CN102533612A - 拜氏梭菌菌株及其筛选方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株高产丁醇的野生型拜氏梭菌（Clostridiumbeijerinckii），采集样品后，经过富集、初筛、分离和复筛，而获得此菌株。菌株经鉴定结果为：拜氏梭菌（Clostridiumbeijerinckii），其分类命名为拜氏梭菌（Clostridiumbeijerinckii）gxas.28，其保藏登记号为：CCTCCM2011454。本发明利用拜氏梭菌以糖蜜为原料发酵生产丁醇，丁醇产量达9.42～13.11g/L，丁醇占总溶剂的比例高达70%～85%。

Description

拜氏梭菌菌株及其筛选方法和应用

技术领域

本发明涉及微生物筛选和培养及其应用，特别是拜氏梭菌应用于发酵生产丁醇的应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

丁醇作为优良的有机化工原料，主要应用于溶剂、抗氧剂、增塑剂、合成药物精细化工等领域。随着生物质制能源的多元化发展，由于丁醇具有能量密度高，亲水性低，蒸汽压低，辛烷值高等特点，被认为是最有发展潜力的新型液体燃料之一。石油资源的枯竭及原油价格的不断上涨，世界各国对能源安全和资源安全的忧虑日增，所以微生物发酵生产丁醇倍受人们的青睐。

生物丁醇的发酵曾经是世界第二大发酵工业，仅次于乙醇发酵，其主要原料是玉米、小麦和木薯等，丁醇产量约12 g/L。发酵生产丁醇的微生物主要有 Clostridium acetobutylicum、Clostridium beijerinckii、Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum和Clostridiumsaccharobutylicum 4种（Keis S, Shaheen R, Jones D T. Emended descriptions of Clostridium acetobutylicum and Clostridium beijerinckii, and descriptions of Clostridium saccharoperbutylacetonicum sp nov and Clostridium saccharobutylicum sp nov. Microbiol, 2001, (51): 2095-2103）。国内生产生物丁醇主要以玉米为原料，利用丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）发酵生产丁醇，如华北制药华盈有限公司菌种Clostridium acetobutylicum HY1710(刘力强, 杨丽萍, 李立强等. 生物丁醇燃料产业化制造中的问题及发展趋势. 生物产业技术. 2008, 05 (9): 36-44)；中国科学院上海植物生理研究所选育的Clostridium acetobutylicumEA2018菌株（中国发明专利：CN 1143677A）；中国科学院微生物研究所选育的Clostridium acetobutylicumSB-1 CGMCC No.2287菌株（中国发明专利：CN 101250496 B）。而国外使用的菌种主要是拜氏梭菌，利用糖蜜发酵生产丁醇，如Annous B A等对拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii NCIMB8052）进行亚硝基胍诱变，筛选获得优良发酵性能的拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii BA101）（Annous B A, Blaschek H P. Isolation and Characterization of Clostridium acetobutylicum Mutants with Enhanced Amylolytic Activity. Applied and environmental microbiology, 1991, 57(9): 2544-2548）；新西兰David Jones 教授选育的拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii260）能同步糖化发酵木质纤维水解液生产丁醇（Qureshi N, Saha B C, Hectora R E, et a1．Butanol production from wheat straw by simultaneous saccharification and fermentation using Clostridium beijennckii：Part I：batch fermentation. Biomass and Bioenergy, 2008, 32(2): 168-175）。考虑到我国的基本情况以及粮食安全问题，生物丁醇的发展必须遵循“不与人争粮、不与粮争地”的原则。实现原料的多元化与可持续发展非粮生物质为原料生产丁醇。

目前制约丁醇发酵生产的主要因素有：原料成本高、转化率低、产量低和生产强度低。为了解决上述问题，各国科研工作者主要围绕菌种的选育、发酵底物、基因工程改造、发酵工艺的优化和产物分离等方面进行研究。随着基因组学和蛋白质组学的快速发展，丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicumATCC824）菌株的全基因组测序已于2001年完成（NÖlling J, Breton G, Omelchenko M V, et al. Genomesequence and comparative analysis of the solvent producing bacterium Clostridium acetobutylicum. Bacteriol, 2001, 183(6): 4823-4838），遗传操作系统已经成功构建；拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii NCIMB8052）菌株的全基因组测序已于2007年完成，分子遗传操作系统正在构建（Copeland A, Lucas S, Lapidus A, et al. Clostridium beijerinckii NCIMB8052, complete genome. http://www.ncbi.nlm.nih.gov）。国内主要研究丙酮丁醇梭菌的改造，对拜氏梭菌的研究较少。很多研究表明拜氏梭菌的原料谱和适宜pＨ范围更广，在丁醇发酵产业上具有更大的应用潜力。

糖蜜是食糖生产的副产品。我国每年糖蜜产量达400多万吨，以廉价的糖蜜为原料发酵生产丁醇可降低生物丁醇的成本，具有市场竞争力。本发明公开了一株野生型拜氏梭菌丰富了丁醇生产菌株的资源，其主要优势在于该菌株以糖蜜为原料发酵生产丁醇，丁醇产量最高可达13.11 g/L，丁醇比例约78.1%。

发明内容

本发明的目的是提供一株拜氏梭菌菌株及其筛选方法和利用。

本发明所提供的拜氏梭菌是在广西南宁采样分离筛选得到的，命名为gxas.28 CCTCC M 2011454。

以上所述的拜氏梭菌gxas.28 CCTCC M 2011454分离筛选方法如下：

a）采样：从广西南宁采集样品。

b）富集：每个样品各称取1 g置于以糖蜜为主要碳源的培养基中，80℃热激10 min，冷却后37℃静止培养72时间范围 h，气相色谱仪检测发酵产物。

c）初筛：将检测有丁醇产生的发酵液稀释涂布含质量百分含量为1.6%丁醇的TYA平板培养基（TYA培养基：葡萄糖40 g，牛肉膏2 g，酵母粉2 g，蛋白胨6 g，醋酸铵3 g, 磷酸二氢钾0.5 g，七水合硫酸镁 0.2 g，七水合硫酸亚铁0.01 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，pH 6.5，121 ℃高压灭菌20 min。倒平板前添加16 g的正丁醇）置于37℃厌氧培养箱中培养24 h。

d）复筛：从TYA平板上挑选单菌落于糖蜜发酵培养基中，37℃静止发酵60h，筛选丁醇产量较高的菌株进行优化。

e）鉴定：经16S rDNA鉴定本菌株为拜氏梭菌。

本发明的拜氏梭菌gxas.28 CCTCC M 2011454可用于发酵生产丁醇，所述发酵的方法具体是：将拜氏梭菌gxas.28 CCTCC M 2011454接种到发酵培养基中，于37℃，静止发酵60 h，得到丁醇、丙酮和乙醇溶液。

所述发酵培养基的主要碳源为糖蜜的发酵液；所述糖蜜发酵液中糖蜜的质量百分含量为8%～12%。

所述发酵培养基中还含有含有硫酸铵的质量百分含量为0.1%～0.3%，最适量为0.27%；酵母粉的质量百分含量为0.5%～1.5%，最适量为1.2% ；碳酸钙的质量百分含量为0.1%～0.4%，最适量为0.34%；过磷酸钙的质量百分含量为0.02%～0.1%，最适量为0.06%。

所述接种是将生长至对数期的拜氏梭菌gxas.28按照体积百分含量为10%的接种量接种到发酵培养基中。

本发明的拜氏梭菌gxas.28以廉价的糖蜜为原料发酵生产丁醇，丁醇产量最高可达13.11 g/L，丁醇比例达78.1%，本发明的推广应用可以降低生物丁醇的成本。

保藏信息说明

拜氏梭菌gxas.28，目前保藏在中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），地址为湖北省武汉市武汉大学，保藏日期为2011年12月9日，其保藏登记号为：CCTCC M 2011454。

具体实施方式

下列实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例 1 ：拜氏梭菌（ Clostridium beijerinckii ） gxas.28 的分离、筛选与鉴定

　　第一步：采样

从广西壮族自治区市南宁采集样品。

第二步：富集

富集培养基组分：糖蜜100 g（糖蜜含糖量约50%，由广西丰浩糖业有限公司提供），酵母粉5 g，碳酸钙3.0 g，过磷酸钙0.7 g，硫酸铵3.0 g，用蒸馏水定容到1000 mL，pH 6.2～6.5。将以上成份混合均匀，分装于30 mL试管中，胶塞密封，115℃高压灭菌20 min。

每个样品各称取1 g分别置于装有糖蜜发酵培养基的试管中，80℃热激10 min杀死不耐热的细菌和营养体细胞，冷却后置于37℃培养箱静止培养72 h，挑选培养过程中有汽泡产生的发酵醪进行气相色谱仪检测。

第三步：初筛

丁醇平板培养基：葡萄糖40 g，牛肉膏2 g，酵母粉2 g，蛋白胨6 g，醋酸铵3 g, 磷酸二氢钾0.5 g，七水合硫酸镁 0.2 g，七水合硫酸亚铁0.01 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，pH 6.5，121 ℃高压灭菌20 min。倒平板前添加16 g的正丁醇。

将检测有丁醇产生的发酵液稀释涂布含质量百分含量为1.6%丁醇的TYA平板培养基，置于37℃厌氧培养箱中培养24 h。

第四步：复筛

糖蜜发酵培养基：糖蜜100 g，酵母粉5 g，碳酸钙3.0 g，过磷酸钙0.7 g，硫酸铵3.0 g，用蒸馏水定容到1000 mL，pH 6.2～6.5。将以上成份混合均匀，分装于30 mL试管中，胶塞密封，115℃高压灭菌20 min。

从丁醇培养基平板上挑选单菌落于糖蜜发酵培养基中，37℃静止发酵60 h，对发酵醪进行气相色谱检测分析，总共筛选获得产丁醇菌株500余株，通过比较各菌株的丁醇和总容剂产量，最后选定一株利用糖蜜生产丁醇产量较高的菌株命名为gxas.28。

第五步：鉴定

生理生化特征：

检测项目	结果	检测项目	结果
				革兰氏染色	+	甘油	-
细胞形状	杆状	麦芽糖	+
				内生孢子	+	L-乳酸	+
厌氧	+	木糖醇	+
				淀粉水解	-	D-半乳糖	+
D-葡萄糖	+	蔗糖	+
				D-木糖	+	D-山梨醇	-
果糖	+	甘露醇	-
				甘露糖	+	棉子糖	+
D-纤维二糖	+	硝酸盐还原	-

（注：表中“＋”为阳性，“－”为阴性）

16S rDNA鉴定：

对菌株gxas.28 16S rDNA序列扩增，测序分析后将获得的序列在GenBank数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中进行比对。序列分析结果表明：gxas.28与拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）同源性在99%以上。

16S rDNA 序列

AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGATGAAGCTCCTTCGGGAGTGGATTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTCATAGAGGGGAATAGCCTTTCGAAAGGAAGATTAATACCGCATAAGATTGTAGTGCCGCATGGCATAGCAATTAAAGGAGTAATCCGCTATGAGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGAGTGATGACGGTCTTCGAATTGTAAAGCTCGGTCTTCAGGGACGATAATGACGGTACCTGAGGAGGAAGCCACGGCTAACTACGGGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCCGAATTACTGGGCGTAAAGGGAGGCGTAGGTGGATATTTAAGTGGGATGTGAAATACTCGGGCTAAACCTGGGTGCTGCATTCCAAACTGGATATCTAGAGTGCAGGAGAGGAAAGTAGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTAGGAAGAATACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGACTGTAACTGGCACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATACTAGGTGTAGGGGTTGTCATGACCTCTGTGCCGCCGCTAACGCATTAAGTATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATATGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTAGACTTGACATCTCCTGAATTACCCTTAATCGGGGAAGCCTTTCGGGGCAGGAAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCTACCATTTAGTTGAGCACTCTAGCGAGACTGCCCGGGTTAACCGGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCTGGTACAGAGAGATGCTAAACCGTGAGGTGGAGCCAAACTTTAAAACCAGTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGAAACTCGCCTACATGAAGCTGGAGTTGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTGGCAATACCCAAAGTTCGTGAGCTAACGCGCAAGCGAGGCAGCGACCTAAGGTAGGGTCAGCGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACC

综上，该菌株拜氏梭菌形态学、生理生化特征符合梭菌属（Clostridium）特征，且最接近拜氏梭菌，且序列分析表明，菌株gxas.28与拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）同源性在99%以上。由此鉴定，菌株gxas.28属于拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）。

从自然界中成功分离筛选出一种能利用糖蜜为原料发酵高产丁醇的新菌株，拓宽了利用微生物发酵生产丁醇的菌株。

实施例 2 ：拜氏梭菌（ Clostridium beijerinckii ） gxas.28 发酵生产丁醇

平板培养基（TYA培养基）：葡萄糖40 g，牛肉膏2 g，酵母粉2 g，蛋白胨6 g，醋酸铵3 g, 磷酸二氢钾0.5 g，七水合硫酸镁 0.2 g，七水合硫酸亚铁0.01 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，pH 6.5，121 ℃高压灭菌20 min。

种子培养基：葡萄糖40 g，牛肉膏2 g，酵母粉2 g，蛋白胨6 g，醋酸铵3 g，磷酸二氢钾0.5 g，七水合硫酸镁 0.2 g，七水合硫酸亚铁0.01 g，蒸馏水1000 mL，pH 6.5，121℃高压灭菌20 min。

糖蜜发酵培养基： 糖蜜100 g，酵母粉5 g，碳酸钙3.0 g，过磷酸钙0.7 g，硫酸铵3.0 g，用蒸馏水定容到1000 mL，pH 6.2～6.5。将以上成份混合均匀，分装于30 mL试管中，胶塞密封，115℃高压灭菌20 min。

取甘油保藏的拜氏梭菌gxas.28涂布TYA平板培养基置于37℃厌氧培养箱培养20 h，挑单菌落于TYA液体培养基中，37℃静止培养至OD₆₀₀为1.0左右，80℃热激10 min杀死营养体细胞，按照体积百分含量为10%的接种量接种到装200 ml糖蜜发酵培养基的250 ml三角瓶中，37℃静止发酵60 h，将发酵后的发酵液用气相色谱检测。所用糖蜜发酵培养基经响应面分析法优化，丁醇产量最高可达13.11 g/L，总溶剂16.78 g/L，丁醇占总容剂的比例达78.1%。

通过以上实例可以看出野生型拜氏梭菌gxas.28在发酵过程中具有良好的发酵性能，经过发酵条件的优化丁醇产量最高可达13.11 g/L。

拜氏梭菌菌株 DNA 序列表

<110> 广西科学院

<120>拜氏梭菌菌株及其筛选方法和应用

<160> 1

<210> 1

<211> 1577

<212> DNA

<213>拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）

<220>

<221>16S rDNA

<222> （1）…（1474）

<400>

AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGATGAAGCTCCTTCGGGAGTGGATTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTCATAGAGGGGAATAGCCTTTCGAAAGGAAGATTAATACCGCATAAGATTGTAGTGCCGCATGGCATAGCAATTAAAGGAGTAATCCGCTATGAGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGAGTGATGACGGTCTTCGAATTGTAAAGCTCGGTCTTCAGGGACGATAATGACGGTACCTGAGGAGGAAGCCACGGCTAACTACGGGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCCGAATTACTGGGCGTAAAGGGAGGCGTAGGTGGATATTTAAGTGGGATGTGAAATACTCGGGCTAAACCTGGGTGCTGCATTCCAAACTGGATATCTAGAGTGCAGGAGAGGAAAGTAGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTAGGAAGAATACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGACTGTAACTGGCACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATACTAGGTGTAGGGGTTGTCATGACCTCTGTGCCGCCGCTAACGCATTAAGTATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATATGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTAGACTTGACATCTCCTGAATTACCCTTAATCGGGGAAGCCTTTCGGGGCAGGAAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCTACCATTTAGTTGAGCACTCTAGCGAGACTGCCCGGGTTAACCGGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCTGGTACAGAGAGATGCTAAACCGTGAGGTGGAGCCAAACTTTAAAACCAGTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGAAACTCGCCTACATGAAGCTGGAGTTGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTGGCAATACCCAAAGTTCGTGAGCTAACGCGCAAGCGAGGCAGCGACCTAAGGTAGGGTCAGCGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACC。

Claims (7)

1.拜氏梭菌菌株，其分类命名为拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）gxas.28，该菌株保存于中国典型培养物保藏中心，保藏登记号：CCTCC M 2011454。

2.权利要求1所述的拜氏梭菌菌株的筛选方法，其特征在于：将采集的样品通过富集培养，气相色谱仪检测发酵液，经检测有丁醇产生的发酵液稀释涂平板获得单菌落，挑单菌落用试管发酵筛选丁醇产量较高的菌株，具体筛选步骤如下：

a）采样：采集样品70余份；

b）富集：每个样品各称取1 g置于以糖蜜为主要碳源的培养基中，80℃热激10 min，冷却后37℃静止培养72 h，气相色谱仪检测发酵产物；

c）初筛：将检测有丁醇产生的发酵液稀释涂布含质量百分含量为1.6%丁醇的TYA平板培养基，置于37℃厌氧培养箱中培养24 h；

d）复筛：从TYA平板上挑选单菌落于糖蜜发酵培养基中，37℃静止发酵60 h，筛选丁醇产量较高的菌株进行优化。

3. 权利要求1所述的拜氏梭菌gxas.28在发酵生产丁醇中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述发酵丁醇的方法是将拜氏梭菌gxas.28接种到发酵培养基中，于37℃静止发酵60 h，得到丁醇、丙酮和乙醇溶液。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述接种是将生长至对数期的拜氏梭菌gxas.28按照体积百分含量为10%的接种量接种到发酵培养基中。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述发酵培养基是以糖蜜为主要碳源的糖蜜发酵培养基，糖蜜发酵培养基中糖蜜的质量百分含量为8%～12%。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述糖蜜发酵培养基中还含有硫酸铵的质量百分含量为0.1%～0.3%，最适量为0.27%；酵母粉的质量百分含量为0.5%～1.5%，最适量为1.2% ；碳酸钙的质量百分含量为0.1%～0.4%，最适量为0.34%；过磷酸钙的质量百分含量为0.02%～0.1%，最适量为0.06%。