CN103805544A - 一种产庆大霉素a工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及一种产庆大霉素A工程菌及其应用，该工程菌为灭活genD1基因功能的绛红色小单孢菌(Micromonosporapurpurea)KD1989，该菌株已于2013年12月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保蒇，保藏编号为CGMCC No.8598。本发明通过基因敲除的方法灭活庆大霉素生物合成基因簇中的genD1功能，包括构建敲除穿梭质粒（如pGD14质粒），pGD14质粒转化庆大霉素产生菌，筛选双交换工程菌绛红色小单孢菌GKD1989（ΔgenK+（ΔgenD1），工程菌经发酵，代谢产物产物检测，确定为庆大霉素A。本发明产单组分庆大霉素A，国内外未见报道，可以实现庆大霉素A产业化，生产工艺简单，易于调控，提取方便，成本低，达到洁净生产水平，产品质量稳定，属国内外首创。

Description

一种产庆大霉素A工程菌及其应用

技术领域

本发明属于抗生素制药领域，涉及一种产庆大霉素A工程菌及其应用。 

背景技术

小单孢菌可产生丰富的次级代谢产物，特别是氨基糖苷类抗生素，如庆大霉素、西索米星和福提米星等。这些小单孢菌分布奇特，生长缓慢且细胞壁结构特殊，故研究进展缓慢。此外，由于缺乏通用的基因操作系统，小单孢菌遗传操作困难，使得对其分子生物学的研究也大大落后于链霉菌。 

庆大霉素(Gentamicin，GM)是由小单孢菌属中的绛红小单孢菌(Micromonospora purpurea)或棘孢小单孢菌（Micromonospora echinospora）等发酵产生的氨基糖苷类广谱抗生素，对多种革兰阴性菌和阳性菌有较强的抗菌作用。1963年，美国人Weinstein首次发现，1969年被用于临床，它是我国乃至世界抗感染必备的基本药物。庆大霉素属多组分代谢产物，临床应用的庆大霉素为庆大霉素C族的混合物，主要为C1、C2、C1a和C2a；此外，作为庆大霉素中间体的A，B和X族等，也有非常重要的作用。庆大霉素A，X具有良好的抗原虫和抗线虫作用，G418常用于分子生物学试验中的抗性筛选，庆大霉素B是进一步合成广谱低毒氨基糖苷类抗生素异帕米星的母体药物。目前氨基糖苷类抗生素已发展到了第三代，随着此类抗生素作用机制研究的不断深入和各种新兴技术的不断运用，各国科学家正通过各种化学改造，以获得广谱、低毒、高效、耐酶或抗耐药菌的新衍生物。近年来，又发现氨基糖苷类抗生素具有抗HIV的功效，有望进一步开发出新型的专一性靶向RNA的类庆大霉素药物。因此对该类稀有药用微生物进行深入研究，特别是分子遗传学方面的研究具有重要科学意义。 

尽管人们对小单孢菌和庆大霉素的研究已超过五十年，也取得了一些可喜的成果，但一直未有重大的突破。青霉素在五十余年的研究开发过程中，效价提高近万倍，而庆大霉素五十年中仅提高几十倍，两者差距悬殊。二十世纪八十年代兴起的链霉菌基因工程，已在抗生素生物合成基因的克隆、产量提高、组分改善及杂合抗生素生产等方面取得了一定的进步，但在小单孢菌中的应用开发进展缓慢。2006年Piepersberg.W等公布了棘孢小单孢菌庆大霉素生物合成基因簇，长达84222bp。2012年潘成奇等公布绛红色小单胞菌庆大霉素生物合成基因簇（44181bp，JQ975418）。严凌斌等于2011年成功建立大肠杆菌-小单孢菌结合转移技术体系，为小单胞菌基因功能研究以及定向改造庆大霉素代谢流奠定了基础。 

当庆大霉素生物合成进入X2到G-418的时候，涉及到两次在非活性C上的甲基转移反应（Scheme 1）。借助计算机分析庆大霉素生物合成基因簇，结果显示：基因gntK产物介导了其中的一个C-甲基化反应。在磷霉素的生物合成中，Fom3是GntK-样蛋白中有代表性的一员，因此提出：Fom3是一种C-甲基转移酶，其底物为S-腺苷甲硫氨酸衍生的5^/-去氧腺苷基，并以甲基钴胺素作为催化剂，催化非活性C上的C-H键，使该键发生均裂，Fom3同时也是甲基的一个来源。提出这种新型的甲基转移机制是受Fom3结构域的构成所启发（也就是，一个钴胺素结合结构域和一个以Cys-XXX-Cys-XX-Cys基序为特征的S-腺苷甲硫氨酸基结构域），这种结构域的形式在Gntk中也存在。Gntk也和Fms7有高度同源性(Fok7在基因库的登记号为AJ628421)，能在福提霉素KL1的C-6^/位上加上一个甲基。庆大霉素和福提霉素化学上的一个共同点是C-6^/位上的甲基化，而存在这种共同的化学作用支持了GntK催化C-6^/位上的甲基化反应这个观点。尽管GntE序列与GntK序列的同源相似性极其有限，但GntE结构域的构成同样与GntK类似。目前的研究表明：gntE的失活导致庆大霉素A2的积累，这表明gntE参与庆大霉素A2到A的转变。此外，庆大霉素高产菌株被成功设计为积累庆大霉素A2。 

庆大霉素A是庆大霉素生物合成的中间产物，经过生物化学甲基化作用修饰成为庆大霉素X2。甲基插入修饰在氨基糖苷类生物合成中并不常见，但在福提霉素生物合成中可以发现，其包括N-甲基化，O-甲基化，C-甲基化。在磷霉素的生物合成中，Fom3是GntK-样蛋白中有代表性的一员，因此提出：Fom3是一种C-甲基转移酶，其底物为S-腺苷甲硫氨酸衍生的5’-去氧腺苷基，并以甲基钴胺素作为催化剂，催化非活性C上的C-H键，使该键发生均裂，Fom3同时也是甲基的一个来源^[10]。提出这种新型的甲基转移机制是受Fom3结构域的构成所启发（也就是，一个钴胺素结合结构域和一个以Cys-XXX-Cys-XX-Cys基序为特征的S-腺苷甲硫氨酸基结构域），这种结构域的形式在Gntk中也存在。Gntk也和Fms7有高度同源性(Fok7在基因库的登记号为AJ628421)，能在福提霉素KL1的C-6’位上加上一个甲基。严凌斌等于2012年将gntK/genK敲除，得到了主产庆大霉素C_1a的工程菌，并阐明了gntK/genK的功能为庆大霉素X₂ C-6’的甲基化，进一步证明了这一阐述的正确性。借助生物信息学技术和计算机对庆大霉素生物合成基因簇进行分析，genD1结构域的构成同样与gntK类似，推测genD1也是一个甲基化基因，可能参与庆大霉素生物合成途径过程中C-4’位上的甲基化。庆大霉素A在C-4’位甲基转移酶的修饰下，进一步合成庆大霉素X2。 

庆大霉素A是重要的氨基寡糖，具有一定的抗虫，抗病毒，抗肿瘤的潜在功能，是进一步开发高效抗病毒，抗肿瘤药物的重要前体。尽管庆大霉素A极其重要，但它是氨基寡糖生物合成的中间体，要获得该化合物，十分困难，国内外少见取得显著突破，在世界上至今无法实现产业化，大量制备该化合物，因此，妨碍了该类抗原虫，抗病毒和抗肿瘤药物的研究与开发。本发明借助微生物分子遗传学的操作技巧，在建立了系统的小单孢菌基因组改造的基础上，成功地实现了对绛红色小单孢菌的基因组改良，在国际上首次得到了主产庆大霉素A工程菌，国内外未见报道，为实现庆大霉素A产业化奠定了坚实基础。 

本发明是前一专利（201110331534.9）的进一步延伸和深化，属系列性专利。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种产庆大霉素A工程菌及其应用，通过灭活genD1基因功能，获得能产生不同于亲株组分的新物种，得到主产庆大霉素A的工程菌。 

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 

一种产庆大霉素A 工程菌，为灭活genD1基因功能的绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea) KD1989，该菌株已于2013年12月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保蒇，保藏编号为CGMCC No.8598。

     一种产庆大霉素A 工程菌的构建方法，通过基因敲除方法阻断绛红色小单孢菌中genD1基因，主要包括以下步骤： 

    A、genD1基因穿梭质粒pGD14的构建；

    B、质粒pGD14转化绛红色小单孢菌；

    C、转化子的筛选；

    D、工程菌株产物的鉴定。

    置换方法为：经PCR扩增分别获得genD1基因上下游各2000-2200bp的片段作为同源交换臂，将这两个片段连接到穿梭载体pKC1139上，载体pKC1139上的安普霉素抗性基因可用做筛选标记。 

    所述的转化是以Ecoli ET12657/pUZ8002介导的结合转移方法。 

    所述的筛选为：先筛选同时含安普霉素抗性的单交换菌株，再经松弛培养，筛选不含安普霉素抗性的双交换菌株。 

    所述的鉴定是通过MS质谱分析。 

    产庆大霉素A 工程菌在制备抗菌药物中的应用。 

其中，基因置换的方法是PCR扩增genD1上下游各2000-2200bp的片段，作为同源交换臂，克隆到温敏型载体pKC1139上，构建穿梭载体pGD14。以E.coli ET12657(pUZ8002)介导的结合转移方法，导入绛红色小单孢菌GK1101，借助阿伯拉霉素抗性筛选，得到9株单交换突变株，依次命名为GKD11~19；选取单交换突变株GKD11进行单菌落松弛培养后得到双交换突变菌株GKD1989。采用TLC和MS法，精确分析提取发酵产物组分的结构。 

基因genD1的DNA序列（1980bp）和氨基酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。 

本发明获得主产庆大霉素A工程菌。填补了国内外研究空白，为庆大霉素A的生产奠定了坚实基础，工艺简单，提取方便，无层析分离污染，可大大提高产品质量，为深度开发重要药物奠定基础。 

附图说明

图1 庆大霉素A化学结构图。 

图2 敲除genD1基因策略示意图。 

图3 重组质粒pGD14图谱及其酶切检测图； 

     M：λ-EcoT14 I digest DNA Marker；1：pGD14（EcoRI/ HindIII）酶切；2：pGD14（XbaI）酶切。

图4 敲除genD1同源重组原理示意图； 

     I：质粒游离存在； II：与染色体DB1侧单交换； III：与染色体DB2侧单交换； IV:染色体双交换；V：染色体回复突变。    

图5双交换工程菌GKD1989的PCR电泳检测图；

     M：DL5000 marker；1：PCR products of GKD1989 。 

图6 GK11101代谢产物质谱分析图。 

图7  GKD1989代谢产物质谱分析图。 

具体实施方式

实施例1 

    1．重组质粒pGD14的构建

    根据2012年我们构建的绛红色小单孢菌的庆大霉素生物合成基因簇（GenBank accession No.：JQ975418，44181bp）和Piepersberg等公布的棘孢小单孢菌庆大霉素生物合成基因簇( GenBank Accession Number AJ628149)，在基因genD1的上下游设计交换臂，采用框内敲除方案（附图1）。上游交换臂引物P1/P2 (P1: 5’-GAATTCCTGTGCCGCTGGATGCTC-3’，EcoRI; P2: 5’- TCTAGAGATACGTTCCGGCTCG TCGC-3’，XbaI）；下游交换臂引物P3/P4(P3: 5’- TCTAGAAAGGGCAACCGGATGGAG-3’，XbaI); P4: 5’- AAGCTTCGGGACGGTATTCGATCC-3’，HindIII)。以出发菌株绛红色小单孢菌G1008（见专利：201110331534.9）的基因组为模板，借助PCR技术，利用引物P1/P2，扩增基因genD的上游序列，作为同源重组的交换臂DB1（2155 bp），PCR的反应条件为：95℃预变性5 min；94℃变性1 min，61℃退火1 min，72℃延伸1.5min，循环30次；同样，利用引物P3/P4，扩增基因genD的下游序列，作为同源重组交换臂DB2（2062 bp），PCR的反应条件为：95℃预变性5 min；94℃变性1 min，63℃退火1 min，72℃延伸1.5min，循环30次；最后72℃延伸反应10 min。PCR样品经电泳检测后，回收目标条带并进行TA克隆，得到中间质粒pGD11（pMD19T::DB1）和pGD12(pMD19T::DB2)，

质粒pGD11（pMD19T::DB1）经EcoRI/XbaI双酶切后回收DB1片段（2155bp），与经相同酶切的pGD12，回收的大片段（4749bp）进行酶连，构建重组质粒pGD13（pMD19T::DB1::DB2）；再用EcoRI/HindIII双酶切得到DB1::DB2片段，与经同样双酶切（EcoRI/HindIII）的重组质粒pKC1139回收的大片段（6419bp）酶连，构建得到穿梭质粒pGD14（pKC1139::DB1::DB2）。该质粒以EcoRI/HindIII双酶切，得到6515bp和4211bp两条亮带，用XbaI单切，得到单条带10732bp，其电泳条带大小与理论预测一致，经DNA测序结果与预测吻合。质粒酶切验证见图3。

2．穿梭质粒pGD14转化绛红色小单孢菌GK1101 

    重组质粒pGD14与绛红色小单孢菌GK1101（见专利：201110331534.9 ）（ΔgenK）发生同源重组，其原理见附图4。将穿梭质粒pGD14转入E.coli ET12567 (pUZ8002)中，得到供体菌E.coli ET12567 (pUZ8002，pGD14)。然后通过结合转移的方法转化绛红色小单孢菌GK1101孢子，37℃培养2 h后，用安普霉素和萘啶酸（终浓度都为50μg/mL和25μg/mL）水溶液覆盖，37℃继续培养5天长出转化子，将所获得的apr^R转化子点接至含有安普霉素50μg/mL)和萘啶酸（25μg/mL）的平板培养基上，37℃培养，8d后将长好的孢子转接到斜面培养基上。只有发生同源交换整合到染色体上之后的结合子才能生长，表现出对安普霉素抗性。设计一对检测单双交换的引物P5/P6，P5(5’-TGCCATCGAGATGGTTCTC-3’)，P6(5’-AGTTTCTGCGTCATCAGCG-3’)，及一对扩增安普霉素抗性基因的引物A1/A2，A1（5’-CGGTCAGCTTCTCAACCTT-3’），A2（5’-GCAGGAAGATCAACGGATC-3’），进行PCR检测，P5/P6的PCR产物，经电泳检测，条带大小分别为2139bp和1173bp；A1/A2的PCR产物，电泳检测条带大小为689bp。选取9株接合子，提取染色体DNA进行PCR验证，结果得到的条带均与理论预测一致。说明这些菌为单交换菌株。将其中一株单交换菌株命名为绛红色小单孢菌GKD11。

3．双交换菌株筛选 

    将GKD11在无压力斜面上松弛培养后，进行分离纯化，挑取单菌落，分别影印到不含抗性的平板和含安普霉素抗性（安普霉素50μg/mL）的平板上，从中筛选对安普霉素敏感的菌株。挑选其中一株，以其染色体DNA作为模板，用引物P5/P6进行PCR检测，结果得到与理论预测一致的1173bp条带，经DNA测序，与预测一致，说明该菌为双交换菌株。电泳检测结果见图5，命名为绛红色小单孢菌GKD1989（ΔgenK+（ΔgenD1）。

实施例2：绛红色小单孢菌GKD1989代谢产物庆大霉素A的制备 

本发明提供的genD1敲除工程菌：绛红色小单孢菌GKD1989可直接用于生产庆大霉素A。

1．绛红色小单孢菌GKD1989菌株的发酵培养 

种子培养基：葡萄糖0.1%，玉米淀粉1.0%，玉米粉1.5%，蛋白胨0.2%，黄豆饼粉1.0%，KNO₃ 0.05%，CaCO₃ 0.5%，pH7.0。

发酵培养基：玉米淀粉6.0%，玉米粉1.0%，蛋白胨0.4%，黄豆饼粉2.0 %，KNO₃ 0.01%，(NH₄)₂SO₄ 0.1%，CaCO₃ 0.5%，淀粉酶0.025%，pH7.5。 

 将实例1中步骤3获得的绛红色小单孢菌GKD1989进行发酵。发酵前先用稀释平板法分离出产孢丰富的单菌落转接于斜面培养基，37℃培养10天，挖块接种于种子培养基（装量为50mL／250mL三角瓶），37℃摇床培养36 h(转速为250rpm)。按10%接种量转种于发酵培养基（装量为50mL/250mL三角瓶），37℃摇床培养120 h(转速为250rpm)。 

20000升发酵罐生产，搅拌转速180转/分钟，通气量1：0.5~1.0  (M³ /M³·min)，培养基，培养温度，接种量比例，发酵时间等参照摇瓶发酵进行。 

2.代谢产物提取精制 

A、粗提

发酵液稀释后分别酸化、碱化，除蛋白、菌丝体和固体物后，用732NH₄ ⁺树脂静态吸附6~8小时。收集吸附饱和树脂，用0.1M HCl溶液，酸洗饱和树脂，然后用无离子水洗涤至中性，而后用质量分数为0.01%氨水进行碱洗，当流出液达pH 9.0以上时，串联到等体积的711树脂柱上，收集树脱液。

B、精制、结晶 

洗脱液经薄膜浓缩到约300000ug/mL，用浓硫酸调至pH5.5~6.0．活性炭脱色到透光度达92%以上，在搅拌下，缓慢向浓缩液中滴加95%以上乙醇，进行结晶，时间3-4小时，再经离心机分离，85%乙醇溶液淋洗，即得湿成品。湿成品真空干燥（真空度500mmHg以上，温度60℃，干燥6小时），即得硫酸庆大霉素A成品，收率80%以上。

C、代谢产物检测 

质谱条件：离子化方式ESI（+），扫描范围100～800m/z，干气流速8.0升/分钟，温度350℃，雾化气压2.07×105Pa，毛细管电压 3500 V，碎裂器电压 135 V，分析软件为安捷伦的MassHunter（B.04.00）。

质谱分析结果，工程菌GKD1989代谢产物为庆大霉素A，分子量为469.2，而没有庆大霉素C复合物，C1a：450，C1：478， C2：464，质谱分析结果见图6和图7。图6中，出发菌株GK1101代谢产物：450.3的峰为庆大霉素C1a，464.3的峰为庆大霉素C2b，483.3的峰为庆大霉素X2；工程菌GKD1989代谢产物（图7）：469.2的峰为庆大霉素A，308.2的峰是碎片峰，235.1的峰是双电荷峰。 

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。 

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  福州大学、福州市鼓楼区荣德生物科技有限公司

 

<120>  一种产庆大霉素A 工程菌及其应用

 

<130>  10

 

<160>  10   

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1980

<212>  DNA

<213>  基因genD1的DNA序列

 

<400>  1

atgaccgtca ctaaaaagat cgtcaccggt gtcgcgttcc caccgtcgtt gttggcggag     60

 

accccgccga tctcggtggc gaccctcacg gcctaccttc gcgacaaggg catgccggct    120

 

cttggcctgg acctgaacgc ggacttcaac aagtacctgc tcgaccgggt cgagatcgag    180

 

caggtgcagg gcccggagaa cacccacgag ttcaccgagc cgttcatcaa gcggttcttc    240

 

ctgaaccaca tcaccggcaa ctacttcacc gagacgaact tcgagcagtg ggacctgcag    300

 

cagcagtgcc aggtcgcgcc ggagagcctc tccatctggg acccgccgtt cccgtactcg    360

 

tactgtgagt tcctgtcgat cctgcgcgac gagccggaac gtatcgcgaa gctggtccgg    420

 

gacccggacg cgaacatcta ccacgccttc taccacgaga aggtcgccgg taaggccgcc    480

 

gatctgggcc tgatgggctt ctcgatcatg gggtacaacc aggtcatccc cgcgctgacc    540

 

ctgggctacc tgatgaagca ggagaacccg gacctctaca tctgctgggg tggcccctgg    600

 

gtgacctcct tcgcggacat gctcatcccg cgcctggagg cctgcccgga actgggtgac    660

 

ctgatcgact ccctggtcgt ccgggagggc gaggagccgc tcctgaagat ggccgaggcg    720

 

ctgtcccggg gcgagcggcc ggtcggcatc cccggtggct gcaagccgat gtcggagcag    780

 

agcgtgctcg acaccaagcc ggtcggccgc aagctgctgc tggagatgtc caagccgcgg    840

 

gagaacatgc ccaacaccca ctggcgtacc gaggacggca cctacgagcg cagcggtgac    900

 

atctcctggg tcgcggacat gaaccagctc ccgaccccgg actacagcga cttcgacctg    960

 

tcgctgtaca ccacgttcca agaggggcag ggcagcctcg tcctccaggg ctcgcggtcc   1020

 

tgctactaca tgaagtgctc gttctgcaac gcgatcacca acttcgcgcc gtggagctac   1080

 

cgggaacgca gcaccgagaa cctccagaag gacatcgaca ccttcctgga gctgtacccc   1140

 

gggaccgtgc acttcgactt cgccgacgcg gtcttcccgg cgaagcgact ggtcgagctc   1200

 

gccgacttct tcatcgccaa gcagcgcccg gagctgttct gggaggttga cgtccggttc   1260

 

gagggcaaca tcgacaaggc cgtcctgacc aagatgcgtg actcgcaggg caccctgcgc   1320

 

ttcggcctgg agaccgcgaa cgagcgcctg ctcgacctgg tccgcaaggg caaccggatg   1380

 

gaggtcgtcc accgcctgct ccaggacagc cgggagctgg gctacaagcc gttcctgatg   1440

 

accatcgtcg gcctgcccac cgaggagcgg aacgaggctg aggagctcta ccagttcctc   1500

 

agcgactacc acgacacggt gacgtaccag atcgccgact tcatcgtcga gcggaactcg   1560

 

ccgatccagc tccggccgga cgagtacggc atccacatcg acgacgacga gcaggagagc   1620

 

ttccaccaca acctgcactt cacccgtcgc gccggctaca gcgacgagga ggcgcaggag   1680

 

gtgtaccagg acatcctggt ccgcaccatg cagcggttca agggtgccca cgaggtggac   1740

 

gtggagcagg agcggagccg ggtcgccccg gacgactccg tctaccgcct gagcctgcgg   1800

 

gccggctcct tcgcattgga gaactactgg gtgaagcaca acaacctgcc gttcgagggc   1860

 

ctggtgccga tcggctacaa ggtccagcag cagtggaccg acatgagtga caagggcacg   1920

 

gtcttcgaga tcgacccgga catcgccctc ggggccctcg ccggggcagg tagccgctga   1980

 

 

<210>  2

<211>  618

<212>  PRT

<213>  基因GenD1的氨基酸序列

 

<400>  2

 

Trp Arg Ser Pro Glu Met Thr Val Thr Lys Lys Ile Val Thr Gly Val

1               5                   10                  15     

 

 

Ala Phe Pro Pro Ser Leu Leu Ala Glu Thr Pro Pro Ile Ser Val Ala

            20                  25                  30         

 

 

Thr Leu Thr Ala Tyr Leu Arg Asp Lys Gly Met Pro Ala Leu Gly Leu

        35                  40                  45             

 

 

Asp Leu Asn Ala Asp Phe Asn Lys Tyr Leu Leu Asp Arg Val Glu Ile

    50                  55                  60                 

 

 

Glu Gln Val Gln Gly Pro Glu Asn Thr His Glu Phe Thr Glu Pro Phe

65                  70                  75                  80 

 

 

Ile Lys Arg Phe Phe Leu Asn His Ile Thr Gly Asn Tyr Phe Thr Glu

                85                  90                  95     

 

 

Thr Asn Phe Glu Gln Trp Asp Leu Gln Gln Gln Cys Gln Val Ala Pro

            100                 105                 110        

 

 

Glu Ser Leu Ser Ile Trp Asp Pro Pro Phe Pro Tyr Ser Tyr Cys Glu

        115                 120                 125            

 

 

Phe Leu Ser Ile Leu Arg Asp Glu Pro Glu Arg Ile Ala Lys Leu Val

    130                 135                 140                

 

 

Arg Asp Pro Asp Ala Asn Ile Tyr His Ala Phe Tyr His Glu Lys Val

145                 150                 155                 160

 

 

Ala Gly Lys Ala Ala Asp Leu Gly Leu Met Gly Phe Ser Ile Met Gly

                165                 170                 175    

 

 

Tyr Asn Gln Val Ile Pro Ala Leu Thr Leu Gly Tyr Leu Met Lys Gln

            180                 185                 190        

 

 

Glu Asn Pro Asp Leu Tyr Ile Cys Trp Gly Gly Pro Trp Val Thr Ser

        195                 200                 205            

 

 

Phe Ala Asp Met Leu Ile Pro Arg Leu Glu Ala Cys Pro Glu Leu Gly

    210                 215                 220                

 

 

Asp Leu Ile Asp Ser Leu Val Val Arg Glu Gly Glu Glu Pro Leu Leu

225                 230                 235                 240

 

 

Lys Met Ala Glu Ala Leu Ser Arg Gly Glu Arg Pro Val Gly Ile Pro

                245                 250                 255    

 

 

Gly Gly Cys Lys Pro Met Ser Glu Gln Ser Val Leu Asp Thr Lys Pro

            260                 265                 270        

 

 

Val Gly Arg Lys Leu Leu Leu Glu Met Ser Lys Pro Arg Glu Asn Met

        275                 280                 285            

 

 

Pro Asn Thr His Trp Arg Thr Glu Asp Gly Thr Tyr Glu Arg Ser Gly

    290                 295                 300                

 

 

Asp Ile Ser Trp Val Ala Asp Met Asn Gln Leu Pro Thr Pro Asp Tyr

305                 310                 315                 320

 

 

Ser Asp Phe Asp Leu Ser Leu Tyr Thr Thr Phe Gln Glu Gly Gln Gly

                325                 330                 335    

 

 

Ser Leu Val Leu Gln Gly Ser Arg Ser Cys Tyr Tyr Met Lys Cys Ser

            340                 345                 350        

 

 

Phe Cys Asn Ala Ile Thr Asn Phe Ala Pro Trp Ser Tyr Arg Glu Arg

        355                 360                 365            

 

 

Ser Thr Glu Asn Leu Gln Lys Asp Ile Asp Thr Phe Leu Glu Leu Tyr

    370                 375                 380                

 

 

Pro Gly Thr Val His Phe Asp Phe Ala Asp Ala Val Phe Pro Ala Lys

385                 390                 395                 400

 

 

Arg Leu Val Glu Leu Ala Asp Phe Phe Ile Ala Lys Gln Arg Pro Glu

                405                 410                 415    

 

 

Leu Phe Trp Glu Val Asp Val Arg Phe Glu Gly Asn Ile Asp Lys Ala

            420                 425                 430         

 

 

Val Leu Thr Lys Met Arg Asp Ser Gln Gly Thr Leu Arg Phe Gly Leu

        435                 440                 445            

 

 

Glu Thr Ala Asn Glu Arg Leu Leu Asp Leu Val Arg Lys Gly Asn Arg

    450                 455                 460                 

 

 

Met Glu Val Val His Arg Leu Leu Gln Asp Ser Arg Glu Leu Gly Tyr

465                 470                 475                 480

 

 

Lys Pro Phe Leu Met Thr Ile Val Gly Leu Pro Thr Glu Glu Arg Asn

                485                 490                 495    

 

 

Glu Ala Glu Glu Leu Tyr Gln Phe Leu Ser Asp Tyr His Asp Thr Val

            500                 505                 510        

 

 

Thr Tyr Gln Ile Ala Asp Phe Ile Val Glu Arg Asn Ser Pro Ile Gln

        515                 520                 525            

 

 

Leu Arg Pro Asp Glu Tyr Gly Ile His Ile Asp Asp Asp Glu Gln Glu

    530                 535                 540                

 

 

Ser Phe His His Asn Leu His Phe Thr Arg Arg Ala Gly Tyr Ser Asp

545                 550                 555                 560

 

 

Glu Glu Ala Gln Glu Val Tyr Gln Asp Ile Leu Val Arg Thr Met Gln

                565                 570                 575    

 

 

Arg Phe Lys Gly Ala His Glu Val Asp Val Glu Gln Glu Arg Ser Arg

            580                 585                 590        

 

 

Val Ala Pro Asp Asp Ser Val Tyr Arg Leu Ser Leu Arg Ala Gly Ser

        595                 600                 605            

 

 

Phe Ala Leu Glu Asn Tyr Trp Val Lys His

    610                 615             

 

 

<210>  3

<211>  24

<212>  DNA

<213>  引物P1

 

<400>  3

gaattcctgt gccgctggat gctc                                            24

 

 

<210>  4

<211>  26

<212>  DNA

<213>  引物P2

 

<400>  4

tctagagata cgttccggct cgtcgc                                          26

 

 

<210>  5

<211>  24

<212>  DNA

<213>  引物P3

 

<400>  5

tctagaaagg gcaaccggat ggag                                            24

 

 

<210>  6

<211>  24

<212>  DNA

<213>  引物P4

 

<400>  6

aagcttcggg acggtattcg atcc                                            24

 

 

<210>  7

<211>  19

<212>  DNA

<213>  引物P5

 

<400>  7

tgccatcgag atggttctc                                                  19

 

 

<210>  8

<211>  19

<212>  DNA

<213>  引物P6

 

<400>  8

agtttctgcg tcatcagcg                                                  19

 

 

<210>  9

<211>  19

<212>  DNA

<213>  引物A1

 

<400>  9

cggtcagctt ctcaacctt                                                  19

 

 

<210>  10

<211>  19

<212>  DNA

<213>  引物A2

 

<400>  10

gcaggaagat caacggatc                                                  19

 

 

Claims (7)

1.一种产庆大霉素A 工程菌，其特征在于：所述工程菌为灭活genD1基因功能的绛红色小单孢菌(Micromonospora purpurea) KD1989，该菌株已于2013年12月18日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保蒇，保藏编号为CGMCC No.8598。

2.一种如权利要求1所述的一种产庆大霉素A 工程菌的构建方法，其特征在于：通过基因敲除方法阻断绛红色小单孢菌中genD1基因，主要包括以下步骤：

    A、genD1基因穿梭质粒pGD14的构建；

    B、质粒pGD14转化绛红色小单孢菌；

    C、转化子的筛选；

    D、工程菌株产物的鉴定。

3.根据权利要求2所述的一种产庆大霉素A 工程菌的构建方法，其特征在于：置换方法为：经PCR扩增分别获得genD1基因上下游各2000-2200bp的片段作为同源交换臂，将这两个片段连接到穿梭载体pKC1139上，载体pKC1139上的安普霉素抗性基因可用做筛选标记。

4.根据权利要求2所述的一种产庆大霉素A 工程菌的构建方法，其特征在于：所述的转化是以EcoliET12657/pUZ8002介导的结合转移方法。

5.根据权利要求2所述的一种产庆大霉素A 工程菌的构建方法，其特征在于：所述的筛选为：先筛选同时含安普霉素抗性的单交换菌株，再经松弛培养，筛选不含安普霉素抗性的双交换菌株。

6.根据权利要求2所述的一种产庆大霉素A 工程菌的构建方法，其特征在于：所述的鉴定是通过MS质谱分析。

7.一种如权利要求1所述的产庆大霉素A 工程菌在制备抗菌药物中的应用。

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