CN103667162A - 一种高产g418工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents
一种高产g418工程菌及其构建方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种高产G418工程菌及其构建方法与应用,属于抗生素制药领域。高产G418工程菌为编码C-6’羟基氧化还原酶的基因genQ功能缺失的棘孢小单孢菌ΔgenQ,其保藏编号为CCTCCNO:M2013729。其构建方法为通过同框敲除的方法缺失棘孢小单孢菌中的基因genQ,包括genQ基因同框敲除质粒的构建、同框敲除质粒转化棘孢小单孢菌和双交换突变株的筛选。本发明利用同框敲除技术对庆大霉素产生菌棘孢小单孢菌中的genQ基因进行缺失,以阻断庆大霉素C组分及其相关中间产物的合成,使其主要产生G418。本发明ΔgenQ的G418产量和纯度高,简化了生产G418的生产工艺,降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明属于抗生素制药领域,涉及一种高产G418工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
G418(Geneticin)是由红橙小单孢菌(Micromonospora rhodorangea)产生的一种结构与新霉素、庆大霉素和卡那霉素相似的氨基糖苷类抗生素,其化学结构式如下式所示。在分子遗传学中,G418是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。近年来,G418还被广泛应用于去除细胞培养中沾染的成纤维细胞。最新研究报道,G418及其衍生物可以用于治疗无义突变引起的人类遗传性疾病以及具有抑制病毒功效。
然而,由于红橙小单孢菌代谢产物复杂,且代谢物化学结构相近,理化性质相似,导致生产G418成本高,层析分离周期长,收率低,料耗大,污染严重,提取精制工艺复杂,而且产品质量不稳定,与G418结构相似的副产物随时出现干扰,给G418产品质量控制造成了极大的不确定性,严重影响了药品的稳定性、安全性和有效性,是迫切需要解决的科学难题。
鉴于庆大霉素产生菌棘孢小单孢菌(M echinospora)的生物合成基因簇的成功克隆,遗传操作系统的建立以及生物合成途径的深入阐明,同时,G418是庆大霉素生物合成中的一种中间产物,为通过生物合成途径改造,实现G418的高产提供了坚实的基础。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足,提供一种高产G418工程菌。
本发明的另一目的在于提供上述高产G418工程菌的构建方法。通过基因工程的方法将庆大霉素生物合成中C-6’羟基氧化还原酶的编码基因genQ敲除,从而使棘孢小单孢菌不能合成庆大霉素C组分及其相关中间产物,使其主要产生G418。
本发明的再一目的在于提供上述高产G418工程菌的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一株高产G418工程菌,为编码C-6’羟基氧化还原酶的基因genQ功能缺失的棘孢小单孢菌。
优选的,所述的高产G418工程菌为棘孢小单孢菌ΔgenQ(Micromonospora echinosporaΔgenQ),已于2013年12月30日在中国典型培养物保藏中心(中国.武汉.武汉大学)登记保藏,保藏编号为CCTCC NO:M2013729。
上述高产G418工程菌的构建方法为通过同框敲除的方法缺失棘孢小单孢菌中的基因genQ,主要包括以下步骤:
(1)genQ基因同框敲除质粒的构建
构建含有棘孢小单孢菌基因genQ的上下游同源交换臂的链霉菌-大肠杆菌(Streptomyces-E.coli shuttle vector)重组穿梭质粒。
(2)同框敲除质粒转化棘孢小单孢菌
采用E.coli ET12567/pUZ8002介导的接合转移方法,将上述构建的重组穿梭质粒导入棘孢小单孢菌中,得到接合转移子。
(3)双交换突变株的筛选
根据抗性表型筛选在DNA水平上发生两次同源重组的genQ敲除突变株,得到高产G418工程菌。
步骤(1)中所述的上下游同源交换臂优选为各2000bp左右。
步骤(1)中所述的重组穿梭质粒优选为pYH7;pYH7的来源见文献Sun,Y.H.,He,X.Y.,Liang,J.D.,Zhou,X.F.,and Deng,Z.X.(2008).Analysis of functions in plasmid pHZ1358influencing its genetic and structural stability in Streptomyces lividans1326.Appl.Microbiol.Biotechnol.82,303-310;Sun,Y.H.,Hong,H.,Samborskyy,M.,Mironenko,T.,Leadlay,P.F.,andHaydock,S.F.,(2006)Organization of the biosynthetic gene cluster in Streptomyces sp.DSM 4137for the novel neuroprotectant polyketide meridamycin.Microbiology 152,3507-3515;Sun,Y.H.,Zhou,X.F.,Liu,J.,Bao,K.,Zhang,G.M.,Tu,G.Q.,Kieser,T.,Deng,Z.X.(2002).‘Streptomycesnanchangensis’,a producer of the insecticidal polyether antibiotic nanchangmycin and theantiparasitic macrolide meilingmycin,contains multiple polyketide gene clusters.Microbiology 148,361-371。
优选的,步骤(1)具体为:使用如下引物PCR扩增野生型棘孢小单孢菌中基因genQ上下游同源臂片段,再通过酶切和酶连,将上下游同源臂片段克隆到pYH7上,得到基因genQ同框敲除质粒;
左臂上游引物L1:5’-CTGCATATGCTCACCGCCCGGC-3’(含NdeI酶切位点),
左臂下游引物L2:5’-CCCGAATTCTCCCTGTGACCTGTCG-3’(含EcoRI酶切位点),扩增左臂(genQ-L)1937bp;
右臂上游引物R1:5’-ACCGAATTCGCCGCTACCGATCACAC-3’(含EcoRI酶切位点),
右臂下游引物R2:5’-GGCAAGCTTGATCGGAACCATCCGG-3’(含HindIII酶切位点),扩增右臂(genQ-R)1988bp。
上述高产G418工程菌在生产G418中的应用。
上述高产G418工程菌在合成抗菌药物中的应用。
本发明相对于现有技术具有如下优点和效果:
本发明通过基因工程的手段,对庆大霉素产生菌棘孢小单孢菌特定的功能基因进行敲除,从而专一性的积累G418,为清洁生产,安全用药,提供了可靠保障。
本发明获得了高产G418的工程菌,不仅提高了G418的产量,同时达到了获得高纯度的G418的目标;简化了生产G418的生产工艺,降低了生产成本。
附图说明
图1是质粒pYH286质粒图谱。
图2是质粒pYH286酶切验证结果图;其中,1:1kb DNA分子量marker(Fermentas),2:BamHI酶切质粒pYH286片段,3:NspI酶切质粒pYH286片段。
图3是突变株ΔgenQ构建示意图。
图4是突变株ΔgenQ的PCR验证结果图;其中,1:1kb DNA分子量marker(Fermentas),2:质粒pYH286(阳性对照),3:野生型棘孢小单孢菌ATCC15835(阴性对照),4:突变株ΔgenQ。
图5是突变株ΔgenQ的Southern-blot验证结果图;其中,1:1kb DNA分子量marker(Fermentas),2:ApaLI酶切野生型棘孢小单孢菌ATCC15835总DNA,3:ApaLI酶切突变株ΔgenQ总DNA。
图6是突变株ΔgenQ发酵产物的LC-ESI-HRMS分析结果图;其中,A:庆大霉素标准品,B:野生型棘孢小单孢菌ATCC15835发酵产物,C:G418标准品,D:突变株ΔgenQ发酵产物。
图7是G418高分辨质谱一级和二级碎片分析结果图;其中,A:G418标准品高分辨质谱一级(MS1)和二级(MS2)碎片分析图,B:突变株ΔgenQ发酵产物中G418高分辨质谱一级(MS1)和二级(MS2)碎片分析图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明做进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)构建基因genQ的同框敲除质粒
根据已发表的庆大霉素产生菌棘孢小单孢菌Micromonospora echinospora生物合成基因簇(GenBank accession number:AJ628149)的相应序列,分别在genQ基因的上下游设计两对引物:
左臂上游引物L1:5’-CTGCATATGCTCACCGCCCGGC-3’(含NdeI酶切位点);
左臂下游引物L2:5’-CCCGAATTCTCCCTGTGACCTGTCG-3’(含EcoRI酶切位点);扩增左臂(genQ-L)1937bp;
右臂上游引物R1:5’-ACCGAATTCGCCGCTACCGATCACAC-3’(含EcoRI酶切位点);
右臂下游引物R2:5’-GGCAAGCTTGATCGGAACCATCCGG-3’(含HindIII酶切位点);扩增右臂(genQ-R)1988bp。
以野生型棘孢小单孢菌ATCC15835总DNA为模板,用高保真DNA聚合酶,以上述两对引物进行PCR,扩增出两个同源交换臂片段。其中,扩增左臂和右臂的PCR反应体系为:2×Phusion Master Mix with GC buffer(New England Biolabs)25μL,上下游引物各4μL,棘孢小单孢菌总DNA2μL,50mM MgCl22μL,DMSO4μL,MilliQ水9μL,总反应体系为50μL。PCR扩增程序为:98℃预变性1min,98℃变性10s,58℃退火15s,72℃延伸1min,30个循环,之后72℃终延伸10min,4℃保存。将PCR扩增出的同源交换臂片段经琼脂糖凝胶电泳回收后,将左臂用NdeI和EcoRI双酶切,与经相同酶处理后的载体pUC18连接,转化DH10B,提取重组质粒pUC18-左臂。同样,将右臂用EcoRI和HindIII双酶切,与经相同酶处理后的载体pUC18连接,转化DH10B,提取重组质粒pUC18-右臂。将酶切验证正确的重组质粒,以pUC18多克隆位点外的通用引物进行测序验证。将测序正确的重组质粒pUC18-左臂和pUC18-右臂,再分别用NdeI、EcoRI和EcoRI、HindIII双酶切,获得两个同源臂片段。采用三片段连接的方式通过NdeI和HindIII将这两个同源臂片段同时克隆到载体pYH7上,得到敲除基因genQ内部1494bp的保守序列的同框敲除质粒pYH286,pYH286质粒图谱见图1,其酶切验证结果见图2,表明基因genQ的同框敲除质粒pYH286构建成功。
(2)同框敲除质粒pYH286转化棘孢小单孢菌
将同框敲除质粒pYH286转入E.coli ET12567/pUZ8002(来源见文献MacNeil,D.J.,Occi,J.L.,Gewain,K.M.,MacNeil,T.,Gibbons,P.H.,Ruby,C.L.,and Danis,S.J.(1992).Complexorganization of the Streptomyces avermitilis genes encoding the avermectin polyketide synthase.Gene115,119-125.)中,得到供体菌株大肠杆菌E.coli ET12567/pUZ8002/pYH286。再将大肠杆菌ET12567/pUZ8002/pYH286单菌落,接种于5mL2×TY培养基(含100μg/mL羧苄青霉素、25μg/mL卡那霉素、25μg/mL氯霉素和25μg/mL阿伯拉霉素)中,37℃、220rpm摇床培养过夜,按1%的接种量转接到5mL含上述四种抗生素的2×TY培养基中,37℃、220rpm摇床2h左右,使其OD600达到0.6左右,5000rpm离心5min收集菌体,用新鲜的2×TY培养基洗涤两次,最后重悬到200μL2×TY培养基。
挑取新鲜平板上棘孢小单孢菌ATCC15835菌块(约1cm2),接入50mL ATCC Meduim172液体培养基中,28℃、220rpm摇床培养72h后,5000rpm离心5min收集菌体,用新鲜的2×TY培养基洗涤两次,最后重悬到200μL2×TY培养基中。
分别取大肠杆菌和棘孢小单孢菌各100μL,混匀后涂布于ABB13培养基(0.5%大豆胨,0.5%可溶性淀粉,0.3%CaCO3,0.21%MOPS,0.0012%FeSO4·7H2O,0.001%thiamine HCl,10mM MgCl2)平板上,置于28℃培养10-14h后,用含有12.5μg/mL阿伯拉霉素和25μg/mL奈啶酮酸的1mL无菌水覆盖,超净台上吹干后,置于28℃培养7d,长出接合转移子。
(3)双交换突变株ΔgenQ的筛选
ΔgenQ的构建示意图如图3所示。
将接合转移子转接到含有25μg/mL阿伯拉霉素和25μg/mL奈啶酮酸的A培养基(1%小麦淀粉,0.25%玉米粉,0.3%酵母提取物,0.3%CaCO3,0.0012%FeSO4·7H2O,10mM MgCl2,用KOH调到pH7.0)平板上,28℃培养4d进行抗性验证(只有发生同源重组的接合转移子才会生长)。将发生单交换的菌株在A培养基平板上进行松弛培养,再将单菌落分别影印到不含抗生素和含有25μg/mL阿伯拉霉素的A培养基平板上,28℃培养4d后,选取对阿伯拉霉素敏感的菌株,对阿伯拉霉素敏感的菌株可能为双交换突变株或野生型菌株。提取对阿伯拉霉素敏感的菌株的总DNA,以双交换突变株验证引物(CP1:5’-CCTCCTCGTCACCGTGG-3’和CP2:5’-CAGGTGCTCAGCGTCCG-3’)进行PCR验证筛选双交换突变株。其中,PCR反应体系为:2×Taq PCR Master Mix(北京原平皓生物技术有限公司)25μL,突变株验证引物各4μL,对阿伯拉霉素敏感的菌株的总DNA2μL,50mM MgCl22μL,DMSO4μL,MilliQ水9μL,总反应体系为50μL。PCR扩增程序为:98℃预变性1min,98℃变性10s,58℃退火15s,72℃延伸1min,30个循环,之后72℃终延伸10min,4℃保存。0.7%琼脂糖凝胶电泳检测结果如图4所示。将PCR验证正确的突变株进行测序,并进行Southern-blot验证(Southern-blot验证结果见图5),最终获得双交换突变株,命名为棘孢小单孢菌ΔgenQ(Micromonosporaechinospora ΔgenQ),已于2013年12月30日在中国典型培养物保藏中心(中国.武汉.武汉大学)登记保藏,保藏编号为CCTCC NO:M2013729。
(4)发酵产物的提取和分析检测
分别将野生型菌株棘孢小单孢菌ATCC15835和突变株ΔgenQ在ATCC Meduim172平板上进行活化,各取约1cm2菌块,接种于30mL ATCC Meduim172液体培养基中,28℃、220rpm摇床培养2d后,按照2%的接种量,转接50mL ATCC Meduim172液体培养基中,28℃、220rpm摇床发酵8d。
用6M硫酸调节发酵液的pH到2左右,振荡酸化5h后,8000rpm离心10min,取约40mL酸化后的发酵上清液过50WX8-200阳离子交换树脂(树脂在使用前用适量乙腈洗涤后再用水洗,最后平衡在pH为2.0硫酸溶液中)。之后用30mL pH为2.0硫酸溶液洗涤(去除杂质),然后用10mL2%氨水溶液洗脱,再将洗脱液在通风厨中过夜挥发氨水后,放置于-80℃冰箱中预冻,再将预冻后的样品置于真空冷冻干燥仪上冻干样品。
将冻干后的样品粉末溶解于1mL MillQ水中,12000rpm离心10min后,取上清液用0.22μm水系微孔滤膜过滤。利用Thermo LTQ-Obitrap XL高分辨质谱对样品进行检测。采用Phenomenex Luna C18(2)反向色谱柱(250×4.6mm,5μm),流动相包括:A相为0.2%TFA,用氨水调节pH2.0的MilliQ H2O;B相为乙腈。梯度洗脱条件为:0-18min,2%B to14%B;18-19min,14%B to40%B;19-24min,40%B;24-25min,40%B to2%B;25-30min,2%B。流速为400μL/min,样品进样量为10μL。正离子模式检测。离子源条件为:喷雾电压3.5kv,毛细管温度275℃,鞘气流速为50L/h,辅助气流速为10L/h,离子源温度350℃,碰撞能量35eV。
LC-ESI-HRMS检测结果表明,与野生型棘孢小单孢菌ATCC15835发酵产物(如图6中B图所示)相比突变株ΔgenQ发酵产物(如图6中D图所示)中没有中间产物JI-20A和JI-20B,以及庆大霉素C组分(包括庆大霉素C1a、C2、C2a、C2b和C1)的产生,同时大量积累目标化合物G418,其G418产量为野生的100倍以上。由此表明,突变株ΔgenQ实现了G418的高产。图7是对突变株ΔgenQ中产生的G418与G418标准品进行高分辨质谱一级和二级碎片分析,进一步证明突变株ΔgenQ中积累的化合物是G418。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉大学
<120> 一种高产G418工程菌及其构建方法与应用
<130> 1
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 左臂上游引物L1
<400> 1
ctgcatatgc tcaccgcccg gc 22
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 左臂下游引物L2
<400> 2
cccgaattct ccctgtgacc tgtcg 25
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 右臂上游引物R1
<400> 3
accgaattcg ccgctaccga tcacac 26
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 右臂下游引物R2
<400> 4
ggcaagcttg atcggaacca tccgg 25
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 双交换突变株验证引物CP1
<400> 5
cctcctcgtc accgtgg 17
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 双交换突变株验证引物CP2
<400> 6
caggtgctca gcgtccg 17
Claims (8)
1.一株高产G418工程菌,其特征在于:为编码C-6’羟基氧化还原酶基因genQ功能缺失的棘孢小单孢菌。
2.根据权利要求1所述的高产G418工程菌,其特征在于:为棘孢小单孢菌ΔgenQ,保藏编号为CCTCC NO:M 2013729。
3.权利要求1或2所述的高产G418工程菌的构建方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)genQ基因同框敲除质粒的构建
构建含有棘孢小单孢菌基因genQ的上下游同源交换臂的链霉菌-大肠杆菌重组穿梭质粒;
(2)同框敲除质粒转化棘孢小单孢菌
采用E. coli ET12567/pUZ8002介导的接合转移方法,将上述构建的重组穿梭质粒导入野生型的棘孢小单孢菌中,得到接合转移子;
(3)双交换突变株的筛选
根据抗性表型筛选在DNA水平上发生两次同源重组的genQ敲除突变株,得到高产G418工程菌。
4.根据权利要求3所述的高产G418工程菌的构建方法,其特征在于:步骤(1)中所述的上下游同源交换臂为各2000 bp左右。
5.根据权利要求3所述的高产G418工程菌的构建方法,其特征在于:步骤(1)中所述的重组穿梭质粒为pYH7。
6.根据权利要求3所述的高产G418工程菌的构建方法,其特征在于步骤(1)具体为:使用如下引物PCR扩增野生型棘孢小单孢菌中基因genQ上下游同源臂片段,再通过酶切和酶连,将上下游同源臂片段克隆到pYH7上,得到基因genQ同框敲除质粒;
左臂上游引物L1:5’-CTGCATATGCTCACCGCCCGGC-3’,
左臂下游引物L2:5’-CCCGAATTCTCCCTGTGACCTGTCG-3’;
右臂上游引物R1:5’-ACCGAATTCGCCGCTACCGATCACAC-3’,
右臂下游引物R2:5’-GGCAAGCTTGATCGGAACCATCCGG-3’。
7.权利要求1或2所述的高产G418工程菌在生产G418中的应用。
8.权利要求1或2所述的高产G418工程菌在合成抗菌药物中的应用。
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PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20140326 |