TW201018401A - Polypeptides having antimicrobial activity - Google Patents

Description

201018401 六、發明說明： 序列表 本發明包含序列表。 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於具有抗微生物活性的經分離的多肽以及 編碼該多肽的經分離的多核苷酸。本發明亦關於包含該多 核皆酸的核酸構築體、載體、與宿主細胞以及用於製造與 © 使用該多肽的方法。 【先前技術】 本發明之目標為提供具有改善的抗微生物活性的多 肽。該多肽可展現降低的溶血活性及/或降低的細胞毒性。 該多肽亦可展現降低的對陽離子（諸如Ca2+、Mg2+、Na+ ) 的敏感性。相較於其他抗微生物多肽，該多肽亦可展現不 同的且有益的抗微生物範圍。 ❹ 【發明内容】 本發明係關於具有抗微生物活性的經分離的多肽，其 選自由以下者所組成的群組： (a) 包含SEQ ID NO: 1之胺基酸1至40的多肽； (b) 具有抗微生物活性的（a)之片段。 本發明亦關於編碼本發明之多肽的多核苷酸；以及關 於包含該多核苷酸的核酸構築體、重組表現載體、與重組 3 201018401 宿主細胞。 本發明亦關於用於製造如此具有抗微生物活性的多肽 的方法，其包含（a)將含有包含編碼該多肽的多核苷酸的核 酸構築體的重組宿主細胞培養在有益於製造該多肽的條件 下；以及（b)回收該多肽。 本發明亦關於使用本發明之多肽與多核苷酸的方法。 定義 抗微生物活性：術語「抗微生物活性」於本文中定義 為能夠殺死微生物細胞或抑制微生物細胞生長的活性。在 本發月的别後文中，術§吾r抗微生物的」意欲意指有殺細 菌的及/或制細菌的及/或殺真菌的及/或制真菌的效果及/或 殺病毒的效果，其中術語「殺細菌的」應被理解為能夠殺 死細菌細胞。術語「制細菌的」應被理解為能夠抑制細菌 的生長即抑制正在生長的細菌細胞。術語「殺真菌的」 應被理解為能夠殺死真菌細胞。術語「制真菌的」應被理 :為忐夠抑制真菌生長，即抑制正在生長的真菌細胞。術 殺病毒的」應被理解為能夠使病毒失活。術語「微生 # @ &」意指細菌或真菌的細胞（包含酵母菌）。 ^在本發明的前後文中，術語「抑制微生物細胞之生長」 係意欲：指細胞係處於非生長狀態，即它們無法增殖。 在-個較佳的具體態樣中，術語「抗微生物活性」係 細菌及/或制細菌活性。更佳地，「抗微生物活性」 :針對葡萄球菌（較佳為金黃色葡萄球菌）的殺細 201018401 菌及/或制細菌活性。 為了本發明的目的，抗微生物活性可根據由Lehrer等 人，Journal of Immunological methods，Vol. 137 ( 2) pp. 167-174 ( 1991)所述的程序測定。或者，抗微生物活性可 根據來自CLSI (臨床與實驗室標準學會（Clinical and Laboratory Standards Institute );之前稱為國家臨床與實驗 室標準委員會（National Committee of Clinical and Laboratory Standards))的 NCCLS 指導方針測定。 ® 具有抗微生物活性的多肽可能能夠以濃度500 y g/ml ;較佳地以濃度250 a g/ml ;更佳地以濃度1〇〇 " g/ml ;又更佳地以濃度50 # g/ml ;最佳地以濃度25 y g/ml ;以及特別是以濃度1〇 μ g/mi的具有抗微生物活性的 多狀’在相關微生物生長基質中於37°C培養16小時後（較 佳8小時後，更佳4小時後，最佳2小時後）減少金黃色 葡萄球菌（ATCC 29213 )之活細胞之數目至1/100。 具有抗微生物活性的多肽當以濃度500 y g/ml加入 時；較佳當以濃度250 " g/ml加入時；更佳當以濃度1 〇〇 " g/ml加入時；又更佳當以濃度50以g/ml加入時；最佳當 以濃度10 // g/ml加入時；以及特別是當以濃度5 /z g/ml 加入時，亦可能能夠在相關微生物生長基質中於3 7。C抑制 金黃色葡萄球菌（ATCC 29213 )之過度生長達8個小時。 本發明之多肽具有至少20%，較佳至少40%，更佳至 少50%’更佳至少60%，更佳至少70%，更佳至少80%， 又更佳至少90%，最佳至少95%，且又最佳至少100%的由 5 201018401 SEQ ID NOM、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3 或 SEQ ID NO: 4之胺基酸1至40所示的胺基酸序列所組成的多肽之抗微 生物活性。 經分離的多肽：術語「經分離的多肽」用於本文中意 指一種多肽，其為至少20%純的，較佳為至少40%純的， 更佳為至少60%純的，又更佳為至少8〇〇/〇純的，最佳為至 少90%純的’且又最佳為至少95%純的，其以sds-PAGE 測定。 實質上純的多肽：術語「實質上純的多肽」於本文中 意指一種多肽製劑’其包含最多1〇%，較佳最多8%，更佳 最多6%，更佳最多5%，更佳最多4%，最多3%，又更佳 最多2% ’最佳最多1%，且又最佳最多〇 5〇/〇以重量計的其 天然與之結合的其他多肽物質。因此，較佳地，實質上純 的多肽為至少92%純的，較佳為至少94%純的，更佳為至 少95%純的’更佳為至少96%純的，更佳為至少96%純的， 更佳為至少97%純的，更佳為至少98%純的，又更佳為至 少99%純的，最佳為至少99 5%純的，且又最佳為1〇〇%純 的’其以出現在該製劑中的總多肽物質之重量計。 本發明之多肽較佳呈實質上純的形式。具體地且較佳 地’該多肽呈「基本上純的形式」，即，該多肽製劑基本 上不含其他其天然與之結合的多肽物質。此可（例如）藉 由使用廣為人知的重組方法之手段製備該多肽或藉由典型 的純化方法而達成。 本文中，術語「實質上純的多肽」與術語「經分離的 201018401 多肽」以及「呈經分離的形式的多肽」同義。 一致性· 一胺基酸序列間或一核普酸序列間的相關性 係以參數「一致性」敘述。 為了本發明的目的，兩胺基酸序列之排比係藉由使用 • 來自 EMBOSS 套裝（http://emboss.org) 2.8.0 版的 Needle •程式而測定。Needle程式執行總體排比演算法，其救述於

Needleman，S. B.與 Wunsch，C. D. ( 1970) J. Mol. Bi〇i. 48 443-453。所使用的取代矩陣為BLOSUM62，空隙開放罰分 ® ( gap opening penalty )為 1〇，而空隙拓展罰分（gap extension penalty)為0.5。一本發明之胺基酸序列（諸如 SEQ ID NO: bSEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3 或 SEQ ID NO: 4之胺基酸1至4〇)與一不同的胺基酸序列間的一致性之 程度係以在兩序列之排比中完全吻合之數目，除以本發明 之序列的長度（胺基酸殘基之數目）而計算；或可選擇使 用標示為「最長一致性（longest identity )」的Needle之輸 出作為百分比一致性且係如下計算：（一致殘基x 1〇〇)/(排 ® 比之長度-排比中空隙之數目）。結果係以百分比—致性表 示0 多肽片段：術語「多肽片段」於本文中係定義為一種 多肽’其具有一個或多個胺基酸自SEQ ID ΝΟ:1或其同源 序列之胺端及/或羧端刪除，其中該片段具有抗微生物活 性。在一個具體態樣中，該片段包含至少34個，較佳地至 少35個’更佳地至少36個，又更佳地至少37個，最佳地 至少38個且特別是至少39個SEQ ID NO:l、SEQ ID N0:2、 7 201018401 SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之連續的胺基酸。 實質上純的多核苷酸：術語「實質上純的多核苷酸」 用於本文t意指一種多核苷酸製劑，其不含其他無關的或 不想要的核苷酸且呈適合用於基因工程設計性蛋白質生產 系統中的形式。因此，實質上純的多核苷酸包含最多丨〇%， 較佳最多8%，更佳最多6%，更佳最多5%，更佳最多4%， 更佳最多3%，又更佳最多2%，最佳最多1%，且又最佳最 多0.5%以重量計的其他其天然所結合的多核苷酸物質。然 而實質上純的多核苷酸可包含天然出現的5’與3，非轉 譯區域，諸如啟動子與終止子。較佳地，實質上純的多核 苦酸係至少90%純的，較佳至少92%純的，更佳至少94% 純的更佳至少95%純的，更佳至少96%純的，更佳至少 97%純的’又更佳至少98%純的，最佳至少99%，且又最佳 至少99.5%純的，其以重量計。本發明之多核苷酸較佳係呈 實質上純的形式。具體地且較佳地，於本文中所揭示的多 核苷酸呈「基本上純的形式」，即，該多核苷酸製劑係基 本上不含其他其天然所結合的多核苷酸物質。本文中，術 語「實質上純的多核苷酸」與術語「經分離的多核發酸」 以及 呈經分離的形式的多核菁酸」同義。多核普酸可為 基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源、或任何其組合。 核酸構築髏：術語「核酸構築體」用於本文中意指一 種核酸分子（單股或雙股），其係自天然存在的基因分離， 或其係經修飾以以否則不會天然發生的方式包含核酸之片 段。當核酸構築體包含表現本發明之編碼序列所需的控制 201018401 序列時’術語核酸構築體與術語「表現匣」同義。 控制序列·•街語「控制序列」於本文中定義為包含所 有表現編碼本發明之多肽的多核苷酸所需的或有助於表現 其的構成要素》每個控制序列對編碼多肽的核苷酸序列可 為固有的或外來的。這些控制序列包含（但不限於）引導 子、聚腺苦酸化序列、原胜肽序列、啟動子、訊號胜狀序 列、以及轉錄終止子。最少，控制序列包含啟動子、以及 轉錄終止訊號與轉譯終止訊號。控制序列可利用連接子來 提供以導入特殊的限切位置以促進控制序列與編碼一多狀 的核苷酸序列之編碼區域接合。 操作14地連結.術語「操作性地連結」於本文中代表 種結構’其中控制序列係置於-個相對於多核苷酸序列 之編碼序列的適當位置，使得該控制序列導引多狀之編碼 序列之表現。 編碼序列：當用於太含士 、本文中時，術語「編碼序列」意指 一種核苷酸序列，其亩技目触〜 Q 、接具體扣定其蛋白質產物之胺基酸 序列。編碼序列之邊界—舻 般藉由開放讀框測定，而開放讀 框通常以ATG起始密竭子杏去 α卞4者諸如GTG與TTG的可遘摆 起始密碼子開始。編碼序 进伴 酸序列。 了為dna、cDNA、或重組核普 表現：術語「表現，台人7 ^ , ^ , ^ 匕3任何涉及多肽之生產的步驟， 其包含（但不限於）轉絲、結α ^ ^ 飾、以及分^ 、錄後修飾、轉譯、轉譯後修 於本文中定義為一種線 表現載髏：術語「表現栽體 9 201018401 ，、裒狀DNA》子，其包含編媽本發明之多肽的多核苦 酸’且其係操作性地連結至用於其表現之附加的核普酸。 宿主細胞：術語「宿主細胞」（用於本文中）包含任 何、胞類型，其容許以包含本發明之多核普酸的核酸構築 體轉形、轉染、轉導、以及類似者。 修飾•術浯「修飾」於本文中意指任何由SEQ ι〇 n〇: 1 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3 或 SEQ ID NO: 4 之胺基 酸1至40所組成之多肽之化學修飾，以及編碼該多肽的 DNA之基因操作。修飾可為胺基酸之取代、刪除及/或插入 以及胺基酸侧鏈的取代；或在胺基酸序列中使用具有類似 特徵的非天然胺基酸。具體地，修飾可為醯胺化，例如c 端的酿胺化。 【實施方式】 具有抗微生物活性的多肽 在第一方面，本發明係關於具有抗微生物活性的經分 離的多肽，其選自由以下者所組成的群組： (a)包含以下胺基酸序列的多肽： GFGCNGPWSE DDLXCHXHCK SIKGYXGGYC AKGGFXCKCY (SEQ ID NO:1) 其中 於位置14的X為R或K; 於位置17的X為N或R;較佳地，於位置17的X為 201018401 於位置26的X為R或K;且 於位置36的X為V或L; 以及 (b)具有抗微生物活性的（a)之片段。 在一個較佳的具體態樣中，本發明之多肽係由SEQ ID NO: 1之胺基酸序列所組成。

本發明之多肽較佳包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或 SEQ IE) NO:4之胺基酸序列；或其具有抗微生物活性的片 © 段。在一個較佳的方面，本發明之多肽包含SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之胺基酸序列。在另一個較 佳的方面’多肽係由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO :4之胺基酸序列所組成；或由其具有抗微生物活性的片 段所組成。在另一個較佳的方面，多肽係由SEQ ID NO:2、 SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之胺基酸序列所組成。 在一個較佳的具體態樣中，本發明之多肽為防禦素多 肽。 N端延伸 本發明之多肽之N端延伸可適合地由1至50個胺基 酸’較佳由2-20個胺基酸，特別地是由3-15個胺基酸所組 成。在一個具體態樣中，N端胜肽延伸不包含Arg ( R )。 在另一個具體態樣中，該N端延伸包含kex2或類kex2切 裂位置（其在以下進一步定義）^在一個較佳的具體態樣 中’N端延伸係一個胜肽，包含至少兩個Glu(E)及/或 Asp (D)胺基酸殘基，諸如包含以下序列之一者的n端延 201018401 - 伸：EAE、EE、DE 與 DD。 、

Kex2位置

Kex2 位置（參見，例如，Methods in Enzymology Vol 185，ed. D. Goeddel，Academic Press Inc. (1990)，加州， 聖地牙哥，“ Gene Expression Technology”）與類 kex2 位 置係在一些蛋白質的原胜肽編碼區域與成熟區域之間出現 的雙驗性（di-basic )辨識位置（即，切裂位置）。 插入kex2位置或類kex2位置在某些實例中已顯示會改 善在原胜肽切裂位置的正確内胜肽酶加工，而導致蛋白質 ❹ 分泌水平增加。 在本發明的前後文中，插入kex2或類kex2位置會導致 在N端延伸的某個位置獲得切裂之可能性，而導致與seq ID NO: 1、SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3 或 SEQ ID NO: 4 之胺基酸1至40所示的成熟多肽相比被延伸的抗微生物多 狀。 經融合多肽 本發明之多肽亦包含經融合多肽或可切裂融合多肽，❹ 其中另一多肽被融合至本發明之多肽或其片段之N端或c 知經融合多肽係藉由將編碼另一多狀的核普酸序列（或 其部分）融合至本發明之核苷酸序列（或其部分）而產生。 用於生產融合多肽的技術為技術領域中已知的，且包含將 編碼該等多肽的編碼序列接合，使其等符合讀框且使經融 合多肽之表現在相同的啟動子與終止子之控制下。 多核苷酸 12 201018401 本發明亦關於經分離& & 離的多核苷酸，其具有編碼本發明 之多肽的核苷酸序列。 核酸構築艟 本發明亦關於核醆構築體，其包含本發明之經分離的 多核苷酸該多核苷酸操作性地連結至—個或多個控制序 丨而該等控制序列在適合的宿主細胞中在與該控制序列 相容的條件下引導該編碼序列之表現。 編碼本發明之多肽的經分離的多核苷酸可以各種方式 〇操2以表現多肽。取決於表現載體，在將多核普酸插入載 體刖操作其序列可能為所欲的或必要的。使用重組dna方 法修飾多核苷酸序列之技術於技術領域中係廣為人知的。 控制序列可為適合的啟動子序列，其為一種被宿主細 胞辨識以表現編瑪本發明之多肽的多核苷酸的核苷酸序 列。啟動子序列包含轉錄控制序列，其介導多肽的表現。 啟動子可為任何在所選擇的宿主細胞中顯現轉錄活性的核 苷酸序列，其包含突變的、截短的、與雜合的啟動子，且 ❹ 也 可獲自編瑪對宿主細胞為同源性或異源性的細胞内或細胞 外多肽的基因。 用於引導本發明之核酸構築體轉錄（特別是在細菌宿 主細胞中）的適合啟動子之實例，為獲自以下者之啟動子： 大腸桿菌lac操縱子、天藍色鏈黴菌（Sirepiomyces coe/ico/or)瓊脂酶基因（dagA)、枯草芽孢桿菌 )菌果聚醣蔗糖酶基因（sacB )、地衣芽孢桿菌 () α 殿粉酶基因（amyL )、脂肪嗜 13 201018401 一 熱芽孢桿菌（5αοζ·//ί/·5 Wearoi/jermopAi/Mi·)產麥芽糖殿粉酶 基因（amyM )、解澱粉芽抱桿菌（5ac///M«s am_y/o/z·分Me/acie«5 ) α殿粉酶基因（amyQ )、地衣芽抱桿菌青黴素酶基因 (penP )、枯草芽抱桿菌xylA與xylB基因、以及原核生物 卢内醯胺酶基因（Villa-Kamaroff 等人，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731 )， 以及 tac 啟動子（DeBoer 等人，1983，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25 )。其他啟動 子係在 Scientific American，1980，242: 74-94 中的 Useful @ proteins from recombinant bacteria ；以及 Sambrook 等人， 1989，如上述中敘述。 用於在絲狀真菌宿主細胞中引導本發明之核酸構築體 轉錄的適合的啟動子之實例，為獲自以下者的基因的啟動 子：米魏菌（or少zae ) TAKA 殿粉酶、Rhizomucor miehei天門冬胺酸蛋白酶、黑麴菌（Aperg/Z/wi· wiger)中 性α澱粉酶、黑麴菌酸穩定性α澱粉酶、黑麴菌或泡盛麴 菌（izwamorz·)葡萄糖漱粉酶（glaA )、Rhizomucor © miehei脂酶、米麴菌鹼性蛋白酶、米麴菌丙醣磷酸異構酶、 小巢狀趟菌（)乙醯胺酶、尸 vewewaiMm 殿粉葡萄糖普酶（WO00/56900 ) 、Fusarium venenatum Daria( WO00/56900 ) ^ Fusarium venenatum Quinn (WO00/56900 )、錘形黴菌（Fwsariwm )類膜蛋 白酶蛋白酶（W096/00787)、裡氏木霉（TWc/zoderwa 冷葡萄糖苷酶、裡氏木霉纖維二糖水解酶I、裡氏木霉内葡 14 201018401 聚醣酶i、裡氏木霉内葡聚醣酶u、裡氏木霉内葡聚醣酶 ΠΙ、裡氏木霉内葡聚醣酶IV、裡氏木霉内葡聚醣酶V、裡 氏木霉聚木糖酶I、裡氏木霉聚木糖酶„、裡氏木霉点木糖 普酶、以及NA2-tpi啟動子（-種來自黑麴菌中性^殿粉酶 與米麴菌丙醣磷酸異構酶的啟動子之雜合物）；以及其突 變的、截短的、與雜合的啟動子。 在酵母菌宿主中，有用的啟動子係獲自以下者的基 因.啤酒酵母菌（心)烯醇酶 © (ENO-1)、啤酒酵母菌半乳糖激酶（GAL1)、啤酒酵母 菌酒精脫氫酶/甘油酸_3_磷酸酯脫氫酶 (adhi，adh2/gap)、啤酒酵母菌丙醣磷酸異構酶（τρι)、 哮酒酵母菌金屬硫蛋白（111咖11〇1111〇111116)(〇：11?1)、與啤 酒酵母菌3-磷酸甘油酸激酶。其他用於酵母菌宿主細胞的 有甩啟動子係由Romanos等人，1992，Yeast 8: 423 488敘 述。 控制序列亦可為適合的轉錄終止子序列，其被宿主細 胞辨識以終止轉錄的序列。該終止子序列係操作性地連結 至編碼該多肽的核苷酸序列之3，端。任何在所選擇的宿主 細胞中起作用的終止子皆可用於本發明中。 用於絲狀真菌宿主細胞的較佳終止子係獲自以下者的 基因：米麴菌TAKA澱粉酶、黑麴菌葡萄糖澱粉酶、小巢 狀麴菌鄰胺苯曱酸合酶、黑麴菌〇：葡萄糖苷酶、與錘形黴 函類騰蛋白酶蛋白酶。 用於酵母菌宿主細胞的較佳終止子係獲自以下者的基 15 201018401 因：啤酒酵母菌烯醇酶、啤酒酵母菌細胞色素C(CYC1)、 與哮酒酵母㈣㈣脫氫酶。其㈣於酵母菌宿

主細胞的有用終止手徭士 D 另用、、止于係由Romanos等人，1992,如上述欽 述。 控制序列亦可為適合的前導序列（leadersequence)， 、、為種對伯主細胞之轉譯為重要的爪尺财《非轉譯區 域。該前導序列係操作性地連結至編碼該多肽的核普酸序 列之5’端。任何在所選擇的宿主細胞中起作用的前導序列 皆可用於本發明中。 用於絲狀真菌宿主細胞的較佳前導序列係獲自以下者 的基因.米麴菌TAKA澱粉酶與小巢狀麴菌丙醣磷酸異構 酶。 用於酵母菌宿主細之適合引導序列係獲自以下者的基 因：啤酒酵母菌烯醇酶（ΕΝ〇_υ、啤酒酵母g 3_鱗酸甘油 酸激酶、啤酒酵母菌α因子、與啤酒酵母8酒精脫氫酶/甘 油搭-3-磷酸酯脫氫酶（ADH2/GAP)。 控制序列亦可為聚腺苷酸化序列，其為一種操作性地 連結至核苦酸序列3，端的序列，且其（當被轉錄時）被宿 ^細胞辨認為將聚腺嘌呤核苷殘基加至所轉錄mRNA的訊 號任何在所選擇的宿主細胞中起作用的聚腺苷酸化序列 皆可用於本發明。 用於絲狀真菌宿主細胞的較佳聚腺苷酸化序列係獲自 以下者的基因：米麴菌TAKA澱粉酶、黑麴菌葡萄糖澱粉 jr 小巢狀麴菌鄰胺苯曱酸合酶、錘形黴菌類胰蛋白酶蛋 201018401 白酶、以及黑麴菌α葡萄糖苷酶。 用於酵母菌宿主細胞的有用聚腺苷酸化序列係由Gu〇 與 Sherman，1995, Molecular Cellular Biol〇gy 15: 5983 599〇 敘述。 控制序列亦可為訊號胜肽編碼區域，其編碼連接至多 肽之胺端的胺基酸序列並引導所編碼的多肽朝向細胞之分 泌途徑。核苷酸序列之編碼序列之5,端可天然地包含訊號 胜肽編碼區域，其天然地以符合轉譯讀框的方式與編碼該 〇 所分泌多肽之編碼區域之片段連接。或者，該編碼序列之 5端可包含訊號胜肽編瑪區域，其對該編碼序列而言為外 來。外來訊號胜肽編碼區域在編碼區域不天然包含訊號胜 肽編碼區域時可能是需要的。或者，外來訊號胜肽編碼區 域可簡單地取代天然的訊號胜肽編碼區域以加強多肽的分 泌。然而，任何引導所表現多肽朝向所選擇宿主細胞之分 泌途徑的訊號胜肽編碼區域皆可用於本發明中。 用於細菌宿主細胞的有效訊號胜肽編碼區域為獲自以 〇 下基因的訊號胜肽編碼區域：芽孢桿菌NCIB1 1837之產麥 芽糖澱粉酶、脂肪嗜熱芽孢桿菌α澱粉酶、地衣芽孢桿菌 地衣芽孢桿菌素酶（subtilisin )、地衣芽抱桿菌泠内醯胺酶、 月曰肪嗜熱芽抱桿菌中性蛋白酶（nprT、nprS、nprM )、與 枯草芽孢桿菌prsA。其他訊號胜肽係由Simonen與Palva、 1993、Microbiological Reviews 57: 109-137 敘述。 用於絲狀真菌宿主細胞的有效訊號胜肽編碼區域為獲 自以下基因的訊號胜肽編碼區域：米麴菌TAKA澱粉酶、 17 201018401 黑麴菌中性澱粉酶、黑麴菌葡萄糖澱粉酶、' 天門冬胺酸蛋白酶、ewwn’co/α iwso/ew纖維素酶、與 Humicola lanuginosa 脂鐵。 用於酵母菌宿主細胞的有用訊號胜肽係獲自以下者的 基因：啤酒酵母菌〇：因子與啤酒酵母菌轉化酶（invertase )。 其他有用的訊號胜狀編碼區域係由於R〇man〇s等人，1992， 如上述敘述。 控制序列亦可為原胜狀編碼區域，其編碼位於一多狀 之胺端的胺基酸序列。所得多肽稱為原酵素（pr〇enzyme) q 或原多肽（或在一些實例稱為酶原（zym〇gen ))。原多肽 一般係非活性的，且可藉由將原胜肽自原多肽催化性地或 自催化地切裂而將原多肽轉變成成熟的活性多肽。原胜肽 編碼區域可獲自以下者的基因：枯草芽孢桿菌鹼性蛋白酶 (aprE )、枯草芽抱才干菌中性蛋白酶（ηρΓτ )、啤酒酵母菌 α因子、及mWei天門冬胺酸蛋白酶、與

Myceliophthora thermophila 漆离〇 在訊號胜肽與原胜肽區域兩者皆出現在多肽的胺端的❿ 情況下，原胜肽區域係緊貼多肽之胺端，而訊號胜肽區域 係緊貼原胜肽區域之胺端。 亦可能希望加入調節序列，其允許對應於宿主細胞的 生長而調節該多狀之表現β調節系統之實例係該等導致基 因之表現對化學或物理刺激（包含調節性化合物之存在） 反應而被打開或關閉者。在原核生物系統中的調節系統包 S lac tac與trp操縱子系統。在酵母菌中，可使用 18 201018401 系統或GAU系統。在絲狀真菌中，可使用TAKA α澱粉 酶欠動子‘，、、麴菌葡萄糖殿粉酶啟動子、與米葡萄糖 殿私酶啟動子作$㈣相。其他㈣序q =基因擴增者:在真核系統中，此等包含二氣葉:= 土因其在甲氨蝶呤（methotrexate)存在時會被擴增， 以及金屬硫蛋白基因，其在重金屬存在下會被擴增。：此 等實例中’編碼多肽的核苦酸序列會與調節序列操 連結》 、 表現載體 本發明亦關於重組表現載體，其包含本發明之多核苷 酸、啟動子、和轉錄與轉料止㈣。上料種核酸與控 制序列可被結合在一起以產生重組表現載體，其可包含一 個或多個方便的限切位置以允許編碼多肽的核苷酸序列可 插入或取代至如此位置。或者，本發明之核苷酸序列可藉 由將包含該序列的核苷酸序列或核酸構築體插入用於表現 的適合載體中而表現。在創造表現載體時，編碼序列係置 於載體中以使得編碼序列與用於表現之適合的控制序列操 作性地連結。 重組表現載體可為任何載體（例如，質體或病毒）， 其可方便地接受重組DNA程序且可引起核苷酸序列之表 現。載體之選擇典型會取決於載體與載體被導入的宿主細 胞間的相容性。載體可為線性或封閉環狀質體。 載體可為獨立複製載體，即，呈染色體外實體的載體 (其複製獨立於染色體複製，例如，質體）、染色體外元 19 201018401 件（extrachr〇mosome element)、袖珍染色體、或人工染色 體。該載體可包含任何工具以確保自我複製。或者，載體 可為以下<··當其被導入宿主細胞時，會併入基因組中並 與其所併人的染色體—起複製。&外，可使用單—載體或 質體或二個或更多個載體或質體（其一起包含要導入宿主 細胞之基因組的整體DNA )、或轉位子。 本發明之載體較佳包含一個或多個可選擇標記，其允 許輕易選擇經轉形細胞。可選擇標記係一基因，其產物提 供殺生物的或病毒的抗性、對重金屬的抗性、自營性 (prototrophy)至他營（auxotr〇phs)、以及類似者。 細菌性可選擇標記之實例為來自枯草芽孢桿菌或地衣 芽孢桿菌的dal基因、或給予對抗生素（例如胺丫青黴素、 康微素、氣黴素、或四環素）的抗性的標記。用於酵母菌 宿主細胞的適合標記為ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、 TRP1、與URA3。用於絲狀真菌宿主細胞的可選擇標記包 3 (但不限於）amdS (乙醯胺酶）、argB (鳥胺酸胺甲醯 基轉移酶）、bar (曱基次膦酸（phosphinothricin )乙酿轉 移酶）、hph (潮黴素磷酸轉移酶）、niaD (硝酸酯還原酶）、 PyrG (乳清酸核苷_5，·磷酸脫羧酶）、sc(硫酸鹽腺苷轉 移酶）、以及trpC (鄰胺笨甲酸合酶）、以及其同等物。 用於麴菌細胞之較佳者為小巢狀麴菌或米麴菌之amdS與 pyrG基因以及吸水鏈霉菌町 的bar基因。 本發明之載體較佳包含一個或多個允許載體併入宿主 201018401 細胞之基因組或允許载體在細胞中獨立於基因組自我複製 的元件。 為了併入宿主細胞基因組，載體可依賴多核苷酸之編 碼多肽的序列或任何其他載體之元件以藉由同源或非同源 重組而併入基因組。或者，載體可包含用於引導在染色體 的精確位置藉由同源重組併入至宿主細胞之基因組中的附 加核苷酸序列。為了增加在精確位置併入的可能性併入 元件較佳應包含足夠數量的核酸，例如100個至1〇 〇〇〇個 © 驗基、較佳為400個至10，_個驗基、且最㈣8〇〇個至 10,000個鹼基，其與相對應目標序列具有高度一致性以増 強同源重組之可能性。併入元件可為任何與宿主細胞之^ 因組中的目標序列同源的序列。此外，併入元件可為非編 碼性或編碼核苷酸序列。在另一方面，載體可藉由非同源 重組併入宿主細胞之基因組中。 對於自我複製’載體可進一步包含使載體能在所考慮 的宿主細胞中自我複製的複製之起點。複製之起點可為任 何質體複製子（replicator)，其介導在細胞中起作用的自 我複製。術語「複製之起點」或「質體複製子」於本文中 疋義為使質體或載體能活體内複製的核苷酸序列。 細菌的複製之起點之實例為以下質體之複製之起點： pBR322、PUC19、pACYC177、與 pACYC184 ’ 其允許在大 腸桿菌中複製，以及pUB110、pE194、pTA1〇6〇、與pAMM， 其允許在芽孢桿菌中複製。 用於酵母菌宿主細胞的複製之起點之實例為2微米（2 21 201018401 micron )複製之起點、ARS1、ARS4、 合、以及ARS4與CEN6之組合。 ARS1 與 CEN3 之組

之實例為ΑΜΑ 1與 61-67 ; Cullen 等人， :9163-9175 ； WO 用於絲狀真菌細胞的複製之起點 ANSI ( Gems 等人，1991，Gene 98 : 1987 * Nuclear Acids Research 15 00/24883)。分離ΑΜΑ 1基因與構箪白人上— 丹傅喿包含该基因的質體或 載體可根據WO 00/24883所揭示的方法完成。 可將多於一個複本的本發明之多核苷酸插入至宿主細 胞中，以增加基因產物之生產。為增加多核苷酸之複本數，

可藉由將至少一個額外的該序列之複本併入宿主細胞之基 因組而獲得，或藉由使該多核苷酸包含可放大可選擇標記 基因而獲得，其中包含經擴增複本數的可選擇標記基因^ 藉此額外複本數的多核苦酸）的細胞可藉由在適合的選擇 作用劑存在下培養該細胞而選擇。 用於連接上述元件以構築本發明之重組表現載體的程 序對所屬技術領域中具有通常知識者而言係廣為人知的 (參見，例如’ Sambrook等人，1989，如上述）。 宿主細胞 本發明亦關於包含本發明之多核苷酸的重組宿主細 胞且其係有利地用於多肽之重組生產。包含本發明之多 核苷酸的載體被導入宿主細胞中，使得該載體被維持成染 色體部分（chromosomal integrant)或為自我複製染色體外 載體，如上述。術語「宿主細胞」含蓋任何親本細胞之後 代’其因為複製中發生的突變而與親本細胞不同。宿主細 22 201018401 胞之選擇會大大地取決於編碼多肽的基因以及其來源。 宿主細胞可為單細胞微生物，例如，原核生物、或非 單細胞微生物’例如，真核生物。 有用的單細胞微生物為細菌細胞，例如葛蘭氏陽性細 菌，其包含（但不限於）芽孢桿菌屬細胞，例如，嗜鹼芽 孢桿菌（)、解澱粉芽孢桿菌短毛芽 孢桿菌（B⑽7/以kvb )、環狀芽孢桿菌（ drcM/aw)、克勞氏芽孢桿菌、凝結芽 ® 孢桿菌（Sac⑴ws c〇agM/㈣）、、遲緩孢芽 辑蛰i Bacillus lentus)、地衣芽抱桿菌、巨大芽抱桿菌 (Bacillus megaterium)、脂肪嗜熱芽孢桿菌、枯草芽孢桿 菌、與蘇雲金抱穿桿菌（_5acz7/Mi Mwriwgie/m··?);或鏈霉 菌屬細胞，例如，變鉛青鏈霉菌（沿^•印化所八以) 與鼠灰鏈霉菌（Sirepiow少ca );或葛蘭氏陰性細 菌’例如大腸桿菌與假單胞菌屬物種。在一個較佳的方面， 細菌宿主細胞係遲緩孢芽桿菌、地衣芽孢桿菌、脂肪嗜熱 〇 a 芽抱桿菌、或枯草芽孢桿菌細胞。在另一個較佳的方面， 芽孢桿菌細胞為嗜鹼芽孢桿菌。 將載體導入細菌宿主細胞可（例如）藉由原生質體轉 形（參見，例如，Chang 與 Cohen，1979，Molecular General Genetics 168: 111-115 )、使用勝任細胞（參見，例如，Y〇ung 與 Spizizin，1961，Journal of Bacteriology 81: 823-829、或

Dubnau H Davidoff-Abelson > 1971，Journal of Molecular Biology 56: 209-221 )、電穿孔（參見’例如，Shigekawa 23 201018401 與 Dower，1988，Biotechniques 6: 742-751 )、或接合（參 ' 見’例如 ’ Koehler 與 Thorne，1987，Journal of Bacteriology 169: 5771-5278 )而達成。 宿主細胞亦可為真核生物，例如哺乳類動物、昆蟲、 植物、或真菌的細胞。 在一個較佳的方面’宿主細胞為真菌細胞。「真菌」 用於本文中包含子囊菌門（Acow>；c〇M )、擔子菌門 (5α以山om少coia)、壺菌門（Chirz·山〇m少coifl)、與接合菌 門（)(如 Hawksworth 等人，在 Ainsworth and ❹ Bisby’ s Dictionary of The Fungi，第 8 版，1995，CAB International，University Press，劍橋，英國中所定義的） 以及卵菌門（Oom少coia )(如在Hawksworth等人，1995， 如上述’第1 71頁所舉出的）以及所有有絲分裂孢子真菌 (Hawksworth 等人，1995，如上述）〇 在一個較佳的方面’真菌宿主細胞為酵母菌細胞。「酵 母菌」用於本文中包含產子囊酵母菌（内孢霉目 (五))、產擔孢子酵母菌、與屬於不完全真 ❹ 菌（芽生菌目（5/ύ^ω；«少ceiej ))的酵母菌。因為酵母菌的 分類未來可能會改變’為了本發明的目的，酵母菌應如 Biology and Activity of Yeast ( Skinner, F.A. > Passmore, S.M.、與 Davenport，R.R. ’ eds，s〇c App Bacteriol. Symposium Series No. 9，1980 )中所述定義。 在一個甚至更佳的方面，酵母菌宿主細胞為假絲酵母 菌屬（C㈣山·心）、漢遜酵母菌屬（丑㈣^心。）、克魯維酵 24 201018401 母酵母菌屬、畢赤酵母菌屬、釀母菌屬、裂殖酵母菌屬、 或耶氏酵母菌屬細胞。 在一個最佳的方面’酵母菌宿主細胞為卡爾酵母菌 (心）、啤酒酵母菌、凝聚性酒 精酵母菌（SaccAaromy⑽㈣）、道格拉斯酵母菌 i Saccharomyces douglasii)、先鲁弗鞲母紙 Sacchar〇myces 恤少vd)、諾地酵母菌（(^c咖r〇w少⑽罐⑹汾）或印 形酵母菌（Sacc/zarowycw oW/br/nb )細胞。在另一個最佳 ^ 的方面，酵母菌宿主細胞為乳酸克魯維酵母菌 (iawveromya /以⑴）細胞。在另一個最佳的方面，酵母 菌佰主細胞為解脂耶氏酵母菌（yarr〇Wa)細胞。 在另一個更佳的方面，真菌宿主細胞為絲狀真菌細 胞。「絲狀真菌」包含所有亞門真菌門（五)與卵 菌門（0〇所少)(如Hawksworth等人，1995,如上述所 定義）的絲狀形式。絲狀真菌一般特徵為由幾丁質、纖維 素、葡聚糖、殼聚糖、甘露聚糖、以及其他複合多醣構成 的菌絲壁。其營養生長係藉由菌絲的延長而碳代謝必為需 氧的。相反的，酵母菌（例如啤酒酵母菌）營養生長係藉 由單細胞菌體之出芽而碳代謝可為發酵性。 在一個又更佳的方面，絲狀真菌宿主細胞為枝頂孢真 菌屬⑽⑽）、麯菌屬（^per糾心）、短梗霉菌屬 (如r⑼^油·謂）、煙管菌屬（办以幻以㈣）、擬蠟孔菌 屬 iCeriporiopsis)、一夜蕈屬（Copri„w〇 、革蓋菌屬 (Coriolus)、隱珠箄屣（Crypt〇c〇ccus)、Fmbasidium、 25 201018401 鐮抱屬〔Fusarium)、农化菌屬 C Humicola)、Magnaporthe、 毛黴菌屬（Mi/cor )、毀絲、黴菌屬（Myceiiophthora )、 Neocallimastix、紅徽菌屬、Neurospora、、擬青黴菌屬 (Paecilomyces )、青黴菌屬（)、顯絲菌屬 (尸ZiawerocAaeie)、射脈菌屬（PA/eHa) 、Pz’ro和少側 耳菌屬（PieMro/Ms ) '裂箱镜 M ( Schizophyllum )、 Talarontyces、Thermoascus、後抱欲窗屬 C Thielavia )、 Tolypocladium、松：摄_病議展 { Trametes、、或木徽屬 (TWc/ioc?erma)細胞。 ❿ 在一個最佳的方面，絲狀真菌宿主細胞為泡盛麴菌、 案、煙色觀靝（Aspergillus fumigatus)、臭觀镜（Aspergillus /beiic/tt·?)、曰本趟菌、小巢狀麴 菌、黑麴菌或米麴菌細胞。在另一個最佳的方面，絲狀真 菌宿主細胞為杆抱狀錄抱（Ft/sariMm ftaciriiZ/ozWes )、

Fusarium cerealis 、 Fusarium crookwellense 、大刀鐮抱

(Fusarium culmorum )、禾本科錄抱（ graminearum )、赤禾錄抱（Fusarium graminum)、異孢鐮 抱（Fusarium heterosporum ) '合歡木錄抱（Fusarium «egw«山·）、鍾形黴菌（_FMsaHMm ολ:少·5_ρο，Μ/η)、多枝鐮抱 (Fusarium reticulatum) 、#•紅 # ( rosewm )、 接骨本鐮抱（Fusaritcm sambucinum)、膚色錄抱〔Fusarium sarcochroum、、三满鐵抱（Fusarium sporotrichioides)、 Fusarium sulphureum 、 Fusarium torulosum 、 Fusarium trichothecioides、Fusarium venenatum 細胞 ° 在另一 4固最佳 26 201018401 的方面，絲狀真菌宿主細胞為煙管菌（5_/erA：izwi/era adusta)、幹擬後蛰（i Ceriporiopsis aneirina)、Ceriporiopsis caregiea 、 Ceriporiopsis gilvescens 、 Ceriporiopsis parmocinta、Geriporiopsis rivulosa、Geriporiopsis subrufa、 或蟲擬壤菌（«SMZjver/wkpWiZ )、灰蓋鬼伞 (Coprinus cinereus)、毛革 1 菌（Coriolus hirsutus )、 Humicola insolens ' Humicola lanuginosa ' Muicor miehei ' Myceliophthora thermophila、粒厚辞經胞子镜（Neurospora © cresset )、產紫青黴、黃孢原毛平革菌（尸AawerocAae/e cArposporiw/w )、射脈菌（Γβί/ίαία) 、P/eMroiMS1 eryngii、Thielavia terrestris、長氣毛松議 Q Trametes villosa )、彩絨栓菌（7>ameie«s verhco/or )、哈茨木霉 (Trichoderma harzianum ) $:氏夫霉（Trichoderma koningii ) 、 Trichoderma longibrachiatum、裡氏木霉 (Trichoderma reesei)、氟綠色表霉（Trichoderma viride strain cell )細胞。 真菌細胞可藉由涉及原生質體形成、原生質體之轉 形、與細胞壁之再生的方法（就其本身而言為已知）轉形。 用於轉形麯菌屬與木黴屬宿主細胞的合適程序於EP 238 023 以及 Yelton 等人，1984，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474 中敘述。用於轉形 鐮孢物種的合適方法由Malardier等人，1989，Gene 78: 147-156、與WO 96/00787敘述。酵母菌可使用於以下者敘 述的程序轉形：Becker 與 Guarente’ 於 Abelson，J.N.與 Simon， 27 201018401 Μ.I.，編者，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology，第 194 冊，pp 182-1 87，Academic Press, Inc.，紐約；Ito 等人，1983，Journal of Bacteriology 15 3: 163 ;以及 Hinnen 等人，1978，Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920 ° 生產之方法 本發明亦關於生產本發明之多肽的方法，其包含（a) 在有益於生產該多肽的條件下培養細胞，其於其野生型能 夠生產該多肽；以及（b)回收該多肽。較佳地，細胞為散❹ 囊菌屬（心pAMw)，且更佳為阿姆斯特丹散囊菌（仏户肋以5 atratus )。 本發明亦關於生產本發明之多肽的方法，其包含（a) 在有益於生產該多肽的條件下培養宿主細胞；以及（b)回 收該多肽。 ❹ 在本發明之生產方法中’細胞係使用技術領域中所熟 知的方法培養於適用於生產該多肽的營養培養基中。例 如’細胞可藉由搖晃燒瓶培養，以及於適合的培養基中與 在允許該多肽被表現及/或分離的條件下在實驗室或工業用 發酵器中的小規模或大規模發酵（包含連續性、批次 I養==批次(Μ—11 )、或固態發酵)而培養。 ―，装你Μ與氮源以及無機鹽的適合營養培養基中進 仃其使用技術領域中已知的程序。、态 供廄斤適合的培養基可麟自 型可根據已出版的配方（例如，於美國菌種中心之 製備。若多肽被分泌至營養培養基中，則該多 28 201018401 狀可直接從培養基回收。若多狀係非分泌性的，則其可從 細胞溶胞產物回收。 多肽可使用技術領域中已知對該多肽具有專一性的方 法偵測。這些偵測方法可包含使用專一性抗體。例如，抗 微生物活性分析可用於測定多肽的活性，如本文中所述。 所產生的多肽可使用技術領域中已知的方法回收。例 如，該多肽可從營養培養基藉由習用的程序（包含，但不 限於，離心、過濾、萃取、噴乾、蒸發'或沈澱）回收。 本發明之多肽可藉由各種技術領域中已知的程序純 化，該等程序包含（但不限於）層析（例如，離子交換、 親合力、疏水性、色層焦集（chromatofocusing )、以及尺 寸排除（size exclusion ))、電泳程序（例如，製備性等電 聚焦（preparative isoelectric focusing ))、差別溶解度（例 如，硫酸敍沈澱）、SDS-PAGE、或萃取（參見，例如，pr〇tein Purification，J.-C· Janson 與 Lars Ryden，編者，VCH Publishers，紐約，1989) ° 植物 本發明亦關於基因轉殖植物 '植物部分、或植物細胞， 其已以編碼本發明之具有抗微生物活性的多肽的核苷酸序 列轉形，以可回收的量表現與生產該多肽。多肽可自植物 或植物部分回收。或者，包含重組多肽的植物或植物部分 本身可被使用，以改善食物或飼料的品質，例如，改善營 養價值、美味程度、以及流變特性、或摧毀抗營養因子。 基因轉殖植物可為雙子葉的（雙子葉植物）或單子葉 29 201018401 的（單子葉植物）。單子葉植物之實例為草，例如早熟禾 草（咖“ graSS/P〇a，藍草（I grass ))、牧草（f〇rage yO ’例如牛毛草屬與黑麥草屬（⑽謂）、 皿帶草’例如小糠草屬（知）、以及榖類，例如，小 麥、燕麥:黑麥、大麥、米、高粱、與玉蜀黍（玉米）。 雙子葉植物的實例為菸草、豆類，例如羽扇豆屬 义—〇、馬鈴著、甜菜、婉豆、豆英、以及黃豆，與十 子花科植物（蕓薹科（如如Wcacefle ))，例如白花椰菜、 油菜子、與極相關典型生物阿拉伯芬（々My吵仏 thaliana) 〇 植物分之實例為莖、癒合組織、葉、根、果、種子、 與塊莖以及包含這些部分的個別組織，例如，表皮、葉肉、 薄壁細胞、維管束組織、分生組織。特殊的植物細胞隔間， 諸如葉綠體、質外體、粒腺體、液泡、過氧化體以及細胞 質亦被視為是植物部分。此外’任何植物細胞，無論其組 織來源為何&被視為是植物部分。類似地，植物部分（諸 如經分離以促進本發明之利用的特殊組織與細胞）亦被視 為是植物部分，例如，胚芽、胚乳、糊粉與種子外皮。 亦包含於本發明之範圍内者為如此植物、植物部分、 與植物細胞之後代。 表現本發明之多肽的基因轉殖植物或植物細胞可根據 技術領域中已知的方法構築。簡而言之，植物或植物細胞 係藉由將一個或多個編碼本發明之多肽的構築體併入植物 宿主基因組’並繁殖所得的經修飾植物或植物細胞成基因 201018401 轉技植物或植物細胞而構築。 表現構築體方便地為核酸構築體，其包含編碼本發明 之多肽的多核苷酸，該多核苷酸操作性地連結至在所選擇 的植物或植物部分中表現該核苷酸序列所需的合適調節序 列。此外，表現構築體可包含有用於鑑定表現構築體已倂 入其中之宿主細胞的可選擇標記與將構築體導入討論中的 植物所需的DNA序列（後者係取決於所使用的dna導入 方法）。 調節序列（諸如啟動子與終止子序列以及視需要的訊 號或轉位序列）之選擇係取決於（例如）欲表現多肽的時 間、地點、與方式。例如，編碼本發明之多肽的基因之表 現可為構成性的或為可誘發的、或可為發育、時期或組織 專一性的，且可使該基因產物瞄準特殊組織或植物部分（諸 如種子或葉）。調節序列由（例如）Tague等人，1988，Plant

Physiology 86: 506 敘述。 對於構成性表現，可使用35S_CaMV、玉米泛素1、與 米肌動蛋白1啟動子（Franck等人，1980, Cell 21: 285-294,

Christensen 等人，1992, Plant Mo. Biol. 18: 675-689; Zhang 等人 ’ 1991 ’ piant cell 3: 1 15 5-1 165 )。器官專一性啟動 子"T為（例如）來自儲藏儲存組織（st〇rage sink tissues， 諸如種子、馬鈴薯塊莖、與果實）的啟動子（Edwards &

Coruzzi ’ 1990，Ann· Rev. Genet. 24: 275-303 )、或來自代 謝儲存組織（metabolic sink tissues，例如分生組織）的啟 動子（It0 等人，1994，Plant Mol. Biol. 24: 863-878)、種 31 201018401 子專一性啟動子，例如來自米的榖蛋白、醇溶蛋白、球蛋 〜 白、或白蛋白啟動子（Wu等人，1998，piant and cell Physiology 39: 885-889)、來自豆球蛋白B4的蠶豆啟動子 與來自蠶豆的未知種子蛋白質基因（C〇nrad等人，1998， Journal of Plant Physiology 152: 7〇8·711)、來自種子油體 蛋白質的啟動子（Chen等人，1998，Pleant and Cell Physiology 39: 935-941 )、來自西洋油菜的儲存蛋白質napA 啟動子、或任何其他技術領域中已知的種子專一性啟動 子，例如，WO 91/14772中敘述者。此外，啟動子可為葉專❿ 一性啟動子，諸如來自米或蕃茄的rbcs啟動子（Ky〇zuka 等人，1993，Plant Physiology 102: 991-1000)、綠藻病毒 腺嗓吟甲基轉移酶基因啟動子（Mitra與Higgins，1994，

Plant Molecular Biology 26: 85-93 )、或來自米的 aldp 基因 啟動子（Kagaya 等人，1995，Molecular and General Genetics 248: 668-674)、或損傷誘發性啟動子，諸如馬鈐薯pin2啟 動子（Xu 等人，1993 ’ Plant Molecular Biology 22: 573-588 )。類似地，啟動子可藉由非生物處理（諸如溫度、❹ 乾旱、或在鹽性的改變）而誘發，或藉由外生地施用活化 啟動子的物質（例如乙醇、雌激素、植物激素，諸如乙烯、 脫落酸、與赤黴酸、與重金屬）而誘發。 亦可使用啟動子增強子元件以在植物中達成本發明之 多肽之較高的表現。例如，啟動子增強子元件可為置於啟 動子與編碼本發明之多肽的核苷酸序列間的内含子。例 如，Xu等人，1993，如上述，揭示使用米肌動蛋白i基因 32 201018401 之第一内含子以增強表現。 可選擇標記基因與表現構築體之任何其他部分可選自 該專技術領域中可得者。 核酸構築體係根據技術領域中已知的習用技術併入植 物基因組中，該等技術包含農桿菌介導性轉形、病毒介導 性轉形、微注射、粒子轟擊、生物彈擊轉形（bi〇listic transformation)、與電穿孔（Gasser 等人，199〇, 244: 1293 ； Potrykus > 1990 > Bio/Technology 8: 535 ； Shimamoto ❹ 等人，1989，Nature 338: 274)。 目刖’根癌農桿菌（jgro心介導 性基因轉移為用於產生基因轉殖雙子葉植物的精選方法 (回顧參見 Hooykas 與 Schilperoort，1992，Plant Molecular Bu>l〇gy 19·· 15-38)，且其亦可用於轉形單子葉植物，雖然 對這些植物往往使用其他轉形方法。目前，用於產生基因 轉殖單子葉植物的精選方法為胚芽癒傷組織（embryonic calli )及發育中胚芽之粒子轟擊（以轉形性〇να塗覆之微 小的金或鎢微粒）（Christou，1992，Plant Journal 2: 275-281 ’ Shimamoto ’ 1994，Current Opinion Biotechnology 5: 158-162 ; Vasil 等人，i992，Bio/Technology 10: 667-674) °另一種用於轉形單子葉植物的方法係基於原生 貝體轉形’如 Omirulleh 等人，1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428 所述。 在轉形後’選擇已併入表現構築體的轉形產物並將之 根據技術領域中廣為人知的方法再生成整珠植物。轉形程 33 201018401 序往往係設計以在再生期間或在再生之後，藉由使用（例 如）以兩個分開的Τ-DNA構築體共轉形或藉由特殊重組酶 位置專一性切除選擇基因而選擇性地排除選擇基因。 本發明亦關於生產本發明之多肽的方法，其包含（a) 在有益於該多肽之生產的條件下培養包含編碼本發明之具 有抗微生物活性的多肽的多核苷酸之基因轉殖植物或植物 細胞；以及（b)回收該多肽。 組成物 本發明亦關於組成物’例如醫藥組成物，其包含本發❹ 明之多肽。較佳地，組成物富含如此多肽。術語「富含」 意指組成物之抗微生物活性已被增加，例如，以增加係數 1.1增加。 組成物可進一步包含另一種醫藥活性劑，諸如附加的 殺生物劑或制生物劑，諸如另一種展現抗微生物活性的抗 微生物多肽，如以上所定義。殺生物劑可為抗生素，如技 術領域中已知者。抗生素之種類包含青黴素，例如青黴素 G、青黴素V、二甲氧苯青黴素、苯0坐西林（〇xaci出n ) 、 ◎ 卡本西林（carbenicillin)、乙氧萘青黴素（nafciUin)、胺 丫青黴素、等等；青擻素與石内醯胺酶抑制子之組合、頭 芽胞菌素’例如頭孢克羅（cefaclor)、頭孢唑林（cefaz〇Hn)、 頭孢呋新（cefuroxime )、拉氧頭孢（m〇xalactam )、等等； 碳青黴稀（earbapenem) ’單菌黴素（monobactam);胺 基醣苷；四環素；巨環内醋；林可黴素；多粘桿菌素；確 醯胺；啥諾酮（quinolone ) ; cloramphenical ;甲硝唾 34 201018401 (metronidazole);觀黴素；三甲氧苄嘧啶（trimeth〇prim); 萬古微素；等等。殺生物劑亦可為抗黴菌劑，包含多烯， 例如雙性殺黴素B、制黴菌素；5-flu cos yn ;以及η坐，例如 咪康唑（miconazol)、酮康唑（ket〇c〇naz〇1)、伊曲康唑 (itraconazo)與氟康唑（fluc〇naz〇1) 〇 在一個具體態樣甲，殺生物劑係非酵素化學劑。在另 一個具體態樣中，殺生物劑係非多肽化學劑。 ® 的遞送媒劑，其當組成物用作為醫藥品時能夠將本發明之 組成物可包含適合的載劑物質。組成物亦可包含適合 抗微生物多肽遞送至所欲位置。 多肽組成物可根據技術領域中已知的方法製備，並可

可根據技術領域中已知的方法穩定化。

方法與用途 本發明亦關於使用具有抗微生物活性 抗微生物多肽 的多肽的方法。

或藻類污染的 水系統、洗滌 田與類似者， 生物之生長。然而 35 201018401 物組成物而言為有用的應用，諸如保護木頭、乳膠、黏著 _ 劑、膠、紙、硬紙板、紡織品、皮革、塑膠、填隙、與飼 料。 其他用途包含食物、飲料、化妝品，諸如洗劑、乳霜、 凝膠、軟膏、肥皂、洗髮精、潤絲精、止汗劑、止臭劑、 漱口水、隱形眼鏡產品、酵素調配物、或食物成分的保存。 因此’本發明之抗微生物多肽可用作為消毒劑，例如， 以治療眼睛或口部的感染、皮膚感染；用於止汗劑或止臭 劑中；用於清潔與消毒隱形眼鏡與牙齒（口部照護）。 · 一般，可預期本發明之抗微生物多肽可用於在任何表 面上之清潔、消毒或抑制微生物的生長。表面（其與本發 明之抗微生物多肽接觸可能為有益的）之例子係所使用的 加工設備（例如製酪場'化學或醫藥加工工廠、水環境衛 生系統、油加工工廠、紙漿加工工廠、水處理工廠、以及 冷卻塔）之表面。本發明之抗微生物多肽應以在所討論的 表面上可有效地清潔、消毒或抑制微生物之生長的量使用。 本發明之抗微生物多肽可在食物加工工廠中以及在任 ❹ 何製備或供應食物的區域（例如醫院、療養院與餐廳）中 額外地用於清潔表面與烹飪器孤0 本發明之抗微生物多狀亦可在水基塗料中用作防腐劑 或消毒劑。 本發明亦關於本發明之抗微生物多肽或組成物作為醫 藥品之用途。此外’本發明之抗微生物多肽或組成物亦可 用於生產用於控制微生物（諸如真菌生物或細菌，較佳為 36 201018401 葛蘭氏％性細菌）或與微生物作戰的醫藥品。 本發明之组成物與抗微生物多肽可用作為抗微生物獸 醫或人類治療性或㈣㈣β ’本發明之組成物外 ❹ 微生物多狀可用於製備獸醫或人類治療性劑或預防性劑， 其用於治療微生物感染，諸如細菌或真菌感染，較佳為葛 蘭氏陽性細g錢。具體地，微生物感染可與肺病（包含 (但不限於）肺結核、肺炎與囊性纖維變性）相關.以及 與性傳染病（包含（但不限於）淋病與披衣菌）相關。 本發明之組成物包含有效量的本發明之抗 肽。 ^ 術有效量」當詩本文中時意欲意指—種本發明 之抗微生物多肽的量’其足以抑制所討論的微生物之生長。 本發明亦關於創傷治療組成物或產品，諸如端帶、醫 療器材’諸如（例如）I管’且進—步關於抗頭皮屑頭髮 產品’例如洗髮精。 本發明之抗微生物多肽之調配物係投藥至患有微生物 感染或有微生物感染之傾向的宿主。投藥可為局部的、區 域陡的（l〇callzed)或全身性的，其取決於特殊的微生物， 較u區域佳的。—&，本發明之抗微生物多肽之劑會 足以減少微生物族群至少大約5〇%，通常至少】個數量級， 且可為2個或更多個數量級的殺死。本發明之化合物係以 縮小微生物族群同县，/, , i 時最小化任何副作用的劑量投藥。可預 期組成物可自醫師獲得並於其指W活體内。本發明 之抗微生物多肽特別有用於殺死葛蘭氏陽性細菌，包含鍵 37 201018401 球菌屬（)，諸如肺炎鏈球菌（57re/)ioc0ccM<s pneumonia ) '乳房鍵球菌（《Sirepiococcws wfteWs )、 Streptococcus hyointestinalis、酿服鍵球菌(Streptococcus )和無乳鍵球菌（5：ire/?iococcw5 izgfl/aciz’ae):以 及葡萄球菌屬（《SiapAy/ocoecM·?)，諸如金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus )、表反葡萄球菌（Staphylococcus epWerwii/i's )、模仿葡萄球菌（57ap/^/OCOCCM5 )、 木糖葡萄球菌（少/iJCOCCMS λ：少/osms )、肉葡萄球菌 (Staphylococcus carnosus) 。 本發明之抗微生物多肽之調配物可投藥至患有微生物 性肺部感染（諸如肺炎）或有微生物性肺部感染之傾向的 宿主’或投藥至患有微生物性創傷感染（諸如細菌性創傷 感染）或有微生物性創傷感染之傾向的宿主。 本發明之抗微生物多肽之調配物亦可投藥至患有皮膚 感染（諸如為痤瘡、異位性皮炎（at0pic dermatitis)或脂 溢性皮炎（seborrheic dermatitis ))或有皮膚感染之傾向的 侣主，較佳皮膚感染為細鹵性皮膚感染，例如由表皮葡萄 ❹ 球菌、金黃色葡萄球菌、痤瘡丙酸桿菌（/v0;n‘〇w6flcieriMw 、卵圓皮屑芽胞菌（/>办r〇i/7〇rMW〇va/e)或糠疹小 芽孢菌（Ma/assezjffl /wr/wr)所造成者。 本發明之抗微生物多肽亦有用於試管内調配以殺死微 生物，特別是當不想導入習用量的抗生素時。例如，本發 明之抗微生物多肽可被加入動物及/或人類食物製劑中；或 其等可被包含作為添加物以用於細胞之試管内培養，以預 38 201018401 防在組織培養中微生物過度生長。 特定微生物對使用本發明之抗微生物多肽殺死的敏感 性，可藉由試管内測試而測定，如在實驗部分所詳述者。 典型地，微生物之培養物與各種濃度的抗微生物多肽結合 一段足以允許蛋白質作用的時間，其通常介於大約一個小 時至一天。接著計算存活的微生物之數目，並測定殺死之 水平。 所關注的微生物包含（但不限於）葛蘭氏陰性細菌， © 例如.檸檬酸桿菌屬（)物種；腸内桿菌屬 (五WerMacier)物種；大腸桿菌屬物種，例如大腸桿菌； 克留氏菌屬（尤/ehie/M )物種；摩根氏菌屬（M〇r卯) 物種；變形桿菌屬（)物種；普羅威登斯菌屬 ()物種；沙門氏桿菌屬物種，例如傷寒沙門 桿菌、鼠傷寒沙氏桿菌；沙雷氏菌屬物種；志 賀桿菌屬物種；假單胞菌屬物種，例如綠膿桿菌 (户卿如7β㈣抑;耶氏菌屬（物種， 例如鼠疫耶氏菌（、假結核耶氏菌（y_·心 pseudotuberculosis )、小腸結腸炎耶氏菌（ ⑴α );弗朗西斯氏菌屬（々㈣)物種； 巴斯德菌屬（尸似⑶rWM )物種；弧菌屬物種，例如霍亂弧 菌、副溶血性弧菌；曲桿菌屬物種，例如空腸曲桿菌；嗜 血桿菌屬物種，例如流行性感冒嗜血桿菌、杜氏嗜血桿菌 (Haem〇Pki〖US d“creyi);博德氏桿菌屬（B〇rdeieUa)物 種，例如百日咳博德氏桿菌、枝氣管敗血性博德氏桿菌、 39 201018401 副百日咳博德氏桿菌，布氏桿菌屬（_grwce//a )物種；奈瑟 氏球菌屬物種，例如淋病雙球菌、腦膜炎球菌、等等。其 他所關注的細菌包含退伍軍人桿菌屬（)物種， 例如退伍軍人嗜肺病滅（pweMmop/n’/a );李氏 菌屬（Zz'Weria )物種，例如單核球增多性李氏菌；黴漿菌 屬（)物種，例如人型黴漿菌、人肺炎黴聚菌； 分枝桿菌屬（M少cokcieriwm)物種，例如結核分枝桿菌、 麻瘋分枝桿菌；密螺旋艘屬（7>e/?o«ema )物種，例如梅毒 密螺旋體；螺旋體屬（5orre/k )物種，例如伯氏疏螺旋體 i Borrelia burgdorferi) ·，鉤端螺'敬龍魇{ Leptospirae)物 種；立克次趙屬物種，例如落機山熱立克次體、傷寒立克 次體；彼衣菌屬（C/iMmy山·α )物種，例如沙眼披衣菌、肺 炎彼衣菌（CA/amyAa pnewmonz’ae)、鸚鵡彼衣菌；螺旋桿 菌屬（ee/icMacier )物種，例如胃幽門螺旋桿菌 (Helicobacter pylori)、等等。 所關注的非細菌病原體包含真菌與原生動物病原體， 例如瘧原蟲屬（物種，例如惡性瘧（朽似山·α /a/c_r請）、錐蟲屬物種’例如布氏錐蟲（Γ〇^Μ〇ί〇则 ); shistosomes ;内阿米巴屬（)物種、 隱球菌屬物種、假絲酵母菌屬物種，例如白色念珠菌；等 等。 可使用各種方法投藥。多肽調配物可口服給予，或可 血管内地、皮下地 '腹膜地注射，藉由氣溶膠、眼部地 (opthalmically )、膀胱内地、局部地、等等方式給予。例 201018401 如，藉由吸入劑之投藥方法於技術領域中係廣為人知的。 治療性調配物之劑量的變化很大，其依欲投藥的特殊抗微 生物多肽、疾病之本性、投藥之頻率、投藥之方式、劑自 佰主中之排除、以及類似者而定。最初的劑量可較大，接 使用較小的維持劑量。劑可不經常地每週或每二週投藥、 或分成較小的劑並每天、每半週、等等投藥一次或多次， 以維持有效劑量水平。在許多實例中’口服投藥會比靜脈 内投藥需要更高的劑量。醯胺鍵，以及胺基與羧基端，可 〇 經修飾以在口服投藥產生較大的穩定性。例如，叛端可經 醯胺化。 調配物 本發明之化合物可被併入各種調配物中以治療性投 藥。更具體地，本發明之化合物可藉由與適合的、醫藥上 可接受的載劑或稀釋劑組合而調配成醫藥組成物，且可調 配成呈固體、半固體、液體或氣體形式的製劑，諸如錠劑、 ⑩膠囊、粉末、細粒（granule)、軟膏、乳霜、泡珠、溶液、 栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠、微球體、洗劑、以及氣溶 膠。本身，化合物之投藥可藉由各種方式（包含口服的、 頰部的、直腸的、非經腸的、腹臈内的、皮内的、穿皮的、 氣管㈣（iiuracheal)、等等，投藥）達成。本發明之抗 微生物多肽在投藥後可為全身性或可藉由使用移植物或其 他調配物（其發生作用以在植入位置保留活性劑）而區域 化。 在一個具體態樣中，用於局部用途的調配物包含螯合 41 201018401 劑，其減少二價陽離子 如，可包含諸如檸檬酸鹽：㈣）的有效濃度。例 酸鹽係較佳的。檸檬酸壅的濃:T;=A的二… 士双⑽ J /晨度通常會為大約1至10 mM。 本發明之化合物可被 等可與其他已知化合物η、彼此結合投藥、或其 炎劑、抗生素、等等"且人使用孔素（perf°rin)、抗發 人札4 、、且δ使用。於醫藥劑量形式中，化 &物可以其醫藥上可接受 的皿類之形式投藥。以下方法與 賦形劑僅為例示性而非欲限制。 ❹ 對於口服製劑’化合物可單獨使用或與適合的添加物 組〇以製造錠劑、粉末、细 Λ粒或膠囊，例如，與習用的添 加♦諸如乳糖、甘露醇、玉米澱粉'或馬鈴薯澱粉；與 接著劑’諸如結晶纖維素、纖維素衍生物、阿拉伯樹膠、 玉米殿粉或明膠；冑崩解劑，例如玉米澱粉'馬鈴箸殿粉 或叛甲基纖維鈉；與潤㈣，例如滑石或硬脂酸鎂；以及 若需要，與稀釋劑、緩衝劑、濕潤劑、防腐劑以及風味劑 結合。 化合物可藉由將其等溶解、懸浮、或乳化於水性或非G 水性溶劑（諸如蔬菜或其他類似的油、合成脂肪酸甘油醋、 較多碳脂肪酸之醋或丙二醇）中’以及若需要使用習用 的添加物（諸如助溶劑、等張劑、懸浮劑、乳化劑、穩定 劑與防腐劑）而調配成用於注射的製劑。 化合物可用於氣溶膠調配物中以藉由吸入投藥。本發 明之化合物可被調配至經加壓可接受推進劑（諸如二氣二 氟甲烷、丙烷、氮與類似物）中。 42 201018401 化合物可呈洗劑使用以（例如）預防烫傷之感染其 係藉由使用習用的添加物（諸如助溶劑、等張劑、懸浮劑、 乳化劑、穩定劑與防腐劑）調配。 此外，化合物可藉由與各種基底（諸如乳化性基底或 水溶性基底）混合而製成栓劑。本發明之化合物可透過检 劑而直腸内投藥。栓劑可包含媒劑，諸如可可油、碳峨與 聚乙二醇，其在體溫會融化，但在室溫會凝固。 可提供用於口服或直腸投藥的單位劑量形式，諸如糖 ❹[醜劑、與懸浮劑，其中每個劑量單位（（例如）一茶 匙、-大起、錠劑或栓劑）包含預決定量的組成物，其包 含-種或多種本發明之化合物。類似地，用於注射或靜脈 内投藥之單位劑量形式可包含在組成物中的本發明之化合 物該組成物呈無菌水、一般食鹽水或另一種醫藥上可接 受載劑之溶液。 用於維持性釋放調配物的移植物在技術領域中係廣為 〇 人知的。移植物係使用生物可降解的或非生物可降解的聚 合物調配成微球體、厚板（slab)、等等。例如，乳酸及/ 或經基乙酸的聚合物形成可降解性聚合物，其可良好地被 宿主所容忍。包含本發明之抗微生物多肽的移植物係置於 感染之位置附近，使得活性劑之局部濃度相對於身體之剩 下的部分增加。 用於本文中’術語「單位劑量形式」意指物理上分開 的^位，其適合作為用於人類和動物個體的單位劑量每 個單位包含預決定量的本發明之化合物，該量係經計算以 43 201018401 足夠產生所欲的效果，該化合物與醫藥上可接受的稀釋 劑、載劑或媒劑組合。本發明之單位劑量形式的規格係取 決所使用的特殊化合物以及欲達成的效果、以及化合物在 宿主中的藥物動力學。 醫藥上可接受的賦形劑（諸如媒劑、辅劑、載劑或稀 釋劑）係公眾可輕易獲得的。此外，醫藥上可接受的辅助 物質（諸如pH調整與緩衝劑、滲透壓調整劑、穩定劑、濕 潤劑、以及類似者）係公眾可輕易獲得的。 用於全身性投藥的典型劑量之範圍係〇」pg至1〇〇毫 克每公斤個體體重每次投藥β典型劑量可為一顆每天服用 二到六次的錠劑，或一顆每天服用一次且包含成比例較高 活性含量的活性成分的隨時間釋放（time_release)膠囊或 錠劑。隨時間釋放效果可藉由溶於不同{)11值的膠囊物質、 藉由透過滲透壓緩慢釋放的膠囊、或藉由任何其他已知的 控制性釋放方法而獲得。 熟習此項技術者會無困難地瞭解到劑量水平可呈特殊 化合物、症狀之嚴重性與個體易被副作用影響的程度之函〇 數的形式變化…些特殊化合物比其他更有潛力。用於給 定化合物之較佳劑量可無困難地由$習此項技術者使用各 種方式測定。一個較佳的方式係測量給定化合物的生理潛 力。 使用脂質體作為遞送媒劑係一種所關注的方法。脂質 體與目標位置之細胞融合並將内腔之内容物遞送至細胞 内。脂質體被維持與細胞接觸一段足夠的時間以融合，其 44 201018401 使用各種方法以維持接觸，例如分離、結合劑、以及類似 者。在本發明的一個方面，脂質體係經設計以氣溶膠化而 用於肺部投藥。脂質體可使用介導膜之融合的經純化蛋白 質或胜肽（諸如仙台病毒或流行性感f病毒、等等）製備。 脂質可為任何已知的脂質體形成性脂質的有用結合，且包 含陽離子性或兩性離子性脂質，諸如㈣脂。剩下的脂質 一般為中性或酸性脂質’諸如膽固醇、填脂醢絲胺酸、磷 脂醯甘油、以及類似者。 為了製備脂質體’可使用由Kat。等人（1991)】獻 hem· 266· 3361所敘述的程序。簡而言之，脂質與包含胜 肽的内腔組成物與適合的水性基質（例行為食鹽水基質） 結合，其中總固體會在大約M〇重量百分比的範圍。在短 時間（大約5-60秒）激烈地攪動後’將管子置於溫水浴（大 約25-40 C)並重複此循環大約5·1〇次。組成物接著被音 波震I一段例行時間（-般大約Μ0秒）並可進一步藉由 漩渦震盪而攪動。接著藉由加入水性基質擴增體積，一般 :加體積大約1-2倍，接著搖動並冷卻。此方法允許高分子 量分子併入内腔中。 與其他活性劑調配 為了用於主題方法，本發明之抗微生物多肽可與其他 醫藥活性冑（特別是其他抗微生物劑）—起調配。所關注 的其他劑包含廣大範圍的抗生素，如技術領域中已知的。 抗生素之種類包含青黴素，例如青黴素G、青黴素ν、二甲 氧苯月黴素、苯唑西林、卡本西林、乙氧萘青黴素、胺丫 45 201018401 青黴素、等等·’青黴素與点内醯胺酶抑制子之組合、頭芽 、 胞菌素，例如頭孢克羅、頭孢唑林、頭孢呋新、拉氧頭孢、 等等；碳青黴烯；單菌擻素；胺基醣苷；四環素；巨環内 酉曰’林可黴素；多枯桿菌素；磺醯胺；喹諾酮； cloramphenicai;曱硝唑；觀黴素；三曱氧节嘧啶；萬古微 素；等等。 抗黴菌劑亦為有用，其包含多烯，例如雙性殺黴素B、 制黴菌素；5-flUC0syn ;以及唑，例如咪康唑、酮康唑、伊 曲康唑與氟康唑。細胞介素（例如干擾素r、腫瘤壞死目❹ 子α、介白素12、等等）亦可包含於本發明之抗微生物多 肽之調配物中。 試管内合成 本發明之抗微生物胜肽可藉由試管内合成，使用技術 領域中已知的例行方法製備。各種商業合成設備係可獲得 的，例如 Applied Bi〇SyStems Inc_，Beckman 等等的自動化 合成儀。藉由使用合成儀，可以非天然胺基酸（特別是d 同型異構物（或D型），例如D丙胺酸與〇異白胺酸、非❹ 鏡像異構物、具有不同長度或官能基的側鏈、以及類似者） 取代天然產生的胺基酸。製備的特殊順序與方式會取決於 方便性、經濟性、所需純度、以及類似者。 可將化學結合（包含例行的用於鍵結之官能基，諸如 用於形成醯胺或經取代胺（例如還原性胺化）的胺基團、 用於形成硫醚或雙硫鍵的硫醇基團、用於形成醯胺的鲮基 團、以及類似者）提供給各種胜肽或蛋白質。 46 201018401 若需要，可在合成期間或在表現期間將各種基團導入 胜肽中，其允許結合至其他分子或至一表面。因此，可使 用半胱胺酸以製造硫醚，使用組胺酸以連結至金屬離子錯 合物，使用羧基團以形成醯胺或脂，使用胺基團以形成醯 胺、以及類似者。 多肽亦可根據習用的重組合成方法而分離與純化。可 自表現宿主製備溶胞產物，並使用HPLC、排除層析、凝膠 電泳、親和力層析、或其他純化技術純化溶胞產物。在大 ® 多數情況下，所使用的組成物會包含至少20重量百分比的 所欲產物，更通常為至少大約75重量百分比，較佳為至少 大約95重直百分比，以及為了治療性目的，通常至少為大 約99.5重量百分比，其係相對於與產物之製備與其純化之 方法有關的污染。通常，該百分比會基於總蛋白質。 本發明進一步以以下實施例敘述，該等實施例不應被 理解為限制本發明的範圍。 ¥ 貧施例 用作為緩衝溶液與基質的化學品係至少試劑等級之商 業產品。 實施例1 合成的防禦素多肽之抗微生物活性

針對展現對葡萄球菌的改善的抗微生物活性，設計三 種合成的防禦素多肽（SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3與SEQ ID NO:4)。抗微生物活性係與已知的防禦素（先前於WO 47 201018401 03/044049與WO 2006/13 1504揭示）比較。胺基酸序列於 以下展示。所有相較於SEQ ID NO:5 ( Plectasin)的差異皆 以底線展示。 A: GFGCNGPWS_E DDLRCHRHCK S 工 KGY民GGYC AKGGFVCKCY (SEQ ID NO:2) B : GFGCNGPWS_E DDLKCHNHCK SIKGYKGGYC AKGGFLCKCY (SEQ ID NO:3) C : GFGCNGPWS_E DDLKCHRHCK SIKGYKGGYC AKGGFLCKCY © (SEQ ID NO :4) D: GFGCNGPWDE DDMQCHNHCK SIKGYKGGYC AKGGFVCKCY (SEQ ID NO :5) E : GFGCNGPWDE DDMKCHNHCK SIKGYKGGYC AKGGFLCKCY (SEQ ID NO :6) F : GFGCNGPWNE DDLRCHNHCK SIKGYKGGYC AKGGFVCKCY (SEQ ID NO：7) ❹ SEQ ID NO:5所示的胺基酸序列與Plectasin (參見WO 03/044049)相同。SEQ ID NO:6 與 WO 2006/131504 中的 SEQ ID NO:227 相同。SEQ ID NO:7 與 WO 2006/131504 中 的 SEQ ID NO:241 相同。 選殖編碼性基因並將其在米麴菌中表現（基本上如WO 03/044049 與 WO 2006/131504 中所述），純化、HPLC 定量 48 201018401 並在胜肽稀釋緩衝溶液（0.1% BS A，0.01 %醋酸）中稀釋成 640 # g/mL。 根據來自NCCLS / CLSI ( CLSI M7-A7)的方法對一、组 葛蘭氏陽性細菌測定最小抑制濃度（Minimal Inhibitory Concentration，MIC )。 將細菌生長在調整過陽離子的Miiler-Hinton液態培養 基中，並暴露至兩倍稀釋的胜肽，例如64、32、16、8、4、 2、1、0.5、0.25、0·13、0.6 與 0.03 y g/mL。於 37°C 培養 © 1 8-24小時後讀取MIC (以預防可目視細菌生長的最低胜肽 濃度測定）。 如表1所示，當與參考防禦素（以D、E與F顯示）相 比時，三種合成的防禦素（以A、B與C顯示）對葡萄球菌 與腸球菌是明顯改善的（2至8倍）。

表1 _最小抑制濃度（MIC ; " g/mL ) ATCC/ 其他Π) 細菌品系 參考 合成性防禦素 D SEQID N0:5 E SEQID NO:6 F SEQID NO:7 A SEQID NO:2 B SEQID NO:3 C SEQID NO:4 700788 金黃色葡萄球菌 >64 16 16 4 4 2 29213 金黃色葡萄球菌 16 4 2 1 1 0.5 700699 金黃色葡萄球菌 >64 64 32 8 16 8 25923 金黃色葡萄球菌 32 4 8 2 1 1 27626 表皮葡萄球菌 64 4 4 0.5 2 0.25 29212 糞腸球菌 (Enterococcus faecalis ) >64 32 32 8 8 4 51559 屎腸球菌 {Enterococcus faecium ) 64 16 8 8 4 4 698-01 金黃色葡萄球菌 32 8 4 1 2 1 2849-03 金黃色葡萄球菌 32 2 2 0.25 0.5 0.25 40135 金黃色葡萄球菌 32 2 2 1 1 0.5 1-15463 表皮葡萄球菌 4 2 1 0.25 0.5 0.25 49 201018401 【圖式簡單說明】 無 【主要元件符號說明】 無

50 201018401 - 序列表 <11 〇>諾佛酵素公司 <120>具有抗微生物活性的多肽 <130> 11539.204-WO <160> 7 <170> Patentln 3.5f® <210> <211> <212> <213> τ Η ο R IV 4 ρ <220> <223>合成的抗微生物胜肽 <220> <221>成熟胜肽 <222> (1)..(40) ❿ <220> <221> <222> <223> 雜項特徵 (14)..(14) Xaa = Arg或Lys <220> <221> <222> <223> 雜項特徵 (17) . . (17) Xaa - Asn^cArg <220> <221> <222> <223> 雜項特徵 (26) . . (26) Xaa = Arg 或：Lys <220> <221> <222> <223> 雜項特徵 (36)..(36) Xaa = Val或Leu ❿ <400> 1 Gly Phe Gly Cys Asn Gly Pro Trp Ser Glu Asp Asp Leu Xaa Cys His 15 10 15

Xaa His Cys Lys Ser lie Lys Gly Tyr Xaa Gly Gly Tyr Cys Ala Lys 20 25 30

Gly Gly Phe Xaa Cys Lys Cys Tyr 35 40 <210> <211> <212> <213>

2 40 PRT <220> <223>合成的抗微生物胜肽 <220> <221> <222> 成熟胜肽 ⑴· .（40) 1 201018401 <400> 2

Gly Phe Gly Cys Asn Gly Pro Trp Ser Glu Asp Asp Leu Arg Cys His 15 10 15

Arg His Cys Lys Ser lie Lys Gly Tyr Arg Gly Gly Tyr Cys Ala Lys 20 25 30

Gly Gly Phe Val Cys Lys Cys Tyr 35 40 <210> 3 <211> 40 <212> PRT <213> 人工 <220> <223>合成的抗微生物胜狀 <220> <221>成熟胜肽 <222> (1)..(40) <400> 3

Gly Phe Gly Cys Asn Gly Pro Trp Ser Glu Asp Asp Leu Lys Cys His 15 10 15

Asn His Cys Lys Ser He Lys Gly Tyr Lys Gly Gly Tyr Cys Ala Lys 20 25 30

Gly Gly Phe Leu Cys Lys Cys Tyr 35 40 <210> 4 <211> 40 <212> PRT <213> ΛΧ <220> <223> 合成的抗微生物胜肽 <220> <221> 成熟胜肽 <222> ⑴··（40) <400> 4

Gly Phe Gly Cys Asn Gly Pro Trp Ser Glu Asp Asp Leu Lys Cys His 1 5 l〇 15

Arg His Cys Lys Ser lie Lys Gly Tyr Lys Gly Gly Tyr Cys Ala Lys 20 25 30

Gly Gly Phe Leu Cys Lys Cys Tyr 35 40 <210> 5 <211> 40 201018401 ^

， <212> PRT <213> 黑色假盤菌(Pseudoplectania nigrella) <220> <221>成熟胜肽 <222> (1)··(40) <400> 5

Gly Phe Gly Cys Asn Gly Pro Trp Asp Glu Asp Asp Met Gin Cys His 15 10 15

Asn His Cys Lys Ser lie Lys Gly Tyr Lys Gly Gly Tyr Cys Ala Lys 20 25 30

Gly Gly Phe Val Cys Lys Cys Tyr 35 40 <210> 6 <211> 40 o

<212> PRT <213> AIL <220> <223>合成的抗微生物胜肽 <220> <221>成熟胜肽 <222> (1) .. (40) <400> 6

Gly Phe Gly Cys Asn Gly Pro Trp Ser Glu Asp Asp Met Lys Cys His 1 5 10 15

Asn His Cys Lys Ser He Lys Gly Tyr Lys Gly Gly Tyr Cys Ala Lys 20 25 30

Gly Gly Phe Leu Cys Lys Cys Tyr 35 40 <210> 7 <211> 40 <212> PRT <213> 人丁 <220> <223〉合成的抗微生物胜肽 <220> <221〉成熟胜肽 <222> (1)..(40) <400> Ί

Gly Phe Gly Cys Asn Gly Pro Trp Asn Glu Asp Asp Leu Arg Cys His 1 5 10 15

Asn His Cys Lys Ser He Lys Gly Tyr Lys Gly Gly Tyr Cys Ala Lys 20 25 30 3 201018401

Gly Gly Phe Val Cys Lys Cys Tyr 35 40

Claims (1)

1. 201018401 ! 七、申請專利範圍： 1· 一種具有抗微生物活性的多肽，其選自由以下者所組 成的群組： (a) 包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列的多肽： Gly-Phe-Gly-Cys-Asn-Gly-Pro-Trp-Ser-Glu-Asp-Asp-L eu-Xaa-Cys-His-Xaa-His-Cys-Lys-Ser-Ile-Lys-Gly-Tyr-Xaa-Gly-Gly-Tyr-Cys-Ala-Lys-Gly-Gly-Phe-Xaa-Cys-Lys-Cys-T yr ; 〇 其中 於位置14的Xaa為Arg或Lys ; 於位置17的Xaa為Asn或Arg ; 於位置26的Xaa為Arg或Lys ; 於位置36的Xaa為Val或Leu ; 以及 (b) 具有抗微生物活性的（a)之片段。 2.根據申請專利範圍第1項的多肽，其由SEQ ID ΝΟ:1 ❹ 之胺基酸序列或其具有抗微生物活性的片段所組成。 3·根據申請專利範圍第2項的多肽，其由SEQ ID NO: 1 之胺基酸序列所組成。 4. 根據申請專利範圍第1項的多肽，其包含sEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3 或 SEQ ID NO:4 之胺基酸序列。 5. 根據申請專利範圍第4項的多肽，其由SEq ip NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID ΝΟ··4之胺基酸序列所組成。 6. —種經分離的多核苷酸’其包含編碼根據申請專利範 1 201018401 圍第1-5項中任一項的多肽的核苷酸序列β 7.—種核酸構築體，其包含根據申請專利範圍第6項的 多核苷酸，該多核苷酸可操作地連接至一種或更多種指揮 該多肽在表現宿主中製造的控制序列。 8·—種重組表現載體，其包含根據申請專利範圍第7項 的核酸構築體。 9. 一種重組宿主細胞，其包含根據申請專利範圍第7項 的核酸構築體。 10.—種用於製造根據申請專利範圍第丨_5項中任一項 的多肽的方法，其包含（a)將含有包含編碼該多肽的核苷酸 序列的核酸構築體的宿主細胞’培養在有益於製造該多肽 的條件下；以及（b)回收該多肽。 ιι_一種用於製造根據申請專利範圍第1-5項中任一項 的多肽的方法，其包含⑷將包含編碼本發明之具有抗微生 物活性的多肽的多核苦酸的基因轉殖植物或植物細胞，培 養在有益於製造該多肽的條件下；以及⑻回收該多肽。 以編基因轉殖植物、植物部分或植物細胞，其已經 以編碼根據申請專利範圍第 苦酸轉形。 $中任-項的多狀的多核 —種醫藥組成物，其包合‘ + 中杯 申請專利範圍第1-53 千任一項中所定義的抗微生物吝 劑。 夕肽以及醫藥上可接受的4 14.根據申請專利範圍第 成物係用於治療微生物感染 13項的醫藥組成物， 其中該組 201018401 他15·一種如申請專利範圍第1-5項中任一項中所定義的 &微生物多肽，其係用作為醫藥品、或抗微生物獸醫或人 類治療性或預防性劑。 16.種如申请專利範圍第i_5項中任一項中所定義的 抗微生物多肽之用途’其係用於製備用於治療微生物感染 的醫藥品。 17_ —種用於殺死微生物細胞或抑制微生物細胞之生長 的方法’包含將該微生物細胞與如申請專利範圍第1 _5項中 〇 任一項中所定義的抗微生物多肽接觸。 八、圖式： 無 ❹ 3