WO1999002692A1 - Genes dtsr sensibles a la temperature - Google Patents

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WO1999002692A1
WO1999002692A1 PCT/JP1998/003017 JP9803017W WO9902692A1 WO 1999002692 A1 WO1999002692 A1 WO 1999002692A1 JP 9803017 W JP9803017 W JP 9803017W WO 9902692 A1 WO9902692 A1 WO 9902692A1
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dna
seq
protein
gene
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PCT/JP1998/003017
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Inventor
Eiichiro Kimura
Chizu Yagoshi
Jun Nakamura
Tsuyoshi Osumi
Tsuyoshi Nakamatsu
Original Assignee
Ajinomoto Co., Inc.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/345—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Brevibacterium (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine

Definitions

  • the present invention relates to a temperature-sensitive A_L ⁇ R gene, and more particularly, to a gene that is involved in the resistance of a coryneform bacterium to a surfactant and encodes a protein having a temperature-sensitive mutation.
  • the present invention also relates to a coryneform bacterium having the gene and capable of producing L-lysine and L-glutamic acid, and a method for producing L-lysine and L-glutamic acid by a fermentation method using the coryneform bacterium.
  • L-lysine and L-glutamic acid have been industrially produced by a fermentation method using a coryneform bacterium belonging to the genus Brevipacterium or Corynepacterium which has the ability to produce these amino acids.
  • coryneform bacteria require biotin for growth, but it is known that L-glutamic acid does not accumulate in the presence of excess biotin in the medium. Therefore, in the conventional method for producing L-glutamic acid, the culture is performed in a medium with a limited biotin concentration, or when a medium containing a sufficient amount of biotin is used, the substance inhibiting the action of biotin at the first or during the culture is used.
  • a method of culturing a medium containing a surfactant or a lactam antibiotic is employed.
  • biotin-containing raw materials such as molasses as the carbon source of the culture medium
  • the substance that inhibits the action of biotin that needs to be added to the culture medium causes high production costs.
  • the present inventors have determined the presence of a gene (dtsR gene) encoding a protein (DTSR protein) derived from a bacterium belonging to the genus Corynebacterium and imparting resistance to the surfactant to the bacterium.
  • Coryneform L-glutamic acid-producing bacteria in which this gene has been disrupted produce significant amounts of L-glutamic acid even under conditions where the wild-type strain has an amount of biotin that hardly produces L-glutamic acid; and Coryneform L-daltamate-producing bacteria capable of producing L-lysine have been found to enhance the ability to produce L-lysine by amplifying the dtsR gene (W ⁇ 95/23224 International Publication Pamphlet).
  • the present inventors are able to stably produce L-glutamic acid even in the presence of biotin by imparting temperature sensitivity to a biotin-inhibiting substance to coryneform L_glutamic acid-producing bacteria, and By imparting L-lysine productivity to a temperature-sensitive strain against such a substance inhibiting the action of biotin, it is possible to stably produce L-lysine and L-glutamic acid simultaneously in the presence of biotin. Heading.
  • One of the means of imparting temperature sensitivity to coryneform bacteria to a substance that inhibits the action of biotin is temperature-sensitive mutant DTS.
  • Another object of the present invention is to provide a novel mutant ii_ ⁇ R gene encoding a temperature-sensitive mutant DTSR protein in order to effectively utilize the dtsR gene.
  • the present inventors have succeeded in obtaining a novel mutant __L ⁇ R gene encoding a DTSR protein having a temperature-sensitive mutation by mutating the already obtained R gene and completing the present invention. I came to.
  • the present invention provides a DNA encoding the protein shown in the following (A) or (B).
  • any of the above DNAs may be referred to as “gene of the present invention” or “mutated dts gene”, and the protein encoded by these DNAs may be referred to as “mutated DTSR protein”.
  • the present invention provides a coryneform bacterium that retains the gene of the present invention, does not retain a wild-type DTSR protein, and has an ability to produce L-glutamic acid; and culturing the coryneform bacterium in a liquid medium, And a method for producing L-glutamic acid, comprising producing and accumulating L-glutamic acid and collecting L-daltamic acid from the medium.
  • the present invention provides the above-mentioned coryneform bacterium further having an ability to produce L-lysine, and further, culturing this coryneform bacterium in a liquid medium to produce L-lysine and L-glutamic acid in the medium. It is intended to provide a method for producing L-lysine and L-glutamic acid, wherein L-lysine and L-glutamic acid are collected from the culture medium.
  • the DTSR activity is an activity of the DTSR protein, and specifically refers to an activity involved in the resistance to a surfactant in a coryneform bacterial cell.
  • the DTSR protein is, for example, a coryneform bacterium mutant (a coryneform bacterium that has grown poorly in a medium containing a surfactant at a concentration that does not affect the growth of a wild-type coryneform bacterium). (Mutant strain belonging to), which has the activity of losing sensitivity to detergents when present in cells of
  • the temperature-sensitive DTSR activity indicates DTSR activity at the optimal growth temperature of coryneform bacteria (31.5 ° C), but DTSR activity at 33 to 37 ° C or higher, preferably 34 ° C or higher. It refers to the property of decreasing.
  • coryneform bacterium refers to a Berzy's manual. A group of microorganisms defined in Bargey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th edition, p. 599 (1974), having aerobic, gram-positive, non-acid-fast, and sporulating ability. Bacteria that have been previously classified into the genus Brevipacterium, but are now integrated as corynepacteriums (Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)) And also includes bacteria of the genus Brevipacterium and Microbaterim, which are very closely related to the genus Corynepacterium.
  • the gene of the present invention is obtained by treating a recombinant DNA containing an A_iR gene derived from a wild-type coryneform bacterium with a mutagen, treating this with a detergent-sensitive mutant belonging to the coryneform bacterium, In a medium containing a detergent at a concentration that does not allow growth of a mutant strain into which the strain has not been introduced, a strain that grows at 31.5 ° C but does not grow at a higher temperature, for example, 35 ° C, is selected and obtained. The above-mentioned recombinant DNA is obtained from the above strain.
  • the dtsR gene derived from a wild-type coryneform bacterium can be obtained according to the method described in WO95Z23224, International Publication Pamphlet.
  • a method for obtaining a wild-type gene using a surfactant-sensitive mutant of a coryneform bacterium, and a method for obtaining a mutant dtsR gene using this wild-type dtsR gene will be described.
  • Chromosomal DNA is recovered from a wild type coryneform bacterium, for example, according to the method of Saito et al. (H. Saito and K. Miura Biochem. Biophys. Acta 72, 619 (1963)).
  • the recovered chromosomal DNA is cut with a restriction enzyme and ligated to a vector that functions in coryneform bacteria to obtain various recombinant DNAs.
  • the vector that functions in a coryneform bacterium is, for example, a plasmid that can autonomously replicate in a coryneform bacterium. Specific examples include the following.
  • pCG11 As above as a surfactant-sensitive mutant strain, for example, when the surfactant is polyoxyethylbitan monopalmitate, polyoxyethylene sorbitan monopalmitate at a concentration of 0.1 to lmg / dl is added. In the culture medium, a mutant having a bad growth as compared with a wild strain can be mentioned. The wild type coryneform bacterium showed no significant change in growth even in the medium containing the surfactant at a concentration of 0.1 to lmg / dl. Specific examples of such a surfactant-sensitive mutant include Corynepterium glutamicum AJ11060.
  • the strain has been deposited with the Ministry of International Trade and Industry at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Postal Code 305-0046, 1-3 1-3 Tsukuba-Higashi, Ibaraki, Japan), and accession number FERM P-3678. Has been granted.
  • Various recombinant DNAs obtained as described above can be introduced into a surfactant-sensitive mutant of a coryneform bacterium by following the transformation method reported so far.
  • a method of increasing the permeability of DNA by treating recipient cells with calcium chloride as reported for Escherichia coli K-12 (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)) and a method for preparing DNA from transgenic cells and introducing DNA as described in Bacillus subtilis (Duncan, CH, Wilson, GA and Young, FE, Gene, ⁇ , 153 (1977)).
  • the cells of the DNA recipient are transformed into protoplasts or spheroplasts that readily incorporate the recombinant DNA, and the recombinant DNA is (Chang, S. and Choen, SN, Mole Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb, MJ., WardJ.M. And Hopwood, OA, Nature, 274, 398 (1978); Hinnen, A., Hicks, JB and Fink, GR, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)).
  • the transformation method used in the examples of the present invention is an electric pulse method (Japanese Unexamined Patent Publication No. 2-207791). See).
  • the transformant was temporarily added to a detergent-free M-CM2G agar plate (glucose 5 g, polypeptone 10 g, yeast extract 10 g, NaC 15 g, DL-methionine 0.2 g).
  • a detergent-free M-CM2G agar plate (glucose 5 g, polypeptone 10 g, yeast extract 10 g, NaC 15 g, DL-methionine 0.2 g).
  • a strain that has lost surfactant sensitivity can be obtained.
  • Recombinant DNA is prepared from a transformant that has lost surfactant sensitivity in the same way as chromosomal DNA of wild-type coryneform bacterium, and the base of the chromosomal DNA fragment of wild-type coryneform bacterium linked to the vector Determine the sequence and confirm that the dtsR gene is included.
  • the dtsR gene can be obtained.
  • the dtsR gene is a DNA containing the i_R gene by PCR using an oligonucleotide prepared based on the nucleotide sequence of the _L ⁇ R gene already reported as a primer and a coryneform bacterium chromosome DNA as ⁇ . It can also be obtained by amplifying a fragment. Furthermore, the dts R gene can also be obtained by screening a coryneform bacterial chromosome library by hybridization using an oligonucleotide prepared based on the base sequence of the _d _ ⁇ _ R gene as a probe. it can.
  • the Escherichia coli-MJ09 / pDTR6 (Private Nampa AJ 12967) strain harboring plasmid pDTR6 containing the dtsR gene was established on February 22, 1994 Deposited with the National Institute of Biotechnology, Japan (zip code 305-0046, 1-3 1-3 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan) under accession number FERM P-14168, and internationally based on the Budapest Treaty on February 9, 1995 Transferred to the deposit and given accession number FERM BP-4994.
  • the mutant dtsR gene can be obtained by subjecting DNA containing the wild-type _l ⁇ _R gene to a mutation treatment. Specifically, the recombinant DNA containing the wild-type A ⁇ R gene is transformed with chemical agents such as sodium hyposulfite and hydroxylamine. Mutation treatment (Shortle, D. and Nathans, D., Pro Natl. Acad. Sci. USA. 75, 270 (1978)). The mutated recombinant DNA is introduced into a surfactant-sensitive mutant of a coryneform bacterium in the same manner as described above to obtain a transformant.
  • This transformant grows at 31.5 ° C in a medium containing a surfactant at a concentration that does not allow growth of the untransformed mutant, for example, 3 Omg / L of polyoxyethylene sorbitan monopalmitate. Select strains that do not grow above 33-37 ° C. By collecting the recombinant DNA from the selected strain, a mutant A_L ⁇ R gene can be obtained.
  • Examples of the gene of the present invention obtained as described above include a base of a mutant ⁇ I ⁇ R gene obtained by subjecting a dts R gene derived from Brevipacterium lactofermentum ATCC 13869 to a mutation treatment.
  • the sequence is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence of the mutant DTSR protein encoded by the mutant A ⁇ R gene.
  • the wild-type DTSR protein derived from Brevipacterium .lactofarmentum ATCC 13869 has an amino acid sequence in which the 139th amino acid residue in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is a Pro residue.
  • the wild-type A_LR gene of Brevipacterium 'lactofermentum ATCC 13869 strain has a nucleotide sequence in which the 774th base in SEQ ID NO: 1 is C.
  • mutant DTSR protein having temperature sensitivity and the nucleotide sequence of the mutant i_L ⁇ R gene encoding the mutant DTSR protein have been clarified.
  • Mutant A_L _ ⁇ _ R gene can also be obtained by introducing a mutation by a static mutation method (Kramer, W. and Frits, HJ, Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)). That is, in the wild-type dtsR gene, in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, the 139th codon encodes a Pro residue, which is replaced with an amino acid residue other than Pro, preferably L The eu residue may be replaced with a codon for coding.
  • the gene of the present invention comprises, in addition to the DNA having the nucleotide sequence represented by nucleotide numbers 359 to 1987 in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1, DNA encoding the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 2
  • the 139th eu residue contains a DNA encoding a sequence changed to another amino acid residue except Pro.
  • substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one or several amino acid residues occurs at positions other than the 139th amino acid residue in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the above DNA.
  • Such DNAs are included in the gene of the present invention, even if the mutation is added, as long as the encoded protein has temperature-sensitive DTSR activity.
  • DNA for example, carries the dtsR gene encoding the DTSR protein in which the 139th amino acid residue has been changed to an amino acid residue other than Pro, specifically the _i gene having the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the coryneform bacterium to be subjected to a mutation treatment, and a mutant obtained is obtained from a mutant having a stringency with DNA having at least a part of the base sequence represented by base numbers 359 to 1987 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. It can be obtained by isolating DNA that hybridizes under the conditions. It can also be isolated as a homologous or allelic variant.
  • Mutation treatment can be performed by irradiation with ultraviolet light or a mutagen that is commonly used for artificial mutation, such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) or nitrite. Is mentioned.
  • stringent conditions refer to conditions under which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. Although it is difficult to quantify these conditions clearly, one example is that DNAs with high homology, for example, DNAs with 90% or more homology, hybridize and become more homologous.
  • DNA encoding a DTSR protein containing substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of one or several amino acid residues at positions other than the 139th amino acid residue can be obtained by site-directed mutagenesis. It can be obtained by modifying a nucleotide sequence so that an amino acid residue at a specific site causes substitution, deletion, insertion, addition or inversion.
  • the position where the mutation can be introduced or the position where the mutation has occurred can be determined.
  • the position of the mutation to be introduced is not particularly limited as long as it does not substantially affect the temperature-sensitive DTSR activity.
  • the number of mutations introduced also depends on the position and type of the amino acid to be mutated in the three-dimensional structure of the protein, and is not particularly limited as long as it does not substantially affect the temperature-sensitive DTSR activity. -20, preferably 1-10.
  • the gene of the present invention can be suitably used for producing L-glutamic acid.
  • a coryneform bacterium that carries the gene of the present invention does not carry the wild-type DTSR protein, and has the ability to produce L-glutamic acid has temperature sensitivity to a surfactant.
  • a coryneform bacterium is grown by culturing at about 31.5 ° C and then shifted to a culturing temperature of 33 to 37 ° C or higher, the coryneform bacterium is interfaced in a medium containing an excessive amount of biotin. L-glutamic acid can be produced even in the absence of an activator.
  • a coryneform bacterium that retains the gene of the present invention, does not retain the wild-type DTSR protein, and has an ability to produce L-glutamic acid (hereinafter, also referred to as L-glutamic acid-producing bacterium of the present invention), and A method for producing L-glutamic acid is also provided, which comprises culturing the coryneform bacterium in a liquid medium, producing and accumulating L-glutamic acid in the medium, and collecting L-glutamic acid from the medium.
  • the L-glutamine-producing bacterium of the present invention uses a recombinant DNA containing the gene of the present invention in a homologous recombination technique (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press (1972); Matsuyama, S. and Mizushima, S., J. BacterioL. 162, 1196 (1985)) and the like, by substituting the wild-type ⁇ R gene on the chromosome of a coryneform bacterium capable of producing L-glutamic acid.
  • Known coryneform bacteria having the ability to produce L-glutamic acid can be used (for example, see WO96Z0618080, International Pamphlet).
  • liquid medium used for culturing the L-glutamic acid-producing bacterium an ordinary nutrient medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, a growth factor and the like is used.
  • the L-glutamine-producing bacterium has the ability to produce L-glutamic acid even when cultured in a liquid medium containing an excessive amount of biotin, without containing a biotin action inhibitor in the medium.
  • Examples of the carbon source include glucose, fructose, sucrose, molasses, carbohydrates such as hydrolyzed starch, alcohols such as ethanol and glycerol, and organic acids such as acetic acid.
  • Examples of the nitrogen source include ammonium sulfate, ammonium nitrate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium acetate, ammonia, sodium, meat extract, yeast extract, yeast extract, and corn steep liquor. When using auxotrophic L-glutamine-producing bacteria, add those required substances as a sample or a natural product containing it.
  • Fermentation is carried out for 2 to 7 days under aerobic conditions such as shaking culture and aeration and stirring culture while maintaining the pH of the culture solution between 5 and 9.
  • urea calcium carbonate, ammonia gas, aqueous ammonia, or the like is used.
  • the culture temperature is 24 to 37 ° C.
  • the culture is started at around 31.5 ° C, and the temperature is raised to 33 to 40 ° C, preferably around 37 ° C during the culture. This gives better results. That is, after the bacteria have been sufficiently grown near the optimal growth temperature, the temperature is increased during the cultivation, so that the production of L-glutamic acid is started without adding a substance inhibiting the action of biotin, and L-glutamic acid is produced and accumulated in a significant amount.
  • the method of collecting L-glutamic acid produced and accumulated in the culture solution may be a conventional method, for example, an ion exchange resin method, a crystallization method, or the like.
  • L-glutamic acid may be adsorbed and separated by an anion exchange resin, or may be subjected to neutralization crystallization.
  • L-glutamic acid producing bacterium further has an ability to produce L-lysine. You can.
  • Such a coryneform bacterium (hereinafter, also referred to as L-lysine-producing bacterium of the present invention) is cultured in a liquid medium to produce and accumulate L-lysine and L-glutamic acid in the medium.
  • L-lysine and L-glutamic acid can be produced by collecting glutamic acid from the medium.
  • the L-lysine-producing bacterium of the present invention is a coryneform bacterium having the ability to produce both L-lysine and L-glutamine by the method of homologous recombination as described above. By substituting the wild-type AJ_ ⁇ _R gene on the chromosome. Known coryneform bacteria having the ability to produce L-lysine and L-glutamic acid can be used (see, for example, WO96 / 06180, International Publication Pamphlet). Alternatively, the L-lysine-producing bacterium of the present invention can be prepared by imparting the L-lysine-producing ability to the L-glutamine-producing bacterium of the present invention according to the method described in Japanese Patent Publication No. 48-28078. Can be obtained.
  • the liquid medium used for culturing the L-lysine-producing bacteria of the present invention contains the same carbon source, nitrogen source, inorganic salts, growth factors, and the like as those used for culturing the L-glutamic acid-producing bacteria of the present invention. Normal nutrient media are used.
  • the L-lysine-producing bacterium of the present invention has the ability to produce L-lysine and L-glutamic acid without adding a biotin-inhibitory substance to the medium even when cultured in a liquid medium containing an excessive amount of biotin.
  • the fermentation is performed for 2 to 7 days under aerobic conditions such as shaking culture and aeration and stirring culture while maintaining the pH of the culture solution between 5 and 9.
  • urea, calcium carbonate, ammonia gas, aqueous ammonia, or the like is used.
  • the culture temperature is 24 to 37.
  • a better result can be obtained by initiating the culture at around 11.5 ° C, which is 1S31.5 ° C, and raising the temperature to 33 to 40 ° C, preferably around 34 ° C, during the culture. .
  • L-lysine is mainly produced around 31.5 ° C, but the rate of production of L-glutamic acid is increased by increasing the temperature during culturing.
  • the ratio of L-lysine to L-glutamic acid in the finally obtained culture solution can be controlled as desired.
  • the method of collecting L-lysine and L-glutamic acid produced and accumulated in the culture solution may be a conventional method, for example, an ion exchange resin method, a crystallization method, or the like.
  • Ion exchange tree In the fat method, L-lysine is first adsorbed and separated from the culture solution by a cation exchange resin, and then L-glutamic acid is adsorbed and separated by an anion exchange resin or neutralized by crystallization.
  • L-lysine and L-glutamic acid are used as a mixture, it is not necessary to separate these amino acids from each other.
  • L-glutamic acid productivity can be improved by enhancing the expression of a glutamate biosynthesis gene.
  • glutamate biosynthesis genes enhanced in cells include glycolytic phosphofructokinase (PFK: JP-A-63-102692), and the phosphoenolpyruvate in the anaplerotic pathway.
  • Carboxylase (PEPC, JP-A-60-87788, JP-A-62-55089), citrate synthase of the TCA cycle (CS, JP-A-62-201585, JP-A-63-119688), Aconitate hydratase (ACO, JP-A-62-294806), isoquenate dehydrogenase (ICDH, JP-A-62-166890, JP-A-63-214189), catalyzing an amination reaction Glutamate dehydrogenase (GDH, JP-A-61-268185).
  • L-lysine productivity can be improved by enhancing the lysine biosynthesis gene.
  • lysine biosynthesis genes enhanced in cells include aspartokinase subunit protein, in which synergistic feedback inhibition by L-lysine and L-threonine has been substantially released.
  • plasmid vector DNA 50 ⁇ g of plasmid vector DNA (pSAC4) 20 ⁇ g and restriction enzyme ⁇ lHI 200 units, which are autonomously replicable in both Escherichia coli and Corynebacterium bacteria Tris-HCl buffer (containing 100 mM NaC1 and 100 mM magnesium sulfate (pH 7.4)) was mixed and reacted at 37 ° C for 2 hours to obtain a digested solution. The solution was subjected to phenol extraction and ethanol precipitation by a conventional method. After this, the DNA fragment derived from the plasmid vector is prevented from religating ⁇ D, so that Molecular Cloning 2nd edition (J. Sambrook, EFFritsch and T.
  • the DNA fragment was dephosphorylated by Bacterial Alkaline Phosphatase treatment according to the above method, and the resulting mixture was subjected to phenol extraction by a conventional method, followed by ethanol precipitation.
  • the pSAC4 digested with BamHI was l / ig, and the chromosome of Brevipacterium 'Lactofamentum AT CC 13896' digested with Sau3AI obtained in ⁇ 1> 1 g of DNA fragment and 2 units of T4 DNA ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.) was added to 66 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 66 mM magnesium chloride, 1 OmM dithiothreitol and 10 mM ATP, and reacted at a temperature of 16 ° C for 16 hours to ligate DNA.
  • T4 DNA ligase T4 DNA ligase
  • the DNA mixture was used to transform Escherichia coli DH5 by a conventional method, and this was spread on an L agar medium containing 170 ⁇ g of Zm1 Kulamuk: n-nicole, and about 20,000 colonies were collected. I got the best gene library.
  • Recombinant DNA was recovered from about 20,000 colonies described above.
  • the method of recovery was based on the method of Saito and Miura shown above.
  • the recombinant DNA mixture divided into 50 batches was introduced into the mutant strain AJ11060 with increased sensitivity to detergents in accordance with the conventional method of transformation using the electric pulse method (Japanese Patent Laid-Open No. 2-207791). .
  • the transformants were inoculated on an agar L medium supplemented with glucose, and statically cultured at 31.5 ° C., thereby producing about 20,000 transformants.
  • these transformants were replied to the same plate containing 3 Omg / 1 of the detergent, and several strains which were resistant to the detergent and could grow on the plate were tested. Obtained.
  • Recombinant DNA was extracted from each of the several strains obtained above.
  • the J11060 strain was retransformed. Here also, a strain showing resistance to the surfactant was obtained.
  • the recombinant DNA contained in one of these strains was named pDTR6.
  • the AJ11060 strain into which pDTR6 had been introduced was inhibited from inhibiting growth in a liquid medium to which 3 g ZL of a surfactant was added (see W095 / 23224 International Publication Panflet).
  • pDTR6 plasmid was treated with hydroxylamine in a test tube according to the method described in the literature Shortle, D. and Nathans, D., Proc. Natl. Acad. Was introduced using the above-described electric pulse method.
  • About 20,000 transformants were cultured on M-CM2G agar medium at 25 ° C for 30 hours to form colonies.
  • Two plates of the plate were replated on the same plate medium containing 3 Omg / 1 surfactant. The cells were cultured at 31.5 ° C and 35 ° C for 20 hours. Then, one strain that grew at 31.5 ° C but did not grow at 35 ° C was obtained. Plasmid was extracted from this strain by a conventional method to obtain pDTR-117.
  • the pDTR-117 obtained above was introduced into Escherichia coli JM109.
  • the obtained Escherichia coli JM109 / pDTR-117 was pre-cultured for 24 hours at a temperature of 37 ° C in a medium 20 ml consisting of 1% tryptone, 0.5% yeast extract and 0.5% NaCl at a temperature of 37 ° C,
  • the obtained culture medium 2 Om1 was inoculated into medium 11 having the same composition as above, cultured at 37 ° C for 3 hours, 0.2 g of chloramphenicol was added, and further at the same temperature for 20 hours. Culture was performed to obtain a culture solution.
  • this culture solution was centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes to obtain 2 g of wet cells, which were suspended in 20 ml of 35 OmM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 25% sucrose. After turbidity, 10 mg of lysozyme (manufactured by Sigma), 8 ml of 0.25 M EDTA solution (pH 8.0) and 8 ml of a 20% sodium dodecyl sulfate solution were added thereto, and the temperature was 60 ° C. For 30 minutes to obtain a lysate.
  • lysozyme manufactured by Sigma
  • 8 ml of 0.25 M EDTA solution pH 8.0
  • 8 ml of a 20% sodium dodecyl sulfate solution were added thereto, and the temperature was 60 ° C. For 30 minutes to obtain a lysate.
  • the precipitate was dissolved in 6 ml of 1 OmM tris-monohydrochloride buffer (pH 7.5) containing ImM EDTA, and 6 g of cesium chloride and ethidium bromide ( (19 mg / ml) was added, and the DNA was isolated by equilibrium density gradient centrifugation using an ultracentrifuge at 39, OOOr. Pm for 42 hours. Furthermore, after removing ethidium bromide using n-butanol, the solution was purified by dialysis against 1 OmM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 1 mM EDTA. About 500 ⁇ 8 of the recombinant DNA pDTR-117 was obtained.
  • the nucleotide sequence of the cloned fragment of pDTR-117 was determined.
  • the nucleotide sequence was determined using Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (manufactured by Pride Noki Chemical) according to the method of Sanger.
  • the determined base sequence and its The amino acid sequence deduced therefrom is shown in SEQ ID NO: 1 of the Sequence Listing.
  • the amino acid sequence is also shown in SEQ ID NO: 2.
  • this cloned DNA fragment contained the entire coding region of the dtsR gene, and that in the wild-type dtsR gene, the C (cytosine) base at position 774 was replaced with T (thymine). . Due to this base substitution, the DTSR protein encoded has the Leu residue at the 139th amino acid residue, which is the Pr0 residue in the wild type.
  • the ⁇ R gene-substituted strain was obtained by a homologous recombination method using a temperature-sensitive plasmid described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-7491. Specifically, the above pDTR-117 was digested with XbaI and Kp ⁇ I to obtain a fragment containing the _L _ ⁇ _ R gene, and PHSG398 (manufactured by Takara Shuzo) was digested with Xbal and Kpnl. This was combined with the above by the above method to obtain pHSGX-K_17.
  • a plasmid pHSC4 Japanese Patent Laid-Open No. 5-7491 having a mutant replication origin whose self-renewal ability obtained from a plasmid capable of self-replication by a coryneform bacterium has become temperature-sensitive was converted to a restriction enzyme BamH. After digestion with I and KpnI, a gene fragment containing the replication origin was obtained. The obtained DNA fragment was blunt-ended using a DNA blunting kit (Takara Shuzo Co., Ltd., Blunting kit).
  • Plasmid pKTCX-K-117 was prepared by introducing into the KpnI recognition site of pHSGX-K-117 using nI linker (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.). Escherichia coli AJ 12571, which retains pHSC4, was established on October 11, 1990 by the Institute of Life Science and Industrial Technology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry. No. 3) and deposited under the Budapest Treaty on August 26, 1991 under the accession number FERM P_1 1 763, and deposited under the accession number FERM BP-3524.
  • Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 or each of the above strains was inoculated into a seed culture medium having the composition shown in Table 1, and cultured with shaking at 31.5 ° C for 24 hours to obtain a seed culture.
  • 300 ml of the main culture medium having the composition shown in Table 1 was dispensed into a 50-ml glass jar armamenter, sterilized by heating, and then inoculated with 40 ml of the above seed culture.
  • the culture was started at a culture temperature of 31.5 ° C with a stirring speed of 800 to 1300 rpra and an aeration rate of 1/2 to LZ of 1 m.
  • the pH of the culture was maintained at 7.5 with ammonia gas.
  • Eight hours after the start of the culture the culture temperature was shifted to 37 ° C. The case where the culture was continued at 31.5 ° C without shifting the culture temperature was used as a control.
  • the culture was terminated when glucose was completely consumed in 20 to 40 hours, and the amount of L-glutamic acid produced and accumulated in the culture solution was measured.
  • the present invention provides a mutant i_L ⁇ R gene encoding a mutant DTSR protein having a temperature-sensitive mutation to a surfactant.
  • a coryneform bacterium that retains the mutant DTSR protein but does not retain the wild-type DTSR protein has temperature sensitivity to a surfactant and can be used for production of L-glutamic acid and the like.

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Description

明細書
温度感受性 d t s R遺伝子 技術分野
本発明は、 温度感受性 A_L^R遺伝子に関し、 詳しくは、 コリネ型細菌の界面 活性剤に対する耐性に関与するタンパク質であって、 温度感受性変異を有するタ ンパク質をコードする遺伝子に関する。 また、 この遺伝子を保持し、 L一リジン 及ぴ L—グルタミン酸の生産能を有するコリネ型細菌及びこのコリネ型細菌を用 いる発酵法による Lーリジン及び L一グルタミン酸の製造方法に関する。 背景技術
従来、 L一リジン及び L一グルタミン酸は、 これらのアミノ酸生産能を有する ブレビパクテリゥム属やコリネパクテリゥム属に属するコリネ型細菌を用いて発 酵法により工業生産されている。 この方法では、 コリネ型細菌は生育にピオチン を要求する一方、 培地中に過剰量のピオチンが存在すると、 L—グルタミン酸が 蓄積しないことが知られている。 従って、 従来の L—グルタミン酸の製造法にお いては、 ビォチン濃度を制限した培地で培養するか、 あるいはピオチンを充分量 含有する培地を用いる場合には、 培養の初発または途上でピオチン作用抑制物質 として界面活性剤またはラクタム系抗生物質を培地に含有させて培養するかのい ずれかの方法が採用されている。 しかしながら、 特に培地の炭素源として廃糖蜜 等の安価ではあるが過剰量のピオチンを含有する原料を使用する場合、 培地に添 加することが必要なピオチン作用抑制物質が製造コスト高の原因となっていた。 これに対し、 本発明者らは、 コリネパクテリゥム属細菌に由来し、 該細菌に界 面活性剤に対する耐性を付与するタンパク質 （D T S R蛋白） をコードする遺伝 子 ( d t s R遺伝子) の存在を突き止め、 この遺伝子が破壊されたコリネ型 L— グルタミン酸生産菌は、 野生株がほとんど L—グルタミン酸を生成しない量のビ ォチンが存在する条件においても著量の L一グルタミン酸を生成すること、 及び、 Lーリジン生産能を有するコリネ型 L一ダルタミン酸生産菌は、 d t s R遺伝子 を増幅すると L—リジンを生産する能力が増強されることを見出している （W〇 95/23224号国際公開パンフレツト） 。
また、 本発明者らは、 コリネ型 L_グルタミン酸生産菌に、 ピオチン作用抑制 物質に対する温度感受性を付与することにより、 ピオチン存在下でも安定して L —グルタミン酸を発酵生産することができること、 及び、 このようなピオチン作 用抑制物質に対する温度感受性株に L—リジン生産性を付与することにより、 ビ ォチン存在下でも、 安定して L—リジンと L—グルタミン酸を同時に発酵生産す ることができることを見出している。 そして、 コリネ型細菌にピオチン作用抑制 物質に対する温度感受性を付与する手段の一つとして、 温度感受性変異型 DTS
R蛋白をコードする変異型！^^ R遺伝子を用いた遺伝子置換を開示している (WO 96/06180号国際公開パンフレツト） 。 発明の開示
上記したように、 コリネ型細菌を用いた発酵法によるアミノ酸の製造において、 _ _L _R遺伝子の有効な利用法が開発されている。 本発明は、 さらに d t s R遺 伝子を有効に利用するために、 温度感受性変異型 DTSR蛋白をコードする新規 な変異型 ii_^R遺伝子を提供することを課題とする。
本発明者は、 すでに取得されている R遺伝子に変異処理を行い、 温度感 受性変異を有する DTSR蛋白をコードする新規な変異型 __L^R遺伝子を取得 することに成功し、 本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、 下記 （A) 又は （B) に示すタンパク質をコードする DN Aを提供する。
(A) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列、 または配列番号 2記載のアミノ酸配列 の 139番目の L e u残基が P r oを除く他のアミノ酸残基に変化した配列を有 し、 温度感受性 DTSR活性を有するタンパク質。
(B) 配列番号 2記載のァミノ酸配列、 または配列番号 2記載のァミノ酸配列の 139番目の L e u残基が P r oを除く他のアミノ酸残基に変化した配列におい て、 さらに、 139番目のアミノ酸残基以外の位置における 1若しくは数個のァ ミノ酸残基の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、 か つ、 温度感受性 DTSR活性を有するタンパク質。 上記 DN Aとして具体的には、 下記 （a) 又は （b) に示す DN Aが挙げられ る。
( a ) 配列番号 1に記載の塩基配列のうち、 塩基番号 359〜 1987からなる 塩基配列を含む DNA。
( b ) 配列番号 1に記載の塩基配列のうち、 塩基番号 359〜 1987からなる 塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DN Aであって、 か つ、 温度感受性 DTSR活性を有するタンパク質をコ一ドする DNA。
以下、 上記のいずれかの DN Aを、 「本発明の遺伝子」 又は 「変異型 d t s遺 伝子」 、 これらの DNAがコ一ドするタンパク質を 「変異型 DTSRタンパク質」 ということがある。
また、 本発明は、 本発明の遺伝子を保持し、 野生型 DTSRタンパク質を保持 せず、 L—グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌、 及び、 このコリネ型細菌 を、 液体培地で培養し、 培地中に、 L—グルタミン酸を生成蓄積させ、 L—ダル タミン酸を該培地から採取することを特徴とする L一グルタミン酸の製造方法を 提供する。
さらに、 本発明は、 L一リジン生産能をさらに有する上記コリネ型細菌、 並ぴ に、 このコリネ型細菌を、 液体培地で培養し、 培地中に、 L—リジン及び Lーグ ルタミン酸を生成蓄積させ、 L—リジン及び L—グルタミン酸を該培地から採取 することを特徴とする L—リジン及び L—グルタミン酸の製造方法を提供する。 尚、 本発明において DTSR活性とは、 DTSRタンパク質が有する活性であ つて、 具体的には、 コリネ型細菌細胞中で界面活性剤に対する耐性に関与する活 性をいう。 DTSRタンパク質は、 例えば、 コリネ型細菌の界面活性剤変異株 (野生型のコリネ型細菌の生育に影響を与えない濃度の界面活性剤が存在する培 地中で、 生育が悪くなつたコリネ型細菌に属する変異株） の細胞中に存在させた ときに、 界面活' 剤に対する感受性を失わせる活性を有する。
また、 温度感受性 DTSR活性とは、 コリネ型細菌の最適生育温度 （31. 5 °C) では DT S R活性を示すが、 33なぃし37°じ以上、 好ましくは 34°C以上 では D T S R活性が低下する性質をいう。
また、 本発明にいうコリネ型細菌とは、 バージーズ ·マニュアル ·ォブ .デタ 一ミネイティブ ·ノ クテリォロジ一 (Bargey's Manual of Determinative Bacteriology) 第 8版 599頁 （1 974) に定義されている一群の微生物であ り、 好気性、 グラム陽性、 非抗酸性、 胞子形成能を有しない桿菌であり、 従来ブ レビパクテリゥム属に分類されていたが現在コリネパクテリゥム属細菌として統 合されたブレビパクテリゥム属細菌 （Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)) を含 み、 またコリネパクテリゥム属細菌と非常に近縁なブレビパクテリゥム属細菌及 びミクロバテリゥム属細菌を含む。
以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明の遺伝子は、 野生型コリネ型細菌由来の A _iR遺伝子を含む組換え D NAを変異剤処理し、 これをコリネ型細菌に属する界面活性剤感受性変異株に導 入し、 組換え DN Aが導入されていない変異株が生育できない濃度の界面活性剤 を含む培地において、 31. 5°Cでは生育するが、 これよりも高い温度、 例えば 35°Cでは生育しない株を選択し、 得られた株より前記組換え DNAを回収する ことによって得られる。
野生型コリネ型細菌由来の d t s R遺伝子は、 WO95Z23224号国際公 開パンフレツトに記載されている方法にしたがって取得することができる。 以下 に、 コリネ型細菌の界面活性剤感受性変異株を利用して野生型 遺伝子を 取得する方法、 及びこの野生型 d t s R遺伝子を用いて変異型 d t s R遺伝子を 取得する方法を説明する。
コリネ型細菌の野生株から、 例えば斎藤らの方法 （H. Saito and K. Miura Biochem. Biophys. Acta 72， 619 (1963)) に従い染色体 D N Aを回収する。 回収した 染色体 DNAを制限酵素を用いて切断し、 コリネ型細菌で機能するベクターに連 結し、 各種組換え DN Aを得る。
前記コリネ型細菌で機能するベクターとは、 例えばコリネ型細菌で自律複製で きるプラスミ ドである。 具体的に例示すれば、 以下のものがあげられる。
(1) AM 330 特開昭 58— 67699号公報参照
(2) pHM 1519 特開昭 58— 77895号公報参照
(3) pAJ 655 特開昭 58— 192900号公報参照
(4) p A J 61 1 同 上 (5) pAJ 1844 同 上
(6) p CG 1 特開昭 57— 1 34500号公報参照
(7) p CG 2 特開昭 58— 35 197号公報参照
(8) p CG 4 特開昭 57— 183799号公報参照
(9) p CG 1 1 同 上 界面活性剤感受性変異株としては、 例えば界面活性剤がポリオキシェチ ルビタンモノパルミテートの場合、 0. 1〜 lmg/dlの濃度のポリオキシェチレ ンソルビタンモノパルミテート添加された培地で、 生育が野生株と比較して悪レヽ 変異株が挙げられる。 尚、 野生型のコリネ型細菌は 0. 1〜 lmg/dlの濃度の上 記界面活性剤が添加された培地中でも生育に大きな変化はみられない。 このよう な界面活性剤感受性変異株としては、 具体的には、 コリネパクテリゥム · グルタ ミカム AJ 1 1060が挙げられる。 同株は通商産業省工業技術院生命工学ェ 業技術研究所 （郵便番号 305- 0046 日本国茨城県つくば巿東一丁目 1番 3号） に 寄託されており、 受託番号 FERM P— 36 78が付与されている。
上記のようにして得られる各種組換え DNAをコリネ型細菌の界面活性剤感受 性変異株に導入するには、 これまでに報告されている形質転換法に従って行えば よレヽ。 例えば、 ェシェリヒア ' コリ K— 1 2について報告されているような、 受容菌細胞を塩化カルシウムで処理して DN Aの透過性を増す方法 （Mandel，M. and Higa，A.， J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)) があり、 バチルス ·ズブチリスについて 報告されているような、 増殖段階の細胞からコンビテントセルを調製して DNA を導入する方法 （Duncan，C.H.， Wilson,G.A. and Young,F.E., Gene,丄， 153 (1977)) が ある。 あるいは、 バチルス 'ズブチリス、 放線菌類及び酵母について知られてい るような、 DNA受容菌の細胞を、 組換え DNAを容易に取り込むプロ トプラス トまたはスフエロプラストの状態にして組換え DNAを DNA受容菌に導入する 方法 （Chang,S. and Choen，S.N.， Mole Gen. Genet., 168, 111 (1979); Bibb，MJ.， WardJ.M. and Hopwood,O.A., Nature, 274, 398 (1978); Hinnen,A., Hicks, J.B. and Fink，G.R.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978)) も応用できる。 本発明の実 施例で用いた形質転換の方法は、 電気パルス法 （特開平 2— 207791号公報 参照） である。
次に、 形質転換株を、 一旦、 界面活性剤を含まない M— CM 2 G寒天プレート (グルコース 5 g、 ポリペプトン 10 g、 酵母エキス 10 g、 Na C 1 5 g、 D L—メチォニン 0. 2 g、 寒天 15 g及びク口ラムフエニコ一ル 4 m gを純水 1 Lに含む。 pH7. 2) に塗布して数万個のコロニーを形成させる。 当該コロニ —を 30 m g/Lの界面活性剤 （Tween40) を含む M— C M 2 Gプレートにレプ リカし、 界面活性剤含有 M— CM 2 Gプレート上で良好な生育を示すものを取得 することにより、 界面活性剤感受性を失った株を取得できる。
界面活性剤感受性が失われた形質転換株より組換え DN Aを、 野生型コリネ型 細菌の染色体 DNAと同様にして調製、 ベクターに連結されている野生型コリネ 型細菌の染色体 DN A断片の塩基配列を決定し、 d t s R遺伝子が含まれている ことを確認する。
以上のようにして、 d t s R遺伝子を取得することができる。
また、 d t s R遺伝子は、 すでに報告されている _L^R遺伝子の塩基配列に 基づいて作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、 コリネ型細菌染色体 D NAを铸型とする P CRによって i _R遺伝子を含む DNA断片を増幅するこ とによっても、 取得することができる。 さらに、 _d_^_R遺伝子の塩基配列に基 づいて作製したオリゴヌクレオチドをプローブとするハイブリダイゼ一ションに よって、 コリネ型細菌染色体ライブラリ一をスクリーニングすることによつても、 d t s R遺伝子を取得することができる。
なお、 d t s R遺伝子を含むプラスミ ド p DTR 6を保持するェシヱリ ヒア - コリ J Ml 09/p DTR 6 (プライベートナンパ一 A J 12967) 株は、 1 994年 2月 22日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所 （郵便番号 305-0046 日本国茨城県つくば市東一丁目 1番 3号） に受託番号 FERM P— 14168として寄託され、 1995年 2月 9日にブダぺスト条約に基づく国際 寄託に移管され、 受託番号 FERM B P— 4994が付与されている。
変異型 d t s R遺伝子は、 野生型 _l^_R遺伝子を含む DNAに変異処理を施 すことによって得ることができる。 具体的には、 野生型 A^^R遺伝子を含む組 換え DNAを、 次亜硫酸ナトリウム、 ヒ ドロキシルァミン等の化学薬剤によって 変異処理する （Shortle, D. and Nathans, D.， Pro Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 75, 270(1978)) 。 変異処理した組換え DN Aを、 上記と同様にしてコリネ型細菌の 界面活性剤感受性変異株に導入し、 形質転換体を得る。 この形質転換体から、 形 質転換されていない変異株が生育できない濃度の界面活性剤、 例えば 3 Omg/ Lのポリオキシエチレンソルビタンモノパルミテートを含む培地において、 31. 5°Cでは生育するが 33ないし 37°C以上では生育しない株を選択する。 選択さ れた株より前記組換え DN Aを回収すれば、 変異型 A_L^R遺伝子を得ることが できる。
上記のようにして得られる本発明の遺伝子の例として、 ブレビパクテリゥム · ラク トフアーメンタム ATCC 13869株由来の d t s R遺伝子に変異処理 を施して得られた変異型 ^I^R遺伝子の塩基配列を、 配列表の配列番号 1に示 す。 また、 変異型 A ^R遺伝子がコードする変異型 DTSRタンパク質のアミ ノ酸配列を配列番号 2に示す。 尚、 ブレビパクテリゥム . ラク トフアーメンタム ATCC 13869株由来の野生型 DTSRタンパク質は、 配列番号 2に示す アミノ酸配列において 139番目のアミノ酸残基が P r o残基であるアミノ酸配 列を有する。 また、 ブレビパクテリゥム ' ラク トファーメンタム ATCC 13 869株の野生型 A_L R遺伝子は、 配列番号 1において 774番目の塩基が C である塩基配列を有する。
本発明により、 温度感受性を有する変異型 DTSRタンパク質のアミノ酸配列、 及び変異型 DT SRタンパク質をコードする変異型 i_L^R遺伝子の塩基配列が 明らかとなったので、 野生型 d t s R遺伝子に、 部位特異的変異法 （Kramer, W. and Frits, H. J., Methods in Enzymology, 154, 350 (1987)) によって変異を導入する ことによつても、 変異型 A_L_^_R遺伝子を取得することができる。 すなわち、 野 生型 d t s R遺伝子では、 配列番号 1に示すアミノ酸配列において、 139番目 のコ ドンは P r o残基をコードしているが、 これを、 P r o以外のアミノ酸残基、 好ましくは L e u残基をコ一ドするコドンに置換すればよい。 P r o以外のァミ ノ酸残基としては、 139番目の P r o残基をそのアミノ酸残基に変化させたと きに、 変異型 DT S Rタンパク質が温度感受性 DT S R活性を有するものであれ ば特に制限されないが、 好ましくは L e u残基が挙げられる。 本発明の遺伝子は、 配列番号 1に示す塩基配列において塩基番号 359〜19 87で表される塩基配列を有する DNAの他に、 配列番号 2に示すアミノ酸配列 をコードする DNA、 及ぴ配列番号 2に示すアミノ酸配列において、 139番目 の e u残基が、 P r oを除く他のアミノ酸残基に変化した配列をコードする D NAを含む。 また、 上記 DNAに、 配列番号 2に記載のアミノ酸配列における 1 39番目のアミノ酸残基以外の位置において、 1若しくは数個のアミノ酸残基の 置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を生じる変異が加わっても、 コードされるタ ンパク質が温度感受性 DTSR活性を有する限り、 そのような DN Aは本発明の 遺伝子に含まれる。
配列番号 2に記載のアミノ酸配列における 139番目のアミノ酸残基以外の位 置において 1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位 を含むアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする DNAは、 例えば、 139 番目のアミノ酸残基が P r o以外のアミノ酸残基に変化した DT S Rタンパク質 をコードする d t s R遺伝子、 具体的には配列番号 1に示す塩基配列を有する _i 遺伝子を保持するコリネ型細菌を突然変異処理し、 得られる変異株から、 配列表の配列番号 1に示す塩基配列において塩基番号 359〜1987で表され る塩基配列の少なく とも一部を有する DNAとストリンジェントな条件下でハイ ブリダィズする DNAを単離することによって、 取得され得る。 また、 同種変異 体または対立遺伝子変異体としても単離され得る。
突然変異処理としては、 紫外線照射または N—メチル一N'—二トロ— N—二トロ ソグァ二ジン （NTG) もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられている変 異剤によって処理する方法が挙げられる。
上記の 「ストリンジェントな条件」 とは、 いわゆる特異的なハイプリッドが形 成され、 非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。 この条件を明確に 数値化することは困難であるが、 一例を示せば、 相同性が高い DN A同士、 例え ば 90%以上の相同性を有する DN A同士がハイプリダイズし、 それより相同性 が低い D N A同士がハイブリダィズしない条件、 あるいは温度が完全にマッチし たハイブリッドの Trr！〜 （Tm— 30) °C、 好ましくは Τπ！〜 （Tm— 20) 。C の範囲で、 かつ 1 X S SC、 好ましくは 0. 1 X S S Cに相当する塩濃度でハイ プリダイズする条件が挙げられる。
また、 139番目のアミノ酸残基以外の位置における 1若しくは数個のァミノ 酸残基の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含む DTSRタンパク質をコード する DNAは、 部位特異的変異法によって、 特定の部位のアミノ酸残基が置換、 欠失、 挿入、 付加又は逆位を起こすように塩基配列を改変することによって得ら れる。
上記のようにして得られる DNAのうち、 温度感受性 DTSR活性を有し、 か つ、 139番目のアミノ酸残基以外の部位において変異が生じた DTSRタンパ ク質をコードするものを選択することによって、 変異を導入することができる位 置、 又は変異が生じた位置を決定することができる。 導入される変異の位置は、 温度感受性 DTSR活性に実質的に影響のない限り、 特に制限されない。 また、 導入される変異の数は、 タンパク質の立体構造における変異されるアミノ酸の位 置や種類によっても異なり、 温度感受性 DT S R活性に実質的に影響のない限り、 特に制限されないが、 通常、 1〜20個、 好ましくは 1〜 10個である。
本発明の遺伝子は、 L—グルタミン酸の製造に好適に利用することができる。 例えば、 本発明の遺伝子を保持し、 野生型 DTSRタンパク質を保持せず、 かつ、 L一グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌は、 界面活性剤に対する温度感受 性を有する。 このようなコリネ型細菌は、 31. 5 °C程度で培養して生育させた 後に、 培養温度を 33ないし 37 °C以上にシフ卜させると、 過剰量のピオチンを 含有する培地中にて界面活性剤の非存在下でも、 L一グルタミン酸を生産するこ とができる。
従って、 本発明により、 本発明の遺伝子を保持し、 野生型 DTSRタンパク質 を保持せず、 L—グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌 （以下、 本発明の L 一グルタミン酸生産菌ともいう） 、 及び、 このコリネ型細菌を、 液体培地で培養 し、 培地中に、 L一グルタミン酸を生成蓄積させ、 L一グルタミン酸を該培地か ら採取することを特徴とする L一グルタミン酸の製造方法も提供される。
本発明の L一グルタミン生産菌は、 本発明の遺伝子を含む組換え DNAを、 既 に確立している相同組換えの手法 (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory press (1972); Matsuyama, S. and Mizushima, S., J. BacterioL. 162, 1196(1985)) 等により、 L—グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌の染色体 上の野生型^^^ R遺伝子と置換することによって、 取得することができる。 L —グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌は、 公知のものを使用できる （例え ば、 WO 9 6 Z 0 6 1 8 0号国際公開パンフレツト参照） 。
本発明において上記 L一グルタミン酸生産菌の培養に用いられる液体培地とし ては、 炭素源、 窒素源、 無機塩類、 生育因子等を含有する通常の栄養培地が用い られる。 上記 L一グルタミン生産菌は、 過剰量のピオチンを含有する液体培地で 培養してもピオチン作用抑制物質を培地に含有させることなく L—グルタミン酸 を生産する能力を有する。
炭素源としては、 グルコース、 フラク トース、 シュクロース、 廃糖蜜、 澱粉加 水分解物等の炭水化物、 エタノール、 グリセロール等のアルコール類、 酢酸等の 有機酸類が使用される。 窒素源としては、 硫酸アンモユウム、 硝酸アンモニゥム、 塩化アンモニゥム、 リン酸アンモニゥム、 酢酸アンモニゥム、 アンモニア、 ぺプ トン、 肉エキス、 酵母エキス、 酵母エキス、 コーン . スティ一プ · リカー等が使 用される。 栄養要求性を有する L—グルタミン生産菌を用いる場合には、 それら の要求物質を標品もしくはそれを含有する天然物として添加する。
発酵は、 振とう培養、 通気撹拌培養等による好気条件下にて、 培養液の p Hを 5〜 9の間に保持しつつ 2〜 7日間行う。 p Hの調節には、 尿素、 炭酸カルシゥ ム、 アンモニアガス、 アンモニア水等を用いる。 培養温度は 2 4〜 3 7 °Cである 力 3 1 . 5 °C付近で培養を開始し、 培養の途中で 3 3〜4 0 °C、 好ましくは 3 7 °C付近に温度を上昇させることによりさらに良好な結果が得られる。 すなわち、 生育至適温度付近にて菌を十分増殖させた後、 培養途中で温度を上昇させること により、 ピオチン作用抑制物質を添加することなく、 L—グルタミン酸の生産が 開始され、 培養液中に L一グルタミン酸が著量、 生成蓄積される。
培養液中に生成蓄積した L一グルタミン酸を採取する方法は常法によって行え ばよく、 例えばイオン交換樹脂法、 晶析法等によることができる。 具体的には、 L—グルタミン酸を陰イオン交換樹脂により吸着、 分離させるか、 または中和晶 析させればよレ、。
上記 L—グルタミン酸生産菌は、 さらに Lーリジン生産能を有するものであつ てもよレ、。 このようなコリネ型細菌 （以下、 本発明の L—リジン生産菌ともいう） を、 液体培地で培養し、 培地中に、 L一リジン及び L一グルタミン酸を生成蓄積 させ、 L—リジン及び L—グルタミン酸を該培地から採取することにより Lーリ ジン及び L—グルタミン酸を製造できる。
本発明の L—リジン生産菌は、 上記のように相同組換えの手法等により、 本発 明の遺伝子を含む組換え D N Aを、 Lーリジン及び L—グルタミンの両方の生産 能を有するコリネ型細菌の染色体上の野生型 AJ_§_R遺伝子と置換することによ つて、 取得することができる。 L—リジン及び L—グルタミン酸の生産能を有す るコリネ型細菌は、 公知のものを使用できる （例えば、 WO 9 6 / 0 6 1 8 0号 国際公開パンフレッ ト参照） 。 あるいは、 本発明の L—グルタミン生産菌に、 特 公昭 4 8— 2 8 0 7 8号公報などに記載の方法に従って Lーリジン生産能を付与 することによつても本発明の L—リジン生産菌を取得することができる。
本発明の L—リジン生産菌の培養に用いられる液体培地としては、 本発明の L —グルタミン酸生産菌の培養に用いられるのと同様の炭素源、 窒素源、 無機塩類、 生育因子等を含有する通常の栄養培地が用いられる。 本発明の L一リジン生産菌 は、 過剰量のピオチンを含有する液体培地で培養してもピオチン作用抑制物質を 培地に含有させることなく Lーリジン及び L—グルタミン酸を生産する能力を有 する。
発酵は、 振とう培養、 通気撹拌培養等による好気条件下にて、 培養液の p Hを 5〜9の間に保持しつつ 2〜7日間行う。 p Hの調節には、 尿素、 炭酸カルシゥ ム、 アンモニアガス、 アンモニア水等を用いる。 培養温度は 2 4〜3 7。Cである 1S 3 1 . 5 °C付近で培養を開始し、 培養の途中で 3 3〜4 0 °C、 好ましくは 3 4 °C付近に温度を上昇させることによりさらに良好な結果が得られる。 すなわち、 3 1 . 5 °C付近では主として L—リジンを生成するが、 培養途中で温度を上昇さ せることにより L—グルタミン酸の生成される割合が增加する。 これを利用して 最終的に得られる培養液中の L—リジンと L一グルタミン酸の比率を望ましいも のに制御することができる。
培養液中に生成蓄積した L—リジンと L一グルタミン酸を採取する方法は常法 でよく、 例えばイオン交換樹脂法、 晶析法等によることができる。 イオン交換樹 脂法では、 培養液からまず陽イオン交換樹脂により L—リジンを吸着、 分離させ、 ついで L—グルタミン酸は陰イオン交換樹脂により吸着、 分離させるかまたは中 和晶析させる。 L—リジンと L—グルタミン酸を混合物として用いる場合にはも ちろんこれらのァミノ酸を相互に分離することは不要である。
本発明の L—グルタミン酸生産菌及び L—リジン生産菌においては、 グルタミ ン酸生合成系遺伝子の発現を強化することにより、 L—グルタミン酸生産性を向 上させることができる。 細胞中で強化されたグルタミン酸生合成系遺伝子の例と しては、 解糖系のホスフォフルク トキナ一ゼ （P FK：、 特開昭 63 - 10269 2号） 、 アナプレロティック経路のホスホエノ一ルビルビン酸カルボキシラーゼ (PEPC、 特開昭 60— 87788号、 特開昭 62— 55089号） 、 TCA 回路のクェン酸合成酵素 （CS、 特開昭 62— 201 585号、 特開昭 63— 1 19688号） 、 アコニット酸ヒ ドラタ一ゼ （ACO、 特開昭 62 - 29408 6号） 、 イソクェン酸デヒ ドロゲナーゼ （ I CDH、 特開昭 62- 166890 号、 特開昭 63— 214189号） 、 アミノ化反応を触媒するグルタミン酸デヒ ドロゲナーゼ （GDH、 特開昭 61— 268185号） 等の遺伝子がある。
さらに、 本発明の L一リジン生産菌においては、 リジン生合成系遺伝子を強化 することによって、 L—リジン生産性を向上させることができる。 細胞中で強化 されたリジン生合成系遺伝子の例としては、 L—リジン及び L—スレオニンによ る相乗的なフィ一ドバック阻害が実質的に解除されたァスパルトキナーゼひサブ ュニット蛋白質又は ]3サブュニット蛋白質をコードする遺伝子 （W094/25605国際 公開パンフレッ ト） 、 コリネホルム細菌由来の野生型ホスホェノールピルビン酸 カルボキシラーゼ遺伝子 （特開昭 60- 87788号公報） 、 コリネホルム細菌由来の野 生型ジヒ ドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子 （特公平 6- 55149号公報） 等が知られている。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例により本発明を更に具体的に説明する。
< 1 >ブレビバクテリ ゥム . ラク トフアーメンタム ATC C 13869 (コリネ バタテリゥム属細菌の野生株） の染色体 DNAの調製 ブレビパクテリゥム . ラク トフアーメンタム ATC C 1 3 8 6 9を T一 Y培 ¾ (B a c t o— t r y p t o n (D i f c o) l %、 B a c t o— y e a s t e x t r a c t (D i f c o) 0. 5 %、 N a C 1 0. 5 % (p H 7. 2) ) 1 00m lに接種し、 温度 3 1. 5 °Cで 8時間培養し、 培養物を得た。 この培養 物を 3,000r.p.m.で 1 5分間、 遠心分離処理し湿潤菌体 0. 5 gを得た後、 該菌 体から斎藤、 三浦の方法 (Biochem. Biophys. Acta., 72, 619 (1963)) により染色体 DNAを得た。 次いで、 この染色体 DNA 6 0 μ g 及び制限酵素 Sau3A I、 3 ユニットを 1 O mMトリス—塩酸緩衝液 （5 OmM N a C l、 1 0 mM Mg S O4及び I mM ジチオスレイ ト一ル含有 （p H 7. 4) ) におのおの混合 し、 温度 3 7 °Cで 3 0分間反応させた。 反応終了液を常法により、 フエノール抽 出処理し、 エタノール沈澱処理して Sau3A Iで消化されたブレビバクテリゥム · ラク トフアーメンタム ATC C 1 3 8 6 9の染色体 DNA断片 5 0 g を得 た。
< 2 >プラスミ ドベクター DN Aを利用したブレビパクテリゥム . ラタ トファ一 メンタム ATC C 1 3 8 6 9の遺伝子ライブラリーの作製
ェシエリヒア ' コリとコリネパクテリゥム属細菌の双方の菌体内で自律複製可 能なプラスミ ドベクタ一 DN A (p S AC 4) 2 0 μ g 及び制限酵素^ lH I 2 0 0ュニットを 5 0 mMトリス—塩酸緩衝液 （1 0 0 mM N a C 1及び 1 0m M硫酸マグネシウム含有 （p H 7. 4) ) に混合し、 温度 3 7 °Cで 2時間反応さ せて消化液を得、 該液を常法によりフエノール抽出及びエタノール沈澱処理した。 この後、 プラスミ ドベクター由来の DNAフラグメントが再結合することを防止 す <Dため、 Molecular Cloning 2nd edition (J.Sambrook, E.F.Fritsch and T.Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pl.56 (1989)) の方法で バクテリァノレアルカ リホスファターゼ （Bacterial Alkaline Phosphatase) 処理により、 DNA断片の脱 リン酸化を行い、 常法によりフヱノール抽出処理し、 更にエタノール沈澱処理を 行った。
この BamH Iで消化された p S AC 4を l /i g、 < 1 >で得られた Sau3A Iで消 化されたブレビパクテリゥム ' ラク トフアーメンタム AT C C 1 3 8 6 9の染 色体 DNA断片を 1 g、 及び 2ュニッ 卜の T 4 DNAリガーゼ （宝酒造 （株） 製） を、 66 mM塩化マグネシウム、 1 OmMジチオスレィ トール及び 10 mM ATPを含有する 66 mMトリス—塩酸緩衝液 （pH7. 5) に添加し、 温度 16°Cで 16時間反応し、 DNAを連結させた。 次いで該 DNA混合物で、 常法 によりェシエリヒア · コリ DH 5を形質転換し、 これを 170 μ gZm 1のク 口ラムフ: n二コールを含む L寒天培地上にまき、 約 20， 000個のコロニーを得、 遺 伝子ライブラリ一とした。
< 3〉遺伝子ライブラリー DN Aによるブレビバクテリウム · ラク トフアーメン タム A J 1 1060の形質転換
上記で述べた約 20， 000個のコロニーより、 組換え DNAの回収を行なった。 回 収の方法は上記に示した斎藤、 三浦の方法に従った。
50のバッチに分けた組換え D N A混合物を電気パルス法を用いた形質転換の 常法 （特開平 2— 207791号公報） に従い、 界面活性剤に対する感受性が上 昇した変異株 A J 11060株に導入した。 形質転換体をグルコース添加寒天 L 培地上に接種し、 31. 5°Cで静置培養を行ない、 約 20, 000個の形質転換体を出 現させた。 次にこれらの形質転換体を界面活性剤 3 Omg/ 1を含む同プレート にレプリ力し、 この中で界面活性剤に対して耐性を示し上記プレート上で生育可 能であった株を数株得た。
上記で得られた数株からそれぞれ組換え D N Aを抽出し、 同 DNAを用いて A
J 11060株を再形質転換した。 ここでも界面活性剤に対して耐性を示した株 を得た。 これらの株の 1株が保持していた組換え DNAを pDTR6と命名した。 p DTR 6を導入した A J 1 1060菌は、 3 g ZLの界面活性剤を添加した液 体培地での生育阻害が抑制されていた （W095/23224号国際公開パンフ レツ ト参照） 。
< 4：>変異型 d t s R遺伝子の取得
pDTR6プラスミ ドを、 文献 Shortle, D. and Nathans, D.， Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75, 270(1978)に記載の方法に従い、 試験管内でヒ ドロキシルァミン処理し、 これを A J 11060に上記の電気パルス法を用いて導入した。 形質転換体約 2 0000株を M— CM 2 G寒天培地に 25°Cにて 30時間培養しコロニ一を形成 させた。 これを 3 Omg/ 1の界面活性剤を含む同プレート培地に 2枚ずつレブ リカし 31. 5°Cおよび 35°Cにおいて 20時間培養した。 その後、 31. 5 °C では生育するが 35°Cでは生育しなかった株を 1株取得した。 この 1株から常法 によりプラスミ ドを抽出し、 pDTR— 11 7を取得した。
< 5〉変異型 A_L^_R遺伝子の塩基配列決定
上記で得られた pDTR— 1 17をェシェリヒア ' コリ JM109に導入し た。 得られたェシェリヒア · コリ JM109/pDTR— 1 1 7をトリプトン 1 %、 酵母エキス 0. 5%及びNa C l 0. 5%からなる培地 20m 1に温度 3 7°Cで 24時間前培養し、 得られた培養液 2 Om 1を上記と同じ組成の培地 1 1 に接種し、 温度 37°Cで 3時間培養したのち、 0. 2 gのクロラムフエ二コール を添加し、 更に同一温度で 20時間培養を行い、 培養液を得た。 次いで、 この培 養液を 3,000r.p.m.で 10分間遠心処理して湿潤菌体 2 gを得、 これを 20m l の 25%ショ糖を含有する 35 OmMトリス—塩酸緩衝液 （pH8. 0) に懸濁 したのち、 更にこれにリゾチーム （シグマ社製） 10mg、 0. 25M EDT A溶液 （ p H 8. 0 ) 8m l及び 20 %ドデシル硫酸ナトリウム溶液 8 m 1を各 々添加し、 温度 60°Cで 30分間保温処理し、 溶菌液を得た。 この溶菌液に、 5 M N a C 1溶液 13mlを添加し、 温度 4 °Cで 16時間処理した後、 15， OOOr. p. ra.で 30分間遠心分離した。 得られた上清液を、 常法によりフエノール抽出処理 及びエタノール沈澱処理を行い DN Aを沈澱させた。
この沈澱物を減圧乾燥処理した後、 ImM EDTAを含有する 1 OmMトリ ス一塩酸緩衝液 （pH 7. 5) 6mlに溶解し、 さらにこれに塩化セシウム 6 g 及びェチジゥムブロマイ ド （19mg/m l) 0. 2m lを添加し、 39， OOOr. p. m.で 42時間超遠心分離機を用いて平衡密度勾配遠心分離処理を行い、 DNAを 単離した。 又更に、 n—ブタノールを使用してェチジゥムブロマイ ドを除去した 後、 1 mM EDTAを含有する 1 OmMトリス—塩酸緩衝液 （pH 7. 5) に 対して透析を行い純化された組換え DN A pDTR— 117を約500 ^ 8を 得た。
pDTR- 1 17のクローン化断片の塩基配列の決定を行った。 塩基配列の決 定は、 Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit ,プライ ドノくィォケミ カル社製） を用い Sangerの方法に従って行った。 決定された塩基配列およびそ れから推定されるアミノ酸配列を配列表配列番号 1に示す。 ァミノ酸配列は配列 番号 2にも示す。
その結果、 このクローン化 DNA断片は、 d t s R遺伝子のコード領域全長を 含み、 野生型 d t s R遺伝子では C (シトシン） である 774番目の塩基が T (チミン） に置換されていることが判明した。 この塩基の置換により、 コードさ れる DTSRタンパク質は、 野生型では P r 0残基である 139番目のアミノ酸 残基が、 L e u残基に置換されている。
< 6 >遺伝子置換による変異型 _d_L R遺伝子導入株の作製
変異型！^^ R遺伝子置換株は特開平 5— 7491号に示される温度感受性プ ラスミ ドを用いた相同組換え法により取得した。 具体的には上記の pDTR— 1 17を Xb a I及び Kp η Iにより消化して _L_^_R遺伝子を含む断片を取得し、 PHSG 398 (宝酒造 （株） 製） を Xb a lおよび Kp n l切断処理したもの と、 上記の方法で結合させ、 pHSGX— K_l 17を取得した。
次に、 コリネ型細菌で自己複製可能なプラスミ ドから取得した自己複製能が温 度感受性になった変異型の複製起点を持つプラスミ ド pHSC4 (特開平 5— 7 491号） を制限酵素 B amH I及び K p n Iで消化し、 複製起点を含む遺伝子 断片を取得し、 得られた DNA断片を DNA平滑末端化キット （宝酒造 （株） 製、 Blunting kit) を用いて平滑末端化した後、 Kp n Iリンカ一 （宝酒造 （株） 製） を用いて、 p HS GX-K- 1 17の K p n I認識部位に導入し、 プラスミ ド p KTCX— K— 1 17を作製した。 尚、 pHSC4を保持するェシエリヒア · コ リ AJ 12571は、 1990年 10月 11日に通商産業省工業技術院生命ェ 学工業技術研究所 （郵便番号 305-0046 日本国茨城県つくば巿東一丁目 1番 3号） に受託番号 FERM P_ 1 1 763として寄託され、 1991年 8月 26日に ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、 FERM BP— 3524の受託 番号で寄託されている。
この 2つのプラスミ ドを、 各々ブレビバタテリ ゥム · ラク トフアーメンタム A TCC 13869に電気パルス法を用いて導入し、 特開平 5— 7491号に記載 の方法で染色体上の A ^R遺伝子を変異型に置換した。 具体的には ブレビバ クテリ ウム ' ラク トフアーメンタム ATCC 13869/p KTCX-K- 1 1 7を M— CM 2 G液体培地で 25 °Cにて 6時間振とう培養した後、 5 gZm 1 のクロラムフエ二コールを含む M—CM2G培地上に撒き、 34°Cでコロニーを 形成した株をプラスミ ド組み込み株として取得した。 次にこの株から 34°Cでク 口ラムフエ二コールに対して感受性になった株をレプリカ法により取得した。 こ の感受性株から 34 °Cにおいて界面活性剤に対する耐性を失った株として N o. 1 17株を取得した。 この株は染色体上の 遺伝子が変異型に置換されて いる。
< 7 >N o . 1 1 7株の L—グルタミン酸生産性
上記項目く 6 >で取得した N 0. 11 7株、 並びに、 WO 96Z06180号 国際公開パンフレッ トに記載の N 0. 1 1株、 No. 77株及び No. 21株に ついて、 WO96Z06180号国際公開パンフレツトに記載の実施例 2と同様 にして L一グルタミン酸の生産性を評価した。 具体的には、 以下の様に評価を行 つた。
ブレビバクテリウム ' ラク トフアーメンタム ATCC 13869または上記 各株を表 1に示す組成の種培養培地に接種し、 31. 5°Cで 24時間振とう培養 して種培養を得た。 表 1に示す組成の本培養培地を 50 Oml容ガラス製ジャーフ アーメンタ一に 300 mlずつ分注し加熱殺菌した後、 上記種培養を 40 ml接種し た。 撹拌速度を 800〜 1300rpra、 通気量を 1 / 2〜； L Z 1 mとし、 培養温 度 31. 5°Cにて培養を開始した。 培養液の pHはアンモニアガスで 7. 5に維 持した。 培養を開始してから 8時間後に培養温度を 37°Cにシフトした。 培養温 度のシフトを行わず、 31. 5°Cのまま培養を継続した場合を比較対象とした。
濃 度
成 分
本培養 グノレコース 5 g/dl 5 g/dl
Figure imgf000020_0001
Mg SO4 · 7H2O 0. 04 g/dl 0. 5 g/dl
Figure imgf000020_0002
大豆蛋白加水分解液 2 ml/dl 5 ml/dl ピオチン 50 β g/i 200 /zg/dl サイアミン塩酸塩 200 β g/1 300 ^g/dl
いずれも 20〜40時間でグルコースが完全に消費された時点で培養を終了し、 培養液中に生成蓄積された L—グルタミン酸の量を測定した。
その結果、 表 2に示すように No. 1 17株の ーグルタミン酸収率は特に上 昇していた。 表 2 菌 株 L—グルタミン酸 （gZd 1 )
ATCC 13869 0. 5
No. 1 1 7. 5
No. 77 6. 9
No. 21 8. 3
No. 1 17 9. 0
産業上の利用可能性
本発明により、 界面活性剤に対する温度感受性変異を有する変異型 DT S Rタ ンパク質をコードする変異型 i_L^R遺伝子が提供される。 この変異型 DTSR タンパク質を保持し、 野生型 DTSRタンパク質を保持しないコリネ型細菌は、 界面活性剤に対する温度感受性を有し、 L一グルタミン酸の生産等に利用できる。

Claims

請求の範囲
1. 下記 （A) 又は （B) に示すタンパク質をコードする DNA。
(A) 配列番号 2に記載のァミノ酸配列、 または配列番号 2記載のァミノ酸配列 の 139番目の L e u残基が P r oを除く他のアミノ酸残基に変化した配列を有 し、 温度感受性 DTSR活性を有するタンパク質。
(B) 配列番号 2記載のアミノ酸配列、 または配列番号 2記載のアミノ酸配列の 139番目の L e u残基が P r oを除く他のアミノ酸残基に変化した配列におい て、 139番目のァミノ酸残基以外の位置における 1若しくは数個のァミノ酸残 基の置換、 欠失、 挿入、 付加、 又は逆位を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、 温度 感受性 D T S R活性を有するタンパク質。
2. 下記 （a) 又は （b) に示す DNAである請求項 1記載の DNA。
( a ) 配列番号 1に記載の塩基配列のうち、 塩基番号 359〜 1987からなる 塩基配列を含む DNA。
(b) 配列番号 1に記載の塩基配列のうち、 塩基番号 359〜 1987からなる 塩基配列とス トリ ンジヱントな条件下でハイブリダィズする D N Aであって、 か つ、 温度感受性 DTSR活性を有するタンパク質をコードする DNA。
3. 配列番号 2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコ一ドする請求項 1記載の DNA。
4. 請求項 1〜3のいずれか 1項に記載の DNAを保持し、 野生型 DTSRタ ンパク質を保持せず、 L一グルタミン酸生産能を有するコリネ型細菌。
5. Lーリジン生産能をさらに有する請求項 4に記載のコリネ型細菌。
6. 請求項 4に記載のコリネ型細菌を、 液体培地で培養し、 培地中に L一ダル タミン酸を生成蓄積させ、 L—グルタミン酸を該培地から採取することを特徴と する L一グルタミン酸の製造方法。
7. 請求項 5に記載のコリネ型細菌を、 液体培地で培養し、 培地中に Lーリジ ン及び L一グルタミン酸を生成蓄積させ、 Lーリジン及び L—グルタミン酸を該 培地から採取することを特徴とする Lーリジン及び L一グルタミン酸の製造方法。
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