CN1367244A - 通过发酵生产l－精氨酸的微生物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有产生L－精氨酸能力的微生物,所述的微生物是一种通过生物合成线性或环化途径合成L－精氨酸的微生物,并且含有一种包括编码具有鸟氨酸乙酰转移酶活性的argJ基因的重组DNA。本发明也涉及一种生产L－精氨酸的方法,该方法包含如上描述的培养微生物的步骤。

Description

通过发酵生产L-精氨酸的微生物和方法
技术领域
本发明涉及一种通过发酵生产L-精氨酸的新方法。
L-精氨酸在是一种工业用的氨基酸，用作肝功能促进剂、输液、食品添加剂等的成分。
技术背景
在微生物中，L-精氨酸的生物合成以8步酶反应步骤进行，从前体L-谷氨酸开始，接着进行2条不同的途径，线性途径或环化乙酰(cyclic acetyl)途径，依据涉及的微生物而异(Cunin et al.，1986，Davis，1986)。在两条生物合成途径中，第一步是谷氨酸的N-酰基转移作用，该步骤由表现出N-乙酰谷氨酸合成酶活性的酶类催化。
在线性途径中，N-乙酰谷氨酸合成酶的活性通过argA基因编码的乙酰辅酶A：L-谷氨酸N-乙酰转移酶(EC 2.3.1.1.)提供，在该途径中的第5酶反应步骤，通过argE基因编码的N2-乙酰-L-鸟氨酸氨基水解酶(EC 3.5.1.16)脱乙酰化，把中间体N-乙酰L-鸟氨酸转变成L-鸟氨酸。
因此，在诸如大肠杆菌的微生物中，从L-谷氨酸，通过N-乙酰谷氨酸、N-乙酰谷氨酰磷酸、N-乙酰谷氨酸半醛、N-乙酰鸟氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸和精氨琥珀酸，合成L-精氨酸。通过下列众所周知的酶催化的连续反应合成这些中间体，这些酶的名称是N-乙酰谷氨酸合成酶、N-乙酰谷氨酸激酶、N-乙酰谷氨酰磷酸还原酶、乙酰鸟氨酸氨基转移酶、N-乙酰鸟氨酸酶、鸟氨酸氨甲酰基转移酶、精氨琥珀酸合成酶和精氨琥珀酸酶。这些酶分别通过argA、argB、argC、argD、argE、argF、argG和argH基因编码。
在乙酰环化途径中，通过argJ基因编码的鸟氨酸乙酰转移酶(N2-乙酰-L-鸟氨酸；L-谷氨酸N-乙酰转移酶；EC 2.3.1.35)，把N-乙酰鸟氨酸的乙酰基团转移到L-谷氨酸。由于这种酶，精氨酸生物合成途径在第1和第5酶反应步骤之间重新环化，上述的乙酰环化途径能量上优于线性途径，因为一旦所述的途径从作为供体的乙酰辅酶A启动，N-乙酰鸟氨酸就能用作乙酰基团的供体。
所述的乙酰环化途径指导下列原核生物和一些真核生物(DeDeken，1962)的L-精氨酸合成流程，这些原核生物是谷氨酸棒杆菌(Udaka和Kinoshita，1958)，蓝细菌属(Hoare和Hoare，1966)，铜绿假单胞菌(Haas et al.，1972)，淋病奈瑟氏球菌(Shinners和Catlin，1978)，古产甲烷菌(Meile和Leisinger，1984)，海栖热袍菌(Van de Casteele et al.，1990)，芽孢杆菌属代表种(Sakanyan et al.，1992)，天蓝色链霉菌(Hindle et al.，1994)，嗜热栖热菌(Baetens et al.，1998)，古詹氏甲烷球菌(Marc et al.，2000)。在一些直核生物中(De Dehen，1962)。对于全部或部分测序过的基因组而言，也可具有与argJ基因或其产物相似的核苷酸和氨基酸序列，该相似性表明在这些生物中存在乙酰环化途径。
一般认为，仅显示鸟氨酸乙酰转移酶的argJ编码产物是一种单功能酶，并且已经描述了该酶的特性(Haas et al.，1972；Sakanyanet al.，1996；Baetens et al.，1998；Marc et al.，2000)。不过，一些微生物含有编码所述酶的argJ基因替代版本，除了鸟氨酸乙酰转移酶活性外，它还拥有N-乙酰谷氨酸合成酶活性。上述基因和相应的双功能酶，已经在淋病奈瑟氏球菌(Picard和Dillon，1989；Martin和Mulks，1992)，嗜热脂肪芽孢杆菌(Sakanyan et al.，1990，1993)，啤酒糖酵母(Crabeel et al.，1997)和那不勒斯栖热袍菌(Marc et al.，2000)中描述。
通过2种方法区别单功能的ArgJ酶和双功能酶：(i)用2种乙酰基团供体N-乙酰L-鸟氨酸和乙酰辅酶A，进行酶反应测定；(ii)用针对克隆的argJ基因的大肠杆菌argE和argA突变株，进行互补试验。单功能ArgJ酶仅将乙酰基团从N-乙酰L-鸟氨酸转移到L-谷氨酸，并仅互补argE突变；而双功能ArgJ酶从N-乙酰L-鸟氨酸和乙酰辅酶A两者转移乙酰基团，并且互补argE和argA突变菌株。
2条生物合成途径，分别通过特异的转录阻遏物或由L-精氨酸或中间体产物抑制酶反应步骤，进行遗传和酶反应调节(Maas，1994；Glansdorff，1996)。此外，L-谷氨酸前体形成之前的早期代谢步骤和进行L-精氨酸降解之后的晚期降解步骤，也在调节机制的控制之下。因此，通过在特定微生物的基因组中的各个靶点导入突变，或者影响特定微生物的培养条件，或者影响特定微生物的膜渗透性，能调节L-精氨酸的合成和该氨基酸的产量。
通过发酵生产L-精氨酸的常规方法是，使用产生L-精氨酸的微生物菌株，尤其是棒状细菌的代表种；使用对某些抗代谢剂，包括2-硫代偶氮丙氨酸、α-氨基β-羟基戊酸、精氨酸异羟肟酯、半胱氨酸类似物和氨磺酰衍生物等有抗性的棒状细菌；使用对某些氨基酸，包括L-脯氨酸、L-组氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-甲硫氨酸或L-色氨酸表现为营养缺陷型的棒状细菌，以及使用那些表现为既有上述提到的抗性又对氨基酸具有营养缺陷型的棒状细菌。在此方面，可以参考下列专利：FR 2 084 059，2 119 755，2 490 674，2 341 648，2 225 519，EP 0 379903 B1，EP 0 378 223 B1，EP 0 336387 B1。
另一方面，披露了通过下述的重组DNA转化属于棒杆菌属、短杆菌属或大肠杆菌属的微生物，生产L-精氨酸的方法，所述的重组DNA含有一种十分明确的L-精氨酸生物合成基因，以增强对特定限速步骤的该基因编码的酶活性。野生型菌株或编码转录阻遏物的突变体或携带相关抗性或营养缺陷型的突变体，被用作发酵的重组宿主细胞。
大多数用于生产L-精氨酸的重组微生物属于棒杆菌属或短杆菌属。在此方面，可以参考下列专利：FR 2 143 238；FR 2 484 448；EP 0 259858 B1；EP 0 261627 B1；EP 0 332233 A1；EP 0 999267A1；EP 1016710 A2。
不过，大肠杆菌K12菌株，因其完整测序过的基因组(Blattneret al.，1997)和各种遗传方法的适用性以及更多有利的载体，以操作该菌株或其衍生物，也是用于生产包括L-精氨酸等氨基酸的有吸引力的宿主。通过使用在质粒载体中克隆的argA基因，然后用已经描述的针对大肠杆菌的方法分离抗反馈突变体(Eckhard和Leisinger，1975；Rajagopal et al.，1998)，能取得由重组大肠杆菌菌株增加L精氨酸的产量。在此方面，可以参考EP 1 016 710 A2专利。
因此，由于增加编码N-乙酰谷氨酸合成酶活性的基因的拷贝数目，即一种野生型argA基因或其抗反馈突变体，提高了重组微生物的L精氨酸产量。
不过，所述的突变argA基因的应用，仅限于进一步增加重组菌株产生L-精氨酸的可能性的情况。
目前已经发现，有可能使用具有产生L-精氨酸能力的微生物产生L-精氨酸，所述的微生物是一种合成L-精氨酸的微生物，并且含有一种包括编码具有鸟氨酸乙酰转移酶活性的argJ基因的重组DNA。
本发明概述
本发明提供一种具有产生L-精氨酸能力的微生物，所述的微生物携带有一种包括编码鸟氨酸乙酰转移酶的argJ基因的重组DNA。
本发明也提供上述的微生物，其中所述的argJ基因编码一种单功能酶，或者优选地编码一种双功能酶。
优选地，所述的argJ基因编码一种单或双功能酶，缺乏L-精氨酸的抑制作用。
更优选地，所述的argJ基因来源于一种嗜热微生物。
本发明也提供一种生产L-精氨酸的方法，该方法包含如下步骤，把上述微生物培养在一种培养基中，以产生和积累L-精氨酸，然后从该培养基中收集L-精氨酸。
在本发明说明书中所用的术语“产生L-精氨酸能力”，意指本发明的微生物当培养在所述的培养基中时，在培养基中积累L-精氨酸的能力。
附图简述
图1是质粒pACYC184、pJ-B、pJ-T和pJ-M的限制性图谱。
本发明详述
本发明的微生物是一种具有产生L-精氨酸能力的微生物，其中所述的能力通过重组DNA技术导入编码鸟氨酸乙酰转移酶的argJ基因提供。
优选地，本发明所用的argJ基因，是编码具有鸟氨酸乙酰转移酶活性或具有鸟氨酸乙酰转移酶和N-乙酰谷氨酸合成酶活性的酶类的基因，所述的单或双功能酶的活性缺乏L-精氨酸的抑制作用。
所述的argJ基因优先地来源于一种嗜热微生物，例如詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannasschii)或嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)和那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)。
所述的基因序列在下列文献中披露，这些文献在此引入仅供参考：詹氏甲烷球菌的argJ：Bult et al.，1996；嗜热脂肪芽孢杆菌NCIB8224的argJ：Sakanyan et al.，1993；和那不勒斯栖热袍菌的argJ：Dimova et al.，2000。
合适的argJ基因的实例是来源于嗜热脂肪芽孢杆菌NCIB8224、ATCC12980、ATCC7953、ATCC10149，那不勒斯栖热袍菌DSM5068、ATCC49049以及詹氏甲烷球菌DSM2661的那些种类。
优选的argJ基因来源于嗜热脂肪芽孢杆菌或那不勒斯栖热袍菌。
所述的产生L-精氨酸的微生物，是任一种能通过生物合成的线性途径或环化途径合成L-精氨酸的微生物，并且该微生物含有通过遗传工程技术导入其中的克隆argJ基因。
例如，所述的微生物可以选自棒状细菌，如属于短杆菌属或棒杆菌属的那些种类，或者是属于大肠杆菌属的细菌。
优选地，所述的微生物是一种通过线性生物合成途径合成精氨酸的微生物，更具体而言，属于大肠杆菌属的细菌。
适合用于本发明的大肠杆菌属细菌的实例，列于如下：大肠杆菌K12菌株和其衍生物，主要是大肠杆菌P4XB2(Hfr，metB，rel A，argR)(Sakanyan et al.，1996)。所述的大肠杆菌P4XB2菌株于2000年10月9日保存在巴斯德研究所(28，Rue du Docteur Roux F-75724PARIS CEDEX 15)国家微生物收集中心(CNCM)，保存号为I 2571。
优选地，宿主菌株缺乏涉及微生物中L-精氨酸生物合成途径负控制的转录阻遏作用(argR-)。
使用合适的引物，通过PCR(聚合酶链式反应，见White T.J.etal.Trends Genet.，5，185(1989))扩增argJ基因，然后按照本领域技术人员众所周知的方法，把其连接到一种DNA载体中。上述方法在Sambrook et al.分子克隆，冷泉港实验室出版社(1989)一书中披露。
用于argJ克隆的载体，可以是一种在微生物中以低或中等或高拷贝自主复制的质粒，一种具体的实例是在Sambrook et al.分子克隆，冷泉港实验室出版社(1989)一书中描述的质粒pACYC184。也可以用噬菌体载体。把argJ基因整合到宿主细菌染色体DNA中，可以通过不用任何载体系统的同源重组进行。也可以使用在合成L-精氨酸的不同微生物中自主复制的穿梭载体，把argJ导入到不是大肠杆菌的宿主细胞中。
为了把携带DNA片段的基因连接到DNA载体中而制备重组DNA分子，使用与该扩增基因末端相应的限制性酶消化所述的载体。一般来说，连接反应使用连接酶，如T4DNA多核苷酸连接酶进行。
所述的DNA载体优选地是一种表达载体，该表达载体优选地含有一个启动子，其后有位于待表达的基因上游的核糖体结合位点。该载体也含有一个复制起点和一个选择标志。
所述的启动子可以是弱或中度或强活性。后者处于一种受控作用之下，因此能提供受控的基因表达。合适的启动子例如是，tet或amp启动子，等等。
所述的选择标志，优选地是一种负责对抗生素，如四环素、氨苄青霉素，氯霉素等有抗性的基因。
包含有在涉及微生物中表达argJ基因的合适机制的重组DNA，通过诸如电穿孔、氯化钙介导的转化等常规方法，被导入到所述的微生物中。
根据本发明的一个实施修改方案，本发明的微生物可额外地含有一种包括编码N-乙酰谷氨酸合成酶的argA基因的重组DNA和一种根据上述方法制备的DNA载体。所述的argA基因可以从大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、铜绿假单胞菌等细菌中得到。
而且，该DNA载体可以额外地含有一种利用不是葡萄糖的碳源的基因，如编码蔗糖酶、果聚糖酶、果聚糖蔗糖酶等的基因，优选地是一种编码果聚糖酶的基因。
本发明生产L-精氨酸的方法，包含如下步骤，把本发明的微生物培养在一种培养基中，以在该培养基中产生和积累L-精氨酸，然后从该培养基中重新收集所述的氨基酸。
在本发明的方法中，培养属于大肠杆菌属的微生物，从液体培养基中收集和纯化氨基酸的方法，可以与用棒状细菌或大肠杆菌或枯草芽孢杆菌发酵生产氨基酸的常规方法相似。用于培养的培养基，可以是合成培养基或天然的培养基，只要该培养基包括碳源和氮源以及矿物质，如果需要，适量提供用于细菌生长所需要的营养物质。所述的碳源可以包括如葡萄糖和蔗糖等各种碳水化合物和各种有机酸。该碳源优选地是蔗糖。依据所用细菌的同化能力，可以使用包括乙醇和甘油的酒精。至于所述的氮源，可用氨，各种铵盐如硫酸铵，其他氮化合物如胺，天然的氮源，如胨、大豆水解物和消化的发酵微生物。至于矿物质，可用磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰和碳酸钙。
所述的培养方法，优选地在有氧条件下进行，如振荡培养和通气搅拌培养。该培养的温度通常是20-40℃，优选地28-38℃。该培养的pH通常是5-9，优选地6.5-7.2。可以用氨、碳酸钙、各种酸、各种碱和缓冲液调节培养物的pH。一般情况下，培养1-3天在所述的培养基中积累特定的氨基酸。
可用常规方法重新获得L-精氨酸，例如培养后通过离心或膜过滤，从培养基中移去如细胞等固体物，然后，通过离子交换，浓缩和结晶分级方法等收集和纯化L-精氨酸。
现在，用下列实施例更详细地披露本发明，给出这些实施例的目的仅仅是说明本发明。实施例1：构建携带argJ基因的质粒
从中度嗜热细菌嗜热脂肪芽孢杆菌(Sakanyan et al.，1993)和高度嗜热细菌那不勒斯栖热袍菌(Dimova et al.，2000)克隆的下列argJ基因，分别具有SEQ ID No1和SEQ ID No3的DNA序列，这些序列编码的蛋白分别具有SEQ ID No2和SEQ ID No4的氨基酸序列。来自嗜热古细菌詹氏甲烷球菌(Bult et al.，1996)的argJ序列，含有SEQ ID No5的DNA序列，该DNA序列编码的蛋白具有SEQ ID No6的氨基酸序列。合成与来源于这3种微生物的argJ基因的5和3末端相应的引物。与含有1个GGAG Shine/Dalgarno位点的argJ基因开始部分相应的寡核苷酸，具有下列的序列：BS  5-GAA GGAGAGTATACCATGACGATCACAAAACAAACGG-3(SEQ ID No7)TN  5-GAA GGAGAGTATACCATGTTCGTTCCGAGGGGATTCAG-3(SEQ ID No8)MJ  5-GAA GGAGAGTATACCATGAGAGTTATTGATGGTGGAG-3(SEQ ID No9)
与含有1个GGATCC BamHI位点的argJ基因末端部分相应的寡核苷酸，具有下列的序列：BS  5-AAAGGATCCTTACGTCCGATAGCTGGCG-3  (SEQ ID No10)TN    5-AAAGGATCCTCATGTCCTGTACCTCCCG-3  (SEQ ID No11)MJ    5-AAAGGATCCTTAAGTTGTATATTCAGCG-3  (SEQ ID No12)
用DNA聚合酶Pfu(Stratagene)，通过PCR从不同的DNA模板，进行argJ基因的扩增。所用的条件如下：
最初变性                        95℃，5min
变性                            94℃，1min
退火                            47℃，1min    30个环化
延伸                            72℃，2min
最后延伸                        72℃，7min    4℃
接着，把PCR产物磷酸化，用BamHI消化，然后和质粒载体pACYC184混合，该质粒载体最初用EcoRV酶消化，脱磷酸化并用第2种酶BamHI消化。用T4 DNA连接酶连接后，通过电穿孔法(2500V，21μF，400，10msec)，把该重组的DNAs转染到大肠杆菌K12 XS1D2R菌株中[F-Δ(ppc-argE)nalA rpoBλ-hsdR recA]。在M9基本培养基中挑选重组的克隆(Miller，1992)，所述的M9培养基不含有精氨酸，用琼脂(1.5％)固化，添加0.2％的琥珀酸盐并含有抗生素氯霉素(25μg/ml)。在37℃培养3天后挑选Cmr AagE+菌落，并且从上述克隆中，分离到携带相应嗜温微生物的argJ基因的重组质粒。对所获得的质粒DNA进行测序以证实该克隆DNA的序列，并选出argJ基因的转录取向被tet基因启动子控制的质粒。它们的限制性酶谱在图1显示。所获得的质粒，含有嗜热脂肪芽孢杆菌，那不勒斯栖热袍菌或詹氏甲烷球菌的argJ基因，分别命名为pJ-B、pJ-T、pJ-M。实施例2：重组质粒的遗传分析
通过遗传和酶法分析，有可能识别2种类型的ArgJ酶。仅拥有鸟氨酸乙酰转移酶活性的单功能酶，能互补大肠杆菌K12的argE突变；而表现为鸟氨酸乙酰转移酶活性和乙酰谷氨酸合成酶活性的双功能酶，能互补大肠杆菌K12的argE和argA突变。
用实施例1描述的条件，通过电穿孔法把所获得的3种质粒，转染到大肠杆菌K12 XA4菌株(含有argA单突变)和双突变大肠杆菌K12 XA4：：argE菌株(含有argA和argE突变)中。在用琼脂(1.2％)固化并含有抗生素氯霉素(25μg/ml)的LB丰富培养基上，挑选出重组菌落。把来自每个平皿的50个菌落重新悬浮在氯化钠溶液(0.9％)中，然后在含有M9基本培养基的平皿上复制，该M9培养基用琼脂(1.2％)固化，添加或不添加L-精氨酸(150μg/ml)但始终含有抗生素氯霉素(25μg/ml)。在37℃培养2天，所有50个大肠杆菌K12菌株XA4(pJ-B)、XA4：：argE(pJ-B)、XA4(pJ-T)和XA4：：argE(pJ-T)的克隆，在所描述的选择培养基中出现。相反，大肠杆菌K12菌株XA4(pJ-M)和XA4：：argE(pJ-M)的菌落，没有在无精氨酸的培养基上生长，而在添加有L-精氨酸的培养基上2天后，就可见这些菌落。这些结果表明，嗜热脂肪芽孢杆菌和那不勒斯栖热袍菌的argJ基因编码双功能酶，而詹氏甲烷球菌的argJ基因编码单功能酶。
实施例3酶活性分析
把大肠杆菌K12菌株XS1D2(pJ-B)、XS1D2(pJ-T)和XS1D2(pJ-M)，培养在不含有精氨酸但添加琥珀酸盐(0.2％)和含有氯霉素(25μg/ml)的M9基本培养基中，37℃24小时。然后使细胞沉淀，用Tris-HCl缓冲液(0.1M，pH8)洗2次，然后超声裂解(每脉冲19 kHz 10s，15min)。使用下列缓冲液：0.1M MES，0.1M PIPES，0.1 M Tris，0.1 M甘氨酸和0.1 M K2HPO4，以及一种乙酰基供体，乙酰辅酶A或N-乙酰鸟氨酸，在37℃或70℃下测定酶活性，然后反应产物即N-乙酰谷氨酸，通过HPLC定量。在HPLC系统(Kontron)的Luna C18柱(phenomenex)中，使用0.1 M磷酸和甲醇(90∶10v∶v)的混合液作为流动相，流率为1ml/min，分析所述的样品。在215nm下检测反应产物。在表1中给出的结果显示，在37℃或70℃下，这3种酶拥有鸟氨酸乙酰转移酶活性。在2种温度下，仅在嗜热脂肪芽孢杆菌和那不勒斯栖热袍菌的酶中，检测到乙酰谷氨酸合成酶活性。
表1：在37℃或70℃下，对重组的热稳定ArgJ酶测定的鸟氨酸乙酰转移酶和乙酰谷氨酸合成酶活性(μmoles·min-1·mg-1蛋白)
 菌株/质粒                 37℃          70℃
鸟氨酸乙酰转移酶活性 存在10mM精氨酸时鸟氨酸乙酰转移酶活性   乙酰谷氨酸合成酶活性 存在10mM精氨酸时乙酰谷氨酸合成酶活性   鸟氨酸乙酰转移酶活性   乙酰谷氨酸合成酶活性
 XS1D2(pJ-B) 4 4   0.5 0.5   25   2
 XS1D2(pJ-T) 5 5   0.4 0.4   190   7
 XS1D2(pJ-M) 4.5 4.5   0 0   165.5   0
这些结果确认，来自嗜热脂肪芽孢杆菌和那不勒斯栖热袍菌的ArgJ酶确实是双功能酶，而来自詹氏甲烷球菌的ArgJ酶是一种单功能酶。添加10 mM L-精氨酸，没有检测到降低酶活性。实施例4：通过重组大肠杆菌K12 P4XB2菌1株产生L-精氨酸
用上述实施例1描述的条件，通过电穿孔法把质粒pJ-B、pJ-T和pJ-M转染到大肠杆菌K12 P4XB2菌株中。在用琼脂(1.2％)固化并含有抗生素氯霉素(25μg/ml)的LB丰富培养基上，挑选出相应的克隆。为了评价发酵过程中产生L-精氨酸的数量，从每个重组菌株中选出3个独立的菌落。为此目的，选自这些平皿的菌落被重新悬浮在含氯霉素的LB培养基中，30℃培养直到光密度在600nm达到0.8。在14ml发酵培养基中加入1ml上述预培养物，所述的发酵培养基具有下列组分：2.8％(NH4)2SO4，0.2％K2HPO4，0.5％酵母提取物，0.05％MgSO4，0.001％FeSO4，0.001％MnSO4，10μg/ml硫胺素，100μg/ml甲硫氨酸，5％葡萄糖，2.5％CaCO3，25μg/ml氯霉素，pH 7.2。在园形摇床上，750ml的锥形瓶中，以320rpm的速度30℃进行发酵40h。发酵后，重新收集样品，通过纸层析或薄层层析，然后用溶解在丙酮中的0.5％茚三酮显色，或者通过分光光度测定术或氨基酸分析仪，根据L-精氨酸的校正范围计算L-精氨酸的量。
这些发酵的结果在表2显示。
表2：大肠杆菌K12 P4XB2菌株及其含有克隆argJ基因的重组衍生物产生的L-精氨酸数量
   菌株/质粒  L-精氨酸(g/l)
    P4XB2     ＜0.2
    P4XB2(pJ-M)     0.5
    P4XB2(pJ-B)     9.0
    P4XB2(pJ-T)     9.0
这些结果表明，所有携带argJ的质粒拥有在大肠杆菌K12宿主细胞中增加L-精氨酸产量的能力。明显地，与含有pJ-M质粒的大肠杆菌K12菌株相比较，L-精氨酸的产量水平在含有pJ-B或pJ-T质粒的菌株中更高。这表明，与编码单功能ArgJ酶的基因相比较，所述的编码双功能ArgJ酶的基因的表达，保证了L-精氨酸的更大产量。实施例5：在携带2种质粒的大肠杆菌K12菌株中合成L-精氨酸
质粒pARG2S使在大肠杆菌K12中产生L-精氨酸成为可能。该质粒在pBR327-kan载体上携带来自大肠杆菌K12的argA基因和来自枯草芽孢杆菌Marburg 168的果聚酶基因(sacC)。通过大肠杆菌K12 argA突变型的互补作用，从大肠杆菌K12中克隆野生型argA基因(Nersisyan et al.，1986)。使用蔗糖作为唯一碳源的M9基本培养基，在pQB79，1粘粒库中，挑选出来自枯草芽孢杆菌Marburg 168的sacC基因(Fouet et al.，1982)。把在6.7 kb的EcoR I-HindIII DNA片段之中鉴别出的sacC基因，插入到用EcoR I和Hind III消化过的pBR327-kan质粒中。通过选择含有pARGS2质粒的重组克隆，把1.5 kb携带argA的BamH I-Sal I DNA片段，插入到所获得的用BamH I和Sal I消化过的质粒中。该pARGS2质粒保证大肠杆菌K12 argA突变细胞，在用蔗糖作为唯一碳源，没有或加有L-精氨酸的M9选择培养基上生长。
把质粒pJ-B、pJ-T和pJ-M转染到大肠杆菌K12 P4XB2(pASGS2)菌株中，然后在含有2种抗生素氯霉素(25μg/ml)和卡那霉素(40μg/ml)的LB培养基上挑选出重组克隆。检测每个转化菌株和原始菌株的3个菌落，产生L-精氨酸的量，所用的测定条件下，除了该培养基仅含有针对大肠杆菌K12 P4XB2(pASGS2)的卡那霉素(40μg/ml)之外，或者除了所述用于转化克隆的组合物之外的卡那霉素，与实施例4一致。
这些发酵的结果在表3给出。
表3：携带有单独pARGS2质粒或与pJ-B、pJ-T和pJ-M组合的大肠杆菌K12 P4XB2菌株的L-精氨酸产量。
    菌株/质粒    L-精氨酸(g/l)
    P4XB2     ＜0.2
    P4XB2(pARGS2)     6.5
    P4XB2(pARGS2/pJ-M)     7.0
    P4XB2(pARGS2/pJ-B)     13
    P4XB2(pARGS2/pJ-T)     13
这些结果说明，在相同的大肠杆菌宿主菌株中，3种携带argJ基因的质粒的任1种与质粒pARGS2相伴存在，提供更高的L-精氨酸产量。不过，在含有pARGS2和pJ-B或pJ-T质粒的大肠杆菌K12 P4XB2菌株中，其L-精氨酸产量比含有pARGS2和pJ-M质粒的大肠杆菌K12P4XB2菌株更高。这些结果表明，在相同的菌株中，所述的argA基因(pARGS2质粒)与编码双功能酶鸟氨酸乙酰转移酶(pJ-B或pJ-T质粒)的argJ基因共同存在，确保比编码单功能酶(pJ-M质粒)的argJ基因更大的L-精氨酸产量。实施例6：在含有蔗糖的发酵培养基中产生L-精氨酸
质粒pARGS2使大肠杆菌K12细胞能消耗蔗糖作为碳源。天然情况下，野生型大肠杆菌K12菌株和其衍生菌，不能在葡萄糖被蔗糖取代的基本培养基中生长。
除了葡萄糖被蔗糖(6％)取代以及培养时间延长44h外，在上述相同的条件下，使用实施例5中描述的菌株进行发酵，产生L-精氨酸。该结果在表4给出。
表4：在含有蔗糖的发酵培养基中重组大肠杆菌K12 P4XB2菌株的L-精氨酸产量。
    菌株/质粒    L-精氨酸(g/l)
    P4XB2     ＜0.2
    P4XB2(pARGS2)     8.5
    P4XB2(pARGS2/pJ-M)     8.5
    P4XB2(pARGS2/pJ-B)     14.0
    P4XB2(pARGS2/pJ-T)     14.0
这些结果再次表明，在携带第二个具有argA和消耗蔗糖的sacC基因的质粒pARGS2的大肠杆菌K12菌株，在用蔗糖取代葡萄糖的培养基中发酵时，所述的双功能酶比单功能酶提供更大的L-精氨酸产量。
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                              序列表<110>AJINOMOTO<120>通过发酵生产L-精氨酸的方法<130>J8520<140><141><160>12<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1233<212>DNA<213>Bacillus stearothermophilus<214>嗜热脂肪芽孢杆菌<400>1atgacgatca caaaacaaac ggggcaagtg acggcggtcg ccgatggaac agtggttacg    60ccggaaggat ttcaagcggc cggggtgaat gccgggctgc gctattcgaa aaacgattta    120ggggttattc tatgcgacgt gcccgcttcg gcggcggcgg tgtatacgca aagccatttt    180caggcggcgc cgctcaaagt gacgcaggcg agcctcgctg tagaacaaaa attgcaggcg    240gtcatcgtca acaggccgtg cgcgaacgcc tgcaccggtg cgcaagggct caaggacgct    300tatgaaatgc gtgagttgtg cgcgaaacag tttggcctgg cgctgcacca tgtggccgtc    360gcttcaacgg gcgtaatcgg ggaatatttg ccgatggaaa aaattcgcgc cggcatcaaa    420cagcttgttc caggggtgac gatggcggat gcggaggcgt ttcaaacggc gattttaacg    480accgatacgg tgatgaagcg cgcttgttac caaacaacga tcgacgggaa aacggtcacc    540gtcggcggag cggcgaaagg gtcggggatg atccatccga acatggcgac gatgctcgca    600ttcatcacga cggatgccaa tgtttcgtcg ccggtgctgc acgcggcgct gcggtcgatt    660acggacgttt cgtttaacca aattacggtc gacggcgata cgtcgacaaa tgatatggtc    720gtcgtgatgg caagcggtct tgctggaaat gatgagttga cgccggatca tccggactgg    780gaaaactttt atgaggcgct gcggaaaacg tgcgaagatt tggcgaagca aatcgccaaa    840gacggcgagg gggcgacgaa gctcattgaa gtgcgcgtgc gcggcgcgaa aacggatgag    900gaagcgaaaa aaatcgccaa gcaaatcgtc ggctctaact tagtgaaaac ggccgtttac    960ggcgcggacg ccaactgggg gcggatcatc ggcgcgatcg gctattcgga tgccgaagtg    1020aacccggaca acgtcgatgt cgccatcggg ccgatggtga tgctgaaagg aagcgagccg    1080cagccgttct cggaagaaga agcggcggcg tatttgcaac aagagacggt cgtcattgag    1140gtcgatttgc atataggcga tggtgtcggc gttgcgtggg gctgcgattt gacatacgat    1200tatgtgaaaa ttaacgccag ctatcggacg taa                                 1233<210>2<211>410<212>PRT<213>Bacillus stearothermophilus<214>嗜热脂肪芽孢杆菌<400>2Met Thr Ile Thr Lys Gln Thr Gly Gln Val Thr Ala Val Ala Asp Gly1               5                  10                  15Thr Val Val Thr Pro Glu Gly Phe Gln Ala Ala Gly Val Asn Ala Gly
         20                  25                  30Leu Arg Tyr Ser Lys Asn Asp Leu Gly Val Ile Leu Cys Asp Val Pro
     35                  40                  45Ala Ser Ala Ala Ala Val Tyr Thr Gln Ser His Phe Gln Ala Ala Pro
 50                  55                  60Leu Lys Val Thr Gln Ala Ser Leu Ala Val Glu Gln Lys Leu Gln Ala65                  70                  75                  80Val Ile Val Asn Arg Pro Cys Ala Asn Ala Cys Thr Gly Ala Gln Gly
             85                  90                  95Leu Lys Asp Ala Tyr Glu Met Arg Glu Leu Cys Ala Lys Gln Phe Gly
        100                 105                 110Leu Ala Leu His His Val Ala Val Ala Ser Thr Gly Val Ile Gly Glu
    115                 120                 125Tyr Leu Pro Met Glu Lys Ile Arg Ala Gly Ile Lys Gln Leu Val Pro
130                 135                 140Gly Val Thr Met Ala Asp Ala Glu Ala Phe Gln Thr Ala Ile Leu Thr145                 150                 155                 160Thr Asp Thr Val Met Lys Arg Ala Cys Tyr Gln Thr Thr Ile Asp Gly
            165                 170                 175Lys Thr Val Thr Val Gly Gly Ala Ala Lys Gly Ser Gly Met Ile His
        180                 185                 190Pro Asn Met Ala Thr Met Leu Ala Phe Ile Thr Thr Asp Ala Asn Val
    195                 200                 205Ser Ser Pro Val Leu His Ala Ala Leu Arg Ser Ile Thr Asp Val Ser
210                 215                 220Phe Asn Gln Ile Thr Val Asp Gly Asp Thr Ser Thr Asn Asp Met Val225                 230                 235                 240Val Val Met Ala Ser Gly Leu Ala Gly Asn Asp Glu Leu Thr Pro Asp
            245                 250                 255His Pro Asp Trp Glu Asn Phe Tyr Glu Ala Leu Arg Lys Thr Cys Glu
        260                 265                 270Asp Leu Ala Lys Gln Ile Ala Lys Asp Gly Glu Gly Ala Thr Lys Leu
    275                 280                 285Ile Glu Val Arg Val Arg Gly Ala Lys Thr Asp Glu Glu Ala Lys Lys
290                 295                 300Ile Ala Lys Gln Ile Val Gly Ser Asn Leu Val Lys Thr Ala Val Tyr305                 310                 315                 320Gly Ala Asp Ala Asn Trp Gly Arg Ile Ile Gly Ala Ile Gly Tyr Ser
            325                 330                 335Asp Ala Glu Val Asn Pro Asp Asn Val Asp Val Ala Ile Gly Pro Met
        340                 345                 350Val Met Leu Lys Gly Ser Glu Pro Gln Pro Phe Ser Glu Glu Glu Ala
    355                 360                 365Ala Ala Tyr Leu Gln Gln Glu Thr Val Val Ile Glu Val Asp Leu His
370                 375                 380Ile Gly Asp Gly Val Gly Val Ala Trp Gly Cys Asp Leu Thr Tyr Asp385                 390                 395                 400Tyr Val Lys Ile Asn Ala Ser Tyr Arg Thr
            405                 410<210>3<211>1194<212>DNA<213>Thermotoga neapolitana<214>那不勒斯栖热袍菌<400>3gtgttcgttc cgaggggatt cagctacgcg ggagtacact gcagaataaa gagaaaaagg   60aaagacctcg gtatcatctt ctctgaagtg ccctgcaccg ccgccggggt tttcaccacg   120aacgttgtga aggctgcacc cgtgatctac gacatggaga ttctggggaa aaatccttct   180ggaatcagag cgattaccgt gaacagcggt gtagcgaacg cctgcacggg agaacaggga   240atgatcaacg caagaaggat ggcggagaaa acggcaaaag aactgaacat ccccgttgaa   300agcgtccttg tgttttcaac aggagtgata ggtgttcaac ttccaatgga aaaagtggag   360tcggggattg aagaggcggt gaagaacctc tcgaaagacc ctgttccctt tgcagaggcc   420atcatgacaa cggacacgaa gataaagatc cacagcaaaa aagtgacgat agaagggaaa   480gagatcaccg tccttggaat agcaaagggc tccggtatga tacatcccaa catggcgacg   540atgctctctt tcataacgac cgatgcgaat gtttctgagg atgctctgaa aaaacttctg   600aagatctctg tcgacgattc ctacaacatg atcgatgtcg acggtgatac aagcacaaac   660gacatggtga tcatactcgc aaatggactt gcaggaaacg cacccattca ggaggaaacc   720gatggtttct ggaagcttta tgaggccgta cacgaagtca accaggtcct tgcggaaaaa   780attgtggagg acggggaggg tgccacaaag gtgatagaag tggaagtgag aaatgctccg   840gacagaaact ctgctcgttt gattgcacgg gcgatcgtct cttcgaatct tgtgaagcca   900gccatctacg gtgaagatgc aaactgggga agggtgatag cagccgcggg gtactccggt   960gcacagttcg atccggacag actcgacctt ttcttcgaaa gcgcagccgg tagaataaag   1020gtggcagaga acggccaggg agtggatttt gacgaagata cagcaaagaa gatactgagc   1080gaaaagaggg tgaaaatcat cctcgatatg aagcagggaa aagaacttgc aagagcctgg   1140ggatgtgatc tgactgaaaa atacgtggaa ataaacggga ggtacaggac atga         1194<210>4<211>397<212>PRT<213>Thermotoga neapolitana<214>那不勒斯栖热袍菌<400>4Val Phe Val Pro Arg Gly Phe Ser Tyr Ala Gly Val His Cys Arg Ile1               5                  10                  15Lys Arg Lys Arg Lys Asp Leu Gly Ile Ile Phe Ser Glu Val Pro Cys
         20                  25                  30Thr Ala Ala Gly Val Phe Thr Thr Asn Val Val Lys Ala Ala Pro Val
     35                  40                  45Ile Tyr Asp Met Glu Ile Leu Gly Lys Asn Pro Ser Gly Ile Arg Ala
 50                  55                  60Ile Thr Val Asn Ser Gly Val Ala Asn Ala Cys Thr Gly Glu Gln Gly65                  70                  75                  80Met Ile Asn Ala Arg Arg Met Ala Glu Lys Thr Ala Lys Glu Leu Asn
             85                  90                  95Ile Pro Val Glu Ser Val Leu Val Phe Ser Thr Gly Val Ile Gly Val
        100                 105                 110Gln Leu Pro Met Glu Lys Val Glu Ser Gly Ile Glu Glu Ala Val Lys
    115                 120                 125Asn Leu Ser Lys Asp Pro Val Pro Phe Ala Glu Ala Ile Met Thr Thr
130                 135                 140Asp Thr Lys Ile Lys Ile His Ser Lys Lys Val Thr Ile Glu Gly Lys145                 150                 155                 160Glu Ile Thr Val Leu Gly Ile Ala Lys Gly Ser Gly Met Ile His Pro
            165                 170                 175Asn Met Ala Thr Met Leu Ser Phe Ile Thr Thr Asp Ala Asn Val Ser
        180                 185                 190Glu Asp Ala Leu Lys Lys Leu Leu Lys Ile Ser Val Asp Asp Ser Tyr
    195                 200                 205Asn Met Ile Asp Val Asp Gly Asp Thr Ser Thr Asn Asp Met Val Ile
210                 215                 220Ile Leu Ala Asn Gly Leu Ala Gly Asn Ala Pro Ile Gln Glu Glu Thr225                 230                 235                 240Asp Gly Phe Trp Lys Leu Tyr Glu Ala Val His Glu Val Asn Gln Val
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        260                 265                 270Glu Val Glu Val Arg Asn Ala Pro Asp Arg Asn Ser Ala Arg Leu Ile
    275                 280                 285Ala Arg Ala Ile Val Ser Ser Asn Leu Val Lys Pro Ala Ile Tyr Gly
290                 295                 300Glu Asp Ala Asn Trp Gly Arg Val Ile Ala Ala Ala Gly Tyr Ser Gly305                 310                 315                 320Ala Gln Phe Asp Pro Asp Arg Leu Asp Leu Phe Phe Glu Ser Ala Ala
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        340                 345                 350Asp Thr Ala Lys Lys Ile Leu Ser Glu Lys Arg Val Lys Ile Ile Leu
    355                 360                 365Asp Met Lys Gln Gly Lys Glu Leu Ala Arg Ala Trp Gly Cys Asp Leu
370                 375                 380Thr Glu Lys Tyr Val Glu Ile Asn Gly Arg Tyr Arg Thr385                 390                 395<210>5<211>1209<212>DNA<213>Methanococcus jannaschii<214>詹氏甲烷球菌<400>5atgagagtta ttgatggtgg agttacagcc cctaagggat ttaaagccaa tggatacaaa   60gagggtaagt ttggagtagc gataattatc tctgaaaaag atgcagtagg agctgggaca   120ttcacaacaa ataaagttgt agctcatcct gtagttttat caagggagtt gataaaaaat   180agagataaat ttagagcaat agttgcaaat agtggaaacg ccaactgttt tacaaaagat   240ggaatggaag atgctaaaga aatgcagaga ttagtagcag agctctttaa tattaatgaa   300gatgaggttt tagtagcctc aactggagtt attggaagaa agatggatat gaacattata   360aaagatagaa taaataaggt ttataattta ataaaagaag gaaacagctc aataaacgct   420gccaaagcaa taatgacaac tgatacaaaa ccaaaggaaa tagctgtgga gtttgaggtt   480aatggaaaaa ctgttagagt tggggggata gcaaaaggag ctgggatgat agctccaaat   540atgttacatg ctactatgct ttgctttata acaacagaca tagagattga taaagaaagc   600ttaacaaata tcttgcaaaa ggttgtagat aaaacattca acaacatatc cgttgatgga   660gacacttcaa caaatgatac cgtttttgtt ttagctaatg gattaagtgg agttaattat   720gaagaatgtg gagaagagtt tgaaaatgcc ttattgtatg tgtgcagaga gcttgccaag   780atgattgtta aggatggtga aggagctacc aaatttatgg aggttgttgt taaaggggct   840aaaactgagg aggatgcagt taaagcatca aaggctatag ttaattcttt gttagttaaa   900actgctgtgt ttggtggaga cccaaattgg ggaaggattg ttgctgctgt tggatatagt   960ggggctgatt tcaacccaga agttgttgat gttatattga gcaactataa agatgaggtt   1020tatttagtta aagatgggat tccattggct gatgaaggaa ctgaagagct aaaaaaggcc   1080gaggagatta tgaaaagtga tgaaataaag atagttgttg atttgaagat gggggagttt   1140gagaacgttt gttatggatg tgatttaagc tatgagtatg ttagaataaa cgctgaatat   1200acaacttaa                                                           1209<210>6<211>402<212>PRT<213>Methanococcus jannaschii<214>詹氏甲烷球菌<400>6Met Arg Val Ile Asp Gly Gly Val Thr Ala Pro Lys Gly Phe Lys Ala1               5                  10                  15Asn Gly Tyr Lys Glu Gly Lys Phe Gly Val Ala Ile Ile Ile Ser Glu
         20                  25                  30Lys Asp Ala Val Gly Ala Gly Thr Phe Thr Thr Asn Lys Val Val Ala
     35                  40                  45His Pro Val Val Leu Ser Arg Glu Leu Ile Lys Asn Arg Asp Lys Phe
 50                  55                  60Arg Ala Ile Val Ala Asn Ser Gly Asn Ala Asn Cys Phe Thr Lys Asp65                  70                  75                  80Gly Met Glu Asp Ala Lys Glu Met Gln Arg Leu Val Ala Glu Leu Phe
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        100                 105                 110Arg Lys Met Asp Met Asn Ile Ile Lys Asp Arg Ile Asn Lys Val Tyr
    115                 120                 125Asn Leu Ile Lys Glu Gly Asn Ser Ser Ile Asn Ala Ala Lys Ala Ile
130                 135                 140Met Thr Thr Asp Thr Lys Pro Lys Glu Ile Ala Val Glu Phe Glu Val145                150                 155                 160Asn Gly Lys Thr Val Arg Val Gly Gly Ile Ala Lys Gly Ala Gly Met
            165                 170                 175Ile Ala Pro Asn Met Leu His Ala Thr Met Leu Cys Phe Ile Thr Thr
        180                 185                 190Asp Ile Glu Ile Asp Lys Glu Ser Leu Thr Asn Ile Leu Gln Lys Val
    195                 200                 205Val Asp Lys Thr Phe Asn Asn Ile Ser Val Asp Gly Asp Thr Ser Thr
210                 215                 220Asn Asp Thr Val Phe Val Leu Ala Asn Gly Leu Ser Gly Val Asn Tyr225                 230                 235                 240Glu Glu Cys Gly Glu Glu Phe Glu Asn Ala Leu Leu Tyr Val Cys Arg
            245                 250                 255Glu Leu Ala Lys Met Ile Val Lys Asp Gly Glu Gly Ala Thr Lys Phe
        260                 265                 270Met Glu Val Val Val Lys Gly Ala Lys Thr Glu Glu Asp Ala Val Lys
    275                 280                 285Ala Ser Lys Ala Ile Val Asn Ser Leu Leu Val Lys Thr Ala Val Phe
290                 295                 300Gly Gly Asp Pro Asn Trp Gly Arg Ile Val Ala Ala Val Gly Tyr Ser305                 310                 315                 320Gly Ala Asp Phe Asn Pro Glu Val Val Asp Val Ile Leu ser Asn Tyr
            325                 330                 335Lys Asp Glu Val Tyr Leu Val Lys Asp Gly Ile Pro Leu Ala Asp Glu
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    355                 360                 365Ile Lys Ile Val Val Asp Leu Lys Met Gly Glu Phe Glu Asn Val Cys
370                 375                 380Tyr Gly Cys Asp Leu Ser Tyr Glu Tyr Val Arg Ile Asn A la Glu Tyr385                 390                 395                  400Thr Thr<210>7<211>37<212>DNA<213>Artificial Sequence<214>人工序列<220><223>人工序列描述：寡核苷酸<400>7gaaggagagt ataccatgac gatcacaaaa caaacgg                      37<210>8<211>38<212>DNA<213>Artificial Sequence<214>人工序列<220><223>人工序列描述：寡核苷酸<400>8gaaggagagt ataccatgtt cgttccgagg ggattcag                  38<210>9<211>37<212>DNA<213>Artificial Sequence<214>人工序列<220><223>人工序列描述：寡核苷酸<400>9gaaggagagt ataccatgag agttattgat ggtggag                   37<210>10<211>28<212>DNA<213>Artificial Sequence<214>人工序列<220><223>人工序列描述：寡核苷酸<400>10aaaggatcct tacgtccgat agctggcg                             28<210>11<211>28<212>DNA<213>Artificial Sequence<214>人工序列<220><223>人工序列描述：寡核苷酸<400>11aaaggatcct catgtcctgt acctcccg                            28<210>12<211>28<212>DNA<213>Artificial Sequence<214>人工序列<220><223>人工序列描述：寡核苷酸<400>12aaaggatcct taagttgtat attcagcg                             28

Claims (11)

1.一种具有产生L-精氨酸能力的微生物，所述的微生物是一种通过生物合成线性途径或环化途径合成L-精氨酸的微生物，并且该微生物含有一种包括编码具有鸟氨酸乙酰转移酶活性的酶的argJ基因的重组DNA。
2.一种具有产生L-精氨酸能力的微生物，所述的微生物是一种通过生物合成线性途径合成L-精氨酸的微生物，并且该微生物含有一种包括编码具有鸟氨酸乙酰转移酶活性的酶的argJ基因的重组DNA。
3.根据权利要求1或2项所述的微生物，其中所述的argJ基因编码一种具有鸟氨酸乙酰转移酶活性和乙酰谷氨酸合成酶活性的双功能酶。
4.根据权利要求1-3项所述的微生物，其中所述的酶缺乏L-精氨酸的抑制作用。
5.一种具有产生L-精氨酸能力的微生物，所述的微生物是一种通过生物合成线性或环化途径合成L-精氨酸的微生物，并且含有一种包括argJ基因的重组DNA，所述的argJ基因编码一种具有鸟氨酸乙酰转移酶活性和乙酰谷氨酸合成酶活性的双功能酶。
6.根据权利要求1所述的微生物，它属于大肠杆菌属。
7.根据权利要求1所述的微生物，其中所述的argJ基因来源于一种嗜热微生物。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的微生物，其中所述的argJ基因来源于属嗜热脂肪芽孢杆菌和那不勒斯栖热袍菌物种的嗜热微生物。
9.根据权利要求1-5中任一项所述的微生物，该微生物含有一种包括编码N-乙酰谷氨酸合成酶的argA基因另一重组的DNA。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的微生物，其中该重组DNA是一种以低或中等拷贝数目的质粒DNA。
11.一种生产L-精氨酸的方法，该方法包含如下步骤，把权利要求1-10中任一项所述的微生物培养在一种培养基中，以产生和积累L-精氨酸，然后从该培养基中回收L-精氨酸。
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Granted publication date: 20100526

Termination date: 20161026

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