CN101774935B - 利用模拟移动床分离提纯l-鸟氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物制药领域，公开了利用模拟移动床分离提纯L-鸟氨酸的方法。该方法是将L-鸟氨酸发酵液首先利用超滤法去除菌体及固形物；再将料液进入模拟移动床系统吸附、洗杂、洗脱L-鸟氨酸、收集洗脱液及柱子再生；收集的洗脱液经浓缩、脱色、盐酸调节pH4.5-5.0、结晶、干燥得到L-鸟氨酸盐酸盐晶体。采用本方法分离提纯的L-鸟氨酸得率高，纯度高，成本低，环保，适于工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于生物制药领域，涉及一种利用模拟移动床从发酵液中分离提纯L-鸟氨酸的方法。
背景技术
L-鸟氨酸是一种重要的非蛋白质组成氨基酸，也是生物合成L-精氨酸的前体。L-鸟氨酸在人体内起着非同寻常的作用，尿素的形成必须有L-鸟氨酸的参与，L-鸟氨酸的缺乏可能会给生命带来危险。现今L-鸟氨酸在医药和食品工业中应用广泛，主要用于急慢性肝炎、肝性脑病等疾病的治疗(GB1020492，1966)、病人机体的恢复、运动饮料、防治良性的囊肿和恶性肿瘤(CA2404275，2001)等方面。
目前，国内外对L-鸟氨酸制备方法的报道主要有化学法、酶转化法、微生物发酵法。化学法主要是碱水解L-精氨酸和丙烯酸跟氰化钠合成DL-鸟氨酸，另外化学法需要大量有机溶剂，对环境污染严重；酶转化法以L-精氨酸为原料，发酵培养细胞菌体，利用所产生的酶催化转化为L-鸟氨酸；微生物发酵法生产L-鸟氨酸，主要使用价格低廉的原料，进行液体深层发酵，直接产生L-鸟氨酸，现在发酵水平相对较国外而且低，但随着菌种和工艺技术研究的深入，其发酵产量也将不断的提高。
上述方法获得的L-鸟氨酸发酵液中杂质多，分离提纯困难。一些文献报道了利用传统的离子交换技术分离发酵液中的L-鸟氨酸，这种方法分离提纯的L-鸟氨酸收率低，水和洗脱剂消耗大，树脂再生需要消耗大量的酸碱，使整个分离提纯成本较高。因此需要开发高效的分离提纯工艺，以实现L-鸟氨酸的工业化生产。
发明内容
本发明的目的在于提供一种超滤膜与模拟移动床相结合的分离提纯L-鸟氨酸的方法。
本发明的目的可以通过下列技术措施来达到：
利用模拟移动床从发酵液中分离提纯L-鸟氨酸的方法，该方法包括以下步骤：
a.L-鸟氨酸发酵液首先利用超滤法去除菌体及固形物，得进料液；
b.步骤a得到的进料液进入模拟移动床系统吸附、洗杂、洗脱L-鸟氨酸、收集洗脱液及柱子再生；
c.步骤b收集的洗脱液经浓缩、脱色、盐酸调节pH4.5-5.0、结晶、干燥得到L-鸟氨酸盐酸盐晶体。
步骤c洗脱液经浓缩后的蒸馏水还可用于步骤b操作的洗杂工序。
所述的利用模拟移动床从发酵液中分离提纯L-鸟氨酸的方法，其中超滤膜采用截流分子量为1万-15万道尔顿的陶瓷膜，超滤系统操作压力为0.3-0.4MPa，操作温度为50-70℃；陶瓷膜优选二氧化钛陶瓷膜。
所述的利用模拟移动床从发酵液中分离提纯L-鸟氨酸的方法，其中模拟移动床系统由7-20根离子交换柱串联组成，模拟移动床系统分为吸附区、洗杂区、洗脱区和再生清洗区四个区；吸附区有3～8柱，洗杂区有1～3柱，洗脱区有2～6柱，再生清洗区有1～3柱；进料液入口与萃余液出口位于吸附区，洗杂剂入口与洗杂液出口位于洗杂区，洗脱剂入口与萃取液(即洗脱液，下同)出口位于洗脱区，再生剂入口与出口位于再生区；将进料液入口、洗脱剂入口、萃取液出口及萃余液出口沿着料液流动方向分别进行周期性切换，收集洗脱液；
周期性切换是指通过调节进料液、洗杂剂、洗脱剂、再生剂的流量，使得各区的第一根柱子处理完全后，同时切换进入下一区，成为下一区的最后一根柱子，执行下一区流程。
所述的利用模拟移动床从发酵液中分离提纯L-鸟氨酸的方法，其中离子交换柱填料为苯乙烯系强酸性阳离子交换树脂JK006；每根柱子的填料量1000～1500mL。
所述的利用模拟移动床从发酵液中分离提纯L-鸟氨酸的方法，其中进入模拟移动床系统的进料液中L-鸟氨酸浓度为20-30g/L，pH为1.5-2.5；洗脱剂为pH10-14的氨水溶液，洗杂剂和再生剂均为中性去离子水；以柱子直径为70mm计，进料液流量20-30mL/min，洗脱剂流量10-20mL/min，洗杂剂流量为50-60mL/min，再生剂流量为70-80mL/min，切换时间为2-4h。
所述的利用模拟移动床从发酵液中分离提纯L-鸟氨酸的方法，其中模拟移动床系统工作温度15-40℃。
本发明方法中所用的L-鸟氨酸发酵液优选采用谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)ATCC 13232液体深层发酵得到的L-鸟氨酸发酵液，或者粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1786酶转化L-精氨酸发酵得到的L-鸟氨酸发酵液，或者固定化粪链球菌(fecal streptococcus)ATCC8043、粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)ATCC21400、格氏沙雷氏菌(Serratia grimesii)等细胞酶法转化L-精氨酸发酵得到的L-鸟氨酸发酵液。
本发明提及的细菌均为现有技术公开。采用细菌发酵制备得到的L-鸟氨酸发酵液均可采用本发明所述的分离提纯方法。
模拟移动床系统通常包括恒流泵、带夹套离子交换柱、控制阀、pH计、温度计。
L-鸟氨酸的溶解度太大，因此让其成盐酸盐的形式进行结晶。采用盐酸进行pH调节的同时也与L-鸟氨酸形成盐酸盐。
离子交换柱高径比可以是3～5∶1(为方便操作过程中的参数控制，实际操作时可限定为同一高径比)；
“各区第一根柱子处理完全”是指吸附区第一根柱子吸附饱和，洗杂区第一根柱子杂质完全洗掉；洗脱区第一根柱子L-鸟氨酸完全被洗脱；再生区第一根柱子离子交换树脂完全被再生，能满足下一轮吸附。
“各区第一根柱子”是指各区液体入口处的柱子。
“周期性切换”的时机是预先采用各区单柱实验确定切换时间，即在模拟移动床的其他实验条件确定后(如树脂类型、装填量、高径比、系统温度等一致，各区液体的类型、pH、各区柱子数量等明确)，在相同时间内，调节各区流速，使得各区第一根柱子处理完全，进行切换。
在交待了柱子的填料体积，控制流量方便操作。也可以换算成流速，如所用柱子的直径是70mm，截面积就是38.48cm2，即10mL/min转换为流速是0.2599cm/min，其他流速可以分别计算。
本发明的有益效果：
1、经超滤法处理的L-鸟氨酸发酵液几乎没有固形物，通过萃余液回收利用，确保在模拟移动床系统中树脂高吸附效率。
2、利用模拟移动床系统分离L-鸟氨酸，实现了分离过程自动化和连续化，提取收率及产品纯度显著提高。
3、树脂的利用率高，洗脱剂的消耗少，省去了树脂再生的酸碱消耗，提取成本降低。
4、减少了离子交换工艺的酸碱废液排放，步骤c获得的洗脱液经浓缩后的蒸馏水还可用于b操作的洗杂工序，节约成本，改善生产环境，实现了廉价、清洁生产，大大提高收率。
5、本方法克服用了传统方法处理L-鸟氨酸发酵液过程中周期长、消耗大、成本高等缺点，为实现发酵法生产L-鸟氨酸的工业化奠定基础。
附图说明
图1是本发明采用的14柱模拟移动床系统操作示意图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
一般说明：
实施例中采用的L-鸟氨酸发酵液可通过下列方法制备得到：
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13232液体深层发酵制备L-鸟氨酸。
种子培养基：葡萄糖25g，酵母膏l0g，(NH4)2SO4 15g，MgSO4·7H2O 2.5g，KH2PO41g，K2HPO4·3H2O 0.5g，NaH2PO4·2H2O 0.5g，CaCO3 10g，加水至1000mL，pH7.0-7.2，0.1Mpa灭菌10min。
发酵培养基：葡萄糖60g，酵母膏30g，(NH4)2SO4 50g，MgSO4·7H2O 2.50g，KH2PO41g，K2HPO4·3H2O 0.5g，Na2HPO4·2H2O 0.50g，CaCO3 10g，FeSO4·7H2O 36.6mg/L，MnSO4·H2O 22.38mg/L，ZnSO4·7H2O 17.8mg/L，Biotin 0.05mg/L，VB1 0.05mg/L，加水至1000mL，pH7.0-7.2，0.1Mpa灭菌10min。
种子培养：培养基初始pH 7.0；装液量为容器体积的10％；转速为200r/min；培养温度为28℃，培养时间10h。
发酵培养：发酵培养基初始pH 7.2；装液量为发酵罐体积的16％；接种量为发酵培养基体积的5％；转速为200r/min；发酵温度为30℃，发酵周期为72h，收集发酵液用于分离提纯L-鸟氨酸。
可用于发酵制备L-鸟氨酸发酵液的细菌及发酵方法在现有技术中均有记载，利用这些细菌如粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1786、粪链球菌(fecalstreptococcus)ATCC8043、粪产碱杆菌(Alcaligenes faecalis)ATCC21400、解蛋白弧菌(Vibrio proteolyticus)、中间气单胞菌(Aeromonas mdeia)、栖息微球菌(Micrococcussedentarius)、格氏沙雷氏菌(Serratia grimesii)等发酵制备得到的L-鸟氨酸发酵液同样也可以采用本发明方法分离提纯L-鸟氨酸。
实施例1
上述L-鸟氨酸发酵液首先利用超滤法(15万道尔顿的二氧化钛陶瓷膜超滤，超滤操作压力为0.38MPa，操作温度为55℃)去除菌体及固形物，得超滤液(即进料液，下同)；
结合图1，模拟移动床系统依次分为吸附区、洗杂区、洗脱区和再生清洗区四个区；进料液入口与萃余液出口位于吸附区，洗杂剂入口与洗杂液出口位于洗杂区，洗脱剂入口与萃取液(即洗脱液，下同)出口位于洗脱区，再生剂入口与出口位于再生区；模拟移动床系统采用14柱，其中吸附区有6柱，洗杂区有2柱，洗脱区有4柱，再生清洗区有2柱。离子交换柱填料为苯乙烯系强酸性阳离子交换树脂JK006，填料量1200mL，柱子的直径70mm，高径比5∶1。模拟移动床系统工作温度20℃。将进料液入口、洗脱剂入口、萃取液出口及萃余液出口沿着料液流动方向分别进行周期性切换，收集洗脱液。周期性切换是指通过调节进料液、洗杂剂、洗脱剂、再生剂的流量，使得各区的第一根柱子处理完全后，切换进入下一区，成为下一区的最后一根柱子，执行下一区流程。
取80L进料液(其中L-鸟氨酸的浓度为25.1g/L，pH控制在2.0)以25mL/min的流量从进料液入口进入模拟移动床系统；洗脱剂为0.5mol/L的氨水溶液，洗脱剂流量15mL/min；洗杂剂和再生剂均为中性去离子水，洗杂剂流量为50mL/min，再生剂流量为72mL/min，每2.9小时将进料液入口、洗脱剂入口、萃取液出口及萃余液出口沿着料液流动方向分别进行周期性切换(在此流速下，各区第一根柱子在此时间均能够处理完全)。
进料液经吸附、洗杂、洗脱、收集萃取液，柱子再生；
萃取液(洗脱液)经浓缩、脱色、盐酸调节pH4.5、结晶、干燥得到L-鸟氨酸盐酸盐晶体2.24千克，纯度为98.8％，收率为86.4％。洗脱液经浓缩后的蒸馏水还可用于洗杂工序。
实施例2：
上述L-鸟氨酸发酵液首先利用超滤法(15万道尔顿的二氧化钛陶瓷膜超滤，超滤操作压力为0.38MPa，操作温度为58℃)去除菌体及固形物，得超滤液(即进料液)；
结合图1，模拟移动床系统依次分为吸附区、洗杂区、洗脱区和再生清洗区四个区；进料液入口与萃余液出口位于吸附区，洗杂剂入口与洗杂液出口位于洗杂区，洗脱剂入口与萃取液出口位于洗脱区，再生剂入口与出口位于再生区；模拟移动床系统采用14柱，其中吸附区有6柱，洗杂区有2柱，洗脱区有4柱，再生清洗区有2柱。离子交换柱填料为苯乙烯系强酸性阳离子交换树脂JK006，填料量1200mL，柱子的直径70mm，高径比5∶1。模拟移动床系统工作温度25℃。将进料液入口、洗脱剂入口、萃取液出口及萃余液出口沿着料液流动方向分别进行周期性切换，收集洗脱液。周期性切换是指通过调节进料液、洗杂剂、洗脱剂、再生剂的流量，使得各区的第一根柱子处理完全后，切换进入下一区，成为下一区的最后一根柱子，执行下一区流程。
取80L进料液(其中L-鸟氨酸的浓度为23.5g/L，pH控制在2.0)以20mL/min的流量从进料液入口进入模拟移动床系统；洗脱剂为0.5mol/L的氨水溶液，洗脱剂流量12mL/min；洗杂剂和再生剂均为中性去离子水，洗杂剂流量为50mL/min，再生剂流量为75mL/min，每3.5小时将进料液入口、洗脱剂入口、萃取液出口及萃余液出口沿着料液流动方向分别进行周期性切换(在此流速下，各区第一根柱子在此时间均能够处理完全)。
进料液经吸附、洗杂、洗脱、收集萃取液(洗脱液)；
萃取液(洗脱液)经浓缩、脱色、盐酸调节pH4.5、结晶、干燥得到L-鸟氨酸盐酸盐晶体2.13千克，纯度为99.2％，收率为88.1％。洗脱液经浓缩后的蒸馏水还可用于洗杂工序。
实施例3：
上述L-鸟氨酸发酵液首先利用超滤法(5万道尔顿的二氧化钛陶瓷膜超滤，超滤操作压力为0.35MPa，操作温度为60℃)去除菌体及固形物，得超滤液(即进料液)；
结合图1，模拟移动床系统依次分为吸附区、洗杂区、洗脱区和再生清洗区四个区；进料液入口与萃余液出口位于吸附区，洗杂剂入口与洗杂液出口位于洗杂区，洗脱剂入口与萃取液出口位于洗脱区，再生剂入口与出口位于再生区；模拟移动床系统采用14柱，其中吸附区有6柱，洗杂区有2柱，洗脱区有4柱，再生清洗区有2柱。离子交换柱填料为苯乙烯系强酸性阳离子交换树脂JK006，填料量1200mL，柱子的直径70mm，高径比5∶1。模拟移动床系统工作温度25℃。将进料液入口、洗脱剂入口、萃取液出口及萃余液出口沿着料液流动方向分别进行周期性切换，收集洗脱液。周期性切换是指通过调节进料液、洗杂剂、洗脱剂、再生剂的流量，使得各区的第一根柱子处理完全后，切换进入下一区，成为下一区的最后一根柱子，执行下一区流程。
取80L进料液(其中L-鸟氨酸的浓度为27.6g/L，pH控制在2.5)以25mL/min的流量从进料液入口进入模拟移动床系统；洗脱剂为0.8mol/L的氨水溶液，洗脱剂流量12mL/min；洗杂剂和再生剂均为中性去离子水，洗杂剂流量为50mL/min，再生剂流量为72mL/min，每3.2小时将进料液入口、洗脱剂入口、萃取液出口及萃余液出口沿着料液流动方向分别进行周期性切换(在此流速下，各区第一根柱子在此时间均能够处理完全)。
进料液经吸附、洗杂、洗脱、收集萃取液(洗脱液)；
萃取液(洗脱液)经浓缩、脱色、盐酸调节pH4.5、结晶、干燥得到L-鸟氨酸盐酸盐晶体2.54千克，纯度为98.5％，收率为88.8％。洗脱液经浓缩后的蒸馏水还可用于洗杂工序。
实施例4：
上述L-鸟氨酸发酵液首先利用超滤法(5万道尔顿的二氧化钛陶瓷膜超滤，超滤操作压力为0.36MPa，操作温度为60℃)去除菌体及固形物，得超滤液(即进料液)；
结合图1，模拟移动床系统依次分为吸附区、洗杂区、洗脱区和再生清洗区四个区；进料液入口与萃余液出口位于吸附区，洗杂剂入口与洗杂液出口位于洗杂区，洗脱剂入口与萃取液出口位于洗脱区，再生剂入口与出口位于再生区；模拟移动床系统采用14柱，其中吸附区有6柱，洗杂区有2柱，洗脱区有4柱，再生清洗区有2柱。离子交换柱填料为苯乙烯系强酸性阳离子交换树脂JK006，填料量1200mL，柱子的直径70mm，高径比5∶1。模拟移动床系统工作温度25℃。将进料液入口、洗脱剂入口、萃取液出口及萃余液出口沿着料液流动方向分别进行周期性切换，收集洗脱液。周期性切换是指通过调节进料液、洗杂剂、洗脱剂、再生剂的流量，使得各区的第一根柱子处理完全后，切换进入下一区，成为下一区的最后一根柱子，执行下一区流程。
取80L进料液(其中L-鸟氨酸的浓度为25.5g/L，pH控制在2.5)以20mL/min的流量从进料液入口进入模拟移动床系统；洗脱剂为0.9mol/L的氨水溶液，洗脱剂流量12mL/min；洗杂剂和再生剂均为中性去离子水，洗杂剂流量为50mL/min，再生剂流量为75mL/min，每3.5小时将进料液入口、洗脱剂入口、萃取液出口及萃余液出口沿着料液流动方向分别进行周期性切换(在此流速下，各区第一根柱子在此时间均能够处理完全)。
进料液经吸附、洗杂、洗脱、收集萃取液(洗脱液)；
萃取液(洗脱液)经浓缩、脱色、盐酸调节pH4.5、结晶、干燥得到L-鸟氨酸盐酸盐晶体2.30千克，纯度为99.1％，收率为87.6％。洗脱液经浓缩后的蒸馏水还可用于洗杂工序。
实施例5：
上述L-鸟氨酸发酵液首先利用超滤法(1万道尔顿的二氧化钛陶瓷膜超滤，超滤操作压力为0.34MPa，操作温度为65℃)去除菌体及固形物，得超滤液(即进料液)；
结合图1，模拟移动床系统依次分为吸附区、洗杂区、洗脱区和再生清洗区四个区；进料液入口与萃余液出口位于吸附区，洗杂剂入口与洗杂液出口位于洗杂区，洗脱剂入口与萃取液出口位于洗脱区，再生剂入口与出口位于再生区；模拟移动床系统采用14柱，其中吸附区有6柱，洗杂区有2柱，洗脱区有4柱，再生清洗区有2柱。离子交换柱填料为苯乙烯系强酸性阳离子交换树脂JK006，填料量1200mL，柱子的直径70mm，高径比5∶1。模拟移动床系统工作温度25℃。将进料液入口、洗脱剂入口、萃取液出口及萃余液出口沿着料液流动方向分别进行周期性切换，收集洗脱液。周期性切换是指通过调节进料液、洗杂剂、洗脱剂、再生剂的流量，使得各区的第一根柱子处理完全后，切换进入下一区，成为下一区的最后一根柱子，执行下一区流程。
取80L进料液(其中L-鸟氨酸的浓度为22.7g/L，pH控制在1.9)以25mL/min的流量从进料液入口进入模拟移动床系统；洗脱剂为0.9mol/L的氨水溶液，洗脱剂流量15mL/min；洗杂剂和再生剂均为中性去离子水，洗杂剂流量为55mL/min，再生剂流量为78mL/min，每2.5小时将进料液入口、洗脱剂入口、萃取液出口及萃余液出口沿着料液流动方向分别进行周期性切换(在此流速下，各区第一根柱子在此时间均能够处理完全)。
进料液经吸附、洗杂、洗脱、收集萃取液(洗脱液)；
萃取液(洗脱液)经浓缩、脱色、盐酸调节pH4.5、结晶、干燥得到L-鸟氨酸盐酸盐晶体2.08千克，纯度为99.4％，收率为89.2％。洗脱液经浓缩后的蒸馏水还可用于洗杂工序。
Claims (6)
1.利用模拟移动床从发酵液中分离提纯L-鸟氨酸的方法，其特征在于该方法包含下列步骤：
a.L-鸟氨酸发酵液首先利用超滤法去除菌体及固形物，得进料液；
b.步骤a得到的进料液进入模拟移动床系统吸附、洗杂、洗脱L-鸟氨酸、收集洗脱液及柱子再生；
c.步骤b收集的洗脱液经浓缩、脱色、盐酸调节pH4.5-5.0、结晶、干燥得到L-鸟氨酸盐酸盐晶体；
其中：
超滤膜采用截流分子量为1万-15万道尔顿的陶瓷膜，超滤系统操作压力为0.3-0.4MPa，操作温度为50-70℃；陶瓷膜优选二氧化钛陶瓷膜；
进入模拟移动床系统的进料液中L-鸟氨酸浓度为20-30gL，pH为1.5-2.5；洗脱剂为pH10-14的氨水溶液，洗杂剂和再生剂均为中性去离子水；以柱子直径为70mm计，进料液流量20-30mL/min，洗脱剂流量10-20mL/min，洗杂剂流量为50-60mL/min，再生剂流量为70-80mL/min，切换时间为2-4h。
2.根据权利要求1所述的利用模拟移动床从发酵液中分离提纯L-鸟氨酸的方法，其特征在于：模拟移动床系统由7-20根离子交换柱串联组成，模拟移动床系统分为吸附区、洗杂区、洗脱区和再生清洗区四个区；吸附区有3~8柱，洗杂区有1~3柱，洗脱区有2~6柱，再生清洗区有1~3柱；进料液入口与萃余液出口位于吸附区，洗杂剂入口与洗杂液出口位于洗杂区，洗脱剂入口与萃取液出口位于洗脱区，再生剂入口与出口位于再生区；将进料液入口、洗脱剂入口、萃取液出口及萃余液出口沿着料液流动方向分别进行周期性切换，收集洗脱液；
周期性切换是指通过调节进料液、洗杂剂、洗脱剂、再生剂的流量，使得各区的第一根柱子处理完全后，同时切换进入下一区，成为下一区的最后一根柱子，执行下一区流程。
3.根据权利要求1所述的利用模拟移动床从发酵液中分离提纯L-鸟氨酸的方法，其特征在于离子交换柱填料为苯乙烯系强酸性阳离子交换树脂JK006。
4.根据权利要求3所述的利用模拟移动床从发酵液中分离提纯L-鸟氨酸的方法，其特征在于：每根柱子的填料量1000~1500mL。
5.根据权利要求1所述的利用模拟移动床从发酵液中分离提纯L-鸟氨酸的方法，其特征在于：模拟移动床系统工作温度15-40℃。
6.根据权利要求1所述的利用模拟移动床从发酵液中分离提纯L-鸟氨酸的方法，其特征在于L-鸟氨酸发酵液是采用谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13232液体深层发酵得到的L-鸟氨酸发酵液或粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCCNO.1786酶转化L-精氨酸发酵或固定化粪链球菌(fecal streptococcus）ATCC8043、粪产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）ATCC21400、格氏沙雷氏菌（Serratia grimesii）细胞酶法转化L-精氨酸发酵得到的L-鸟氨酸发酵液。
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