CN114507630A - 一种合成14α-羟基-雄烷二酮的基因工程菌及其应用 - Google Patents

一种合成14α-羟基-雄烷二酮的基因工程菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种合成14α‑羟基‑雄烷二酮的基因工程菌及其应用，通过串联电子传递链元件以及辅酶再生元件合成14α‑OH‑AD的基因工程菌，串联表达菌株MNR M3△ksdD/pMV261‑14α‑G6PDH的14α‑OH‑AD摩尔生成率最高可达71.2±2.2％；通过以廉价植物甾醇作为底物一步生物转化生成14α‑羟基‑雄烯二酮，解决了现有霉菌细胞转化存在的底物价格昂贵，酶专一性不强以及后期产物分离难度大等问题。

Description

一种合成14α-羟基-雄烷二酮的基因工程菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物催化技术领域，尤其是一种合成14α-羟基-雄烷二酮的基因工程菌及其应用。
背景技术
甾体化合物也称为类固醇，在自然界中分布广泛，是一类以环戊烷多氢菲为母核的化合物，其广泛用作抗炎、利尿、避孕、抗雄激素、孕激素和抗癌药物，具有多种生理活性。
工业甾体激素药物合成的关键中间体为雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)和雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)，大部分甾体药物的合成都以这两种中间体为原料。而分枝杆菌具有可以直接将廉价植物甾醇进行侧链降解生成AD的作用，可以很大程度地降低底物成本。
在AD的甾体母核的不同位置引入羟基能增强甾体药物的抗炎活性。而含C-14羟基的甾体化合物具有重要的生理活性和药用价值，其具有抗促性腺激素、抗炎、抗癌以及心脏活性。14α-OH-AD可以通过化学方法转化成具有心脏活性的甾体14β-羟基衍生物，也是合成抗肿瘤药物14α-羟基-雄甾-4-烯-3,6,17-三酮(14α-OH-AT)的重要前体以及合成兽用孕激素14α，17α-丙基二氧孕酮-4-烯-3，20-二酮的关键中间体。
目前对于14α-OH-AD的合成主要采用霉菌细胞催化的方法，已知具有14α-羟化功能的真菌菌种主要是霉菌，如新月弯孢霉、卵形球孢托霉、冻土毛霉、毛壳霉、粗糙脉孢霉、总状毛霉、雅致枝霉、卷枝霉等。而14α-OH-AD在大多数真菌的催化反应中是以副产物的形式出现，生成率低，难以分离纯化。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种合成14α-羟基-雄烷二酮的基因工程菌。
本发明所要解决的技术问题在于提供上述合成14α-羟基-雄烷二酮的基因工程菌的应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种合成14α-羟基-雄烷二酮的基因工程菌，所述基因工程菌是以主产AD的分枝杆菌为宿主细胞，异源表达14α-羟化酶基因，并通过串联电子传递链元件还原酶(CPR)基因或辅酶再生元件葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶(G6PDH)基因所获得的。
上述合成14α-羟基-雄烷二酮的基因工程菌可促进14α-羟化反应的进行，以实现14α-OH-AD高效合成。
优选的，上述合成14α-羟基-雄烷二酮的基因工程菌，所述分枝杆菌为快速生长型分枝杆菌，包括分枝杆菌(Mycobacterium sp.)NRRLB-3683、分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)NRRLB-3805、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatism)、偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)、微黄分枝杆菌(Mycobacterium gilvum)、新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)、草分枝杆菌(Mycobacterium Phlei)或鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)。
优选的，上述合成14α-羟基-雄烷二酮的基因工程菌，所述分枝杆菌为新金分枝杆菌MNR M3△ksdD。
优选的，上述合成14α-羟基-雄烷二酮的基因工程菌，所述新金分枝杆菌MNR M3△ksdD由原始菌株TCCC11028(MNR)(保藏编号为CICC 21097，通过中国工业微生物菌种保藏管理中心购买得到，http://www.china-cicc.org/cicc/detail2/？sid＝3297)经自发突变后得到的突变菌株TCCC11028M3(MNR M3)为出发菌株，通过敲除3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因，从而获得基因缺陷型菌株MNR M3△ksdD。
上述新金分枝杆菌MNR M3△ksdD的构建方法来源于文章：Xie R,Shen Y,Qin N,et al.Genetic differences in ksdD influence on the A DD/AD ratio ofMycobacterium neoaurum[J].Journal of Industrial Microb iology&Biotechnology,2015,42(4):507-513.
优选的，上述合成14α-羟基-雄烷二酮的基因工程菌，所述14α-羟化酶基因来源于稻平脐蠕孢并且根据分枝杆菌密码子偏好性进行了密码子优化处理，优化后的14α-羟化酶基因的GC％为65.03％，序列如SEQ ID:NO 1所示。
优选的，上述合成14α-羟基-雄烷二酮的基因工程菌，所述14α-羟化酶基因插入表达载体pMV261的EcoRI和SalI酶切位点之间。
优选的，上述合成14α-羟基-雄烷二酮的基因工程菌，所述还原酶基因(CPR)来源于新月弯孢霉并且根据分枝杆菌密码子偏好性进行了密码子优化处理，所述还原酶基因(CPR)的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.2所示序列。
优选的，上述合成14α-羟基-雄烷二酮的基因工程菌，所述葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶(G6PDH)基因来源于分枝杆菌，所述葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶基因(G6PDH)的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.3所示序列。
优选的，上述合成14α-羟基-雄烷二酮的基因工程菌，为基因工程菌MNR M3△ksdD/pMV261-14α-G6PDH，完整pMV261-14α-G6PDH的核苷酸序列如SEQ ID:NO 4所示。
优选的，上述合成14α-羟基-雄烷二酮的基因工程菌，为基因工程菌MNR M3△ksdD/pMV261-14α-CPR，完整pMV261-14α-CPR的核苷酸序列如SEQ ID:NO 5所示。
上述合成14α-羟基-雄烷二酮的基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：
(1)将根据分枝杆菌偏好性密码子优化后的14α-羟化酶基因和表达质粒pMV261通过酶切，连接，构建pMV261-14α重组质粒，序列如SEQ ID:NO 6所示；
(2)将G6PDH基因和表达质粒pMV261通过酶切，连接，构建pMV261-G6PDH重组质粒；
(3)以所述重组质粒pMV261-G6PDH为模板，通过扩增得到带有质粒pMV261核糖体结合位点的G6PDH基因，将该G6PDH基因与重组质粒pMV261-14α通过酶切，连接，构建pMV261-14α-G6PDH重组质粒；
(4)将所述重组质粒pMV261-14α-G6PDH导入至分枝杆菌的感受态细胞中，构建串联辅酶再生元件的14α-羟化酶基因工程菌MNR M3△ksdD/pMV261-14α-G6PDH。
上述合成14α-羟基-雄烷二酮的基因工程菌的构建方法，具体步骤如下：
(1)将根据分枝杆菌偏好性密码子优化后的14α-羟化酶基因和表达质粒pMV261通过酶切，连接，构建pMV261-14α重组质粒，序列如SEQ ID:NO 6所示；
(2)将根据分枝杆菌偏好性密码子优化后的CPR基因和表达质粒pMV261通过酶切，连接，构建pMV261-CPR重组质粒；
(3)以所述重组质粒pMV261-CPR为模板，通过扩增得到带有质粒pMV261核糖体结合位点的CPR基因，将该CPR基因与重组质粒pMV261-14α通过酶切，连接，构建pMV261-14α-CPR重组质粒；
(4)将所述重组质粒pMV261-14α-CPR导入至新金分枝杆菌MNR M3△ksdD的感受态细胞中，构建获得基因工程菌MNR M3△ksdD/pMV261-14α-CPR。
上述基因工程菌在发酵制备14α-羟基-雄烷二酮(14α-OH-AD)方面的应用。
优选的，上述基因工程菌的应用，合成14α-羟基-雄烷二酮的具体方法如下：将合成14α-OH-AD的基因工程菌经种子培养后，按5-10％(v/v)的接种量转接至发酵培养基中，28-32℃，130-250r/min，pH 6.5-7.8条件下，发酵4-8d。
优选的，上述基因工程菌的应用，采用的发酵培养基(g/L)配方为：葡萄糖10，柠檬酸2，柠檬酸铁铵0.05，七水硫酸镁0.5，磷酸氢二钾0.5，磷酸氢二铵3.5，植物甾醇0.5-5，其余为水，pH 6.5-7.5。
有益效果：
上述合成14α-羟基-雄烷二酮的基因工程菌，其构建方法通过串联电子传递链元件或辅酶再生元件合成14α-OH-AD的基因工程菌，串联表达菌株MNR M3△ksdD/pMV261-14α-G6PDH的14α-OH-AD摩尔生成率最高可达71.2±2.2％；通过以廉价植物甾醇作为底物一步生物转化生成14α-羟基-雄烯二酮(14α-OH-AD)，解决了现有霉菌细胞转化存在的底物价格昂贵，酶专一性不强以及后期产物分离难度大等问题。
14α-羟化酶属于NADPH依赖型的P450酶，其羟化过程过程需要辅酶NADPH参与，并且霉菌中的14α羟化过程往往需要还原酶基因CPR的递氢作用参与。本发明构建出合成14α-羟基-雄烷二酮的基因工程菌，可实现直接从廉价底物植物甾醇(PS)为原料到新型甾体药物中间体14α-羟基-雄烯二酮(14α-OH-AD)的一步转化，并且通过构建电子传递链或串联辅酶再生元件来提高14α-羟化反应的进行效果。
附图说明
图1：重组质粒pMV261-14α-G6PDH的PCR验证图以及基因工程菌MNR M3△ksdD/pMV261-14α-G6PDH双酶切验证图，其中，M：DL 5000DNA Marker；1为重组质粒pMV261-14α-G6PDH的质粒PCR扩增条带；2为基因工程菌MNR M3△ksdD/pMV261-14α-G6PDH的双酶切条带。
图2：为本发明14α-羟化酶重组工程菌MNR M3△ksdD/pMV261-14α转化植物甾醇的反应式。
图3：为14α-羟化酶工程菌甾醇转化发酵液的TLC硫酸喷显图，其中1为AD标准品，2为终产物纯化样品，3为工程菌株MNR M3△ksdD/pMV261-14α终产物转化样品，4为工程菌株MNR M3△ksdD/pMV261-14α-G6PDH的终产物转化样品。
图4：为纯化产物气质联用分析中的质谱图。
图5：为纯化产物在400MHz下的1HNMR图。
图6：为纯化产物在101MHz的13CNMR图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。
下述实施例中主要试剂：
所用宿主菌MNR M3△ksdD的原始菌株TCCC11028(MNR)(保藏编号为CICC 21097)通过中国工业微生物菌种保藏管理中心购买得到(http://www.china-cicc.org/cicc/detail2/？sid＝3297)，经自发突变后得到的突变菌株TCCC11028M3(MNR M3)为出发菌株，通过敲除3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因，从而获得基因缺陷型菌株MNR M3△ksdD。
甾体底物购自中粮集团有限公司，甲基倍他环糊精购自山东滨州智源生物科技有限公司，乙酸乙酯、石油醚购自天津市津东天正精细化学试剂厂，色谱甲醇购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司，TLC硅胶板以及300目硅胶购自青岛海洋化工厂，其他试剂未特别注明来源的，均购自国药集团化学试剂有限公司。
实施例1目的基因14α-羟化酶基因的获得
由于新月弯孢霉的14α-羟化酶已成功表达于酿酒酵母细胞，并展现出相应的活性；因此选择新月弯孢霉来源的14α-羟化酶基因作为氨基酸比对模板通过KEGG序列比对功能以及后期甾醇转化实验筛选出来源于稻平脐蠕孢的14α-羟化酶基作为本发明的原始基因。
将来源于稻平脐蠕孢的14α-羟化酶原始基因序列送至金唯智公司，合成符合分枝杆菌密码子偏好性的14α-羟化酶基因。以公司合成的含有14α-羟化酶基因序列的质粒pUC57-14α为模板(质粒pUC57-14α的序列为序列表SEQ ID NO.7所示序列)，以及pMV261质粒上的酶切位点设计14α-羟化酶基因引物，通过PCR扩增并纯化获得密码子优化后的14α-羟化酶基因(序列为序列表SEQ ID NO.1所示序列)；
PCR反应体系：5×Trans pfu Buffer 10μL，2.5mM dNTPS 4μL，模板DNA 1μL，上下游引物14α-F、14α-R各0.5μL，Trans Fastpfu DNA ploymerase 1μL，ddH2O补齐至总体积50μL。
PCR反应条件：95℃5min，95℃30s，63℃30s，72℃100s，循环30次，72℃10min，10℃保持。
对比例1基因工程菌MNR M3△ksdD/pMV261-14α的构建
1、构建pMV261-14α质粒，其过程包括：
将由实施例1获得的目的片段14α-羟化酶基因与穿梭质粒pMV261分别用EcoRI和SalI双酶切并纯化，然后16℃过夜连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，使用卡那霉素平板筛选基因工程菌，挑取转化子进行PCR验证，扩增出长度1500bp的条带，将PCR验证正确的质粒送至金唯智公司测序，测序正确的质粒即为重组质粒pMV261-14α，序列如SEQ ID:NO 6所示。
2、构建基因工程菌MNR M3△ksdD/pMV261-14α：
(1)新金分枝杆菌MNRM3△ksdD感受态细胞制备：选择新金分枝杆菌MNR M3△ksdD作为宿主细胞，将该菌的一级种子培养至OD600为1.0左右,按10％接种量转接到种子培养基中进行二级种子培养；24h后加入2％甘氨酸继续培养24h。离心收集菌体，分四次用10％预冷甘油冲洗悬浮菌体并离心，最后加入甘油悬浮菌体，并分装保存；
种子培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO3 10g/L，其余为水，pH7.2；
(2)电转化：10μL步骤1所得重组质粒pMV261-14α加入100μL分枝MNR M3△ksdD感受态菌体中放置10min，电击条件如下：1.5KV-2KV条件下电转两次，每次4-5ms；
(3)重组子筛选与验证：电转产物加入种子培养基复苏培养3-5h后，涂布于含有卡那霉素(50mg/L)种子培养基平板上，30℃静置培养3-5d，挑取单菌落至液体种子培养基培养3d左右，进行菌液双酶切验证，释放出1.9kb和4kb的条带，验证正确的阳性转化子即为基因工程菌MNR M3△ksdD/pMV261-14α。
实施例2串联表达菌株MNR M3△ksdD/pMV261-14α-G6PDH的构建
1、构建pMV261-G6PDH质粒，其过程包括：
根据NCBI序列查找，发现分枝杆菌自身存在葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶基因(G6PDH)，参照NCBI公布的Mycobacterium neoaurum1815D的G6PDH基因序列，故本发明选用分枝杆菌自身的G6PDH作为目的基因(序列如序列表SEQ ID NO.3所示)。
以pMV261上的酶切位点设计G6PDH基因引物，以分枝杆菌基因组为模板，以G6PDH-F、G6PDH-R为引物，通过PCR扩增出G6PDH基因序列(SEQ ID NO.3所示序列)。将获得的目的片段G6PDH以及穿梭质粒pMV261分别双酶切并纯化，然后16℃过夜连接，化转至大肠杆菌DH5α感受态细胞，使用卡那霉素平板筛选基因工程菌，挑取转化子进行质粒双酶切验证，将验证正确的质粒送至金唯智公司测序，测序正确的质粒即为重组质粒pMV261-G6PDH；
2、构建pMV261-14α-G6PDH重组质粒
以构建好的重组质粒pMV261-G6PDH为模板，设计引物G6PDH-F、G6PDH-R，通过PCR扩增得到G6PDH基因，对纯化后的G6PDH及实施例1中的重组质粒pMV261-14α进行双酶切处理，16℃过夜连接后，化转至大肠杆菌DH5α感受态细胞，使用卡那霉素平板筛选基因工程菌，挑取转化子进行菌液PCR及质粒PCR验证(参照图1(a))，将验证正确的质粒送至金唯智公司测序，测序正确的质粒即为重组质粒pMV261-14α-G6PDH(SEQ ID NO.4所示序列)；
3、构建基因工程菌MNR M3△ksdD/pMV261-14α-G6PDH：
新金分枝杆菌MNR M3△ksdD感受态细胞制备：选择新金分枝杆菌MNR M3△ksdD作为宿主细胞，按照对比例1步骤2(1)的方法制备感受态细胞；
电转化：取10μL步骤1所得重组质粒pMV261-14α-G6PDH加入100μL新金分枝杆菌MNR M3△ksdD感受态菌体冰上放置10min，电击条件如下：1.5KV条件下电转两次，每次4-5ms；
重组子筛选与验证：电转产物加入种子培养基复苏培养3-5h后，涂布于含有卡那霉素(50mg/L)种子培养基平板上，30℃静置培养3-5d，挑取单菌落至液体种子培养基培养3d左右，提取质粒双酶切酶切验证，释放出大小约为6kb和1.5kb的基因片段(参照图1(b))，验证正确的阳性转化子即为基因工程菌MNR M3△ksdD/pMV261-14α-G6PDH。
实施例3串联表达菌株MNR M3△ksdD/pMV261-14α-CPR的构建
1、构建pMV261-CPR重组质粒，其过程包括：
根据文献报道选用已知新月弯孢霉来源且有活性的CPR基因，进行NCBI序列查找，并按照分枝杆菌密码子偏好性进行优化(序列如序列表SEQ ID NO.2所示)。
以pMV261上的酶切位点设计CPR基因引物，以分枝杆菌基因组为模板，以CPR-F、CPR-R为引物，通过PCR扩增出CPR基因序列。将获得的目的片段CPR以及穿梭质粒pMV 261分别用双酶切并纯化，然后16℃过夜连接，化转至大肠杆菌DH5α感受态细胞，使用卡那霉素平板筛选基因工程菌，挑取转化子进行菌液PCR和质粒经PCR验证，验证正确的质粒送至金唯智公司测序，测序正确的质粒即为重组质粒pMV261-CPR；
2、构建pMV261-14α-CPR重组质粒
以构建好的重组质粒pMV261-CPR为模板，设计引物CPR-F、CPR-R，通过PCR扩增得到含有质粒pMV261核糖体结合位点的G6PDH基因(SEQ ID NO.3所示序列)，对纯化后的G6PDH及实施例1中的重组质粒pMV261-14α进行双酶切处理，16℃过夜连接后，化转至大肠杆菌DH5α感受态细胞，使用卡那霉素平板筛选基因工程菌，挑取转化子进行菌液PCR，将PCR验证正确的质粒送至金唯智公司测序，测序正确的质粒即为重组质粒pMV261-14α-CPR(SEQID NO.5所示序列)；
3、构建基因工程菌MNR M3△ksdD/pMV261-14α-CPR：
(1)新金分枝杆菌MNR M3△ksdD感受态细胞制备：选择新金分枝杆菌MNR M3△ksdD作为宿主细胞，按照对比例1步骤2(1)的方法制备感受态细胞；
(2)电转化：取10μL步骤1所得重组质粒pMV261-14α-CPR加入100μL新金分枝杆菌MNR M3△ksdD感受态菌体冰上放置10min，电击条件如下：1.5KV条件下电转两次，每次4-5ms；
(3)重组子筛选与验证：电转产物加入种子培养基复苏培养3-5h后，涂布于含有卡那霉素(50mg/L)种子培养基平板上，30℃静置培养3-5d，挑取单菌落至液体种子培养基培养3d左右，进行质粒提取并且双酶切验证，释放出长度为1.3kb和6.7kb的片断，验证正确的阳性转化子即为基因工程菌MNR M3△ksdD/pMV261-14α-CPR。
上述实施例、对比例涉及引物及酶切位点见下表1。
表1
Figure BDA0003486781840000081
实施例4合成14α-OH-AD的工程菌株转化PS生产14α-OH-AD的方法与产物鉴定
1、菌种活化培养:
将14α-羟化酶的单表达以及串联表达菌株转接于新鲜斜面培养基上，30℃培养3d，用20mL 0.5％的Tween 80无菌水溶液洗下斜面培养基上的菌种，混合均匀得洗脱液，吸取1mL洗脱液加入到30mL种子培养基中，于30℃，200r/min条件下摇床培养36h；
斜面培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO3 10g/L，琼脂20g/L，其余为水，pH7.2；
种子培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO3 10g/L，其余为水，pH7.2。
2.植物甾醇微生物转化：
将步骤1中活化的种子培养液按8-12％的接种量转接于装有发酵培养基的250mL挡板瓶中，在30℃，140r/min条件下摇床培养4-8d；
发酵培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，植物甾醇0.5-5g/L，其余为水，pH 7.2。
3.14α-羟化酶重组工程菌转化植物甾醇的反应式如图2所示。
4.甾醇转化产物纯化与结构鉴定
(1)TLC薄层层析初步检测产物
样品处理：
取800μL实施例2转化完成获得的发酵液于2mL离心管，取800μL乙酸乙酯超声萃取30min，使其与发酵液充分混合，14000r/min离心10min分层。
用内径为0.3mm的毛细吸管(长10cm)吸取处理完成的样品约2-4cm上层乙酸乙酯层点样于硅胶层析板上。在距层析板边缘1cm处点样，样点间距0.7cm。在展开之前需要用展开剂将层析缸饱和30min。
层析：
将点有样品的硅胶板放于层析缸中展开，加盖，密封，待展开剂距离前沿1cm时，取出点样板，挥干。采用紫外检测仪于254nm的波长下观察层析斑点的颜色和大小。展开剂为石油醚:乙酸乙酯＝3:2(v/v)。
TLC薄层层析检测产物结果如图3所示。结果显示该菌株能够转化PS生成除AD外的其他产物，且经过硫酸：乙醇＝1:9(v/v)的喷显剂喷显烤板显示，该产物的喷显颜色为紫红色。
(2)实验产物分离纯化:
将样品用硅胶层析柱进行分离，固定相为300目的硅胶层析柱，流动相为配比为石油醚：乙酸乙酯＝3:2(v/v)的有机溶液，以样品与硅胶的体积比为1:50-100的方式进行干法装柱，分离完成后合并含有较多产物的组分，并用旋转蒸发仪在30-40℃中将有机溶剂挥发，得到产物的粗品结晶，用有机溶液复溶，进行重结晶，最终得到转化产物纯品。
(3)高效液相色谱分析检测产物纯度
为了进一步鉴定得到的产物是否纯净，取分离纯化的产物于干净的1.5mL EP管中挥干，加入1mL 80％甲醇溶液完全溶解后，经0.22μm膜过滤至液相小瓶中，备用。
高效液相色谱分析的色谱条件如下：
色谱柱为C18柱(4.6mmDL×250L mm，5μm)，甲醇-水为流动相，流动相比为80:20(v/v)，流速为1mL/min，柱温为30℃，进样量为10μL，采用紫外检测器，检测波长为254nm。本方法中所用甲醇为色谱纯，水为超纯水经过滤超声处理。
(4)气质联用(GC-MS)测定产物分子量
通过气质联用(GC-MS)对纯化产物进行分子质量检测，其最大吸收峰处对应的质谱(ESI-MS)图，即为转化产物的质谱图，如图4显示，其相对分子质量为302，比底物(286)多了16，多了一个氧的质量，推测可能是在母核上发生了羟基化反应。
(5)核磁共振波谱分析产物结构
将上述分离纯化获得的产物溶于CDCl3中至饱和利用型号为布鲁克Ascend 400的核磁共振仪进行核磁共振检测。
1H NMR、13C NMR谱分别用400MHz和101MHz记录，图谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δppm 5.66(1H，s，H-4)，1.15(3H,s，H-19),0.97(3H,s，H-18).
13C NMR(101MHz,CDCl3)δppm 218.65(C-17),199.67(C-17),170.49(C-5),123.99(C-4),80.53(C-14),52.59(C-13),46.76(C-9),38.66(C-10),37.96(C-12),35.65(C-1),33.88(C-2),32.38(C-6),30.13(C-7),29.67(C-8),25.58(C-15),24.50(C-16),19.13(C-11),17.84(C-19),17.30(C-18).
根据产物的1H NMR、13C NMR结果，如图5以及图6显示，碳谱中C-14位的化学位移从AD的50.05变为80.53，后者与文献报道C14α-OH-AD的碳谱数据一致，氢谱的特征峰(H4＝5.66，H18＝0.97，H19＝1.15)的化学位移值与文献报道C14α-OH-AD的氢谱数据一致，鉴于AD母核的C14α-H被OH取代，故产物确认为C14α-OH-AD。
需要说明的是由以下实施例5-12构建的基因工程菌在进行产物结构的核磁分析鉴定结果均与实施例1-3的基因工程菌的鉴定结果一致，实施例5-12的工程菌所产14α-OH-AD的1H和13C谱数据显示，其化学迁移均与文献报道的14α-OH-AD保持一致。
C14α-OH-AD的碳谱数据和氢谱数据来源于以下文献：Faramarzi M A,Badiee M,Yazdi M T,et al.Formation of hydroxysteroid derivatives from androst-4-en-3,17-dione by the filamentous fungus Mucor racemosus[J].Journal of MolecularCatalysis B Enzymatic,2008,50(1):7-12.
实施例5基因工程菌的构建以及转化PS生产14α-OH-AD的方法
1.基因工程菌的构建：(1)构建14α-羟化酶质粒：方法同实施例1-3；(2)构建基因工程菌株：选择将分枝杆菌NRRLB-3683作为宿主细胞，在感受态细胞制备、电转化以及重组子筛选与验证方法同实施例1-3，以此获得基因工程菌。
2.基因工程菌转化PS生产14α-OH-AD的方法：
将构建的基因工程菌按照实施例4的菌种活化培养以及植物甾醇微生物转化方法发酵生产14α-OH-AD。
实施例6基因工程菌的构建以及转化PS生产14α-OH-AD的方法
基因工程菌的构建以及转化PS生产14α-OH-AD的方法同实施例4，唯一不同是宿主菌为分枝杆菌NRRLB-3805。
实施例7基因工程菌的构建以及转化PS生产14α-OH-AD的方法
基因工程菌的构建以及转化PS生产14α-OH-AD的方法同实施例4，唯一不同是宿主菌为耻垢分枝杆菌。
实施例8基因工程菌的构建以及转化PS生产14α-OH-AD的方法
基因工程菌的构建以及转化PS生产14α-OH-AD的方法同实施例4，唯一不同是宿主菌为偶发分枝杆菌。
实施例9基因工程菌的构建以及转化PS生产14α-OH-AD的方法
基因工程菌的构建以及转化PS生产14α-OH-AD的方法同实施例4，唯一不同是宿主菌为微黄分枝杆菌。
实施例10基因工程菌的构建以及转化PS生产14α-AD的方法基因工程菌的构建以及转化PS生产14α-OH-AD的方法同实施例4，唯一不同是宿主菌为新金分枝杆菌。
实施例11基因工程菌的构建以及转化PS生产14α-OH-AD的方法基因工程菌的构建以及转化PS生产生产14α-OH-AD的方法同实施例4，唯一不同是宿主菌为草分枝杆菌。
实施例12基因工程菌的构建以及转化PS生产14α-OH-AD的方法
基因工程菌的构建以及转化PS生产14α-OH-AD的方法同实施例4，唯一不同是宿主菌为鸟分枝杆菌。
实施例13基因工程菌与原始菌株性能比较
将菌株分为三组，分别进行以下菌株性能的测定。分组如下：
实验组1：本发明实施例2构建的基因工程菌：MNR M3△ksdD/pMV 261-14α-G6PDH；
实验组2：本发明实施例3构建的基因工程菌：MNR M3△ksdD/pMV 261-14α-CPR；
对照组1：本发明对比例1构建的基因工程菌：MNR M3△ksdD/pMV 261-14α。
1、3株菌株生长性能比较
将三株菌分别转接于新鲜斜面培养基上，30℃培养3d，用20mL 0.5％的Tween 80无菌水溶液洗下斜面培养基上的菌种，混合均匀得洗脱液，吸取1mL洗脱液加入到30mL种子培养基中，在30℃，200r/min条件下摇床培养36h得种子培养液，当菌株生长到对数生长期时，按10％的接种量转接至装有50mL不含0.5g/L植物甾醇的发酵培养基中，每隔12h取样测定吸光度600nm处的吸光值，绘制生长曲线。
斜面培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO3 10g/L，琼脂20g/L，其余为水，pH7.2；
种子培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO3 10g/L，其余为水，pH7.2。
发酵培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，植物甾醇0.5g/L，其余为水，pH 7.2。
所述宿主菌MNR M3△ksdD为敲除了3-甾酮-Δ1-脱氢酶(ksdD)的分枝杆菌，ksdD催化AD生成ADD，其敲除可以阻断AD的降解，达到积累AD的目的。
2.工程菌葡萄糖消耗情况比较
对分枝杆菌进行活化及种子培养，当菌株生长到对数生长期时，按10％的接种量转接至装有50mL含0.5g/L植物甾醇的发酵培养基中，每隔12h取样测发酵液中葡萄糖含量。
3.结果比较
串联表达菌株MNR M3△ksdD/pMV261-14α-G6PDH的生长速率以及葡萄糖消耗较单表达菌株MNR M3△ksdD/pMV261-14α较快，而串联表达菌株MNR M3△ksdD/pMV261-14α-CPR较单表达菌株其葡萄糖消耗以及生长情况较慢。在4d之后，推测可能是由于辅酶再生基因的辅酶回补作用以及还原酶基因的表达促进了羟化反应中质子传递作用抵消了串联元件对于菌株生长性能的影响，三株菌株的生长情况以及葡萄糖消耗情况逐渐趋于一致，并且串联辅酶再生基因G6PDH相较于串联还原酶基因CPR其对于工程菌的生长情况影响较小。由实施例5-12构建的基因工程菌在进行实施例13的菌种性能测定中，菌株生长性能、菌葡萄糖消耗均得到与实施例13的基因工程菌MNR M3△ksdD/pMV 261-14α-G6PDH、MNR M3△ksdD/pMV261-14α-CPR,MNR M3△ksdD/pMV 261-14α相近的技术效果。
实施例14基因工程菌MNR M3△ksdD/pMV261-14α和MNR M3△ksdD/pMV261-14α-G6PDH、MNR M3△ksdD/pMV261-14α-CPR转化PS生产14α-OH-AD比较
将工程菌分组进行由PS生产14α-OH-AD转化性能的比较，具体分组为：
对照组：对比例1构建的基因工程菌MNR M3△ksdD/pMV261-14α；
实验组1：实施例2构建的基因工程菌MNR M3△ksdD/pMV261-14α-G6PDH；
实验组2：实施例3构建的基因工程菌MNR M3△ksdD/pMV261-14α-CPR；
1、基因工程菌转化植物甾醇实验方法如下：
按照实施例4中菌种活化培养方法，分别将两组菌株经相同的方法活化后，将活化的种子培养液以8-10％的接种量转接于含有发酵培养基的250mL挡板瓶中，在30℃，140r/min条件下摇床培养4-8d；
斜面培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，硝酸铵2g/L，甘油20g/L，葡萄糖5g/L，CaCO3 10g/L，琼脂20g/L，其余为水，pH7.2；
2、14α-OH-AD摩尔生成率的检测：
用乙酸乙酯超声萃取发酵液，离心，取乙酸乙酯相0.2mL于1.5mL管中,自然风干后加1mL的流动相，超声溶解，离心后进行HPLC分析。
色谱条件：C18柱,流动相为甲醇：水(4:1)，流速为1mL/min，柱温为30℃，检测波长为254nm。
2、结果比较：
表2
Figure BDA0003486781840000131
如表1所示，串联表达辅酶再生元件的工程菌株MNR M3△ksdD/pMV261-14α-G6PDH的14α-OH-AD的摩尔生成率最高达到了71.2±2.2％，
采用ksdD(C1,2位脱氢酶)基因敲除的新金分枝杆菌作为宿主，植物甾醇侧链降解时不会将生成的AD转化成ADD等C1,2位脱氢产物，提高AD的积累量，最终可协同异源表达的14α-羟化酶共同提高目标产物14α-OH-AD的产量。
需要说明的是，由实施例5-12构建的基因工程菌在进行实施例14转化PS生产14α-OH-AD的14α-OH-AD产量以及摩尔转化率中，均能获得与实施例14的基因工程菌MNR M3△ksdD/pMV261-14α-G6PDH相近的技术效果。
实施例15基因工程菌MNR M3△ksdD/pMV261-14α-G6PDH转化不同浓度PS生产14α-OH-AD性能比较
(1)菌种培养：将基因工程菌MNR M3△ksdD/pMV261-14α-G6PDH按照实施例3步骤1：菌种活化培养。
转化实验：将活化好的种子液转接至分枝发酵培养基中，每天在固定的取样。
发酵培养基组成:K2HPO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，柠檬酸铁铵0.05g/L，柠檬酸2g/L，磷酸氢二铵3.5g/L，葡萄糖10g/L，植物甾醇1g/L，其余为水，pH 7.2。
(2)14α-OH-AD的检测分析：用乙酸乙酯超声萃取发酵液，离心，取乙酸乙酯相0.2mL于1.5mL管中,自然风干后加1mL的流动相，超声溶解，离心后进行HPLC分析。色谱条件：C18柱,流动相为甲醇：水(4:1)，流速为1mL/min，柱温为30℃，检测波长为254nm。
(3)结果比较：
对工程菌株MNR M3△ksdD/pMV261-14α-G6PDH转化PS结果分析发现，当PS浓度为1g/L时，14α-OH-AD的摩尔转化率达50±2％。
实施例16基因工程菌MNR M3△ksdD/pMV261-14α-G6PDH转化不同浓度PS生产14α-OH-AD性能比较
基因工程菌MNR M3△ksdD/pMV261-14α-G6PDH转化PS生产14α-OH-AD的方法同实施例15，唯一不同是植物甾醇为5g/L，对转化结果分析发现，当底物浓度为5g/L时，14α-OH-AD的摩尔转化率约15±1.3％。
需要说明书的是，由实施例5-12构建的基因工程菌在进行实施例15、16转化PS生产14α-OH-AD产量以及摩尔转化率中，均能获得与实施例15、16的基因工程菌MNR M3△ksdD/pMV261-14α-G6PDH相近的技术效果。
综上所述，本发明利用植物甾醇经分枝杆菌侧链降解作用生成AD，AD经甾体14α-羟化酶的催化作用生成14α-OH-AD；同时，AD到14α-OH-AD的催化反应是由14α-羟化酶作用完成。在羟化反应中葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶(G6PDH)以葡萄糖为底物，催化其脱氢生成NADPH。为了实现14α-羟化反应中NADPH的循环再生，将14α-羟化酶与G6PDH串联表达于分枝杆菌，来提高14α-OH-AD的生成效率。同时本发明还将电子传递链元件还原酶基因CPR与14α-羟化酶基因串联表达于分枝杆菌，利用还原酶的质子传递作用促进羟化反应的正常进行。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，本发明菌株的构建步骤不分先后顺序，本技术领域技术人员以本发明的方法或以本方法为基础进行的菌种改造等改进和润饰均视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种合成14α-羟基-雄烷二酮的基因工程菌及其应用
<130> 2022
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1518
<212> DNA
<213> Mycobacterium neoaurum
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1518)
<400> 1
atggacccgc agaccgccgc gcagatcgtg cacaccctgc agaccaccgc catcgcggcc 60
gtgatcttcg ccgcctgtgt cctgctgccg cgcctgcaag ccaaggcgca gctggagaag 120
ctgccgtcgg ccaacctcga tgccggcgag aaggcccgcc aagccttcat cacctcggcc 180
cgcaagctgt accaagacgg ctaccacaac ttcaagaact cggtgttccg cctgatcaac 240
gagaacggcc aagagaacgt gatcgtgccg cgctcgctgc tgcaagagct gcgcaagatg 300
ccggacgacg tgctgtcgtt cccgaaggcc atcgaggacg acatggagat caagtacacc 360
cgcctgcagt cggagggcgc caccgccatc cacgtggtga agtcggacct gacctcggcc 420
ctgccgcggc tgaacccgat catctgccaa gacgtggacg ccgccctgaa ggagtacatg 480
ccgccgtgcg acgactggac cgacgtgaac atcaacgcca agctggtgac catcattgcc 540
aaagtcagcg gccgcatctt cgtgggcccg gagctgtcgc gcgacccgga gtacctggac 600
gccgcctgca actacaccat cgacctgatc aacgccgtga acggcatcaa aaagatccgc 660
ccgtggctca agccgttcct ggccccgcgc accccggagc tcatcgccct gcgcaaccgc 720
gagaagcaag ccgagaagat cctgcagccg ctggtggccg agcgcctcgc cgcgaaggcc 780
ggcgacccga actggcaaga gccggacgac atgctgcagt ggatgatcaa ccgctcggac 840
ggcaaggagt cggtggccct gctggcccgc tatcagctgg ccgtcatctt cgccgccatc 900
cacaccacga ccatgaccgc caccaacgtg ctgtacaccc tggccgtgac cccggagtac 960
atcgagccga tccgcgagga gatccgcaac gccatcgccg agcacggctc gatcaccttc 1020
cgcgccctgc agcagatggt gaagctggac tcgtacatga aagaggtgac ccgcctgtac 1080
ccgccgggca tcacctcgtt cgcccgccgc accctgaagg gcatcaccct gtcgaacggt 1140
cagtacatcc cgccgggcgt gaccatcgag gtgccgtcgg ccgccatcta caccgacgag 1200
tcggtgttcc cgagctcgga gaccttcgac ggtctgcgcg cctacaacgc ccgcagcacc 1260
ggcaaggcct cggacatcgc ccgcaatcag ttcgtgacca ccaacgagga gaacctgacc 1320
ttcggctacg gccgccacgc ctgcccgggc cgcttcttcg ccgccaacga gatcaagatg 1380
gtggtggccc gcctggtgct ggactacgac gtgaagatgc cgaacgacga gaccaagcgc 1440
tacacgcaga tcgagatcgg caagcagtcg atgccggacc cgaccaagac cctggccttc 1500
aagaaggtgg tgatctga 1518
<210> 2
<211> 2091
<212> DNA
<213> Curvularia lunata
<220>
<221> gene
<222> (1)..(2091)
<400> 2
atggcgcagc tggacaccct ggacatcatc gtcctggccg tcctgctggt cggcaccgtc 60
gcctacttca ccaagggcac ctactgggcc gtctccgccg acccgtatgg gtcgtccctc 120
gccaccgcga acggcgccgc caaggccggc aagtcccgca acatcatcga gaagatggac 180
gagaccgaca agaactgcgt cgtcttctac ggctcgcaga ccggcaccgc cgaggactac 240
gcctcgcgca tctcgaagga gggccactcg cgcttcggcc tgaagaccat ggtcgccgac 300
ctggaggagt acgactacga caacctggac gccttcccgg aggacaagct ggccgtcttc 360
gtcctggcca cctacgggga aggcgagccg accgacaacg ccgtcgagtt ctacgagttc 420
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gtccgcaacg tcgacaaata cctcacgcgc ctgggggcca agcgcctggg ggccgccggg 600
gagggcgacg atggcgccgg caccatggag gaggacttcc tggcctggaa ggagccgatg 660
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tccccgacga cctacgacgc cgccctgcgc taccacatcg agatcaacgc cgccgtctcg 1140
cggcagctgg tctcggtcgt cgcgcagttc gccccgaacg aggacatcaa ggccgagatc 1200
gtcaagctgg gcggcgacaa ggactacttc aaggagcaag tcaccgaccg caacctgaac 1260
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gccccgtacg ccctgaaggg cgtcaccacc aactacctgc tggccctgaa gcagaagcag 1500
cacggcgacc cgaacccgga cccgcacggc ctgtcgtact cgatcaccgg cccgcgcaac 1560
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gatccgtcca agccgatcat catggtcggc ccgggcaccg gcgtggcgcc cttccgcggc 1680
tttgtgcaag agcgcgcggc ccaagccaag gccgggcaga acgtcggcaa gaccgtcctg 1740
ttcttcggct gccgcaagca gtcggaggac ttcatgtacg ccgacgagtg gaagcagtat 1800
cagcaagacc tgggcgacaa gttcgagatg cacaccgcct tctcgcgcga cggcccgcag 1860
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ctgctgggca agatcatcgc caagtaccgc aacgtctcgg agaccaaggg cgaggagatt 2040
gtgaaggcca tgcgcgcctc gaatcagtac caagaggacg tctggtcgtg a 2091
<210> 3
<211> 1542
<212> DNA
<213> Mycobacterium
<220>
<221> gene
<222> (1)..(1542)
<400> 3
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gccgccaagg acggcgacag ctggagccgg gtggtcatcg agaagccgtt cggccacgac 540
ctgtccagcg ccgaggagct caacggcctg gtcaacagcg tgttcccgga gtcgtcggtg 600
ttccgcatcg accactatct gggcaaggag acggtgcaga acatcttggc gttgcgtttt 660
gccaacgaga tgttcgagcc gatctggaac gcccattacg tcgaccatgt ccagatcacc 720
atggccgagg acatcggtct gggcggtcgg ggcggctact acgacggtgt cggtgcggcc 780
cgcgatgtga tccagaacca tctgatccag ctgctggcgc tgacggcgat ggaggagccg 840
gtgagcttct cccccgccga actgcaggcc gagaagatca aggtgctggc cgccagccgg 900
ttggccgaac cgttggacca gaccacctcc cgcggccagt acgccgcggg ctggcagggc 960
ggtgagaagg tggtcgggct gctcgacgag gaggggttct cccagacctc gactacggag 1020
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<210> 4
<211> 7541
<212> DNA
<213> plasmid
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(7541)
<400> 4
gctagccaac aaagcgacgt tgtgtctcaa aatctctgat gttacattgc acaagataaa 60
aatatatcat catgaacaat aaaactgtct gcttacataa acagtaatac aaggggtgtt 120
atgagccata ttcaacggga aacgtcttgc tcgaggccgc gattaaattc caacatggat 180
gctgatttat atgggtataa atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc 240
tatcgcttgt atgggaagcc ccatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc 300
gttgccaatg atgttacaga tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcct 360
cttccgacca tcaagcattt tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg 420
atccccggga aaacagcatt ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt 480
gttgatgcgc tggcagtgtt cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct 540
tttaacagcg atcgcgtatt tcgtctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg 600
gttgatgcga gtgattttga tgacgagcgt aatggctggc ctgttgaaca agtctggaaa 660
gaaatgcata atcttttgcc attctcaccg gattcagtcg tcactcatgg tgatttctca 720
cttgataacc ttatttttga cgaggggaaa ttaataggtt gtattgatgt tggacgagtc 780
ggaatcgcag accgatacca ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct 840
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ccctcacttt ctggctggat gatggggcga ttcaggcctg gtatgagtca gcaacacctt 1200
cttcacgagg cagacctcac tagttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag 1260
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cgctaccagc ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc aactcttttt ccgaaggtaa 1380
ctggcttcag cagagcgcag ataccaaata ctgtccttct agtgtagccg tagttaggcc 1440
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ccgaagggag aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag ggtcggaaca ggagagcgca 1740
cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 1800
tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 1860
ccagcaacgc ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg gccttttgct cacatgttct 1920
ttcctgcgtt atcccctgat tctgtggata accgtattac cgcctttgag tgagctgata 1980
ccgctcgccg cagccgaacg accgagcgca acgcgtgagc ccaccagctc cgtaagttcg 2040
ggtgctgtgt ggctcgtacc cgcgcattca ggcggcaggg ggtctaacgg gtctaaggcg 2100
gcgtgtacgg ccgccacagc ggctcttagc ggcccggaaa cgtcctcgaa acgacgcatg 2160
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ctgacttgga gctcgtgtcg gaccatacac cggtgattaa tcgtggttta ttatcaagcg 2340
tgagccacgt cgccgacgaa tttgagcagc tctggctgcc gtactggtcc ctggcaagcg 2400
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atcgcgccaa cggccacgca cacgcagtgt gggcactcaa cgcccctgtt ccacgcaccg 2640
aatacgcgcg gcgtaagccg ctcgcataca tggcggcgtg cgccgaaggc cttcggcgcg 2700
ccgtcgatgg cgaccgcagt tactcaggcc tcatgaccaa aaaccccggc cacatcgcct 2760
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gcgcgaacat gccaccgccg cgctggcgtc agcagaccac gtacaaagcg gctccgacgc 2880
cgctagggcg gaattgcgca ctgttcgatt ccgtcaggtt gtgggcctat cttcccgccc 2940
tcatgcggat ctacctgccg acccggaacg tggacggact cggccgcgcg atctatgccg 3000
agtgccacgc gcgaaacgcc gaatttccgt gcaacgacgt gtgtcccgga ccgctaccgg 3060
acagcgaggt ccgcgccatc gccaacagca tttggcgttg gatcacaacc aagtcgcgca 3120
tttgggcgga cgggatcgtg gtctacgagg ccacactcag tgcgcgccat gcggccatct 3180
cgcggaaggg cgcagcagcg cgcacggcgg cgagcacagt tgcgcggcgc gcaaagtccg 3240
cgtcagccat ggaggcattg ctatgagcga cggctacagc gacggctaca gcgacggcta 3300
caactggcag ccgactgtcc gcaaaaagcg gcgcgtgacc gccgccgaag gcgctcgaat 3360
caccggacta tccgaacgcc acgtcgtccg gctcgtggcg caggaacgca gcgagtggtt 3420
cgccgagcag gctgcacgcc gcgaacgcat ccgcgcctat cacgacgacg agggccactc 3480
ttggccgcaa acggccaaac atttcgggct gcatctggac accgttaagc gactcggcta 3540
tcgggcgagg aaagagcgtg cggcagaaca ggaagcggct caaaaggccc acaacgaagc 3600
cgacaatcca ccgctgttct aacgcaattg gggagcgggt gtcgcggggg ttccgtgggg 3660
ggttccgttg caacgggtcg gacaggtaaa agtcctggta gacgctagtt ttctggtttg 3720
ggccatgcct gtctcgttgc gtgtttcgtt gcgtccgttt tgaataccag ccagacgaga 3780
cggggttcta cgaatcttgg tcgataccaa gccatttccg ctgaatatcg tggagctcac 3840
cgccagaatc ggtggttgtg gtgatgtacg tggcgaactc cgttgtagtg cttgtggtgg 3900
catccgtggc gcggccgcgg taccagatct ttaaatctag aggtgaccac aacgacgcgc 3960
ccgctttgat cggggacgtc tgcggccgac catttacggg tcttgttgtc gttggcggtc 4020
atgggccgaa catactcacc cggatcggag ggccgaggac aaggtcgaac gaggggcatg 4080
acccggtgcg gggcttcttg cactcggcat aggcgagtgc taagaataac gttggcactc 4140
gcgaccggtg agtcgtaggt cgggacggtg aggccaggcc cgtcgtcgca gcgagtggca 4200
gcgaggacaa cttgagccgt ccgtcgcggg cactgcgccc ggccagcgta agtagcgggg 4260
ttgccgtcac ccggtgaccc ccggtttcat ccccgatccg gaggaatcac ttcgcaatgg 4320
ccaagacaat tgcggatcca gctgcagaat tcatggaccc gcagaccgcc gcgcagatcg 4380
tgcacaccct gcagaccacc gccatcgcgg ccgtgatctt cgccgcctgt gtcctgctgc 4440
cgcgcctgca agccaaggcg cagctggaga agctgccgtc ggccaacctc gatgccggcg 4500
agaaggcccg ccaagccttc atcacctcgg cccgcaagct gtaccaagac ggctaccaca 4560
acttcaagaa ctcggtgttc cgcctgatca acgagaacgg ccaagagaac gtgatcgtgc 4620
cgcgctcgct gctgcaagag ctgcgcaaga tgccggacga cgtgctgtcg ttcccgaagg 4680
ccatcgagga cgacatggag atcaagtaca cccgcctgca gtcggagggc gccaccgcca 4740
tccacgtggt gaagtcggac ctgacctcgg ccctgccgcg gctgaacccg atcatctgcc 4800
aagacgtgga cgccgccctg aaggagtaca tgccgccgtg cgacgactgg accgacgtga 4860
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ccctcgtcgg cttcgcgcgg cgggactggg ccgacgagga tttcggccag gtcgtctacg 6120
acgcggtcaa gcagcacgcg cgtaccccgt tccggcagga ggtctgggac cgcctggcgg 6180
agggtttccg attcgtccag ggcgcattcg atgacgacga ggccttcgga cacttggccg 6240
agactttgca caccctcgac gtcgagcgcg ggaccaacgg caatcacgcg ttctacctgt 6300
cgattccgcc gaaggcgttc ccgcaggtac tggagcagct gtcccggtcg ggcctggccg 6360
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gcatcgacca ctatctgggc aaggagacgg tgcagaacat cttggcgttg cgttttgcca 6540
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ccgaggacat cggtctgggc ggtcggggcg gctactacga cggtgtcggt gcggcccgcg 6660
atgtgatcca gaaccatctg atccagctgc tggcgctgac ggcgatggag gagccggtga 6720
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ccgaaccgtt ggaccagacc acctcccgcg gccagtacgc cgcgggctgg cagggcggtg 6840
agaaggtggt cgggctgctc gacgaggagg ggttctccca gacctcgact acggagacgt 6900
tcgccgcgat caccgtcgat gtcgacaccc gccgctgggc cggtgtgccg ttctatctgc 6960
gcaccggaaa acgcttgggc cgcagggtca ccgagatcgc gctggtcttc aagcgggcgc 7020
cccatctgcc gttcgacgcg accatgaccg aggagctggg caagaacgcc ctggtgatcc 7080
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tggaggtccg cgatgtcagc atggacttct cctacggttc ggcgttcgcc gaggagtccc 7200
cggaggccta cgagcggctg atcctggatg tgttgctcgg cgaaccatcg ctgtttccgg 7260
tcaatgccga ggtcgaactg tcctggaaga tcctggatcc cgcgctggag tactgggcgt 7320
cacacggcac acccgacagc tacgagtccg gtacctgggg cccggagtcg gcattcgaga 7380
tgttgcgccg cgtcggacgc gagtggcggc ggccgtgagt cgacgtagtt aactagcgta 7440
cgatcgactg ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt 7500
tttatctgtt gtttgtccgg ccatcatggc cgcggtgatc a 7541
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<211> 8087
<212> DNA
<213> plasmid
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(8087)
<400> 5
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aatatatcat catgaacaat aaaactgtct gcttacataa acagtaatac aaggggtgtt 120
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gctgatttat atgggtataa atgggctcgc gataatgtcg ggcaatcagg tgcgacaatc 240
tatcgcttgt atgggaagcc ccatgcgcca gagttgtttc tgaaacatgg caaaggtagc 300
gttgccaatg atgttacaga tgagatggtc agactaaact ggctgacgga atttatgcct 360
cttccgacca tcaagcattt tatccgtact cctgatgatg catggttact caccactgcg 420
atccccggga aaacagcatt ccaggtatta gaagaatatc ctgattcagg tgaaaatatt 480
gttgatgcgc tggcagtgtt cctgcgccgg ttgcattcga ttcctgtttg taattgtcct 540
tttaacagcg atcgcgtatt tcgtctcgct caggcgcaat cacgaatgaa taacggtttg 600
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ggaatcgcag accgatacca ggatcttgcc atcctatgga actgcctcgg tgagttttct 840
ccttcattac agaaacggct ttttcaaaaa tatggtattg ataatcctga tatgaataaa 900
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ccctcacttt ctggctggat gatggggcga ttcaggcctg gtatgagtca gcaacacctt 1200
cttcacgagg cagacctcac tagttccact gagcgtcaga ccccgtagaa aagatcaaag 1260
gatcttcttg agatcctttt tttctgcgcg taatctgctg cttgcaaaca aaaaaaccac 1320
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cgagggagct tccaggggga aacgcctggt atctttatag tcctgtcggg tttcgccacc 1800
tctgacttga gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg gcggagccta tggaaaaacg 1860
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tcgatgccgg acccgaccaa gaccctggcc ttcaagaagg tggtgatctg atgcagaggc 1980
ctgcatgcaa gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg 2040
ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa 2100
tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac 2160
ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt 2220
gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga 2280
gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca 2340
ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg 2400
ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt 2460
cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 2520
ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct 2580
tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc 2640
gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 2700
tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 2760
gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 2820
tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag 2880
ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 2940
agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 3000
gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg 3060
attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga 3120
agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta 3180
atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc 3240
cccgtcgtgt agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg 3300
ataccgcgag acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga 3360
agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt 3420
tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt 3480
gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc 3540
caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc 3600
ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca 3660
gcactgcata attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag 3720
tactcaacca agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg 3780
tcaatacggg ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa 3840
cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa 3900
cccactcgtg cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga 3960
gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga 4020
atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg 4080
agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt 4140
ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa accattatta tcatgacatt aacctataaa 4200
aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtc 4228
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(29)
<400> 8
ccggaattca tggacccgca gaccgccgc 29
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> primer
<220>
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<222> (1)..(26)
<400> 9
gtcgactcag atcaccacct tcttga 26
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(25)
<400> 10
gtcgacatga gcacagccga ggcat 25
<210> 11
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<212> DNA
<213> primer
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<222> (1)..(26)
<400> 11
gtcgactcac ggccgccgcc actcgc 26
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> primer
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<222> (1)..(26)
<400> 12
gtcgaccgag aaggagatat aatggc 26
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> primer
<220>
<221> primer_bind
<222> (1)..(26)
<400> 13
cgtacgtcac gaccagacgt cctctt 26

Claims (10)

1.一种合成14α-羟基-雄烷二酮的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌是以主产AD的分枝杆菌为宿主细胞，异源表达14α-羟化酶基因，并通过串联电子传递链元件还原酶基因或辅酶再生元件葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶基因所获得的。
2.根据权利要求1所述的合成14α-羟基-雄烷二酮的基因工程菌，其特征在于：所述分枝杆菌为快速生长型分枝杆菌，包括分枝杆菌NRRLB-3683、分枝杆菌NRRLB-3805、耻垢分枝杆菌、偶发分枝杆菌、微黄分枝杆菌、新金分枝杆菌、草分枝杆菌或鸟分枝杆菌。
3.根据权利要求2所述的合成14α-羟基-雄烷二酮的基因工程菌，其特征在于：所述分枝杆菌为新金分枝杆菌MNR M3△ksdD，所述新金分枝杆菌MNR M3△ksdD由原始菌株TCCC11028(MNR)经自发突变后得到的突变菌株TCCC11028M3(MNR M3)为出发菌株，通过敲除3-甾酮-Δ1-脱氢酶基因，从而获得基因缺陷型菌株MNR M3△ksdD。
4.根据权利要求1所述的合成14α-羟基-雄烷二酮的基因工程菌，其特征在于：所述14α-羟化酶基因来源于稻平脐蠕孢并且根据分枝杆菌密码子偏好性进行了密码子优化处理，优化后的14α-羟化酶基因的GC％为65.03％，序列如SEQ ID:NO 1所示。
5.根据权利要求1所述的合成14α-羟基-雄烷二酮的基因工程菌，其特征在于：所述还原酶基因来源于新月弯孢霉并且根据分枝杆菌密码子偏好性进行了密码子优化处理，所述还原酶基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.2所示序列；所述葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶基因来源于分枝杆菌，所述葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶基因的核苷酸序列为序列表SEQ ID NO.3所示序列。
6.根据权利要求1所述的合成14α-羟基-雄烷二酮的基因工程菌，其特征在于：为基因工程菌MNR M3△ksdD/pMV261-14α-G6PDH，完整pMV261-14α-G6PDH的核苷酸序列如SEQ ID:NO 4所示。
7.根据权利要求1所述的合成14α-羟基-雄烷二酮的基因工程菌，其特征在于：为基因工程菌MNR M3△ksdD/pMV261-14α-CPR，完整pMV261-14α-CPR的核苷酸序列如SEQ ID:NO 5所示。
8.权利要求1或6所述合成14α-羟基-雄烷二酮的基因工程菌的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)将根据分枝杆菌偏好性密码子优化后的14α-羟化酶基因和表达质粒pMV261通过酶切，连接，构建pMV261-14α重组质粒，序列如SEQ ID:NO 6所示；
(2)将G6PDH基因和表达质粒pMV261通过酶切，连接，构建pMV261-G6PDH重组质粒；
(3)以所述重组质粒pMV261-G6PDH为模板，通过扩增得到带有质粒pMV261核糖体结合位点的G6PDH基因，将该G6PDH基因与重组质粒pMV261-14α通过酶切，连接，构建pMV261-14α-G6PDH重组质粒；
(4)将所述重组质粒pMV261-14α-G6PDH导入至分枝杆菌的感受态细胞中，构建串联辅酶再生元件的14α-羟化酶基因工程菌MNR M3△ksdD/pMV261-14α-G6PDH。
9.权利要求1或7所述合成14α-羟基-雄烷二酮的基因工程菌的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)将根据分枝杆菌偏好性密码子优化后的14α-羟化酶基因和表达质粒pMV261通过酶切，连接，构建pMV261-14α重组质粒，序列如SEQ ID:NO 6所示；
(2)将根据分枝杆菌偏好性密码子优化后的CPR基因和表达质粒pMV261通过酶切，连接，构建pMV261-CPR重组质粒；
(3)以所述重组质粒pMV261-CPR为模板，通过扩增得到带有质粒pMV261核糖体结合位点的CPR基因，将该CPR基因与重组质粒pMV261-14α通过酶切，连接，构建pMV261-14α-CPR重组质粒；
(4)将所述重组质粒pMV261-14α-CPR导入至新金分枝杆菌MNR M3△ksdD的感受态细胞中，构建获得基因工程菌MNR M3△ksdD/pMV261-14α-CPR。
10.权利要求1所述基因工程菌在发酵制备14α-羟基-雄烷二酮方面的应用。
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