JP2018529361A - クロストリジウム ベイジェリンキー及びその使用、並びにブタノールの製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は微生物技術分野に属するものであり、具体的には、ブタノール製造用クロストリジウム ベイジェリンキー(Clostridium beijerinckii)及びその使用、並びに該クロストリジウム ベイジェリンキーを用いてブタノールの製造方法に関連する。
[背景技術]
[発明の内容]
[生物保蔵]
[発明の詳細な説明]
(1)クロストリジウム ベイジェリンキーを固体培地に接種し、嫌気性条件下で28〜42℃で、12〜48時間培養する;
(2)ステップ(1)で得られたクロストリジウム ベイジェリンキーを種子培地中に接種し、兼気性条件下で28〜42℃で、12〜48時間そのまま置いて培養して種子液を得る;
(3)ステップ(2)で得られた種子液を、2〜20体積%の接種量にて発酵培地中に接種し、兼気性条件下で発酵培養を行う、ことを含む。具体的な発酵培養条件については、前記の説明を参照し、ここではもう贅言しない。
実施例
実施例1
(1)クロストリジウム ベイジェリンキーを固体培地の斜面上に接種し、嫌気性条件下で30℃で、24時間培養した;
(2)ステップ(1)で得られたクロストリジウム ベイジェリンキーを斜面上から2リングを取って振盪フラスコの種子培地中に置き、除酸素剤に加える必要はないし、N2を通して嫌気性環境を維持する必要もなく、35℃で24時間そのまま置いて培養して種子液を得た;
(3)ステップ(2)で得られた種子液を、10体積%の接種量にて5Lの発酵タンクに置かれる3Lの液発酵培地中に接種し、除酸素剤に加える必要はないし、N2を通して嫌気性環境を維持する必要もなく、37℃で発酵培養を行い、撹拌速度は150r/minとし、発酵の進行に伴って発酵液のpH値は先に下がってから上昇し、発酵液のpH値は原始の7.0から6.0まで下がった時に、10MのNaOH溶液を連続的に加えることで、この時点から発酵終了までのこの段階内にある発酵液のpH値を6.0に制御した。測定により、72時間の後、発酵液に残留するグルコース濃度は9.67g/L、アセトン濃度は0.04g/L、エタノール濃度は0.02g/Lとし、ブタノール、酢酸及び酪酸の濃度はそれぞれ10.17g/L、0.56g/L及び0.42g/Lであり、ブタノール収率は28.79%である。
実施例1の方法に従って、異なったのは、それぞれ異なった炭素源と窒素源を採用して培地中のグルコース、ペプトン或いは硫酸アンモニウムを置換した。測定により、72h後に発酵液中のアセトン濃度はいずれも0.1g/Lより小さく、エタノール濃度はいずれも0.1g/Lより小さくなった。残存したグルコース濃度(残糖)、酢酸、酪酸及びブタノールの発酵結果を表2に示す。
実施例1の方法によれば、異なったのは、液培地の組成は以下の通りである:ペプトン10g/L、牛肉エキス6g/L、グルコース45g/L、塩化ナトリウム0.5g/L、硫酸アンモニウム0.9g/L、硫酸鉄0.1g/L、硫酸マグネシウム0.3g/L、塩化カルシウム0.1g/L、リン酸二水素カリウム1g/L及びリン酸水素二ナトリウム2g/L。pH値は7.0とした。
測定により、72時間の後、発酵液に残留するグルコース濃度は10.95g/L、アセトン濃度は0.09g/L、エタノール濃度は0.05g/Lとし、ブタノール、酢酸及び酪酸の濃度はそれぞれ9.33g/L、0.55g/L及び0.47g/Lであり、ブタノール収率は27.4%である。
実施例1の方法によれば、異なったのは、ステップ(3)では、全発酵過程はpH値を制御せず、発酵の進行に伴って発酵液のpH値が先に下がってから上昇し、発酵過程においてpH値が最低4.5まで下がった。測定により、72時間の後、発酵液に残留するグルコース濃度は13.36g/L、アセトン濃度は0.05g/L、エタノール濃度は0.03g/Lとし、ブタノール、酢酸及び酪酸の濃度はそれぞれ8.61g/L、0.496g/L及び0.326g/Lであり、ブタノール収率は27.21%である。
実施例1の方法によれば、異なったのは、ステップ(3)では、発酵液のpH値は元の7.0から5.5まで下がった時に、10MのNaOH溶液を連続的に加えることで、この時点から発酵終了までのこの段階内にある発酵液のpH値を5.5とした。測定により、72時間の後、発酵液に残留するグルコース濃度は9.55g/L、アセトン濃度は0.05g/L、エタノール濃度は0.03g/Lとし、ブタノール、酢酸及び酪酸の濃度はそれぞれ9.92g/L、0.54g/L及び0.32g/Lであり、ブタノール収率は27.98%である。
実施例1の方法によれば、異なったのは、ステップ(3)では、発酵液のpH値は元の7.0から6.5まで下がった時に、10MのNaOH溶液を連続的に加えることで、この時点から発酵終了までのこの段階内にある発酵液のpH値を6.5とした。測定により、72時間の後、発酵液に残留するグルコース濃度は10.41g/L、アセトン濃度は0.07g/L、エタノール濃度は0.04g/Lとし、ブタノール、酢酸及び酪酸の濃度はそれぞれ9.67g/L、0.54g/L及び0.9g/Lであり、ブタノール収率は27.96%である。
実施例1の方法によれば、異なったのは、ステップ(3)では、発酵液のpH値は元の7.0から5まで下がった時に、10MのNaOH溶液を連続的に加えることで、この時点から発酵終了までのこの段階内にある発酵液のpH値を5とした。測定により、72時間の後、発酵液に残留するグルコース濃度は11.15g/L、アセトン濃度は0.08g/L、エタノール濃度は0.04g/Lとし、ブタノール、酢酸及び酪酸の濃度はそれぞれ8.54g/L、0.51g/L及び0.23g/Lであり、ブタノール収率は25.23%である。
実施例1の方法によれば、異なったのは、ステップ(2)では、種子培養においては、完全に密閉する嫌気性ボトルを使用し、嫌気性チャンバーに培地を脱酸素化し、しかも亜ジチオン酸ナトリウムを加えることによって嫌気性ボトル内の酸素分圧を0まで下げさせ、そして嫌気性チャンバーに接種して培養した。ステップ(3)では、発酵タンクの培地に亜ジチオン酸ナトリウムを加えて酸素を除去し、そして全過程でN2を通し嫌気性環境を維持し、全発酵過程はpH値を制御しない。測定により、72時間の後、発酵液に残留するグルコース濃度は5.0g/L、アセトン濃度は0.21g/L、エタノール濃度は0.07g/Lとし、ブタノール、酢酸及び酪酸の濃度はそれぞれ9.98g/L、1.22g/L及び1.46g/Lであり、ブタノール収率は24.95%である。
液培地の組成は以下の通りである:ペプトン10g/L、牛肉エキス6g/L、グルコース40g/L、塩化ナトリウム0.5g/L、硫酸アンモニウム0.9g/L、硫酸鉄0.1g/L、硫酸マグネシウム0.3g/L、塩化カルシウム0.1g/L。pH値は7.0とし、121℃で15min滅菌した。固体培地は、1wt%の寒天を液培地に添加してなったものである。
(1)クロストリジウム ベイジェリンキーを固体培地の斜面上に接種し、嫌気性条件下で30℃で、24時間培養した;
(2)ステップ(1)で得られたクロストリジウム ベイジェリンキーを斜面上から2リングを取って振盪フラスコの種子培地中に置き、除酸素剤に加える必要はないし、N2を通して嫌気性環境を維持する必要はせず、35℃で24時間そのまま置いて培養して種子液を得た;
(3)ステップ(2)で培養された種子液を、10体積%の接種量にて液発酵培地中に接種し、除酸素剤に加える必要はないし、N2を通して嫌気性環境を維持する必要もせず、pHを自然にして、37℃で88時間を発酵した。88時間を発酵した後に、発酵液におけるブタノール濃度は7.5g/Lとなって、アセトンとエタノールの生成物はなく、酢酸及び酪酸の濃度はそれぞれ1.0g/Lと0.6g/Lとなった。
実施例9の方法によれば、異なったのは、それぞれ異なった炭素源と窒素源を採用して培地中のグルコース、ペプトン或いはアンモニウムを置換した。発酵の結果を表3に示す。
5Lの発酵タンクを利用してグルコースを基質にし、初期の培地におけるグルコース濃度は40g/Lである。発酵培地の組成は、実施例9の上で0.1%のリン酸二水素カリウム(1g/L)、0.2%のリン酸水素二ナトリウム(2g/L)、0.004%のp-アミノ安息香酸(0.04g/L)、0.004%のビタミンB1(0.04g/L)と0.0004%のビオチン(0.004g/L)を加えた。積載量は3Lで、攪拌速度150r/min、発酵開始の16hはpHを制御せず、それは自然に下って、16時間の後、10MのNaOH溶液を連続に加えることによってpH値を6.0に調整し、72時間後にグルコースが完全に消費された。測定により、発酵液におけるブタノール、酢酸及び酪酸の濃度はそれぞれ8.25g/L、1.2g/L及び0.8g/Lである。
Claims (11)
- 受託番号CGMCC No.9124であるクロストリジウム ベイジェリンキー(Clostridium beijerinckii)。
- ブタノールの製造における請求項1に記載のクロストリジウム ベイジェリンキーの使用。
- 請求項1に記載のクロストリジウム ベイジェリンキーを、発酵培地中に接種し、発酵培養することでブタノールを製造することを特徴とする、ブタノールの製造方法。
- 前記発酵培養は兼気性条件下で行う、請求項3に記載の方法。
- 前記発酵培養の条件として、発酵温度は20〜42℃、好ましくは28〜42℃であり、発酵時間は48〜120h、好ましくは60〜80hであり、pH値は4〜9、好ましくは5〜7であることを含む、請求項3または請求項4に記載の方法。
- 発酵培地の初期pH値は5.5〜8.5、好ましくは6〜8であり、発酵過程では、発酵液のpH値を5.5〜6.5のいずれかの値まで下がる時に、該時刻から発酵終了までのこの段階内の発酵液のpH値を5.5〜6.5に抑制する、請求項5に記載の方法。
- 前記発酵培地は、炭素源、窒素源、無機塩およびビタミンを含み、前記発酵培地の初期pH値は5.5〜8.5、好ましくは6〜8である、請求項3〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記炭素源はグルコース、キシロース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、マルトース、セロビオース、オリゴグルコースとオリゴキシロースからなる群より選択される一種類もしくは二種類以上であり、好ましくはグルコースおよび/またはキシロースである;
前記窒素源は有機窒素源と無機窒素源を含み、前記有機窒素源は牛肉エキス、酵母エキス、ペプトン、コーンシロップと大豆ミールの加水分解物からなる群より選択される一種類もしくは二種類以上であり、好ましくはペプトンと牛肉エキスである;前記無機窒素源は酢酸アンモニウム、硝酸ナトリウムおよび硫酸アンモニウムからなる群より選択される一種類もしくは二種類以上、好ましくは硫酸アンモニウムである;
前記無機塩はリン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸亜鉄、硫酸鉄、硫酸マグネシウム、塩化カルシウムと硫酸マンガンからなる群より選択される一種類もしくは二種類以上である;
前記ビタミンは、ビタミンB1、ビオチン、p-アミノ安息香酸からなる群より選択される一種類もしくは二種類以上である;
好ましくは、1L当たりの発酵培地で計算すると、前記炭素源の使用量は20〜60gが好ましく、40〜50gがさらに好ましい;前記有機窒素源の使用量は1〜20gが好ましく、10〜18gがさらに好ましい;前記無機窒素源の使用量は0.1〜10gが好ましく、0.5〜5gがさらに好ましい;前記無機塩の使用量は0〜10gが好ましく、2.5〜5gがさらに好ましい;前記ビタミンの使用量は0〜0.2gが好ましく、0.04〜0.12gがさらに好ましいことである、請求項7に記載の方法。 - 1L当たりの発酵培地で計算すると、前記発酵培地は、40〜50gのグルコース、8〜12gのペプトン、4〜8gの牛肉エキス、0.6〜1.2gの硫酸アンモニウム、0.25〜0.75gの塩化ナトリウム、0.05〜0.2gの硫酸鉄、0.15〜0.45gの硫酸マグネシウム、0.05〜0.15gの塩化カルシウム、0.5〜4gのリン酸二水素カリウム、1〜4gのリン酸水素二ナトリウム、0.01〜0.06gのp-アミノ安息香酸、0.01〜0.06gのビタミンB1、および0.001〜0.006gのビオチンである、請求項8に記載の方法。
- 発酵培養する前に、株の活性化や種子培養を順次行うことを含む;
好ましくは、ブタノールの製造方法は、
(1)クロストリジウム ベイジェリンキーを固体培地に接種し、嫌気性条件下で28〜42℃で、12〜48時間培養する;
(2)ステップ(1)で得られたクロストリジウム ベイジェリンキーを種子培地中に接種し、兼気性条件下で28〜42℃で、12〜48時間そのまま置いて培養して種子液を得る;
(3)ステップ(2)で得られた種子液を、2〜20体積%の接種量にて発酵培地中に接種し、兼気性条件下で発酵培養を行うことを含む、請求項3〜9のいずれか一項に記載の方法。 - 前記兼気性条件の実施様態は、培地には除酸素剤を入れずに、培養過程においても、嫌気性環境を維持するN2および/または不活性ガスを通さないことを含む、請求項4または10に記載の方法。
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