JP4078515B2 - 発酵によるｌ−アルギニン産生のための微生物および方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、発酵によるＬ-アルギニン産生のための新規な方法に関する。
Ｌ-アルギニンは、肝機能促進剤、輸血溶液、食品添加物などの成分として産業的に有用なアミノ酸である。
【０００２】
【従来の技術】
微生物において、Ｌ-アルギニンの生合成は、前駆体Ｌ-グルタミン酸から開始する８つの酵素学的な工程において進行し、そして関与する微生物に依存して、２つの異なる経路の、直線経路または環状アセチル経路を伴う（Ｃｕｎｉｎら、１９８６；Ｄａｖｉｓ、１９８６）。両方の生合成経路において、最初の工程は、Ｎ-アセチルグルタミン酸合成酵素活性を示す酵素によって触媒されるグルタミン酸のＮ-アセチル基転移である。
【０００３】
直線経路において、アセチルグルタミン酸合成酵素活性は、ａｒｇＡ遺伝子によってコードされる酵素アセチルＣｏＡ：Ｌ-グルタミン酸 Ｎ-アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２.３.１.１.）によって提供され、およびこの経路において中間体のＮ-アセチル Ｌ-オルニチンは、ａｒｇＥ遺伝子によってコードされるＮ２-アセチル-Ｌ-オルニチンアミド加水分解酵素（ＥＣ３.５.１.１６）による脱アセチル化を介して、５番目の酵素学的工程にて、Ｌ-オルニチンに変換される。
【０００４】
従って、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような微生物において、Ｌ-アルギニンは、Ｎ-アセチルグルタミン酸、Ｎ-アセチルグルタミルリン酸、Ｎ-アセチルグルタミン酸セミアルデヒド、Ｎ-アセチルオルニチン、オルニチン、シトルリン、およびアルギニノコハク酸を介してＬ-グルタミン酸から合成される。これらの中間体は、Ｎ-アセチルグルタミン酸合成酵素、Ｎ-アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ-アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ-アセチルオルニチナーゼ、オルニチンカルバミルトランスフェラーゼ、アルギニノコハク酸合成酵素、およびアルギニノスクシナーゼの名称の下に一般に知られる酵素によって触媒される継続的な反応を介して合成される。これらの酵素は、それぞれ、ａｒｇＡ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ａｒｇＥ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、およびａｒｇＨ遺伝子によってコードされる。
【０００５】
環状アセチル経路において、Ｎ−アセチルオルニチンのアセチル基は、ａｒｇＪ遺伝子によってコードされる、酵素オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（Ｎ２-アセチル-Ｌ-オルニチン：Ｌ-グルタミン酸 Ｎ-アセチルトランスフェラーゼ；ＥＣ２．３.１．３５）によってＬ-グルタミン酸に転移される。この酵素に起因して、アルギニン生合成経路は、第１の酵素学的工程と第５の酵素学的工程との間を再循環し、そしてこのような環状アセチル経路は、一旦経路が供与体としてアセチル-ＣｏＡから開始されると、Ｎ-アセチルオルニチンがアセチル基供与体として使用され得るので、直線経路よりもエネルギー的に有利である。
【０００６】
環状アセチル経路は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＵｄａｋａおよびＫｉｎｏｓｈｉｔａ、１９５８）、ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ（ＨｏａｒｅおよびＨｏａｒｅ、１９６６）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｈａａｓら、１９７２）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＳｈｉｎｎｅｒｓおよびＣａｔｌｉｎ、１９７８）、ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｃ ａｒｃｈａｅａ（ＭｅｉｌｅおよびＬｅｉｓｉｎｇｅｒ、１９８４）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｖａｎ ｄｅ Ｃａｓｔｅｅｌｅら、１９９０）、Ｂａｃｉｌｌｕｓの代表物（Ｓａｋａｎｙａｎら、１９９２）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ（Ｈｉｎｄｌｅら、１９９４）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂａｅｔｅｎｓら、１９９８）、古細菌のＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｍａｒｃら、２０００）のような原核生物における、およびいくつかの真核生物体（ＤｅＤｅｋｅｎ、１９６２）における、Ｌ-アルギニンへの基質代謝を示す。ａｒｇＪ遺伝子またはその産物と相同性を共有するヌクレオチドまたはアミノ酸の配列はまた、完全にまたは部分的に配列決定されたゲノムについて利用可能であり、および相同性は、これらの生物体における環状アセチル経路の存在の指標である。
【０００７】
ａｒｇＪにコードされる産物は、オルニチンアセチルトランスフェラーゼのみを示し、単機能性の酵素として考慮され、このような酵素の特性が記載されている（Ｈａａｓら、１９７２；Ｓａｋａｎｙａｎら、１９９６；Ｂａｅｔｅｎｓら、１９９８；Ｍａｒｃら、２０００）。しかし、いくつかの微生物は、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ活性に加えて、Ｎ-アセチルグルタミン酸合成酵素活性をまた保持する酵素をコードする、ａｒｇＪ遺伝子の代替のバージョンを保有する。このような遺伝子および対応する二機能性の酵素は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＰｉｃａｒｄおよびＤｉｌｌｏｎ、１９８９；ＭａｒｔｉｎおよびＭｕｌｋｓ、１９９２）、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｓａｋａｎｙａｎら、１９９０および１９９３）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｃｒａｂｅｅｌら、１９９７）、Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（Ｍａｒｃら、２０００）について記載されている。
【０００８】
単機能性のＡｒｇＪ酵素は、二機能性の酵素から、２つの手段によって：
（ｉ）２つのアセチル基供与体の、Ｎ-アセチル Ｌ-オルニチンおよびアセチル-ＣｏＡを使用する酵素学的アッセイによって、（ｉｉ）クローン化されたａｒｇＪ遺伝子についての、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのａｒｇＥおよびａｒｇＡ変異体を使用する相補試験によって区別され得る。単機能性のＡｒｇＪ酵素は、Ｎ-アセチル Ｌ-オルニチンからＬ-グルタミンにアセチル基のみを転移し、そしてａｒｇＥ変異体のみを相補するのに対して、二機能性のＡｒｇＪ酵素は、Ｎ-アセチル Ｌ-オルニチンおよびアセチル-ＣｏＡの両方からアセチル基を転移し、そしてａｒｇＥおよびａｒｇＡの両方の変異体株を相補する。
両方の生合成経路は、特異的な転写リプレッサーによっておよびＬ-アルギニンまたは中間体産物による酵素学的工程の阻害によって、それぞれ、遺伝子調節および酵素学的調節に供される（Ｍａａｓ、１９９４；Ｇｌａｎｓｄｏｒｆｆ、１９９６）。さらに、Ｌ-グルタミン酸前駆体形成を先行する初期の代謝工程、およびＬ-アルギニン分解を伴う後の分解工程は、調節性の機構の制御下にある。従って、Ｌ-アルギニンの合成およびこのアミノ酸の産生量は、所与の微生物のゲノムにおける種々の標的での変異の導入によって、または所与の微生物の培養条件を影響することによって、または所与の微生物の膜透過性を影響することによって、調整され得る。
【０００９】
発酵による従来のＬ-アルギニン産生は、Ｌ-アルギニンを産生する微生物株、特にコリネ型細菌の代表物を使用して；２-チオアゾアラニン、α-アミノ-β-ヒドロキシ吉草酸、アルギニンヒドロキサメート、システインアナログ、スルホンアミド誘導体などを含むある代謝阻害物質に耐性のコリネ型細菌を使用して；Ｌ-プロリン、Ｌ-ヒスチジン、Ｌ-スレオニン、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-メチオニン、またはＬ-トリプトファンを含むいくつかのアミノ酸についての栄養素要求性を示すコリネ型細菌を使用して、ならびに上述の耐性およびアミノ酸についての栄養素要求性の両方を示すコリネ型細菌を使用して行われている。これに関して、参照が以下の特許に対してなされ得る：ＦＲ ２ ０８４ ０５９、２ １１９ ７５５、２ ４９０ ６７４、２ ３４１ ６４８、２ ２２５ ５１９、ＥＰ ０ ３７９９０３ Ｂ１、ＥＰ ０ ３７８ ２２３ Ｂ１、ＥＰ ０ ３３６３８７ Ｂ１。
【００１０】
他方、、アルギニン生合成について十分に知られた遺伝子を含有する組換えＤＮＡによって形質転換されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物を使用することによって、律速反応の酵素活性を増強することによるＬ-アルギニンを産生するための方法が開示されている。野生型株、または転写リプレッサーについての変異体、または関連の抵抗性もしくは栄養素要求性を保有する変異体が、発酵のための組換え宿主細胞として使用されてきた。
【００１１】
Ｌ-アルギニンを産生するために使用される、大部分の組換え微生物は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する。これに関して、参照が、以下の特許に対してなされる：ＦＲ ２ １４３ ２３８；ＦＲ ２ ４８４ ４４８；ＥＰ ０ ２５９８５８ Ｂ１；ＥＰ ０２６１６２７ Ｂ１；ＥＰ ０ ３３２２３３ Ａ１；ＥＰ ０ ９９９２６７ Ａ１；ＥＰ １０１６７１０ Ａ２。
【００１２】
しかし、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２株は、完全に配列決定されたゲノム（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、１９９７）、および種々の遺伝子アプローチの適用可能性、およびこの株またはその誘導体において操作するためのより有利なベクターを伴い、Ｌ-アルギニンを含むアミノ酸の産生について同様に魅力的な宿主である。組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株によるＬ-アルギニンの増加された産生は、プラスミドベクター上にクローン化されたａｒｇＡ遺伝子を使用し、続いてＥ.ｃｏｌｉについて記載される方法（ＥｃｋｈａｒｄおよびＬｅｉｓｉｎｇｅｒ、１９７５；Ｒａｊａｇｏｐａｌら、１９９８）によってフィードバック阻害耐性変異体を単離することによって達成され得る。これに関して、参照が、ＥＰ １ ０１６ ７１０ Ａ２に対してなされ得る。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、効率の良いＬ−アルギニンを賛成する能力を有する微生物を提供し、効率の良いＬ−アルギニンの製造法を提供することを課題とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、次に列挙される。
（請求項１）Ｌ-アルギニンを産生する能力を有する微生物であって、該微生物は生合成の直線経路または環状経路を介してＬ-アルギニンを合成する微生物であり、およびオルニチンアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子を含有する組換えＤＮＡを保有する、微生物。
（請求項２）Ｌ-アルギニンを産生する能力を有する微生物であって、該微生物は生合成の直線経路を介してＬ-アルギニンを合成する微生物であり、およびオルニチンアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子を含有する組換えＤＮＡを保有する、微生物。
（請求項３）請求項１または２に記載の微生物であって、ここで遺伝子が、ａｒｇＪである、微生物。
（請求項４）請求項１または２に記載の微生物であって、ここで遺伝子が、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ活性およびアセチルグルタミン酸合成酵素活性の両方を有する二機能性の酵素をコードする、微生物。
（請求項５）請求項１〜４に記載の微生物であって、ここで酵素がＬ-アルギニンによる阻害を欠く、微生物。
（請求項６）Ｌ-アルギニンを産生する能力を有する微生物であって、該微生物は生合成の直線経路または環状経路を介してＬ-アルギニンを合成する微生物であり、およびオルニチンアセチルトランスフェラーゼ活性およびアセチルグルタミン酸合成酵素活性を有する二機能性の酵素をコードする遺伝子ａｒｇＪを含有する組換えＤＮＡを保有する、微生物。
（請求項７）請求項１に記載の微生物であって、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ属に属する、微生物。
（請求項８）請求項１に記載の微生物であって、ここで遺伝子が、好熱性微生物に由来する、微生物。
（請求項９）請求項１〜８のいずれかに記載の微生物であって、ここで遺伝子が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ種またはＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ種に属する好熱性微生物に由来する、微生物。
（請求項１０）請求項１〜９のいずれかに記載の微生物であって、Ｎ-アセチルグルタミン酸合成酵素をコードするａｒｇＡ遺伝子を含有する組換えＤＮＡをさらに保有する、微生物。
（請求項１１）請求項１〜１０のいずれかに記載の微生物であって、ここで組換えＤＮＡが低いまたは中程度のコピー数で存在するプラスミドＤＮＡである、微生物。
（請求項１２）Ｌ-アルギニンを産生するための方法であって、培養培地中で、請求項１〜１１のいずれかにおいて規定されるような微生物を培養して、培地中でＬ-アルギニンを産生および蓄積する工程、ならびに培地からＬ-アルギニンを回収する工程、を包含する、方法。
【００１５】
組換え微生物によるＬ-アルギニン産生が、野生型ａｒｇＡ遺伝子またはそのフィードバック阻害耐性変異体によって、Ｎ-アセチルグルタミン酸合成酵素活性をコードする遺伝子のコピー数を増強することによって、改善されてきた。 しかし、変異体ａｒｇＡ遺伝子の適用は、組換え株によるＬ-アルギニンの生産性をさらに増加するためには限界を有する。
【００１６】
Ｌ-アルギニン産生能を有する微生物を用いてＬ-アルギニンを産生することが可能であることが今や見出され、当該微生物は、Ｌ-アルギニンを合成する微生物であり、およびオルニチンアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子（以下、「ａｒｇＪ遺伝子」ということがある。）を含む組換えＤＮＡを保有する。
【００１７】
本発明は、L-アルギニンを産生する能力を有する微生物を提供し、これはオルニチンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ａｒｇＪ遺伝子）を含む組換えＤＮＡを保有する。
【００１８】
本発明はまた、上記の微生物を提供し、ここでａｒｇＪ遺伝子は単機能性の酵素または好ましくは二機能性の酵素をコードする。
好ましくは、ａｒｇＪ遺伝子は、単機能性または二機能性の酵素をコードし、Ｌ-アルギニンの阻害がない。
より好ましくは、ａｒｇＪ遺伝子は好熱性微生物に由来する。
【００１９】
本発明はまた、Ｌ-アルギニンを産生するための方法に関し、培地中で上記の微生物を培養して、Ｌ-アルギニンを産生および蓄積し、そしてＬ-アルギニンを培地から回収する工程を包含する。
【００２０】
本明細書中で使用される用語「Ｌ-アルギニンを産生する能力」は、本発明の微生物が、培養培地中にＬ-アルギニンを、これが当該培地中で培養される場合に、蓄積する能力を意味する。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明の微生物は、Ｌ-アルギニンを産生する能力を有する微生物であり、ここで当該能力は、組換えＤＮＡ技術によってそこに導入された、オルニチンアセチルトランスフェラーゼをコードするａｒｇＪ遺伝子によって提供される。
【００２２】
好ましくは、本発明において有用なａｒｇＪ遺伝子は、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ活性を伴う酵素、またはオルニチンアセチルトランスフェラーゼおよびＮ-アセチルグルタミン酸合成酵素の活性を伴う酵素をコードする遺伝子であり、単機能性または二機能性酵素の当該活性は、Ｌ-アルギニンによる阻害を欠く。
【００２３】
ａｒｇＪ遺伝子は、例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ Ｊａｎｎａｓｓｃｈｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、またはＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａのような好熱性微生物に由来するのが有利である。 当該遺伝子の配列は、本明細書中に参考として援用される以下の論文において開示される：
-Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ＪａｎｎａｓｃｈｉｉのａｒｇＪ：Ｂｕｌｔら、１９９６；
-Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＩＢ８２２４のａｒｇＪ：Ｓａｋａｎｙａｎら、１９９３；
-Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａのａｒｇＪ：Ｄｉｍｏｖａら、２０００。
【００２４】
適切なａｒｇＪ遺伝子の例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＩＢ８２２４、ＡＴＣＣ１２９８０、ＡＴＣＣ７９５３、ＡＴＣＣ１０１４９、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ ＤＳＭ５０６８、ＡＴＣＣ４９０４９、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ Ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＤＳＭ２６６１に由来する遺伝子である。
【００２５】
好ましいａｒｇＪ遺伝子は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、またはＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａに由来する遺伝子である。
【００２６】
Ｌ-アルギニンを産生する微生物は、生合成の直線経路または環状経路のいずれかを介してＬ-アルギニンを合成し得、および遺伝子操作によってそこに導入されるクローン化されたａｒｇＪ遺伝子を保有する、任意の微生物である。
【００２７】
当該微生物は、例えば、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属もしくはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌のようなコリネ型細菌、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する細菌から選択され得る。
【００２８】
好ましくは、当該微生物は、直線生合成経路を介してアルギニンを合成する微生物、およびより好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物である。
【００２９】
本発明について適切なＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の細菌の例は、以下のように列挙される：
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２株およびその派生体、特にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｐ４ＸＢ２（Ｈｆｒ、ｍｅｔＢ、ｒｅｌＡ、ａｒｇＲ）（Ｓａｋａｎｙａｎら、１９９６）。当該株のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｐ4ＸＢ２は、番号Ｉ ２５７１の下、２０００年１０月９日にパスツール研究所の「Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｔｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ」（ＣＮＣＭ）に寄託された。
【００３０】
好ましくは、宿主株は、微生物におけるＬ-アルギニン生合成経路のネガティブな制御に関与する転写抑制を欠く（ａｒｇＲ-）。
【００３１】
ａｒｇＪ遺伝子は、適切なプライマーを利用するＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応、Ｗｈｉｔｅ Ｔ．Ｊ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．、５、１８５（１９８９）を参照のこと）によって増幅され、そしてその後当業者に周知の方法に従ってＤＮＡベクターとライゲーションされる。このような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）によって開示される。 ａｒｇＪのクローニングのために使用されるベクターは、低いもしくは中程度のまたは高いコピー数で、微生物において自己複製可能なプラスミドであり得；その特定の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）において記載されるプラスミドｐＡＣＹＣ１８４である。ファージベクターはまた使用され得る。宿主細菌の染色体ＤＮＡ上へのａｒｇＪ遺伝子の取り込みはまた、任意のベクター系を使用しない相同組換えによって行われ得る。Ｌ-アルギニンを合成する異なる微生物において自己複製可能なシャトルベクターはまた、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ以外の宿主細胞へのａｒｇＪの取り込みのために使用され得る。
【００３２】
遺伝子を保有するＤＮＡフラグメントおよびＤＮＡベクターをライゲーションすることによって組換えＤＮＡ分子を調製するために、ベクターは、増幅される遺伝子の末端に対応する制限酵素によって消化される。ライゲーションは、一般に、Ｔ４ ＤＮＡ ポリヌクレオチドリガーゼのようなリガーゼを使用して行われる。
【００３３】
ＤＮＡベクターは、好ましくはプロモーターを含有する発現ベクターであり、プロモーターは、発現される遺伝子の上流のリボソーム結合部位が続き得る。このベクターはまた、複製起点および選択マーカーを含む。
【００３４】
プロモーターは、弱いもしくは中程度であるか、または強くあり得る。後者は、制御された作用に供され、そしてそれゆえ、制御された遺伝子発現を提供する。適切なプロモーターは、例えば、ｔｅｔまたはａｍｐプロモーターなどである。
【００３５】
選択マーカーは、テトラサイクリン、アンピシリン、クロラムフェニコールなどのような抗生物質に対する抵抗性を担う遺伝子である。
【００３６】
関連される微生物におけるａｒｇＪ遺伝子の発現のための適切な手段を含む組換えＤＮＡは、エレクトロポレーション、ＣａＣｌ２媒介性の形質転換などのような従来の方法によってその微生物に導入される。
【００３７】
本発明の実施態様の変形に従って、本発明の微生物は、Ｎ-アセチルグルタミン酸合成酵素をコードするａｒｇＡ遺伝子を含有する組換えＤＮＡ、および上述の方法に従って調製されるＤＮＡベクターをさらに保有し得る。ａｒｇＡ遺伝子は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなどから採取され得る。
【００３８】
さらに、ＤＮＡベクターは、スクラーゼ、レバナーゼ、レバンスクラーゼなどをコードする遺伝子、好ましくはレバナーゼをコードする遺伝子のような、グルコース以外の炭素の供給源の利用のための遺伝子をさらに含み得る。
【００３９】
Ｌ-アルギニンを産生するための本発明の方法は、本発明の微生物を、適切な培養培地中で培養して、培地中にアミノ酸を産生および蓄積する工程、ならびに培地からアミノ酸を回収する工程を包含する。
【００４０】
本発明の方法において、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物の培養、液体培地からのアミノ酸の回収および精製は、コリネ型細菌またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓを使用する発酵によってアミノ酸を産生するための従来の方法の様式に類似の様式において、行われ得る。培養のために使用される培地は、培地が炭素および窒素供給源および鉱物、ならびに必要であれば、適切な量において増殖するために使用される細菌が必要とする栄養素を含む限り、合成培地または天然の培地のいずれかであり得る。
【００４１】
炭素供給源は、グルコースおよびスクロースのような種々の炭水化物、ならびに種々の有機酸を含み得る。炭素供給源は好ましくはスクロースである。使用される細菌の同化作用能に依存して、エタノールおよびグリセロールを含むアルコールが使用され得る。窒素供給源として、アンモニア、硫酸アンモニウムのような種々のアンモニウム塩、アミンのような他の窒素化合物、ペプトンのような天然の窒素供給源、ダイズ水和物、および分解された発酵微生物が使用される。鉱物として、カリウム一リン酸、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸鉄、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウムが使用される。
【００４２】
培養は好ましくは、振盪培養、エアレーション、および攪拌培養のような好気性の条件下で行われる。培養の温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは２８〜３８℃である。培養のｐＨは、通常５と９との間、好ましくは６．５と７．２との間である。培養のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、種々の酸、種々の塩基、および緩衝液で調節され得る。通常、１〜３日間の培養は、培地中への所与のアミノ酸の蓄積を導き得る。
【００４３】
Ｌ-アルギニンを回収することは、例えば培養後の遠心分離または膜ろ過によって、培地から細胞のような固形物を除去し、次いでイオン交換によってＬ-アルギニンを回収および精製することによる従来の方法、濃縮、および結晶分画法などによって行われ得る。
【００４４】
本発明は、説明の目的のためのみに与えられる以下の実施例において今やより詳細に開示される。
【００４５】
【実施例】
以下実施例によって本発明を説明するが、本実施例は発明を限定するものではない。
【００４６】
実施例１：ａｒｇＪ遺伝子を保有するプラスミドの構築
中程度の好熱性細菌のＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｓａｋａｎｙａｎら、１９９３）および超好熱性細菌のＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（Ｄｉｍｏｖａら、２０００）からクローン化された以下のａｒｇＪ遺伝子は、それぞれ、配列番号１および配列番号３のＤＮＡ配列を有し、これはそれぞれ、配列番号２および配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。超好熱性古細菌のＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｂｕｌｔら、１９９６）由来のａｒｇＪ配列は、配列番号５のＤＮＡ配列を有し、これは配列番号６のアミノ酸を有するタンパク質をコードする。これらの３つの微生物に由来する３つのａｒｇＪ遺伝子の５'および３'末端に対応するプライマーを合成した。ＧＧＡＧ Ｓｈｉｎｅ／Ｄａｌｇａｒｎｏ部位を含有するａｒｇＪ遺伝子の開始に対応するオリゴヌクレオチドは以下の配列を有する：
ＢＳ ５'-ＧＡＡＧＧＡＧＡＧＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＣＧＡＴＣＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＣＧＧ-３'（配列番号７）
ＴＮ ５'-ＧＡＡＧＧＡＧＡＧＴＡＴＡＣＣＡＴＧＴＴＣＧＴＴＣＣＧＡＧＧＧＧＡＴＴＣＡＧ-３'（配列番号８）
ＭＪ ５'-ＧＡＡＧＧＡＧＡＧＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＧＡＧＴＴＡＴＴＧＡＴＧＧＴＧＧＡＧ-３'（配列番号９）。
ＧＧＡＴＣＣ ＢａｍＨＩ部位を含有するａｒｇＪ遺伝子の末端に対応するオリゴヌクレオチド以下の配列を有する：
ＢＳ ５'-ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＧＴＣＣＧＡＴＡＧＣＴＧＧＣＧ-３'（配列番号１０）
ＴＮ ５'-ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＧＴＣＣＴＧＴＡＣＣＴＣＣＣＧ-３'（配列番号１１）
ＭＪ ５'-ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＧＴＴＧＴＡＴＡＴＴＣＡＧＣＧ-３'（配列番号１２）。
【００４７】
異なるＤＮＡ鋳型からのａｒｇＪ遺伝子の増幅は、ＤＮＡポリメラーゼＰｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いるＰＣＲによって行われた。使用された条件は以下のようであった：
最初の変性 ９５℃、５分間
変性 ９４℃、１分間
アニーリング ４７℃、１分間 ３０サイクル
伸長 ７２℃、２分間、
最後の伸長 ７２℃、７分間、４℃
【００４８】
ＰＣＲ産物は続いてリン酸化され、ＢａｍＨＩで消化され、そして酵素ＥｃｏＲＶで予め消化され、脱リン酸され、次いで第２の酵素ＢａｍＨＩで消化されたプラスミドベクターｐＡＣＹＣ１８４と混合される。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによるライゲーション後、組換えＤＮＡを、エレクトロポレ-ション（２５００Ｖ、２１μＦ、４００Ω、１０ｍｓｅｃ）によってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＸＳ１Ｄ２Ｒ株［Ｆ-△（ｐｐｃ-ａｒｇＥ）ｎａｌＡ ｒｐｏＢ λ- ｈｓｄＲ ｒｅｃＡ］にトランスファーした。組換えクローンを、０．２％のクエン酸を補充し、および抗生物質のクロラムフェニコール（２５μｇ/ｍｌ）を含有する、寒天（１．５％）で固化した、アルギニン非含有の最小培地Ｍ９（Ｍｉｌｌｅｒ、１９９２）上で選択した。３７℃での３日間のインキュベーション後、Ｃｍｒ ＡｒｇＥ＋コロニーを選択し、そして対応する好熱性微生物のａｒｇＪ遺伝子を保有する組換えプラスミドをこのようなクローンから単離した。得られたプラスミドＤＮＡを配列決定して、クローン化されたＤＮＡ配列を確認し、そしてａｒｇＪ遺伝子転写がｔｅｔ遺伝子プロモーターの制御下で配向されるプラスミドを選択した。それらの制限酵素マップは、図１において示される。得られたプラスミドは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、またはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのａｒｇＪ遺伝子を含有し、それぞれ、ｐＪ-Ｂ、ｐＪ-Ｔ、およびｐＪ-Ｍと称した。
【００４９】
実施例２：組換えプラスミドの遺伝子解析
遺伝子解析および酵素学的解析の手段によって、２つのタイプのＡｒｇＪ酵素を認識することが可能である。オルニチンアセチルトランスフェラーゼ活性のみを保有する単機能性の酵素は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２のａｒｇＥ変異体を補足することが可能であるのに対して、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ活性およびアセチルグルタミン酸合成酵素活性の両方を示す二機能性の酵素は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２のａｒｇＥおよびａｒｇＡ変異体を相補することが可能である。
【００５０】
得られた３つのプラスミドを、実施例１において記載される条件を使用して、単一のａｒｇＡ変異を相補するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＸＡ４株に、ならびにａｒｇＡおよびａｒｇＥ変異を保有する二重変異体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＸＡ４：ａｒｇＥ株に、エレクトロポレーションによってトランスファーした。組換えコロニーを、抗生物質クロラムフェニコール（２５μｇ/ｍｌ）を含有する、寒天（１．２％）で固化したＬＢリッチ培地上で選択した。各ディッシュからの５０個のコロニーをＮａＣｌ溶液（０．９％）に再懸濁し、次いでＬ-アルギニン（１５０μｇ／ｍｌ）は含有するかまたは含有しないが、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）は常に含有する、寒天（１．２％）で固化した最小培地Ｍ９を有するディッシュ上にレプリカした。３７℃で２日間のインキュベーション後、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２株ＸＡ４（ｐＪ-Ｂ）、ＸＡ４：：ａｒｇＥ（ｐＪ-Ｂ）、ＸＡ４（ｐＪ-Ｔ）、およびＸＡ４：：ａｒｇＥ（ｐＪ-Ｔ）の５０個の全てのコロニーは、記載される選択培地上で発育した。対照的に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２株ＸＡ４（ｐＪ-Ｍ）およびＸＡ４：：ａｒｇＥ（ｐＪ-Ｍ）のコロニーはアルギニン非含有培地上で増殖しなかったが、これらは明らかにＬ−アルギニンを補充した培地上で２日後に可視できた。これらの結果は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａのａｒｇＪ遺伝子は、二機能性の酵素をコードするのに対して、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのａｒｇＪ遺伝子は、単機能性の酵素をコードすることを示す。
【００５１】
実施例３：酵素学的解析
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２株ＸＳ1Ｄ２（ｐＪ-Ｂ）、ＸＳ１Ｄ２（ｐＪ-Ｔ）、およびＸＳ１Ｄ２（ｐＪ-Ｍ）を、アルギニンを欠くが、クエン酸（０．２％）を補充し、およびクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）を含有する最小培地Ｍ９において、３７℃で２４時間培養した。次いで細胞をペレット化し、Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８）中で２回洗浄し、次いで超音波処理（１９ｋＨｚで１０秒間のパルスにつき１５分間）によって溶解した。酵素学的活性を、アセチル基供与体としてアセチルＣｏＡまたはＮ-アセチルオルニチンを使用して、３７℃または７０℃にて、以下の緩衝液：０．１Ｍ ＭＥＳ、０．１Ｍ ＰＩＰＥＳ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、０．１Ｍグリシン、０．１Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４中で測定し、そして、反応産物、すなわちＮ-アセチルグルタミン酸を、ＨＰＬＣによって定量した。サンプルを、移動相として１ｍｌ／分の流動速度を用い、０．１Ｍリン酸とメタノールとの混合液（９０：１０ 容量：容量）を使用して、ＨＰＬＣシステム（Ｋｏｎｔｒｏｎ）上のＬｕｎａ Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上で解析した。反応産物を２１５ｎｍで検出した。表１において与えられる結果は、３つの酵素が３７℃および７０℃にてオルニチンアセチルトランスフェラーゼ活性を保有することを示す。
【００５２】
【表１】
【００５３】
アセチルグルタミン酸合成酵素活性は、両方の温度にて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａの酵素についてのみ検出された。これらの結果は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａからのＡｒｇＪ酵素は実際に二機能性であるが、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ Ｊａｎｎａｓｃｈｉｉからの酵素は単機能性の酵素であることを確認する。酵素学的活性の減少は、１０ｍＭ Ｌ-アルギニンの添加によって何ら検出されなかった。
【００５４】
実施例４：組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｐ４ＸＢ２株によるＬ-アルギニン産生
プラスミドｐＪ-Ｂ、ｐＪ-Ｔ、およびｐＪ-Ｍを、実施例１において上記される条件下で、エレクトロポレ-ションによってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｐ４ＸＢ２株にトランスファーした。対応するクローンを、寒天（１．２％）で固化され、およびクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢリッチ培地上で選択した。各組換え株の３つの独立したコロニーを、発酵の間に産生されるＬ−アルギニンの量を評価するために選択した。この目的のために、ディッシュから採取されたコロニーをクロラムフェニコールを含有するＬＢ培地中に再懸濁し、そして至適密度が６００ｎｍにて０．８に達するまで、３０℃で培養した。この前培養の１ｍｌを、以下の組成：２．８％の（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２％のＫ２ＨＰＯ４、０．５％の酵母抽出物、０．０５％のＭｇＳＯ４、０．００１％のＦｅＳＯ４、０．００１％のＭｎＳＯ４、１０μｇ／ｍｌのチアミン、１００μｇ／ｍｌのメチオニン、５％のグルコース、２．５％のＣａＣＯ３、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール；ｐＨ７．２を有する、１４ｍｌの発酵培地に添加した。発酵を、３０℃にて４０時間、３２０ｒｐｍの速さにて円形振盪器上の７５０ｍｌのコニカルフラスコにおいて行った。発酵後、サンプルを回収し、そしてＬ−アルギニンの量を、ペーパークロマトグラフィーによるか、または薄層クロマトグラフィーおよびアセトン中に溶解された０．５％のニンヒドリンでの展開によるか、または分光光度計によるか、またはアミノ酸解析器によるかのいずれかで、Ｌ−アルギニン検量目盛りに対して評価した。
これらの発酵の結果は、表２において示される。
【００５５】
【表２】
【００５６】
これらの結果は、全てのａｒｇＪを保有するプラスミドは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２宿主細胞においてＬ−アルギニンの収量を増加する能力を保有することを示した。明らかに、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおけるＬ−アルギニンの産生のレベルは、ｐＪ-Ｍプラスミドを含有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２株と比較されるように、プラスミドｐＪ-ＢまたはｐＪ-Ｔを含むそれらの株において非常により優れていた。このことは、二機能性のＡｒｇＪ酵素をコードする遺伝子の発現が、単機能性のＡｒｇＪ酵素をコードする遺伝子と比較して、Ｌ−アルギニンのより優れた産生量を確実にすることを実証する。
【００５７】
実施例５：２つのプラスミドを保有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２株におけるＬ−アルギニンの合成
プラスミドｐＡＲＧ２Ｓは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２においてＬ−アルギニンを産生することを可能にする。このプラスミドは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２からのａｒｇＡ遺伝子およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ １６８からのレバナーゼ遺伝子（ｓａｃＣ）をｐＢＲ３２７-ｋａｎベクター上に保有する。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ Ｋ１２からの野生型ａｒｇＡ遺伝子を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２のａｒｇＡ変異体（Ｎｅｒｓｉｓｙａｎら、１９８６）の相補によってクローン化した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ １６８からのｓａｃＣ遺伝子を、唯一の炭素供給源としてスクロースを含有する最小培地Ｍ９を使用することによって、ｐＱＢ７９,１コスミドバンク（Ｆｏｕｅｔら、１９８２）において選択した。６．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ-ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡ内に同定されるｓａｃＣ遺伝子を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって消化されたプラスミドｐＢＲ３２７-ｋａｎに挿入した。次いで、得られたプラスミドをＢａｍＨＩおよびＳａｌＩにより消化したものの中に、ａｒｇＡを保有する１．５ｋｂのＢａｍＨＩ-ＳａｌＩ ＤＮＡフラグメントを挿入し、ｐＡＲＧＳ２プラスミドを保有する組換えクローンを選択した。ｐＡＲＧＳ２プラスミドは、Ｌ−アルギニンを含有するかまたは含有しない、唯一の炭素供給源としてスクロースを含有する、選択培地Ｍ９上でのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ａｒｇＡ変異体細胞の増殖を確実にする。
【００５８】
プラスミドｐＪ-Ｂ、ｐＪ-Ｔ、およびｐＪ-Ｍを、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｐ４ＸＢ２（ｐＡＲＧＳ２）株にトランスファーし、そして組換えクローンを２つの抗生物質のクロラムフェニコール（２５μｇ/ｍｌ）およびカナマイシン（４０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上で選択した。各形質転換された株および元来の株のそれぞれ３つのコロニーを、実施例４において使用された条件下で、Ｌ-アルギニン産生について試験した。ただし、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｐ４ＸＢ２（ｐＡＲＧＳ２）についての培地はカナマイシン（４０μｇ／ｍｌ）のみを含み、あるいは形質転換されたクローンについての培地は記載される組成物に加えてカナマイシンを含む。
発酵の結果は、表３において与えられる。
【００５９】
【表３】
【００６０】
これらの結果は、同じＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ宿主株において、ｐＡＲＧＳ２プラスミドと、ａｒｇＪ遺伝子を保有する３つのプラスミドのうちのいずれかとの同時の存在は、Ｌ-アルギニンのより高い産生を提供することを実証する。しかし、Ｌ-アルギニン収量は、ｐＡＲＧＳ２およびｐＪ-Ｍプラスミドを保有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｐ４ＸＢ２株におけるよりも、ｐＡＲＧＳ２およびｐＪ-ＢまたはｐＪ-Ｔプラスミドを保有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｐ４ＸＢ２株において優れる。これらの結果は、同じ株におけるａｒｇＡ遺伝子（ｐＡＲＧＳ２プラスミド）と、二機能性の酵素オルニチンアセチルトランスフェラーゼをコードするａｒｇＪ遺伝子（ｐＪ-ＢまたはｐＪ-Ｔプラスミド）との共存は、単機能性の酵素をコードするａｒｇＪ遺伝子（ｐＪ-Ｍプラスミド）との共存よりもＬ-アルギニンの優れた収量を保証することを示す。
【００６１】
実施例６：スクロースを含有する発酵培地におけるＬ-アルギニンの産生
プラスミドｐＡＲＧＳ２は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２細胞が炭素供給源としてスクロースを消費することを可能にする。野生型Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２株およびその派生体は天然で、グルコースをスクロースで置き換えられた最小培地において発育し得ない。
グルコースがスクロース（６％）に置き換えられ、および培養が４４時間に延長された以外は上記の条件下で、実施例５において記載される株を使用して、Ｌ-アルギニンの産生のために発酵を行った。結果は表４において与えられる。
【００６２】
【表４】
【００６３】
これらの結果はまた、二機能性のＡｒｇＪ酵素は、単機能性の酵素と比較して、グルコースがスクロースによって置き換えられる培地中での発酵の間、ａｒｇＡおよびスクロース消費遺伝子ｓａｃＣを有する第２のプラスミドｐＡＲＧＳ２を保有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２株において、より高い収量のＬ？アルギニンを提供することを示す。
【００６４】
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【００６５】
【配列表】
【００６７】
【００６８】
【００６９】
【００７０】
【００７１】
【００７２】
【００７３】
【００７４】
【００７５】
【００７６】
【００７７】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４；ｐＪ-Ｂ；ｐＪ-Ｔ、およびｐＪ-Ｍの制限酵素マップである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、発酵によるＬ-アルギニン産生のための新規な方法に関する。
Ｌ-アルギニンは、肝機能促進剤、輸血溶液、食品添加物などの成分として産業的に有用なアミノ酸である。
【０００２】
【従来の技術】
微生物において、Ｌ-アルギニンの生合成は、前駆体Ｌ-グルタミン酸から開始する８つの酵素学的な工程において進行し、そして関与する微生物に依存して、２つの異なる経路の、直線経路または環状アセチル経路を伴う（Ｃｕｎｉｎら、１９８６；Ｄａｖｉｓ、１９８６）。両方の生合成経路において、最初の工程は、Ｎ-アセチルグルタミン酸合成酵素活性を示す酵素によって触媒されるグルタミン酸のＮ-アセチル基転移である。
【０００３】
直線経路において、アセチルグルタミン酸合成酵素活性は、ａｒｇＡ遺伝子によってコードされる酵素アセチルＣｏＡ：Ｌ-グルタミン酸 Ｎ-アセチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２.３.１.１.）によって提供され、およびこの経路において中間体のＮ-アセチル Ｌ-オルニチンは、ａｒｇＥ遺伝子によってコードされるＮ２-アセチル-Ｌ-オルニチンアミド加水分解酵素（ＥＣ３.５.１.１６）による脱アセチル化を介して、５番目の酵素学的工程にて、Ｌ-オルニチンに変換される。
【０００４】
従って、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのような微生物において、Ｌ-アルギニンは、Ｎ-アセチルグルタミン酸、Ｎ-アセチルグルタミルリン酸、Ｎ-アセチルグルタミン酸セミアルデヒド、Ｎ-アセチルオルニチン、オルニチン、シトルリン、およびアルギニノコハク酸を介してＬ-グルタミン酸から合成される。これらの中間体は、Ｎ-アセチルグルタミン酸合成酵素、Ｎ-アセチルグルタミン酸キナーゼ、Ｎ-アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ、Ｎ-アセチルオルニチナーゼ、オルニチンカルバミルトランスフェラーゼ、アルギニノコハク酸合成酵素、およびアルギニノスクシナーゼの名称の下に一般に知られる酵素によって触媒される継続的な反応を介して合成される。これらの酵素は、それぞれ、ａｒｇＡ、ａｒｇＢ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ、ａｒｇＥ、ａｒｇＦ、ａｒｇＧ、およびａｒｇＨ遺伝子によってコードされる。
【０００５】
環状アセチル経路において、Ｎ−アセチルオルニチンのアセチル基は、ａｒｇＪ遺伝子によってコードされる、酵素オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（Ｎ２-アセチル-Ｌ-オルニチン：Ｌ-グルタミン酸 Ｎ-アセチルトランスフェラーゼ；ＥＣ２．３.１．３５）によってＬ-グルタミン酸に転移される。この酵素に起因して、アルギニン生合成経路は、第１の酵素学的工程と第５の酵素学的工程との間を再循環し、そしてこのような環状アセチル経路は、一旦経路が供与体としてアセチル-ＣｏＡから開始されると、Ｎ-アセチルオルニチンがアセチル基供与体として使用され得るので、直線経路よりもエネルギー的に有利である。
【０００６】
環状アセチル経路は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ（ＵｄａｋａおよびＫｉｎｏｓｈｉｔａ、１９５８）、ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ（ＨｏａｒｅおよびＨｏａｒｅ、１９６６）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（Ｈａａｓら、１９７２）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＳｈｉｎｎｅｒｓおよびＣａｔｌｉｎ、１９７８）、ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｃ ａｒｃｈａｅａ（ＭｅｉｌｅおよびＬｅｉｓｉｎｇｅｒ、１９８４）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ（Ｖａｎ ｄｅ Ｃａｓｔｅｅｌｅら、１９９０）、Ｂａｃｉｌｌｕｓの代表物（Ｓａｋａｎｙａｎら、１９９２）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ（Ｈｉｎｄｌｅら、１９９４）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｂａｅｔｅｎｓら、１９９８）、古細菌のＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｍａｒｃら、２０００）のような原核生物における、およびいくつかの真核生物体（ＤｅＤｅｋｅｎ、１９６２）における、Ｌ-アルギニンへの基質代謝を示す。ａｒｇＪ遺伝子またはその産物と相同性を共有するヌクレオチドまたはアミノ酸の配列はまた、完全にまたは部分的に配列決定されたゲノムについて利用可能であり、および相同性は、これらの生物体における環状アセチル経路の存在の指標である。
【０００７】
ａｒｇＪにコードされる産物は、オルニチンアセチルトランスフェラーゼのみを示し、単機能性の酵素として考慮され、このような酵素の特性が記載されている（Ｈａａｓら、１９７２；Ｓａｋａｎｙａｎら、１９９６；Ｂａｅｔｅｎｓら、１９９８；Ｍａｒｃら、２０００）。しかし、いくつかの微生物は、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ活性に加えて、Ｎ-アセチルグルタミン酸合成酵素活性をまた保持する酵素をコードする、ａｒｇＪ遺伝子の代替のバージョンを保有する。このような遺伝子および対応する二機能性の酵素は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ（ＰｉｃａｒｄおよびＤｉｌｌｏｎ、１９８９；ＭａｒｔｉｎおよびＭｕｌｋｓ、１９９２）、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｓａｋａｎｙａｎら、１９９０および１９９３）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｃｒａｂｅｅｌら、１９９７）、Ｔ．ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（Ｍａｒｃら、２０００）について記載されている。
【０００８】
単機能性のＡｒｇＪ酵素は、二機能性の酵素から、２つの手段によって：
（ｉ）２つのアセチル基供与体の、Ｎ-アセチル Ｌ-オルニチンおよびアセチル-ＣｏＡを使用する酵素学的アッセイによって、（ｉｉ）クローン化されたａｒｇＪ遺伝子についての、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉのａｒｇＥおよびａｒｇＡ変異体を使用する相補試験によって区別され得る。単機能性のＡｒｇＪ酵素は、Ｎ-アセチル Ｌ-オルニチンからＬ-グルタミンにアセチル基のみを転移し、そしてａｒｇＥ変異体のみを相補するのに対して、二機能性のＡｒｇＪ酵素は、Ｎ-アセチル Ｌ-オルニチンおよびアセチル-ＣｏＡの両方からアセチル基を転移し、そしてａｒｇＥおよびａｒｇＡの両方の変異体株を相補する。
両方の生合成経路は、特異的な転写リプレッサーによっておよびＬ-アルギニンまたは中間体産物による酵素学的工程の阻害によって、それぞれ、遺伝子調節および酵素学的調節に供される（Ｍａａｓ、１９９４；Ｇｌａｎｓｄｏｒｆｆ、１９９６）。さらに、Ｌ-グルタミン酸前駆体形成を先行する初期の代謝工程、およびＬ-アルギニン分解を伴う後の分解工程は、調節性の機構の制御下にある。従って、Ｌ-アルギニンの合成およびこのアミノ酸の産生量は、所与の微生物のゲノムにおける種々の標的での変異の導入によって、または所与の微生物の培養条件を影響することによって、または所与の微生物の膜透過性を影響することによって、調整され得る。
【０００９】
発酵による従来のＬ-アルギニン産生は、Ｌ-アルギニンを産生する微生物株、特にコリネ型細菌の代表物を使用して；２-チオアゾアラニン、α-アミノ-β-ヒドロキシ吉草酸、アルギニンヒドロキサメート、システインアナログ、スルホンアミド誘導体などを含むある代謝阻害物質に耐性のコリネ型細菌を使用して；Ｌ-プロリン、Ｌ-ヒスチジン、Ｌ-スレオニン、Ｌ-イソロイシン、Ｌ-メチオニン、またはＬ-トリプトファンを含むいくつかのアミノ酸についての栄養素要求性を示すコリネ型細菌を使用して、ならびに上述の耐性およびアミノ酸についての栄養素要求性の両方を示すコリネ型細菌を使用して行われている。これに関して、参照が以下の特許に対してなされ得る：ＦＲ ２ ０８４ ０５９、２ １１９ ７５５、２ ４９０ ６７４、２ ３４１ ６４８、２ ２２５ ５１９、ＥＰ ０ ３７９９０３ Ｂ１、ＥＰ ０ ３７８ ２２３ Ｂ１、ＥＰ ０ ３３６３８７ Ｂ１。
【００１０】
他方、、アルギニン生合成について十分に知られた遺伝子を含有する組換えＤＮＡによって形質転換されたＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物を使用することによって、律速反応の酵素活性を増強することによるＬ-アルギニンを産生するための方法が開示されている。野生型株、または転写リプレッサーについての変異体、または関連の抵抗性もしくは栄養素要求性を保有する変異体が、発酵のための組換え宿主細胞として使用されてきた。
【００１１】
Ｌ-アルギニンを産生するために使用される、大部分の組換え微生物は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する。これに関して、参照が、以下の特許に対してなされる：ＦＲ ２ １４３ ２３８；ＦＲ ２ ４８４ ４４８；ＥＰ ０ ２５９８５８ Ｂ１；ＥＰ ０２６１６２７ Ｂ１；ＥＰ ０ ３３２２３３ Ａ１；ＥＰ ０ ９９９２６７ Ａ１；ＥＰ １０１６７１０ Ａ２。
【００１２】
しかし、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２株は、完全に配列決定されたゲノム（Ｂｌａｔｔｎｅｒら、１９９７）、および種々の遺伝子アプローチの適用可能性、およびこの株またはその誘導体において操作するためのより有利なベクターを伴い、Ｌ-アルギニンを含むアミノ酸の産生について同様に魅力的な宿主である。組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株によるＬ-アルギニンの増加された産生は、プラスミドベクター上にクローン化されたａｒｇＡ遺伝子を使用し、続いてＥ.ｃｏｌｉについて記載される方法（ＥｃｋｈａｒｄおよびＬｅｉｓｉｎｇｅｒ、１９７５；Ｒａｊａｇｏｐａｌら、１９９８）によってフィードバック阻害耐性変異体を単離することによって達成され得る。これに関して、参照が、ＥＰ １ ０１６ ７１０ Ａ２に対してなされ得る。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、効率の良いＬ−アルギニンを賛成する能力を有する微生物を提供し、効率の良いＬ−アルギニンの製造法を提供することを課題とする。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、次に列挙される。
（請求項１）Ｌ-アルギニンを産生する能力を有する微生物であって、該微生物は生合成の直線経路または環状経路を介してＬ-アルギニンを合成する微生物であり、およびオルニチンアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子を含有する組換えＤＮＡを保有する、微生物。
（請求項２）Ｌ-アルギニンを産生する能力を有する微生物であって、該微生物は生合成の直線経路を介してＬ-アルギニンを合成する微生物であり、およびオルニチンアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子を含有する組換えＤＮＡを保有する、微生物。
（請求項３）請求項１または２に記載の微生物であって、ここで遺伝子が、ａｒｇＪである、微生物。
（請求項４）請求項１または２に記載の微生物であって、ここで遺伝子が、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ活性およびアセチルグルタミン酸合成酵素活性の両方を有する二機能性の酵素をコードする、微生物。
（請求項５）請求項１〜４に記載の微生物であって、ここで酵素がＬ-アルギニンによる阻害を欠く、微生物。
（請求項６）Ｌ-アルギニンを産生する能力を有する微生物であって、該微生物は生合成の直線経路または環状経路を介してＬ-アルギニンを合成する微生物であり、およびオルニチンアセチルトランスフェラーゼ活性およびアセチルグルタミン酸合成酵素活性を有する二機能性の酵素をコードする遺伝子ａｒｇＪを含有する組換えＤＮＡを保有する、微生物。
（請求項７）請求項１に記載の微生物であって、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ属に属する、微生物。
（請求項８）請求項１に記載の微生物であって、ここで遺伝子が、好熱性微生物に由来する、微生物。
（請求項９）請求項１〜８のいずれかに記載の微生物であって、ここで遺伝子が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ種またはＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ種に属する好熱性微生物に由来する、微生物。
（請求項１０）請求項１〜９のいずれかに記載の微生物であって、Ｎ-アセチルグルタミン酸合成酵素をコードするａｒｇＡ遺伝子を含有する組換えＤＮＡをさらに保有する、微生物。
（請求項１１）請求項１〜１０のいずれかに記載の微生物であって、ここで組換えＤＮＡが低いまたは中程度のコピー数で存在するプラスミドＤＮＡである、微生物。
（請求項１２）Ｌ-アルギニンを産生するための方法であって、培養培地中で、請求項１〜１１のいずれかにおいて規定されるような微生物を培養して、培地中でＬ-アルギニンを産生および蓄積する工程、ならびに培地からＬ-アルギニンを回収する工程、を包含する、方法。
【００１５】
組換え微生物によるＬ-アルギニン産生が、野生型ａｒｇＡ遺伝子またはそのフィードバック阻害耐性変異体によって、Ｎ-アセチルグルタミン酸合成酵素活性をコードする遺伝子のコピー数を増強することによって、改善されてきた。 しかし、変異体ａｒｇＡ遺伝子の適用は、組換え株によるＬ-アルギニンの生産性をさらに増加するためには限界を有する。
【００１６】
Ｌ-アルギニン産生能を有する微生物を用いてＬ-アルギニンを産生することが可能であることが今や見出され、当該微生物は、Ｌ-アルギニンを合成する微生物であり、およびオルニチンアセチルトランスフェラーゼ活性を有する酵素をコードする遺伝子（以下、「ａｒｇＪ遺伝子」ということがある。）を含む組換えＤＮＡを保有する。
【００１７】
本発明は、L-アルギニンを産生する能力を有する微生物を提供し、これはオルニチンアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子（ａｒｇＪ遺伝子）を含む組換えＤＮＡを保有する。
【００１８】
本発明はまた、上記の微生物を提供し、ここでａｒｇＪ遺伝子は単機能性の酵素または好ましくは二機能性の酵素をコードする。
好ましくは、ａｒｇＪ遺伝子は、単機能性または二機能性の酵素をコードし、Ｌ-アルギニンの阻害がない。
より好ましくは、ａｒｇＪ遺伝子は好熱性微生物に由来する。
【００１９】
本発明はまた、Ｌ-アルギニンを産生するための方法に関し、培地中で上記の微生物を培養して、Ｌ-アルギニンを産生および蓄積し、そしてＬ-アルギニンを培地から回収する工程を包含する。
【００２０】
本明細書中で使用される用語「Ｌ-アルギニンを産生する能力」は、本発明の微生物が、培養培地中にＬ-アルギニンを、これが当該培地中で培養される場合に、蓄積する能力を意味する。
【００２１】
【発明の実施の形態】
本発明の微生物は、Ｌ-アルギニンを産生する能力を有する微生物であり、ここで当該能力は、組換えＤＮＡ技術によってそこに導入された、オルニチンアセチルトランスフェラーゼをコードするａｒｇＪ遺伝子によって提供される。
【００２２】
好ましくは、本発明において有用なａｒｇＪ遺伝子は、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ活性を伴う酵素、またはオルニチンアセチルトランスフェラーゼおよびＮ-アセチルグルタミン酸合成酵素の活性を伴う酵素をコードする遺伝子であり、単機能性または二機能性酵素の当該活性は、Ｌ-アルギニンによる阻害を欠く。
【００２３】
ａｒｇＪ遺伝子は、例えばＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ Ｊａｎｎａｓｓｃｈｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、またはＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａのような好熱性微生物に由来するのが有利である。 当該遺伝子の配列は、本明細書中に参考として援用される以下の論文において開示される：
-Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ＪａｎｎａｓｃｈｉｉのａｒｇＪ：Ｂｕｌｔら、１９９６；
-Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＩＢ８２２４のａｒｇＪ：Ｓａｋａｎｙａｎら、１９９３；
-Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａのａｒｇＪ：Ｄｉｍｏｖａら、２０００。
【００２４】
適切なａｒｇＪ遺伝子の例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＮＣＩＢ８２２４、ＡＴＣＣ１２９８０、ＡＴＣＣ７９５３、ＡＴＣＣ１０１４９、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ ＤＳＭ５０６８、ＡＴＣＣ４９０４９、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ Ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ ＤＳＭ２６６１に由来する遺伝子である。
【００２５】
好ましいａｒｇＪ遺伝子は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、またはＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａに由来する遺伝子である。
【００２６】
Ｌ-アルギニンを産生する微生物は、生合成の直線経路または環状経路のいずれかを介してＬ-アルギニンを合成し得、および遺伝子操作によってそこに導入されるクローン化されたａｒｇＪ遺伝子を保有する、任意の微生物である。
【００２７】
当該微生物は、例えば、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属もしくはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する細菌のようなコリネ型細菌、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する細菌から選択され得る。
【００２８】
好ましくは、当該微生物は、直線生合成経路を介してアルギニンを合成する微生物、およびより好ましくはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物である。
【００２９】
本発明について適切なＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属の細菌の例は、以下のように列挙される：
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２株およびその派生体、特にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｐ４ＸＢ２（Ｈｆｒ、ｍｅｔＢ、ｒｅｌＡ、ａｒｇＲ）（Ｓａｋａｎｙａｎら、１９９６）。当該株のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｐ4ＸＢ２は、番号Ｉ ２５７１の下、２０００年１０月９日にパスツール研究所の「Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｄｅ Ｍｉｃｔｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ」（ＣＮＣＭ）に寄託された。
【００３０】
好ましくは、宿主株は、微生物におけるＬ-アルギニン生合成経路のネガティブな制御に関与する転写抑制を欠く（ａｒｇＲ-）。
【００３１】
ａｒｇＪ遺伝子は、適切なプライマーを利用するＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応、Ｗｈｉｔｅ Ｔ．Ｊ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．、５、１８５（１９８９）を参照のこと）によって増幅され、そしてその後当業者に周知の方法に従ってＤＮＡベクターとライゲーションされる。このような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）によって開示される。 ａｒｇＪのクローニングのために使用されるベクターは、低いもしくは中程度のまたは高いコピー数で、微生物において自己複製可能なプラスミドであり得；その特定の例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）において記載されるプラスミドｐＡＣＹＣ１８４である。ファージベクターはまた使用され得る。宿主細菌の染色体ＤＮＡ上へのａｒｇＪ遺伝子の取り込みはまた、任意のベクター系を使用しない相同組換えによって行われ得る。Ｌ-アルギニンを合成する異なる微生物において自己複製可能なシャトルベクターはまた、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ以外の宿主細胞へのａｒｇＪの取り込みのために使用され得る。
【００３２】
遺伝子を保有するＤＮＡフラグメントおよびＤＮＡベクターをライゲーションすることによって組換えＤＮＡ分子を調製するために、ベクターは、増幅される遺伝子の末端に対応する制限酵素によって消化される。ライゲーションは、一般に、Ｔ４ ＤＮＡ ポリヌクレオチドリガーゼのようなリガーゼを使用して行われる。
【００３３】
ＤＮＡベクターは、好ましくはプロモーターを含有する発現ベクターであり、プロモーターは、発現される遺伝子の上流のリボソーム結合部位が続き得る。このベクターはまた、複製起点および選択マーカーを含む。
【００３４】
プロモーターは、弱いもしくは中程度であるか、または強くあり得る。後者は、制御された作用に供され、そしてそれゆえ、制御された遺伝子発現を提供する。適切なプロモーターは、例えば、ｔｅｔまたはａｍｐプロモーターなどである。
【００３５】
選択マーカーは、テトラサイクリン、アンピシリン、クロラムフェニコールなどのような抗生物質に対する抵抗性を担う遺伝子である。
【００３６】
関連される微生物におけるａｒｇＪ遺伝子の発現のための適切な手段を含む組換えＤＮＡは、エレクトロポレーション、ＣａＣｌ２媒介性の形質転換などのような従来の方法によってその微生物に導入される。
【００３７】
本発明の実施態様の変形に従って、本発明の微生物は、Ｎ-アセチルグルタミン酸合成酵素をコードするａｒｇＡ遺伝子を含有する組換えＤＮＡ、および上述の方法に従って調製されるＤＮＡベクターをさらに保有し得る。ａｒｇＡ遺伝子は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなどから採取され得る。
【００３８】
さらに、ＤＮＡベクターは、スクラーゼ、レバナーゼ、レバンスクラーゼなどをコードする遺伝子、好ましくはレバナーゼをコードする遺伝子のような、グルコース以外の炭素の供給源の利用のための遺伝子をさらに含み得る。
【００３９】
Ｌ-アルギニンを産生するための本発明の方法は、本発明の微生物を、適切な培養培地中で培養して、培地中にアミノ酸を産生および蓄積する工程、ならびに培地からアミノ酸を回収する工程を包含する。
【００４０】
本発明の方法において、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物の培養、液体培地からのアミノ酸の回収および精製は、コリネ型細菌またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉまたはＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓを使用する発酵によってアミノ酸を産生するための従来の方法の様式に類似の様式において、行われ得る。培養のために使用される培地は、培地が炭素および窒素供給源および鉱物、ならびに必要であれば、適切な量において増殖するために使用される細菌が必要とする栄養素を含む限り、合成培地または天然の培地のいずれかであり得る。
【００４１】
炭素供給源は、グルコースおよびスクロースのような種々の炭水化物、ならびに種々の有機酸を含み得る。炭素供給源は好ましくはスクロースである。使用される細菌の同化作用能に依存して、エタノールおよびグリセロールを含むアルコールが使用され得る。窒素供給源として、アンモニア、硫酸アンモニウムのような種々のアンモニウム塩、アミンのような他の窒素化合物、ペプトンのような天然の窒素供給源、ダイズ水和物、および分解された発酵微生物が使用される。鉱物として、カリウム一リン酸、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸鉄、硫酸マグネシウム、炭酸カルシウムが使用される。
【００４２】
培養は好ましくは、振盪培養、エアレーション、および攪拌培養のような好気性の条件下で行われる。培養の温度は、通常２０〜４０℃、好ましくは２８〜３８℃である。培養のｐＨは、通常５と９との間、好ましくは６．５と７．２との間である。培養のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウム、種々の酸、種々の塩基、および緩衝液で調節され得る。通常、１〜３日間の培養は、培地中への所与のアミノ酸の蓄積を導き得る。
【００４３】
Ｌ-アルギニンを回収することは、例えば培養後の遠心分離または膜ろ過によって、培地から細胞のような固形物を除去し、次いでイオン交換によってＬ-アルギニンを回収および精製することによる従来の方法、濃縮、および結晶分画法などによって行われ得る。
【００４４】
本発明は、説明の目的のためのみに与えられる以下の実施例において今やより詳細に開示される。
【００４５】
【実施例】
以下実施例によって本発明を説明するが、本実施例は発明を限定するものではない。
【００４６】
実施例１：ａｒｇＪ遺伝子を保有するプラスミドの構築
中程度の好熱性細菌のＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｓａｋａｎｙａｎら、１９９３）および超好熱性細菌のＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ（Ｄｉｍｏｖａら、２０００）からクローン化された以下のａｒｇＪ遺伝子は、それぞれ、配列番号１および配列番号３のＤＮＡ配列を有し、これはそれぞれ、配列番号２および配列番号４のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。超好熱性古細菌のＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（Ｂｕｌｔら、１９９６）由来のａｒｇＪ配列は、配列番号５のＤＮＡ配列を有し、これは配列番号６のアミノ酸を有するタンパク質をコードする。これらの３つの微生物に由来する３つのａｒｇＪ遺伝子の５'および３'末端に対応するプライマーを合成した。ＧＧＡＧ Ｓｈｉｎｅ／Ｄａｌｇａｒｎｏ部位を含有するａｒｇＪ遺伝子の開始に対応するオリゴヌクレオチドは以下の配列を有する：
ＢＳ ５'-ＧＡＡＧＧＡＧＡＧＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＣＧＡＴＣＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＣＧＧ-３'（配列番号７）
ＴＮ ５'-ＧＡＡＧＧＡＧＡＧＴＡＴＡＣＣＡＴＧＴＴＣＧＴＴＣＣＧＡＧＧＧＧＡＴＴＣＡＧ-３'（配列番号８）
ＭＪ ５'-ＧＡＡＧＧＡＧＡＧＴＡＴＡＣＣＡＴＧＡＧＡＧＴＴＡＴＴＧＡＴＧＧＴＧＧＡＧ-３'（配列番号９）。
ＧＧＡＴＣＣ ＢａｍＨＩ部位を含有するａｒｇＪ遺伝子の末端に対応するオリゴヌクレオチド以下の配列を有する：
ＢＳ ５'-ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＧＴＣＣＧＡＴＡＧＣＴＧＧＣＧ-３'（配列番号１０）
ＴＮ ５'-ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＴＣＡＴＧＴＣＣＴＧＴＡＣＣＴＣＣＣＧ-３'（配列番号１１）
ＭＪ ５'-ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＧＴＴＧＴＡＴＡＴＴＣＡＧＣＧ-３'（配列番号１２）。
【００４７】
異なるＤＮＡ鋳型からのａｒｇＪ遺伝子の増幅は、ＤＮＡポリメラーゼＰｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いるＰＣＲによって行われた。使用された条件は以下のようであった：
最初の変性 ９５℃、５分間
変性 ９４℃、１分間
アニーリング ４７℃、１分間 ３０サイクル
伸長 ７２℃、２分間、
最後の伸長 ７２℃、７分間、４℃
【００４８】
ＰＣＲ産物は続いてリン酸化され、ＢａｍＨＩで消化され、そして酵素ＥｃｏＲＶで予め消化され、脱リン酸され、次いで第２の酵素ＢａｍＨＩで消化されたプラスミドベクターｐＡＣＹＣ１８４と混合される。Ｔ４ ＤＮＡリガーゼによるライゲーション後、組換えＤＮＡを、エレクトロポレ-ション（２５００Ｖ、２１μＦ、４００Ω、１０ｍｓｅｃ）によってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＸＳ１Ｄ２Ｒ株［Ｆ-△（ｐｐｃ-ａｒｇＥ）ｎａｌＡ ｒｐｏＢ λ- ｈｓｄＲ ｒｅｃＡ］にトランスファーした。組換えクローンを、０．２％のクエン酸を補充し、および抗生物質のクロラムフェニコール（２５μｇ/ｍｌ）を含有する、寒天（１．５％）で固化した、アルギニン非含有の最小培地Ｍ９（Ｍｉｌｌｅｒ、１９９２）上で選択した。３７℃での３日間のインキュベーション後、Ｃｍｒ ＡｒｇＥ＋コロニーを選択し、そして対応する好熱性微生物のａｒｇＪ遺伝子を保有する組換えプラスミドをこのようなクローンから単離した。得られたプラスミドＤＮＡを配列決定して、クローン化されたＤＮＡ配列を確認し、そしてａｒｇＪ遺伝子転写がｔｅｔ遺伝子プロモーターの制御下で配向されるプラスミドを選択した。それらの制限酵素マップは、図１において示される。得られたプラスミドは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ，Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、またはＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのａｒｇＪ遺伝子を含有し、それぞれ、ｐＪ-Ｂ、ｐＪ-Ｔ、およびｐＪ-Ｍと称した。
【００４９】
実施例２：組換えプラスミドの遺伝子解析
遺伝子解析および酵素学的解析の手段によって、２つのタイプのＡｒｇＪ酵素を認識することが可能である。オルニチンアセチルトランスフェラーゼ活性のみを保有する単機能性の酵素は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２のａｒｇＥ変異体を補足することが可能であるのに対して、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ活性およびアセチルグルタミン酸合成酵素活性の両方を示す二機能性の酵素は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２のａｒｇＥおよびａｒｇＡ変異体を相補することが可能である。
【００５０】
得られた３つのプラスミドを、実施例１において記載される条件を使用して、単一のａｒｇＡ変異を相補するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＸＡ４株に、ならびにａｒｇＡおよびａｒｇＥ変異を保有する二重変異体Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＸＡ４：ａｒｇＥ株に、エレクトロポレーションによってトランスファーした。組換えコロニーを、抗生物質クロラムフェニコール（２５μｇ/ｍｌ）を含有する、寒天（１．２％）で固化したＬＢリッチ培地上で選択した。各ディッシュからの５０個のコロニーをＮａＣｌ溶液（０．９％）に再懸濁し、次いでＬ-アルギニン（１５０μｇ／ｍｌ）は含有するかまたは含有しないが、クロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）は常に含有する、寒天（１．２％）で固化した最小培地Ｍ９を有するディッシュ上にレプリカした。３７℃で２日間のインキュベーション後、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２株ＸＡ４（ｐＪ-Ｂ）、ＸＡ４：：ａｒｇＥ（ｐＪ-Ｂ）、ＸＡ４（ｐＪ-Ｔ）、およびＸＡ４：：ａｒｇＥ（ｐＪ-Ｔ）の５０個の全てのコロニーは、記載される選択培地上で発育した。対照的に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２株ＸＡ４（ｐＪ-Ｍ）およびＸＡ４：：ａｒｇＥ（ｐＪ-Ｍ）のコロニーはアルギニン非含有培地上で増殖しなかったが、これらは明らかにＬ−アルギニンを補充した培地上で２日後に可視できた。これらの結果は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａのａｒｇＪ遺伝子は、二機能性の酵素をコードするのに対して、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｎｎａｓｃｈｉｉのａｒｇＪ遺伝子は、単機能性の酵素をコードすることを示す。
【００５１】
実施例３：酵素学的解析
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２株ＸＳ1Ｄ２（ｐＪ-Ｂ）、ＸＳ１Ｄ２（ｐＪ-Ｔ）、およびＸＳ１Ｄ２（ｐＪ-Ｍ）を、アルギニンを欠くが、クエン酸（０．２％）を補充し、およびクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）を含有する最小培地Ｍ９において、３７℃で２４時間培養した。次いで細胞をペレット化し、Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８）中で２回洗浄し、次いで超音波処理（１９ｋＨｚで１０秒間のパルスにつき１５分間）によって溶解した。酵素学的活性を、アセチル基供与体としてアセチルＣｏＡまたはＮ-アセチルオルニチンを使用して、３７℃または７０℃にて、以下の緩衝液：０．１Ｍ ＭＥＳ、０．１Ｍ ＰＩＰＥＳ、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ、０．１Ｍグリシン、０．１Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４中で測定し、そして、反応産物、すなわちＮ-アセチルグルタミン酸を、ＨＰＬＣによって定量した。サンプルを、移動相として１ｍｌ／分の流動速度を用い、０．１Ｍリン酸とメタノールとの混合液（９０：１０ 容量：容量）を使用して、ＨＰＬＣシステム（Ｋｏｎｔｒｏｎ）上のＬｕｎａ Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上で解析した。反応産物を２１５ｎｍで検出した。表１において与えられる結果は、３つの酵素が３７℃および７０℃にてオルニチンアセチルトランスフェラーゼ活性を保有することを示す。
【００５２】
【表１】
アセチルグルタミン酸合成酵素活性は、両方の温度にて、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａの酵素についてのみ検出された。これらの結果は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓおよびＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａからのＡｒｇＪ酵素は実際に二機能性であるが、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ Ｊａｎｎａｓｃｈｉｉからの酵素は単機能性の酵素であることを確認する。酵素学的活性の減少は、１０ｍＭ Ｌ-アルギニンの添加によって何ら検出されなかった。
【００５４】
実施例４：組換えＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｐ４ＸＢ２株によるＬ-アルギニン産生
プラスミドｐＪ-Ｂ、ｐＪ-Ｔ、およびｐＪ-Ｍを、実施例１において上記される条件下で、エレクトロポレ-ションによってＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｐ４ＸＢ２株にトランスファーした。対応するクローンを、寒天（１．２％）で固化され、およびクロラムフェニコール（２５μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢリッチ培地上で選択した。各組換え株の３つの独立したコロニーを、発酵の間に産生されるＬ−アルギニンの量を評価するために選択した。この目的のために、ディッシュから採取されたコロニーをクロラムフェニコールを含有するＬＢ培地中に再懸濁し、そして至適密度が６００ｎｍにて０．８に達するまで、３０℃で培養した。この前培養の１ｍｌを、以下の組成：２．８％の（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２％のＫ２ＨＰＯ４、０．５％の酵母抽出物、０．０５％のＭｇＳＯ４、０．００１％のＦｅＳＯ４、０．００１％のＭｎＳＯ４、１０μｇ／ｍｌのチアミン、１００μｇ／ｍｌのメチオニン、５％のグルコース、２．５％のＣａＣＯ３、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール；ｐＨ７．２を有する、１４ｍｌの発酵培地に添加した。発酵を、３０℃にて４０時間、３２０ｒｐｍの速さにて円形振盪器上の７５０ｍｌのコニカルフラスコにおいて行った。発酵後、サンプルを回収し、そしてＬ−アルギニンの量を、ペーパークロマトグラフィーによるか、または薄層クロマトグラフィーおよびアセトン中に溶解された０．５％のニンヒドリンでの展開によるか、または分光光度計によるか、またはアミノ酸解析器によるかのいずれかで、Ｌ−アルギニン検量目盛りに対して評価した。
これらの発酵の結果は、表２において示される。
【００５５】
【表２】
これらの結果は、全てのａｒｇＪを保有するプラスミドは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２宿主細胞においてＬ−アルギニンの収量を増加する能力を保有することを示した。明らかに、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉにおけるＬ−アルギニンの産生のレベルは、ｐＪ-Ｍプラスミドを含有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２株と比較されるように、プラスミドｐＪ-ＢまたはｐＪ-Ｔを含むそれらの株において非常により優れていた。このことは、二機能性のＡｒｇＪ酵素をコードする遺伝子の発現が、単機能性のＡｒｇＪ酵素をコードする遺伝子と比較して、Ｌ−アルギニンのより優れた産生量を確実にすることを実証する。
【００５７】
実施例５：２つのプラスミドを保有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２株におけるＬ−アルギニンの合成
プラスミドｐＡＲＧ２Ｓは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２においてＬ−アルギニンを産生することを可能にする。このプラスミドは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２からのａｒｇＡ遺伝子およびＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ １６８からのレバナーゼ遺伝子（ｓａｃＣ）をｐＢＲ３２７-ｋａｎベクター上に保有する。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ Ｋ１２からの野生型ａｒｇＡ遺伝子を、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２のａｒｇＡ変異体（Ｎｅｒｓｉｓｙａｎら、１９８６）の相補によってクローン化した。Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ １６８からのｓａｃＣ遺伝子を、唯一の炭素供給源としてスクロースを含有する最小培地Ｍ９を使用することによって、ｐＱＢ７９,１コスミドバンク（Ｆｏｕｅｔら、１９８２）において選択した。６．７ｋｂ ＥｃｏＲＩ-ＨｉｎｄＩＩＩ ＤＮＡ内に同定されるｓａｃＣ遺伝子を、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって消化されたプラスミドｐＢＲ３２７-ｋａｎに挿入した。次いで、得られたプラスミドをＢａｍＨＩおよびＳａｌＩにより消化したものの中に、ａｒｇＡを保有する１．５ｋｂのＢａｍＨＩ-ＳａｌＩ ＤＮＡフラグメントを挿入し、ｐＡＲＧＳ２プラスミドを保有する組換えクローンを選択した。ｐＡＲＧＳ２プラスミドは、Ｌ−アルギニンを含有するかまたは含有しない、唯一の炭素供給源としてスクロースを含有する、選択培地Ｍ９上でのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ ａｒｇＡ変異体細胞の増殖を確実にする。
【００５８】
プラスミドｐＪ-Ｂ、ｐＪ-Ｔ、およびｐＪ-Ｍを、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｐ４ＸＢ２（ｐＡＲＧＳ２）株にトランスファーし、そして組換えクローンを２つの抗生物質のクロラムフェニコール（２５μｇ/ｍｌ）およびカナマイシン（４０μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ培地上で選択した。各形質転換された株および元来の株のそれぞれ３つのコロニーを、実施例４において使用された条件下で、Ｌ-アルギニン産生について試験した。ただし、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｐ４ＸＢ２（ｐＡＲＧＳ２）についての培地はカナマイシン（４０μｇ／ｍｌ）のみを含み、あるいは形質転換されたクローンについての培地は記載される組成物に加えてカナマイシンを含む。
発酵の結果は、表３において与えられる。
【００５９】
【表３】
これらの結果は、同じＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ宿主株において、ｐＡＲＧＳ２プラスミドと、ａｒｇＪ遺伝子を保有する３つのプラスミドのうちのいずれかとの同時の存在は、Ｌ-アルギニンのより高い産生を提供することを実証する。しかし、Ｌ-アルギニン収量は、ｐＡＲＧＳ２およびｐＪ-Ｍプラスミドを保有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｐ４ＸＢ２株におけるよりも、ｐＡＲＧＳ２およびｐＪ-ＢまたはｐＪ-Ｔプラスミドを保有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２ Ｐ４ＸＢ２株において優れる。これらの結果は、同じ株におけるａｒｇＡ遺伝子（ｐＡＲＧＳ２プラスミド）と、二機能性の酵素オルニチンアセチルトランスフェラーゼをコードするａｒｇＪ遺伝子（ｐＪ-ＢまたはｐＪ-Ｔプラスミド）との共存は、単機能性の酵素をコードするａｒｇＪ遺伝子（ｐＪ-Ｍプラスミド）との共存よりもＬ-アルギニンの優れた収量を保証することを示す。
【００６１】
実施例６：スクロースを含有する発酵培地におけるＬ-アルギニンの産生
プラスミドｐＡＲＧＳ２は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２細胞が炭素供給源としてスクロースを消費することを可能にする。野生型Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２株およびその派生体は天然で、グルコースをスクロースで置き換えられた最小培地において発育し得ない。
グルコースがスクロース（６％）に置き換えられ、および培養が４４時間に延長された以外は上記の条件下で、実施例５において記載される株を使用して、Ｌ-アルギニンの産生のために発酵を行った。結果は表４において与えられる。
【００６２】
【表４】
これらの結果はまた、二機能性のＡｒｇＪ酵素は、単機能性の酵素と比較して、グルコースがスクロースによって置き換えられる培地中での発酵の間、ａｒｇＡおよびスクロース消費遺伝子ｓａｃＣを有する第２のプラスミドｐＡＲＧＳ２を保有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２株において、より高い収量のＬ？アルギニンを提供することを示す。
【００６４】
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【００６５】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４；ｐＪ-Ｂ；ｐＪ-Ｔ、およびｐＪ-Ｍの制限酵素マップである。
Claims (5)
- Ｌ - アルギニンを産生する能力を有し、アルギニンリプレッサー遺伝子が欠損し、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ活性およびアセチルグルタミン酸合成酵素活性の両方を有する二機能性の酵素をコードする遺伝子を含有する組換えＤＮＡとＬ - アルギニンによる阻害を欠くＮ - アセチルグルタミン酸合成酵素をコードするａｒｇＡ遺伝子を含有する組換えＤＮＡを保有する、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ微生物を培養培地中で培養して、培地中でＬ - アルギニンを産生および蓄積する工程、ならびに培地からＬ - アルギニンを回収する工程、を包含する、Ｌ - アルギニンを産生するための方法。
- 二機能性の酵素をコードする遺伝子が、ａｒｇＪである請求項１記載の方法。
- 遺伝子が、好熱性微生物に由来する請求項２記載の方法。
- 遺伝子が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ種またはＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ種に属する好熱性微生物に由来する請求項３記載の方法。
- 組換えＤＮＡがプラスミドＤＮＡである、請求項１〜４記載の方法。
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