CN103865840B - 一种产g418单组分的工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于抗生素制药领域，涉及一种产G418单组分的工程菌及其应用，该工程菌为绛红色小单孢菌GQ175，该菌株已于2013年12月6日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保蒇，保藏编号为CGMCC？No.8543，通过破坏绛红小单孢菌中庆大霉素的生物合成关键基因，阻断庆大霉素的生物合成代谢流，促使代谢产物中间体G418的积累，不再合成庆大霉素复合物。本发明通过基因框内敲除的方法灭活绛红小单孢菌中庆大霉素生物合成基因<i>genQ</i>，构建穿梭载体pDB303，pDB303转化绛红小单孢菌G1008，筛选双交换菌株，发酵生产，代谢产物检测和新组分鉴定。本发明产单组分G418，填补国内至今无法生产G418的空白，该工程菌生产工艺简单，成本低，产率高，便于控制，质量稳定。

Description

一种产G418单组分的工程菌及其应用

技术领域

本发明属抗生素制药领域，涉及一种产G418单组分的工程菌及其应用，是利用分子生物学操作技术，阐明genQ(GenBankaccessionNo.：AJ628149，genQ；AY524043.1，gntX；AJ575343.3，gacJ)基因的功能，并破坏绛红小单孢菌G1008中氨基寡糖生物合成的关键基因genQ，从而获得一株高产G418的工程菌，可应用于氨基寡糖制造，生产G418。

背景技术

氨基糖苷类抗生素是临床上广泛使用的抗生素药物，包括链霉素、新霉素、卡那霉素和庆大霉素等，该类化合物依赖其自身的化学结构特征，结合到30S核糖体亚基的不同区域，干扰细菌蛋白质的合成，从而杀死或抑制细菌生长。氨基糖糖苷类抗生可分为含2-DOS和不含2-DOS两大类。2-DOS类依据糖基的取代位置不同，又可分为4-单取代，4，5-和4,6-双取代等三类。G418是一种以4,6-双取代的2-DOS类抗生素，可作用于真核生物的80S核糖体上，因此可被用于抗寄生虫药。此外，G418也被用于治疗遗传病。在分子生物学研究领域，G418是细胞转染实验中不可缺少的抗性筛选标记材料。

绛红小单孢菌G1008是庆大霉素产生菌，主要组分为C1a、C2a、C2和C1。由于各组分化学结构的差异，庆大霉素各组分的毒副作用也各不相同，因此获得单组分产生菌，一直是科学家苦苦追求的目标。分子生物学和生物信息学的快速发展，为基因工程定向育种奠定了坚实基础。2006年Piepersberg.W等公布了棘孢小单孢菌庆大霉素生物合成基因簇（GenBankaccessionNo.：AJ628149），长达84222bp，2012年洪文荣等公布了绛红色小单孢菌的庆大霉素生物合成基因簇（GenBankaccessionNo.：JQ975418），44181bp，并于2012建立了系统的绛红小单孢菌接合转移体系，为获得重要的氨基寡糖生物合成代谢中间体，奠定了坚实基础。

氨基糖寡糖类抗生素的生物合成过程有些相似，部分庆大霉素的生物合成步骤可以根据已知的其它同类抗生素的生物合成进行推测。文献报道有关新霉素、丁酰苷菌素和卡那霉素的生物合成，由巴龙霉胺至新霉胺的催化酶（即6＇C位的氨基化）分别是NeoQ-NeoB、BtrQ-BtrB和KanQ-KanB。庆大霉素的生物合成没有巴龙霉素至新霉胺这一转化，但从庆大霉素X2至JI-20A和G418至JI-20B都是C6＇位的氨基化，通过生物信息学分析，庆大霉素生物合成基因簇中genQ与neoQ、btrQ、kanQ同源，因此推测genQ作用于6＇C位的氨基化，可以通过破坏绛红小单孢菌G1008中的genQ，基因，来创造一株高产G418单组分的工程菌。

目前G418由原美国先令公司独家垄断生产，默克公司参与销售。制备G418极其困难，需要层析分离，工艺复杂，因此，价格昂贵，国内所需G-418全部依赖进口。因此构建中国自己的G418工程菌，生产G418，具有重要的生物学意义和现实意义。本发明是前一专利（201110331534.9）的进一步延伸和深化，属系列性专利。

发明内容

本发明的目的是提供一种产G418单组分的工程菌及其应用，通过灭活genQ基因功能的方法，获得能产生不同于亲株组分，只产G418单组分的工程菌，命名为绛红小单孢菌GQ175（MicromonosporapurpureaGQ175），该菌株已于2013年12月6日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保蒇，保藏编号为CGMCCNo.8543。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

通过敲除绛红小单孢菌中genQ基因序列，丧失其功能，主要包括以下步骤：

A.genQ同源重组质粒的构建；

B.同源重组质粒导入绛红色小单孢菌；

C.接合子的筛选；

D.工程菌组分的鉴定。

基因置换的方法为PCR分别获得genQ基因上下游分子量大约2000bp的两个片段作为交换臂，将两者同时连接到pKC1139中，得到同源重组质粒pDB303。

转化是以EcoliET12657/pUZ8002介导的结合转移方法。

所述的筛选为先筛选安普霉素抗性菌株，无抗性传代后再从中筛选到安普霉素敏感菌株，再从中筛选到不产庆大霉素复合物单产G418的转化子。

所述的鉴定为发酵滤液采用薄层层析TLC、新组分采用HPLC-ELSD分析和MS分析。

一种产G418单组分的工程菌在制备抗菌药物和抗生素药物中的应用。

基因破坏的方法是：借助PCR扩增genQ上下游序列各2000bp左右的片段作为同源交换臂，两个片段连接到穿梭载体pKC1139上，得到穿梭质粒pQB303，载体pKC1139上的安普霉素抗性基因作为筛选标记。

转化是借助E.coliET12657(pUZ8002)介导的结合转移法。首先，筛选含安普霉素抗性（Am^R）菌株，松弛培养数代后，再从中筛选安普霉素敏感（Am^S）菌株，通过PCR分析验证，得到双交换工程菌，再经发酵，提取，精制，分析，确认其是产单组分菌株，命名为绛红色小单孢菌GQ175。发酵代谢组分确认，采用（TLC）薄层层析和MS法（质谱法），确定其分子量，与G418同质。

其中，基因genQ的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示和氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。

本发明的优点在于：在国际上首次采用微生物分子遗传学技术，通过基因敲除，阐明了庆大霉素生物合成基因簇上genQ基因，与庆大霉素绛红糖氨C6’的氨基化有关。显然通过敲除该基因，预测可以阻断庆大霉素中间产物的进一步修饰，生物合成停止在积累G418的位点上。该方法过程机制清楚，不存在后续回复突变问题。工程菌代谢组分单一，发酵控制简单，提取精制方便，无需层析分离，达到了洁净的生产境界，填补了国内外研究空白，不仅对生物学研究具有理论意义，而且所得到的工程菌可以直接应用于产业化，产生极大的经济效益和社会效益，因此，具有一举多得的显著效果。

附图说明

图1G418的结构图。

图2敲除genQ基因同源交换原理图，其中，I：质粒pQB303游离存在；II：亲株G1008染色体组；III：GQ175染色体组；P1/P2上游交换臂引物，P3/P4下游交换臂引物，P5/P6双交换验证引物。

图3穿梭质粒pQB303及其酶切验证图，其中，B1为genQ的上游同源交换臂，B2为genQ的下游同源交换臂；1：pQB303（EcoRⅠ/XbaⅠ）酶切；2：pQB303（HindⅢ）酶切；3：pQB303（SacⅠ）酶切；M：λ-EcoT14IdigestDNAMarker。

图4工程菌GQ175基因失活变化验证图，其中，M：DL5000；1：GQ175/(PQ5/PQ6)；2：GQ1/(PQ5/PQ6)；3：G1008/(PQ5/PQ6)。

图5工程菌代谢产物薄层层析（TLC）分析图，其中1：亲株G1008代谢产物；2：GQ175代谢产物；3：G418标准品。

具体实施方式

实施例1：

1.同源重组质粒pQB303的构建

根据2012年洪文荣等公布的绛红色小单孢菌的庆大霉素生物合成基因簇（GenBankaccessionNo.：JQ975418，44181bp）和Piepersberg等公布的棘孢小单孢菌庆大霉素生物合成基因簇(GenBankAccessionNumberAJ628149)，以基因genQ的上下游序列，设计框内敲除方案（图2）。两对扩增交换臂引物分别为PQ1/PQ2和PQ3/PQ4。P1（5′-GAATTCAGGAGGTGCTCACCGACG-3′，EcoRI），P2（5＇-AAGCTTAGAACCGGGTGTCCCTCG-3＇，HindⅢ）；P3（5＇-AAGCTTTTCCGTTCGAAGGCGACC-3＇，HindⅢ），P4（5＇-TCTAGAAACGGCTCGGTGAACTCGTG-3＇，XbaⅠ）。

以绛红小单孢菌G1008的基因组为模板，PCR反应体系和反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性1min，67.5℃退火1min，72℃延伸1min，72℃保持10min，4℃保存。采用Ex-TaqDNA聚合酶，扩增基因genQ的上游序列，作为同源重组的交换臂B1（1995bp）。经电泳检测，回收目标DNA片段，并将其克隆至pMD19-T载体，得到中间质粒，命名为pQB301（pMD19-T::QB1）；以同样的方法扩增下游交换臂B2，并克隆到pMD19-T载体，命名为pQB302（pMD19-T::QB2）。

质粒pQB301经(HindⅢ/EcoRⅠ)双酶切，回收1995bp的B1片段；质粒pQB302经（HindⅢ/XbaⅠ）双酶切，回收1917bp的B2片段；与此同时，pKC1139经（EcoRⅠ/XbaⅠ）双酶切，回收大片段，并与交换臂B1、B2三个片段连接，酶连产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞，挑取抗性菌落，转接于液体LB培养基中培养过夜，提取得到重组质粒，命名为pQB303（图3）。重组质粒pQB303的理论图谱中存在6个SacⅠ限制酶酶切位点，可以将质粒切割成6214bp、1606bp、1217bp、751bp、531bp和82bp六个线性片段，因此采用SacⅠ酶切重组质粒pQB303，电泳检测结果见图3，电泳条带与理论预测吻合，经DNA测序，结果一致，证明得到的最终质粒pQB303构建正确。

2.绛红小单孢菌GQ1接合子的制备

穿梭质粒转化大肠杆菌ET12567/pUZ8002感受态细胞，在含有阿泊拉霉素、氯霉素、卡那霉素的LB平板上培养过夜，挑取抗性菌落并对质粒进行验证，得到大肠杆菌ET12567/（pUZ8002，pQB303）供体菌。过夜培养的供体大肠杆菌ET12567（pUZ8002，pQB303）转接到含相应抗生素的LB培养基中，37℃振荡培养；当OD600达到0.3~0.6时（约3h），收集菌体，并用新鲜LB培养基洗涤2次备用；将绛红色小单孢菌孢子悬浮于5mLpH8.0的0.05mol/LTES缓冲液中，60℃水浴热激2min，待其冷却至室温后加入等体积预萌发培养基，37℃振荡（250r/min）培养3h；离心收集孢子并重悬于适量的无菌水中，在混合器上振荡打散孢子，按10⁸：10⁸与大肠杆菌细胞等量混合，涂布于绛红色小单孢菌平板培养基上，于37℃培养24h后，用1mL的无菌水（含阿泊拉霉素和萘啶酸）覆盖，使两种抗生素的终浓度分别为25μg/mL，37℃继续培养4-6天，长出转化子，将所获得的Am^R转化子在含有安普霉素(50μg／mL)的斜面培养基上，继续37℃培养，得到单交换整合子。随机挑选一株命名为绛红小单孢菌GQ1。

3．双交换工程菌GQ175的筛选

将Am^R转化子在无安普霉素平板上连续传三代以上，挑取单菌落分别点种到无安普霉素和含安普霉素（50μg/mL)平板上，从37株中筛选获得10个Am^S菌株。提取染色体，作为模板，设计双交换验证引物P5/P6（5′-TACGACGACTCACGCCAGGTCA-3′；5′-TGGATCCCTGGGTGAGCTACGA-3′），进行PCR扩增和电泳检测，结果见图4。扩增产物经DNA测序，与预测吻合。证明是双交换工程菌，genQ基因已经被破坏。所得双交换工程菌，命名为绛红小单孢菌GQ175。

4.工程菌发酵代谢产物分析

对该菌株进行发酵，过滤收集发酵液，滤液通过硅胶GF₂₅₄薄层层析，该菌株代谢产物呈单组份，不再是庆大霉素C复合物（图5）。

实施例2：工程菌GQ175代谢产物的制备

1．工程菌GQ175菌株的发酵培养

种子培养基：葡萄糖0.1%，玉米淀粉1.0%，玉米粉1.5%，蛋白胨0.2%，黄豆饼粉1.0%，KNO₃0.05%，CaCO₃0.5%，pH7.0。

发酵培养基：玉米淀粉6.0%，玉米粉1.0%，蛋白胨0.4%，黄豆饼粉2.0%，KNO₃0.01%，(NH₄)₂SO₄0.1%，CaCO₃0.5%，淀粉酶0.025%，pH7.5。

实例1步骤3中获得的绛红色小单孢菌GQ175的发酵。发酵前先用稀释平板法分离出产孢丰富的单菌落转接于斜面培养基，37℃培养10天，挖块接种于种子培养基（装量为50mL／250mL三角瓶），37℃摇床培养36h(转速为250rpm)，深沉培养进入对数生长期时，按10%接种量转接于发酵培养基（装量为50mL/250mL三角瓶），37℃摇床发酵120h(转速为250rpm)。

20000升发酵罐生产，搅拌转速180转/分钟，通气量1：0.5~1.0(M³/M³·min)，培养基，培养温度，接种量比例，发酵时间等，类似于摇瓶发酵。

2代谢产物提取精制

A、粗提

发酵液稀释后分别酸化、碱化后，用732树脂静态吸附6~8小时。收集吸附饱和树脂，用0.01MHCl溶液酸洗饱和树脂，再用无离子水洗涤至中性，而后用0.01%氨水进行碱洗，当流出液达pH9.0以上时，串联到等体积的711树脂柱上，收集树脱液。

B、精制、结晶

洗脱液经薄膜浓缩到约300000ug/mL，用浓硫酸调至pH5.5~6.0，透光度达92%以上，在搅拌下，缓慢向浓缩液中滴加入95%以上乙醇，进行结晶，时间3—4小时，之后经离心分离，85%乙醇溶液淋洗即得湿成品。湿品经真空干燥（真空度500mmHg以上，温度60⁰C，干燥6小时），即得硫酸G418成品。

C、代谢产物检测

薄层色谱分析：展开剂为氯仿：甲醇：氨水=1:1:1（中国药典2010版），振荡混合均匀，检测结果见图5，图5中的1是庆大霉素C复合物，2是工程菌GQ175的代谢产物，3是G418标准品。从图5可以看出，敲除genQ基因后，工程菌不再合成庆大霉素C复合物，GQ175的组分与原始菌株G1008不同，而与G418位移相近。

D、代谢产物质谱分析：工程菌GQ175的代谢产物经安捷伦质谱仪分析，G1008中450.3,464.3和478.3的峰，对应的组分依次是庆大霉素C1a，C2和C1；GQ175中497.3的峰，对应的是G418；峰322.2的是G418的碎片峰；249.1的峰对应的是G418的双电荷峰。因此，从质谱图分析结果可以确定，工程菌代谢产物是单组份G418，不再合成庆大霉素C复合物。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCELISTING

<110>福州大学、福州市鼓楼区荣德生物科技有限公司

<120>一种产G418单组分的工程菌及其应用

<130>8

<160>8

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>1515

<212>DNA

<213>基因genQ的DNA序列

<400>1

tcacagcgagaagtcgggatcgaggccgaactcccggaccaggagctcgcgggccatccg60

cagggcgagggcctggatggtgagggtggggttgacgccgcccgggtagggcatcacgcc120

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gccactgccgatcac1515

<210>2

<211>504

<212>PRT

<213>基因genQ的氨基酸序列

<400>2

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151015

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202530

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354045

IleArgGlnAspSerGlyLeuTrpGluLysThrGlyAsnProTrpSer

505560

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65707580

ArgTyrArgProValAspPheAspAlaGluSerArgLeuGlyArgSer

859095

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100105110

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115120125

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130135140

ThrAlaGluGlyAlaValIleLeuGluAlaAlaArgSerLeuGlyLeu

145150155160

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165170175

ArgLeuProCysAlaGlyGluArgProCysIleSerAsnArgCysAsp

180185190

ArgGlyAlaLysGlyAspAlaLeuThrValPheLeuAspProAlaArg

195200205

LysAlaGlyLeuArgLeuPheAlaGlyLeuLysAlaValArgLeuLeu

210215220

ArgArgAspAlaThrSerValAspGlyValGluCysValArgValAsp

225230235240

AsnGlyAsnArgHisValPheArgAlaArgHisValValValAlaGly

245250255

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260265270

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275280285

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290295300

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305310315320

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325330335

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340345350

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355360365

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370375380

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385390395400

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405410415

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420425430

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435440445

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450455460

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465470475480

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485490495

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500

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>P1

<400>3

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<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>P2

<400>4

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<212>DNA

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<211>22

<212>DNA

<213>P5

<400>7

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<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>P6

<400>8

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Claims (7)

1.一种产G418单组分的工程菌，其特征在于：所述工程菌为绛红色小单孢菌GQ175，该菌株已于2013年12月6日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCCNo.8543。

2.一种如权利要求1所述的产G418单组分的工程菌的制备方法，其特征在于：通过敲除绛红小单孢菌中genQ基因序列，丧失其功能，主要包括以下步骤：

A.genQ同源重组质粒的构建；

B.同源重组质粒导入绛红色小单孢菌G1008；

C.接合子的筛选；

D.工程菌组分的鉴定；

所述genQ同源重组质粒的构建方法为使用两对特定的引物PQ1/PQ2和PQ3/PQ4，以绛红小单胞菌G1008的基因组为模板，通过PCR扩增得到作为同源重组的上游交换臂B1、下游交换臂B2，并将二者插入到质粒中构建得到genQ同源重组质粒，所述的引物PQ1、PQ2、PQ3、PQ4序列如SEQIDNO.3-6所示。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：PCR分别获得genQ基因上下游分子量大约2000bp的两个片段作为交换臂，pKC1139经EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切，回收大片段，并与交换臂B1、B2三个片段连接，得到同源重组质粒pDB303。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述导入是通过EcoliET12657/pUZ8002介导的结合转移方法。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的筛选为先筛选安普霉素抗性菌株，传代后再从中筛选到安普霉素敏感菌株，再从中筛选到不产庆大霉素复合物而单产G418的转化子。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的鉴定为发酵滤液采用薄层层析TLC、新组分采用HPLC-ELSD分析和MS分析。

7.如权利要求1所述的产G418单组分的工程菌在制备抗菌药物和抗生素药物中的应用。