JP2501543B2 - ヘモグロビン−ポリオキシアルキレン結合体凍結乾燥製剤 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、代用血液中に必要な酸
素運搬物質として使用する新規なヘモグロビン−ポリオ
キシアルキレン結合体の凍結乾燥製剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】代用血液に使用する酸素運搬物質として
ヘモグロビン−ポリオキシアルキレン結合体が血流内寿
命を大幅に延ばすことができる点で優れていることは既
に明らかにされている（特開昭５６−１２３０８号、５
７−２０６６２２号明細書参照。）。

【０００３】

【発明が解決しようとする問題点】ヘモグロビンが生体
成分であるところから、ポリオキシアルキレンを結合さ
せることによりヘモグロビンが変性したり酸素親和性を
減少させたりする問題があった。さらに、得られたヘモ
グロビン−ポリオキシアルキレン結合体の保存性特にポ
リオキシアルキレン−ヘモグロビン間の結合の安定性に
も問題があった。さらに、代用血液として使用する修飾
ヘモグロビンの凍結乾燥製剤の調製に際しては、いわゆ
る安定化剤を添加することによりメトヘモグロビンの生
成や不溶物の生成を防止することが知られており、この
安定化剤として、例えば亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素
ナトリウム、硫酸第一鉄等の抗酸化剤、ＥＤＴＡ等のア
ミンおよびその塩が提案されている。しかし、無機抗酸
化剤は人体に有害であり不溶物の生成量が多く、また、
ＥＤＴＡは長期保存時の安定性が悪く、何れもメトヘモ
グロビンの発生を効率よく防止することが困難である等
の問題があった。

【０００４】

【問題点を解決するための手段】本発明者は、長期安定
性にすぐれた修飾ヘモグロビンの凍結乾燥製剤を鋭意検
討した結果、末端にエーテル結合を介してカルボキシル
基を有するポリオキシアルキレンを用いてこれにヘモグ
ロビンをアミド結合させて得られた結合体にマルトース
を共存させて凍結乾燥することにより、上記問題点を解
決することを見いだし本発明を完成させるに至った。す
なわち本発明は、ポリオキシアルキレン末端とヘモグロ
ビンのアミノ基との結合部分が下記の構造式よりなるヘ
モグロビン−ポリオキシアルキレン結合体

【０００５】

【化２】 −ＣＨ_２−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＯＮＨ−Ｈｂ

【０００６】（式中、Ｈｂはヘモグロビンを表わし、ｎ
＝１〜７である。）とマルトースを含有する凍結乾燥製
剤、に関するものである。

【０００７】以下本発明を詳細に説明する。本発明で用
いられるポリオキシアルキレンは、例えばポリオキシエ
チレン（エチレンオキサイドの重合体でポリエチレング
リコールともいう。）、ポリオキシプロピレンあるいは
エチレンオキサイドとプロピレンオキサイドとの共重合
体等水溶性の高い重合物であり、その分子量は３００〜
２０，０００、製造される結合体の粘度等の観点から好
ましくは７５０〜１０，０００、特に好ましくは１００
０〜６０００、の範囲内にあるものである。ポリオキシ
アルキレンの末端とカルボキシル基部分との間の結合に
はエステル結合、アミド結合、エーテル結合等が考えら
れる。これらの結合のうちで特にエーテル結合が有効で
あることを見出してなされたのが本発明である。従っ
て、本発明のヘモグロビン−ポリオキシアルキレン結合
体の合成に使用されるポリオキシアルキレンはヘモグロ
ビンを結合させる末端が−Ｏ−（ＣＨ₂ ）_n −ＣＯＯＨ
に変換されているものである。ｎは１〜１０程度であ
り、１〜７程度、特に１〜３程度のものが選択されるこ
とが多い。

【０００８】ポリオキシアルキレンの末端をこのような
形に変換する方法としては、白金、パラジウムの炭素担
持触媒を用いて末端炭素を酸化する方法、活性化二酸化
マンガンで末端のオキシメチル基を酸化してアルデヒド
に変え、過酸化水素でさらに酸化してカルボン酸にする
方法、塩基の存在下でポリオキシアルキレンにハロゲン
化脂肪酸を反応させる方法、ジアゾ基を有する脂肪酸と
ポリオキシアルキレンを反応させる方法などを利用すれ
ばよい。このようにカルボキシル基を付与されたポリオ
キシアルキレンとヘモグロビンの反応に際して、例えば
Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、Ｎ−ヒドロキシフタル
酸イミド、ｐ−ニトロフェノール、ペンタクロロフェノ
ール等通常のペプチド合成におけるカルボン酸活性化剤
により活性エステルとし、これとヘモグロビンと反応さ
せてアミド交換することもできるし、塩化チオニル等ハ
ロゲン化剤を作用させてポリオキシアルキレンの酸ハロ
ゲン化物とし、これとヘモグロビンとを反応させること
もできる。

【０００９】本発明に使用するヘモグロビンは、ヒト、
ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、サル、ウサギ、ニワ
トリ等ヘモグロビンを有する動物由来のものであればよ
い。本明細書でいうヘモグロビンとは、いわゆる異常ヘ
モグロビン（Ｋ．Ｉｍａｉ，Ａｌｌｏａｔｅｒｌｅ Ｅ
ｆｆｅｃｔｓ ｉｎ Ｈａｅｍｏｇｌｏｂｉｎ，Ｃａｍ
ｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１
９８０参照）あるいはピリドキサール−リン酸例えば、
ピリドキサール−５′−リン酸、２−ノル−２−ホルミ
ルピリドキサール−５′−リン酸、ピリドキサール−硫
酸、例えばピリドキサール−５′−硫酸、グリセリンリ
ン酸類、例えばグリセリン−２，３−ジリン酸、糖リン
酸、例えばグルコース−６−リン酸、アデノシン−５′
−リン酸等のヘモグロビン誘導体であってもよい。

【００１０】ヘモグロビンの反応時の濃度は、０．５〜
２０％（重量）程度、好ましくは０．５〜１０％（重
量）程度である。しかしながら、アミノ酸等が共存せず
ヘモグロビン濃度が４％を越えた場合には、架橋反応が
進んで高分子化しゲル化しやすくなるので反応の管理に
注意を要する。一方、ヘモグロビンが低濃度になると反
応容器が大型化するとともに反応後に濃縮が必要になる
ので好ましくない。ポリオキシアルキレンの使用量は、
ヘモグロビン１モルに対して１〜５０モル程度、好まし
くは２〜１０モル程度である。

【００１１】ポリオキシアルキレンとヘモグロビンとの
結合反応においてアミノ酸又はアミンを共存させること
により、生成するヘモグロビン−ポリオキシアルキレン
結合体の分子量をコントロールすることができる。これ
はポリオキシアルキレンの活性化されたカルボキシル基
の一部にアミノ酸又はアミンを結合させてヘモグロビン
への結合を阻止することによる。この方法により、ヘモ
グロビンを希薄溶液としなくとも好ましい結合体を得る
ことができる。反応時に存在せしめるアミノ酸は、例え
ば蛋白質の構成アミノ酸を使用すればよく、リジン、ア
ルギニン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸、グリシン、
フェニルアラニン等の中性アミノ酸、グルタミン酸、ア
スパラギン酸等の酸性アミノ酸が例示される。一方、ア
ミンはアンモニア、脂肪族アミン、芳香族アミンのいず
れでもよいが、本物質が血流内に投与される関係から安
全性の高いものが好ましい。アミノ酸及びアミンは１種
であってもよく、２種以上であってもよい。アミノ酸又
はアミンのアミノ基が第３級である場合には活性エステ
ルの分解を触媒することによりヘモグロビンと結合して
いないポリオキシアルキレンの末端は−Ｏ−（ＣＨ₂ ）
_n −ＣＯＯＨの形をとる。一方、第１級又は第２級の場
合には末端が−Ｏ−（ＣＨ₂ ）_n −ＣＯＮＨＲとなり、
Ｒの種類によってヘモグロビン表面の電荷や疎水性を変
えることができる。これによって本発明の結合体を代用
血液に用いた場合に生体内の血液との混合によって接す
る赤血球、白血球、血漿タンパク等との相互作用を変え
て免疫的認識等を好ましい方向に変えることができる。
アミノ酸の使用量はヘモグロビン１モルに対し１〜１０
０モル程度、好ましくは５〜２０モル程度である。

【００１２】ヘモグロビンとポリオキシアルキレンとを
結合させる反応時に、酸素不存在か酸素低濃度とするの
が好ましい、酸素分圧として０〜３０ｍｍＨｇ程度を選
択すればよい。上記酸素濃度以外の反応条件は、ヘモグ
ロビンの変性を伴わない条件であればいずれであっても
よい。酸素の濃度を低下させるには、窒素、アルゴン、
ヘリウム等の不活性ガスで反応容器中の空気を置換する
方法、容器中の酸素を還元剤（ＮａＢＨ₄ ，Ｎａ₂ Ｓ₂
Ｏ₃ 等）によって還元し除去する方法、ポンプ等で脱ガ
スしアルゴン等の不活性ガスで置換する方法等、公知の
方法を採用することができる。

【００１３】このようにして得られたヘモグロビン−ポ
リアルキレン結合体を凍結乾燥して製剤化する。本発明
のヘモグロビン−ポリオキシアルキレン結合体の凍結乾
燥製剤を調製するには、該結合体水溶液にマルトースの
水溶液を添加して、常法により凍結乾燥することにより
達成できる。結合体に対するマルトースの混合割合は、
結合体１に対し重量比で０．１〜２．０とするのが適当
である。例えば、２〜２０ｗ／ｖ％の結合体水溶液にマ
ルトースを結合体に対して０．１〜２．０倍量、保存安
定性のうえから好ましくは０．５〜１．２倍量となるよ
うにマルトース水溶液を加えて混合した後、−３５℃〜
−５０℃、２０〜６０分で凍結し、減圧下棚温１０〜５
０℃で５〜７０時間乾燥することにより凍結乾燥製剤を
得ることができる。さらに、保存安定性のうえから、と
くにヒスチジン、グルタミン、トリプトファンなどのア
ミノ酸を添加するのが有効である。これらのアミノ酸は
マルトースに比べて少量でよく、結合体１に対し重量比
で０．１〜１とするのが適当である。結合体水溶液とマ
ルトース溶液の混合及び凍結乾燥は、従来公知の安定化
剤を微量添加するようにしてもよく、晶質浸透圧調整の
ための塩類（ＮａＣｌ，ＫＣｌ，ＣａＣｌ₂ ，ＡｃＯＮ
ａ等）を添加することにより凍結乾燥品の安定性はさら
に高まる。

【００１４】

【作用】本発明のヘモグロビン−ポリオキシアルキレン
結合体は、エーテル結合を介してカルボン酸が結合した
形のポリオキシアルキレンを用いることによって、ヘモ
グロビンの酸素親和力を低下させないばかりでなく、安
定性の高い結合体になっている。

【００１５】例えばポリオキシエチレン４０００の末端
が−ＯＣＯ（ＣＨ₂ ）₂ ＣＯＯＨ，−ＮＨＣＯ（Ｃ
Ｈ₂ ）₂ ＣＯＯＨ，−Ｏ−ＣＨ₂ ＣＯＯＨの３種のポリ
オキシエチレンを調製し、これらのポリオキシエチレン
と結合させた３種のポリオキシエチレン−ヘモグロビン
結合体の加水分解反応に対する抵抗性を比較したところ
次のような結果が得られた。すなわち、上記エステル型
（Ｉ）、アミド型（II）、エーテル型（III)の各々５％
水溶液（ｐＨ７．０ ０．１規定リン酸緩衝液）を３５
℃で１週間インキュベートし、分解によって生じたポリ
オキシエチレンを定量したところ、III ＞II＞Ｉの順と
なった。そこで、最も安定性が秀れているのがエーテル
型である事が明らかとなった。

【００１６】また、この結合体の凍結乾燥製剤を製造す
る際にマルトースを加えておくことにより、これらはヘ
モグロビン−ポリオキシアルキレン結合体の安定化剤と
して作用する。

【００１７】

【実施例】以下実施例で本発明の詳細を説明する。な
お、これらの実施例において、生成物の分子量はプレパ
ックドゲル（Ｐｒｅｐａｃｋｅｄ）型カラムＳＷ３００
０Ｇ（東洋ソーダ（株）、日本）を用い高速液体クロマ
トグラフィーより測定した。なお用いた展開溶媒は０．
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ＝６．８）を使用し、分子量は
ファルマシア社製（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃ
ｈｅｍ．，Ｓｗｅｄｅｎ）の分子量決定のための標準タ
ンパク質キットを用いて検量線を求め、溶出量より推定
した。

【００１８】またヘモグロビン１分子当りの結合ポリア
ルキレン分子数は、限外濾過により完全に塩類と未反応
ポリオキシアルキレンを除去して、凍結乾燥（脱水）し
た後、重量測定し、その後吸光度より算出して当該サン
プル中のヘモグロビン量を差引く事によって求めた。

【００１９】またえられた安定化ヘモグロビンの酸素解
離曲線の測定はｐＨ７．４の０．１Ｍリン酸緩衝液を用
い、今井らの方法（Ｋ．Ｉｍａｉ．Ｈ．Ｍｏｒｉｍｏｔ
ｏ，Ｍ．Ｋｏｔａｎｉ，Ｈ．Ｗａｋａ，Ｍ．Ｋｕｒｏｄ
ａ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，２
００，１８９〜１９６（１９７０））によっておこなっ
た。

【００２０】実施例１ 分子量１０００ダルトンのポリオキシエチレン（Ａｌｄ
ｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，ＵＳＡ）３０ｇ
（３０ｍモル）と３−クロロプロピオン酸エチル１６．
４ｇ（１２０ｍモル）を乾燥したジメチルホルムアミド
７００ｍｌに溶解し、これに２０ｇの酸化銀を加え７０
℃で２４時間反応したのち沈殿物を濾過により除去し
た。えられた濾液は３ｌの冷却したエチルエーテル中に
そそぎ、ポリオキシエチレン誘導体を沈澱させた。沈殿
物はエチルエーテルで洗浄後乾燥し、水３００ｍｌに再
び溶かし、１規定水酸化ナトリウム水溶液をｐＨ１１以
上になるまで加え、６０℃で一夜撹拌してエステルの加
水分解をおこなった。１規定塩酸で反応液を中和してｐ
Ｈ５とし、濃縮、乾固した。えられた生成物は塩化メチ
レン−エーテルの１：１混合溶液２００ｍｌに溶かし不
溶物を濾別したのち濃縮し、白色粉末を沈殿によってえ
た。えられた固型物を水１００ｍｌに溶解したのち強塩
基性イオン交換樹脂Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＡＧＩＸ２（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）にか
け、吸着物を０．０５規定塩酸で溶離した。生成物は１
８ｇの白色結晶であった。この生成物（ポリオキシエチ
レンのジカルボン酸誘導体）１０ｇとＮ−ヒドロキシコ
ハク酸イミド６．５ｇ（５６．５ミリモル）をジメチル
ホルムアミド２００ｍｌに溶かし、ジシクロヘキシルカ
ルボジイミドで脱水縮合してポリオキシエチレン１００
０の活性エステル９．８ｇをえた。一方ウシの新鮮赤血
球１００ｍｌを０．９％食塩水に浮遊させ遠心分離機を
用いて４℃で４回洗浄した。ウシ洗浄赤血球６０ｍｌを
同容の注射薬用蒸留水を用いて溶血し孔径０．２２μの
フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏ．，ＵＳＡ）を
用いて膜成分を除いた。さらに残存する膜成分は遠心分
離機で６０００回転１時間遠心分離して除いた。えられ
たウシヘモグロビン溶液１０ｇを２００ｍｌのホウ酸
０．１モル緩衝液ｐＨ７．０に溶解し、えられた溶液
（０．１５ミリモル）に活性ポリオキシエチレン４．７
ｇ（３．５ミリモル）とリジン２１２ｍｇ（１．４５ミ
リモル）を加え、アルゴンで酸素分圧１ｍｍＨｇまで引
下げたあと４℃で２時間反応させた。えられた反応液は
分画分子量１０，０００ダルトンの限外濾過膜ＹＭ−１
０（Ａｍｉｃｏｎ Ｃｏ，ＵＳＡ）で未反応ポリオキシ
エチレンが１００ｐｐｍ以下になるまでくり返し精製し
た。生成した反応液のゲル濾過クロマトグラフィーにお
けるピークの面積比から原料ヘモグロビンは、ほとんど
残存せず、図１に例示するような単量体型（Ａ）、二量
体型（Ｂ）、三量体型（Ｃ）がほぼ５：３：１で混合し
ている事が判明した。尚、図中丸４つでヘモグロビン分
子を表わし、カギ形はポリオキシエチレンを表わしてい
る。またヘモグロビン分子１個あたりについているポリ
オキシエチレンの結合分子数は６．３個であった。また
Ｐ₅₀即ち酸素解離曲線において５０％の酸素が化学修飾
ヘモグロビンに配位する時の酸素分圧は２５℃で１３．
７ｍｍＨｇであった。また、結合ポリオキシエチレンの
末端にリジン基が存在する事が加水分解物のアミノ酸分
析より明らかにされた。

【００２１】実施例２ 特開昭５３−１４１２１９（川研ファインケミカル
（株））に述べられている方法で調製した白金パラジウ
ム炭素触媒２０ｇと市販のポリオキシエチレン（日本油
脂（株）、日本）（Ｍａｃｒｏｇｏａｌ４０００）２０
０ｇを含む水溶液５００ｍｌを１．５ｌオートクレーブ
中に入れ、加圧空気を導入して圧力を１０ｋｇ／ｃｍ²
とし、９０℃で１０時間反応させた。反応生成物は濾過
により触媒を除去したのち、活性炭で処理し、さらに水
から再結晶し１８０ｇの両末端にカルボキシル基を有す
るポリオキシエチレンの酸誘導体（α−カルボキシメチ
ル−ω−カルボメトキシポリ（エチレンオキシド））を
えた。この分子量約４０００のポリオキシエチレンの酸
誘導体２０ｇ（５ミリモル）、Ｎ−ヒドロキシコハク酸
イミド４ｇ及びジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣ
Ｃ）７ｇをジメチルホルムアミド１００ｍｌに溶かし一
夜撹拌した。生成した結晶のジシクロヘキシル尿素を分
離したのち、エチルエーテル４００ｍｌを加えてポリオ
キシエチレンの活性化エステル１７ｇを沈殿させ、濾別
後更にエーテルで洗浄した。一方期限切れ輸血用血液よ
り得られたヒト赤血球５０ｍｌを０．９％の食塩水５０
ｍｌで遠心分離機を用いて４℃で４回洗浄した。上記の
操作でえられた洗浄赤血球４０ｍｌを注射薬用蒸留水４
０ｍｌに加えて溶血したあと、２０ｍｌのトルエンにて
膜成分を抽出した。えられたヘモグロビン液は８０００
回転で１時間遠心分離を行う事によって更に膜成分とヘ
モグロビンを分離した。ヘモグロビン溶液は０．１Ｍリ
ン酸緩衝液に溶解し濃度を６ｇ／ｄｌ（０．０８８ｍ
Ｍ），ｐＨ７．０とした。ついでこのヘモグロビン溶液
１．００ｍｌに酸素分圧が２ｍｍＨｇ以下になるまで激
しくアルゴンをふき込む事により脱酸素したのち、ベネ
シェらの方法（Ｒ．Ｂｅｎｅｓｃｈ，Ｓ．Ｋｗｏｎｇ，
Ａ．Ａｃｈａｒｙａ，Ｊ．Ｍａｎｎｉｎｇ，Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ２５７（３）１３２０−２４（１９８
２））によりピリドキサール−５′−リン酸を付加し、
ピリドキサール化ヘモグロビン（６ｇ／ｄｌ）をえた。
これにグリシン１６０ｍｇを加えた後、上記の方法でえ
たポリオキシエチレンの活性化エステル７．２ｇを加
え、３０分４℃で反応した。ついで、１規定水酸化ナト
リウム水溶液を加えｐＨ７．８にしたのち更に３０分反
応させた。反応液は分子量分画３万の限外濾過膜ＹＭ３
０（Ａｍｉｃｏｎ社、ＵＳＡ）により限外濾過をくり返
し、未反応のポリオキシエチレンの濃度が１００ｐｐｍ
以下にした。実施例１で述べたゲルタイプの充填カラム
を用いた高速液体クロマトグラフィーから生成物の分子
量は約９．８万ダルトンと推定された。なおポリオキシ
エチレンのヘモグロビンと結合していない方の末端には
グリシンが結合している。かくして得られた６．０％の
修飾ヘモグロビン溶液に塩類（ＮａＣｌ，ＫＣｌ，ＣＨ
₃ ＣＯＯＮａ等の混合物）を溶解した液４部にグルコー
ス溶液あるいはマルトース溶液１部を添加して表１のよ
うに糖濃度の異なる種々の修飾ヘモグロビン溶液を調製
し常法通り棚温２０℃で１８時間凍結乾燥し、製剤とし
た。この製剤の凍乾直後及び３０℃で保存した時のメト
ヘモグロビンの全ヘモグロビンに対する割合（以下、
「メト化率」という。）をそれぞれ表１に示した（ｎ＝
２〜４）。その結果、マルトースがグルコースより安定
化剤として優れていることが判明した。特に４〜６％の
濃度（修飾ヘモグロビンに対して約０．８〜１．２倍
量）で効果が大きく、濃度が高い程安定である。

【００２２】

【表１】

【００２３】実施例３ 市販のプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｐ１２３、分
子量４０００ダルトン（エチレンオキサイドとプロピレ
ンオキサイドのブロック共重体（ＢＡＳＦ Ｗａｙａｎ
ｄｏｔｔｅ Ｃｏ，ＵＳＡ））２０ｇ（５ミリモル）を
よく脱水したジオキサン中１ｇの金属ナトリウムと反応
させ、プルロニックの２ナトリウム塩をえた。沈殿物を
濾過後、この濾過液に、モノクロロ酢酸エチルエステル
２ｍｌを滴下し５０℃で２４時間反応させた。えられた
反応液は実施例１で述べた方法により、エステルを加水
分解後、沈殿をくり返す事により精製した。更にプルロ
ニックの両末端にカルボキシル基を有するこのポリアル
キレングリコール誘導体は実施例２で述べた方法を用い
てＮ−ヒドロキシコハク酸イミドと反応させ活性エステ
ルとした。一方実施例２の方法によってえられたヒトヘ
モグロビンの６％溶液（０．０９ミリモル）１００ｍｌ
（ｐＨ７．４のホウ酸緩衝溶液）に窒素ガスを吸込む事
により酸素分圧を５ｍｍＨｇに下げたのち、上記によっ
てえられたプルロニックの活性エステル７ｇ（１．７ミ
リモル）とＬ−アラニン２５０ｍｇ（２．８ミリモル）
を加え４℃で１時間反応させた。次いでｐＨ７．８に上
げ更に３０分撹拌し実施例１の方法で精製した。高速液
体クロマトグラフィーによって推定した分子量は９５，
０００ダルトン、ヘモグロビン分子１個あたりのプルロ
ニック結合数は４．８であった。また酸素解離曲線より
推定された５０％酸素解離圧（Ｐ₅₀）は２５℃で６．１
ｍｍＨｇであった。

【００２４】実施例４ ポリオキシエチレンメチルエーテル分子量１９００（Ａ
ｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．ＵＳＡ）１５
ｇ（７．９ミリモル）を乾燥したジクロロメタンに溶解
し、３０ｇの活性化二酸化マンガンを加え、室温で一夜
撹拌し反応させた。濾過により触媒を分離したのち、ア
ルデヒド型に酸化されたポリオキシエチレン誘導体は、
溶媒を減圧下で留去したのち３％の過酸化水素水５００
ｍｌに溶解し２４時間反応させた。反応液はＢｉｏ−Ｒ
ａｄ ＡＧＩ×２を充填したカラムを通し中性物を除去
したのち０．０２Ｍ ＨＣｌで末端にカルボキシル基を
有するポリオキシエチレン誘導体を分離した。この酸誘
導体５ｇ（２．６ミリモル）を乾燥したジメチルホルム
アミド１００ｍｌに溶解し０．８ｇ（７．０ミリモル）
のＮ−ヒドロキシコハク酸イミドと１．５ｇ（７．２ミ
リモル）のジシクロヘキシルカルボジイミドを加えて一
夜室温で反応させた。不溶物を濾別後、乾燥エーテルを
沈殿が生成するまで加え活性化エステルをえた。一方、
実施例２により調製したヒトヘモグロビンの６％溶液３
００ｍｌを２０倍過剰のグリオキザール酸とＨＥＰＥＳ
緩衝液中でディドナートらの方法（Ａ．Ｄｉｄｏｎａｔ
ｏ，Ｗ．Ｆａｒｔｌ，Ａ．Ａｃｈａｒｙａ，Ｊ．Ｍａｎ
ｎｉｎｇ，Ｍ．Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．２５８（１９）１
１８９０〜８９５（１９８３））で反応させひきつづき
ＮａＢＨ₃ ＣＮで還元した。えられたカルボキシメチル
化したヘモグロビンはセファデックスＧ−１００で低分
子物質を除き、さらに０．１Ｍのリン酸緩衝液で５．２
ｇ／１００ｍｌの溶液とし、４．８ｇの上記の手法によ
ってえられたポリオキシエチレンモノメチルエーテルの
活性化エステルと５℃２時間反応させた。生成物は実施
例１の限外濾過の手法で精製した。前記の高速液体クロ
マトグラフィーで測定した分子量は８．２万ダルトン、
Ｐ₅₀＝１２ｍｍＨｇ（２５℃，ｐＨ７．４）であった。

【００２５】実施例５ ポリオキシエチレン平均分子量８，０００ダルトン（Ａ
ｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．ＵＳＡ）２０
ｇ（２．５ミリモル）を用い実施例２で示した方法で該
当するポリオキシエチレンの両末端に−Ｏ−ＣＨ₂ −Ｃ
Ｏ₂ Ｈを持つカルボン酸をえた。このカルボン酸をＢｉ
ｏ−Ｒａｄ ＡＧＩ×２の樹脂で精製したあと実施例２
の方法でＮ−ヒドロキシコハク酸イミドと反応させ活性
エステルとした。一方実施例１で示した方法によってえ
られたウシヘモグロビン７ｇを用い、これをｐＨ７．４
のリン酸緩衝液に溶解して０．１Ｍ溶液（１００ｍｌ）
を作り、前記ベネシェらの方法でピリドキサール−５′
−リン酸と反応させ、ひきつづき水素化ホウ素ナトリウ
ム（ＮａＢＨ₄ ）で還元した。この溶液を高純度窒素で
脱酸素後、Ｎ−ジメチルグリシン１５００ｍｇと４．８
ｇの活性化ポリオキシエチレンエステルを加え４℃の低
温で１時間反応させた。反応液は実施例１で述べた方法
を用いて低分子量の物質を除き精製した。シアンメトヘ
モグロビン法でヘモグロビン濃度を測定した。収率はウ
シヘモグロビンから計算して６３％であった。また平均
分子量１２万ダルトン、６％のヘモグロビン濃度の溶液
の粘度は２．８ｃｐｓであった。今井の方法（前述）で
測定した酸素解離曲線からＰ₅₀＝１９ｍｍＨｇ（２５
℃，ｐＨ＝７．４）がえられた。上記標準修飾ヘモグロ
ビン溶液（ヘモグロビン濃度６．０％）１００ｍｌにマ
ルトース３．４ｇ（対ヘモグロビン０．５６倍）及び実
施例２で示した塩類を適量加え、浸透圧を２８０ｍＯｓ
ｍｏｌに調整した。この溶液から実施例２と同様に製剤
を調製し、１０℃で保存した結果を表２に示した（ｎ＝
６）。その結果、マルトースと塩類を添加した修飾ヘモ
グロビンは非常に安定な製剤となることを確認した。

【００２６】

【表２】

【００２７】実施例６ １０．９％のヒトヘモグロビン溶液２０ｍｌ（０．０３
４ミリモル）を０．１２２Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ６．
８）９０ｍｌに溶解した液に容量２００ｍｌの三つ口フ
ラスコに入れ、アルゴンガスを１時間通気した。引き続
き、アルゴンガスを通気しつつ、ピリドキサール５リン
酸エステル−水和物３３ｍｇ（０．１２５ミリモル）を
加え、さらに１時間アルゴンガスを通気した後、水素化
ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ₄ ）２５ｍｇ（０．６６ミ
リモル）を加えてさらに１時間アルゴンガスを通気し、
溶液１を得た。一方、ポリオキシエチレン（Ａｌｄｒｉ
ｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．ＵＳＡ、平均分子量３
４００）をジョーンズ試薬で酸化し、両端にカルボキシ
メチル基を有するポリオキシエチレンを調整し、これと
Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドとを反応させて活性化ポ
リオキシエチレン（α−カルボキシメチル−ω−カルボ
メトキシポリ（エチレンオキシド）のＮ−ヒドロキシコ
ハク酸イミドエステル）を得た。溶液１に活性化ポリオ
キシエチレン３．２９ｇ（０．９１ミリモル）を加えて
４℃で一夜撹拌した後に分子量阻止３０，０００の限外
濾過膜により限外濾過を繰り返し、未反応の活性エステ
ルまたはその分解物を除去することにより、４．５％の
修飾ヘモグロビン溶液４１ｍｌを得た。これを標準修飾
ヘモグロビン溶液とする。なお、この修飾ヘモグロビン
は分子量約８６，０００ダルトン、置換度６．２であっ
てＰ₅₀（リン酸緩衝液、ｐＨ７．４０，２５℃）は１
１．０ｍｍＨｇであった。上記標準修飾ヘモグロビン溶
液（ヘモグロビン濃度６．３％）に塩類＊を溶解した液
４部にグルコース溶液あるいはマルトース溶液１部を添
加して表３のように糖濃度の異なる種々の修飾ヘモグロ
ビン溶液を調整し常法通り棚温２０℃で１８時間凍結乾
燥し、製剤とした。この製剤の凍乾直後及び３０℃で保
存した時のメト化率をそれぞれ表３に示した。その結
果、実施例２と同様にマルトースがグルコースより安定
化剤として優れ、特に４〜６％の濃度（修飾ヘモグロビ
ンに対して約０．８〜１．２倍量）で効果が大きく、濃
度が高い程安定であることを再確認した。 ＊ＮａＣｌ，ＫＣｌ，ＣＨ₃ ＣＯＯＮａ等の混合物

【００２８】

【表３】

【００２９】実施例７ 上記標準修飾ヘモグロビン溶液（ヘモグロビン濃度９．
６，６．４，３．２，０．９６％）各３０ｍｌにマルト
ース１．８ｇ（対ヘモグロビン０．６，０．９，１．
９，６．３倍量）をそれぞれ溶解した溶液を常法通り、
棚温２０℃で１８時間凍結乾燥し、各々の製剤を調製し
た。これらの製剤の凍結乾燥後の初期メト化率と２５℃
で保存したときのメト化率の上昇値を表４に示した。そ
の結果、ヘモグロビンに対し重量比で１．９まで添加し
た場合にはその添加量に伴って強いメト化の抑制効果が
見られるが、それ以上ではその効果は頭打ち傾向がある
ことが判明した。

【００３０】

【表４】

【００３１】実施例８ 上記標準修飾ヘモグロビン溶液（ヘモグロビン濃度１
０．０％）４部にグルコース溶液またはマルトース溶液
１部を添加し、表５のように糖濃度の異なる種々の修飾
ヘモグロビン溶液を調製し、常法通り凍結乾燥し、製剤
を調製した。また、塩類を添加し、同様の手順で表６の
様に糖濃度の異なる種々の塩類添加修飾ヘモグロビン溶
液を調製し、凍結乾燥した製剤も調製した。これらの製
剤を２５℃で保存した時のメト化率の上昇を表５及び表
６に示した。その結果、明らかに同一濃度ではマルトー
スはグルコースより安定化効果が大きく、また同一糖濃
度では塩類を加えたものの方が無添加のものより安定性
が大きく、塩類にもメト化防止効果があることが判明し
た。このとき添加する塩類の組成は、Ｎａ，Ｋ，Ｃｌ，
Ｃａ，Ｍｇ各イオンが血漿正常レベルとほぼ等しくなる
様調整することが代用血液として使用する場合には望ま
しい。

【００３２】

【表５】

【００３３】

【表６】

【００３４】実施例９ 上記標準修飾ヘモグロビン溶液（ヘモグロビン濃度９．
６％）１００ｍｌにマルトース８ｇ（対ヘモグロビン
０．８３倍量）を溶解した溶液を常法通り凍結乾燥し製
剤を調製した。この製剤の１０℃での保存試験を１２ヶ
月間行った時のメト化率を表７に示した（ｎ＝６）。そ
の結果１０℃保存ではかなり安定であり十分実用に耐え
ることが確認された。

【００３５】

【表７】

【００３６】実施例１０ 上記標準修飾ヘモグロビン溶液（ヘモグロビン濃度９．
０％）１００ｍｌにマルトース５ｇ（対ヘモグロビン
０．５６倍量）及び上記塩類を適量加え、浸透圧を２８
０ｍＯｓｍｏｌに調整した溶液を実施例１と同様に製剤
を調製し、１０℃で保存した結果を表８に示した（ｎ＝
６）。その結果、マルトースと塩類を添加した修飾ヘモ
グロビンは非常に安定な製剤となることを確認した。

【００３７】

【表８】

【００３８】

【発明の効果】本発明のヘモグロビン−ポリオキシアル
キレン結合体はヘモグロビンを変性させず酸素親和力を
損なわない。また、安定性が高く、製剤化工程及び保存
時においてその活性を長く維持する。また、安定化剤と
してマルトース、グルコース、アミノ酸、塩類などを添
加した本発明の凍結乾燥製剤は、メト化防止および長期
安定性にきわめてすぐれている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 矢吹 昭 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味 の素株式会社 中央研究所内 (72)発明者 岩下 雄二 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味 の素株式会社 中央研究所内 審査官 吉住 和之 (56)参考文献 特開 昭59−104323（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−89629（ＪＰ，Ａ) 特開 昭57−206622（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−53223（ＪＰ，Ａ)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ポリオキシアルキレン末端とヘモグロビ
   ンのアミノ基との結合部分が下記の構造式よりなるヘモ
   グロビン−ポリオキシアルキレン結合体 【化１】 −ＣＨ_２−Ｏ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＯＮＨ−Ｈｂ （式中、Ｈｂはヘモグロビンを表わし、ｎ＝１〜７であ
   る。）とマルトースを含有する凍結乾燥製剤。
2. 【請求項２】 ヘモグロビン−ポリオキシアルキレン結
   合体１に対してマルトースを重量比で０．１〜２．０含
   有する請求項２記載の凍結乾燥製剤。