CN117844897A - 一种培养基的制备及其在水体毒性比色检测中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种培养基及其在水体毒性比色检测中的应用。所述培养基包括：葡萄糖，蛋白胨，NaCl，牛肉膏和铁盐。该铁盐在水中溶解度不大使得部分铁盐仍与培养后的细菌经过离心、清洗后一起重新悬浮在溶液中持续释放Fe³⁺，从而成功构建一种简单、环境友好、肉眼可见的水体毒性比色检测传感器。

Description

一种培养基的制备及其在水体毒性比色检测中的应用

技术领域

本发明涉及检测方法技术领域，尤其是涉及一种培养基的制备及其在水体毒性比色检测中的应用。

背景技术

随着我国现代化工、农业的快速发展，大量化学品被研制、开发、使用。同时，工业废水，农药等被排放进入水体导致江、河、湖、海水被污染。由于废水中的有些污染物对水环境危害极大，近年来，我国在有毒有害污染物的检测和监测方面愈发重视。2018年起开始实施的《中华人民共和国水污染防治法》第二十五条规定国家要完善和加强水环境质量监测与水污染物排放监测。但是重金属、农药类有机物等有毒化学品在水体中含量低、毒性大，给生物毒性等指标的检测带来一定的难度。

近年来，基于微生物的各种全细胞水体综合毒性检测方法相继被开发出来。其中，水体毒性比色检测由于响应信号肉眼可见，所需检测仪器简单、检测成本低而受到广大科研工作者的青睐。但是，水体毒性比色检测方法较少，现有的方法操作繁琐，使用单通道紫外检测仪检测效率低，很难在实际应用中得到推广。

前期研究工作中我们使用的商品化的海生培养基中含有溶解度不大的铁盐，在细菌培养过程中以及后续离心、清洗、储存过程中该铁盐仍然能够持续释放Fe³⁺，基于该原理我们构建了一种水体毒性比色检测传感器。但是，该海生培养基不适合淡水细菌的培养。淡水细菌枯草芽孢杆菌作为原核生物被毒性检测广泛采用作为受试体。本发明在在传统CM培养基中添加溶解度不大的铁盐，制备得到的培养基用于淡水细菌培养并能够持续释放Fe³⁺构建比色检测传感器。在无毒和有毒情况下，枯草芽孢杆菌与氧化态铁氰化钾反应生成的还原态媒介体亚铁氰化钾的量不同，培养基中持续释放的Fe³⁺与亚铁氰化钾生成的普鲁士蓝(PB)的量也不同，根据蓝色的PB与黄色的铁氰化钾复合得到的绿色颜色的差异来进行水体毒性比色检测。

现有的用于水体毒性检测的比色检测方法的缺点是：(1)制作复合黏土程序繁琐；(2)成本高，需要葡萄糖或者果糖或者半乳糖等、以及乙醇、氨丙基三乙氧基硅烷等化学试剂；(3)黏土固定的铁氰化钾和Fe³⁺容易变质、流失影响检测效果；(4)单通道紫外检测效率低。

因此，开发一种简单、环境友好、高效、肉眼可见的水体毒性比色检测方法是非常必要的。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种水体毒性的检测方法，本发明提供的检测方法简单、环境友好、肉眼可见，同时检测效率高。

本发明提供了一种培养基，包括：

葡萄糖，蛋白胨，NaCl，牛肉膏和铁盐。

优选的，所述葡萄糖，蛋白胨，NaCl，牛肉膏和铁盐的质量比为：20:15:5:0.5:0.001～10；

所述铁盐为柠檬酸铁、柠檬酸铁铵或硫酸铁中的一种或几种。

本发明提供了上述任意一项所述的培养基在水体毒性比色检测中的应用。

本发明提供了一种水体毒性比色检测方法，包括如下步骤：

A)将细菌悬浮液、铁氰化钾和待测水体加入孔板中，混合，反应，得到待测样品；

将细菌悬浮液、铁氰化钾和标准水体加入孔板中，混合，反应，得到标准样品；

B)检测所述标准样品和待测样品的紫外吸收光谱、记录紫外吸收光谱峰值，并计算抑制率和/或IC₅₀值。

优选的，所述细菌为枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。

优选的，所述细菌悬浮液的制备方法具体为：

细菌摇床培养，离心，采用NaCl溶液离心、洗涤，重新悬浮在NaCl溶液中，即得；

所述培养为50～300rpm，15～40℃下培养8～30h；所述离心为3000～10000rpm离心1～20min；所述NaCl浓度为0.1～30％。

优选的，步骤A)所述细菌悬浮液OD₆₀₀＝0.1～20；所述铁氰化钾的浓度为0.5～50mM；

所述反应温度为4～45℃；所述反应时间为1min～120min。

优选的，所述抑制率计算具体为：Inhibition％＝(1-Abs_tox/Abs_con)×100(1)；其中，Abs_tox代表待测样品在690nm处的紫外吸收峰值，Abs_con代表标准样品在690nm处的紫外吸收峰值；

所述IC₅₀值的计算具体为：以待测水体中毒性物质的浓度为横坐标，抑制率做纵坐标绘制曲线，拟合得到IC₅₀。

优选的，所述待测水体中含金属离子为Cd²⁺、Hg²⁺、Zn²⁺、Cr⁶⁺、U⁶⁺、Te³⁺、Co³⁺、Se⁶⁺、Pu^{3 +}、Hg²⁺、Mn⁴⁺、Cd²⁺等，或者有机物3,5-二氯苯酚，甲醛等，或者他们之间二元、三元、多元等复合得到的混合物，或者实际水样；

所述待测水体中毒性物质的浓度为0.001～200mg L^-1；

所述孔板为2～200孔板。

优选的，所述紫外吸收光谱的检测采用酶标仪测试、紫外分光光度计测试、取色软件读取或比色卡检测中的一种或几种；所述检测为检测690nm的紫外吸收光谱峰值或者RGB值；

还包括用肉眼直接观察样品的颜色，通过对比有毒样品与标准样品的颜色差异判断样品有无毒性或毒性大小；或通过RGB取色，电化学测量电流值等方式来得到抑制率，进而判断样品有无毒性或毒性大小。

与现有技术相比，本发明提供了一种培养基及其水体毒性检测中的应用。所述培养基包括：葡萄糖，蛋白胨，NaCl，牛肉膏和铁盐。该铁盐在水中溶解度不大使得部分铁盐仍与培养后的细菌经过离心、清洗后一起重新悬浮在溶液中持续释放Fe³⁺，从而成功构建一种简单、环境友好、肉眼可见的水体毒性检测传感器。

附图说明

图1、两种培养基培养的细菌与铁氰化钾反应后的(A)紫外吸收光谱；(B)样品照片；样品1(11，12，13)为CM培养基培养的细菌与铁氰化钾混合样品，样品2(21，22，23)为CM-Fe培养基培养的细菌与铁氰化钾混合样品；

图2、反应时间优化，(A)10min；(B)20min；(C)25min；(D)30min；

图3、含Cu²⁺废水毒性检测，(A)抑制率曲线；(B)对应样品照片。毒性物质终浓度从上到下分别为：0,0.49,0.98,1.95,3.9,7.8,15.63mg/L；

图4、含Hg²⁺废水毒性检测，(A)抑制率曲线；(B)对应样品照片。毒性物质终浓度从上到下分别为：0,0.25,0.49,0.98,1.95,3.9,7.8,15.63mg/L；

图5、样品照片，(A)培养基中加入柠檬酸铁；(B)培养基中加入硝酸铁；

图6、样品照片，(A)培养基中加入0.5g/L柠檬酸铁；(B)培养基中加入0.0001g/L柠檬酸铁。

具体实施方式

本发明提供了一种培养基的制备及其在水体毒性比色检测中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都属于本发明保护的范围。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

普鲁士蓝：

普鲁士蓝(Prussian blue，PB)是一种常见的六氰合铁酸盐，即亚铁氰化铁，化学式为Fe₄[Fe(CN)₆]₃，是一种配位化合物，可以用来上釉、用作油画染料等。PB因具有独特的电致变色性能及可逆的氧化还原行为，使其有望用于电显色器件、电催化和光谱电化学研究。

培养基：

是指供给微生物、植物或动物(或组织)生长繁殖的，由不同营养物质组合配制而成的营养基质。

比色法：

是通过比较或测量有色物质溶液在特定波长下颜色深度来确定待测组分含量的方法。常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法，前者用眼睛观察，后者用光电比色计测量，两种方法都是以朗伯-比尔定律(见紫外-可见分光光度法)为基础。

RGB色彩模式：

是工业界的一种颜色标准，是通过对红(R)、绿(G)、蓝(B)三个颜色通道的变化以及它们相互之间的叠加来得到各式各样的颜色的，RGB即是代表红、绿、蓝三个通道的颜色，这个标准几乎包括了人类视力所能感知的所有颜色，是运用最广的颜色系统之一。

酶标仪

酶标仪即酶联免疫检测仪。是酶联免疫吸附实验的专用仪器，又称微孔板检测器。可简单地分为半自动和全自动两大类，但其工作原理基本上都是一致的，其核心都是一个比色计，即用比色法来进行分析。测定一般要求测试液的最终体积在250μL以下，用一般光电比色计无法完成测试，因此对酶标仪中的光电比色计有特殊要求。

水体毒性比色检测：

是通过比较待测样品与标准样品溶液颜色差异来判断待测样品是否有毒及毒性大小。

本发明提供了一种培养基，包括：

葡萄糖，蛋白胨，NaCl，牛肉膏和铁盐。

本发明其中一部分优选实施方式中，所述葡萄糖，蛋白胨，NaCl，牛肉膏和铁盐的质量比为：20:15:5:0.5:0.001～10。

具体的，所述铁盐为柠檬酸铁、柠檬酸铁铵或硫酸铁中的一种或几种。

用球磨机将以上混合物磨成粉末状得到新型培养基。优选为采用干式磨矿方式磨细成粉末状。本发明所述球磨的粒径优选为100～2000目。

本发明培养基中常含有各种微量元素，主要包括铁、铜、锌、硒、锰等。铁是一种必需元素，因为铁涉及众多参与DNA复制和细胞代谢的酶，铁缺陷会引起细胞周期停滞在G0或者G1期，甚至使快速分裂的细胞发生凋亡。

本发明提供了任意一项所述的培养基在水体毒性比色检测中的应用。

本发明由于上述培养基在水中不完全溶解使得部分铁盐仍与培养后的细菌经过离心、清洗后一起重新悬浮在溶液中持续释放Fe³⁺，结合酶标仪的使用，从而成功构建一种简单、环境友好、肉眼可见的水体毒性高效比色检测传感器。在水体毒性检测过程中，铁氰化钾被细菌还原得到亚铁氰化钾，亚铁氰化钾与悬浮细菌中持续释放的Fe³⁺反应生成PB，以蓝色的PB和黄色的铁氰化钾通过混合颜色原理得到的绿色物质作为指示剂构建水体毒性比色检测传感器。该发明通过一步混合细菌、铁氰化钾和水样即可实现水体毒性简单、快速、高效比色检测的目的，大大简化了检测程序。

本发明提供了一种水体毒性比色检测方法，包括如下步骤：

A)将细菌悬浮液、铁氰化钾和待测水体加入孔板中，混合，反应，得到待测样品；

将细菌悬浮液、铁氰化钾和标准水体加入孔板中，混合，反应，得到标准样品；

B)检测所述标准样品和待测样品的紫外吸收光谱、记录紫外吸收光谱峰值，并计算抑制率和/或IC₅₀值。

按照本发明，所述细菌悬浮液的制备方法具体为：

细菌摇床培养，离心，采用NaCl溶液离心、洗涤，重新悬浮在NaCl溶液中，即得；

所述培养为50～300rpm，15～40℃下培养8～30h；所述离心为3000～10000rpm离心1～20min；所述NaCl浓度为0.1～30％；优选为0.1～20％；

具体的，所述细菌为枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。

在其中一些具体实施方式中，本发明所述菌种培养更优选具体为：

将枯草芽孢杆菌分别接种到已经灭菌的CM-Fe培养基中，放入恒温摇床中50～300rpm，37℃下培养8～30h。培养后的菌液以3000～10000rpm离心1～20min，然后用0.1～30％NaCl溶液离心、洗涤两次以去除培养基。最后，将枯草芽孢杆菌重新悬浮在0.1～30％NaCl溶液中，并放入0～30℃环境中备用。

将细菌悬浮液、铁氰化钾和待测水体加入孔板中，混合，反应，得到待测样品。

本发明所述待测水体中含金属离子为Cd²⁺、Hg²⁺、Zn²⁺、Cr⁶⁺、U⁶⁺、Te³⁺、Co³⁺、Se⁶⁺、Pu^{3 +}、Hg²⁺、Mn⁴⁺、Cd²⁺等，或者有机物3,5-二氯苯酚，甲醛等，或者他们之间二元、三元、多元等复合得到的混合物，或者实际水样。

所述待测水体中毒性物质的浓度为0.001～200mg L^-1；更优选为0.49～16mg L^-1。

所述孔板为2～200孔板；本发明优选采用96孔板，可以同时测定96个样品，相对于现有技术的单个样品测定，检测效率更高。

所述细菌悬浮液OD₆₀₀＝0.1～20；更优选为0.1～15；最优选为1～10；所述铁氰化钾的浓度为0.5～50mM；更优选为2～20mM；

所述反应温度为4～45℃；更优选为10～40℃；所述反应时间为20min～90min；更优选的，所述反应时间为25min～30min。

在其中一个具体实施方式中，OD₆₀₀＝6、铁氰化钾的浓度为8mM；

本发明培养基培养的细菌与铁氰化钾反应后出现明显的吸收峰。

将细菌悬浮液、铁氰化钾和标准水体加入孔板中，混合，反应，得到标准样品；

为尽可能同时加入样品，使用多通道移液器加样。反应后，用肉眼直接观察样品的颜色，通过对比有毒样品与标准样品的颜色差异判断样品有无毒性或毒性大小。

检测所述标准样品和待测样品的紫外吸收光谱、记录紫外吸收光谱峰值，并计算抑制率和/或IC₅₀值。

本发明所述记录690nm处的紫外吸收峰值。

所有样品均进行三个平行实验，所有比色和电化学实验均在室温下进行。

所述抑制率计算具体为：Inhibition％＝(1-Abs_tox/Abs_con)×100(1)；

其中，Abs_tox代表待测样品在690nm处的紫外吸收峰值，Abs_con代表标准样品在690nm处的紫外吸收峰值；

所述IC₅₀值的计算具体为：以待测水体中毒性物质的浓度为横坐标，抑制率做纵坐标绘制曲线，拟合得到IC₅₀。

所述紫外吸收光谱的检测采用酶标仪测试、紫外分光光度计、取色软件读取或比色卡检测中的一种或几种；所述检测为检测690nm的紫外吸收光谱峰值或者RGB值；

还包括用肉眼直接观察样品的颜色，通过对比有毒样品与标准样品的颜色差异判断样品有无毒性或毒性大小；或通过RGB取色，电化学测量电流值等方式来得到抑制率，进而判断样品有无毒性或毒性大小。

本发明所述紫外吸收光谱的检测采用酶标仪测试、紫外分光光度计、取色软件读取或比色卡检测中的一种或几种。

本发明提出了一种培养基的制备方法及其在水体毒性比色检测中的应用。该新型培养基通过添加溶解度不大的铁盐制得。该铁盐在水中溶解度不大使得部分铁盐仍与培养后的细菌经过离心、清洗后一起重新悬浮在溶液中持续释放Fe³⁺，从而成功构建一种简单、环境友好、肉眼可见的水体毒性比色检测传感器。

本发明的方法使得检测程序得到简化：无需制作黏土，只需一步将培养的细菌、铁氰化钾和水样混合反应即可；成本低：无需葡萄糖，乙醇、氨丙基三乙氧基硅烷等额外化学试剂；环境友好：铁氰化钾浓度低，通过优化铁氰化钾浓度仅为10mM即可达到较好的比色检测效果。

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种培养基的制备及其在水体毒性比色检测中的应用进行详细描述。

实施例1：对比培养基与本发明培养基的比对

(1)本发明培养基(CM-Fe)的制备

称取20g葡萄糖，15g蛋白胨，5g NaCl，0.5g酵母膏，0.001～10g柠檬酸铁，混合，用球磨机干式磨矿方式磨成粉末状即可得到新型培养基CM-Fe。

对比培养基CM配方

20g葡萄糖，15g蛋白胨，5g NaCl，0.5g酵母膏。另外根据经验值用NaOH调节该培养基的pH，使其达到7.4(该pH适合目前使用的原核表达菌种枯草芽孢杆菌的生长)。

(2)液体培养基的配制

分别称取CM和CM-Fe培养基1～100g、1～100g于两只1L烧杯中，加入去离子水分别定容至1L。搅拌、超声混合、溶解。分装于6个500mL的三角烧瓶中(每种培养基3个)，无菌过滤透气膜封口，121℃(98kPa)高温高压灭菌5～40min，冷却备用。

(3)细菌培养

将枯草芽孢杆菌分别接种到已经灭菌的CM、CM-Fe培养基中，放入恒温摇床中50～300rpm，37℃下培养8～30h。培养后的菌液以3000～10000rpm离心1～20min，然后用0.1～30％NaCl溶液离心洗涤两次以去除培养基。最后，将枯草芽孢杆菌重新悬浮在0.1～30％NaCl溶液中，并放入0～30℃环境中备用。

(4)两种培养基培养的细菌与铁氰化钾反应对比

分别取浓度OD₆₀₀＝6的两种细菌悬浮液100μL，去离子水50μL，8mM铁氰化钾50μL于96孔板的孔洞中混合，25℃反应20min。图1.两种培养基培养的细菌与铁氰化钾反应后的(A)紫外吸收光谱；(B)样品照片。样品1(11，12，13)为CM培养基培养的细菌与铁氰化钾混合样品，样品2(21，22，23)为CM-Fe培养基培养的细菌与铁氰化钾混合样品。

如图1A所示，CM培养基培养的枯草芽孢杆菌与铁氰化钾反应后没有出现明显的吸收峰，而加入铁盐的CM-Fe培养基培养的细菌与铁氰化钾反应后出现明显的吸收峰。由图1B也可以明显看出两种培养基培养的细菌与铁氰化钾反应后的颜色差别明显。

实施例2：反应时间优化

实验过程与实施例2类似，分别取OD₆₀₀＝8培养的细菌悬浮液100μL，50μL 2mg/L的Hg²⁺，50μL 20mM铁氰化钾于96孔板的孔洞中混合，标准样品用去离子水代替，分别反应10、20、25和30min。如图2A可以明显看出，反应10min标准样品与待测样品的颜色几乎一致，反应20min后标准样品颜色稍微变绿，但是与待测样品颜色差异不大(图2B)，反应25min后，两者差异变大(图2C)，反应30min后，虽然待测样品颜色也较深，但是两者颜色差异较小(图2D)，因此，25min作为最优的反应时间。图2.反应时间优化，(A)10min；(B)20min；(C)25min；(D)30min。

实施例3：含Cu²⁺废水毒性检测

(1)CM-Fe培养基的制备，液体培养基的配制，细菌培养与实施例1相同。

(2)毒性检测

分别取OD₆₀₀＝2的两种细菌悬浮液100μL，50μL各种浓度的Cu²⁺，50μL 8mM铁氰化钾于96孔板的孔洞中混合，反应20min。读取每条光谱在690nm处的紫外吸收峰值，根据公式(1)计算得到各个浓度毒性物质的抑制率曲线(图3A)，拟合得到IC₂₀＝2.4mg/L。对应样品照片如图3B所示，可以明显看出含不同浓度毒性物质的细菌与铁氰化钾反应后的颜色差别。当Cu²⁺浓度较小时，有毒样品颜色与无毒样品相近。当Cu²⁺浓度较大时，有毒样品基本没有变成绿色，而是只显示出铁氰化钾的黄色。肉眼可以明显分辨出含浓度3.9mg/L Cu²⁺的样品，因此，检测限为3.9mg/L。图3.含Cu²⁺废水毒性检测，(A)抑制率曲线；(B)对应样品照片。毒性物质终浓度从上到下分别为：0,0.49,0.98,1.95,3.9,7.8,15.63mg/L。

培养一段时间后，含标准水样的溶液中铁氰化钾被微生物还原得到亚铁氰化钾，溶液中持续释放的Fe³⁺与亚铁氰化钾反应生成PB，蓝色的PB与过量的黄色的铁氰化钾复合得到绿色。而当水样含有毒性物质时，毒性物质会抑制微生物的活性，从而导致被微生物还原得到的亚铁氰化钾的量减少，进而溶液中持续释放的Fe³⁺与亚铁氰化钾反应生成的PB的量相应减少，蓝色的PB与过量的黄色的铁氰化钾复合得到的绿色变浅。

实施例3：水中Hg²⁺的毒性检测

(1)CM-Fe培养基的制备，液体培养基的配制，细菌培养与实施例1相同。

(2)毒性检测

实验过程与实施例2类似，只是毒性物质由Cu²⁺变为Hg²⁺。图4A为抑制率曲线，图4B为对应样品照片，由图可见检测限为0.49mg/L。

图4.含Hg²⁺废水毒性检测，(A)抑制率曲线；(B)对应样品照片。毒性物质终浓度从上到下分别为：0,0.25,0.49,0.98,1.95,3.9,7.8,15.63mg/L。

对比例1：基础培养基中加入柠檬酸铁与硝酸铁的对比

葡萄糖，蛋白胨，NaCl，牛肉膏基础培养基中加入两种铁盐得到不同的新型培养基：加入柠檬酸铁得到的培养基CM-Fe(1)与加入硝酸铁得到的培养基CM-Fe(2)。在两种培养基中接种培养枯草芽孢杆菌，通过离心、清洗、重新悬浮后加入20mM铁氰化钾，可以观察到加入柠檬酸铁得到的培养基CM-Fe(1)培养的细菌加入铁氰化钾样品变绿(图5A)，而CM-Fe(2)培养的细菌加入铁氰化钾样品不变绿色(图5B)。图5.样品照片，(A)培养基中加入柠檬酸铁；(B)培养基中加入硝酸铁。

对比例2：基础培养基中加入不同量的柠檬酸铁的对比

葡萄糖，蛋白胨，NaCl，牛肉膏基础培养基中加入不同量的柠檬酸铁得到的不同新型培养基：加入0.5g/L柠檬酸铁得到的培养基CM-Fe(3)与加入0.0001g/L柠檬酸铁得到的培养基CM-Fe(4)。在两种培养基中接种培养枯草芽孢杆菌，通过离心、清洗、重新悬浮后加入10mM铁氰化钾，可以观察到培养基CM-Fe(3)培养的细菌加入铁氰化钾样品变绿(图6A)，用CM-Fe(4)培养的细菌加入铁氰化钾样品不变绿色(图6B)。图6.样品照片，(A)培养基中加入0.5g/L柠檬酸铁；(B)培养基中加入0.01g/L柠檬酸铁。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种培养基，其特征在于，包括：

葡萄糖、蛋白胨、NaCl、牛肉膏和铁盐。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述葡萄糖，蛋白胨，牛肉膏和铁盐的质量比为：20:15:5:0.5:0.001～10；

所述铁盐为柠檬酸铁、柠檬酸铁铵或硫酸铁中的一种或几种。

3.权利要求1～2任意一项所述的培养基在水体毒性比色检测中的应用。

4.一种水体的水体毒性比色检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

A)将细菌悬浮液、铁氰化钾和待测水体加入孔板中，混合，反应，得到待测样品；

将细菌悬浮液、铁氰化钾和标准水体加入孔板中，混合，反应，得到标准样品；

B)检测所述标准样品和待测样品的紫外吸收光谱、记录紫外吸收光谱峰值，并计算抑制率和/或IC₅₀值。

5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述细菌为枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌。

6.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述细菌悬浮液的制备方法具体为：

细菌摇床培养，离心，采用NaCl溶液离心、洗涤，重新悬浮在NaCl溶液中，即得；

所述培养为50～300rpm，15～40℃下培养8～30h；所述离心为3000～10000rpm离心1～20min；所述NaCl浓度为0.1～30％。

7.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤A)所述细菌悬浮液OD₆₀₀＝0.1～20；所述铁氰化钾的浓度为0.5～50mM；

所述反应温度为4～45℃；所述反应时间为1min～120min。

8.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述抑制率计算具体为：Inhibition％＝(1-Abs_tox/Abs_con)×100(1)；其中，Abs_tox代表待测样品在690nm处的紫外吸收峰值，Abs_con代表标准样品在690nm处的紫外吸收峰值；

所述IC₅₀值的计算具体为：以待测水体中毒性物质的浓度为横坐标，抑制率做纵坐标绘制曲线，拟合得到IC₅₀。

9.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述待测水体中含金属离子为Cd²⁺、Hg²⁺、Zn²⁺、Cr⁶⁺、U⁶⁺、Te³⁺、Co³⁺、Se⁶⁺、Pu³⁺、Hg²⁺、Mn⁴⁺、Cd²⁺等，或者有机物3,5-二氯苯酚，甲醛，或者他们之间二元、三元、多元等复合得到的混合物，或者实际水样；

所述待测水体中毒性物质的浓度为0.001～200mg L^-1；

所述孔板为2～200孔板。

10.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述紫外吸收光谱的检测采用酶标仪测试、紫外分光光度计、取色软件读取或比色卡检测中的一种或几种；所述检测为检测690nm的紫外吸收光谱峰值或者RGB值；

还包括用肉眼直接观察样品的颜色，通过对比有毒样品与标准样品的颜色差异判断样品有无毒性或毒性大小；或通过RGB取色，电化学测量电流值等方式来得到抑制率，进而判断样品有无毒性或毒性大小。