JP2501543B2 - ヘモグロビン−ポリオキシアルキレン結合体凍結乾燥製剤 - Google Patents
ヘモグロビン−ポリオキシアルキレン結合体凍結乾燥製剤Info
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- JP2501543B2 JP2501543B2 JP6057162A JP5716294A JP2501543B2 JP 2501543 B2 JP2501543 B2 JP 2501543B2 JP 6057162 A JP6057162 A JP 6057162A JP 5716294 A JP5716294 A JP 5716294A JP 2501543 B2 JP2501543 B2 JP 2501543B2
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Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、代用血液中に必要な酸
素運搬物質として使用する新規なヘモグロビン−ポリオ
キシアルキレン結合体の凍結乾燥製剤に関する。
素運搬物質として使用する新規なヘモグロビン−ポリオ
キシアルキレン結合体の凍結乾燥製剤に関する。
【0002】
【従来の技術】代用血液に使用する酸素運搬物質として
ヘモグロビン−ポリオキシアルキレン結合体が血流内寿
命を大幅に延ばすことができる点で優れていることは既
に明らかにされている(特開昭56−12308号、5
7−206622号明細書参照。)。
ヘモグロビン−ポリオキシアルキレン結合体が血流内寿
命を大幅に延ばすことができる点で優れていることは既
に明らかにされている(特開昭56−12308号、5
7−206622号明細書参照。)。
【0003】
【発明が解決しようとする問題点】ヘモグロビンが生体
成分であるところから、ポリオキシアルキレンを結合さ
せることによりヘモグロビンが変性したり酸素親和性を
減少させたりする問題があった。さらに、得られたヘモ
グロビン−ポリオキシアルキレン結合体の保存性特にポ
リオキシアルキレン−ヘモグロビン間の結合の安定性に
も問題があった。さらに、代用血液として使用する修飾
ヘモグロビンの凍結乾燥製剤の調製に際しては、いわゆ
る安定化剤を添加することによりメトヘモグロビンの生
成や不溶物の生成を防止することが知られており、この
安定化剤として、例えば亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素
ナトリウム、硫酸第一鉄等の抗酸化剤、EDTA等のア
ミンおよびその塩が提案されている。しかし、無機抗酸
化剤は人体に有害であり不溶物の生成量が多く、また、
EDTAは長期保存時の安定性が悪く、何れもメトヘモ
グロビンの発生を効率よく防止することが困難である等
の問題があった。
成分であるところから、ポリオキシアルキレンを結合さ
せることによりヘモグロビンが変性したり酸素親和性を
減少させたりする問題があった。さらに、得られたヘモ
グロビン−ポリオキシアルキレン結合体の保存性特にポ
リオキシアルキレン−ヘモグロビン間の結合の安定性に
も問題があった。さらに、代用血液として使用する修飾
ヘモグロビンの凍結乾燥製剤の調製に際しては、いわゆ
る安定化剤を添加することによりメトヘモグロビンの生
成や不溶物の生成を防止することが知られており、この
安定化剤として、例えば亜硫酸ナトリウム、亜硫酸水素
ナトリウム、硫酸第一鉄等の抗酸化剤、EDTA等のア
ミンおよびその塩が提案されている。しかし、無機抗酸
化剤は人体に有害であり不溶物の生成量が多く、また、
EDTAは長期保存時の安定性が悪く、何れもメトヘモ
グロビンの発生を効率よく防止することが困難である等
の問題があった。
【0004】
【問題点を解決するための手段】本発明者は、長期安定
性にすぐれた修飾ヘモグロビンの凍結乾燥製剤を鋭意検
討した結果、末端にエーテル結合を介してカルボキシル
基を有するポリオキシアルキレンを用いてこれにヘモグ
ロビンをアミド結合させて得られた結合体にマルトース
を共存させて凍結乾燥することにより、上記問題点を解
決することを見いだし本発明を完成させるに至った。す
なわち本発明は、ポリオキシアルキレン末端とヘモグロ
ビンのアミノ基との結合部分が下記の構造式よりなるヘ
モグロビン−ポリオキシアルキレン結合体
性にすぐれた修飾ヘモグロビンの凍結乾燥製剤を鋭意検
討した結果、末端にエーテル結合を介してカルボキシル
基を有するポリオキシアルキレンを用いてこれにヘモグ
ロビンをアミド結合させて得られた結合体にマルトース
を共存させて凍結乾燥することにより、上記問題点を解
決することを見いだし本発明を完成させるに至った。す
なわち本発明は、ポリオキシアルキレン末端とヘモグロ
ビンのアミノ基との結合部分が下記の構造式よりなるヘ
モグロビン−ポリオキシアルキレン結合体
【0005】
【化2】 −CH2−O−(CH2)n−CONH−Hb
【0006】(式中、Hbはヘモグロビンを表わし、n
=1〜7である。)とマルトースを含有する凍結乾燥製
剤、に関するものである。
=1〜7である。)とマルトースを含有する凍結乾燥製
剤、に関するものである。
【0007】以下本発明を詳細に説明する。本発明で用
いられるポリオキシアルキレンは、例えばポリオキシエ
チレン(エチレンオキサイドの重合体でポリエチレング
リコールともいう。)、ポリオキシプロピレンあるいは
エチレンオキサイドとプロピレンオキサイドとの共重合
体等水溶性の高い重合物であり、その分子量は300〜
20,000、製造される結合体の粘度等の観点から好
ましくは750〜10,000、特に好ましくは100
0〜6000、の範囲内にあるものである。ポリオキシ
アルキレンの末端とカルボキシル基部分との間の結合に
はエステル結合、アミド結合、エーテル結合等が考えら
れる。これらの結合のうちで特にエーテル結合が有効で
あることを見出してなされたのが本発明である。従っ
て、本発明のヘモグロビン−ポリオキシアルキレン結合
体の合成に使用されるポリオキシアルキレンはヘモグロ
ビンを結合させる末端が−O−(CH2 )n −COOH
に変換されているものである。nは1〜10程度であ
り、1〜7程度、特に1〜3程度のものが選択されるこ
とが多い。
いられるポリオキシアルキレンは、例えばポリオキシエ
チレン(エチレンオキサイドの重合体でポリエチレング
リコールともいう。)、ポリオキシプロピレンあるいは
エチレンオキサイドとプロピレンオキサイドとの共重合
体等水溶性の高い重合物であり、その分子量は300〜
20,000、製造される結合体の粘度等の観点から好
ましくは750〜10,000、特に好ましくは100
0〜6000、の範囲内にあるものである。ポリオキシ
アルキレンの末端とカルボキシル基部分との間の結合に
はエステル結合、アミド結合、エーテル結合等が考えら
れる。これらの結合のうちで特にエーテル結合が有効で
あることを見出してなされたのが本発明である。従っ
て、本発明のヘモグロビン−ポリオキシアルキレン結合
体の合成に使用されるポリオキシアルキレンはヘモグロ
ビンを結合させる末端が−O−(CH2 )n −COOH
に変換されているものである。nは1〜10程度であ
り、1〜7程度、特に1〜3程度のものが選択されるこ
とが多い。
【0008】ポリオキシアルキレンの末端をこのような
形に変換する方法としては、白金、パラジウムの炭素担
持触媒を用いて末端炭素を酸化する方法、活性化二酸化
マンガンで末端のオキシメチル基を酸化してアルデヒド
に変え、過酸化水素でさらに酸化してカルボン酸にする
方法、塩基の存在下でポリオキシアルキレンにハロゲン
化脂肪酸を反応させる方法、ジアゾ基を有する脂肪酸と
ポリオキシアルキレンを反応させる方法などを利用すれ
ばよい。このようにカルボキシル基を付与されたポリオ
キシアルキレンとヘモグロビンの反応に際して、例えば
N−ヒドロキシコハク酸イミド、N−ヒドロキシフタル
酸イミド、p−ニトロフェノール、ペンタクロロフェノ
ール等通常のペプチド合成におけるカルボン酸活性化剤
により活性エステルとし、これとヘモグロビンと反応さ
せてアミド交換することもできるし、塩化チオニル等ハ
ロゲン化剤を作用させてポリオキシアルキレンの酸ハロ
ゲン化物とし、これとヘモグロビンとを反応させること
もできる。
形に変換する方法としては、白金、パラジウムの炭素担
持触媒を用いて末端炭素を酸化する方法、活性化二酸化
マンガンで末端のオキシメチル基を酸化してアルデヒド
に変え、過酸化水素でさらに酸化してカルボン酸にする
方法、塩基の存在下でポリオキシアルキレンにハロゲン
化脂肪酸を反応させる方法、ジアゾ基を有する脂肪酸と
ポリオキシアルキレンを反応させる方法などを利用すれ
ばよい。このようにカルボキシル基を付与されたポリオ
キシアルキレンとヘモグロビンの反応に際して、例えば
N−ヒドロキシコハク酸イミド、N−ヒドロキシフタル
酸イミド、p−ニトロフェノール、ペンタクロロフェノ
ール等通常のペプチド合成におけるカルボン酸活性化剤
により活性エステルとし、これとヘモグロビンと反応さ
せてアミド交換することもできるし、塩化チオニル等ハ
ロゲン化剤を作用させてポリオキシアルキレンの酸ハロ
ゲン化物とし、これとヘモグロビンとを反応させること
もできる。
【0009】本発明に使用するヘモグロビンは、ヒト、
ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、サル、ウサギ、ニワ
トリ等ヘモグロビンを有する動物由来のものであればよ
い。本明細書でいうヘモグロビンとは、いわゆる異常ヘ
モグロビン(K.Imai,Alloaterle E
ffects in Haemoglobin,Cam
bridge University Press,1
980参照)あるいはピリドキサール−リン酸例えば、
ピリドキサール−5′−リン酸、2−ノル−2−ホルミ
ルピリドキサール−5′−リン酸、ピリドキサール−硫
酸、例えばピリドキサール−5′−硫酸、グリセリンリ
ン酸類、例えばグリセリン−2,3−ジリン酸、糖リン
酸、例えばグルコース−6−リン酸、アデノシン−5′
−リン酸等のヘモグロビン誘導体であってもよい。
ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマ、イヌ、サル、ウサギ、ニワ
トリ等ヘモグロビンを有する動物由来のものであればよ
い。本明細書でいうヘモグロビンとは、いわゆる異常ヘ
モグロビン(K.Imai,Alloaterle E
ffects in Haemoglobin,Cam
bridge University Press,1
980参照)あるいはピリドキサール−リン酸例えば、
ピリドキサール−5′−リン酸、2−ノル−2−ホルミ
ルピリドキサール−5′−リン酸、ピリドキサール−硫
酸、例えばピリドキサール−5′−硫酸、グリセリンリ
ン酸類、例えばグリセリン−2,3−ジリン酸、糖リン
酸、例えばグルコース−6−リン酸、アデノシン−5′
−リン酸等のヘモグロビン誘導体であってもよい。
【0010】ヘモグロビンの反応時の濃度は、0.5〜
20%(重量)程度、好ましくは0.5〜10%(重
量)程度である。しかしながら、アミノ酸等が共存せず
ヘモグロビン濃度が4%を越えた場合には、架橋反応が
進んで高分子化しゲル化しやすくなるので反応の管理に
注意を要する。一方、ヘモグロビンが低濃度になると反
応容器が大型化するとともに反応後に濃縮が必要になる
ので好ましくない。ポリオキシアルキレンの使用量は、
ヘモグロビン1モルに対して1〜50モル程度、好まし
くは2〜10モル程度である。
20%(重量)程度、好ましくは0.5〜10%(重
量)程度である。しかしながら、アミノ酸等が共存せず
ヘモグロビン濃度が4%を越えた場合には、架橋反応が
進んで高分子化しゲル化しやすくなるので反応の管理に
注意を要する。一方、ヘモグロビンが低濃度になると反
応容器が大型化するとともに反応後に濃縮が必要になる
ので好ましくない。ポリオキシアルキレンの使用量は、
ヘモグロビン1モルに対して1〜50モル程度、好まし
くは2〜10モル程度である。
【0011】ポリオキシアルキレンとヘモグロビンとの
結合反応においてアミノ酸又はアミンを共存させること
により、生成するヘモグロビン−ポリオキシアルキレン
結合体の分子量をコントロールすることができる。これ
はポリオキシアルキレンの活性化されたカルボキシル基
の一部にアミノ酸又はアミンを結合させてヘモグロビン
への結合を阻止することによる。この方法により、ヘモ
グロビンを希薄溶液としなくとも好ましい結合体を得る
ことができる。反応時に存在せしめるアミノ酸は、例え
ば蛋白質の構成アミノ酸を使用すればよく、リジン、ア
ルギニン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸、グリシン、
フェニルアラニン等の中性アミノ酸、グルタミン酸、ア
スパラギン酸等の酸性アミノ酸が例示される。一方、ア
ミンはアンモニア、脂肪族アミン、芳香族アミンのいず
れでもよいが、本物質が血流内に投与される関係から安
全性の高いものが好ましい。アミノ酸及びアミンは1種
であってもよく、2種以上であってもよい。アミノ酸又
はアミンのアミノ基が第3級である場合には活性エステ
ルの分解を触媒することによりヘモグロビンと結合して
いないポリオキシアルキレンの末端は−O−(CH2 )
n −COOHの形をとる。一方、第1級又は第2級の場
合には末端が−O−(CH2 )n −CONHRとなり、
Rの種類によってヘモグロビン表面の電荷や疎水性を変
えることができる。これによって本発明の結合体を代用
血液に用いた場合に生体内の血液との混合によって接す
る赤血球、白血球、血漿タンパク等との相互作用を変え
て免疫的認識等を好ましい方向に変えることができる。
アミノ酸の使用量はヘモグロビン1モルに対し1〜10
0モル程度、好ましくは5〜20モル程度である。
結合反応においてアミノ酸又はアミンを共存させること
により、生成するヘモグロビン−ポリオキシアルキレン
結合体の分子量をコントロールすることができる。これ
はポリオキシアルキレンの活性化されたカルボキシル基
の一部にアミノ酸又はアミンを結合させてヘモグロビン
への結合を阻止することによる。この方法により、ヘモ
グロビンを希薄溶液としなくとも好ましい結合体を得る
ことができる。反応時に存在せしめるアミノ酸は、例え
ば蛋白質の構成アミノ酸を使用すればよく、リジン、ア
ルギニン、ヒスチジン等の塩基性アミノ酸、グリシン、
フェニルアラニン等の中性アミノ酸、グルタミン酸、ア
スパラギン酸等の酸性アミノ酸が例示される。一方、ア
ミンはアンモニア、脂肪族アミン、芳香族アミンのいず
れでもよいが、本物質が血流内に投与される関係から安
全性の高いものが好ましい。アミノ酸及びアミンは1種
であってもよく、2種以上であってもよい。アミノ酸又
はアミンのアミノ基が第3級である場合には活性エステ
ルの分解を触媒することによりヘモグロビンと結合して
いないポリオキシアルキレンの末端は−O−(CH2 )
n −COOHの形をとる。一方、第1級又は第2級の場
合には末端が−O−(CH2 )n −CONHRとなり、
Rの種類によってヘモグロビン表面の電荷や疎水性を変
えることができる。これによって本発明の結合体を代用
血液に用いた場合に生体内の血液との混合によって接す
る赤血球、白血球、血漿タンパク等との相互作用を変え
て免疫的認識等を好ましい方向に変えることができる。
アミノ酸の使用量はヘモグロビン1モルに対し1〜10
0モル程度、好ましくは5〜20モル程度である。
【0012】ヘモグロビンとポリオキシアルキレンとを
結合させる反応時に、酸素不存在か酸素低濃度とするの
が好ましい、酸素分圧として0〜30mmHg程度を選
択すればよい。上記酸素濃度以外の反応条件は、ヘモグ
ロビンの変性を伴わない条件であればいずれであっても
よい。酸素の濃度を低下させるには、窒素、アルゴン、
ヘリウム等の不活性ガスで反応容器中の空気を置換する
方法、容器中の酸素を還元剤(NaBH4 ,Na2 S2
O3 等)によって還元し除去する方法、ポンプ等で脱ガ
スしアルゴン等の不活性ガスで置換する方法等、公知の
方法を採用することができる。
結合させる反応時に、酸素不存在か酸素低濃度とするの
が好ましい、酸素分圧として0〜30mmHg程度を選
択すればよい。上記酸素濃度以外の反応条件は、ヘモグ
ロビンの変性を伴わない条件であればいずれであっても
よい。酸素の濃度を低下させるには、窒素、アルゴン、
ヘリウム等の不活性ガスで反応容器中の空気を置換する
方法、容器中の酸素を還元剤(NaBH4 ,Na2 S2
O3 等)によって還元し除去する方法、ポンプ等で脱ガ
スしアルゴン等の不活性ガスで置換する方法等、公知の
方法を採用することができる。
【0013】このようにして得られたヘモグロビン−ポ
リアルキレン結合体を凍結乾燥して製剤化する。本発明
のヘモグロビン−ポリオキシアルキレン結合体の凍結乾
燥製剤を調製するには、該結合体水溶液にマルトースの
水溶液を添加して、常法により凍結乾燥することにより
達成できる。結合体に対するマルトースの混合割合は、
結合体1に対し重量比で0.1〜2.0とするのが適当
である。例えば、2〜20w/v%の結合体水溶液にマ
ルトースを結合体に対して0.1〜2.0倍量、保存安
定性のうえから好ましくは0.5〜1.2倍量となるよ
うにマルトース水溶液を加えて混合した後、−35℃〜
−50℃、20〜60分で凍結し、減圧下棚温10〜5
0℃で5〜70時間乾燥することにより凍結乾燥製剤を
得ることができる。さらに、保存安定性のうえから、と
くにヒスチジン、グルタミン、トリプトファンなどのア
ミノ酸を添加するのが有効である。これらのアミノ酸は
マルトースに比べて少量でよく、結合体1に対し重量比
で0.1〜1とするのが適当である。結合体水溶液とマ
ルトース溶液の混合及び凍結乾燥は、従来公知の安定化
剤を微量添加するようにしてもよく、晶質浸透圧調整の
ための塩類(NaCl,KCl,CaCl2 ,AcON
a等)を添加することにより凍結乾燥品の安定性はさら
に高まる。
リアルキレン結合体を凍結乾燥して製剤化する。本発明
のヘモグロビン−ポリオキシアルキレン結合体の凍結乾
燥製剤を調製するには、該結合体水溶液にマルトースの
水溶液を添加して、常法により凍結乾燥することにより
達成できる。結合体に対するマルトースの混合割合は、
結合体1に対し重量比で0.1〜2.0とするのが適当
である。例えば、2〜20w/v%の結合体水溶液にマ
ルトースを結合体に対して0.1〜2.0倍量、保存安
定性のうえから好ましくは0.5〜1.2倍量となるよ
うにマルトース水溶液を加えて混合した後、−35℃〜
−50℃、20〜60分で凍結し、減圧下棚温10〜5
0℃で5〜70時間乾燥することにより凍結乾燥製剤を
得ることができる。さらに、保存安定性のうえから、と
くにヒスチジン、グルタミン、トリプトファンなどのア
ミノ酸を添加するのが有効である。これらのアミノ酸は
マルトースに比べて少量でよく、結合体1に対し重量比
で0.1〜1とするのが適当である。結合体水溶液とマ
ルトース溶液の混合及び凍結乾燥は、従来公知の安定化
剤を微量添加するようにしてもよく、晶質浸透圧調整の
ための塩類(NaCl,KCl,CaCl2 ,AcON
a等)を添加することにより凍結乾燥品の安定性はさら
に高まる。
【0014】
【作用】本発明のヘモグロビン−ポリオキシアルキレン
結合体は、エーテル結合を介してカルボン酸が結合した
形のポリオキシアルキレンを用いることによって、ヘモ
グロビンの酸素親和力を低下させないばかりでなく、安
定性の高い結合体になっている。
結合体は、エーテル結合を介してカルボン酸が結合した
形のポリオキシアルキレンを用いることによって、ヘモ
グロビンの酸素親和力を低下させないばかりでなく、安
定性の高い結合体になっている。
【0015】例えばポリオキシエチレン4000の末端
が−OCO(CH2 )2 COOH,−NHCO(C
H2 )2 COOH,−O−CH2 COOHの3種のポリ
オキシエチレンを調製し、これらのポリオキシエチレン
と結合させた3種のポリオキシエチレン−ヘモグロビン
結合体の加水分解反応に対する抵抗性を比較したところ
次のような結果が得られた。すなわち、上記エステル型
(I)、アミド型(II)、エーテル型(III)の各々5%
水溶液(pH7.0 0.1規定リン酸緩衝液)を35
℃で1週間インキュベートし、分解によって生じたポリ
オキシエチレンを定量したところ、III >II>Iの順と
なった。そこで、最も安定性が秀れているのがエーテル
型である事が明らかとなった。
が−OCO(CH2 )2 COOH,−NHCO(C
H2 )2 COOH,−O−CH2 COOHの3種のポリ
オキシエチレンを調製し、これらのポリオキシエチレン
と結合させた3種のポリオキシエチレン−ヘモグロビン
結合体の加水分解反応に対する抵抗性を比較したところ
次のような結果が得られた。すなわち、上記エステル型
(I)、アミド型(II)、エーテル型(III)の各々5%
水溶液(pH7.0 0.1規定リン酸緩衝液)を35
℃で1週間インキュベートし、分解によって生じたポリ
オキシエチレンを定量したところ、III >II>Iの順と
なった。そこで、最も安定性が秀れているのがエーテル
型である事が明らかとなった。
【0016】また、この結合体の凍結乾燥製剤を製造す
る際にマルトースを加えておくことにより、これらはヘ
モグロビン−ポリオキシアルキレン結合体の安定化剤と
して作用する。
る際にマルトースを加えておくことにより、これらはヘ
モグロビン−ポリオキシアルキレン結合体の安定化剤と
して作用する。
【0017】
【実施例】以下実施例で本発明の詳細を説明する。な
お、これらの実施例において、生成物の分子量はプレパ
ックドゲル(Prepacked)型カラムSW300
0G(東洋ソーダ(株)、日本)を用い高速液体クロマ
トグラフィーより測定した。なお用いた展開溶媒は0.
1Mリン酸緩衝液(pH=6.8)を使用し、分子量は
ファルマシア社製(Pharmacia Fine C
hem.,Sweden)の分子量決定のための標準タ
ンパク質キットを用いて検量線を求め、溶出量より推定
した。
お、これらの実施例において、生成物の分子量はプレパ
ックドゲル(Prepacked)型カラムSW300
0G(東洋ソーダ(株)、日本)を用い高速液体クロマ
トグラフィーより測定した。なお用いた展開溶媒は0.
1Mリン酸緩衝液(pH=6.8)を使用し、分子量は
ファルマシア社製(Pharmacia Fine C
hem.,Sweden)の分子量決定のための標準タ
ンパク質キットを用いて検量線を求め、溶出量より推定
した。
【0018】またヘモグロビン1分子当りの結合ポリア
ルキレン分子数は、限外濾過により完全に塩類と未反応
ポリオキシアルキレンを除去して、凍結乾燥(脱水)し
た後、重量測定し、その後吸光度より算出して当該サン
プル中のヘモグロビン量を差引く事によって求めた。
ルキレン分子数は、限外濾過により完全に塩類と未反応
ポリオキシアルキレンを除去して、凍結乾燥(脱水)し
た後、重量測定し、その後吸光度より算出して当該サン
プル中のヘモグロビン量を差引く事によって求めた。
【0019】またえられた安定化ヘモグロビンの酸素解
離曲線の測定はpH7.4の0.1Mリン酸緩衝液を用
い、今井らの方法(K.Imai.H.Morimot
o,M.Kotani,H.Waka,M.Kurod
a,Biochim.Biophys.Acta.,2
00,189〜196(1970))によっておこなっ
た。
離曲線の測定はpH7.4の0.1Mリン酸緩衝液を用
い、今井らの方法(K.Imai.H.Morimot
o,M.Kotani,H.Waka,M.Kurod
a,Biochim.Biophys.Acta.,2
00,189〜196(1970))によっておこなっ
た。
【0020】実施例1 分子量1000ダルトンのポリオキシエチレン(Ald
rich Chemical Co.,USA)30g
(30mモル)と3−クロロプロピオン酸エチル16.
4g(120mモル)を乾燥したジメチルホルムアミド
700mlに溶解し、これに20gの酸化銀を加え70
℃で24時間反応したのち沈殿物を濾過により除去し
た。えられた濾液は3lの冷却したエチルエーテル中に
そそぎ、ポリオキシエチレン誘導体を沈澱させた。沈殿
物はエチルエーテルで洗浄後乾燥し、水300mlに再
び溶かし、1規定水酸化ナトリウム水溶液をpH11以
上になるまで加え、60℃で一夜撹拌してエステルの加
水分解をおこなった。1規定塩酸で反応液を中和してp
H5とし、濃縮、乾固した。えられた生成物は塩化メチ
レン−エーテルの1:1混合溶液200mlに溶かし不
溶物を濾別したのち濃縮し、白色粉末を沈殿によってえ
た。えられた固型物を水100mlに溶解したのち強塩
基性イオン交換樹脂Bio−Rad AGIX2(Bi
o−Rad Laboratories,USA)にか
け、吸着物を0.05規定塩酸で溶離した。生成物は1
8gの白色結晶であった。この生成物(ポリオキシエチ
レンのジカルボン酸誘導体)10gとN−ヒドロキシコ
ハク酸イミド6.5g(56.5ミリモル)をジメチル
ホルムアミド200mlに溶かし、ジシクロヘキシルカ
ルボジイミドで脱水縮合してポリオキシエチレン100
0の活性エステル9.8gをえた。一方ウシの新鮮赤血
球100mlを0.9%食塩水に浮遊させ遠心分離機を
用いて4℃で4回洗浄した。ウシ洗浄赤血球60mlを
同容の注射薬用蒸留水を用いて溶血し孔径0.22μの
フィルター(Millipore Co.,USA)を
用いて膜成分を除いた。さらに残存する膜成分は遠心分
離機で6000回転1時間遠心分離して除いた。えられ
たウシヘモグロビン溶液10gを200mlのホウ酸
0.1モル緩衝液pH7.0に溶解し、えられた溶液
(0.15ミリモル)に活性ポリオキシエチレン4.7
g(3.5ミリモル)とリジン212mg(1.45ミ
リモル)を加え、アルゴンで酸素分圧1mmHgまで引
下げたあと4℃で2時間反応させた。えられた反応液は
分画分子量10,000ダルトンの限外濾過膜YM−1
0(Amicon Co,USA)で未反応ポリオキシ
エチレンが100ppm以下になるまでくり返し精製し
た。生成した反応液のゲル濾過クロマトグラフィーにお
けるピークの面積比から原料ヘモグロビンは、ほとんど
残存せず、図1に例示するような単量体型(A)、二量
体型(B)、三量体型(C)がほぼ5:3:1で混合し
ている事が判明した。尚、図中丸4つでヘモグロビン分
子を表わし、カギ形はポリオキシエチレンを表わしてい
る。またヘモグロビン分子1個あたりについているポリ
オキシエチレンの結合分子数は6.3個であった。また
P50即ち酸素解離曲線において50%の酸素が化学修飾
ヘモグロビンに配位する時の酸素分圧は25℃で13.
7mmHgであった。また、結合ポリオキシエチレンの
末端にリジン基が存在する事が加水分解物のアミノ酸分
析より明らかにされた。
rich Chemical Co.,USA)30g
(30mモル)と3−クロロプロピオン酸エチル16.
4g(120mモル)を乾燥したジメチルホルムアミド
700mlに溶解し、これに20gの酸化銀を加え70
℃で24時間反応したのち沈殿物を濾過により除去し
た。えられた濾液は3lの冷却したエチルエーテル中に
そそぎ、ポリオキシエチレン誘導体を沈澱させた。沈殿
物はエチルエーテルで洗浄後乾燥し、水300mlに再
び溶かし、1規定水酸化ナトリウム水溶液をpH11以
上になるまで加え、60℃で一夜撹拌してエステルの加
水分解をおこなった。1規定塩酸で反応液を中和してp
H5とし、濃縮、乾固した。えられた生成物は塩化メチ
レン−エーテルの1:1混合溶液200mlに溶かし不
溶物を濾別したのち濃縮し、白色粉末を沈殿によってえ
た。えられた固型物を水100mlに溶解したのち強塩
基性イオン交換樹脂Bio−Rad AGIX2(Bi
o−Rad Laboratories,USA)にか
け、吸着物を0.05規定塩酸で溶離した。生成物は1
8gの白色結晶であった。この生成物(ポリオキシエチ
レンのジカルボン酸誘導体)10gとN−ヒドロキシコ
ハク酸イミド6.5g(56.5ミリモル)をジメチル
ホルムアミド200mlに溶かし、ジシクロヘキシルカ
ルボジイミドで脱水縮合してポリオキシエチレン100
0の活性エステル9.8gをえた。一方ウシの新鮮赤血
球100mlを0.9%食塩水に浮遊させ遠心分離機を
用いて4℃で4回洗浄した。ウシ洗浄赤血球60mlを
同容の注射薬用蒸留水を用いて溶血し孔径0.22μの
フィルター(Millipore Co.,USA)を
用いて膜成分を除いた。さらに残存する膜成分は遠心分
離機で6000回転1時間遠心分離して除いた。えられ
たウシヘモグロビン溶液10gを200mlのホウ酸
0.1モル緩衝液pH7.0に溶解し、えられた溶液
(0.15ミリモル)に活性ポリオキシエチレン4.7
g(3.5ミリモル)とリジン212mg(1.45ミ
リモル)を加え、アルゴンで酸素分圧1mmHgまで引
下げたあと4℃で2時間反応させた。えられた反応液は
分画分子量10,000ダルトンの限外濾過膜YM−1
0(Amicon Co,USA)で未反応ポリオキシ
エチレンが100ppm以下になるまでくり返し精製し
た。生成した反応液のゲル濾過クロマトグラフィーにお
けるピークの面積比から原料ヘモグロビンは、ほとんど
残存せず、図1に例示するような単量体型(A)、二量
体型(B)、三量体型(C)がほぼ5:3:1で混合し
ている事が判明した。尚、図中丸4つでヘモグロビン分
子を表わし、カギ形はポリオキシエチレンを表わしてい
る。またヘモグロビン分子1個あたりについているポリ
オキシエチレンの結合分子数は6.3個であった。また
P50即ち酸素解離曲線において50%の酸素が化学修飾
ヘモグロビンに配位する時の酸素分圧は25℃で13.
7mmHgであった。また、結合ポリオキシエチレンの
末端にリジン基が存在する事が加水分解物のアミノ酸分
析より明らかにされた。
【0021】実施例2 特開昭53−141219(川研ファインケミカル
(株))に述べられている方法で調製した白金パラジウ
ム炭素触媒20gと市販のポリオキシエチレン(日本油
脂(株)、日本)(Macrogoal4000)20
0gを含む水溶液500mlを1.5lオートクレーブ
中に入れ、加圧空気を導入して圧力を10kg/cm2
とし、90℃で10時間反応させた。反応生成物は濾過
により触媒を除去したのち、活性炭で処理し、さらに水
から再結晶し180gの両末端にカルボキシル基を有す
るポリオキシエチレンの酸誘導体(α−カルボキシメチ
ル−ω−カルボメトキシポリ(エチレンオキシド))を
えた。この分子量約4000のポリオキシエチレンの酸
誘導体20g(5ミリモル)、N−ヒドロキシコハク酸
イミド4g及びジシクロヘキシルカルボジイミド(DC
C)7gをジメチルホルムアミド100mlに溶かし一
夜撹拌した。生成した結晶のジシクロヘキシル尿素を分
離したのち、エチルエーテル400mlを加えてポリオ
キシエチレンの活性化エステル17gを沈殿させ、濾別
後更にエーテルで洗浄した。一方期限切れ輸血用血液よ
り得られたヒト赤血球50mlを0.9%の食塩水50
mlで遠心分離機を用いて4℃で4回洗浄した。上記の
操作でえられた洗浄赤血球40mlを注射薬用蒸留水4
0mlに加えて溶血したあと、20mlのトルエンにて
膜成分を抽出した。えられたヘモグロビン液は8000
回転で1時間遠心分離を行う事によって更に膜成分とヘ
モグロビンを分離した。ヘモグロビン溶液は0.1Mリ
ン酸緩衝液に溶解し濃度を6g/dl(0.088m
M),pH7.0とした。ついでこのヘモグロビン溶液
1.00mlに酸素分圧が2mmHg以下になるまで激
しくアルゴンをふき込む事により脱酸素したのち、ベネ
シェらの方法(R.Benesch,S.Kwong,
A.Acharya,J.Manning,J.Bio
l.Chem257(3)1320−24(198
2))によりピリドキサール−5′−リン酸を付加し、
ピリドキサール化ヘモグロビン(6g/dl)をえた。
これにグリシン160mgを加えた後、上記の方法でえ
たポリオキシエチレンの活性化エステル7.2gを加
え、30分4℃で反応した。ついで、1規定水酸化ナト
リウム水溶液を加えpH7.8にしたのち更に30分反
応させた。反応液は分子量分画3万の限外濾過膜YM3
0(Amicon社、USA)により限外濾過をくり返
し、未反応のポリオキシエチレンの濃度が100ppm
以下にした。実施例1で述べたゲルタイプの充填カラム
を用いた高速液体クロマトグラフィーから生成物の分子
量は約9.8万ダルトンと推定された。なおポリオキシ
エチレンのヘモグロビンと結合していない方の末端には
グリシンが結合している。かくして得られた6.0%の
修飾ヘモグロビン溶液に塩類(NaCl,KCl,CH
3 COONa等の混合物)を溶解した液4部にグルコー
ス溶液あるいはマルトース溶液1部を添加して表1のよ
うに糖濃度の異なる種々の修飾ヘモグロビン溶液を調製
し常法通り棚温20℃で18時間凍結乾燥し、製剤とし
た。この製剤の凍乾直後及び30℃で保存した時のメト
ヘモグロビンの全ヘモグロビンに対する割合(以下、
「メト化率」という。)をそれぞれ表1に示した(n=
2〜4)。その結果、マルトースがグルコースより安定
化剤として優れていることが判明した。特に4〜6%の
濃度(修飾ヘモグロビンに対して約0.8〜1.2倍
量)で効果が大きく、濃度が高い程安定である。
(株))に述べられている方法で調製した白金パラジウ
ム炭素触媒20gと市販のポリオキシエチレン(日本油
脂(株)、日本)(Macrogoal4000)20
0gを含む水溶液500mlを1.5lオートクレーブ
中に入れ、加圧空気を導入して圧力を10kg/cm2
とし、90℃で10時間反応させた。反応生成物は濾過
により触媒を除去したのち、活性炭で処理し、さらに水
から再結晶し180gの両末端にカルボキシル基を有す
るポリオキシエチレンの酸誘導体(α−カルボキシメチ
ル−ω−カルボメトキシポリ(エチレンオキシド))を
えた。この分子量約4000のポリオキシエチレンの酸
誘導体20g(5ミリモル)、N−ヒドロキシコハク酸
イミド4g及びジシクロヘキシルカルボジイミド(DC
C)7gをジメチルホルムアミド100mlに溶かし一
夜撹拌した。生成した結晶のジシクロヘキシル尿素を分
離したのち、エチルエーテル400mlを加えてポリオ
キシエチレンの活性化エステル17gを沈殿させ、濾別
後更にエーテルで洗浄した。一方期限切れ輸血用血液よ
り得られたヒト赤血球50mlを0.9%の食塩水50
mlで遠心分離機を用いて4℃で4回洗浄した。上記の
操作でえられた洗浄赤血球40mlを注射薬用蒸留水4
0mlに加えて溶血したあと、20mlのトルエンにて
膜成分を抽出した。えられたヘモグロビン液は8000
回転で1時間遠心分離を行う事によって更に膜成分とヘ
モグロビンを分離した。ヘモグロビン溶液は0.1Mリ
ン酸緩衝液に溶解し濃度を6g/dl(0.088m
M),pH7.0とした。ついでこのヘモグロビン溶液
1.00mlに酸素分圧が2mmHg以下になるまで激
しくアルゴンをふき込む事により脱酸素したのち、ベネ
シェらの方法(R.Benesch,S.Kwong,
A.Acharya,J.Manning,J.Bio
l.Chem257(3)1320−24(198
2))によりピリドキサール−5′−リン酸を付加し、
ピリドキサール化ヘモグロビン(6g/dl)をえた。
これにグリシン160mgを加えた後、上記の方法でえ
たポリオキシエチレンの活性化エステル7.2gを加
え、30分4℃で反応した。ついで、1規定水酸化ナト
リウム水溶液を加えpH7.8にしたのち更に30分反
応させた。反応液は分子量分画3万の限外濾過膜YM3
0(Amicon社、USA)により限外濾過をくり返
し、未反応のポリオキシエチレンの濃度が100ppm
以下にした。実施例1で述べたゲルタイプの充填カラム
を用いた高速液体クロマトグラフィーから生成物の分子
量は約9.8万ダルトンと推定された。なおポリオキシ
エチレンのヘモグロビンと結合していない方の末端には
グリシンが結合している。かくして得られた6.0%の
修飾ヘモグロビン溶液に塩類(NaCl,KCl,CH
3 COONa等の混合物)を溶解した液4部にグルコー
ス溶液あるいはマルトース溶液1部を添加して表1のよ
うに糖濃度の異なる種々の修飾ヘモグロビン溶液を調製
し常法通り棚温20℃で18時間凍結乾燥し、製剤とし
た。この製剤の凍乾直後及び30℃で保存した時のメト
ヘモグロビンの全ヘモグロビンに対する割合(以下、
「メト化率」という。)をそれぞれ表1に示した(n=
2〜4)。その結果、マルトースがグルコースより安定
化剤として優れていることが判明した。特に4〜6%の
濃度(修飾ヘモグロビンに対して約0.8〜1.2倍
量)で効果が大きく、濃度が高い程安定である。
【0022】
【表1】
【0023】実施例3 市販のプルロニック(Pluronic)P123、分
子量4000ダルトン(エチレンオキサイドとプロピレ
ンオキサイドのブロック共重体(BASF Wayan
dotte Co,USA))20g(5ミリモル)を
よく脱水したジオキサン中1gの金属ナトリウムと反応
させ、プルロニックの2ナトリウム塩をえた。沈殿物を
濾過後、この濾過液に、モノクロロ酢酸エチルエステル
2mlを滴下し50℃で24時間反応させた。えられた
反応液は実施例1で述べた方法により、エステルを加水
分解後、沈殿をくり返す事により精製した。更にプルロ
ニックの両末端にカルボキシル基を有するこのポリアル
キレングリコール誘導体は実施例2で述べた方法を用い
てN−ヒドロキシコハク酸イミドと反応させ活性エステ
ルとした。一方実施例2の方法によってえられたヒトヘ
モグロビンの6%溶液(0.09ミリモル)100ml
(pH7.4のホウ酸緩衝溶液)に窒素ガスを吸込む事
により酸素分圧を5mmHgに下げたのち、上記によっ
てえられたプルロニックの活性エステル7g(1.7ミ
リモル)とL−アラニン250mg(2.8ミリモル)
を加え4℃で1時間反応させた。次いでpH7.8に上
げ更に30分撹拌し実施例1の方法で精製した。高速液
体クロマトグラフィーによって推定した分子量は95,
000ダルトン、ヘモグロビン分子1個あたりのプルロ
ニック結合数は4.8であった。また酸素解離曲線より
推定された50%酸素解離圧(P50)は25℃で6.1
mmHgであった。
子量4000ダルトン(エチレンオキサイドとプロピレ
ンオキサイドのブロック共重体(BASF Wayan
dotte Co,USA))20g(5ミリモル)を
よく脱水したジオキサン中1gの金属ナトリウムと反応
させ、プルロニックの2ナトリウム塩をえた。沈殿物を
濾過後、この濾過液に、モノクロロ酢酸エチルエステル
2mlを滴下し50℃で24時間反応させた。えられた
反応液は実施例1で述べた方法により、エステルを加水
分解後、沈殿をくり返す事により精製した。更にプルロ
ニックの両末端にカルボキシル基を有するこのポリアル
キレングリコール誘導体は実施例2で述べた方法を用い
てN−ヒドロキシコハク酸イミドと反応させ活性エステ
ルとした。一方実施例2の方法によってえられたヒトヘ
モグロビンの6%溶液(0.09ミリモル)100ml
(pH7.4のホウ酸緩衝溶液)に窒素ガスを吸込む事
により酸素分圧を5mmHgに下げたのち、上記によっ
てえられたプルロニックの活性エステル7g(1.7ミ
リモル)とL−アラニン250mg(2.8ミリモル)
を加え4℃で1時間反応させた。次いでpH7.8に上
げ更に30分撹拌し実施例1の方法で精製した。高速液
体クロマトグラフィーによって推定した分子量は95,
000ダルトン、ヘモグロビン分子1個あたりのプルロ
ニック結合数は4.8であった。また酸素解離曲線より
推定された50%酸素解離圧(P50)は25℃で6.1
mmHgであった。
【0024】実施例4 ポリオキシエチレンメチルエーテル分子量1900(A
ldrich Chemical Co.USA)15
g(7.9ミリモル)を乾燥したジクロロメタンに溶解
し、30gの活性化二酸化マンガンを加え、室温で一夜
撹拌し反応させた。濾過により触媒を分離したのち、ア
ルデヒド型に酸化されたポリオキシエチレン誘導体は、
溶媒を減圧下で留去したのち3%の過酸化水素水500
mlに溶解し24時間反応させた。反応液はBio−R
ad AGI×2を充填したカラムを通し中性物を除去
したのち0.02M HClで末端にカルボキシル基を
有するポリオキシエチレン誘導体を分離した。この酸誘
導体5g(2.6ミリモル)を乾燥したジメチルホルム
アミド100mlに溶解し0.8g(7.0ミリモル)
のN−ヒドロキシコハク酸イミドと1.5g(7.2ミ
リモル)のジシクロヘキシルカルボジイミドを加えて一
夜室温で反応させた。不溶物を濾別後、乾燥エーテルを
沈殿が生成するまで加え活性化エステルをえた。一方、
実施例2により調製したヒトヘモグロビンの6%溶液3
00mlを20倍過剰のグリオキザール酸とHEPES
緩衝液中でディドナートらの方法(A.Didonat
o,W.Fartl,A.Acharya,J.Man
ning,M.Biol,Chem.258(19)1
1890〜895(1983))で反応させひきつづき
NaBH3 CNで還元した。えられたカルボキシメチル
化したヘモグロビンはセファデックスG−100で低分
子物質を除き、さらに0.1Mのリン酸緩衝液で5.2
g/100mlの溶液とし、4.8gの上記の手法によ
ってえられたポリオキシエチレンモノメチルエーテルの
活性化エステルと5℃2時間反応させた。生成物は実施
例1の限外濾過の手法で精製した。前記の高速液体クロ
マトグラフィーで測定した分子量は8.2万ダルトン、
P50=12mmHg(25℃,pH7.4)であった。
ldrich Chemical Co.USA)15
g(7.9ミリモル)を乾燥したジクロロメタンに溶解
し、30gの活性化二酸化マンガンを加え、室温で一夜
撹拌し反応させた。濾過により触媒を分離したのち、ア
ルデヒド型に酸化されたポリオキシエチレン誘導体は、
溶媒を減圧下で留去したのち3%の過酸化水素水500
mlに溶解し24時間反応させた。反応液はBio−R
ad AGI×2を充填したカラムを通し中性物を除去
したのち0.02M HClで末端にカルボキシル基を
有するポリオキシエチレン誘導体を分離した。この酸誘
導体5g(2.6ミリモル)を乾燥したジメチルホルム
アミド100mlに溶解し0.8g(7.0ミリモル)
のN−ヒドロキシコハク酸イミドと1.5g(7.2ミ
リモル)のジシクロヘキシルカルボジイミドを加えて一
夜室温で反応させた。不溶物を濾別後、乾燥エーテルを
沈殿が生成するまで加え活性化エステルをえた。一方、
実施例2により調製したヒトヘモグロビンの6%溶液3
00mlを20倍過剰のグリオキザール酸とHEPES
緩衝液中でディドナートらの方法(A.Didonat
o,W.Fartl,A.Acharya,J.Man
ning,M.Biol,Chem.258(19)1
1890〜895(1983))で反応させひきつづき
NaBH3 CNで還元した。えられたカルボキシメチル
化したヘモグロビンはセファデックスG−100で低分
子物質を除き、さらに0.1Mのリン酸緩衝液で5.2
g/100mlの溶液とし、4.8gの上記の手法によ
ってえられたポリオキシエチレンモノメチルエーテルの
活性化エステルと5℃2時間反応させた。生成物は実施
例1の限外濾過の手法で精製した。前記の高速液体クロ
マトグラフィーで測定した分子量は8.2万ダルトン、
P50=12mmHg(25℃,pH7.4)であった。
【0025】実施例5 ポリオキシエチレン平均分子量8,000ダルトン(A
ldrich Chemical Co.USA)20
g(2.5ミリモル)を用い実施例2で示した方法で該
当するポリオキシエチレンの両末端に−O−CH2 −C
O2 Hを持つカルボン酸をえた。このカルボン酸をBi
o−Rad AGI×2の樹脂で精製したあと実施例2
の方法でN−ヒドロキシコハク酸イミドと反応させ活性
エステルとした。一方実施例1で示した方法によってえ
られたウシヘモグロビン7gを用い、これをpH7.4
のリン酸緩衝液に溶解して0.1M溶液(100ml)
を作り、前記ベネシェらの方法でピリドキサール−5′
−リン酸と反応させ、ひきつづき水素化ホウ素ナトリウ
ム(NaBH4 )で還元した。この溶液を高純度窒素で
脱酸素後、N−ジメチルグリシン1500mgと4.8
gの活性化ポリオキシエチレンエステルを加え4℃の低
温で1時間反応させた。反応液は実施例1で述べた方法
を用いて低分子量の物質を除き精製した。シアンメトヘ
モグロビン法でヘモグロビン濃度を測定した。収率はウ
シヘモグロビンから計算して63%であった。また平均
分子量12万ダルトン、6%のヘモグロビン濃度の溶液
の粘度は2.8cpsであった。今井の方法(前述)で
測定した酸素解離曲線からP50=19mmHg(25
℃,pH=7.4)がえられた。上記標準修飾ヘモグロ
ビン溶液(ヘモグロビン濃度6.0%)100mlにマ
ルトース3.4g(対ヘモグロビン0.56倍)及び実
施例2で示した塩類を適量加え、浸透圧を280mOs
molに調整した。この溶液から実施例2と同様に製剤
を調製し、10℃で保存した結果を表2に示した(n=
6)。その結果、マルトースと塩類を添加した修飾ヘモ
グロビンは非常に安定な製剤となることを確認した。
ldrich Chemical Co.USA)20
g(2.5ミリモル)を用い実施例2で示した方法で該
当するポリオキシエチレンの両末端に−O−CH2 −C
O2 Hを持つカルボン酸をえた。このカルボン酸をBi
o−Rad AGI×2の樹脂で精製したあと実施例2
の方法でN−ヒドロキシコハク酸イミドと反応させ活性
エステルとした。一方実施例1で示した方法によってえ
られたウシヘモグロビン7gを用い、これをpH7.4
のリン酸緩衝液に溶解して0.1M溶液(100ml)
を作り、前記ベネシェらの方法でピリドキサール−5′
−リン酸と反応させ、ひきつづき水素化ホウ素ナトリウ
ム(NaBH4 )で還元した。この溶液を高純度窒素で
脱酸素後、N−ジメチルグリシン1500mgと4.8
gの活性化ポリオキシエチレンエステルを加え4℃の低
温で1時間反応させた。反応液は実施例1で述べた方法
を用いて低分子量の物質を除き精製した。シアンメトヘ
モグロビン法でヘモグロビン濃度を測定した。収率はウ
シヘモグロビンから計算して63%であった。また平均
分子量12万ダルトン、6%のヘモグロビン濃度の溶液
の粘度は2.8cpsであった。今井の方法(前述)で
測定した酸素解離曲線からP50=19mmHg(25
℃,pH=7.4)がえられた。上記標準修飾ヘモグロ
ビン溶液(ヘモグロビン濃度6.0%)100mlにマ
ルトース3.4g(対ヘモグロビン0.56倍)及び実
施例2で示した塩類を適量加え、浸透圧を280mOs
molに調整した。この溶液から実施例2と同様に製剤
を調製し、10℃で保存した結果を表2に示した(n=
6)。その結果、マルトースと塩類を添加した修飾ヘモ
グロビンは非常に安定な製剤となることを確認した。
【0026】
【表2】
【0027】実施例6 10.9%のヒトヘモグロビン溶液20ml(0.03
4ミリモル)を0.122Mのトリス緩衝液(pH6.
8)90mlに溶解した液に容量200mlの三つ口フ
ラスコに入れ、アルゴンガスを1時間通気した。引き続
き、アルゴンガスを通気しつつ、ピリドキサール5リン
酸エステル−水和物33mg(0.125ミリモル)を
加え、さらに1時間アルゴンガスを通気した後、水素化
ホウ素ナトリウム(NaBH4 )25mg(0.66ミ
リモル)を加えてさらに1時間アルゴンガスを通気し、
溶液1を得た。一方、ポリオキシエチレン(Aldri
ch Chemical Co.USA、平均分子量3
400)をジョーンズ試薬で酸化し、両端にカルボキシ
メチル基を有するポリオキシエチレンを調整し、これと
N−ヒドロキシコハク酸イミドとを反応させて活性化ポ
リオキシエチレン(α−カルボキシメチル−ω−カルボ
メトキシポリ(エチレンオキシド)のN−ヒドロキシコ
ハク酸イミドエステル)を得た。溶液1に活性化ポリオ
キシエチレン3.29g(0.91ミリモル)を加えて
4℃で一夜撹拌した後に分子量阻止30,000の限外
濾過膜により限外濾過を繰り返し、未反応の活性エステ
ルまたはその分解物を除去することにより、4.5%の
修飾ヘモグロビン溶液41mlを得た。これを標準修飾
ヘモグロビン溶液とする。なお、この修飾ヘモグロビン
は分子量約86,000ダルトン、置換度6.2であっ
てP50(リン酸緩衝液、pH7.40,25℃)は1
1.0mmHgであった。上記標準修飾ヘモグロビン溶
液(ヘモグロビン濃度6.3%)に塩類*を溶解した液
4部にグルコース溶液あるいはマルトース溶液1部を添
加して表3のように糖濃度の異なる種々の修飾ヘモグロ
ビン溶液を調整し常法通り棚温20℃で18時間凍結乾
燥し、製剤とした。この製剤の凍乾直後及び30℃で保
存した時のメト化率をそれぞれ表3に示した。その結
果、実施例2と同様にマルトースがグルコースより安定
化剤として優れ、特に4〜6%の濃度(修飾ヘモグロビ
ンに対して約0.8〜1.2倍量)で効果が大きく、濃
度が高い程安定であることを再確認した。 *NaCl,KCl,CH3 COONa等の混合物
4ミリモル)を0.122Mのトリス緩衝液(pH6.
8)90mlに溶解した液に容量200mlの三つ口フ
ラスコに入れ、アルゴンガスを1時間通気した。引き続
き、アルゴンガスを通気しつつ、ピリドキサール5リン
酸エステル−水和物33mg(0.125ミリモル)を
加え、さらに1時間アルゴンガスを通気した後、水素化
ホウ素ナトリウム(NaBH4 )25mg(0.66ミ
リモル)を加えてさらに1時間アルゴンガスを通気し、
溶液1を得た。一方、ポリオキシエチレン(Aldri
ch Chemical Co.USA、平均分子量3
400)をジョーンズ試薬で酸化し、両端にカルボキシ
メチル基を有するポリオキシエチレンを調整し、これと
N−ヒドロキシコハク酸イミドとを反応させて活性化ポ
リオキシエチレン(α−カルボキシメチル−ω−カルボ
メトキシポリ(エチレンオキシド)のN−ヒドロキシコ
ハク酸イミドエステル)を得た。溶液1に活性化ポリオ
キシエチレン3.29g(0.91ミリモル)を加えて
4℃で一夜撹拌した後に分子量阻止30,000の限外
濾過膜により限外濾過を繰り返し、未反応の活性エステ
ルまたはその分解物を除去することにより、4.5%の
修飾ヘモグロビン溶液41mlを得た。これを標準修飾
ヘモグロビン溶液とする。なお、この修飾ヘモグロビン
は分子量約86,000ダルトン、置換度6.2であっ
てP50(リン酸緩衝液、pH7.40,25℃)は1
1.0mmHgであった。上記標準修飾ヘモグロビン溶
液(ヘモグロビン濃度6.3%)に塩類*を溶解した液
4部にグルコース溶液あるいはマルトース溶液1部を添
加して表3のように糖濃度の異なる種々の修飾ヘモグロ
ビン溶液を調整し常法通り棚温20℃で18時間凍結乾
燥し、製剤とした。この製剤の凍乾直後及び30℃で保
存した時のメト化率をそれぞれ表3に示した。その結
果、実施例2と同様にマルトースがグルコースより安定
化剤として優れ、特に4〜6%の濃度(修飾ヘモグロビ
ンに対して約0.8〜1.2倍量)で効果が大きく、濃
度が高い程安定であることを再確認した。 *NaCl,KCl,CH3 COONa等の混合物
【0028】
【表3】
【0029】実施例7 上記標準修飾ヘモグロビン溶液(ヘモグロビン濃度9.
6,6.4,3.2,0.96%)各30mlにマルト
ース1.8g(対ヘモグロビン0.6,0.9,1.
9,6.3倍量)をそれぞれ溶解した溶液を常法通り、
棚温20℃で18時間凍結乾燥し、各々の製剤を調製し
た。これらの製剤の凍結乾燥後の初期メト化率と25℃
で保存したときのメト化率の上昇値を表4に示した。そ
の結果、ヘモグロビンに対し重量比で1.9まで添加し
た場合にはその添加量に伴って強いメト化の抑制効果が
見られるが、それ以上ではその効果は頭打ち傾向がある
ことが判明した。
6,6.4,3.2,0.96%)各30mlにマルト
ース1.8g(対ヘモグロビン0.6,0.9,1.
9,6.3倍量)をそれぞれ溶解した溶液を常法通り、
棚温20℃で18時間凍結乾燥し、各々の製剤を調製し
た。これらの製剤の凍結乾燥後の初期メト化率と25℃
で保存したときのメト化率の上昇値を表4に示した。そ
の結果、ヘモグロビンに対し重量比で1.9まで添加し
た場合にはその添加量に伴って強いメト化の抑制効果が
見られるが、それ以上ではその効果は頭打ち傾向がある
ことが判明した。
【0030】
【表4】
【0031】実施例8 上記標準修飾ヘモグロビン溶液(ヘモグロビン濃度1
0.0%)4部にグルコース溶液またはマルトース溶液
1部を添加し、表5のように糖濃度の異なる種々の修飾
ヘモグロビン溶液を調製し、常法通り凍結乾燥し、製剤
を調製した。また、塩類を添加し、同様の手順で表6の
様に糖濃度の異なる種々の塩類添加修飾ヘモグロビン溶
液を調製し、凍結乾燥した製剤も調製した。これらの製
剤を25℃で保存した時のメト化率の上昇を表5及び表
6に示した。その結果、明らかに同一濃度ではマルトー
スはグルコースより安定化効果が大きく、また同一糖濃
度では塩類を加えたものの方が無添加のものより安定性
が大きく、塩類にもメト化防止効果があることが判明し
た。このとき添加する塩類の組成は、Na,K,Cl,
Ca,Mg各イオンが血漿正常レベルとほぼ等しくなる
様調整することが代用血液として使用する場合には望ま
しい。
0.0%)4部にグルコース溶液またはマルトース溶液
1部を添加し、表5のように糖濃度の異なる種々の修飾
ヘモグロビン溶液を調製し、常法通り凍結乾燥し、製剤
を調製した。また、塩類を添加し、同様の手順で表6の
様に糖濃度の異なる種々の塩類添加修飾ヘモグロビン溶
液を調製し、凍結乾燥した製剤も調製した。これらの製
剤を25℃で保存した時のメト化率の上昇を表5及び表
6に示した。その結果、明らかに同一濃度ではマルトー
スはグルコースより安定化効果が大きく、また同一糖濃
度では塩類を加えたものの方が無添加のものより安定性
が大きく、塩類にもメト化防止効果があることが判明し
た。このとき添加する塩類の組成は、Na,K,Cl,
Ca,Mg各イオンが血漿正常レベルとほぼ等しくなる
様調整することが代用血液として使用する場合には望ま
しい。
【0032】
【表5】
【0033】
【表6】
【0034】実施例9 上記標準修飾ヘモグロビン溶液(ヘモグロビン濃度9.
6%)100mlにマルトース8g(対ヘモグロビン
0.83倍量)を溶解した溶液を常法通り凍結乾燥し製
剤を調製した。この製剤の10℃での保存試験を12ヶ
月間行った時のメト化率を表7に示した(n=6)。そ
の結果10℃保存ではかなり安定であり十分実用に耐え
ることが確認された。
6%)100mlにマルトース8g(対ヘモグロビン
0.83倍量)を溶解した溶液を常法通り凍結乾燥し製
剤を調製した。この製剤の10℃での保存試験を12ヶ
月間行った時のメト化率を表7に示した(n=6)。そ
の結果10℃保存ではかなり安定であり十分実用に耐え
ることが確認された。
【0035】
【表7】
【0036】実施例10 上記標準修飾ヘモグロビン溶液(ヘモグロビン濃度9.
0%)100mlにマルトース5g(対ヘモグロビン
0.56倍量)及び上記塩類を適量加え、浸透圧を28
0mOsmolに調整した溶液を実施例1と同様に製剤
を調製し、10℃で保存した結果を表8に示した(n=
6)。その結果、マルトースと塩類を添加した修飾ヘモ
グロビンは非常に安定な製剤となることを確認した。
0%)100mlにマルトース5g(対ヘモグロビン
0.56倍量)及び上記塩類を適量加え、浸透圧を28
0mOsmolに調整した溶液を実施例1と同様に製剤
を調製し、10℃で保存した結果を表8に示した(n=
6)。その結果、マルトースと塩類を添加した修飾ヘモ
グロビンは非常に安定な製剤となることを確認した。
【0037】
【表8】
【0038】
【発明の効果】本発明のヘモグロビン−ポリオキシアル
キレン結合体はヘモグロビンを変性させず酸素親和力を
損なわない。また、安定性が高く、製剤化工程及び保存
時においてその活性を長く維持する。また、安定化剤と
してマルトース、グルコース、アミノ酸、塩類などを添
加した本発明の凍結乾燥製剤は、メト化防止および長期
安定性にきわめてすぐれている。
キレン結合体はヘモグロビンを変性させず酸素親和力を
損なわない。また、安定性が高く、製剤化工程及び保存
時においてその活性を長く維持する。また、安定化剤と
してマルトース、グルコース、アミノ酸、塩類などを添
加した本発明の凍結乾燥製剤は、メト化防止および長期
安定性にきわめてすぐれている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 矢吹 昭 神奈川県川崎市川崎区鈴木町1−1 味 の素株式会社 中央研究所内 (72)発明者 岩下 雄二 神奈川県川崎市川崎区鈴木町1−1 味 の素株式会社 中央研究所内 審査官 吉住 和之 (56)参考文献 特開 昭59−104323(JP,A) 特開 昭59−89629(JP,A) 特開 昭57−206622(JP,A) 特開 昭61−53223(JP,A)
Claims (2)
- 【請求項1】 ポリオキシアルキレン末端とヘモグロビ
ンのアミノ基との結合部分が下記の構造式よりなるヘモ
グロビン−ポリオキシアルキレン結合体 【化1】 −CH2−O−(CH2)n−CONH−Hb (式中、Hbはヘモグロビンを表わし、n=1〜7であ
る。)とマルトースを含有する凍結乾燥製剤。 - 【請求項2】 ヘモグロビン−ポリオキシアルキレン結
合体1に対してマルトースを重量比で0.1〜2.0含
有する請求項2記載の凍結乾燥製剤。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6057162A JP2501543B2 (ja) | 1994-03-28 | 1994-03-28 | ヘモグロビン−ポリオキシアルキレン結合体凍結乾燥製剤 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP6057162A JP2501543B2 (ja) | 1994-03-28 | 1994-03-28 | ヘモグロビン−ポリオキシアルキレン結合体凍結乾燥製剤 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP61142302A Division JPH0676333B2 (ja) | 1985-06-19 | 1986-06-18 | ヘモグロビン―ポリオキシアルキレン結合体 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0748273A JPH0748273A (ja) | 1995-02-21 |
JP2501543B2 true JP2501543B2 (ja) | 1996-05-29 |
Family
ID=13047877
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP6057162A Expired - Lifetime JP2501543B2 (ja) | 1994-03-28 | 1994-03-28 | ヘモグロビン−ポリオキシアルキレン結合体凍結乾燥製剤 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2501543B2 (ja) |
-
1994
- 1994-03-28 JP JP6057162A patent/JP2501543B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0748273A (ja) | 1995-02-21 |
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
EXPY | Cancellation because of completion of term |