CN103614330A - 产卡那霉素b工程菌及其构建和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了高产卡那霉素B基因工程菌及其构建和应用。本发明先对黑暗链霉菌中安普霉素生物合成基因aprD3-D4进行框内敲除，然后进一步敲除氨甲酰转移酶基因tobZ，得到大量积累卡那霉素B的生产菌株Streptomycestenebrarius314(△aprD3-D4+△tobZ)。本发明的菌株产量高，品质好，组份单一，遗传稳定，可用于大规模生产卡那霉素B，解决了长期以来需要从卡那霉素A生产过程中的残液，分离少量卡那霉素B的困局，实现了直接发酵生产卡那霉素B的独特优势，达到了低成本，低能耗，不产生二次污染的洁净生产目的，开创了全新的制备卡那霉素B新方法，解决了阿贝卡星及地贝卡星合成原料紧缺的难题，具有良好的应用前景。

Description

产卡那霉素B工程菌及其构建和应用

技术领域

本发明属于微生物制药、基因工程与微生物分子遗传学技术领域，针对产业化中的科学技术难题，引入交叉学科技术和微生物分子遗传学技术，解决生产过程中的关键技术瓶颈，涉及一种主产卡那霉素B基因工程菌及其构建和应用，达到低耗，高产，稳产，环保，洁净和高质的效果。 

背景技术

卡那霉素B（Kanamycin B）是一种重要的氨基糖苷类抗生素，具有很强的抑杀菌能力，且对金黄色葡萄球菌的作用明显优于头孢菌素、四环素以及青霉素等抗生素。但其耳肾毒性较高，且易于被氨基糖苷类钝化酶钝化，从而限制了卡那霉素B在临床上的应用。为了克服这些缺陷，日本科学家梅泽等对卡那霉素B进行了结构改造，脱去卡那霉素B中的3′位和4′位羟基，得到地贝卡星（Dibekacin，3′, 4′-双去氧卡那霉素B），地贝卡星不仅保留了卡那霉素B的抗菌活性，且抵制氨基糖苷类钝化酶攻击的能力明显强于卡那霉素B，在临床上得到广泛应用。梅泽等人进一步在地贝卡星的C1位氨基上引入α-氨基-γ-羟基丁酸侧链，得到阿贝卡星（Arbekacin）。阿贝卡星的耐钝化酶能力更强，耳肾毒性更低，对许多耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌有效。因此，卡那霉素B是制备半合成抗生素阿贝卡星及其中间体地贝卡星的重要原料（图1）。 

目前工业上使用的卡那霉素B主要从卡那链霉菌发酵液中分离得到。但卡那链霉菌发酵产物的主要组分为卡那霉素A，卡那霉素B的含量较低，且这两种组分结构相似，导致卡那霉素B的提取精制十分困难，价格昂贵，无法大规模生产，从而大大束缚了阿贝卡星与地贝卡星的开发应用。卡那霉素B也可通过氨甲酰卡那霉素B水解制得，氨甲酰卡那霉素B是黑暗链霉菌发酵产物中的三种主要组分之一，但与其他两种主要组分（安普霉素和氨甲酰妥布霉素）相比，氨甲酰卡那霉素B产量很低。从发酵调控提高氨甲酰卡那霉素B产量非常困难[Irina Borodina, Charlotte Scho¨ller, Anna Eliasson, and Jens Nielsen. Metabolic Network Analysis of Streptomyces tenebrarius, a StreptomycesSpecies with an Active Entner-Doudoroff Pathway. Applied and environmental microbiology , May 2005, p. 2294–2302]，因此，很难从发酵液中提取精制。此外，氨甲酰卡那霉素B与氨甲酰妥布霉素的理化性质也很相似，导致这两种重要药物的提取分离变得非常困难。因此，若从黑暗链霉菌发酵液中提取氨甲酰卡那霉素B，将面临着氨甲酰卡那霉素B含量过低与提取精制困难两大难题。 

此外，从氨甲酰卡那霉素B制备卡那霉素B，需要在碱性条件下经过高温热水解，去掉氨甲酰基，才能得到卡那霉素B。由于水解过程存在化学反应平衡问题，因此或多或少都存在部分氨甲酰卡那霉素B不能完全转化为卡那霉素B，因此要制备符合药品规定质量标准的卡那霉素B就变得非常困难。此外，碱性（pH10）高温水解不仅是高能耗过程，而且属危险性操作，还会破坏一定数量的卡那霉素B，产生二次副产物，给制备符合质量标准的卡那霉素B添加了更多的副产物。因此，碱性水解也是产业化中的无奈之举，成了生产过程的关键技术瓶颈。如果能从发酵法直接获得卡那霉素B，所有这些难题将迎刃而解。 

长期以来，对制备卡那霉素B的研究，主要集中在对其产生菌—卡那链霉菌的发掘与选育，以及通过化学方法对其进行结构修饰与改造。近年来，对卡那霉素生物合成基因的研究，虽然也取得了一定进展，卡那霉素生物合成途径也逐渐被阐明，但卡那链霉菌的遗传操作体系至今未取得突破，大大束缚了卡那链霉菌的遗传改造。所幸的是，近年来随着链霉菌分子生物学的发展，黑暗链霉菌中安普霉素、氨甲酰妥布霉素以及氨甲酰卡那霉素B的生物合成途径逐步被阐明，且黑暗链霉菌遗传操作体系也逐步建立 [W. Hong and S. Yan. Engineering Streptomyces tenebrarius to synthesize single component of carbamoyl tobramycin. Letters in Applied Microbiology, 2012, April, p1-7；朱碧银,洪文荣,李辉. 黑暗链霉菌aprFG基因功能的研究.食品与生物技术学报,2011,31(4), p391-395.]。这为采用分子生物学技术改造黑暗链霉菌，阻断安普霉素与氨甲酰妥布霉素的生物合成，达到定向合成氨甲酰卡那霉素B或直接合成卡那霉素B奠定了基础。推测的安普霉素生物合成途径见图2，推测的氨甲酰卡那霉素B与氨甲酰妥布霉素的生物合成途径见图3。 

黑暗链霉菌中安普霉素生物合成基因簇上的aprD3、aprD4不仅是安普霉素生物合成过程中的关键基因，还参与了氨甲酰妥布霉素生物合成过程的3′-脱羟基反应。在氨甲酰妥布霉素与氨甲酰卡那霉素B的生物合成途径中，先合成卡那霉素B，然后通过3′-脱羟基酶催化形成妥布霉素，妥布霉素与卡那霉素B最后在氨甲酰磷酸转移酶TobZ的催化下，分别形成氨甲酰妥布霉素与氨甲酰卡那霉素B。理论上，敲除安普霉素生物合成基因aprD3-D4 (aprD3-aprQ-aprD4)，将同时阻断黑暗链霉菌中安普霉素与氨甲酰妥布霉素两大生物合成代谢，使代谢流集中转向氨甲酰卡那霉素B，从而得到高产氨甲酰卡那霉素B的基因工程菌。若在此基础上进一步敲除氨甲酰磷酸转移酶基因tobZ，将阻断由卡那霉素B通过氨甲酰化作用转化为氨甲酰卡那霉素B的合成步骤，从而得到直接产生卡那霉素B的基因工程菌[专利：201110333833.6，一株产氨甲酰妥布霉素工程菌及其应用，洪文荣，严紹德]。  

发明内容

本发明的目的在于解决长期困扰生产上的关键技术难题，利用现代分子生物学技术，现代分子遗传学技术，实现规模化，低成本，低污染，高质量制备卡那霉素B的现代化洁净生产目标。提供高产卡那霉素B基因工程菌的构建及其应用，同时解决为合成抗耐药菌药物阿贝卡星及其中间体地贝卡星所需原料卡那霉素B的紧缺难题。 

本发明利用微生物分子遗传学技术和基因工程技术，以工业化高产黑暗链霉菌Tt-49（S.tenebrariusTt-49）作为出发菌株，敲除安普霉素生物合成基因簇上aprD3-aprQ-aprD4（aprD3-D4）基因和氨甲酰妥布霉素生物合成基因簇上tobZ基因的重要序列，从而阻断安普霉素、氨甲酰妥布霉素和妥布霉素的生物合成，得到代谢流转向合成卡那霉素B的工程菌，积累大量卡那霉素B。该菌株命名为Streptomyces tenebrarius DZ314 (△aprD3-D4+△tobZ),于2013年9月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC 8286。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 

本发明主要包括以下几个步骤： 

1）              敲除基因aprD3-D4重组质粒pBD5的构建

重组质粒pBD5的构建是以温敏型穿梭质粒pKC1139为基础，通过PCR扩增aprD3-D4上下游各约2000bp的片段作为同源交换臂，将两者插入到pKC1139的多克隆位点，再在交换臂外侧插入红霉素抗性基因作为筛选标记。

2）              重组质粒pBD5转化黑暗链霉菌 

采用以E.coli ET12657(pUZ8002) 介导的接合转移技术。重组质粒转化E.coli ET12657后，经接合转移导入黑暗链霉菌，然后在红霉素筛选压力下，筛选通过其所携带的交换臂与黑暗链霉菌染色体上的同源区段发生重组，整合到染色体上的单交换接合子。

将单交换接合子在斜面上松弛传代后分离单菌落，影印到添加红霉素的抗性平板和不添加红霉素的普通平板上，得到在普通平板上生长而在抗性平板上不生长的红霉素敏感型（Ery^S）菌株，然后根据同源重组模型设计特定引物，利用PCR方法对Ery^S菌株进行筛选验证和测序，最终确认筛选到的工程菌是目标突变株，专一性地合成卡那霉素B。 

3）              灭活aprD3-D4基因功能突变株的筛选与鉴定； 

4）              aprD3-D4突变株发酵与产物分析；

5）              敲除基因tobZ重组质粒pBZ5的构建；

重组质粒pBZ5的构建采用与pBD5相似的构建方法，同源交换臂为基因tobZ两端约2000bp的序列。

6）              灭活tobZ突变株的筛选与鉴定； 

7）              tobZ阻断突变株发酵与产物分析。

发酵液经处理后，经离子交换树脂提取发酵代谢产物，然后采用TLC、生物显影以及HPLC-MS对产物结构进行确认。 

产卡那霉素B工程菌在卡那霉素B产业化中的应用，具体包括以下步骤： 

（1）    基因工程菌斜面培养；

（2）    基因工程菌深层菌丝种子培养；

（3）    基因工程菌发酵培养，代谢产物分离提取；

（4）    代谢产物分析检测。

其中，所述培养基组成如下： 

1）斜面培养基（g/L）：蔗糖 24.0~36.0, 蛋白胨 4.0~6.0, KCl , FeSO₄.7H₂O 0.008~0.012, K₂HPO₄ 0.8~1.2, MgSO₄ 0.4~0.6, 琼脂 16.0~24.0。

2）种子培养基（g/L）：葡萄糖4.0~6.0，玉米淀粉，黄豆饼粉12.0~18.0，KCl 0.8~1.2，MgSO₄ 4.0~6.0，KH₂PO₄ 0.4~0.6，CaCl₂ 0.20~0.30。 

3）发酵培养基（g/L）：葡萄糖12.0~18.0，玉米粉，黄豆饼粉28.0~42.0，玉米淀粉16.0~24.0，鱼粉5.8~7.2，蚕蛹粉5.6~8.4，豆油8.0~12.0，淀粉酶0.4~0.6，(NH₄)₂SO₄ 5.6~8.4，MgSO₄ 8.8~13.2，CaCO₃ 5.6~8.4，ZnSO₄ 0.08~0.12，pH 7.0~7.2。 

其中，所述培养基组成优选如下： 

1）斜面培养基（g/L）：蔗糖 30.0, 蛋白胨 5.0, KCl 0.5, FeSO₄.7H₂O 0.01, K₂HPO₄ 1.0, MgSO₄ 0.5, 琼脂 20.0。

2）种子培养基（g/L）：葡萄糖5.0，玉米淀粉10.0，黄豆饼粉15.0，KCl 1.0，MgSO₄ 5.0，KH₂PO₄ 0.5，CaCl₂ 0.25。 

3）发酵培养基（g/L）：葡萄糖15.0，玉米粉20.0，黄豆饼粉35.0，玉米淀粉20.0，鱼粉6.0，蚕蛹粉7.0，豆油10.0，淀粉酶0.5，(NH₄)₂SO₄ 7.0，MgSO₄ 11.0，CaCO₃ 7.0，ZnSO₄ 0.1，pH 7.0~7.2。 

本发明利用黑暗链霉菌构建工程菌，生产卡那霉素B，消除了安普霉素，氨甲酰卡那霉素，氨甲酰妥布霉素的形成。本发明的菌株产量高，品质好，组份单一，遗传稳定，可用于大规模生产卡那霉素B，解决了长期以来需要从卡那霉素A生产过程中的残液，分离少量卡那霉素B的困局，实现了直接发酵生产卡那霉素B的独特优势，可以大大降低生产成本，简化生产工艺，省略碱性高温水解工序，消除污染，避免二次副产物的产生，彻底解决了产业化中的关键技术瓶颈，起到一举多得的良好效果。 

附图说明

图1卡那霉素B、地贝卡星及阿贝卡星化学结构。 

图2安普霉素的生物合成途径。 

图3氨甲酰卡那霉素B与氨甲酰妥布霉素生物合成途径。 

图4重组质粒pBD5构建流程图。 

图5重组质粒pBZ5构建流程图。 

图6 出发菌株S.tenebrariusTt-49发酵产物的HPLC-MS分析图谱。 

图7 基因aprD3-D4阻断突变株S.tenebrarius312发酵产物的HPLC-MS分析图谱。 

图8 基因tobZ阻断突变株S.tenebrarius318发酵产物的HPLC-MS分析图谱。 

具体实施方式

实施例1：重组质粒pBD5的构建

以S.tenebrariusTt-49染色体DNA为模板，利用引物PD1/PD2扩增约2000bp 的上游交换臂BD1，该片段包括aprD3-D4部分序列及其上游片段，PCR产物经EcoRI 和XbaI酶切，连接到经相同酶酶切的PKC1139载体上，得到中间质粒pBD3。然后以Tt-49染色体DNA为模板，利用引物PD3/PD4扩增约2000bp的下游交换臂BD2，该片段包括aprD3-D4部分序列及其下游片段，PCR产物经XbaI 和Hind III酶切后连接到经相同酶酶切的pBD3上，得到中间质粒pBD4。最后用EcoRI 酶切含红霉素抗性基因的质粒pAGe，回收1746bp的片段连接到经EcoRI酶切并去磷酸化处理的pBD4上，得到重组质粒pBD5。质粒构建均转化于E. coli DH5α。为验证pBD5构建的成功与否，对其进行酶切验证和序列测定，结果均与理论吻合，证明重组质粒pBD5构建正确，重组质粒的构建流程见图4。

实施例1的引物如下： 

PD1: 5′-CCGGAATTCTGCACGTTCTCCGGGAACA-3′（SEQ ID No.1）, 带EcoRI酶切位点；

PD2: 5′-CTAGTCTAGAGAACGCGATGACCAGGAACCT-3′（SEQ ID No.2）, 带XbaI酶切位点；

PD3: 5′-CTAGTCTAGAAGCGCCTGAACCTGGACACC-3′（SEQ ID No.3）, 带XbaI酶切位点；

PD4: 5′-CCCAAGCTTAGCACCGGCAGGAACTCGT-3′（SEQ ID No.4）, 带Hind III酶切位点。

实施例2：重组质粒pBD5转化S.tenebrariusTt-49

将重组质粒pBD5转化 E.coli ET12567（pUZ8002），得到含重组质粒的供体菌E.coli ET12567（pUZ8002，pBD5），过夜培养后转接至30ml添加相应抗生素（卡那霉素25μg/ml，氯霉素25μg/ml，安普霉素50μg/ml）的LB培养基中，培养2-3 h使菌体进入对数生长期，8000 rpm离心5 min收集菌体，用等体积新鲜LB洗涤2次除去残余的抗生素，悬浮于适量LB培养基中备用。同时，刮取适量成熟丰满的S.tenebrariusTt-49斜面孢子悬于2×YT培养基中，50℃热激10 min，冷却至室温。将孢子悬液和大肠杆菌悬液等比例混合，10倍梯度稀释后涂布于MS平板，然后置于37℃培养18-24 h后，用含红霉素（50μg/ml）与萘啶酸（25μg/ml）的水溶液覆盖，继续培养3-4天，待接合子长出。由于重组质粒pBD5携带有温度敏感型链霉菌复制子，只有重组质粒pBD5通过其所携带的交换臂BD1或BD2与染色体上的同源区段发生重组而整合到染色体上的菌株才能生长。因此MS平板上长出的接合子即是单交换菌株。

实施例3：敲除aprD3-D4基因突变株的筛选

将单交换突菌株转接斜面培养基，松弛培养5代后分离单菌落，影印到添加红霉素的抗性平板和不添加抗生素的普通平板上，培养后筛选到7株在普通平板上生长而在抗性平板上不生长的红霉素敏感型（Ery^S）菌株。这些Ery^S菌株可能为aprD3-D4阻断突变株，也可能回复突变株，为最终筛选到aprD3-D4阻断突变株，通过PCR方法进行筛选验证。

选择D2菌株，提取染色体DNA，设计引物PD5/PD6和PD7/PD8对D2进行PCR验证分析。利用PD5/PD6引物进行PCR，可扩增到一条2452bp的条带，利用PD7/PD8理论上可扩增出一条6701bp的条带，但实际上由于扩增片度过长，无法扩增出目标条带；若BD2端发生同源单交换，利用PD7/PD8可扩增将得到一条2594bp的条带，利用PD5/PD6理论上可扩增出一条6843bp的条带，但同样由于扩增片度过长，也无法扩增出目标条带）。理论上，亲株或回复突变株则可得到6701bp（PD5/PD6）和6843bp（PD7/PD8）的两条带，实际上亦扩增不到目标条带。 

电泳结果显示，单交换菌株染色体DNA经PD5/PD6扩增后得到了约2500bp的条带，说明单交换菌株是在交换臂BD1端发生了同源重组；而D2经PD5/PD6扩增后得到2500bp左右的条带，经PD7/PD8扩增后得到2600bp左右的条带，因此D2为aprD3-D4被成功敲除的双交换菌株，暂时命名为S. tenebrarius312(△aprD3-D4）。 

实施例3所涉及的引物如下： 

PD5: 5′-TCCTGGTGTTCGTTCTGGCTCC-3′（SEQ ID No.5）;

PD6: 5′-TGAGGTTGAACTCGGTGTCGGC-3′（SEQ ID No.6）;

PD7: 5′-GGGAATGGGGAGGAACTCGT-3′（SEQ ID No.7）;

PD8: 5′-TACCGTGGCGACGAAGGTGTT-3′（SEQ ID No.8）;

实施例4：工程菌 S. tenebrarius 312发酵与产物分析

1．黑暗链霉菌摇瓶发酵工艺

将突变株S. tenebrarius312转接到斜面培养基，置37℃培养7天；待孢子成熟丰满后，挖取1cm×1cm的斜面孢子接种至种子培养基，37℃，320rpm振荡培养16~18h，使菌体处于对数生长期；培养16～18小时后按10％的接种量（v/v）接种于装有50ml发酵培养基的三角瓶中，37℃，320 rpm摇床振荡培养7天，发酵完毕。同时以出发菌株S. tenebrariusTt-49作对照。

斜面培养基（g/L）：蔗糖 30.0, 蛋白胨 5.0, KCl 0.5, FeSO₄.7H₂O 0.01, K₂HPO₄ 1.0, MgSO₄ 0.5, 琼脂 20.0, pH自然。 

种子培养基（g/L）：葡萄糖5.0，玉米淀粉10.0，黄豆饼粉15.0，KCl 1.0，MgSO₄ 5.0，KH₂PO₄ 0.5，CaCl₂ 0.25，pH自然。 

发酵培养基（g/L）：葡萄糖15.0，玉米粉20.0，黄豆饼粉35.0，玉米淀粉20.0，鱼粉6.0，蚕蛹粉7.0，豆油10.0，淀粉酶0.5，(NH4)₂SO₄ 7.0，MgSO₄ 11.0，CaCO₃ 7.0，ZnSO₄ 0.1，pH 7.0~7.2。 

 2．发酵产物的提取分离  

发酵终止后，用10%（v/v）的自来水稀释发酵液，然后加入浓硫酸酸化调节pH至1.5~2.0，静置30 min，然后用NaOH 调节发酵液pH至6.0~6.5。投入732-NH₄ ⁺ 树脂静态吸附2小时，树脂投放量按5 万u/ml 左右计算。收集吸附饱和树脂，用自来水漂洗干净,直至无漂浮菌丝体为止。饱和树脂装柱后用0.1%氨水进行洗涤，当流出液pH达9.0以上时，改用5.0%的氨水进行洗脱，氨水用量为饱和树脂体积的8~10倍，洗脱时间控制在8~10 h。收集含抗生素的解析液，解析液加热浓缩后，用浓硫酸调pH至 6.0，然后加入乙醇沉淀，去杂质，得到抗生素结晶，最后用无盐水溶解成1000μg/ml左右的溶液，供HPLC-MS检测。

 3．发酵产物检测

采用HPLC-MS对发酵产物进行分析检测，液相条件：色谱柱Agilent SB-C18 柱；流动相为0.2 mol/L三氟乙酸水溶液：甲醇（95:5）；流速为0.6 ul/min；柱温30℃，进样量1ul。

从图6可知，出发菌株S.tenebrariusTt-49发酵产物中主要含安普霉素（分子量540.3）、氨甲酰妥布霉素（分子量511.3）以及少量妥布霉素（分子量468.3）。而S.tenebrarius312发酵产物中检测不到安普霉素、氨甲酰妥布霉素和妥布霉素，但在出峰时间6.7min处出现了一个主峰，质谱图中对应的分子量为527.3，与氨甲酰卡那霉素B的分子量一致(图7)，因此S.tenebrarius312发酵产生的主要组分为氨甲酰卡那霉素B。出发菌株Tt-49中由于氨甲酰卡那霉素B的产量很低，通过HPLC-MS分析几乎检测不到，因此其HPLC-MS图谱中没有出现相应的峰和对应的分子量。但S.tenebrarius312，由于aprD3-D4灭活后，流向妥布霉素的代谢流终止在卡那霉素B，导致生物合成代谢流转向合成氨甲酰卡那霉素B，因此S.tenebrarius312发酵代谢产物，HPLC-MS检测到了氨甲酰卡那霉素B和少量卡那霉素B。  

实施例5：重组质粒pBZ5的构建

以S.tenebrarius312染色体DNA为模板，利用引物PZ1/PZ2扩增基因tobZ上游2022bp序列作为上游同源交换臂BZ1，PCR产物用EcoRI 和XbaI酶切，连接到经相同酶酶切的PZC1139载体上，得到中间质粒pBZ3。然后以S.tenebrarius312染色体DNA为模板，利用引物PZ3/PZ4扩增基因tobZ下游 2050bp的序列，作为下游同源交换臂BZ2，PCR产物经XbaI 和Hind III酶切后连接到经相同酶切的pBZ3上，得到中间质粒pBZ4。最后EcoRI 酶切含红霉素抗性基因的质粒pAGe，回收1746bp的片段连接到经EcoRI酶切并去磷酸化处理的pBZ4上，得到重组质粒pBZ5。重组质粒构建涉及宿主菌均为E. coli DH5α。为验证pBZ5的正确性，对其进行酶切验证和测序，结果均与预测一致，说明重组质粒pBZ5构建正确,重组质粒的构建流程见图5。 

实施例5所涉及的引物如下： 

PZ1: 5′-CCGGAATTCAGGTGCCGACGAGGTTCT-3′（SEQ ID No.9）, 带EcoRI酶切位点；

PZ2: 5′-CTAGTCTAGATAGGCCACCACGCGTCAA-3′（SEQ ID No.10）, 带XbaI酶切位点；

PZ3: 5′-CTAGTCTAGATGTCTCTACCTCCGATGGGGAAG-3′（SEQ ID No.11）, 带XbaI酶切位点；

PZ4: 5′-CCCAAGCTTCTGCGTTGTCCACTGTGGA -3′（SEQ ID No.12）, 带Hind III酶切位点。

实施例6：工程菌S.tenebrariusDZ 312突变株的筛选

重组质粒pBZ5转化E.coli ET12567(pUZ8002)后，通过接合转移将重组质粒导入S.tenebrarius312受体菌，得到重组质粒整合到S.tenebrarius312染色体上的单交换突变株。将单交换菌株转接斜面，松弛培养5代后分离单菌落，并影印到含50μg/ml红霉素的抗性平板和不添加抗生素的普通平板上。在红霉素平板上不生长而在对应的普通平板上正常生长的Ery^S型菌落，可能为tobZ阻断突变株或回复突变株。

随机挑选1株Ery^S型菌株，命名为Z2，提取染色体DNA为模板，利用双交换筛选引物PZ5/PZ6进行PCR鉴定。根据同源重组原理，阻断突变株可扩增得到约794bp的片段，回复突变株或出发菌株可扩增得到约2507bp的片段。从电泳结果可知Z2为阻断突变株。 为进一步确认Z2是tobZ被成功敲除的双交换突变株，利用PZ7/PZ8和PZ9/PZ10进行PCR扩增检测。理论上，PZ7/PZ8可扩增到2606bp的目标条带，PZ9/PZ10则可扩增到2545 bp的目标条带。电泳结果显示，Z2基因组DNA经PZ7/PZ8与PZ9/PZ10扩增后均得到了与预期大小一致的片段，回收PCR产物并进行DNA测序，结果与预测一致。因此Z2即为tobZ被成功阻断的双交换突变株，将其暂时命名为S. tenebrarius DZ314 (△aprD3-D4+△tobZ)。 

实施例6所涉及的引物如下： 

PZ5: 5′-TTGTAGGCG GCGAAGTCCCT-3′（SEQ ID No.13）;

PZ6: 5′-TGCCTTGGTGAGGATGTCGG-3′（SEQ ID No.14）;

PZ7: 5′-ACCGACATCCTCACCAAGGC-3′（SEQ ID No.15）;

PZ8: 5′-TGGCTGGAGGAGAACTACGG-3′（SEQ ID No.16）;

PZ9: 5′-TTGTAGGCGGCGAAGTCCCT-3′（SEQ ID No.17）;

PZ10: 5′-GTCTCCAAGGGACTGGCCAA-3′（SEQ ID No.18）.

实施例7：工程菌 S. tenebrarius DZ314发酵产物分析

采用与实施例4相同的方法，对工程菌S. tenebrarius DZ314(△aprD3-D4+△tobZ)进行发酵，提取代谢产物，并对发酵产物进行HPLC-MS检测分析。结果见图8，主峰分子量为484的是卡那霉素B，几乎检测不到氨甲酰卡那霉素B、氨甲酰妥布霉素、妥布霉素和安普霉素。与S. tenebrarius 312(△aprD3-D4)相比，工程菌S. tenebrarius DZ314(△aprD3-D4+△tobZ)不再合成氨甲酰卡那霉素B，主要合成卡那霉素B。发酵单位可达2000ug/mL以上，完全满足产业化的需要，发酵条件优化后，生产力将进一步大幅度提高。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。 

  

SEQUENCE LISTING

 

<110>  福州市鼓楼区荣德生物科技有限公司

 

<120>  产卡那霉素B工程菌及其构建和应用

 

<130>  2013

 

<160>  18   

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

ccggaattct gcacgttctc cgggaaca                                       

28

 

 

<210>  2

<211>  31

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

ctagtctaga gaacgcgatg accaggaacc t                                   

31

 

 

<210>  3

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

ctagtctaga agcgcctgaa cctggacacc                                     

30

 

 

<210>  4

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

cccaagctta gcaccggcag gaactcgt                                       

28

 

 

<210>  5

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  5

tcctggtgtt cgttctggct cc                                             

22

 

 

<210>  6

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  6

tgaggttgaa ctcggtgtcg gc                                             

22

 

 

<210>  7

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  7

gggaatgggg aggaactcgt                                                

20

 

 

<210>  8

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  8

taccgtggcg acgaaggtgt t                                              

21

 

 

<210>  9

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  9

ccggaattca ggtgccgacg aggttct                                        

27

 

 

<210>  10

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  10

ctagtctaga taggccacca cgcgtcaa                                       

28

 

 

<210>  11

<211>  33

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  11

ctagtctaga tgtctctacc tccgatgggg aag                                  

33

 

 

<210>  12

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  12

cccaagcttc tgcgttgtcc actgtgga                                       

28

 

 

<210>  13

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  13

ttgtaggcgg cgaagtccct                                                 

20

 

 

<210>  14

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  14

tgccttggtg aggatgtcgg                                                

20

 

 

<210>  15

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  15

accgacatcc tcaccaaggc                                                 

20

 

 

<210>  16

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  16

tggctggagg agaactacgg                                                

20

 

 

<210>  17

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  17

ttgtaggcgg cgaagtccct                                                 

20

 

 

<210>  18

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  18

gtctccaagg gactggccaa                                                

20

Claims (7)

1.产卡那霉素B工程菌，其特征是：该菌株被命名为Streptomyces tenebrarius 314 (△aprD3-D4+△tobZ)，于2013年9月25日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC  8286，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

2.根据权利要求1所述的产卡那霉素B工程菌，其特征是：在野生型黑暗链霉菌中敲除安普霉素生物合成基因簇中的基因aprD3-D4和tobZ的保守性序列，达到灭活目的。

3.根据权利要求2所述的产卡那霉素B工程菌，其特征是：所述的敲除基因后的黑暗链霉菌中安普霉素、氨甲酰妥布霉素和妥布霉素生物合成均被阻断，氨甲酰化基因被灭火，最终只合成卡那霉素B。

4.如权利要求1、2所述的产卡那霉素B工程菌的构建方法，其特征是主要包括以下步骤：

1）敲除aprD3-D4基因载体构建；

2）敲除aprD3-D4基因载体接合转移导入黑暗链霉菌；

3）敲除aprD3-D4基因突变株的筛选；

4）敲除aprD3-D4基因工程菌发酵产物分析；

5）敲除tobZ 基因载体构建；

6）敲除tobZ基因载体导入黑暗链霉菌；

7）敲除tobZ基因突变株的筛选；

8）敲除tobZ基因工程菌发酵产物分析。

5.如权利要求1~4所述的产卡那霉素B工程菌的应用，其特征是：在卡那霉素B产业化中的应用，具体包括以下步骤：

1）基因工程菌斜面培养；

2）基因工程菌深层菌丝种子培养；

3）基因工程菌发酵培养，代谢产物分离提取；

4）代谢产物分析检测。

6.根据权利要求5所述的产卡那霉素B工程菌的应用，其特征在于：所述培养基组成如下： 

1）斜面培养基（g/L）：蔗糖 24.0~36.0, 蛋白胨 4.0~6.0, KCl , FeSO₄.7H₂O 0.008~0.012, K₂HPO₄ 0.8~1.2, MgSO₄ 0.4~0.6, 琼脂 16.0~24.0；

2）种子培养基（g/L）：葡萄糖4.0~6.0，玉米淀粉，黄豆饼粉12.0~18.0，KCl 0.8~1.2，MgSO₄ 4.0~6.0，KH₂PO₄ 0.4~0.6，CaCl₂ 0.20~0.30；

3）发酵培养基（g/L）：葡萄糖12.0~18.0，玉米粉，黄豆饼粉28.0~42.0，玉米淀粉16.0~24.0，鱼粉5.8~7.2，蚕蛹粉5.6~8.4，豆油8.0~12.0，淀粉酶0.4~0.6，(NH₄)₂SO₄ 5.6~8.4，MgSO₄ 8.8~13.2，CaCO₃ 5.6~8.4，ZnSO₄ 0.08~0.12，pH 7.0~7.2。

7.根据权利要求5、6所述的产卡那霉素B工程菌的应用，其特征在于：所述培养基组成优选如下：

1）斜面培养基（g/L）：蔗糖 30.0, 蛋白胨 5.0, KCl 0.5, FeSO₄.7H₂O 0.01, K₂HPO₄ 1.0, MgSO₄ 0.5, 琼脂 20.0；

2）种子培养基（g/L）：葡萄糖5.0，玉米淀粉10.0，黄豆饼粉15.0，KCl 1.0，MgSO₄ 5.0，KH₂PO₄ 0.5，CaCl₂ 0.25；

3）发酵培养基（g/L）：葡萄糖15.0，玉米粉20.0，黄豆饼粉35.0，玉米淀粉20.0，鱼粉6.0，蚕蛹粉7.0，豆油10.0，淀粉酶0.5，(NH4)₂SO₄ 7.0，MgSO₄ 11.0，CaCO₃ 7.0，ZnSO₄ 0.1，pH 7.0~7.2。

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