JP3279642B2 - アルギナーゼバッチおよびオルニチンの酵素的製造方法 - Google Patents
アルギナーゼバッチおよびオルニチンの酵素的製造方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、安定化アルギナーゼバ
ッチ、水溶液中でアルギニンをオルニチンに酵素的に変
換する方法およびそのためのアルギナーゼキットに関す
る。
ッチ、水溶液中でアルギニンをオルニチンに酵素的に変
換する方法およびそのためのアルギナーゼキットに関す
る。
【０００２】
【従来の技術】アルギナーゼ（Ｌ−アルギナーゼ、Ｌ−
アルギニンアミジノヒドロラーゼ；Ｅ．Ｃ．３．５．
３．１）は、Ｌ−アルギニンからのＬ−オルニチンの酵
素的製造を接触する、５０年来公知の酵素である。生体
内で、これらの触媒反応は哺乳動物において肝臓内で尿
素回路の最終段階で生起し、その際Ｌ−アルギニン（２
−アミノ−５−グアニジノペンタン酸）から加水分解に
より尿素とＬ−オルニチン（２，５−ジアミノペンタン
酸）が形成する。酵素は、それに応じて哺乳動物の肝
臓、たとえば子牛の肝臓から製造することができるが、
該酵素は植物分野ならびに幾つかの微生物中にも出現す
る。
アルギニンアミジノヒドロラーゼ；Ｅ．Ｃ．３．５．
３．１）は、Ｌ−アルギニンからのＬ−オルニチンの酵
素的製造を接触する、５０年来公知の酵素である。生体
内で、これらの触媒反応は哺乳動物において肝臓内で尿
素回路の最終段階で生起し、その際Ｌ−アルギニン（２
−アミノ−５−グアニジノペンタン酸）から加水分解に
より尿素とＬ−オルニチン（２，５−ジアミノペンタン
酸）が形成する。酵素は、それに応じて哺乳動物の肝
臓、たとえば子牛の肝臓から製造することができるが、
該酵素は植物分野ならびに幾つかの微生物中にも出現す
る。
【０００３】アルギナーゼは、約１３８０００の分子量
を有し、４つの同じサブユニットからなる。代表的活性
化剤として、Ｍｎ2+、さらにＣｏ2+およびＮｉ2+も添加
することができる。
を有し、４つの同じサブユニットからなる。代表的活性
化剤として、Ｍｎ2+、さらにＣｏ2+およびＮｉ2+も添加
することができる。
【０００４】Ｌ−オルニチンは、哺乳動物の身体内に出
現するが、同化の際には生成せず、従ってタンパク質中
へ組込まれない、つまり自然の非タンパク質生成アミノ
酸である。
現するが、同化の際には生成せず、従ってタンパク質中
へ組込まれない、つまり自然の非タンパク質生成アミノ
酸である。
【０００５】Ｌ−オルニチンは、乳児および子供におけ
る必須アミノ酸であるＬ−アルギニンをすべての機能に
おいて代替しうる。Ｌ−オルニチンの塩は、Ｌ−アルギ
ニンよりも僅かな、生体に対する尿素負荷を伴ない、部
分的に良好な溶解特性を保持するので、Ｌ−オルニチン
は著しい商業的将来性を有する。アルギニンないしはオ
ルニチンの欠乏は、たとえば断食期間または栄養不足後
の高いアミノ酸摂取により、過度に高いアンモニア血中
濃度によって死に到るまでの損害を生じうる。
る必須アミノ酸であるＬ−アルギニンをすべての機能に
おいて代替しうる。Ｌ−オルニチンの塩は、Ｌ−アルギ
ニンよりも僅かな、生体に対する尿素負荷を伴ない、部
分的に良好な溶解特性を保持するので、Ｌ−オルニチン
は著しい商業的将来性を有する。アルギニンないしはオ
ルニチンの欠乏は、たとえば断食期間または栄養不足後
の高いアミノ酸摂取により、過度に高いアンモニア血中
濃度によって死に到るまでの損害を生じうる。
【０００６】アルギナーゼは、診断酵素として久しく慣
用されている。しかしこの酵素は、工業的規模でＬ−ア
ルギニンからＬ−オルニチンを製造するためには今日ま
で使用することができなかった。それというのもこの酵
素は反応条件下では極めて低い安定性を有するだけであ
り、それに応じ酵素バッチからは全く回収することがで
きないかまたは極めて僅かな程度しか回収できない。従
って、高い酵素コストと結合して、工業的規模でＬ−ア
ルギニンからのＬ−オルニチンの酵素的生産は引き合な
い。
用されている。しかしこの酵素は、工業的規模でＬ−ア
ルギニンからＬ−オルニチンを製造するためには今日ま
で使用することができなかった。それというのもこの酵
素は反応条件下では極めて低い安定性を有するだけであ
り、それに応じ酵素バッチからは全く回収することがで
きないかまたは極めて僅かな程度しか回収できない。従
って、高い酵素コストと結合して、工業的規模でＬ−ア
ルギニンからのＬ−オルニチンの酵素的生産は引き合な
い。
【０００７】このため、Ｌ−オルニチンおよびその塩の
合成法としては、酵素的方法のほかに、大工業的にはグ
ルコースから菌株ブレビバクテリウム、コリネバクテリ
ウムおよびアルトロバクテリウムを用いる発酵、ならび
にＬ−アルギニンの化学的加水分解が挙げられるにすぎ
ない。しかし化学的加水分解は多くの副生成物を生じ
る、たとえばＬ−シトルリン（２−アミノ−５−ウレイ
ド−ペンタン酸）への部分的加水分解またはＬ−アルギ
ニンまたはＬ−オルニチンのラセミ化を生じる。Ｌ−オ
ルニチンへの発酵は、高いトン数ではじめて経済的であ
る。
合成法としては、酵素的方法のほかに、大工業的にはグ
ルコースから菌株ブレビバクテリウム、コリネバクテリ
ウムおよびアルトロバクテリウムを用いる発酵、ならび
にＬ−アルギニンの化学的加水分解が挙げられるにすぎ
ない。しかし化学的加水分解は多くの副生成物を生じ
る、たとえばＬ−シトルリン（２−アミノ−５−ウレイ
ド−ペンタン酸）への部分的加水分解またはＬ−アルギ
ニンまたはＬ−オルニチンのラセミ化を生じる。Ｌ−オ
ルニチンへの発酵は、高いトン数ではじめて経済的であ
る。
【０００８】アルギナーゼはＬ−アルギニンのＬ−オル
ニチンへの加水分解に対し申分のない活性および選択性
を有するが、酵素の安定性は工業的使用には十分でな
い。良好な活性を得るためには、反応溶液に酵素のほか
に２価のマンガンイオンの添加が必要である。しかし、
文献に公開されたアルギナーゼの最適活性に一致する、
通常調節される９．５の反応のｐＨ値では、２価のマン
ガンの４価のマンガンへの酸化のため、しばしば短時間
後に褐石（二酸化マンガン）が沈殿する。同時に、これ
とアルギナーゼの失活が結合している（Ｍ．Ｍｕｎａｋ
ａｔａ等．，“Ｂｉｏｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ”１９７６年，第６巻，第１３３頁〜第１４２
頁；Ｖ．Ｒｏｓｓｉ等．，“Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄ
ｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．”，１９８３年，第２２
巻，第２３９頁〜第２５０頁）。
ニチンへの加水分解に対し申分のない活性および選択性
を有するが、酵素の安定性は工業的使用には十分でな
い。良好な活性を得るためには、反応溶液に酵素のほか
に２価のマンガンイオンの添加が必要である。しかし、
文献に公開されたアルギナーゼの最適活性に一致する、
通常調節される９．５の反応のｐＨ値では、２価のマン
ガンの４価のマンガンへの酸化のため、しばしば短時間
後に褐石（二酸化マンガン）が沈殿する。同時に、これ
とアルギナーゼの失活が結合している（Ｍ．Ｍｕｎａｋ
ａｔａ等．，“Ｂｉｏｉｎｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ”１９７６年，第６巻，第１３３頁〜第１４２
頁；Ｖ．Ｒｏｓｓｉ等．，“Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄ
ｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．”，１９８３年，第２２
巻，第２３９頁〜第２５０頁）。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、広い
ｐＨ範囲内でも、過度に失活することなしに使用でき
る、安定化された形のアルギナーゼバッチを提供するこ
とである。さらに、アルギナーゼは反応後、場合により
再利用のため分離可能であるべきである。相応するアル
ギナーゼキットおよび溶液でＬ−アルギニンをＬ−オル
ニチンに酵素的に変換することも本発明の課題であり、
この方法でもアルギナーゼは場合により同様に再使用可
能であるべきである。
ｐＨ範囲内でも、過度に失活することなしに使用でき
る、安定化された形のアルギナーゼバッチを提供するこ
とである。さらに、アルギナーゼは反応後、場合により
再利用のため分離可能であるべきである。相応するアル
ギナーゼキットおよび溶液でＬ−アルギニンをＬ−オル
ニチンに酵素的に変換することも本発明の課題であり、
この方法でもアルギナーゼは場合により同様に再使用可
能であるべきである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】この課題は、安定化アル
ギナーゼバッチに関し、請求項１の特徴部に記載された
特徴によって解決される。
ギナーゼバッチに関し、請求項１の特徴部に記載された
特徴によって解決される。
【００１１】通常のアルギナーゼバッチは、水に溶解し
て、酵素アルギナーゼ、酵素によって変換さるべき基質
および場合によりＭｎ2+を含有する。
て、酵素アルギナーゼ、酵素によって変換さるべき基質
および場合によりＭｎ2+を含有する。
【００１２】本発明によるアルギナーゼバッチ、アルギ
ナーゼキットおよび方法は、アルギナーゼに対し少なく
とも１０倍モル濃度で存在すべき還元剤の添加によって
すぐれている。
ナーゼキットおよび方法は、アルギナーゼに対し少なく
とも１０倍モル濃度で存在すべき還元剤の添加によって
すぐれている。
【００１３】濃度およびコスト上の理由から、酵素に対
して１０6倍モル量の還元剤を過剰量の上限と評価する
ことができる。有利には還元剤の添加は、アルギナーゼ
に対して１０2〜１０4倍モル過剰であり、この場合還元
剤は有利に１０-7〜１０-1モル／ｌ、とくに１０-5〜１
０-3モル／ｌの濃度で存在する。メルカプトエタノー
ル、ジチオトレイトール、殊に有利にはアスコルビン
酸、（Ｌ−アスコルビン酸、ビタミンＣ）が有利な還元
剤であることが判明した。
して１０6倍モル量の還元剤を過剰量の上限と評価する
ことができる。有利には還元剤の添加は、アルギナーゼ
に対して１０2〜１０4倍モル過剰であり、この場合還元
剤は有利に１０-7〜１０-1モル／ｌ、とくに１０-5〜１
０-3モル／ｌの濃度で存在する。メルカプトエタノー
ル、ジチオトレイトール、殊に有利にはアスコルビン
酸、（Ｌ−アスコルビン酸、ビタミンＣ）が有利な還元
剤であることが判明した。
【００１４】アルギナーゼ反応は、有利にはアルギナー
ゼの１０-8〜１０-5モル濃度（モル／ｌ）で起き、この
場合Ｍｎ2+イオンがアルギナーゼに対して１０〜１０6
倍モル過剰に存在するのが、良好なアルギナーゼ活性に
とり有利である。溶剤はとくに純水性である。有利に
は、酵素、たとえば子牛の肝臓からのアルギナーゼは１
０００〜１００００単位／ｌで使用され；Ｍｎ2+は有利
には１０-4〜１０-2モル／ｌ、望ましくは硫酸マンガン
として添加される。さらにこの場合、Ｍｎ2+イオンに対
し還元剤の化学量論的過剰の場合、殊に還元剤対Ｍｎ2+
イオンのモル比０．０１〜０．９の場合、アルギナーゼ
のとくに良好な安定性が達成されることが確かめられ
た。この場合、還元剤対Ｍｎ2+イオンのモル比が０．１
〜０．５である場合に安定性は最大である。これらの比
は、とくにアルギナーゼ反応をｐＨ８．５〜１０．５で
開始するときに指示される。８．５〜１０．５のｐＨ
は、アルギニン溶液に酸（たとえばＨ2ＳＯ4，ＨＣｌ）
を添加することによって調節することができる。この場
合、酸、アルギニンおよび／またはオルニチンは緩衝系
を形成する。
ゼの１０-8〜１０-5モル濃度（モル／ｌ）で起き、この
場合Ｍｎ2+イオンがアルギナーゼに対して１０〜１０6
倍モル過剰に存在するのが、良好なアルギナーゼ活性に
とり有利である。溶剤はとくに純水性である。有利に
は、酵素、たとえば子牛の肝臓からのアルギナーゼは１
０００〜１００００単位／ｌで使用され；Ｍｎ2+は有利
には１０-4〜１０-2モル／ｌ、望ましくは硫酸マンガン
として添加される。さらにこの場合、Ｍｎ2+イオンに対
し還元剤の化学量論的過剰の場合、殊に還元剤対Ｍｎ2+
イオンのモル比０．０１〜０．９の場合、アルギナーゼ
のとくに良好な安定性が達成されることが確かめられ
た。この場合、還元剤対Ｍｎ2+イオンのモル比が０．１
〜０．５である場合に安定性は最大である。これらの比
は、とくにアルギナーゼ反応をｐＨ８．５〜１０．５で
開始するときに指示される。８．５〜１０．５のｐＨ
は、アルギニン溶液に酸（たとえばＨ2ＳＯ4，ＨＣｌ）
を添加することによって調節することができる。この場
合、酸、アルギニンおよび／またはオルニチンは緩衝系
を形成する。
【００１５】アルギナーゼバッチに、基質として有利に
はアルギニン０．１〜２．０モル／ｌを添加することが
でき、この場合沈殿物としてアルギニンを有する飽和溶
液が存在しうる。緩衝剤不含のバッチでは形成したオル
ニチンも沈殿しうる。良好なアルギナーゼ活性および高
いアルギナーゼ回収率には、殊に０．５〜１．５モル／
ｌ、最良には１．０モル／ｌのアルギニン濃度が有利で
あることが立証された。この場合、アルギニン溶液は緩
衝する必要はない、つまり溶液の初期ｐＨ値は１０．５
〜１１．５、とくに１１〜１１．５であってもよい。こ
の場合、この値は第一にアルギニンの固有のｐＨ値によ
って定まる。次いで、反応の経過中にこのｐＨ値は、ア
ルギニンのオルニチンへの変換によって約９．５に低下
する。殊にこの初期ｐＨでは、還元剤の濃度は少なくと
も１０-5モル／ｌであるべきである。
はアルギニン０．１〜２．０モル／ｌを添加することが
でき、この場合沈殿物としてアルギニンを有する飽和溶
液が存在しうる。緩衝剤不含のバッチでは形成したオル
ニチンも沈殿しうる。良好なアルギナーゼ活性および高
いアルギナーゼ回収率には、殊に０．５〜１．５モル／
ｌ、最良には１．０モル／ｌのアルギニン濃度が有利で
あることが立証された。この場合、アルギニン溶液は緩
衝する必要はない、つまり溶液の初期ｐＨ値は１０．５
〜１１．５、とくに１１〜１１．５であってもよい。こ
の場合、この値は第一にアルギニンの固有のｐＨ値によ
って定まる。次いで、反応の経過中にこのｐＨ値は、ア
ルギニンのオルニチンへの変換によって約９．５に低下
する。殊にこの初期ｐＨでは、還元剤の濃度は少なくと
も１０-5モル／ｌであるべきである。
【００１６】この場合、文献に記載された９．５の至適
ｐＨとは異なり、酵素は１１．５までのｐＨ値で少なく
とも２日間活性であり、むしろ最大の活性を示すことが
判明した。
ｐＨとは異なり、酵素は１１．５までのｐＨ値で少なく
とも２日間活性であり、むしろ最大の活性を示すことが
判明した。
【００１７】アルギニンからオルニチンを酵素的に製造
する本発明方法は、アルギニンを（場合により沈積物と
共に）水溶液でアルギナーゼと、場合によりＭｎ2+およ
び場合により緩衝系の存在で反応させ、その際溶液中に
還元剤はアルギナーゼに対して少なくとも１０倍モル量
で存在する。方法の望ましい手段に対しては、原則上特
別な実施形のアルギナーゼバッチが相応に妥当である。
する本発明方法は、アルギニンを（場合により沈積物と
共に）水溶液でアルギナーゼと、場合によりＭｎ2+およ
び場合により緩衝系の存在で反応させ、その際溶液中に
還元剤はアルギナーゼに対して少なくとも１０倍モル量
で存在する。方法の望ましい手段に対しては、原則上特
別な実施形のアルギナーゼバッチが相応に妥当である。
【００１８】反応は静止、つまり撹拌または振とうしな
い溶液中で行なうべきである。それというのも運動溶液
中に出現するせん断力が酵素を失活しうるからである。
反応時間は通常２４〜７２時間であり、この場合Ｌ−ア
ルギニンの変換率は完全である。殊に緩衝されてないバ
ッチでは、反応はｐＨ値の減少により追跡することがで
き、ｐＨは終り頃に約９．５（生じるＬ−オルニチンの
固有のｐＨ）に低下する。
い溶液中で行なうべきである。それというのも運動溶液
中に出現するせん断力が酵素を失活しうるからである。
反応時間は通常２４〜７２時間であり、この場合Ｌ−ア
ルギニンの変換率は完全である。殊に緩衝されてないバ
ッチでは、反応はｐＨ値の減少により追跡することがで
き、ｐＨは終り頃に約９．５（生じるＬ−オルニチンの
固有のｐＨ）に低下する。
【００１９】本発明による還元剤の添加は、還元剤なし
のアルギナーゼバッチ（ｐＨは９．５の近くである）よ
りも著しく広いｐＨ範囲内のアルギナーゼバッチを可能
にする。これは、より高いアルギニン初期濃度を用い、
補助的緩衝系なしで作業することができるという利点を
有し、この場合それにも拘らずアルギニンの高い回収率
は数回のバッチを１つの酵素量で許容する。この場合、
緩衝剤不含または低濃度系中での作業は、方法における
塩輸送が減少するという利点を有する。従来のアルギナ
ーゼバッチに比して、還元剤の添加によりアルギナーゼ
の失活が、還元剤の添加なしの値の１０分の１以下に低
下する、つまりアルギナーゼは本発明による還元剤添加
によって少なくとも１０の数倍だけ安定化される。
のアルギナーゼバッチ（ｐＨは９．５の近くである）よ
りも著しく広いｐＨ範囲内のアルギナーゼバッチを可能
にする。これは、より高いアルギニン初期濃度を用い、
補助的緩衝系なしで作業することができるという利点を
有し、この場合それにも拘らずアルギニンの高い回収率
は数回のバッチを１つの酵素量で許容する。この場合、
緩衝剤不含または低濃度系中での作業は、方法における
塩輸送が減少するという利点を有する。従来のアルギナ
ーゼバッチに比して、還元剤の添加によりアルギナーゼ
の失活が、還元剤の添加なしの値の１０分の１以下に低
下する、つまりアルギナーゼは本発明による還元剤添加
によって少なくとも１０の数倍だけ安定化される。
【００２０】安定化は、酵素消費数として、つまり各バ
ッチから酵素を循環する場合、産出されたオルニチン１
ｋｇあたりのアルギナーゼ単位の消費数として表わすこ
とができる。この消費数は、 −還元剤なし、ポンプ運動使用のアルギナーゼバッチの場合 ５８９０ −還元剤なし、ポンプ運動なしのアルギナーゼバッチの場合 ５０００ −還元剤使用、ポンプ運動なし 〃 ２７０である 。
ッチから酵素を循環する場合、産出されたオルニチン１
ｋｇあたりのアルギナーゼ単位の消費数として表わすこ
とができる。この消費数は、 −還元剤なし、ポンプ運動使用のアルギナーゼバッチの場合 ５８９０ −還元剤なし、ポンプ運動なしのアルギナーゼバッチの場合 ５０００ −還元剤使用、ポンプ運動なし 〃 ２７０である 。
【００２１】条件は例１と同様 この安定化は、実際完全に進行しうる、反応後のアルギ
ナーゼの経済的回収を可能にする。文献によればＬ−オ
ルニチンはアルギナーゼを阻害するが、この影響は本発
明による反応の場合決定的ではない。回収のためには、
アルギナーゼバッチから酵素を、とくに毛管限外濾過流
過カートリッジ（たとえばＲｏｍｉｃｏｎ，分離限界１
００００ダルトン）を用いる限外濾過により、低分子成
分と少なくとも十分に分離する。カートリッジの場合、
沈殿した二酸化マンガンを有するバッチは毛管を流過
し、その際低分子の溶解した成分を有する溶液の大部分
は毛管の細孔を透過し、酵素は沈殿した褐石と一緒に、
バッチ（溶液）の小部分中で、毛管の流出口から濃厚な
形で流出する。引き続き褐石と酵素は、とくに濾過によ
り分離することができる。分離した酵素は、直ちに改め
てＬ−アルギニンと同様に反応させるかまたはあとでの
適用のために保存することができる。
ナーゼの経済的回収を可能にする。文献によればＬ−オ
ルニチンはアルギナーゼを阻害するが、この影響は本発
明による反応の場合決定的ではない。回収のためには、
アルギナーゼバッチから酵素を、とくに毛管限外濾過流
過カートリッジ（たとえばＲｏｍｉｃｏｎ，分離限界１
００００ダルトン）を用いる限外濾過により、低分子成
分と少なくとも十分に分離する。カートリッジの場合、
沈殿した二酸化マンガンを有するバッチは毛管を流過
し、その際低分子の溶解した成分を有する溶液の大部分
は毛管の細孔を透過し、酵素は沈殿した褐石と一緒に、
バッチ（溶液）の小部分中で、毛管の流出口から濃厚な
形で流出する。引き続き褐石と酵素は、とくに濾過によ
り分離することができる。分離した酵素は、直ちに改め
てＬ−アルギニンと同様に反応させるかまたはあとでの
適用のために保存することができる。
【００２２】この異常に高い安定化はなかんずく、還元
剤が部分的にＭ2+のＭ4+への酸化を阻止することにより
実現するものと推測されるが、その際酸化は完全に阻止
される必要はない。それというのも少量のＭｎ4+は酵素
の良好な活性に対し恐らくは再び有利であるからであ
る。即ち、比較的低い、つまり８．５〜１０．５のｐＨ
では、Ｍｎ2+の酸化が完全には阻止されないようにする
ためには、還元剤はＭｎ2+／Ｍｎ4+に対して過剰に存在
すべきである。他方において、より高いｐＨ、この場合
には約１１．５までのｐＨでは酵素反応の際に通常使用
しうる還元剤は、Ｍｎ2+の酸化を完全に阻止できるほど
強力ではなく、それに応じてＭｎ2+に対し過剰の還元剤
を使用することもできる。従って、ｐＨおよび還元剤
は、二酸化マンガンの緩慢な沈殿が保証されているよう
に互いに同調されているべきである。それというのもこ
れが恐らく、酵素を遊離体および生成物と再び分離する
ことのできる限外濾過膜上に保護層の形成を生じるから
である。この場合、限外濾過膜は酵素メンブレン反応器
中または別個のユニットとして配置して、使用すること
ができる。従って、還元は有利には、ＭｎＯ2の存在で
実施され、ＭｎＯ2は反応の間にも形成しうる。
剤が部分的にＭ2+のＭ4+への酸化を阻止することにより
実現するものと推測されるが、その際酸化は完全に阻止
される必要はない。それというのも少量のＭｎ4+は酵素
の良好な活性に対し恐らくは再び有利であるからであ
る。即ち、比較的低い、つまり８．５〜１０．５のｐＨ
では、Ｍｎ2+の酸化が完全には阻止されないようにする
ためには、還元剤はＭｎ2+／Ｍｎ4+に対して過剰に存在
すべきである。他方において、より高いｐＨ、この場合
には約１１．５までのｐＨでは酵素反応の際に通常使用
しうる還元剤は、Ｍｎ2+の酸化を完全に阻止できるほど
強力ではなく、それに応じてＭｎ2+に対し過剰の還元剤
を使用することもできる。従って、ｐＨおよび還元剤
は、二酸化マンガンの緩慢な沈殿が保証されているよう
に互いに同調されているべきである。それというのもこ
れが恐らく、酵素を遊離体および生成物と再び分離する
ことのできる限外濾過膜上に保護層の形成を生じるから
である。この場合、限外濾過膜は酵素メンブレン反応器
中または別個のユニットとして配置して、使用すること
ができる。従って、還元は有利には、ＭｎＯ2の存在で
実施され、ＭｎＯ2は反応の間にも形成しうる。
【００２３】アルギナーゼバッチに必要ないしは有利な
成分は個々におよび混合物または部分的混合物で安定で
あるので、有利にはキットとして販売し、貯蔵すること
ができる。即ち、１つのキットはアルギナーゼおよび還
元剤を互いに同調した量で含有する。有利には、キット
はＭｎ2+をたとえば硫酸マンガンまたは塩化マンガンと
しておよび／または場合によりなおアルギニンのような
基質ならびに場合によりＬ−オルニチンも含有する。Ｌ
−オルニチンは実際に酵素の競合的阻害剤であるが、ア
ルギナーゼを（溶液および凍結乾燥形で）貯蔵する場合
に安定剤として使用される。この場合、バッチを調製す
るためには、相応する量の、とくに滅菌水に溶解するだ
けでよい。さらにキットに、殊に一回使用製品である場
合、必要な器具の一部、たとえば毛管限外濾過カートリ
ッジを添付することができる。
成分は個々におよび混合物または部分的混合物で安定で
あるので、有利にはキットとして販売し、貯蔵すること
ができる。即ち、１つのキットはアルギナーゼおよび還
元剤を互いに同調した量で含有する。有利には、キット
はＭｎ2+をたとえば硫酸マンガンまたは塩化マンガンと
しておよび／または場合によりなおアルギニンのような
基質ならびに場合によりＬ−オルニチンも含有する。Ｌ
−オルニチンは実際に酵素の競合的阻害剤であるが、ア
ルギナーゼを（溶液および凍結乾燥形で）貯蔵する場合
に安定剤として使用される。この場合、バッチを調製す
るためには、相応する量の、とくに滅菌水に溶解するだ
けでよい。さらにキットに、殊に一回使用製品である場
合、必要な器具の一部、たとえば毛管限外濾過カートリ
ッジを添付することができる。
【００２４】次に、本発明を実施例および図面につきさ
らに説明する。
らに説明する。
【００２５】第１図におけるバッチ式限外濾過膜反応器
は、反応容器２および限外濾過カートリッジ３を含有
し、これらは弁４を介して互いに結合されている。反応
容器２は反応バッチ１４を含有し、密閉可能でありかつ
圧力導管５に接続されている。反応が終了した後、圧力
導管５を介して弁４を開いた状態で、反応バッチ１４を
大きい渦動なしにＮ2によりカートリッジ３を通して圧
送することができる。カートリッジ３は多数の多孔性毛
管６を含有し、その一端７は弁４を介して反応容器２と
結合し、その他端８は戻り導管９に接続されていて、該
導管により毛管を通過した酵素は再び反応容器２に戻す
ことができる。戻り導管９中には、カートリッジ３を通
過した褐石を分離するため濾過器１０が配置されてい
る。毛管の外側は流出口１１を介して１３により生成物
用ストレージタンク１２と結合していて、該タンク中に
反応バッチ１４の低分子成分（オルニチン、場合により
未反応のアルギニン、緩衝塩、還元剤の残分およびＭｎ
2+）が留まる。
は、反応容器２および限外濾過カートリッジ３を含有
し、これらは弁４を介して互いに結合されている。反応
容器２は反応バッチ１４を含有し、密閉可能でありかつ
圧力導管５に接続されている。反応が終了した後、圧力
導管５を介して弁４を開いた状態で、反応バッチ１４を
大きい渦動なしにＮ2によりカートリッジ３を通して圧
送することができる。カートリッジ３は多数の多孔性毛
管６を含有し、その一端７は弁４を介して反応容器２と
結合し、その他端８は戻り導管９に接続されていて、該
導管により毛管を通過した酵素は再び反応容器２に戻す
ことができる。戻り導管９中には、カートリッジ３を通
過した褐石を分離するため濾過器１０が配置されてい
る。毛管の外側は流出口１１を介して１３により生成物
用ストレージタンク１２と結合していて、該タンク中に
反応バッチ１４の低分子成分（オルニチン、場合により
未反応のアルギニン、緩衝塩、還元剤の残分およびＭｎ
2+）が留まる。
【００２６】戻された酵素を用い、改めてアルギナーゼ
バッチを使用することができる。
バッチを使用することができる。
【００２７】図２の系統図は、図１と同様にバッチ式限
外濾過反応器１を含有するが、カートリッジ３の流出口
１１は陽イオン交換カラム１５と結合していて、該カラ
ムにカートリッジ３の濾液のオルニチンが保持され、そ
の際尿素および陰イオンはカラムを通過する。オルニチ
ンで負荷されたカラム１５は洗浄され、アンモニア水で
溶離される。溶離されたオルニチンは容器１６中で溶液
が飽和するまで濃縮され、酸（たとえばＨＣｌ，Ｈ2Ｓ
Ｏ4，Ｌ−アスパラギン酸、α−ケトグルタル酸、酢
酸）で中和され、弱酸性にまで調節され、沈殿槽２１中
で約３倍量のＥｔＯＨが加えられる。この場合、撹拌
（１７）下に、相応するオルニチン塩が沈殿し、濾過器
１８により分離され、乾燥器１９中で所望の乾燥度にも
たらされる。反応容器２における密閉可能な孔２０によ
り、相応する成分（消費された酵素、Ｈ2Ｏ、還元剤
等）を有する新しいバッチが補充される。
外濾過反応器１を含有するが、カートリッジ３の流出口
１１は陽イオン交換カラム１５と結合していて、該カラ
ムにカートリッジ３の濾液のオルニチンが保持され、そ
の際尿素および陰イオンはカラムを通過する。オルニチ
ンで負荷されたカラム１５は洗浄され、アンモニア水で
溶離される。溶離されたオルニチンは容器１６中で溶液
が飽和するまで濃縮され、酸（たとえばＨＣｌ，Ｈ2Ｓ
Ｏ4，Ｌ−アスパラギン酸、α−ケトグルタル酸、酢
酸）で中和され、弱酸性にまで調節され、沈殿槽２１中
で約３倍量のＥｔＯＨが加えられる。この場合、撹拌
（１７）下に、相応するオルニチン塩が沈殿し、濾過器
１８により分離され、乾燥器１９中で所望の乾燥度にも
たらされる。反応容器２における密閉可能な孔２０によ
り、相応する成分（消費された酵素、Ｈ2Ｏ、還元剤
等）を有する新しいバッチが補充される。
【００２８】
例 １ 硫酸で９．５のｐＨ値に調節されているＬ−アルギニン
の０．７５モル溶液１ｌに、硫酸マンガン・Ｈ2Ｏ
２．５×１０-4モル、アスコルビン酸１／２当量、従っ
て１．２５×１０-4モル、ならびに子牛肝臓アルギナー
ゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ
連邦共和国）１００００単位を加える。２４時間後、Ｌ
−アルギニンの変換率は９８％であり、さらに２４時間
後は１００％であった。
の０．７５モル溶液１ｌに、硫酸マンガン・Ｈ2Ｏ
２．５×１０-4モル、アスコルビン酸１／２当量、従っ
て１．２５×１０-4モル、ならびに子牛肝臓アルギナー
ゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ドイツ
連邦共和国）１００００単位を加える。２４時間後、Ｌ
−アルギニンの変換率は９８％であり、さらに２４時間
後は１００％であった。
【００２９】中空糸モジュール（Ａｍｉｃｏｎ社、ＭＷ
ＣＯ １００００，０．０３ｍ2）による限外濾過後、
濾液を酸性イオン交換体に装入し、５％のアンモニア約
１ｌで溶離し、５００ｍｌに濃縮し、濃硫酸約２６〜２
８ｍｌでｐＨ値６．９に調節し、エタノール１．５ ｌ
でオルニチン硫酸塩を沈殿させた。純粋なオルニチン硫
酸塩１１４．３ｇが得られた（理論量の８４．６％）。
ＣＯ １００００，０．０３ｍ2）による限外濾過後、
濾液を酸性イオン交換体に装入し、５％のアンモニア約
１ｌで溶離し、５００ｍｌに濃縮し、濃硫酸約２６〜２
８ｍｌでｐＨ値６．９に調節し、エタノール１．５ ｌ
でオルニチン硫酸塩を沈殿させた。純粋なオルニチン硫
酸塩１１４．３ｇが得られた（理論量の８４．６％）。
【００３０】例 ２ 例１と同様に実施したが、０．５モル／ｌのＬ−アルギ
ニン濃度および酵素６６００単位を使用した。Ｌ−オル
ニチン硫酸塩８２．２ｇ（理論量の９１．３％）が得ら
れた。
ニン濃度および酵素６６００単位を使用した。Ｌ−オル
ニチン硫酸塩８２．２ｇ（理論量の９１．３％）が得ら
れた。
【００３１】例 ３ 例１と同様に実施したが、１モル／ｌのＬ−アルギニン
濃度および子牛肝臓アルギナーゼ９４００単位を使用し
た。Ｌ−オルニチン硫酸塩の収量は１４１．４ｇ（理論
量の７８．５％）であった。
濃度および子牛肝臓アルギナーゼ９４００単位を使用し
た。Ｌ−オルニチン硫酸塩の収量は１４１．４ｇ（理論
量の７８．５％）であった。
【００３２】例 ４ ０．７５モルのＬ−アルギニン溶液３０ｍｌに、硫酸マ
ンガン・Ｈ2Ｏ２．５×１０-4モル、異なる量のアスコ
ルビン酸を加え、アルギニンの固有ｐＨ値（約ｐＨ１
１．５）で１回、塩酸で安定化して９．５の初期ｐＨ値
で１回、子牛肝臓アルギナーゼ３７０単位を加えた。室
温で２３時間後、アルギニンの変換率を測定した。引き
続き、限外濾過器により酵素を分離し、すぐ次のバッチ
中で改めて使用した。
ンガン・Ｈ2Ｏ２．５×１０-4モル、異なる量のアスコ
ルビン酸を加え、アルギニンの固有ｐＨ値（約ｐＨ１
１．５）で１回、塩酸で安定化して９．５の初期ｐＨ値
で１回、子牛肝臓アルギナーゼ３７０単位を加えた。室
温で２３時間後、アルギニンの変換率を測定した。引き
続き、限外濾過器により酵素を分離し、すぐ次のバッチ
中で改めて使用した。
【００３３】初期ｐＨ値９．５ ブランクの膜 ブランクの膜 バッチＮｏ． 変換率 アスコルビン酸 変換率 アスコルビン酸 （％） （モル／ｌ） （％） （モル／ｌ） １ ５２ ２．５×１０-4 ６７ １．２５×１０-4 ２ ３７ ５６ 〃 ３ １３ ４１ 〃 ４ ７ ３７ 〃 ５ ４ ３０ ０ ＊ ６ ０ ２９ ０ ＊ ７ − ２９ ０ ＊ ８ − ２８ ０ ＊ ＊＝褐石の沈殿初期ｐＨ値９．５ 褐石負荷された膜 バッチＮｏ． 変換率 アスコルビン酸 （％） （モル／ｌ） １ ５９ ２．５×１０-4 ２ ３１ ３ １９ ４ １６ ５ １２ ６ １０ ７ ８ ８ ７ 初期ｐＨ値１１．５ 褐石負荷された膜 ブランクの膜 バッチＮｏ． 変換率 アスコルビン酸 変換率 アスコルビン酸 （％） （モル／ｌ） （％） （モル／ｌ） １ ７９ ２．５×１０-4 ７９ ２．５×１０-4 ２ ７３ ７３ ３ ６９ ７２ ４ ７０ ６５ ５ ６７ ６１ ６ ６６ ６１ ７ ６６ ６２ ８ ６６ ６１ 初期ｐＨ値９．５では、酵素は始めに褐石負荷された膜
の場合でもブランクの膜の場合でも失活する。それとい
うのもこのｐＨ値では十分なアスコルビン酸が膜を褐石
無負荷状態に保つことができるからである。しかし、ア
スコルビン酸を全然または不足量しか添加しないときに
は、褐石層が形成し、酵素はもはや強く失活しない。し
かしｐＨ１１．５では、ブランクの膜上に急速に褐石層
が形成し、それぞれの場合酵素は僅かに失活する。
の場合でもブランクの膜の場合でも失活する。それとい
うのもこのｐＨ値では十分なアスコルビン酸が膜を褐石
無負荷状態に保つことができるからである。しかし、ア
スコルビン酸を全然または不足量しか添加しないときに
は、褐石層が形成し、酵素はもはや強く失活しない。し
かしｐＨ１１．５では、ブランクの膜上に急速に褐石層
が形成し、それぞれの場合酵素は僅かに失活する。
【００３４】例 ５ 内容積１２ ｌの酵素メンブレン循環反応器中に、０．
７５モルのＬ−アルギニン溶液を装入し、硫酸マンガン
・Ｈ2Ｏ ０．５１ｇ（２．５×１０-4モル）、アスコ
ルビン酸０．５３ｇないしは０．２６５ｇ（２．５ない
しは１．２５×１０-4モル）、ならびに子牛肝臓アルギ
ナーゼ６００００単位（５０００単位／ｌ）を添加し、
ｐＨ値を硫酸で９．５に調節する。運動しない循環媒体
中で２３時間の反応時間後に変換率を測定し、酵素を窒
素圧力輸送で、ロミコン社（Ｆａ．Ｒｏｍｉｃｏｎ）の
２．４ｍ2の限外濾過中空糸モジュールに通して分離
し、次のバッチ中で改めて反応に供給した。
７５モルのＬ−アルギニン溶液を装入し、硫酸マンガン
・Ｈ2Ｏ ０．５１ｇ（２．５×１０-4モル）、アスコ
ルビン酸０．５３ｇないしは０．２６５ｇ（２．５ない
しは１．２５×１０-4モル）、ならびに子牛肝臓アルギ
ナーゼ６００００単位（５０００単位／ｌ）を添加し、
ｐＨ値を硫酸で９．５に調節する。運動しない循環媒体
中で２３時間の反応時間後に変換率を測定し、酵素を窒
素圧力輸送で、ロミコン社（Ｆａ．Ｒｏｍｉｃｏｎ）の
２．４ｍ2の限外濾過中空糸モジュールに通して分離
し、次のバッチ中で改めて反応に供給した。
【００３５】初期ｐＨ値９．５ ブランクの膜 ブランクの膜 バッチＮｏ． 変換率 アスコルビン酸 変換率 アスコルビン酸 （％） （モル／ｌ） （％） （モル／ｌ） １ ７０ ２．５×１０-4 ８８ １．２５×１０-4 ２ ５０ 〃 ８６ 〃 ３ ３５ 〃 ９０ 〃 ４ ２０ 〃 ８４ 〃 ５ ４ 〃 ８４ 〃 ６ １．５ 〃 ８４ 〃 ７ ０ 〃 ８３ 〃 ８ − ８４ 〃 硫酸マンガンの等モル添加の場合酵素は急速に失活し、
１／２当量添加の場合既に２３時間後に軽微な褐石の沈
殿が認められ、アルギナーゼは僅かだけ失活した。
１／２当量添加の場合既に２３時間後に軽微な褐石の沈
殿が認められ、アルギナーゼは僅かだけ失活した。
【００３６】例６ Ｌ−オルニチン酢酸塩の製造 ０．７５モルのＬ−アルギニン溶液１ ｌに、硫酸マン
ガン水和物４２．３ｍｇ（１．２５×１０-4モル）なら
びにベーリンガー・マンハイム社の子牛の肝臓アルギナ
ーゼ１５０００単位を添加した。４８時間後の変換率
は、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）によれば
１００％であった。酢酸でｐＨ６．８に調節し、水の３
／４を留去し、室温でエタノール１ ｌでオルニチン酢
酸塩を沈殿させた。１５分後撹拌した後、沈殿物を濾取
し、エタノールで後洗浄し、真空（４０ミリバール）中
で乾燥した。純粋のオルニチン酢酸塩の収量は１３７．
０ｇ（理論量の９５％）であった。旋光度（ｃ＝５水
中）：＋１０．０゜（理論値：＋９．０〜＋１１．０
゜）。
ガン水和物４２．３ｍｇ（１．２５×１０-4モル）なら
びにベーリンガー・マンハイム社の子牛の肝臓アルギナ
ーゼ１５０００単位を添加した。４８時間後の変換率
は、ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）によれば
１００％であった。酢酸でｐＨ６．８に調節し、水の３
／４を留去し、室温でエタノール１ ｌでオルニチン酢
酸塩を沈殿させた。１５分後撹拌した後、沈殿物を濾取
し、エタノールで後洗浄し、真空（４０ミリバール）中
で乾燥した。純粋のオルニチン酢酸塩の収量は１３７．
０ｇ（理論量の９５％）であった。旋光度（ｃ＝５水
中）：＋１０．０゜（理論値：＋９．０〜＋１１．０
゜）。
【００３７】例 ７ １ ｌのバッチ用アルギナーゼキット アルギナーゼ １００００単位 Ｌ−オルニチン・ＨＣｌ １７０ｍｇ（１ミリモル） 硫酸マンガン・Ｈ2Ｏ ４２．３ｍｇ（０．２５ミリモル） Ｌ−アスコルビン酸 ４３．７ｍｇ（０．１２５ミリモル） Ｌ−アルギニン １７４．２ｇ（１モル） 酵素（凍結乾燥形）およびＬ−オルニチンは混合物で容
器中に存在し、これに殊に硫酸マンガンおよびアスコル
ビン酸が混加されていてもよい。アルギニンは通常別個
に添加されるが、その他の成分と混合して存在していて
もよい。
器中に存在し、これに殊に硫酸マンガンおよびアスコル
ビン酸が混加されていてもよい。アルギニンは通常別個
に添加されるが、その他の成分と混合して存在していて
もよい。
【００３８】バッチに対しては、全部を水１ ｌに加
え、約２日放置する。
え、約２日放置する。
【図１】アルギナーゼバッチ製造装置の系統図。
【図２】アルギニンからオルニチンの酵素的製造装置の
系統図。
系統図。
１ バッチ式限外濾過反応器 ２ 反応容器 ３ 限外濾過カートリッジ ４ 弁 ５ 圧力導管 ６ 毛管 ７ 一端 ８ 他端 ９ 戻り導管 １０ 濾過器 １１ 流出口 １２ 生成物留め容器 １３ 導管 １４ 反応バッチ １５ 陽イオン交換体カラム １６ 容器 １７ 撹拌機 １８ 濾過器 １９ 乾燥器 ２０ 孔
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 キリアコス マクリアレアス ドイツ連邦共和国 フライゲリヒト １ アム ライン ２ (56)参考文献 特開 昭48−26976（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−53465（ＪＰ，Ａ) 国際公開91／13336（ＷＯ，Ａ１) Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，127 （２）（1982），ｐ．237−243 Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｔｅｃ ｈｎｉｑｕｅｓ，４（２）（1990）, ｐ．133−136 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａ ｃｔａ．，527（１）（1978），ｐ．１ −７ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/96 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (16)
- 【請求項１】 アルギナーゼ、水および基質を含有する
アルギナーゼバッチにおいて、還元剤としてアスコルビ
ン酸が、アルギナーゼに対して少なくとも１０倍モル濃
度に水に溶解して存在することを特徴とするアルギナー
ゼバッチ。 - 【請求項２】 還元剤が、アルギナーゼに対し１０〜１
０６倍モル濃度で存在することを特徴とする請求項１記
載のアルギナーゼバッチ。 - 【請求項３】 アルギナーゼが１０-８〜１０-５モル／
ｌの濃度で存在することを特徴とする請求項１または２
記載のアルギナーゼバッチ。 - 【請求項４】 基質がアルギニンであって、０．１〜
２．０モル／ｌの量で存在し、その際場合によりアルギ
ニンの一部は溶解していないことを特徴とする請求項１
から３までのいずれか１項記載のアルギナーゼバッチ。 - 【請求項５】 Ｍｎ２＋がアルギナーゼに対し１０〜１
０６倍モル過剰量で存在することを特徴とする請求項１
から４までのいずれか１項記載のアルギナーゼバッチ。 - 【請求項６】 還元剤がＭｎ ２＋に対し化学量論的過剰
量で存在することを特徴とする請求項５記載のアルギナ
ーゼバッチ。 - 【請求項７】 水溶液中に、アルギナーゼ、基質および
アルギナーゼに対し少なくとも１０倍モル濃度のアスコ
ルビン酸、ならびに場合によりＭｎ ２＋および場合によ
り補助的緩衝系を含有する、アルギナーゼバッチ。 - 【請求項８】 還元剤としてのアスコルビン酸およびア
ルギナーゼならびに場合により塩の形のＭｎ２＋および
場合によりアルギニンを含有する、請求項１から７まで
のいずれか１項記載のアルギナーゼバッチを製造するた
めのアルギナーゼキット。 - 【請求項９】 アルギナーゼおよび場合によりＭｎ２＋
を用い、水溶液中でアルギニンからオルニチンを酵素的
に製造する方法において、溶液に還元剤としてアスコル
ビン酸を、アルギナーゼに対し少なくとも１０倍モル量
で溶解することを特徴とするオルニチンの酵素的製造方
法。 - 【請求項１０】 還元剤を１０-７〜１０-１モル／ｌの
濃度に添加することを特徴とする請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 ｐＨをアルギナーゼ反応の開始時に１
０．５〜１１．５に調節し、還元剤を少なくとも１０
-５モル／ｌの濃度に添加することを特徴とする請求項
１０記載の方法。 - 【請求項１２】 還元剤対Ｍｎ ２＋ のモル比が０.０１
〜０.９である、請求項９または１０記載の方法。 - 【請求項１３】 反応後限外濾過により反応バッチを少
なくとも十分に、低分子の溶解している成分を含有する
濾液と、反応バッチの溶解していない成分を有するアル
ギナーゼとに分離することを特徴とする請求項９から１
２までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項１４】 アルギナーゼを限外濾過により存在す
る不溶のＭｎＯ２と分離することを特徴とする請求項１
３記載の方法。 - 【請求項１５】 濾液を酸性イオン交換体に装入し、引
き続き該交換体をアンモニアで溶離し、溶離液を中和
し、酸で約６．９のｐＨに調節し、濃縮し、Ｌ−オルニ
チンをエタノールで塩として沈殿させることを特徴とす
る請求項１３または１４記載の方法。 - 【請求項１６】 アルギニンからオルニチンを酵素的に
製造するため、水溶液中でアルギニンを、場合によりＭ
ｎ２＋および場合により緩衝系の存在でアルギナーゼを
用いてオルニチンに変換する方法において、溶液中にア
スコルビン酸がアルギナーゼに対し少なくとも１０倍モ
ル量で存在することを特徴とするオルニチンの酵素的製
造方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4119029A DE4119029A1 (de) | 1991-06-10 | 1991-06-10 | Stabilisierte, metallionenaktivierte l-arginase (l-arginin amidinohydrolase |
| DE4119029.7 | 1991-06-10 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05176768A JPH05176768A (ja) | 1993-07-20 |
| JP3279642B2 true JP3279642B2 (ja) | 2002-04-30 |
Family
ID=6433597
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15030592A Expired - Fee Related JP3279642B2 (ja) | 1991-06-10 | 1992-06-10 | アルギナーゼバッチおよびオルニチンの酵素的製造方法 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5554518A (ja) |
| EP (1) | EP0521305B1 (ja) |
| JP (1) | JP3279642B2 (ja) |
| AT (1) | ATE188249T1 (ja) |
| CA (1) | CA2070898A1 (ja) |
| DE (3) | DE4119029A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101851646A (zh) * | 2009-03-31 | 2010-10-06 | 上海汉飞生化科技有限公司 | 一种固定化酶法生产l-鸟氨酸盐酸盐的方法 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2248558A1 (en) * | 1996-03-15 | 1997-09-18 | Yale University | Methods and means of detecting nitric oxide synthase |
| JP4874999B2 (ja) * | 2005-02-07 | 2012-02-15 | ジェン−プローブ・インコーポレーテッド | Ｂ群連鎖球菌属を検出するための組成物及び方法 |
| JP2011015641A (ja) * | 2009-07-09 | 2011-01-27 | Nichirei Foods:Kk | 酵母を用いたｌ−オルニチンの製造方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4826976A (ja) * | 1971-08-14 | 1973-04-09 | ||
| SU1034618A3 (ru) * | 1978-06-21 | 1983-08-07 | "Раделкиш" Электрокемиаи Мюсердьярто Севеткезет (Инопредприятие) | Электрохимический датчик дл определени концентрации веществ в растворах |
| CH663353A5 (de) * | 1984-03-28 | 1987-12-15 | Joaquin Amat Larraz | Mittel gegen krebs. |
| DE4020980C1 (ja) * | 1990-07-02 | 1991-09-26 | Degussa Ag, 6000 Frankfurt, De |
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- 1991-06-10 DE DE4119029A patent/DE4119029A1/de active Granted
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-
1994
- 1994-10-17 US US08/323,609 patent/US5554518A/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，５２７（１）（１９７８），ｐ．１−７ |
| Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４（２）（１９９０），ｐ．１３３−１３６ |
| Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２７（２）（１９８２），ｐ．２３７−２４３ |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101851646A (zh) * | 2009-03-31 | 2010-10-06 | 上海汉飞生化科技有限公司 | 一种固定化酶法生产l-鸟氨酸盐酸盐的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE59209785D1 (de) | 2000-02-03 |
| DE4119029A1 (de) | 1992-12-17 |
| EP0521305B1 (de) | 1999-12-29 |
| ATE188249T1 (de) | 2000-01-15 |
| DE9116462U1 (ja) | 1992-11-19 |
| EP0521305A2 (de) | 1993-01-07 |
| JPH05176768A (ja) | 1993-07-20 |
| CA2070898A1 (en) | 1992-12-11 |
| US5554518A (en) | 1996-09-10 |
| DE4119029C2 (ja) | 1993-08-26 |
| EP0521305A3 (en) | 1993-07-21 |
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