CN113355347A - 一种g418在少孢节丛孢菌中遗传转化筛选体系的建立方法 - Google Patents
一种g418在少孢节丛孢菌中遗传转化筛选体系的建立方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了在少孢节丛孢菌中建立了一种新的遗传转化筛选体系，将有利于该真菌遗传转化体系的多层次应用。该方法包括如下步骤：首先将G418编码的对应氨基酸序列根据少孢节丛孢菌密码子偏好性进行密码子优化；将优化后的DNA序列在5’加上Ptef，3’加上Ttef，接着连接在pUC57载体上进行合成，获得Ptef‑G418‑Ttef的DNA模板；在使用时根据实验要求设计特异性引物进行PCR合成使用；使用同源重组‑原生质体转化法将G418导入少孢节丛孢菌。本发明为少孢节丛孢菌增加了一种新的抗性选择标记，可使原来对G418敏感的少孢节丛孢菌对其产生抗性，可对少孢节丛孢菌进行遗传基因操作，为研究少孢节丛孢菌的基因功能带来了巨大方便，而且费用低廉。
Description
技术领域
本发明属于微生物基因工程生物技术领域，具体涉及在丝状真菌少孢节丛孢菌中建立一种G418遗传转化筛选体系的方法。
背景技术
少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)是一类捕食线虫丝状真菌，属于子囊菌门，在普通环境中营腐生生活，但是当在周围环境中存在线虫时该丝状真菌通过营养菌丝体特化形成三维菌网来捕食线虫。此菌广泛存在土壤环境中，在人体健康、生物医药、农业生产及环境保护等具有独特作用。在基因工程中，丝状真菌筛选方法常用的是潮霉素B抗性基因作为筛选标记，单一的筛选标记限制了丝状真菌基因工程操作研究中多层次的应用。建立新的筛选标记的分子操作技术可满足日益发展的实验研究需求。
G418(Geneticin)是由红橙小单孢菌(Micromonospora rhodorangea)产生的一种结构与新霉素、庆大霉素和卡那霉素相似的氨基糖苷类抗生素。在分子遗传学中，G418是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。在少孢节丛孢菌遗传转化体系中，最常用的筛选标记基因是潮霉素B抗性基因，通过潮霉素B抗性标记可以筛选获得少孢节丛孢菌突变菌株，进一步进行少孢节丛孢菌基因功能的研究，更好的发挥少孢节丛孢菌在生物防治、环境修复及生态平衡中的作用。但在研究少孢节丛孢菌基因功能时，往往需要对其进行基因敲除实验，在此基础上对敲除突变株进行基因功能互补验证实验。那么，单一抗性筛选标记往往不能满足实验要求，必须要有其他新的抗性选择标记才可以进行遗传转化子的筛选。长期以来，用于少孢节丛孢菌遗传转化的选择性标记仅有潮霉素B，缺乏其他有效的抗性选择标记。因此，扩展少孢节丛孢菌显性筛选标记具有非常重要的意义。
本发明提供的少孢节丛孢菌遗传转化筛选体系在基因遗传上的应用，经文献查阅检索，未见与本发明有相同的公开报道。
发明内容
本发明旨在提供一种以G418为筛选标记的基因遗传操作方法，该应用以G418的抗性为少孢节丛孢菌抗性筛选标记，以解决少孢节丛孢菌遗传转化的选择性标记不足的问题。
本发明是通过以下技术方案实现的。
一种G418在少孢节丛孢菌中遗传转化筛选体系的建立方法，包括以下步骤：
(1)使用少孢节丛孢菌密码子偏好性对G418基因序列进行手动优化，优化后的G418基因序列为SEQ ID No.1；
(2)将上述优化后的G418基因序列5’加上Ptef启动子序列，3’加上Ttef终止子序列，获得Ptef-G418-Ttef的DNA序列；
(3)将上述Ptef-G418-Ttef的DNA序列连接至pUC57载体上，获得目标DNA序列模板；
(4)使用同源重组-原生质体转化法将目标DNA序列模板导入少孢节丛孢菌中，在含有G418抗生素的培养基上进行筛选；
(5)设计特异性引物进行转化子验证。
具体地，上述步骤(2)中，Ptef-G418-Ttef的DNA序列长度为2170bp。
具体地，上述步骤(3)中，获得的目标DNA序列模板转化保存在E.coli DH5α中。
具体地，上述步骤(4)中，使用同源重组-原生质体转化法，所用的同源臂长度为1000-2500bp。
具体地，上述步骤(4)中，G418抗生素的培养基中，G418抗生素浓度为175-250μg/mL。
具体地，上述步骤(4)中，原生质体转化法使用的是PEG/CaCl2介导。
具体地，上述步骤(5)中，特异性引物的Tm值为58-62℃。
具体地，上述步骤(5)中，转化子验证的反应体系为25μL，由5μL的5×Buffer、5μL的浓度为20mmol/L的dNTP、0.75μL的浓度为10μmol/L的上游引物、0.75μL的浓度为10μmol/L的下游引物、0.5μL的KOD FX Neo酶、以待验证菌丝为模板和13μL无菌水组成；PCR反应条件：94℃预变性2min；98℃变性10s，Tm温度退火30s，68℃延伸1kb/30s，共35个循环；72℃延伸10min。
由以上的技术方案可知，本发明的有益效果是：
本发明为少孢节丛孢菌增加了一种新的抗性选择标记，可使原来对G418敏感的少孢节丛孢菌对其产生抗性，可对少孢节丛孢菌进行遗传基因操作，为研究少孢节丛孢菌的基因功能带来了巨大方便，而且费用低廉。
附图说明
图1是本发明遗传转化用的构建质粒原理图。
图2是少孢节丛孢菌中的AOL_s00080g55敲除质粒图谱。
图3是本发明使用少孢节丛孢菌中的AOL_s00080g55基因为替换目标的转化子验证图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本发明而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本发明所要求保护的技术方案。
实施例
一种G418在少孢节丛孢菌中遗传转化筛选体系的建立方法，包括以下步骤：
(1)使用少孢节丛孢菌密码子偏好性对G418基因序列进行手动优化，优化后的G418基因序列为SEQ ID No.1；
(2)将上述优化后的G418基因序列5’加上Ptef启动子序列，3’加上Ttef终止子序列，获得Ptef-G418-Ttef的DNA序列，其中Ptef-G418-Ttef的DNA序列长度为2170bp；
(3)将上述Ptef-G418-Ttef的DNA序列连接至pUC57载体上，获得目标DNA序列模板，获得的目标DNA序列模板转化保存在E.coli DH5α中；
(4)使用同源重组-原生质体转化法将目标DNA序列模板导入少孢节丛孢菌中，在含有G418抗生素的培养基上进行筛选，其中，使用同源重组-原生质体转化法，所用的同源臂长度为1000-2500bp，G418抗生素的培养基中，G418抗生素浓度为175-250μg/mL；原生质体转化法使用的是PEG/CaCl2介导
(5)设计特异性引物进行转化子验证，特异性引物的Tm值为58-62℃，转化子验证的反应体系为25μL，由5μL的5×Buffer、5μL的浓度为20mmol/L的dNTP、0.75μL的浓度为10μmol/L的上游引物、0.75μL的浓度为10μmol/L的下游引物、0.5μL的KOD FX Neo酶、以待验证菌丝为模板和13μL无菌水组成；PCR反应条件：94℃预变性2min；98℃变性10s，Tm温度退火30s，68℃延伸1kb/30s，共35个循环；72℃延伸10min。
具体的试验方法如下：
一、以少孢节丛孢菌中的AOL_s00080g55基因为敲除目标构建敲除质粒
通过In-Fusion组装的方式将G418抗性基因与AOL_s00080g55基因上游5’UTR区和下游3’UTR区连接起来，得到转化片段。根据目的基因上下游片段，长度为2000bp、G418cassette(长度为2170bp)和在质粒pUC19上选择的双酶切位点，利用SnapGene软件设计特异性引物，并参考全式金无缝连接试剂盒提供的方法，调整引物与载体的重叠片段长度，以提升片段和线性质粒的结合效率。设计引物见下表1，均送至生物公司合成，基因敲除载体pUC19-Aog55-G418图谱见下图2。
表1三片段组装与阳性转化子验证引物
二、pUC19双酶切与三片段组装
首先为了获得线性化载体，需要对pUC19质粒进行双酶切，NdeⅠ与PciⅠ为双酶切位点，双酶切体系加样如下表2可进行等倍扩增，使用凝胶电泳进行酶切结果验证，正确后再使用胶回收试剂盒回目的条带。使用pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit进行组装，反应体系详见使用说明书，对三片段和线性化质粒进行连接，优化反应条件为50℃，连接50min。然后将连接产物迅速放入冰上十秒左右，然后使用化学热激法将连接产物转化至新制备的E.coli DH5α感受态细胞中，最后涂布在含有氨苄抗生素的LB平板上培养进行，37℃恒温过夜培养，第二天挑取单一转化子于含氨苄抗生素的LB液体培养基中，220rpm，37℃，培养大约14h以上，对出现浑浊的样品进行菌液PCR验证。三片段都验证正确的样品可以留样后提取质粒进行再次验证，验证正确的菌液样品可扩大培养后送生物公司进行测序验证。测序正确后再进行后续的实验工作。
三、少孢节丛孢菌原生质体转化
A.oligospora原生质体的制备及转化的操作步骤如下：
(1)首先，将A.oligospora在PDA平板上28℃恒温培养5d。然后在超净工作台中使用高压灭菌后的刀片将培养好且无污染的菌落进行切块，大约2cm2大小的小块，然后加入适量菌块于200mL TG液体培养基中，根据实验需求来设定接种数量，在28℃恒温培养箱静置12h后，移至恒温摇床中，28℃，160rpm培养约24h。
(2)检查上述培养的菌丝是否被污染，在确定培养基澄清的情况下，将菌丝使用垫有四层无菌擦镜纸的漏斗过滤培养液进行收集，接着使用MN buffer进行冲洗，直至菌丝发白为止。
(3)将上述收集且清洗干净的菌丝使用无菌黄色枪头挑至进行灭菌处理过的100mL锥形瓶中，然后加入适量除菌处理过的蜗牛酶溶液和纤维素酶溶液，按照体积比为2:3的比例进行添加，然后放入30℃，180rpm恒温摇床酶解4.5-5h。
(4)酶解过程中可偶尔观察是否酶解彻底，然后再使用垫有六层无菌擦镜纸的漏斗对酶解液进行过滤，保留含有原生质体的滤液，滤液进行低温离心(5500rpm 10min)后去上清。然后使用适量KTC buffer富集沉淀，即A.oligospora的原生质体，然后使用移液枪轻轻吸打混匀，再放置低温离心机中5500rpm离心10min，去上清；再加入1mL KTC buffer，轻轻吸打混匀，再次放置低温离心机中5500rpm离心10min，去上清，最后将原生质体悬浮在适量KTC buffer中，取样进行镜检，原生质体数量大约达108个/mL即可，然后将新制备的原生质体分装成100μL每管，备用。
(5)吸取50μL当天获得的PCR产物，即全长片段，与100μL原生质体悬浮液混匀后，于冰中静置40min。然后加入700μL在28℃温浴过的PTC buffer，轻轻混匀后放置28℃恒温箱静置1h。
(6)先将上述获得的原生质体转化混合液均匀涂布至不含抗生素的TB3平板上，28℃静置恒温培养16-18h后，然后再在各个平板上铺一层含175μg/mL G418的TB3培养基，最后放置28℃恒温培养箱培养至平板上出现肉眼可见的转化子。
表2双酶切体系
四、少孢节丛孢菌转化子验证
实验得到的转化子转接至含抗性的TYGA培养基上，放置恒温培养箱在28℃下继续培养3-5d。直到可以清楚的看到菌落，然后使用无菌牙签挑取适量菌丝进行菌丝PCR验证，这里使用的验证引物见表1的Dx-F/Dx-R引物对，以筛选出阳性转化子，若电泳条带单一且与预期大小一致，则使用无抗性平板传代该转化子3代，接着再次进行菌丝PCR验证，若条带单一且是想要的目的条带，再送生物公司进行测序验证。PCR体系及程序见表3和表4。
表3 PCR反应体系
表4 PCR程序
使用第一片段的正向引物，第三片段的反向引物作为引物对，以构建成功的敲除质粒pUC19-Aog55-G418为模板，进行PCR，扩增出三个片段连接成功的目的片段，通过原生质体转化方法将目的片段导入A.oligospora中，从而获得转化子，然后使用聚合酶KOD FXNeo，以各个转化子的菌丝为模板，引物为Aog55-Dx-F和Aog55-Dx-R，进行转化子PCR验证。由于AOL_s00080g55基因长度为1618bp，G418cassette序列长度为2170bp，验证引物设计的位置在基因上下游各约500bp处，因此，理论上来说敲除株条带大小是3196bp，WT条带大小是2634bp。PCR验证图片见下图3。
当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员，在本发明的实质范围内，作出的变化、改变、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 安徽大学
<120> 一种G418在少孢节丛孢菌中遗传转化筛选体系的建立方法
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
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<212> DNA
<213> 少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)
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Claims (8)
1.一种G418在少孢节丛孢菌中遗传转化筛选体系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)使用少孢节丛孢菌密码子偏好性对G418基因序列进行手动优化，优化后的G418基因序列为SEQ ID No.1；
(2)将上述优化后的G418基因序列5’加上Ptef启动子序列，3’加上Ttef终止子序列，获得Ptef-G418-Ttef的DNA序列；
(3)将上述Ptef-G418-Ttef的DNA序列连接至pUC57载体上，获得目标DNA序列模板；
(4)使用同源重组-原生质体转化法将目标DNA序列模板导入少孢节丛孢菌中，在含有G418抗生素的培养基上进行筛选；
(5)设计特异性引物进行转化子验证。
2.根据权利要求1所述的一种G418在少孢节丛孢菌中遗传转化筛选体系的建立方法，其特征在于，上述步骤(2)中，Ptef-G418-Ttef的DNA序列长度为2170bp。
3.根据权利要求1所述的一种G418在少孢节丛孢菌中遗传转化筛选体系的建立方法，其特征在于，上述步骤(3)中，获得的目标DNA序列模板转化保存在E.coli DH5α中。
4.根据权利要求1所述的一种G418在少孢节丛孢菌中遗传转化筛选体系的建立方法，其特征在于，上述步骤(4)中，使用同源重组-原生质体转化法，所用的同源臂长度为1000-2500bp。
5.根据权利要求1所述的一种G418在少孢节丛孢菌中遗传转化筛选体系的建立方法，其特征在于，上述步骤(4)中，G418抗生素的培养基中，G418抗生素浓度为175-250μg/mL。
6.根据权利要求1所述的一种G418在少孢节丛孢菌中遗传转化筛选体系的建立方法，其特征在于，上述步骤(4)中，原生质体转化法使用的是PEG/CaCl2介导。
7.根据权利要求1所述的一种G418在少孢节丛孢菌中遗传转化筛选体系的建立方法，其特征在于，上述步骤(5)中，特异性引物的Tm值为58-62℃。
8.根据权利要求1-7中任意所述的一种G418在少孢节丛孢菌中遗传转化筛选体系的建立方法，其特征在于，上述步骤(5)中，转化子验证的反应体系为25μL，由5μL的5×Buffer、5μL的浓度为20mmol/L的dNTP、0.75μL的浓度为10μmol/L的上游引物、0.75μL的浓度为10μmol/L的下游引物、0.5μL的KOD FX Neo酶、以待验证菌丝为模板和13μL无菌水组成；PCR反应条件：94℃预变性2min；98℃变性10s，Tm温度退火30s，68℃延伸1kb/30s，共35个循环；72℃延伸10min。
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2021
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