CN115028686A - 一种提高Bacillomycin D发酵产量的方法 - Google Patents

一种提高Bacillomycin D发酵产量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种提高Bacillomycin D发酵产量的方法，以枯草芽孢杆菌fmbJ为出发菌株，通过添加生长因子VC，来提高Bacillomycin D产量。在本发明方法中，在发酵培养基中添加VC，可提高Bacillomycin D合成酶基因的相对表达量，促进氨基酸前体合成途径中关键酶基因转录，促进了degQ、comA、comP、comQ、sigM和spo0A等参与次级代谢产物合成的正调控信号因子的表达量上调，同时下调了一些负调控因子如rapC和abrB，使Bacillomycin D的产量提升至对照组的1.44倍；同时本发明方法成本低、操作简单方便，可以有效降低脂肽的生产成本、提高生产效率，有望用于大规模生产应用。

Description

一种提高Bacillomycin D发酵产量的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，涉及一种提高BacillomycinD发酵产量的方法。
背景技术
杆菌霉素D(Bacillomycin D)属于伊枯草菌素(Iturin)家族，是由枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等芽孢杆菌属微生物通过非核糖体途径合成的一类脂肽物质，由脂质和肽两部分构成，脂质部分为β-氨基脂肪酸链(C11-C17)，肽段氨基酸序列为L-Asn、D-Tyr、D-Asn、L-Pro、L-Glu、D-Ser和L-Thr，两部分通过苏氨酰-β-氨基键连接。Bacillomycin D对黄曲霉菌、赭曲霉菌、匍枝根酶菌等病原真菌具有很强的抑制效果，有潜力成为高效安全的食品防腐剂，应用于食品和粮食的防腐。
然而，利用基础发酵培养基对野生菌枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)进行发酵，Bacillomycin D产量较低。研究人员对基础培养基进行优化，以菊糖作为碳源，能显著提高Bacillomycin D的产量，分批补料发酵后产量更是提高了3.12倍，但优化后的培养基成本较高，不利于推广Bacillomycin D在防治粮食真菌污染等方面的应用；另外，如中国专利申请第CN109022474A和CN109136250A，对参与Bacillomycin D合成的信号因子进行过表达，也能显著提高其产量，但是基因层面操作复杂。
检索暂未发现通过添加生长因子VC提高Bacillomycin D产量的报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种提高Bacillomycin D发酵产量的方法。本发明中Bacillomycin D产量最低可以提高27％以上，在最优VC添加量的情况下，产量可提高44％；而且VC成本低廉、容易获取，非常适用于大规模生产应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种提高Bacillomycin D发酵产量的方法，在发酵初期，向发酵培养基中转接产Bacillomycin D的芽孢杆菌种子液的同时，添加生长因子VC，即可。
该方法中，本发明生长因子VC的添加促进了Bacillomycin D合成酶表达基因的上调，同时也促进了一些参与次级代谢产物合成的信号因子的表达量上调，使得Bacillomycin D的产量得以提高。
优选的，所述的VC添加量为0g/L-0.75g/L，更优选VC添加量为0.6g/L。
当VC添加量为0.6g/L时，Bacillomycin D的产量可以提升至对照组的1.44倍。
优选的，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌。
更优选的，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)fmbJ，由南京农业大学酶工程实验室自主筛选所得，菌种保藏号为CGMCC No.0943。
其中，因鉴定技术的进步，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)fmbJ后更名为解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)fmbJ，因此在本申请中，无论是枯草芽孢杆菌fmbJ还是解淀粉芽孢杆菌fmbJ，都实为保藏号CGMCC No.0943的这株菌。
具体的，所述方法包括如下具体步骤：
(1)取枯草芽孢杆菌fmbJ进行平板培养；
(2)将步骤(1)中的枯草芽孢杆菌fmbJ转接至种子培养基中，进行种子液培养；
(3)将步骤(2)中的种子液转接至发酵培养基中，同时向发酵培养基中添加生长因子VC，进行发酵培养制备抗菌脂肽Bacillomycin D。
优选的，所述的种子培养基为：牛肉浸膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0-7.2。
优选的，种子液培养条件为37℃，180rpm，培养至OD600达0.8-1.0。
优选的，步骤(2)培养时间约为3h。
优选的，所述的发酵培养基为：葡萄糖20.0g，L-谷氨酸5.0g，酵母浸膏1.0g，KH2PO40.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.5g，CuSO4·5H2O 0.15mg，FeSO4·7H2O 1.2mg，MnSO4 5mg，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0，发酵条件为：33℃，180rpm，72-150h，优选为72-120h，更优选为120h。
本发明还保护VC在提高抗菌脂肽Bacillomycin D产量方面的应用。
其中，VC的添加浓度为0g/L-0.75g/L。
有益效果
本发明采用在基础发酵培养基中添加生长因子VC来促进Bacillomycin D的产量，VC通过上调Bacillomycin D合成酶基因的表达，促进脂肽的合成，此外VC还能上调一些与枯草芽孢杆菌生长代谢密切相关的信号蛋白的表达，如能调控Iturin A合成的信号蛋白degQ、能调控芽孢合成和抗菌物质分泌的spoθA以及双组分调节系统comA-comP等，下调一些不利于脂肽合成的信号因子如rapC和abrB等。经实验验证，本发明中Bacillomycin D产量最低可以提高27％以上，在最优VC添加量的情况下，产量可提高44％。该方法制作简单、成本低、操作方便，可以有效降低脂肽的生产成本、提高生产效率，有望用于大规模生产应用。
附图说明
图1为VC对Bacillomycin D产量的影响；
图2为外源添加VC对Bacillomycin D合成酶基因相对表达量的影响；
图3为外源添加VC对氨基酸前体合成关键酶相对表达量的影响；
图4为外源添加VC对Bacillomycin D合成相关信号因子的相对表达量的影响；
图5为外源添加生长因子VB1、VB12、硫辛酸、VK1、VB2、VH、VB6、和VPP对Bacillomycin D产量的影响。
具体实施方式
下面结合实例对本发明做进一步说明，下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段，或按照制造厂商的建议条件。
实施例1
(1)平板活化：配制LB固体培养基(蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g，酵母提取物5.0g，琼脂20.0g，定容至1000mL，121℃，灭菌20min)，取枯草芽孢杆菌fmbJ甘油菌，在LB固体平板上划线，与37℃恒温培养箱中倒置培养16h。
(2)种子培养：从枯草芽孢杆菌fmbJ平板上挑取单菌落，接种至含有150mL种子培养基的500mL三角瓶中，于37℃，180转/分钟条件下培养约3h，至OD600达0.8-1.0。所述的种子培养基为：牛肉浸膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0-7.2。
(3)VC母液配制：称取3g维生素C粉末(分析纯)溶于10ml无菌水中，0.22微米滤膜过滤除菌，现配现用。
(4)发酵瓶培养：将步骤(2)中得到的枯草芽孢杆菌fmbJ种子液按5％(体积比)的接种量接入装有200ml发酵培养基的1000ml三角瓶中，同时加入VC，浓度梯度为0g/L、0.15g/L、0.30g/L、0.45g/L、0.60g/L和0.75g/L，于33℃，180rpm培养120h。所述的发酵培养基：葡萄糖20.0g，L-谷氨酸5.0g，酵母浸膏1.0g，KH2PO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl0.5g，CuSO4·5H2O0.15mg，FeSO4·7H2O 1.2mg，MnSO4 5mg，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0。
(5)提取样品RNA：取1mL步骤(4)中已发酵36h的发酵液(VC添加量为0g/L和0.60g/L)，采用Trizol试剂提取总RNA，具体步骤参照操作说明。采用Nano Drop 2000测定RNA的浓度，通过2％的琼脂糖凝胶检测RNA的质量。
(6)制备含有Bacillomycin D的甲醇粗提液：将步骤(4)中的发酵液，8000rpm离心20min，去除菌体，收集上清液，并用6M HCl将上清液的pH调至2.0，4℃静置过夜后，9000rpm离心20min，弃上清，得到沉淀，加入色谱级甲醇进行溶解，然后用NaOH将其pH调至7.0，9500rpm离心20min，取上清获得含有Bacillomycin D粗提物的甲醇溶液。
(7)含有Bacillomycin D粗提物的甲醇溶液的HPLC检测：Bacillomycin D粗提取物0.22μm滤膜过滤后，进行HPLC检测。柱子：Shim-pack GWS C18(5μm×4.6mm×250mm)；流动相A:纯水+0.1％三氟乙酸，流动相B：乙腈+0.1％三氟乙酸；梯度洗脱条件：0-15min，A70％-55％，B 30％-45％，15-40min，A 55％-45％，B 45％-55％；检测波长：207nm；流速：0.6mL/min。并按照如下标准曲线计算Bacillomycin D的最终产量：y＝7.6396x-2.3576，R2＝0.9999，x，Bacillomycin D浓度，mg/L；y，峰面积，mAU·h。
结果参见图1，随着VC添加量增加，Bacillomycin D产量不断提升，在添加量为0.6g/L时，Bacillomycin D产量达到峰值320.39mg/L，是对照组的1.44倍。
(8)qPCR实验：将步骤(5)中的RNA反转录成cDNA，具体操作方法见
Figure BDA0003700286040000041
IIIRT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)试剂盒说明书。荧光定量PCR的体系如下：10μL SYBRPremix Ex TaqII、1μL cDNA、1μL正向引物(10μM)和1μL反向引物(10μM)，ddH2O补充至20μL，轻轻混匀。两步法扩增程序如下：95℃，30s；40个循环：95℃，5s；60℃，30s。以16S rRNA为内参基因，用2-ΔΔCt法分析目的基因的表达，引物设计如表3-1所示，实验结果如图2、图3和图4所示。图2为外源添加VC对Bacillomycin D合成酶基因的影响，与对照组相比，bam A、bamB和TE的表达量显著升高，bam C和bam D的表达量也有升高，但不显著。图3为外源添加VC对氨基酸代谢关键基因的影响，参与Asn合成的天冬酰胺合成酶asnB、参与glu合成的谷氨酸脱氢酶GDH、谷氨酰胺合成酶glnA和参与ser合成的磷酸丝氨酸磷酸化酶rsbX的相对表达量显著上调，而参与Thr合成最后步骤的苏氨酸合成酶thrC和另一个也参与ser合成的磷酸丝氨酸磷酸化酶rsbU也有所增加，但不显著。图4为外源添加VC对参与芽孢杆菌次级代谢途径中信号因子的影响，多效调控蛋白DegQ、双组分调控系统ComP/ComA、编码编码RNA聚合酶σ因子的SigA/SigM、参与芽孢形成的spo0A和调控蛋白ComQ的相对表达量均显著上调，而天冬氨酸磷酸酯酶蛋白家族中RapC、RapI、RapF和过渡状态调节蛋白AbrB的相对表达量则显著下调。
表1 RT-qPCR所用引物
Table1 Oligonucleotide primers for RT-qPCR
Figure BDA0003700286040000051
Figure BDA0003700286040000061
对比例1
(1)平板活化：配制LB固体培养基(蛋白胨10.0g，NaCl 10.0g，酵母提取物5.0g，琼脂20.0g，定容至1000mL，121℃，灭菌20min)，取枯草芽孢杆菌fmbJ甘油菌，在LB固体平板上划线，与37℃恒温培养箱中倒置培养16h。
(2)种子培养：从枯草芽孢杆菌fmbJ平板上挑取单菌落，接种至含有150mL种子培养基的500mL三角瓶中，于37℃，180转/分钟条件下培养约3h。所述的种子培养基为：牛肉浸膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0-7.2。
(3)发酵瓶培养：将步骤(2)中得到的枯草芽孢杆菌fmbJ种子液按5％(体积比)的接种量接入装有200mL发酵培养基的1000mL三角瓶中，同时加入生长因子VB1、VB12、硫辛酸、VK1、VB2、VH、VB6和VPP，其中VB1添加梯度为0.0mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、3.0mg/L、4.0mg/L、5.0mg/L；VB12、硫辛酸和VK1的添加梯度为0.0mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L、6.0mg/L、8.0mg/L、10.0mg/L；VB2和VH添加量为0.0mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L、1.0mg/L；VB6添加梯度为0.0mg/L、0.67mg/L、1.33mg/L、2.00mg/L、1.67mg/L、3.33mg/L；氯化血红素和VPP添加梯度为0.0mg/L、3.0mg/L、6.0mg/L、9.0mg/L、12.0mg/L、15.0mg/L。于33℃，180rpm培养120h。所述的发酵培养基：葡萄糖20.0g，L-谷氨酸5.0g，酵母浸膏1.0g，KH2PO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，KCl 0.5g，CuSO4·5H2O 0.15mg，FeSO4·7H2O 1.2mg，MnSO4 5mg，蒸馏水定容至1000mL，pH 7.0。
(4)制备含有Bacillomycin D的甲醇粗提液：将步骤(3)中的发酵液，8000rpm离心20min，去除菌体，收集上清液，并用6M HCl将上清液的pH调至2.0，4℃静置过夜后，9000rpm离心20min，弃上清，得到沉淀，加入色谱级甲醇进行溶解，然后用NaOH将其pH调至7.0，9500rpm离心20min，取上清获得含有Bacillomycin D粗提物的甲醇溶液。
(5)含有Bacillomycin D粗提物的甲醇溶液的HPLC检测：Bacillomycin D粗提取物0.22μm滤膜过滤后，进行HPLC检测。柱子：Shim-pack GWS C18(5μm×4.6mm×250mm)；流动相A:纯水+0.1％三氟乙酸，流动相B：乙腈+0.1％三氟乙酸；梯度洗脱条件：0-15min，A70％-55％，B 30％-45％，15-40min，A 55％-45％，B 45％-55％；检测波长：207nm；流速：0.6mL/min。并按照如下标准曲线计算Bacillomycin D的最终产量：y＝7.6396x-2.3576，R2＝0.9999，x，Bacillomycin D浓度，mg/L；y，峰面积，mAU·h。
结果如图5所示，添加生长因子VH和VB12时也有明显提升效果，但是BacillomycinD最高产量仅为对照的1.14倍；其他生长因子VPP、VK1、VB6、VB1、VB2和硫辛酸添加后没有显著提升作用，氯化血红素添加后，直接抑制了菌株fmbJ的生长。
综上，通过实施例1以及对比例1对比9种生长因子对Bacillomycin D产量的影响，从中可以得出特定浓度的VC可以显著提高Bacillomycin D的产量。针对其中产量最高的VC，研究了其对Bacillomycin D合成酶基因、氨基酸前体合成关键基因和代谢途径中相关信号因子的影响，探究VC调控Bacillomycin D合成的机制。结果表明，外源添加VC一方面能通过上调参与Bacillomycin D氨基酸前体生物合成途径的关键酶基因，促进氨基酸前体物质的合成，从而促进Bacillomycin D的合成；另一方面能通过促进多效调控蛋白DegQ、双组分调控系统ComP/ComA、编码RNA聚合酶σ因子RpoD的SigA、编码RNA聚合酶σ因子rpoE的SigM、参与芽孢形成的spo0A和调控蛋白ComQ的转录，抑制天冬氨酸磷酸酯酶蛋白家族中RapC、RapI、RapF和过渡状态调节蛋白AbrB的转录，从而促进Bacillomycin D合成基因表达量上调，提高Bacillomycin D的产量。
虽然，上文中已经用一般性说明和具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明的基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1. 一种提高Bacillomycin D发酵产量的方法，其特征在于，在发酵初期，向发酵培养基中转接产Bacillomycin D的芽孢杆菌种子液的同时，添加生长因子VC，发酵培养即可。
2. 根据权利要求1所述的一种提高Bacillomycin D发酵产量的方法，其特征在于，所述的VC添加量为0 g/L - 0.75 g/L，优选VC添加量为0.6 g/L。
3. 根据权利要求1或2所述的一种提高Bacillomycin D发酵产量的方法，其特征在于，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌。
4. 根据权利要求3所述的一种提高Bacillomycin D发酵产量的方法，其特征在于，所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）fmbJ，由南京农业大学酶工程实验室自主筛选所得，菌种保藏号为CGMCC No.0943。
5. 根据权利要求4所述的一种提高Bacillomycin D发酵产量的方法，其特征在于，所述方法包括如下具体步骤：
（1）取枯草芽孢杆菌fmbJ进行平板培养；
（2）将步骤（1）中的枯草芽孢杆菌fmbJ转接至种子培养基中，进行种子液培养，种子液培养条件为37℃，180 rpm，培养至OD600达0.8-1.0；
（3）将步骤（2）中的种子液转接至发酵培养基中，同时向发酵培养基中添加生长因子VC，进行发酵培养制备抗菌脂肽Bacillomycin D，发酵条件为：33℃，180 rpm，72-150 h。
6. 根据权利要求5所述的一种提高Bacillomycin D发酵产量的方法，其特征在于，所述的种子培养基为：牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，蒸馏水定容至1000 mL，pH7.0-7.2。
7. 根据权利要求5或6所述的一种提高Bacillomycin D发酵产量的方法，其特征在于，所述的发酵培养基为：葡萄糖 20.0 g，L-谷氨酸 5.0 g，酵母浸膏1.0 g，KH2PO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，CuSO4·5H2O 0.15 mg，FeSO4·7H2O 1.2 mg，MnSO4 5mg，蒸馏水定容至1000 mL，pH 7.0。
8. VC在提高抗菌脂肽Bacillomycin D产量方面的应用。
9. 根据权利要求8所述的应用，VC的添加浓度为0 g/L-0.75 g/L。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN115466764A (zh) * 2022-09-27 2022-12-13 淮阴师范学院 氯化钠在提高枯草芽孢杆菌合成杆菌霉素d的应用和氯化钠发酵培养基及方法
CN115466765A (zh) * 2022-09-27 2022-12-13 淮阴师范学院 硫酸镁在提高枯草芽孢杆菌合成杆菌霉素d的应用和硫酸镁发酵培养基及方法
CN115478088A (zh) * 2022-09-27 2022-12-16 淮阴师范学院 乳酸钙在提高枯草芽孢杆菌合成杆菌霉素d的应用和乳酸钙发酵培养基及方法

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