CN108676811B - 一种基因无痕编辑载体及其在生物体基因编辑中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基因无痕编辑载体及其在生物体基因编辑中的应用，所述的基因无痕编辑载体由基因组同源序列A、启动子序列、细胞壁蛋白CWP1基因序列、抗性筛选报告基因序列和基因组同源序列B组成。本发明针对酿酒酵母传统基因敲除中筛选标记残留，不便进行多基因敲除研究，以及残留外源基因的问题，提供了一种酿酒酵母高效的基因无痕编辑方法。此方法不仅可以用于酿酒酵母的基因编辑，而且可以适用此基因编辑原理的其它微生物。本发明不仅可用于研究酵母基因的功能和代谢机制，而且所获得的突变株不残留任何外源基因，可以安全的用于工业生产。
Description
技术领域
本发明涉及微生物基因工程领域，具体涉及一种基因无痕编辑的载体及其应用。
背景技术
酿酒酵母作为模式真菌，既具有原核生物生长迅速操作简单的特点，又具有与高等真核生物相似的基因表达调控机制。目前常用的筛选标记基因，如Cre/Loxp系统、5-FOA均属非自身的外源基因，其生产应用受到限制。因此，有必要开发适用于酵母基因无痕敲除技术，以保证不引入任何外源DNA，便于工程菌的实际应用。去除筛选标记的方法主要有两种：一种是利用重组酶介导的敲除系统，例如Cre/Loxp系统，通过转化筛选标记两侧带有重组酶位点的敲除元件到酵母中，经一步整合实现目的基因的敲除，然后转化另一个编码重组酶的质粒，以实现抗性标记的去除。在工业酵母的改造中，这个系统具有很高的效率，但是其仍会留下外源序列(loxp位点)，并且在进行多基因敲除时，留下的这些位点增大了发生染色体重排的可能性。另一种是在目的基因敲除后，利用敲除元件中正向重复序列之间的同源重组。通过这种方法得到的转化子，其基因组的靶位点上，会残留一个重复序列。
CWP1是酿酒酵母细胞壁蛋白1，通过磷酸二酯键与β-1,3-和β-1,6-葡聚糖杂聚物连接到定位于子细胞出生伤痕的细胞壁甘露糖蛋白。CWP1p翻译后经O-糖基化修饰，随后GPI锚定蛋白附着于内质网中的cwp1蛋白上并将其靶向细胞表面，葡糖胺-肌醇磷脂部分被切除，且GPI修饰的甘露糖蛋白通过其无脂GPI聚糖残基共价连接到外部细胞壁层的β-1,6-葡聚糖上。CWP1通过MPK1响应细胞壁摄动的细胞完整性信号传导而受到正向调节，诱导依赖于转录因子RLM1，在厌氧生长过程中下调，由低pH值上调。当Gal启动子高表达CWP1时，细胞形态异常，芽细胞增殖不受细胞调控，致使细胞凋亡。可用此方法筛选出分子内同源重组使Gal-CWP1片段丢失而达到基因无痕编辑的效果。
目前，缺乏一种高效的无痕基因敲除方法。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种基因无痕编辑载体在生物体基因编辑中的应用及其在废水处理领域中的应用。
为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本发明的一种基因无痕编辑载体，其特征在于：所述的基因无痕编辑载体由基因组同源序列A、启动子序列、细胞壁蛋白CWP1基因序列、抗性筛选报告基因序列和基因组同源序列B组成；
所述的基因组同源序列A具有SEQ ID No.1的核苷酸序列；
所述的细胞壁蛋白CWP1基因序列具有SEQ ID No.2的核苷酸序列；
所述的基因组同源序列B具有SEQ ID No.3的核苷酸序列。
进一步地，所述的细胞壁蛋白CWP1基因由CWP1基因或其同源基因构成。
进一步地，所述的基因组同源序列A由目的基因上游序列Ⅰ和目的基因下游序列Ⅲ组成，所述序列Ⅰ和序列Ⅲ长度为10-100bp；
所述的目的基因上游序列Ⅰ具有SEQ ID No.4的核苷酸序列；所述的目的基因下游序列Ⅲ具有SEQ ID No.5的核苷酸序列。
更进一步地，所述的基因组同源序列B由目的基因下游序列两段连续序列Ⅱ和Ⅲ组成，所述的序列Ⅱ和序列Ⅲ长度为10-100bp；
所述的目的基因下游序列Ⅱ具有SEQ ID No.6核苷酸序列。
进一步地，所述载体筛选标记基因为URA营养筛选标记基因、ADE营养筛选标记基因、HIS营养筛选标记基因、TRP营养筛选标记基因、LEU营养筛选标记基因、G418抗性筛选标记基因、KanMX抗性筛选标记基因、Amp抗性筛选标记基因、潮霉素抗性筛选标记基因Hygr、草甘膦抗性筛选标记基因Bar、natMX抗性筛选标记基因、博来霉素抗性筛选标记基因Bleomcin。
本发明所述的基因无痕编辑载体在生物体基因编辑中的应用。
进一步地，所述的生物体包括原核细胞和真核细胞。
本发明的一种酿酒酵母基因编辑的载体及基因无痕敲除的方法，包括如下步骤：
(1)构建带有Gal-CWP1序列的筛选模板质粒；
(2)设计带有目的基因上游同源臂序列Ⅰ、Ⅲ为引物F，目的基因下游同源臂序列Ⅲ为引物R；
(3)在模板质粒基础上扩增带有两端同源臂的Gal-CWP1片段，将其通过醋酸锂化学转化法导入到酿酒酵母出发菌株，通过同源重组以实现出发菌株的目的基因突变；
(4)将经过鉴定的发生第一步同源重组的酵母突变株，经含半乳糖的丰富合成培养基平板进行筛选，通过分子内同源重组消除Gal-CWP1片段，最终获得目的基因无痕敲除的酵母突变株。
进一步地，在步骤(4)中，将经过鉴定的发生第一步同源重组的酵母突变株，经YPG合成培养基平板反向筛选，使含有同源臂片段的Gal-CWP1基因序列再次发生同源重组，丢失Gal-CWP1片段，最终获得目的基因无痕敲除的酵母突变株。
进一步地，在步骤(4)中，所述的筛选培养基为培养酵母菌的YPG培养基。
有益效果：本发明针对酿酒酵母传统基因敲除中筛选标记残留，不便进行多基因敲除研究，以及残留外源基因的问题，提供了一种酿酒酵母高效的基因无痕编辑方法。此方法不仅可以用于酿酒酵母的基因编辑，而且可以适用此基因编辑原理的其它微生物。本发明不仅可用于研究酵母基因的功能和代谢机制，而且所获得的突变株不残留任何外源基因，可以安全的用于工业生产。
附图说明
图1为本发明pRS306-Gal-CWP1-13myc载体质粒图谱；
图2为本发明pFA6A-Gal-CWP1-KanMX-3HA载体质粒图谱；
图3为本发明基因无痕编辑载体的应用的图谱；
图4a为本发明A.pRS306-Gal-CWP1-13myc载体无痕敲除ADE8基因的结果；ade8Δ::Gal-CWP1:URA3表示整合删除盒和ade8Δ表示删除ADE8基因后的PCR电泳图谱；B.PCR示意图；
图4b为本发明A.pFA6a-Gal-CWP1-KanMX-3HA载体无痕敲除ADE8基因的结果；ade8Δ::Gal-CWP1:KanMX表示整合删除盒和ade8Δ表示删除ADE8基因后的PCR电泳图谱。B.PCR示意图；
图5a为本发明菌株ade8Δ::Gal-CWP1:URA3、ade8Δ分别在YPD和SD-Uraˉ固体培养基的生长情况；
图5b为本发明菌株ade8Δ::Gal-CWP1:KanMX、ade8Δ分别在YPD和YPD+G418(600μg/mL)固体培养基的生长情况。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
实施例1
本发明的一种基因无痕编辑载体，其特征在于：所述的基因无痕编辑载体由基因组同源序列A、启动子序列、细胞壁蛋白CWP1基因序列、抗性筛选报告基因序列和基因组同源序列B组成；
所述的基因组同源序列A具有SEQ ID No.1的核苷酸序列；
所述的细胞壁蛋白CWP1基因序列具有SEQ ID No.2的核苷酸序列；
所述的基因组同源序列B具有SEQ ID No.3的核苷酸序列。
所述的细胞壁蛋白CWP1基因由CWP1基因或其同源基因构成。
所述的基因组同源序列A由目的基因上游序列Ⅰ和目的基因下游序列Ⅲ组成，所述序列Ⅰ和序列Ⅲ长度为10-100bp；
所述的目的基因上游序列Ⅰ具有SEQ ID No.4的核苷酸序列；所述的目的基因下游序列Ⅲ具有SEQ ID No.5的核苷酸序列。
所述的基因组同源序列B由目的基因下游序列两段连续序列Ⅱ和Ⅲ组成，所述的序列Ⅱ和序列Ⅲ长度为10-100bp；
所述的目的基因下游序列Ⅱ具有SEQ ID No.6核苷酸序列。
所述载体筛选标记基因为URA营养筛选标记基因、ADE营养筛选标记基因、HIS营养筛选标记基因、TRP营养筛选标记基因、LEU营养筛选标记基因、G418抗性筛选标记基因、KanMX抗性筛选标记基因、Amp抗性筛选标记基因、潮霉素抗性筛选标记基因Hygr、草甘膦抗性筛选标记基因Bar、natMX抗性筛选标记基因、博来霉素抗性筛选标记基因Bleomcin。
本发明所述的基因无痕编辑载体在生物体基因编辑中的应用。
所述的生物体包括原核细胞和真核细胞。
本发明的一种酿酒酵母基因编辑的载体及基因无痕敲除的方法，包括如下步骤：
(1)构建带有Gal-CWP1序列的筛选模板质粒；
(2)设计带有目的基因上游同源臂序列Ⅰ、Ⅲ为引物F，目的基因下游同源臂序列Ⅲ为引物R；
(3)在模板质粒基础上扩增带有两端同源臂的Gal-CWP1片段，将其通过醋酸锂化学转化法导入到酿酒酵母出发菌株，通过同源重组以实现出发菌株的目的基因突变；
(4)将经过鉴定的发生第一步同源重组的酵母突变株，经含半乳糖的丰富合成培养基平板进行筛选，通过分子内同源重组消除Gal-CWP1片段，最终获得目的基因无痕敲除的酵母突变株。
在步骤(4)中，将经过鉴定的发生第一步同源重组的酵母突变株，经YPG合成培养基平板反向筛选，使含有同源臂片段的Gal-CWP1基因序列再次发生同源重组，丢失Gal-CWP1片段，最终获得目的基因无痕敲除的酵母突变株。所述的筛选培养基为培养酵母菌的YPG培养基。
实施例2
1.其中的大肠杆菌感受态细胞的制备与转化、质粒的提取以及限制性内切酶消化、DNA片段回收、DNA片段连接、重组质粒的筛选与鉴定等都参照《分子克隆实验指南》相关章节进行。
2.限制性内切酶、试剂盒试剂等相关材料均为市售商品。
如图1所示，该载体以pRS306-Gal-CWP1-13myc质粒为出发质粒，以酿酒酵母ADE8基因为敲除基因。
1)设计扩增带有同源臂序列的Gal-CWP1片段的引物并扩增
F：ACTTGCAGCAAGCGCAGGTGAGAGCCAACACACATCAATAATCTTTCCAAAAGCTCTCGCGTCGTAAATCATGATCATGGATTGTGACAAAACGATCTTAAAGGTTTCGAACCTTCTCTTTGGAACTTTC
R：ATGTTTCGCGCCTCACTTTGAAGAATGCCAAATATAAAAGTATAAATATGGGAACTATTCAGATTGTACTGAGAGTGCAC
(1)将样品在板内混合均匀，进行扩增反应。PCR扩增程序：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃4min，35个循环；72℃5min，12℃∞。
醋酸锂化学转化法导入到酿酒酵母出发菌株
(2)将酵母出发菌株在YPD固体培养基上培养，挑取单克隆接种到5mLYPD液体培养基中，220rpm、30℃培养过夜。第二天将培养好的菌体取出少许镜检观察是否污染，未污染的情况下，再取少许菌体，稀释10倍，测OD值，当OD＝0.2～0.3时，再摇3h即可。将培养好的菌体倒入离心管中800g离心2min，去上清加入转化体系。转化体系为：
充分混匀，30℃室温孵育，时间为30min，结束后，42℃热击15min。孵育结束后，离心，转速为800g/min，2min，去上清，最后用适量的无菌水重悬酵母沉淀，将重悬液涂布到SD-Ura-固体培养基上，在30℃条件下培养2～3d。当长出单克隆时，二次筛选挑取单克隆并用划线法再次接种于SD-Ura-固体培养基上在30℃条件下培养1d。
3)设计检测引物并PCR鉴定的发生同源重组的酵母突变株
check-F：TCCAGCAAGAGGAAAGTTAT
check-R：AGCGTTTACACATGCACATT
①取O/N的菌液10000g离心2min.去上清，加1mL ddH2O转移至1.5mL离心管中，800g 2min.
②弃净上清，加400uLLysis buffer，悬起沉淀，再加200uL玻璃珠.
③漩涡振荡90s.
④加400uLPCI，漩涡振荡90s.
⑤最大转速离心5min.
⑥取上清至一新的1.5mL离心管,加400uLPCI，颠倒混匀.
⑦将上清转移至新的离心管中，加等体积异丙醇混匀，冰浴放置15min.
⑧最大转速离心5min，将上清弃去.加1mL 70％酒精，轻轻混匀.最大转速离心5min.
⑨弃净上清，室温下吹干酒精.
⑩加20uL新制TE溶解。
将样品在板内混合均匀，进行扩增反应。PCR扩增程序：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃5min，35个循环；72℃5min，12℃∞。
(4)将经过鉴定的发生第一步同源重组的酵母突变株，划线到YPG合成培养基平板进行反向筛选，待培养基长出单菌落测以check-F、check-R为引物，测序验证获得基因无痕敲除菌株，如图5.a。
将样品在板内混合均匀，进行扩增反应。PCR扩增程序：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃15s，35个循环；72℃5min，12℃∞。
实施例3
如图2所示，该载体以pFA6A-Gal-CWP1-KanMX-3HA质粒为出发质粒，以酿酒酵母ADE8基因为敲除基因。
1)设计扩增带有同源臂序列的Gal-CWP1片段的引物并扩增
F’：
ACTTGCAGCAAGCGCAGGTGAGAGCCAACACACATCAATAATCTTTCCAAAAGCTGAATAGTTCCCATATTTATACTTTTATATTTGGCATTCTTCAAAGTGAGGCGCGAgacatggaggcccagaatac
R’：
TTATTTGTGAAGCTGCTGTAAAACCTTATATGTAGCTTCTACAATCGCGATGTGCTCAGCagatCCGCGGTTAACAACAA
质粒
将样品在板内混合均匀，进行扩增反应。PCR扩增程序：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃3min，35个循环；72℃5min，12℃∞。
2)醋酸锂化学转化法导入到酿酒酵母出发菌株
将酵母出发菌株在YPD固体培养基上培养，挑取单克隆接种到5mLYPD液体培养基中，220rpm、30℃培养过夜。第二天将培养好的菌体取出少许镜检观察是否污染，未污染的情况下，再取少许菌体，稀释10倍，测OD值，当OD＝0.2～0.3时，再摇3h即可。将培养好的菌体倒入离心管中800g离心2min，去上清加入转化体系。转化体系为：
充分混匀，30℃室温孵育，时间为30min，结束后，42℃热击15min。孵育结束后，离心，转速为800g/min，2min，去上清，最后用适量的无菌水重悬酵母沉淀，将重悬液涂布到固体(YPD+G418)培养基上，在30℃条件下培养2～3d。当长出单克隆时，二次筛选挑取单克隆并用划线法再次接种于固体培养基(YPD+G418)上在30℃条件下培养1d。
3)设计检测引物并PCR鉴定的发生同源重组的酵母突变株
check-F：TCCAGCAAGAGGAAAGTTAT
check-R：AGCGTTTACACATGCACATT
①取O/N的菌液10000g离心2min.去上清(菌体量为左右为好)，加1mL ddH2O转移至1.5mL离心管中，800g 2min。
②弃净上清，加400uLLysis buffer，悬起沉淀，再加200uL玻璃珠。
③漩涡振荡90s。
④加400uLPCI，漩涡振荡90s。
⑤最大转速离心5min。
⑥取上清至一新的1.5mL离心管(一定不能吸到下层沉淀！宁弃一部分上清.)加400uLPCI，颠倒混匀.(不要太剧烈，上下颠倒混匀)
⑦将上清转移至新的离心管中，加等体积异丙醇混匀，冰浴放置15min.
⑧最大转速离心5min，将上清弃去.(可不去净.)加1mL 70％酒精，轻轻混匀，最大转速离心5min.
⑨弃净上清，室温下吹干酒精.(10min左右)
注：当提取的gDNA的模板要求较高时，建议向TE中加入1ul RNaseA消化37℃3h。
⑩加20uL新制TE溶解。
将样品在板内混合均匀，进行扩增反应。PCR扩增程序：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃5min，35个循环；72℃5min，12℃∞。
(4)将经过鉴定的发生第一步同源重组的酵母突变株，划线到YPG合成培养基平板进行反向筛选，待培养基长出单菌落测以check-F、check-R为引物，测序验证获得基因无痕敲除菌株,如图5.b。
将样品在板内混合均匀，进行扩增反应。PCR扩增程序：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃15s，35个循环；72℃5min，12℃∞。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
序列表
<110> 河北农业大学
<120> 一种基因无痕编辑载体及其在生物体基因编辑中的应用
<130> 2018
<141> 2018-05-28
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 110
<212> DNA
<213> 人工序列(A序列)
<400> 1
acttgcagca agcgcaggtg agagccaaca cacatcaata atctttccaa aagctctcgc 60
gtcgtaaatc atgatcatgg attgtgacaa aacgatctta aaggtttcga 110
<210> 2
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工序列(细胞壁蛋白CWP1基因序列)
<400> 2
atgaaattct ccactgcttt gtctgtcgct ttattcgcct tggctaagat ggtcattgcc 60
gattccgaag aattcggcct ggtgagtatc cgttccggct cggatttaca atacttgagt 120
gtttacagtg ataacggcac tttgaaactt ggcagcggta gtggctcatt tgaggcaact 180
attaccgatg acggtaaact gaaatttgac gacgataagt atgctgttgt caatgaggat 240
ggctcattca aagaaggttc tgagagcgat gctgccactg gtttttctat taaagatggc 300
catctaaact acaagagctc ttctggtttc tacgctatca aggacgggtc gtcttacatt 360
ttctcttcta agcaatccga cgacgctacc ggtgttgcga ttagaccaac tagtaagagc 420
ggatctgttg cagcagattt ttctccaagc gactctagtt cctcttcatc tgcttctgct 480
tcgtctgctt ccgcatcatc ttctacaaag catagttcga gtatagaatc tgtcgagacc 540
tctactactg tggaaacttc ctctgctagc tccccaactg cttcagttat ctctcaaatt 600
actgatggac aaatccaagc tccaaacaca gtttacgaac aaacagaaaa tgcaggtgcc 660
aaggctgccg tcggcatggg tgctggtgct ctagcggtcg cagctgctta cttgttgtaa 720
<210> 3
<211> 115
<212> DNA
<213> 人工序列(B序列)
<400> 3
gaatagttcc catatttata cttttatatt tggcattctt caaagtgagg cgcgaaacat 60
ctcgcgtcgt aaatcatgat catggattgt gacaaaacga tcttaaaggt ttcga 115
<210> 4
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(目的基因上游序列Ⅰ)
<400> 4
acttgcagca agcgcaggtg agagccaaca cacatcaata atctttccaa aagct 55
<210> 5
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列(目的基因下游序列Ⅱ)
<400> 5
ctcgcgtcgt aaatcatgat catggattgt gacaaaacga tcttaaaggt ttcga 55
<210> 6
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(目的基因下游序列Ⅲ)
<400> 6
gaatagttcc catatttata cttttatatt tggcattctt caaagtgagg cgcgaaacat 60
Claims (7)
1.一种基因无痕编辑载体，其特征在于：所述的基因无痕编辑载体由基因组同源序列A、启动子序列、细胞壁蛋白CWP1基因序列、抗性筛选报告基因序列和基因组同源序列B组成；
所述的基因组同源序列A的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；
所述的细胞壁蛋白CWP1基因序列的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；
所述的基因组同源序列B的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.根据权利要求1所述的基因无痕编辑载体，其特征在于：所述抗性筛选报告基因为URA营养筛选标记基因、ADE营养筛选标记基因、HIS营养筛选标记基因、TRP营养筛选标记基因、LEU营养筛选标记基因、G418抗性筛选标记基因、KanMX抗性筛选标记基因、Amp抗性筛选标记基因、潮霉素抗性筛选标记基因Hygr、草甘膦抗性筛选标记基因Bar、natMX抗性筛选标记基因或博来霉素抗性筛选标记基因Bleomcin中的任意一种。
3.一种权利要求1所述的基因无痕编辑载体在细胞基因编辑中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的细胞包括原核细胞和真核细胞。
5.一种基因无痕敲除的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)构建带有Gal-CWP1序列的筛选模板质粒；所述的CWP1序列的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示；
(2)设计带有目的基因上游同源臂序列Ⅰ和下游同源臂序列Ⅲ的引物F，带有目的基因下游同源臂序列Ⅱ的引物R；所述的目的基因上游序列Ⅰ的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述的目的基因下游序列Ⅲ的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；所述的目的基因下游序列Ⅱ的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；
(3)在模板质粒基础上扩增带有两端同源臂的Gal-CWP1片段，将其通过醋酸锂化学转化法导入到酿酒酵母出发菌株，通过同源重组以实现出发菌株的目的基因突变；
(4)将经过鉴定的发生第一步同源重组的酵母突变株，经含半乳糖的合成培养基平板进行筛选，通过分子内同源重组消除Gal-CWP1片段，最终获得目的基因无痕敲除的酵母突变株。
6.根据权利要求5所述的基因无痕敲除的方法，其特征在于：在步骤(4)中，将经过鉴定的发生第一步同源重组的酵母突变株，经YPG合成培养基平板反向筛选，使含有同源臂片段的Gal-CWP1基因序列再次发生同源重组，丢失Gal-CWP1片段，最终获得目的基因无痕敲除的酵母突变株。
7.根据权利要求5所述的基因无痕敲除的方法，其特征在于：在步骤(4)中，所述的合成培养基为培养酵母菌的YPG培养基。
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