CN107119067B - 谷氨酸棒杆菌中一种基因连续无痕敲除的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开谷氨酸棒杆菌中一种基因连续无痕敲除的方法，属于基因工程技术领域。本发明在谷氨酸棒杆菌中构建了核酸外切酶‑重组酶‑Cre/loxP连续无痕敲除系统，以RecET‑Cre/loxP连续无痕敲除系统最佳。本方法在谷氨酸棒杆菌中的同源重组不需要质粒的介导，在RecET的协助下仅需转化入线性双链DNA即可完成同源重组；仅需要一轮转化，即可完成靶标基因的无痕敲除，整个无痕敲除过程仅需4～6天，同时能够完成基因的连续无痕敲除；利用抗性基因作为筛选标记筛选过程简单有效，相对于谷氨酸棒杆菌中的其他无痕敲除的方法更加简单，有效且节省时间。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，特别涉及谷氨酸棒杆菌中一种基因连续无痕敲除的方法。
背景技术
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)被广泛应用于生产L-氨基酸，维他命，燃料乙醇以及其他的有机酸等产品中，目前主要通过代谢工程及合成生物学的方法在谷氨酸棒杆菌中完成相应代谢产物的积累，因此连续无痕敲除的方法显得尤为重要。在谷氨酸棒杆菌的模式菌株ATCC13032中，反向筛选标记系统，Cre-loxP重组系统，RecT介导的单链DNA重组系统以及CRISPRi干扰系统等方法已经成功的运用于靶标基因的无痕敲除，点突变及抑制靶标基因表达中，为相关生产菌株的构建奠定了坚实的基础。
然而，在谷氨酸棒杆菌的模式菌株ATCC13032中，广泛应用的sacB反向筛选技术，需要在整合型质粒的帮助下通过两轮的交换才能完成靶标基因的同源重组；该方法双交换的概率低，耗时久，完成一个基因的敲除需要10～13天。RecT介导的单链DNA重组系统为基因组中的点突变提供一种非常有效的方法，但是当前能有效的筛选正确重组子的方法非常有限。CRISPRi干扰系统为有效干扰靶标基因的表达提供一种非常有效的方法，但是该方法目前仅限于抑制靶标基因的表达；利用Cre-loxP重组系统，在谷氨酸棒杆菌中的靶标基因的同源重组需要设计两个质粒以及两轮的转化，过程繁琐。这使快速高效地构建谷氨酸棒杆菌相关生产菌株进入瓶颈，而迫切需要在谷氨酸棒杆菌中建立一种有效快速的基因连续无痕敲除的方法。
在一些能够通过自身的重组系统完成外源线性双链DNA的同源重组的菌株中，通过构建外源线性双链DNA完成靶标基因的敲除的方法，过程简单，省时。但是谷氨酸棒杆菌自身重组系统的限制，在没有整合型质粒协助的情况下，发生同源重组的概率很低。这使在谷氨酸棒杆菌中的同源重组需要通过整合型质粒介导来完成，而使整个敲除过程繁琐冗长。针对这个问题，利用核酸外切酶-重组酶协助外源线性双链DNA重组的系统，给简化谷氨酸棒杆菌的同源重组提供有效方法。
基于大肠杆菌Rec噬菌体的RecET系统(RecE Protein ID：NP_415866.1；RecTProtein ID：NP_415865.1)是协助完成外源线性双链DNA同源重组的核酸外切酶-重组酶系统中的典型。该系统由两种蛋白组成，RecE和RecT组成：RecE是一种双链DNA依赖的核酸外切酶，结合在5′-3′线性双链DNA的末端，从5′端向3′端降解DNA，产生3′端突出端；RecT是单链退火蛋白，结合在单链DNA上，介导互补单链DNA退火，能够有效的实现单链DNA的重组。此外RecET功能相似的核酸外切酶-重组酶也具有类似的功能，例如Orf47+Orf48(Orf47Protein ID：CAB53837.1；Orf48 Protein ID：CAB53838.1)、OrfB+OrfC(OrfB Protein ID：CAC33455.1；OrfC Protein ID：CAC33454.1)及Orf60+Orf61(Orf60 Protein ID：AAN12619.1；Orf61 Protein ID：AAN12618.1)。
Cre/mutant lox特异位点重组系统在连续无痕敲除的方法中广泛应用。Cre/mutant lox特异位点重组系统由Cre重组酶(GenBank accession ALD15663.1)和突变的loxP序列(loxp71：5′-TACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTT AT-3′和loxp66：5′-ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAACGGTA-3′)两部分组成。Cre重组酶能够特异性地识别loxP序列，当两个loxP位点位于一条D NA链上且方向相同时，Cre重组酶催化loxp71和loxp66位点间的DNA进行精确的位点特异性重组，完成loxP位点间序列的剪切，留下不被Cre重组酶识别的loxp72(序列：5′-TACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAACGGTA-3′)。这对简化谷氨酸棒杆菌基因无痕敲除的过程具有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供谷氨酸棒杆菌中一种基因连续无痕敲除的方法。该方法简单有效，简化了谷氨酸棒杆菌基因无痕敲除的过程。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
谷氨酸棒杆菌中一种基因连续无痕敲除的方法，包括以下步骤：
(1)构建核酸外切酶-重组酶表达的质粒，转化入谷氨酸棒杆菌的感受态细胞中；
(2)制备同时含有靶标基因1的左同源臂及loxp71序列，Cre酶表达盒及谷氨酸棒杆菌中有效的抗性筛选标记表达盒，loxp66序列及靶标基因1的右同源臂的自我切割线性敲除表达盒；
(3)制备核酸外切酶-重组酶表达的的谷氨酸棒杆菌感受态细胞；
(4)将步骤(2)中的自我切割线性敲除表达盒转化入步骤(3)中制备的感受态细胞中，涂布于相应的抗性筛选平板；
(5)将鉴定成功的阳性转化子接种于诱导Cre酶表达的液体培养基，诱导Cre酶表达，执行loxp71和loxp66序列间的DNA的剪切，剔除Cre酶表达盒及Kan抗性表达盒；
(6)将诱导培养后的菌液划线分离单菌落；单菌落点板于含以及不含自我切割线性敲除表达盒中相应抗性的平板进行筛选；
(7)将步骤(6)中鉴定正确的菌株进行PCR及测序验证，成功获取靶标基因1无痕敲除的菌株，即含有核酸外切酶-重组酶表达质粒的靶标基因1无痕敲除菌株。
为了更好的实现本发明，还包括：
(8)制备同时含有靶标基因2的左同源臂及loxp71序列，Cre酶表达盒及谷氨酸棒杆菌中有效的抗性筛选标记表达盒，loxp66序列及靶标基因2的右同源臂的自我切割线性敲除表达盒；
(9)制备核酸外切酶-重组酶表达的靶标基因1无痕敲除菌株的谷氨酸棒杆菌感受态细胞，并按照上述步骤(4)～(7)完成靶标基因2的连续无痕敲除；依次类推，完成多个靶标基因的连续无痕敲除。
所述的核酸外切酶-重组酶，除了RecET，还可以是在谷氨酸棒杆菌中功能类似的核酸外切酶-重组酶，例如：Orf47+Orf48或OrfB+OrfC或gp60+gp61。
所述的自我剪切敲除表达盒，在相同质量的线性双链DNA的条件下左右同源臂长度最佳长度为500～1000bp。
具体的，
谷氨酸棒杆菌中一种基因连续无痕敲除的方法，具体包括以下步骤(图1)：
(1)构建异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)可诱导的核酸外切酶-重组酶RecET表达的质粒pEC-XC99E-RecET(氯霉素抗性)，转化入谷氨酸棒杆菌的感受态细胞中；
(2)通过重叠延伸PCR的方法制备同时含有长度在500～1000bp的靶标基因1的左同源臂及loxp71序列(片段1)，茶碱可诱导的Cre酶表达盒及Kan抗性筛选标记表达盒(片段2)，loxp66序列及长度在500～1000bp的靶标基因1的右同源臂(片段3)的自我切割线性敲除表达盒；
(3)制备已诱导pEC-XC99E-RecET表达的的谷氨酸棒杆菌感受态细胞；
(4)将步骤(2)中的自我切割线性敲除表达盒转化入步骤(3)中制备的感受态细胞中，涂布于含有卡那霉素25μg/mL和氯霉素7.5μg/mL的LBH固体平板(LBH+Kan25+Chl7.5)；
(5)将鉴定成功的阳性转化子接种于含1mM茶碱及氯霉素7.5μg/mL的BHI液体培养基，诱导Cre酶表达，执行loxp71和loxp66序列间的DNA的剪切，剔除Cre酶表达盒及Kan抗性表达盒；
(6)将诱导培养后的菌液划线于含1mM茶碱及氯霉素7.5μg/mL的BHI平板(BHI+Chl7.5+1mM茶碱)，分离单菌落；单菌落分别点板于同时含卡那霉素25μg/mL和氯霉素7.5μg/mL的含BHI平板(BHI+Kan25+Chl7.5)及仅含氯霉素7.5μg/mL的BHI平板(BHI+Chl7.5)进行筛选；在BHI+Kan25+Chl7.5平板上不生长，BHI+Chl7.5平板上生长的菌落为初步鉴定为成功剔除Cre酶表达盒及Kan抗性表达盒的无痕敲除菌株；
(7)将步骤(6)中鉴定正确的菌株进行PCR及测序验证，成功获取靶标基因1无痕敲除的菌株，即：含有核酸外切酶-重组酶RecET表达质粒的靶标基因1无痕敲除菌株。
为了更好的实现本发明，还包括：
(8)通过重叠延伸PCR的方法制备同时含有长度在500～1000bp的靶标基因2的左同源臂及loxp71序列(片段1)，茶碱可诱导的Cre酶表达盒及Kan抗性筛选标记表达盒(片段2)，loxp66序列及长度在500～1000bp的靶标基因2的右同源臂(片段3)的自我切割线性敲除表达盒；
(9)制备核酸外切酶-重组酶RecET表达的靶标基因1无痕敲除菌株的感受态细胞，并按照上述步骤(4)～(7)完成靶标基因2的连续无痕敲除；依次类推，完成多个靶标基因的连续无痕敲除。
本发明的具体实施方案中，首先确定核酸外切酶-重组酶RecET、Orf47+Orf48、OrfB+OrfC及Orf60+Orf61分别在谷氨酸棒杆菌中对线性双链DNA表达盒的重组效率及RecET对线性双链DNA重组的最佳同源臂长度。
在本发明中的具体实施方案中，将构建的ΔArgR自我切割线性敲除表达盒，转化入14067-RecET的感受态细胞中，完成基因argR(GenBank number 354510801)的无痕敲除。
在本发明中的具体实施方案中，将构建的ΔCrtB自我切割线性敲除表达盒转化入argR无痕敲除菌株的感受态细胞中，完成在基因argR的无痕敲除的基础上crtB基因(GenBank number：658107612)的连续无痕敲除。
在本发明中的具体实施方案中，另外分别构建基因Ncgl1221(Genbank number：658108254)，proB(Genbank number：658109122)的自我切割线性敲除表达盒，转化入RecET表达的感受态细胞中，分析RecET对线性自我切割敲除表达盒的重组效率；通过茶碱诱导Cre切除筛选标记，测定无痕剪切的效率。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
本发明在谷氨酸棒杆菌中构建了核酸外切酶-重组酶-Cre/loxP连续无痕敲除系统，以RecET-Cre/loxP连续无痕敲除系统最佳。本方法在谷氨酸棒杆菌中的同源重组不需要质粒的介导，在RecET的协助下仅需转化入线性双链DNA即可完成同源重组；仅需要一轮转化，即可完成靶标基因的无痕敲除，整个无痕敲除过程仅需4～6天，同时能够完成基因的连续无痕敲除；利用抗性基因作为筛选标记筛选过程简单有效，相对于谷氨酸棒杆菌中的其他无痕敲除的方法更加简单，有效且节省时间。
附图说明
图1是利用RecET-Cre/loxP系统完成谷氨酸棒杆菌基因连续无痕敲除的方法示意图；其中，LBH+Chl7.5+Kan2.5表示含有氯霉素的浓度为7.5μg/mL和卡那霉素浓度为25μg/mL的LBH培养基；BHI+Chl7.5+1mM茶碱表示含有氯霉素的浓度为7.5μg/mL和茶碱浓度为1mM的BHI培养基。
图2是在谷氨酸棒杆菌中不同核酸外切酶-重组酶对线性双链DNA的重组效率；其中，同源臂长度为400bp的crtB基因的左右同源臂和抗性筛选标记Kan表达盒融合的线性双链DNA表达盒被用来测试不同核酸外切酶-重组酶对线性双链DNA同源重组的效率；每组实验至少做三组平行。
图3是不同同源臂长度对RecET同源重组效率的影响；其中，长度为100，200，300，400，500，800，1000，1200，1500，2000bp的crtB基因的左右同源臂和抗性筛选标记Kan表达盒融合的线性双链DNA表达盒被用来测试不同同源臂长度对RecET同源重组效率的影响；每组实验至少做三组平行。
图4是谷氨酸棒杆菌ATCC14067-XC99E-RecET中基因argR的无痕敲除；其中，图a，ΔArgR自我切割线性表达盒在ATCC14067-XC99E-RecET中的同源重组；MCargR：基因argR被4335bp的ΔArgR自我切割线性表达盒替换；图b，基因argR无痕敲除菌株的鉴定；MargR：基因argR被34bp的loxp72序列替换。
图5是谷氨酸棒杆菌ATCC14067-RecET-MargR中基因crtB的无痕敲除；其中，MargR-crtB：基因argR和crtB被34bp的loxp72序列替换；PR：引物ΔargR-JD-S，ΔargR-JD-A；PC：引物ΔcrtB-JD-S，ΔcrtB-JD-A。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明所使用的实验材料若无特别说明均为市售购买产品。
实施例1核酸外切酶-重组酶在谷氨酸棒杆菌中对线性双链DNA的重组
一、核酸外切酶-重组酶表达的谷氨酸棒杆菌感受态细胞的制备
设计引物recT/recE-S：5′-CAAAAAGGAGGCCCTTCAGATGAGCACAAAACCACTCTTC-3′及recT/recE-A：5′-GGCACCAATAACTGCCTTAATTATTCCTCTGAATTATCGA-3′，扩增基因recT+recE；
设计引物orfC/orfB-S：5′-CAAAAAGGAGGCCCTTCAGATGACAAAATTATGTTTTAGTG-3′，orfC/orfB-A：5′-GGCACCAATAACTGCCTTAATTAAGCCTTATCCTGATTAGT-3′，扩增基因orfC+orfB；
设计引物orf48/orf47-S：5′-CAAAAAGGAGGCCCTTCAGATGGCTATTGCAAAAGAAAAGAC-3′，orf48/orf47-A：5′-GGCACCAATAACTGCCTTAATTAGATCATTGACCCTTGAACC-3′，扩增orf48+orf47基因；
设计引物gp60/61-S：5′-ACAAAAAGGAGGCCCTTCAGATGAGTGTGCCCACACAGGACGGA-3′，gp60/61-A：5′-GGCACCAATAACTGCCTTAATCATGCGTTGGGCCCGTCGAACAT-3′，扩增gp60+gp61基因；
设计引物PEC-A：5′-CTGAAGGGCCTCCTTTTTGTTATCCG-3′及PEC-S：5′-TTAAGGCAGTTATTGGTGCCCATGCG-3′，扩增pEC-XC99E(GenBank nu mber：AY219682)的骨架序列；
将上述基因片段recT+recE、orfC+orfB、orf48+orf47及gp60+gp61分别和p EC-XC99E的骨架序列用NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(购自Ne w EnglandBioLabs)试剂盒进行组装，构建核酸外切酶-重组酶诱导表达质粒p EC-XC99E-RecET、pEC-XC99E-Orf47/Orf48、pEC-XC99E-OrfB/OrfC和pEC-X C99E-gp60/61。将成功构建的pEC-XC99E-RecET、pEC-XC99E-Orf47/Orf48、p EC-XC99E-OrfB/OrfC和pEC-XC99E-gp60/61质粒分别转化入谷氨酸棒杆菌AT CC14067感受态细胞中，并分别制备核酸外切酶-重组酶表达的感受态细胞ATC C14067-XC99E-RecET、ATCC14067-XC99E-Orf47/Orf48、ATCC14067-XC99E-OrfB/OrfC和ATCC14067-XC99E-gp60/61。
以菌株ATCC14067-XC99E-RecET为例，描述制备核酸外切酶-重组酶表达的ATCC14067感受态细胞的方法。首先，接种ATCC14067-XC99E-RecET的单菌落于含7.5μg/mL氯霉素的BHI液体培养基，过夜摇菌；将上述的菌体转接入30mL EPO培养基(含7.5μg/mL氯霉素和1mM IPTG)，控制起始OD≈0.3，30℃，250rpm培养3～4h后，使OD在0.9左右；将菌液转移至灭菌的50mL离心管中，冰上放置20min；4℃、4000rpm离心10min，去上清，收集菌体；用预冷的10％甘油30mL重悬菌体，重复本步骤2次；用400μL预冷的10％甘油重悬细胞，分装于预冷的EP管中，每管分装80μL。
二、含同源臂及筛选标记的线性双链DNA的制备
设计引物crtB-L-S：5′-TAATAGGTACGCCAGACCAAAAGG-3′，crtB-L-A：5′-ATGAAGACATCAACTACAACTCCA-3′，以ATCC14067基因组为模板，扩增2487bp的crtB基因的左同源臂；
设计引物crtB-R-A：5′-CATCGCCTATGCTCGAAATACTGC-3′，crtB-R-S：5′-TCATAGCTGAGCCTGCTTCTGGTA-3′，以ATCC14067基因组为模板，扩增2581bp的crtB基因的右同源臂；
设计引物kan-crtB-A：5′-AGAAGCAGGCTCAGCTATGAATGGGTTAAAAAGGATCGATCCTC-3′，kan-crtB-S：5′-GTTGTAGTTGATGTCTTCATCGCAAGCGCAAAGAGAAAGCAGGT-3′，扩增质粒pEC-K18mob2(GenBank number：A F445080)上1103bp的Kan抗性筛选标记表达盒；
设计引物PBS-crtB-A：5′-TTGGTCTGGCGTACCTATTATTGTTATCCGCTCACAATTCCACAC-3′，PBS-crtB-S：5′-ATTTCGAGCATAGGCGATGATGCAGGAATTCGATATCAAGCTTA-3′，扩增2877bp的pBluescript II SK(+)(购自Str atagene)质粒骨架序列。
用NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(购自New England BioLabs)试剂盒通过同源重组的方法将上述四个片段进行组装，构建质粒PBS-crtB-L/R-Kan质粒，用于扩增含有Kan筛选标记表达盒及同源臂长度分别为100，200，300，400，500，800，1000，1200，1500和2000bp的线性双链DNA表达盒CrtB/100-Kan，CrtB/200-Kan，CrtB/300-Kan，CrtB/400-Kan，CrtB/500-Kan，CrtB/800-Kan，CrtB/1000-Kan，CrtB/1200-Kan，CrtB/1500-Kan，CrtB/2000-Kan。
三、不同核酸外切酶-重组酶对线性双链DNA的重组
将构建的crtB基因同源臂长度为400bp的线性双链双链DNA表达盒CrtB/400-Kan分别电击转化入核酸外切酶-重组酶表达的ATCC14067-XC99E-RecET，ATCC14067-XC99E-Orf47/Orf48，ATCC14067-XC99E-OrfB/OrfC和ATCC14067-XC99E-gp60/61感受态细胞中。电击转化的方法如下：(1)吸取预冷的线性双链DNA，加入核酸外切酶-重组酶表达的感受态细胞中，弹壁使其混匀，冰浴5～10min；(2)将上述混合物加入预冷的电击杯中，1.8KV，5ms电击3次，加入6mL LBH恢复培养基(含7.5μg/mL的氯霉素)，46℃水浴6min，30℃，250rpm复苏培养5h；(3)4000rpm，离心10min，收集菌体；(4)弃上清，剩余200μL液体，重悬菌体，涂布于LBH+Kan25+Chl7.5固体培养基，30℃培养36～48h。计数平板上的菌落个数，PCR鉴定分析菌落的重组情况，结果表明核酸外切酶-重组酶RecET、Orf47+Orf48、OrfB+OrfC及gp60+gp61均能在谷氨酸棒杆菌中协助完成线性双链DNA的同源重组，且核酸外切酶-重组酶RecET的效果最好，结果见图2。
四、500～1000bp的同源臂长度提高核酸外切酶-重组酶RecET对的线性双链DNA的同源重组效率
将500ng不同同源臂长度的线性双链DNA表达盒CrtB/100-Kan，CrtB/200-Kan，CrtB/300-Kan，CrtB/400-Kan，CrtB/500-Kan，CrtB/800-Kan，CrtB/1000-Kan，CrtB/1200-Kan，CrtB/1500-Kan和CrtB/2000-Kan分别转化入RecET表达的ATCC14067-XC99E-RecET的感受态细胞中，30℃培养36～48h后计数平板上的菌落个数，PCR鉴定分析菌落的重组情况。结果表明，在谷氨酸棒杆菌中，在相同质量的线性双链DNA的条件下，同源臂长度在500～1000bp左右，核酸外切酶-重组酶RecET对线性双链DNA的同源重组的效率最佳(图3)。
实施例2单基因无痕敲除菌株ATCC14067-RecET-MargR的获得
一、自我剪切的线性双链DNA敲除表达盒ΔArgR的制备
设计引物PBS-Kan-S：5′-TCGATCCTTTTTAACCCATTGCAGGAATTCGATATCAAG-3′，PBS-Cre-A：5′-GCGACACGAATTATGCAGTTTGTTATCCGCTCACAATTC-3′，扩增2875bp的质粒pBluescript II SK(+)骨架片段；
设计引物theoE-Cre-S：5′-ACTGCATAATTCGTGTCGCTCAAG-3′，theoE-Cre-A：5′-CTTTGCGCTTGCGCGGAATTAATTCATGAGCG-3′，扩增1594bp的诱导型Cre酶表达盒；
设计引物Kan-S：5′-AATTAATTCCGCGCAAGCGCAAAGAGAAAGCA-3′，
Kan-A：5′-ATGGGTTAAAAAGGATCGATCCTC-3′，扩增1074bp的Kan抗性筛选标记表达盒；
将上述三个片段胶回收后用NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix(NewEngland BioLabs)试剂盒进行组装，得到通用质粒PBS-Cre-Kan。
设计通用引物C-K-loxp66：5′-TACCGTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATATGGGTTAAAAAGGATCGATCC-3′，C-K-loxp71：5′-TACCGTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATACTGCATAATTCGTGTCGCTCA-3′，以通用质粒PBS-Cre-Kan为模板扩增左端含有loxp71序列，右端含有loxp66序列的2712bp的通用的Cre-Kan表达盒(片段2)(图1)；
设计引物argR-L-S：5′-TCAACTCGTACTCGCTTCTCCTTC-3′，argR-L-lox p71：5′-TGCAGTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAACGGTAGTCTTACCTCGGCTGGTTGGC-3′，以ATCC14067的基因组为模板，扩增841bp的含有a rgR基因左同源臂及loxp71序列的DNA序列(片段R-1)；
设计引物argR-R-loxp66：5′-ACCCATATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAACGGTAAGCGCCCCTAGTTCAAGGCTTG-3′，argR-R-A：5′-TGATGACCTCATCTGGAGCGTTAC-3′，扩增862bp的含有loxp66及argR基因右同源臂的DNA序列(片段R-3)。
以argR-L-S，argR-R-A作为引物，片段R-1，片段2和片段R-3作为模板，重叠延伸PCR扩增4335bp的ΔArgR自我剪切线性敲除表达盒。
二、argR基因的无痕敲除
将上述制备的ΔArgR自我剪切线性敲除表达盒，1μg转入新鲜制备ATCC14067-XC99E-RecET的感受态细胞中，按照实施例1中电击转化的方法转化ΔA rgR自我剪切线性敲除表达盒。在抗性平板上，平均有转化子122个，设计引物ΔargR-JD-S：5′-GTTGTCATCACCGATACCTGGGTATCCA-3′，ΔargR-JD-A：5′-AGGTCGAGAGAAACTGCGATGACTTCAC-3′，对平板上长出的菌落进行PCR验证，ΔArgR自我剪切线性敲除表达盒成功重组的菌株在3265bp处有条带，野生菌株在1069bp处有条带(图4)。挑取约30个转化子，用引物ΔargR-JD-S，ΔargR-JD-A进行PCR鉴定，结果表明94％的转化子均为正确重组的阳性转化子(表1)。
挑取正确重组的转化子，诱导Cre酶表达，执行loxp71和loxp66位点间序列的剪切，完成argR基因的无痕敲除。诱导Cre酶表达，执行loxp71和loxp66位点间序列的剪切及无痕敲除菌株的筛选方法如下：将验证正确的转化子，挑取5株，接种于含7.5μg/mL氯霉素及1mM茶碱的BHI液体培养基中，30℃，250rpm，摇菌24h；蘸取菌液，划线于含1mM茶碱及7.5μg/mL氯霉素的BHI固体培养基上，30℃，培养24h；将上述长出的单菌落分别点板于含BHI+Kan25+Chl7.5及BHI+Chl7.5的平板上，30℃，培养12h后，观察菌落的生长情况。在仅含氯霉素的平板上生长，同时在含氯霉素和卡那霉素的平板上不生长(图4)，初步鉴定有效剔除Cre表达盒及Kan筛选标记，点板结果表明100％的Cre切割菌株均有效完成loxp位点间DNA序列的剪切(表1)；用引物ΔargR-JD-S，ΔargR-JD-A进一步PCR验证，无痕敲除在600bp左右处有条带，野生的对照菌株在1100bp左右处有条带(图4)，进一步确定成功有效剔除Cre表达盒及Kan筛选标记；用引物ΔargR-JD-S，ΔargR-JD-A扩增的敲除菌株的条带进行测序，再一步确定基因组上的argR基因被34bp的loxp72代替，测序结果表明重组切割后的无痕敲除菌株基因突变的概率为0％。成功获得argR基因无痕敲除的菌株，ATCC14067-RecET-MargR。
实施例3无痕敲除菌株ATCC14067-RecET-MargR中叠加无痕敲除crtB基因
按照实施例2中的方法设计引物crtB-L-S(1)：5′-GAAGTGTTGATAGAAATGACCTCA-3′，crtB-L-loxp71：5′-TGCAGTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAACGGTAATGAAGACATCAACTACAACTCC-3′，以ATCC14067的基因组为模板扩增840bp的含有crtB基因左同源臂及loxp71序列的DNA序列(C-1)；
设计引物crtB-R-loxp66：5′-ACCCATATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAACGGTATCATAGCTGAGCCTGCTTCTGG-3′，crtB-R-A(1)：5′-GTCACTAGTGCTGACTCCCCCTCT-3′，以ATCC14067的基因组为模板扩增850bp的含有loxp66及crtB基因右同源臂的DNA序列(C-3)。
以crtB-L-S(1)，crtB-R-A(1)作为引物，片段C-1、2712bp的通用的Cre-Kan表达盒(片段2)和片段C-3作为模板，融合4322bp的ΔCrtB自我剪切的线性敲除表达盒。
按照施例1中的方法，完成RecET表达的ATCC14067-RecET-MargR感受态细胞的制备并完成ΔCrtB线性敲除表达盒的转化。
设计引物ΔcrtB-JD-S：5′-CCAGGCGTTAATTCTACCAAATCGAGAT-3′，ΔcrtB-JD-A：5′-GGTCTGACAGTAACCGGCGGAGTAATTA-3′，对平板上长出的菌落进行PCR验证，ΔCrtB线性敲除表达盒成功同源重组的菌株在3257bp处有条带，野生菌株在1455bp处有条带。挑取约30个转化子，用引物ΔcrtB-JD-S，ΔcrtB-JD-A进行PCR鉴定，结果表明97％的转化子均为成功重组的阳性转化子(表1)。按照实施例2中的方法完成Cre酶的诱导剪切及点板筛选，点板结果表明100％的Cre切割菌株均有效完成loxp位点间DNA序列的剪切(表1)；用引物ΔcrtB-JD-S，ΔcrtB-JD-A进一步PCR验证，无痕敲除在600bp左右处有条带，野生的对照菌株在1455bp左右处有条带(图5)，进一步确定成功剔除Cre酶表达盒及Kan筛选标记表达盒序列；用引物ΔcrtB-JD-S，ΔcrtB-JD-A扩增的敲除菌株的条带进行测序，再一步确定基因组上的crtB基因被34bp的loxp72代替，测序结果表明重组切割后的无痕敲除菌株基因突变的概率为0％，成功获得crtB基因无痕敲除的菌株；同时对无痕敲除菌株用引物ΔargR-JD-S，ΔargR-JD-A进行PCR验证，在600bp左右处有条带，表明成功获得argR和crtB基因连续无痕敲除的菌株ATCC14067-RecET-MargR-crtB。
实施例4RecET对线性敲除表达盒重组效率及Cre酶切割效率分析
为了探索RecET-Cre/loxP系统在谷氨酸棒杆菌中的同源重组效率及Cre切割效率，首先按照实施例2中制备自我剪切敲除表达盒的方法分别制备敲除基因Ncgl1221和proB的自我剪切线性敲除表达盒。
设计引物Ncgl-L-S：5′-GACGGTGGTGACTTTTGAACGAAG-3′，Ncgl-L-l oxp71：5′-TGCAGTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAACGGTAGACGCTGATTACAGACGTGTCC-3′，以ATCC14067基因组为模板扩增886bp的含有N cgl1221基因左同源臂及loxp71序列的DNA序列(片段N-1)；
设计引物Ncgl-R-loxp66：5′-ACCCATATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAACGGTAGAGCCAAGATTAGCGCTGAAAAGTAG-3′，Ncgl-R-A：5′-GAACGGAGTCCAAGTTTGCATCAG-3′，以ATCC14067的基因组为模板扩增826bp的含有loxp66序列及Ncgl1221基因右同源臂的DNA序列(片段N-3)。
以Ncgl-L-S，Ncgl-R-A为引物，片段N-1，2712bp的通用的Cre-Kan表达盒(片段2)和片段N-3作为模板，融合4343bp的ΔNcgl自我剪切线性敲除表达盒。
设计引物proB-L-S：5′-GATGGCCCGTGTTCATTATCTCCG-3′，ProB-L-lox p71：5′-TGCAGTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAACGGTATCCGGATTCATGTCCGTATGCG-3′，以ATCC14067的基因组为模板扩增849bp的含有pr oB基因左同源臂及loxp71序列的DNA序列(P-1)；
设计引物ProB-R-loxp66：5′-ACCCATATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAACGGTAAGCGCGGGCCTGCTGGTGGCAG-3′，proB-R-A：5′-GTCAGGAAGTGGCTCAGGATC-3′，以ATCC14067的基因组为模板扩增849bp的含有l oxp66序列及proB基因右同源臂的DNA序列(P-3)。
以proB-L-S，proB-R-A作为引物，片段P-1，通用的Cre-Kan表达盒片段(片段2)和片段P-3作为模板，融合4330bp的ΔProB自我剪切线性敲除表达盒。
按照实施例1中的方法，将制备好的1μg自我剪切的ΔNcgl1221及ΔProB的线性敲除表达盒分别转化入RecET表达的ATCC14067-XC99E-RecET及ATCC14067-RecET-MargR感受态细胞中。按照实施例2中的方法计数平板上长出的单菌落个数，不同基因的敲除菌株挑取转化子30个进行菌落PCR验证，分析RecET对线性敲除表达盒的替换频率(表1)。
按照实施例2中的方法，诱导Cre酶的表达，执行loxp位点间的剪切、点板筛选及测序，分析不同敲除基因中Cre酶的切割效率(表1)，并分别获得无痕敲除菌株ATCC14067-RecET-MNcgl1221，ATCC14067-RecET-MproB，ATCC14067-RecET-MargR-Ncgl1221，ATCC14067-RecET-MargR-proB。
表1RecET对自我剪切线性敲除表达盒的重组效率及Cre剪切效率统计结果
本发明中，通过将构建的RecET-Cre/loxP系统应用于谷氨酸棒杆菌ATCC14067中，利用核酸外切酶-重组酶RecET直接有效地完成线性双链DNA的同源重组，整个过程只需要一轮的转化，且成功重组的转化子的概率≥94％；同时Cre酶能够有效的执行loxP位点间的剪切，剪切效率≥97％；RecET-Cre/loxP系统完成靶标基因的无痕敲除仅需4～6天，同时能够完成靶标基因的连续无痕敲除，相对于谷氨酸棒杆菌中的其他无痕敲除的方法更加简单，有效而且节省时间。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 华南理工大学
<120> 谷氨酸棒杆菌中一种基因连续无痕敲除的方法
<130> 1
<160> 49
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> loxp71
<400> 1
taccgttcgt atagcataca ttatacgaag ttat 34
<210> 2
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> loxp66
<400> 2
ataacttcgt atagcataca ttatacgaac ggta 34
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> loxp72
<400> 3
taccgttcgt atagcataca ttatacgaac ggta 34
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> recT/recE-S
<400> 4
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> recT/recE-A
<400> 5
ggcaccaata actgccttaa ttattcctct gaattatcga 40
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> orfC/orfB-S
<400> 6
caaaaaggag gcccttcaga tgacaaaatt atgttttagt g 41
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> orfC/orfB-A
<400> 7
ggcaccaata actgccttaa ttaagcctta tcctgattag t 41
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> orf48/orf47-S
<400> 8
caaaaaggag gcccttcaga tggctattgc aaaagaaaag ac 42
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> orf48/orf47-A
<400> 9
ggcaccaata actgccttaa ttagatcatt gacccttgaa cc 42
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gp60/61-S
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acaaaaagga ggcccttcag atgagtgtgc ccacacagga cgga 44
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> gp60/61-A
<400> 11
ggcaccaata actgccttaa tcatgcgttg ggcccgtcga acat 44
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PEC-A
<400> 12
ctgaagggcc tcctttttgt tatccg 26
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PEC-S
<400> 13
ttaaggcagt tattggtgcc catgcg 26
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> crtB-L-S
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taataggtac gccagaccaa aagg 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> crtB-L-A
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atgaagacat caactacaac tcca 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> crtB-R-A
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catcgcctat gctcgaaata ctgc 24
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> crtB-R-S
<400> 17
tcatagctga gcctgcttct ggta 24
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<211> 44
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> kan-crtB-A
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agaagcaggc tcagctatga atgggttaaa aaggatcgat cctc 44
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> kan-crtB-S
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gttgtagttg atgtcttcat cgcaagcgca aagagaaagc aggt 44
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PBS-crtB-A
<400> 20
ttggtctggc gtacctatta ttgttatccg ctcacaattc cacac 45
<210> 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PBS-crtB-S
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atttcgagca taggcgatga tgcaggaatt cgatatcaag ctta 44
<210> 22
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PBS-Kan-S
<400> 22
tcgatccttt ttaacccatt gcaggaattc gatatcaag 39
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PBS-Cre-A
<400> 23
gcgacacgaa ttatgcagtt tgttatccgc tcacaattc 39
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> theoE-Cre-S
<400> 24
actgcataat tcgtgtcgct caag 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> theoE-Cre-A
<400> 25
ctttgcgctt gcgcggaatt aattcatgag cg 32
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<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Kan-S
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aattaattcc gcgcaagcgc aaagagaaag ca 32
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Kan-A
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atgggttaaa aaggatcgat cctc 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C-K-loxp66
<400> 28
taccgttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatatgggt taaaaaggat cgatcc 56
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> C-K-loxp71
<400> 29
taccgttcgt atagcataca ttatacgaag ttatactgca taattcgtgt cgctca 56
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> argR-L-S
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tcaactcgta ctcgcttctc cttc 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> argR-L-loxp71
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tgcagtataa cttcgtataa tgtatgctat acgaacggta gtcttacctc ggctggttgg 60
c 61
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<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> argR-R-loxp66
<400> 32
acccatataa cttcgtatag catacattat acgaacggta agcgccccta gttcaaggct 60
tg 62
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> argR-R-A
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tgatgacctc atctggagcg ttac 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> △argR-JD-S
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gttgtcatca ccgatacctg ggtatcca 28
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> △argR-JD-A
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aggtcgagag aaactgcgat gacttcac 28
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> crtB-L-S（1）
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gaagtgttga tagaaatgac ctca 24
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<211> 63
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> crtB-L-loxp71
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tgcagtataa cttcgtataa tgtatgctat acgaacggta atgaagacat caactacaac 60
tcc 63
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> crtB-R-loxp66
<400> 38
acccatataa cttcgtatag catacattat acgaacggta tcatagctga gcctgcttct 60
gg 62
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> crtB-R-A（1）
<400> 39
gtcactagtg ctgactcccc ctct 24
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<212> DNA
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<220>
<223> △crtB-JD-S
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ccaggcgtta attctaccaa atcgagat 28
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> △crtB-JD-A
<400> 41
ggtctgacag taaccggcgg agtaatta 28
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ncgl-L-S
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<213> Artificial Sequence
<220>
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tgcagtataa cttcgtataa tgtatgctat acgaacggta gacgctgatt acagacgtgt 60
cc 62
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ncgl-R-loxp66
<400> 44
acccatataa cttcgtatag catacattat acgaacggta gagccaagat tagcgctgaa 60
aagtag 66
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ncgl-R-A
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gaacggagtc caagtttgca tcag 24
<210> 46
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<212> DNA
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<220>
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gatggcccgt gttcattatc tccg 24
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<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ProB-L-loxp71
<400> 47
tgcagtataa cttcgtataa tgtatgctat acgaacggta tccggattca tgtccgtatg 60
cg 62
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ProB-R-loxp66
<400> 48
acccatataa cttcgtatag catacattat acgaacggta agcgcgggcc tgctggtggc 60
ag 62
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<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> proB-R-A
<400> 49
gtcaggaagt ggctcaggat c 21
Claims (7)
1.谷氨酸棒杆菌中一种基因连续无痕敲除的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)构建核酸外切酶-重组酶表达的质粒，转化入谷氨酸棒杆菌的感受态细胞中；
(2)制备同时含有靶标基因1的左同源臂及loxp71序列，Cre酶表达盒及谷氨酸棒杆菌中有效的抗性筛选标记表达盒，loxp66序列及靶标基因1的右同源臂的自我切割线性敲除表达盒；
(3)制备核酸外切酶-重组酶表达的的谷氨酸棒杆菌感受态细胞；
(4)将步骤(2)中的自我切割线性敲除表达盒转化入步骤(3)中制备的感受态细胞中，涂布于相应的抗性筛选平板；
(5)将鉴定成功的阳性转化子接种于诱导Cre酶表达的液体培养基，诱导Cre酶表达，执行loxp71和loxp66序列间的DNA的剪切，剔除Cre酶表达盒及抗性筛选标记表达盒；
(6)将诱导培养后的菌液划线分离单菌落；单菌落点板于含以及不含自我切割线性敲除表达盒中相应抗性的平板进行筛选；
(7)将步骤(6)中鉴定正确的菌株进行PCR及测序验证，成功获取靶标基因1无痕敲除的菌株，即含有核酸外切酶-重组酶表达质粒的靶标基因1无痕敲除菌株。
2.根据权利要求1所述的谷氨酸棒杆菌中一种基因连续无痕敲除的方法，其特征在于还包括：
(8)制备同时含有靶标基因2的左同源臂及loxp71序列，Cre酶表达盒及谷氨酸棒杆菌中有效的抗性筛选标记表达盒，loxp66序列及靶标基因2的右同源臂的自我切割线性敲除表达盒；
(9)制备核酸外切酶-重组酶表达的靶标基因1无痕敲除菌株的谷氨酸棒杆菌感受态细胞，将步骤(8)中的自我切割线性敲除表达盒转化入核酸外切酶-重组酶表达的靶标基因1无痕敲除菌株的谷氨酸棒杆菌感受态细胞，涂布于相应的抗性筛选平板；并按照上述步骤(5)～(6)获得鉴定正确的菌株，再对其进行PCR及测序验证，成功获取靶标基因2无痕敲除的菌株，完成靶标基因2的连续无痕敲除；依次类推，完成多个基因的连续无痕敲除。
3.根据权利要求1或2所述的谷氨酸棒杆菌中一种基因连续无痕敲除的方法，其特征在于：
所述的核酸外切酶-重组酶为RecET、Orf47+Orf48、OrfB+OrfC或gp60+gp61。
4.根据权利要求3所述的谷氨酸棒杆菌中一种基因连续无痕敲除的方法，其特征在于：
所述的核酸外切酶-重组酶为RecET。
5.根据权利要求1或2所述的谷氨酸棒杆菌中一种基因连续无痕敲除的方法，其特征在于：
所述的自我切割线性敲除表达盒，在相同质量的线性双链DNA的条件下左右同源臂长度为500～1000bp。
6.根据权利要求1或2所述的谷氨酸棒杆菌中一种基因连续无痕敲除的方法，其特征在于具体包括以下步骤：
(1)构建IPTG诱导的核酸外切酶-重组酶RecET表达的质粒pEC-XC99E-RecET，转化入谷氨酸棒杆菌的感受态细胞中；
(2)通过重叠延伸PCR的方法制备同时含有长度在500～1000bp的靶标基因1的左同源臂及loxp71序列，茶碱诱导的Cre酶表达盒及Kan抗性表达盒，loxp66序列及长度在500～1000bp的靶标基因1的右同源臂的自我切割线性敲除表达盒；
(3)制备已诱导pEC-XC99E-RecET表达的的谷氨酸棒杆菌感受态细胞；
(4)将步骤(2)中的自我切割线性敲除表达盒转化入步骤(3)中制备的感受态细胞中，涂布于含有卡那霉素25μg/mL和氯霉素7.5μg/mL的LBH固体平板；
(5)将鉴定成功的阳性转化子接种于含1mM茶碱及氯霉素7.5μg/mL的BHI液体培养基，诱导Cre酶表达，执行loxp71和loxp66序列间的DNA的剪切，剔除Cre酶表达盒及Kan抗性表达盒；
(6)将诱导培养后的菌液划线于含1mM茶碱及氯霉素7.5μg/mL的BHI平板，分离单菌落；单菌落分别点板于同时含卡那霉素25μg/mL和氯霉素7.5μg/mL的含BHI平板及仅含氯霉素7.5μg/mL的BHI平板进行筛选；在同时含卡那霉素25μg/mL和氯霉素7.5μg/mL的含BHI平板上不生长，仅含氯霉素7.5μg/mL的BHI平板上生长的菌落为初步鉴定为成功剔除Cre酶表达盒及Kan抗性表达盒的无痕敲除菌株；
(7)将步骤(6)中鉴定正确的菌株进行PCR及测序验证，成功获取靶标基因1无痕敲除的菌株，即：含有核酸外切酶-重组酶RecET表达质粒的靶标基因1无痕敲除菌株。
7.根据权利要求6所述的谷氨酸棒杆菌中一种基因连续无痕敲除的方法，其特征在于还包括：
(8)通过重叠延伸PCR的方法制备同时含有长度在500～1000bp的靶标基因2的左同源臂及loxp71序列，茶碱诱导的Cre酶表达盒及Kan抗性表达盒，loxp66序列及长度在500～1000bp的靶标基因2的右同源臂的自我切割线性敲除表达盒；
(9)制备核酸外切酶-重组酶RecET表达的靶标基因1无痕敲除菌株的谷氨酸棒杆菌感受态细胞，将步骤(8)中的自我切割线性敲除表达盒转化入核酸外切酶-重组酶RecET表达的靶标基因1无痕敲除菌株的谷氨酸棒杆菌感受态细胞，涂布于含有卡那霉素25μg/mL和氯霉素7.5μg/mL的LBH固体平板；并按照上述步骤(5)～(6)获得鉴定正确的菌株，再对其进行PCR及测序验证，成功获取靶标基因2无痕敲除的菌株，完成靶标基因2的连续无痕敲除；依次类推，完成多个靶标基因的连续无痕敲除。
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (2)
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| Development of a markerless gene knock-out system for Mannheimia succiniciproducens using a temperature-sensitive plasmid;Kim, JM等;《FEMS MICROBIOLOGY LETTERS》;20080101;第278卷(第1期);第78-85页 * |
| 利用Red同源重组技术构建产L-苏氨酸的基因工程菌;闫继爱等;《中国生物工程杂志》;20100315;第30卷(第3期);第79-83页 * |
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