日本专利申请公开号62-166890(1987)和63-214189(1983))、催化氨基化反应的谷氨酸脱氢酶(GDH，日本专利申请公开号61-268185(1986))。
本发明L-赖氨酸生产菌的L-赖氨酸生产力也可通过增强赖氨酸生物合成系统的基因而得到改进。
细胞中增强的赖氨酸生物合成系统基因的已知实例包括编码对L-赖氨酸和L-苏氨酸的协同反馈抑制作用基本脱敏的天冬氨酸激酶α-亚单位蛋白或β-亚单位蛋白的基因(国际公开号WO94/25605)、棒状细菌野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因(日本专利申请公开号60-87788(1985))、编码棒状细菌野生型二氢吡啶二羧酸合成酶的基因(日本专利申请公开号6-55194(1994))等。
实施本发明的最佳方式
以下实施例将详细描述本发明。
(1)乳发酵短杆菌ATCC 13869(棒状细菌野生型菌株)染色体DNA的制备
乳发酵短杆菌ATCC 13869接种于100ml T-Y培养基(含1％细菌用胰蛋白胨(Difco)，0.5％细菌用酵母提取物(Difco)和0.5％NaCl；pH7.2)，于31.5℃培养8小时。将所获培养物在3,000 r.p.m.离心15分钟获得0.5g湿细胞。按Saito & Miura方法从中获得染色体DNA(参见Biochem.Biophys.Acta.72，619，(1963))。将60μg染色体DNA和3个单位的限制酶Sau3AI分别混合于10mM Tris-HCl缓冲液(含50mMNaCl，10mM MgSO4和1mM二硫苏糖醇；pH 7.4)，反应于37℃进行30分钟。然后对反应混合物进行常规酚抽提和乙醇沉淀，获得用Sau3AI消化的乳发酵短杆菌ATCC 13869染色体DNA片段50μg。
(2)用质粒载体DNA制备乳发酵短杆菌ATCC 13869的基因文库
能在大肠杆菌细胞和棒状细菌细胞中自我复制的质粒载体DNA(pSAC4)20μg与200单位限制酶BamHI混合于50mM Tris-HCl缓冲液(含100mM NaCl，10mM MgSO4；pH 7.4)，于37℃反应2小时获得消化溶液，再对该溶液进行常规酚抽提和乙醇沉淀。然后，按分子克隆第二版(J.Sambrook，E.F.Fritsch & T.Maniatis，冷泉港实验室出版社，p.1.56(1989))所述方法用细菌碱性磷酸酶使DNA去磷酸化，以防止质粒载体DNA片段自我配对，再对如此去磷酸化的DNA片段进行常规酚抽提和乙醇沉淀。
经BamHI消化的该pSAC4 1μg、经Sau3AI消化的乳发酵短杆菌ATCC13869染色体DNA片段(如(1)所获)1μg、以及T4 DNA连接酶(TakaraShuzo公司生产)2个单位均加入含66mM MgCl2、10mM二硫苏糖醇和10mMATP的Tris-HCl缓冲液66mM(pH7.5)中，于16℃反应16小时以使DNA发生连接。然后用常规方法以该DNA混合物转化大肠杆菌DH5，将所得转化体接种在含氯霉素170μg/ml的L-琼脂培养基，获得约20,000个菌落构成基因文库。
(3)用基因文库DNA转化乳发酵短杆菌AJ 11060
按上述Saito & Miura方法从上述近20,000个菌落中回收重组DNA。
用常规电脉冲转化法(参见日本专利申请公开号2-207791(1990))将分为50批的重组DNA混合物导入对表面活性剂敏感的突变体菌株AJ11060。所得转化体细胞接种于添加葡萄糖的L-琼脂培养基于31.5℃进行静置培养，在培养基上形成约20,000个转化体。然后，将这些转化体菌落影印于同样的但含有30mg/l表面活性剂的培养基，获得几株有表面活性剂抗性并生长于平板培养基的菌株。
每种重组DNA分别从所获菌株中提取，菌株AJ 11060也用每种重组DNA转化。从而再次获得表面活性剂抗性菌株。其中一株菌株的重组DNA命名为pDTR6。在含3g/l表面活性剂的培养基中已导入pDTR6的菌株AJ 11060的生长抑制作用受阻(参见国际公开号WO95/23224)。
(4)突变型dtsR基因的制备
质粒pDTR6按文献(Shortle，D. & Nathans，D.，美国国家科学院学报，75，270(1978))所述方法经羟胺体外处理，再用上述电脉冲法导入AJ 11060。约20,000个转化体菌株在M-CM2G琼脂培养基上于25℃培养30小时形成菌落。每块平板上的菌落均影印至含30mg/l表面活性剂的两个培养基平板上，于31.5℃和35℃培养20小时。此后，获得一株在31.5℃生长但在35℃不生长的菌株。按常规方法从菌株中提取质粒。从而获得pDTR-117。
(5)突变型dtsR基因的测序
将质粒pDTR-117导入大肠杆菌JM 109。所得大肠杆菌JM 109/pDTR-117在含有1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物和0.5％NaCl的培养基20ml中于37℃培养24小时，所得培养物20ml接种于含上述相同组成的培养基1L中37℃培养3小时。然后加入0.2g氯霉素，继续在同一温度下培养20小时。下一步，所得培养物在3000rpm离心10分钟，获得2g湿细胞。将所获细胞悬浮于含25％蔗糖的350mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)20ml中，然后向其中加入溶菌酶(Sigma公司产)10mg、0.25M EDTA溶液(pH 8.0)8ml以及20％十二烷基硫酸钠8ml。将所得悬浮液于60℃加热30分钟获得裂解物。裂解物中加入5M NaCl 13ml，于4℃处理16小时。再于15000rpm离心30分钟。所获上清经常规酚抽提和乙醇沉淀获得DNA沉淀物。
沉淀物减压干燥，再溶于含1mM EDTA的10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)6ml中，向其中加入氯化铯6g和溴化乙锭(19mg/ml)0.2ml。然后用超速离心机于39000rpm经平衡密度梯度离心42小时分离DNA。接着，用正丁醇除去溴化乙锭，再对含1mM EDTA的10mM Tris-HCl(pH7.5)进行透析，获得纯化重组DNA(pDTR-117)约500μg。
测定pDTR-117克隆片段的核苷酸序列。根据Sanger法，用TaqDyeDeoxy终止循环测序试剂盒(Applied Biochemical公司产)进行测序。测定的核苷酸序列及其所推导的氨基酸序列示于序列表中的SEQ IDNO：1。氨基酸序列也示于SEQ ID NO：2。
测序显示克隆的DNA片段包括dtsR基因的完整编码序列，还显示野生型dtsR基因中第774位碱基(即C，胞嘧啶)被T(胸腺嘧啶)置换。通过置换，在所编码的DTSR蛋白中，野生型DTSR蛋白第139位氨基酸残基即脯氨酸残基被亮氨酸残基置换。
(6)经基因置换导入突变型dtsR基因的菌株的构建
按同源重组法用日本专利申请公开号5-7491(1993)所述温度敏感性质粒获得突变型dtsR基因置换的菌株。具体而言，上述pDTR6-117用XbaI和KpnI消化，将所得含dtsR基因的片段与已用XbaI和KpnI以上述方法消化的pHSG398(Tjakara Shuzo产)连接，获得pHSGX-K-117。
接着，具有突变型复制起点及其来自棒状细菌中能自我复制的质粒的温度敏感性自我复制能力的质粒pHSC4(日本专利申请公开号5-7491(1993))用限制酶BanHI和KpnI消化，获得含复制起点的基因片段。所获DNA片段用DNA钝端形成试剂盒(Takara Shuzo产，钝化盒)钝端化，再用KpnI接头(Takara Shuzo产)插入pHSGX-K-117的KpnI识别位点，构建质粒pKTCX-K-117。携有pHSC4的大肠杆菌AJ 12571已于1990年10月11日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所，保藏号FERM P-11763，1991年8月26日根据布达佩斯条约转为国际保藏，保藏号FERM BP-3524。
质粒用电脉冲法导入乳发酵短杆菌ATCC 13869，染色体上的dtsR基因按日本专利申请公开号5-7491(1993)所述方法置换为突变型。具体而言，乳发酵短杆菌ATCC 13869/pKTCX-K-117在M-CM2G液体培养基中于25℃振荡培养6小时，再接种于含5μg/ml氯霉素的M-CM2G培养基。得到在34℃形成菌落的菌株为质粒已掺入的菌株。接着，在34℃对氯霉素敏感的菌株用影印法从质粒已掺入的菌株中获得。第117号菌株作为在34℃失去表面活性剂抗性的菌株从敏感菌株中获得。在此菌株中，染色体上的dtsR基因已置换为突变型。
(7)第117号菌株的L-谷氨酸生产力
用与国际专利公开号WO96/06180中实施例2所述相同方法评估了(6)中所获第117号菌株以及国际专利公开号WO96/06180中所述第11、77、21号菌株的L-谷氨酸生产力。具体而言，评估过程如下进行：
乳发酵短杆菌ATCC 13869或其它任一株菌株接种于含表1所示成分的种子培养基，31.5℃振荡培养24小时获得种子培养物。含有表6所示成分的用于规模培养的培养基分成每份300ml。倾入500ml玻璃制发酵罐中，热力灭菌。然后，向其中接种40ml种子培养物。以800-1,300rpm搅拌速度、1/2-1/1 vvm通气量、31.5℃培养温度开始培养。培养液用氨水维持pH 7.5。培养8小时后温度改为37℃。提供不改变培养温度，就在31.5C持续培养的对照。
                       表    1成分                               浓度
                    种子培养物          规模培养葡萄糖                  5g/dl             15g/dlKH2PO4               0.1g/dl            0.2g/dlMgSO4·7H2O          0.04g/dl           0.15g/dlFeSO4·7H2O          1mg/dl             1.5mg/dlMnSO4·4H2O          1mg/dl             1.5mg/dl大豆蛋白水解物溶液      2mg/dl             5mg/dl生物素                  50μg/dl           200μg/dl盐酸硫胺素              200μg/dl          300μg/dl
在任一项实验中，培养结束于20-40小时内葡萄糖消耗殆尽之时。对培养液中产生和积累的L-谷氨酸进行测量。
结果，第117号菌株的L-谷氨酸产量大大提高，如表2所示。
                       表    2细菌菌株                  L-谷氨酸(g/dl)ATCC 13869                    0.5第11号                        7.5第77号                        6.9第21号                        8.3第117号                       9.0
工业实用性
根据本发明，提供了编码具有表面活性剂温度敏感性的突变型DTSR蛋白的突变型dtsR基因。带有突变型DTSR蛋白而无野生型DTSR蛋白的棒状细菌具有对表面活性剂的温度敏感性，并能用于生产L-谷氨酸等等。
                          序列表
<110>AJINOMOTO有限公司
<120>温度敏感性dtsR基因
<150>JP 9-184176
<151>1997-07-09
<160>2
<210>1
<211>2047
<212>DNA
<213>乳发酵短杆菌
<220>
<221>CDS
<222>359..1987
<400>1
gatcttggaa ctcgacagtt ttcaccgtcc agtttggagc gcctgagctt gcaagctcca     60
gcaagtcagc attagtggag cctgtcactt tttcgtaaat gacctggcca aagtcaccgt    120
tttggagcaa tttttccttc aggagctcaa cgtttagcgg ctctctggat cgtgaaatgt    180
caacgttcat ggaagccaat gtagtggggt cgcgtcgaaa agcgcgcttt aagggcgaca    240
cgcccaaaaa gttttacctt taaaaactac ccgcacgcag cacgaacctg ttcagtgatg    300
taaatcaccg cggaaatatt gtggacgtta cccccgccta ccgctacgat ttcaaaac      358
atg acc att tcc tca cct ttg att gac gtc gcc aac ctt cca gac atc      406
Met Thr Ile Ser Ser Pro Leu Ile Asp Val Ala Asn Leu Pro Asp Ile
  1               5                  10                  15
aac acc act gcc ggc aag atc gcc gac ctt aag gct cgc cgc gcg gaa      454
Asn Thr Thr Ala Gly Lys Ile Ala Asp Leu Lys Ala Arg Arg Ala Glu
             20                  25                  30
gcc cat ttc ccc atg ggt gaa aag gca gta gag aag gtc cac gct gct      502
Ala His Phe Pro Met Gly Glu Lys Ala Val Glu Lys Val His Ala Ala
         35                  40                  45
gga cgc ctc act gcc cgt gag cgc ttg gat tac tta ctc gat gag ggc      550
Gly Arg Leu Thr Ala Arg Glu Arg Leu Asp Tyr Leu Leu Asp Glu Gly
     50                  55                  60
tcc ttc atc gag acc gat cag ctg gct cgc cac cgc acc acc gct ttc      598
Ser Phe Ile Glu Thr Asp Gln Leu Ala Arg His Arg Thr Thr Ala Phe
 65                  70                  75                  80ggc ctg ggc gct aag cgt cct gca acc gac ggc atc gtg acc ggc tgg     646Gly Leu Gly Ala Lys Arg Pro Ala Thr Asp Gly Ile Val Thr Gly Trp
             85                  90                  95ggc acc att gat gga cgc gaa gtc tgc atc ttc tcg cag gac ggc acc     694Gly Thr Ile Asp Gly Arg Glu Val Cys Ile Phe Ser Gln Asp Gly Thr
        100                 105                 110gta ttc ggt ggc gcg ctt ggt gag gtg tac ggc gaa aag atg atc aag     742Val Phe Gly Gly Ala Leu Gly Glu Val Tyr Gly Glu Lys Met Ile Lys
    115                 120                 125atc atg gag ctg gca atc gac acc ggc cgc cta ttg atc ggt ctt tac     790Ile Met Glu Leu Ala Ile Asp Thr Gly Arg Leu Leu Ile Gly Leu Tyr
130                 135                 140gaa ggc gct ggc gct cgc att cag gac ggc gct gtc tcc ctg gac ttc     838Glu Gly Ala Gly Ala Arg Ile Gln Asp Gly Ala Val Ser Leu Asp Phe145                 150                 155                 160att tcc cag acc ttc tac caa aac att cag gct tct ggc gtt atc cca     886Ile Ser Gln Thr Phe Tyr Gln Asn Ile Gln Ala Ser Gly Val Ile Pro
            165                 170                 175cag atc tcc gtc atc atg ggc gca tgt gca ggt ggc aac gct tac ggc     934Gln Ile Ser Val Ile Met Gly Ala Cys Ala Gly Gly Asn Ala Tyr Gly
        180                 185                 190cca gcc ctg acc gac ttc gtg gtc atg gtg gac aag acc tcc aag atg     982Pro Ala Leu Thr Asp Phe Val Val Met Val Asp Lys Thr Ser Lys Met
    195                 200                 205ttc gtt acc ggc cca gac gtg atc aag acc gtc acc ggc gag gaa atc    1030Phe Val Thr Gly Pro Asp Val Ile Lys Thr Val Thr Gly Glu Glu Ile
210                 215                 220acc cag gaa gag ctt ggc gga gca acc acc cac atg gtg acc gct ggc    1078Thr Gln Glu Glu Leu Gly Gly Ala Thr Thr His Met Val Thr Ala Gly225                 230                 235                 240aac tcc cac tac acc gct gcg acc gat gag gaa gca ctg gat tgg gta    1126Asn Ser His Tyr Thr Ala Ala Thr Asp Glu Glu Ala Leu Asp Trp Val
            245                 250                 255cag gac ctg gtg tcc ttc ctc cca tcc aac aat cgc tct tac aca cca    1174Gln Asp Leu Val Ser Phe Leu Pro Ser Asn Asn Arg Ser Tyr Thr Pro
        260                 265                 270ctg gaa gac ttc gac gag gaa gaa ggc ggc gtt gaa gaa aac atc acc    1222Leu Glu Asp Phe Asp Glu Glu Glu Gly Gly Val Glu Glu Asn Ile Thr
    275                 280                 285gct gac gat ctg aag ctc gac gag atc atc cca gat tcc gcg acc gtt    1270Ala Asp Asp Leu Lys Leu Asp Glu Ile Ile Pro Asp Ser Ala Thr Val
290                 295                 300cct tac gac gtc cgc gat gtc atc gaa tgc ctc acc gac gat ggc gaa    1318Pro Tyr Asp Val Arg Asp Val Ile Glu Cys Leu Thr Asp Asp Gly Glu305                 310                 315                 320tac ctg gaa atc cag gca gac cgc gca gaa aac gtt gtt att gca ttc     1366Tyr Leu Glu Ile Gln Ala Asp Arg Ala Glu Asn Val Val Ile Ala Phe
            325                 330                 335ggc cgc atc gaa ggc cag tcc gtt gga ttt gtt gcc aac cag cca acc     1414Gly Arg Ile Glu Gly Gln Ser Val Gly Phe Val Ala Asn Gln Pro Thr
        340                 345                 350cag ttc gct ggc tgc ctg gac atc gac tcc tct gag aag gca gct cgc     1462Gln Phe Ala Gly Cys Leu Asp Ile Asp Ser Ser Glu Lys Ala Ala Arg
    355                 360                 365ttc gtc cgc acc tgc gac gcg ttt aac atc cca atc gtc atg ctt gtc     1510Phe Val Arg Thr Cys Asp Ala Phe Ash Ile Pro Ile Val Met Leu Val
370                 375                 380gac gtc ccc ggc ttc ctt cca ggc gca ggc cag gag tat ggt ggc atc     1558Asp Val Pro Gly Phe Leu Pro Gly Ala Gly Gln Glu Tyr Gly Gly Ile385                 390                 395                 400ctg cgt cgt ggc gca aag ctg ctc tac gca tac ggc gaa gca acc gtt     1606Leu Arg Arg Gly Ala Lys Leu Leu Tyr Ala Tyr Gly Glu Ala Thr Val
            405                 410                 415cca aag att acc gtc acc atg cgt aag gct tac ggc gga gcg tac tgc     1654Pro Lys Ile Thr Val Thr Met Arg Lys Ala Tyr Gly Gly Ala Tyr Cys
        420                 425                 430gtg atg ggt tcc aag ggc ttg ggc tct gac atc aac ctt gca tgg cca     1702Val Met Gly Ser Lys Gly Leu Gly Ser Asp Ile Asn Leu Ala Trp Pro
    435                 440                 445acc gca cag atc gcc gtc atg ggc gct gct ggc gca gtc gga ttc atc     1750Thr Ala Gln Ile Ala Val Met Gly Ala Ala Gly Ala Val Gly Phe Ile
450                 455                 460tac cgc aag gag ctc atg gca gct gat gcc aag ggc ctc gat acc gta     1798Tyr Arg Lys Glu Leu Met Ala Ala Asp Ala Lys Gly Leu Asp Thr Val465                 470                 475                 480gct ctg gct aag tcc ttc gag cgc gag tac gaa gac cac atg ctc aac     1846Ala Leu Ala Lys Ser Phe Glu Arg Glu Tyr Glu Asp His Met Leu Asn
            485                 490                 495ccg tac cac gct gca gaa cgt ggc ctg atc gac ggc gtg atc ctg cca     1894Pro Tyr His Ala Ala Glu Arg Gly Leu Ile Asp Gly Val Ile Leu Pro
        500                 505                 510agc gaa acc cgc gga cag att tcc cgc aac ctt cgc ctg ctc aag cac     1942Ser Glu Thr Arg Gly Gln Ile Ser Arg Asn Leu Arg Leu Leu Lys His
    515                 520                 525aag aac gtc act cgc cct gct cgc aag cac ggc aac atg cca ctg         1987Lys Asn Val Thr Arg Pro Ala Arg Lys His Gly Asn Met Pro Leu
530                 535                 540taaatcggcg aatccataaa ggttcaaaag aattcaataa ggattcgata agggttcgat  2047<210>2<211>543<212>PRT<213>乳发酵短杆菌<400>2Met Thr Ile Ser Ser Pro Leu Ile Asp Val Ala Asn Leu Pro Asp Ile1               5                  10                  15Asn Thr Thr Ala Gly Lys Ile Ala Asp Leu Lys Ala Arg Arg Ala Glu
         20                  25                  30Ala His Phe Pro Met Gly Glu Lys Ala Val Glu Lys Val His Ala Ala
     35                  40                  45Gly Arg Leu Thr Ala Arg Glu Arg Leu Asp Tyr Leu Leu Asp Glu Gly
 50                  55                  60Ser Phe Ile Glu Thr Asp Gln Leu Ala Arg His Arg Thr Thr Ala Phe65                  70                  75                  80Gly Leu Gly Ala Lys Arg Pro Ala Thr Asp Gly Ile Val Thr Gly Trp
             85                  90                  95Gly Thr Ile Asp Gly Arg Glu Val Cys Ile Phe Ser Gln Asp Gly Thr
        100                 105                 110Val Phe Gly Gly Ala Leu Gly Glu Val Tyr Gly Glu Lys Met Ile Lys
    115                 120                 125Ile Met Glu Leu Ala Ile Asp Thr Gly Arg Leu Leu Ile Gly Leu Tyr
130                 135                 140Glu Gly Ala Gly Ala Arg Ile Gln Asp Gly Ala Val Ser Leu Asp Phe145                 150                 155                 160Ile Ser Gln Thr Phe Tyr Gln Asn Ile Gln Ala Ser Gly Val Ile Pro
            165                 170                 175Gln Ile Ser Val Ile Met Gly Ala Cys Ala Gly Gly Asn Ala Tyr Gly
        180                 185                 190Pro Ala Leu Thr Asp Phe Val Val Met Val Asp Lys Thr Ser Lys Met
    195                 200                 205Phe Val Thr Gly Pro Asp Val Ile Lys Thr Val Thr Gly Glu Glu Ile
210                 215                 220Thr Gln Glu Glu Leu Gly Gly Ala Thr Thr His Met Val Thr Ala Gly225                 230                 235                 240Asn Ser His Tyr Thr Ala Ala Thr Asp Glu Glu Ala Leu Asp Trp Val
            245                 250                 255Gln Asp Leu Val Ser Phe Leu Pro Ser Asn Asn Arg Ser Tyr Thr Pro
        260                 265                 270Leu Glu Asp Phe Asp Glu Glu Glu Gly Gly Val Glu Glu Asn Ile Thr
    275                 280                 285Ala Asp Asp Leu Lys Leu Asp Glu Ile Ile Pro Asp Ser Ala Thr Val
290                 295                 300Pro Tyr Asp Val Arg Asp Val Ile Glu Cys Leu Thr Asp Asp Gly Glu305                 310                 315                 320Tyr Leu Glu Ile Gln Ala Asp Arg Ala Glu Asn Val Val Ile Ala Phe
            325                 330                 335Gly Arg Ile Glu Gly Gln Ser Val Gly Phe Val Ala Asn Gln Pro Thr
        340                 345                 350Gln Phe Ala Gly Cys Leu Asp Ile Asp Ser Ser Glu Lys Ala Ala Arg
    355                 360                 365Phe Val Arg Thr Cys Asp Ala Phe Asn Ile Pro Ile Val Met Leu Val
370                 375                 380Asp Val Pro Gly Phe Leu Pro Gly Ala Gly Gln Glu Tyr Gly Gly Ile385                 390                 395                 400Leu Arg Arg Gly Ala Lys Leu Leu Tyr Ala Tyr Gly Glu Ala Thr Val
            405                 410                 415Pro Lys Ile Thr Val Thr Met Arg Lys Ala Tyr Gly Gly Ala Tyr Cys
        420                 425                 430Val Met Gly Ser Lys Gly Leu Gly Ser Asp Ile Asn Leu Ala Trp Pro
    435                 440                 445Thr Ala Gln Ile Ala Val Met Gly Ala Ala Gly Ala Val Gly Phe Ile
450                 455                 460Tyr Arg Lys Glu Leu Met Ala Ala Asp Ala Lys Gly Leu Asp Thr Val465                 470                 475                 480Ala Leu Ala Lys Ser Phe Glu Arg Glu Tyr Glu Asp His Met Leu Asn
            485                 490                 495Pro Tyr His Ala Ala Glu Arg Gly Leu Ile Asp Gly Val Ile Leu Pro
        500                 505                 510Ser Glu Thr Arg Gly Gln Ile Ser Arg Asn Leu Arg Leu Leu Lys His
    515                 520                 525Lys Asn Val Thr Arg Pro Ala Arg Lys His Gly Asn Met Pro Leu
530                 535                 540

Claims (7)

1.一段DNA，可编码：
(A)具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质，或具有SEQ IDNO：2所示氨基酸序列但其中第139位亮氨酸残基已换成除脯氨酸残基以外的氨基酸残基的蛋白质，该蛋白质具有温度敏感性DTSR活性，或
(B)包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中除第139位氨基酸残基以外的一或多个氨基酸残基的置换、缺失、插入、增加或倒位的氨基酸序列的蛋白质，或具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列但其中第139位亮氨酸残基已换成除脯氨酸残基以外的氨基酸残基的蛋白质，该蛋白质具有温度敏感性DTSR活性。
2.权利要求1的DNA，为：
(a)包含SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中第359-1987位碱基的核苷酸序列的DNA，或
(b)与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列中第359-1987位碱基的核苷酸序列在严紧条件下杂交、并编码具有温度敏感性DTSR活性的蛋白质的DNA。
3.权利要求1的DNA，其编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质。
4.含有权利要求1至3中任一项所限定的DNA、不含野生型DTSR蛋白、具有产L-谷氨酸能力的棒状细菌。
5.权利要求4的棒状细菌，还有产L-赖氨酸的能力。
6.生产L-谷氨酸的方法，包括以下步骤：
在液体培养基中培养权利要求4的棒状细菌以便在培养基中产生并积累L-谷氨酸，和从培养基中收集L-谷氨酸。
7.生产L-赖氨酸和L-谷氨酸的方法，包括以下步骤：
在液体培养基中培养权利要求5的棒状细菌以便在培养基中产生并积累L-赖氨酸和L-谷氨酸，和从培养基中收集L-赖氨酸和L-谷氨酸。
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Cited By (1)

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CN105018515A (zh) * 2015-07-15 2015-11-04 江西师范大学 一种利用谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌提高精氨酸产量的方法

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6822084B1 (en) 1999-06-25 2004-11-23 Basf Aktiengesellschaft Corynebacterium glutamicum genes encoding stress, resistance and tolerance proteins
KR20070087093A (ko) * 1999-06-25 2007-08-27 바스프 악티엔게젤샤프트 탄소 대사 및 에너지 생산과 관련된 단백질을 코딩하는코리네박테리움 글루타미쿰 유전자
HUP0203340A2 (hu) * 1999-06-25 2003-01-28 Basf Ag Stressz-, rezisztencia- és toleranciafehérjéket kódoló Corynebacterium glutamicum gének
EP1831250B1 (en) 2004-12-28 2015-05-06 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing microorganism and a method for producing l-glutamic acid
JP2008283863A (ja) 2005-08-26 2008-11-27 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造方法
JP5329055B2 (ja) * 2006-07-24 2013-10-30 東レ株式会社 変異型ピルビン酸脱炭酸酵素５遺伝子を有する酵母及び乳酸の製造方法
JP5660167B2 (ja) * 2006-07-24 2015-01-28 東レ株式会社 変異型ピルビン酸脱炭酸酵素５遺伝子を有する酵母及び乳酸の製造方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS57102193A (en) * 1980-12-17 1982-06-25 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd Preparation of l-glutamic acid
MY113040A (en) * 1994-02-24 2001-11-30 Ajinomoto Kk Novel gene derived from coryneform bacteria and use thereof
ES2191710T3 (es) * 1994-08-19 2003-09-16 Ajinomoto Kk Procedimiento para producir l-lisina y acido l-glutamico por fermentacion.
JPH1087A (ja) * 1996-06-17 1998-01-06 Ajinomoto Co Inc 発酵法による目的物質の製造法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105018515A (zh) * 2015-07-15 2015-11-04 江西师范大学 一种利用谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌提高精氨酸产量的方法

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