CN104498555A

CN104498555A - 一种加补料并超声波辅助的l-酪氨酸酶法转化制备方法

Info

Publication number: CN104498555A
Application number: CN201410739103.XA
Authority: CN
Inventors: 王雷; 缪铭; 张涛; 夏小乐; 李永彪
Original assignee: Ningbo Zhenhai Haide Biochem Co Ltd
Current assignee: CJ HAIDE (NINGBO) BIOTECH CO.,LTD.
Priority date: 2014-12-08
Filing date: 2014-12-08
Publication date: 2015-04-08

Abstract

本发明涉及一种加补料并超声波辅助的L-酪氨酸酶法转化制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将具有酪氨酸酚裂解酶活性的菌株经斜面活化种子培养接入发酵培养基发酵培养后收集得到静息细胞；将静息细胞加入到磷酸钾缓冲液中，并置于超声波装置中；将苯酚、丙酮酸钠、氯化铵和磷酸吡哆醛加入至静息细胞中，转化合成后过滤得到静息细胞与转化产物，静息细胞继续下一次反应，转化产物进行过滤烘干的到L-酪氨酸。本发明具有工艺简单、技术先进、安全性高、生产周期短、适合工业化生产等特点，具有良好的市场前景。

Description

一种加补料并超声波辅助的L-酪氨酸酶法转化制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种L-酪氨酸制备方法，具体涉及一种加补料并超声波辅助的L-酪氨酸酶法转化制备方法。

背景技术

L-酪氨酸是一种芳香族氨基酸，是动物体内合成蛋白质所需要的重要氨基酸之一，其所带的氨基和羧基具有重要的生理功能。在医药领域，L-酪氨酸是合成甲状腺素、多巴、肾上腺的前体；在食品领域，L-酪氨酸是一种重要的添加剂；临床上，L-酪氨酸还用于生殖避孕疗效研究。根据目前文献报道，L-酪氨酸的制备方法主要有提取法、化学合成法、发酵法和酶转化法。

酶法转化因具有专一性强、反应条件温和、反应周期短、分离提纯容易等优点而日益受到重视，是廉价生产L-酪氨酸的有效方法。ENEI Hitoshi，等（Agr. Biol. Chem., 37(3): 493-499, 1973）以DL-丝氨酸和苯酚为底物，利用Erwinia herbicola ATCC 21434中酪氨酸酚裂解酶酶法合成了L-酪氨酸，100 ml反应体系中得到了5.35 g L-酪氨酸。Kim Do Young，等（J.Microbiol. Biotechn., 2007, 17(1): 116-122）在分批补料反应器中流加苯酚、丙酮酸和氨，利用Symbiobacterium toebii 来源酪氨酸酚裂解酶催化反应，转化30 h生成130 g/L L-酪氨酸，L-酪氨酸对苯酚的最大转化率92%。

酶法转化主要以苯酚、氨、丙酮酸或 L-丝氨酸纯品为底物，以不同来源的酪氨酸酚裂解酶催化合成L-酪氨酸，且丙酮酸比L-丝氨酸更适合做该酶底物。

中国专利公告号CN100564536C，公告日2009年12月2日，名称为一种采用酶法拆分制备L-酪氨酸-¹⁵N的方法，该申请案公开了一种采用酶法拆分制备L-酪氨酸-¹⁵N的方法，该方法步骤如下：1.酶反应底物的配制；2.保温反应；3.萃取；4.脱色；5.脱色液浓缩至一定体积后，用稀盐酸和稀氢氧化钠调pH至等电点，在0-4℃下过夜，再用冰水洗去杂质，过滤后烘干即得L-酪氨酸-¹⁵N。其不足之处在于，转化合成效率较低，反应时间较长。

发明内容

本发明的目的在于为了解决现有制备L-酪氨酸的效率较低，反应时间长、成本较高的缺陷而提供一种高效，环保，安全和节约成本的加补料并超声波辅助的L-酪氨酸酶法转化制备方法。

为了实现上述目地，本发明采用以下技术方案：

一种加补料并超声波辅助的L-酪氨酸酶法转化制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

a）将具有酪氨酸酚裂解酶活性的菌株经斜面活化种子培养接入发酵培养基发酵培养后收集得到静息细胞；

b）将步骤a）的静息细胞加入到磷酸钾缓冲液中，并置于超声波装置中，作用时间1-20min；

c）将苯酚、丙酮酸钠、氯化铵和磷酸吡哆醛加入至步骤b）处理后的静息细胞中，反应温度25-55℃，连续流加补料，转化合成2-48小时后过滤得到静息细胞与转化产物，静息细胞继续下一次反应，转化产物进行过滤烘干的到L-酪氨酸。在本技术方案中，将收集到的静息细胞加入到超声功能的特定装置中，在设定超声功率和温度的前提下超声一段时间，再将处理后的细胞用于全细胞转化合成L-酪氨酸，超声处理后的静息细胞其反应效率更高；补料罐内的料液通过连接到反应罐的管路由泵连续的加到反应器中，补料的不断加入使产物不断累积，提高了产量；当反应罐内产物达到一定量时，利用过滤装置可以将粗产品和细胞分离开，粗产品可继续提纯，而静息细胞可被回收到反应罐内再一次的用作转化反应。所以，综合上述几点特征，该发明缩短了全细胞转化合成L-酪氨酸的反应时间，提高了L-酪氨酸的产量并充分利用了发酵得到的菌体。本发明是一种高效，环保，安全和节约成本的方法，该方法可满足工业化生产的要求，具有较高的经济效益。

利用全细胞转化合成L-酪氨酸，合理的流加补料，适时的补充底物，可以有效的解除抑制，充分利用细胞来转化合成从而获得更高的产率，将转化产物与静息细胞分离开，静息细胞流回反应罐，转化产物被排出反应罐，添加苯酚，丙酮酸钠，氯化铵和磷酸吡哆醛至回收的静息细胞中，控制反应罐内温度37℃，连续流加补料，转化合成24h，提高产率与转化率。

作为优选，L-酪氨酸酶法转化制备方法的反应装置主体包括：补料装置、反应装置和超声处理装置，补料装置包括补料罐（1）、补料出口阀（2），补料泵（4）；反应装置包括排气管（5），搅拌器（6），反应罐（3）、排出阀（10），出液泵（11），过滤器（12），出液阀（13）；超声装置包括显示器（7），控制面板（8）与罐体（9），反应罐（3）置于超声装置的罐体（9）中。

作为优选，步骤a）中发酵培养基为酵母膏3-6g/L、L-酪氨酸1-3g/L、磷酸氢二钾1-3g/L、七水合硫酸镁0.5-1.2g/L、七水合硫酸亚铁0.01-0.03g/L与盐酸吡哆醇0.05-0.13g/L。

作为优选，步骤b）中静息细胞加入到100mM、pH为8-9的反应罐的磷酸钾缓冲液中，加入量为10¹⁰CFU/mL。

作为优选，步骤b）中超声装置的超声波功率为5-100w，温度8-12℃。

作为优选，步骤c）中加入的苯酚浓度为1-3mol/L，丙酮酸钠的浓度为1-3mol/L，氯化铵2-5mol/L，磷酸吡哆醛0.3-0.5mmol/L，pH8-9。

作为优选，补料罐（1）为两个，一个补料罐（1）中加入的为苯酚，另一个补料罐（1）加入的为丙酮酸钠、氯化铵和磷酸吡哆醛的混合溶液。

作为优选，具有酪氨酸酚裂解酶活性的菌株为弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii ATCC 8090。

本发明的有益效果为：

1）通过利用超声波场技术改变微生物细胞膜的通透性和结构，提高了全细胞转化合成L-酪氨酸的效率，缩短了反应时间；

2）连续流加补料的策略可以更高的得到L-酪氨酸的产率。该方法具有工艺简单、技术先进、安全性高、生产周期短、适合工业化生产等特点，具有良好的市场前景；

3）酶法合成具有条件温和，成本低，工艺流程简单的优点，适合工业化生产。

附图说明

图1是本发明的一种结构示意图。

图中，1、补料罐；2、补料出口阀；3、反应罐；4、补料泵；5、排气管；6、搅拌器；7、显示器；8、控制面板；9、罐体；10、排出阀；11、出液泵；12、过滤器；13、出液阀。

具体实施方式

以下通过具体实施例与附图，对本发明作进一步的解释：

L-酪氨酸酶法转化制备方法的反应装置主体包括：补料装置、反应装置和超声处理装置，补料装置包括补料罐1、补料出口阀2，补料泵4；反应装置包括排气管5，搅拌器6，反应罐3、排出阀10，出液泵11，过滤器12，出液阀13；超声装置包括显示器7，控制面板8与罐体9，反应罐3置于超声装置的罐体9中，补料罐1为两个，一个补料罐1中加入的为苯酚，另一个补料罐1加入的为丙酮酸钠、氯化铵和磷酸吡哆醛的混合溶液。

本发明所用原料与菌种可从市场购得。

实施例1

a）将弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii ATCC 8090经斜面活化种子培养接入发酵培养基发酵培养后收集得到静息细胞；其中，发酵培养基为酵母膏3g/L、L-酪氨酸1g/L、磷酸氢二钾1g/L、七水合硫酸镁0.5g/L、七水合硫酸亚铁0.01g/L与盐酸吡哆醇0.05g/L；

b）将步骤a）的静息细胞加入到反应罐中，反应罐中的磷酸钾缓冲液pH为8，100mM，静息细胞的加入量为10¹⁰CFU/mL，反应罐置于超声装置的罐体中，作用时间15min；超声波功率为5w，温度8℃

c）将补料罐中的苯酚、丙酮酸钠、氯化铵和磷酸吡哆醛加入至反应罐中，直至反应罐中建立0.78mol/L丙酮酸钠，1.56mol/L氯化铵，0.156mmol/L磷酸吡哆醛，0.78mol/L苯酚的转化体系，反应温度25℃，转化合成2小时后过滤得到静息细胞与转化产物，可累积L-酪氨酸130g/L，苯酚转化率为92%，将转化产物与静息细胞分离开，静息细胞流回反应罐，转化产物被排出反应罐，添加苯酚，丙酮酸钠，氯化铵和磷酸吡哆醛至回收的静息细胞中，连续流加补料至反应罐，补料罐中苯酚浓度1mol/L，丙酮酸钠1mol/L，氯化铵2mol/L，磷酸吡哆醛0.3mmol/L，37℃下连续反应24h，直至反应罐中0.78mol/L丙酮酸钠，1.56mol/L氯化铵，0.156mmol/L磷酸吡哆醛，0.78mol/L苯酚的转化体系，2h后可累积L-酪氨酸125g/L，苯酚转化率为80%，转化产物进行过滤烘干的到L-酪氨酸。

实施例2

a）将弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii ATCC 8090经斜面活化种子培养接入发酵培养基发酵培养后收集得到静息细胞；其中，发酵培养基为酵母膏5g/L、L-酪氨酸2g/L、磷酸氢二钾2g/L、七水合硫酸镁1g/L、七水合硫酸亚铁0.02g/L与盐酸吡哆醇0.1g/L；

b）将步骤a）的静息细胞加入到反应罐中，反应罐中的磷酸钾缓冲液pH为9，100mM，静息细胞的加入量为10¹⁰CFU/mL，反应罐置于超声装置的罐体中，作用时间20min；超声波功率为85w，温度10℃

c）将补料罐中的苯酚、丙酮酸钠、氯化铵和磷酸吡哆醛加入至反应罐中，反应温度37℃，直至反应罐中建立0.78mol/L丙酮酸钠，1.56mol/L氯化铵，0.156mmol/L磷酸吡哆醛，0.78mol/L苯酚的转化体系，转化合成24小时后过滤得到静息细胞与转化产物，可累积L-酪氨酸130g/L，苯酚转化率为93%，将转化产物与静息细胞分离开，静息细胞流回反应罐，转化产物被排出反应罐，添加苯酚，丙酮酸钠，氯化铵和磷酸吡哆醛至回收的静息细胞中，连续流加补料至反应罐，补料罐中苯酚浓度2mol/L，丙酮酸钠2 mol/L，氯化铵4 mol/L，磷酸吡哆醛0.4mmol/L，37℃下连续反应24h，直至反应罐中建立0.78mol/L丙酮酸钠，1.56mol/L氯化铵，0.156mmol/L磷酸吡哆醛，0.78mol/L苯酚的转化体系，24h后可累积L-酪氨酸125g/L，苯酚转化率为88%，转化产物进行过滤烘干的到L-酪氨酸。

实施例3

a）将弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii ATCC 8090经斜面活化种子培养接入发酵培养基发酵培养后收集得到静息细胞；其中，发酵培养基为酵母膏6g/L、L-酪氨酸3g/L、磷酸氢二钾3g/L、七水合硫酸镁1.2g/L、七水合硫酸亚铁0.03g/L与盐酸吡哆醇0.13g/L；

b）将步骤a）的静息细胞加入到反应罐中，反应罐中的磷酸钾缓冲液pH为9，100mM,，静息细胞的加入量为10¹⁰CFU/mL，反应罐置于超声装置的罐体中，作用时间1min；超声波功率为100w，温度12℃

c）将补料罐中苯酚、丙酮酸钠、氯化铵和磷酸吡哆醛加入至反应罐中，反应温度55℃，直至反应罐中建立0.78mol/L丙酮酸钠，1.56mol/L氯化铵，0.156mmol/L磷酸吡哆醛，0.78mol/L苯酚的转化体系，转化合成48小时后过滤得到静息细胞与转化产物，可累积L-酪氨酸130g/L，苯酚转化率为91%，将转化产物与静息细胞分离开，静息细胞流回反应罐，转化产物被排出反应罐，添加苯酚，丙酮酸钠，氯化铵和磷酸吡哆醛至回收的静息细胞中，连续流加补料至反应罐，补料罐中苯酚浓度2mol/L，丙酮酸钠2 mol/L，氯化铵4 mol/L，磷酸吡哆醛0.4mmol/L，37℃下连续反应24h，直至反应罐中0.78mol/L丙酮酸钠，1.56mol/L氯化铵，0.156mmol/L磷酸吡哆醛，0.78mol/L苯酚的转化体系，24h后可累积L-酪氨酸125g/L，苯酚转化率为88%，转化产物进行过滤烘干的到L-酪氨酸。

Claims

1.一种加补料并超声波辅助的L-酪氨酸酶法转化制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

c）将苯酚、丙酮酸钠、氯化铵和磷酸吡哆醛加入至步骤b）处理后的静息细胞中，反应温度25-55℃，连续流加补料，转化合成2-48小时后过滤得到静息细胞与转化产物，静息细胞继续下一次反应，转化产物进行过滤烘干的到L-酪氨酸。

2.根据权利要求1所述的一种加补料并超声波辅助的L-酪氨酸酶法转化制备方法，其特征在于，L-酪氨酸酶法转化制备方法的反应装置主体包括：补料装置、反应装置和超声处理装置，补料装置包括补料罐（1）、补料出口阀（2），补料泵（4）；反应装置包括排气管（5），搅拌器（6），反应罐（3）、排出阀（10），出液泵（11），过滤器（12），出液阀（13）；超声装置包括显示器（7），控制面板（8）与罐体（9），反应罐（3）置于超声装置的罐体（9）中。

3.根据权利要求1所述的一种加补料并超声波辅助的L-酪氨酸酶法转化制备方法，其特征在于，步骤a）中发酵培养基为酵母膏3-6g/L、L-酪氨酸1-3g/L、磷酸氢二钾1-3g/L、七水合硫酸镁0.5-1.2g/L、七水合硫酸亚铁0.01-0.03g/L与盐酸吡哆醇0.05-0.13g/L。

4.根据权利要求1所述的一种加补料并超声波辅助的L-酪氨酸酶法转化制备方法，其特征在于，步骤b）中静息细胞加入到100mM、pH为8-9的反应罐的磷酸钾缓冲液中，加入量为10¹⁰CFU/mL。

5.根据权利要求1所述的一种加补料并超声波辅助的L-酪氨酸酶法转化制备方法，其特征在于，步骤b）中超声装置的超声波功率为5-100w，温度8-12℃。

6.根据权利要求1所述的一种加补料并超声波辅助的L-酪氨酸酶法转化制备方法，其特征在于，步骤c）中加入的苯酚浓度为1-3mol/L，丙酮酸钠的浓度为1-3mol/L，氯化铵2-5mol/L，磷酸吡哆醛0.3-0.5mmol/L，pH8-9。

7.根据权利要求2所述的一种加补料并超声波辅助的L-酪氨酸酶法转化制备方法，其特征在于，补料罐（1）为两个，一个补料罐（1）中加入的为苯酚，另一个补料罐（1）加入的为丙酮酸钠、氯化铵和磷酸吡哆醛的混合溶液。

8.根据权利要求1或3或4或5或6所述的一种加补料并超声波辅助的L-酪氨酸酶法转化制备方法，其特征在于，具有酪氨酸酚裂解酶活性的菌株为弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii ATCC8090。