一种固定化酶法生产L-鸟氨酸盐酸盐的方法
技术领域
本发明涉及一种生产L-鸟氨酸盐酸盐的方法,尤其是涉及一种固定化酶法生产L-鸟氨酸盐酸盐的方法。
背景技术
L-鸟氨酸盐酸盐是重要的医药工业基础原料,是细胞中重要的代谢产物,对于生物体内液态氨的排除有重要的调节作用。
目前,国内外对于酶法转化生产L-鸟氨酸盐酸盐的文献报道不一。L-鸟氨酸盐酸盐的制备方法主要有三种:化学法、发酵法和酶法。
1化学法
目前工业上最常用的生产方法是采用化学法水解L-精氨酸制备L-鸟氨酸,1966年Shell Int.Rearsch采用丙烯酸和氰化钠作为主要原料化学合成L-鸟氨酸。(GB1020492,1966)。
2发酵法
用肠杆菌中的某些菌如Escherichia coli,Aerobacter aerogenes,Proteus rettgeri和Proteus mirabili的突变菌株,进行发酵生产L-鸟氨酸,发酵液中L-鸟氨酸最高为15mg/mL,(GB1098348,1968;US39668072,1972),Shibuya等利用Arthrobacter citreus 23-2A的突变株发酵生产L-鸟氨酸,发酵72h,产率为35.2g/L。
3酶法
沈淑英等用粪链球菌ATCC8043,粪产碱杆菌ATCC21400,粪链球菌S-43游离细胞转化底物L-精氨酸制备L-鸟氨酸,转化率为95-100%,提取收率为85-90%(天津微生物,1981,3:28-38)。1995年,M Kyriakos等利用从动物肝脏中提取的精氨酸酶水解L-精氨酸用于多种L-鸟氨酸盐的制备(US5405761,1995)。
上述L-鸟氨酸酶法生产过程都是利用游离细胞转化底物L-精氨酸,所以转化液中会含有少量菌体蛋白和其他杂质,不利于产物的分离纯化;且转化后要去除菌体,降低产物得率,导致生产成本增加。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种操作简单、精氨酸转化率高、产量高的固定化酶法生产L-鸟氨酸盐酸盐的方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现,包括如下步骤:
一种酶转化生产L-鸟氨酸盐酸盐的方法,其特征在于,该方法包括如下步骤:
(1)固定化酶的制备
取三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂,用碳酸钾溶液浸泡6-18h后过滤,再将滤出的三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂与碳酸钾、溴化氢按质量比为1∶(0.1-0.6)∶(0.2-0.5)配制成反应溶液,于冰浴中反应5-60min,调节pH值至7-10,再加入精氨酸酶,使其与三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂的质量比为(0.002-0.01)∶1,于1-10℃反应12-48h,洗涤后用饱和食盐水浸泡0.5-3h,再洗净即制得固定化酶,保存于水中;
(2)转化条件的优化
将步骤(1)中制得的固定化酶与精氨酸、乙酸锰按质量比1∶(1-3)∶(0.004-0.02)混合,溶于去离子水中,调节pH值至6-9,在30-50℃下,搅拌反应得到混合液;
(3)产物提取和精制
将步骤(2)中的混合液过滤后,向滤液中加入活性炭,用盐酸调节pH值至3-6,于40-90℃下搅拌反应5-30min后,过滤,将滤出液浓缩至有结晶析出,停止浓缩,加入醇类,搅拌0.5-3h,析出L-鸟氨酸盐酸盐,过滤、干燥即得产品。
所述的步骤(1)中的反应溶液含三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂质量为40-60g/100ml。
所述的步骤(1)中的碳酸钾溶液的摩尔浓度为1-5M。
所述的步骤(1)中的碳酸钾是摩尔浓度为1-5M的溶液,所述的溴化氢是质量浓度为1-4g/ml的溶液,所述的精氨酸酶是质量浓度为1-4g/1的溶液。
所述的步骤(1)中的pH值采用摩尔浓度为0.05-2M的冷碳酸氢钠溶液调节。
所述的步骤(1)中的洗涤是依次利用100-400ml,0.05-0.3M的碳酸氢钠溶液,0.5-4M的氯化钠溶液和去离子水洗涤2-5次。
所述的步骤(2)中的pH值采用盐酸调节。
所述的步骤(2)中搅拌反应的搅拌速度为60-200rpm,反应时间为6-18h。
所述的步骤(3)中活性炭的加入量为1-6g/100ml滤液。
所述的步骤(3)中醇类包括甲醇、乙醇或正丙醇。
与现有技术相比,本发明通过精氨酸酶转化生产L-鸟氨酸盐酸盐。它包括:(1)固定化酶的制备(2)转化条件的优化(3)产物提取和精制工艺步骤。具有生产成本低、生产条件温和、转化体系中杂质较少、工艺步骤简单、生产操作安全等优点,采用本发明生产的L-鸟氨酸盐酸盐纯度高,产量高,每升溶液中含有100g-130g的L-鸟氨酸盐酸盐。精氨酸的转化率可达到95%以上。L-鸟氨酸盐酸盐是重要的医药工业基础原料,是细胞中重要的代谢产物,对于生物体内液态氨的排除有重要的调节作用。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
一种酶转化生产L-鸟氨酸盐酸盐的方法,其特征在于,该方法包括如下步骤:
1、固定化酶的制法
(1)原料用量:
三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂 50g
精氨酸酶 400mg
饱和食盐水 以能浸没固酶为准
(2)操作过程:
将三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂50g,用2M碳酸钾溶液浸泡12h,过滤。滤干后,加入100ml2M碳酸钾溶液,于冰浴下加入10ml溴化氢(2g/ml)于冰浴下反应15分钟,用冷0.1M碳酸氢钠洗至pH=8.5,加入精氨酸酶溶液100ml(约400mg)4℃反应24h。依次用0.1M碳酸氢钠、1M氯化钠、去离子水洗涤3次,每次200ml。
用饱和食盐水浸泡固化酶1小时,洗净至检测不出氯离子,保存于水中,备用。
2、固定化酶制备L-鸟氨酸盐酸盐的方法
精氨酸 60g
湿固酶 50.4g
纯水 120g
乙酸锰 0.2g
盐酸 根据pH确定用量
PH值 7.4~7.6
温度 38~40℃
时间 8小时
搅拌转速 80~120转/分
在上述条件下,将步骤(1)中制得的固定化酶(湿固酶)50.4g与精氨酸60g、乙酸锰0.2g混合,溶于纯水中,采用盐酸调节pH值至7.4~7.6,在38-40℃下,搅拌反应8小时;精氨酸转化率达到95~98%。每升发酵液中含约130g L-鸟氨酸盐酸盐。反应结束后,过滤,滤饼(固相酶)保存于水中,下次备用。
3、L-鸟氨酸盐酸盐的分离纯化
在步骤(2)反应结束过滤后的滤液中加入3g活性炭,调节pH=4,70℃保温搅拌10分钟,过滤,滤液浓缩至有结晶析出,停止浓缩,加入200ml乙醇,搅拌1小时,析出的L-鸟氨酸盐酸盐经过滤,干燥,得53g L-鸟氨酸盐酸盐。
实施例2
(1)固定化酶的制备
取三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂40g,用摩尔浓度为1M的碳酸钾溶液浸泡8h后过滤,滤干后,加入摩尔浓度为1M的碳酸钾溶液10ml,质量浓度为1g/ml的溴化氢溶液5ml于冰浴条件下反应5min,用摩尔浓度为0.05M的冷碳酸氢钠溶液调节溶液pH值至7,再加入质量浓度为1g/l的精氨酸酶溶液50ml,于1℃反应12h,依次用摩尔浓度为0.05M的碳酸氢钠溶液100ml、0.5M的氯化钠溶液100ml、去离子水100ml洗涤2次,最后用饱和食盐水浸泡0.5h,洗净即制得固定化酶,保存于水中;
(2)转化条件的优化
将步骤(1)中制得的固定化酶与精氨酸、乙酸锰按质量比1∶1∶0.004混合溶于100ml去离子水中,利用盐酸调节溶液pH值至6,在30℃,搅拌速度60rpm的条件下,搅拌反应6h,得到混合液;
(3)产物提取和精制
将步骤(2)中制得的混合液进行过滤,向滤液中加入1g活性炭,控制溶液pH=3,反应温度40℃,搅拌5min后过滤,滤出液浓缩至有结晶析出,停止浓缩,加入100ml乙醇,继续搅拌0.5h,析出L-鸟氨酸盐酸盐,经过滤,干燥后得到50g,精氨酸转化率达95%。
实施例3
(1)固定化酶的制备
取三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂50g,用摩尔浓度为2M碳酸钾溶液浸泡12h后过滤,滤干后,加入摩尔浓度为2M的碳酸钾溶液100ml,质量浓度为2g/ml的溴化氢溶液10ml于冰浴条件下反应15min,用摩尔浓度为0.1M的冷碳酸氢钠溶液调节溶液pH值至8.5,再加入质量浓度为4g/l的精氨酸酶溶液100ml,于4℃反应24h,依次用摩尔浓度为0.1M的碳酸氢钠溶液200ml、摩尔浓度为1M的氯化钠溶液200ml、去离子水200ml洗涤3次,最后用饱和食盐水浸泡1h,洗净即制得固定化酶,保存于水中;
(2)转化条件的优化
将步骤(1)中制得的固定化酶与精氨酸、乙酸锰按质量比1∶1.5∶0.008混合溶于120ml去离子水中,利用盐酸调节溶液pH值至7.5,在40℃,搅拌速度100rpm的条件下,反应8h,得到混合液;
(3)产物提取和精制
将步骤(2)中制得的混合液进行过滤,向滤液中加入3g活性炭,控制溶液pH=4,反应温度70℃,搅拌10min后过滤,滤出液浓缩至有结晶析出,停止浓缩,加入200ml乙醇,继续搅拌1h,析出L-鸟氨酸盐酸盐,经过滤,干燥后得到53g,精氨酸转化率达98%。
实施例4
(1)固定化酶的制备
取三乙醇胺阴离子苯乙烯树脂60g,用摩尔浓度为5M碳酸钾溶液浸泡18h后过滤,滤干后,加入摩尔浓度为4M的碳酸钾溶液150ml,质量浓度为4g/ml的溴化氢溶液20ml于冰浴条件下反应60min,用摩尔浓度为2M的冷碳酸氢钠溶液调节溶液pH值至10,再加入质量浓度为2g/l的精氨酸酶溶液200ml,于10℃反应48h,依次用摩尔浓度为0.3M的碳酸氢钠溶液400ml、摩尔浓度为4M的氯化钠溶液400ml、去离子水400ml洗涤5次,最后用饱和食盐水浸泡3h,洗净即制得固定化酶,保存于水中;
(2)转化条件的优化
将步骤(1)中制得的固定化酶与精氨酸、乙酸锰按质量比1∶2∶0.02混合溶于200ml去离子水中,利用盐酸调节溶液pH值至9,在50℃,搅拌速度200rpm的条件下,反应18h,得到混合液;
(3)产物提取和精制
将步骤(2)中制得的混合液进行过滤,向滤液中加入6g活性炭,控制溶液pH=6,反应温度90℃,搅拌30min后过滤,滤出液浓缩至有结晶析出,停止浓缩,加入500ml乙醇,继续搅拌3h,析出L-鸟氨酸盐酸盐,经过滤,干燥后得到54g,精氨酸转化率达96%。