KR100986733B1 - 증진된 부탄올 내성 및 부탄올 고생산 균주의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 증진된 부탄올 내성 및 부탄올 고생산 균주의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 클로스트리디움 베이저링키(Clostridium beijerinckii) NCIMB 8052 야생형 균주를 돌연변이 시킨 후, 세포막 합성저해 화학물질에 내성을 갖으며, 고농도로 부탄올을 생산할 수 있는 균주를 스크리닝하여 선별된, 부탄올 내성 및 부탄올 고생산 균주에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 부탄올 내성 및 부탄올 고생산 균주는 바이오 부탄올 상업화 기술에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

부탄올, 클로스트리디움 베이저링키, 돌연변이, 대량생산, 바이오 부탄올

Description

증진된 부탄올 내성 및 부탄올 고생산 균주의 제조방법{Method of preparing microorganism producing butanol with elevated butanol tolerance}

본 발명은 증진된 부탄올 내성 및 부탄올 고생산 균주의 제조방법에 관한 것이다.

최근 전 세계적인 국제원유 가격 상승에 의해 수송용 연료인 휘발유를 대체할 수 있는 대체에너지원의 개발이 가속되고 있다. 이에 미국 및 브라질을 중심으로, 전분당 또는 원당을 이용한 바이오에탄올 생산이 2007년 말 기준 100조 갤런을 넘어서며, 점차 그 시장이 확대되고 있다. 또한 유럽 및 동남아시아를 중심으로, 기존의 원유 유래 경유를 대체하기 위한, 식물성 오일을 원료로 하는 바이오디젤도 급속히 성장하고 있다.

바이오에탄올과 더불어 최근 다양한 대체에너지원에 대한 관심이 증가하고 있는데, 그중 가장 대표적인 것이 부탄올이다. 부탄올은 연료로서 에탄올보다 많은 장점을 가진다. 먼저 에너지 함량이 에탄올보다 월등히 높아 거의 휘발유 수준에 근접하고, 증기압이 낮아 휘발성이 적으며, 흡습성이 낮고, 부식성이 덜해서 기존의 가솔린 수송 인프라인 파이프라인을 이용한 전송이 가능하다. 이러한 연료로서의 부탄올의 장점은, 현재까지 기술 면에서 에탄올에 비해 열세에 있지만 차세대 대체에너지로서 많은 관심을 불러일으키고 있다. 부탄올은 에탄올과 더불어 가장 오래된 미생물 발효 산물의 하나로, 1861년 파스퇴르에 의해 대사특성이 알려진 클로스트리디움(Clostridium) 속 미생물에 의해 아세톤, 부탄올 및 에탄올이 동시에 생성되므로 ABE 발효라고 일컬어져 왔다. 부탄올 발효의 경우 1950년대까지는 석유화학대비 경제성을 확보하고 있었으나 이후 석유화학의 급속한 발전으로 더 이상 경쟁력을 상실하게 되었다. 하지만 1990년대부터 미래의 대체에너지원으로서 관심이 재조명되면서 많은 연구개발이 진행되고 있다.

부탄올 고생산 균주개발의 성과를 살펴보면, 기존의 ABE 발효로 잘 알려진 클로스트리디움속 미생물을 활용한 연구가 가장 많은데, 미국 일리노이 대학의 Hans Blaschek 그룹은 화학적 돌연변이 및 2-디옥시글루코오즈(2-deoxyglucose)라는 화학물질에 내성인 균주를 찾는 과정을 통해, 아밀로스 분해능이 우수한 부탄올 고생산 균주를 개발하였다(Hans Blaschek et al ., Appl . Environ . Microbiol . 57(9):2544-2548, 1991). 상기 아밀로스 분해능이 우수한 균주는 클로스트리디움 베이저링키(Clostridium beijerinckii) BA101로 명명되었으며, 현재까지 20 g/ℓ 수준의 부탄올을 생산하여 가장 우수한 부탄올 발효를 보인 균주로 보고되었다(미국 등록 특허 제 6358717호). 상기 연구그룹은 이와 같은 균주개발 연구와 더불어 가스스트리핑(Gas Stripping)을 이용한 추출 발효 공정개발, P2 배지 개발 등 부탄 올 생산과 관련된 다양한 연구개발을 수행해 오고 있다. 또한 미시간 생물공학 연구소(Michigan Biotechnology Institute) 그룹도 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutyricum) ATCC 824 균주를 이용하여 화학적 변이법에 의한 새로운 균주를 개발하여 보고한바 있다(미국 등록 특허 제 5192673호).

2001년에 대표적인 야생 균주인 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 ATCC 824의 전체 염기서열이 밝혀진 후(Nolling J et al ., J. Bacteriol . 183(6):4823-4838, 2001), 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조된 새로운 균주들도 다수 보고되고 있다. 대표적인 연구그룹으로는 미국 노스웨스턴 대학의 Papoutsakis 그룹이 있는데, 이들은 부탄올 생산에 유리한 유전자를 안티센스 RNA, 게놈 DNA 라이브러리를 이용하여 발굴함으로써 새로운 가능성을 보여주었다. 또한 Rice 대학의 Bennett 그룹도 재조합 DNA 기술을 이용하여 유기산과 부탄올의 생산과의 상관성에 대한 연구를 다수 진행하였다(Scotcher MC et al ., Appl . Environ . Microbiol . 71(4):1987-1995, 2005).

최근에는 기존의 부탄올 생산 균주들이 여전히 낮은 농도의 부탄올을 생산하는 한계점을 인식하고 대장균이나 다른 균주를 부탄올 생산 균주로 활용하고자 하는 연구가 많이 진행되고 있다. 대표적으로는 DuPont사의 경우 클로스트리디움 균주의 부탄올 생합성 대사경로의 유전자를 전부 클로닝하여 이를 대장균(국제공개특허 제 2007/041269호)이나 락토바실러스(Lactobacillus) 등의 다른 부탄올 내성이 높은 균주(미국 공개 특허 제 2008-0124774호)에 도입함으로써 신규 재조합 균주를 개발하고자 노력하고 있으나, 여전히 발효농도는 매우 미미한 수준으로 파악된다. 또한 최근에 UCLA의 Liao 그룹은 대장균의 아미노산 대사경로와 2-케토산 디카복실아제(2-ketoacid decarboxylase), 알콜 디하이드로게나제(alcohol dehydrogenase)를 결합시켜 새로운 경로의 부탄올 대사경로를 설계한 균주를 보고하였다(Atsumi et al ., Nature 451(3):86-90, 2008). 하지만 실제 부탄올의 생성수준은 역시 미미한 수준이다.

1980년대에 클로스트리디움 속 미생물에 대한 부탄올의 영향에 대해서 많은 연구가 진행되었다. 주요한 영향으로는 부탄올이 증가하면 세포막의 구성성분 중 포화 아실기가 불포화 아실기에 비해 증가한다는 보고가 있으며(Vollherbst-Schneck K et al., Appl . Environ . Microbiol . 47(1):193-194, 1984), 이러한 결과와 비슷한 이유로 외부에서 올레인산(Oleic acid), 엘라이딘산(Elaidic acid) 등을 첨가할 경우 부탄올에 대한 내성이 증가한다는 보고가 있다(Baer SH et al., Appl . Environ. Microbiol . 53(12):2854-2861, 1987). 또한 클로스트리디움 속에서 성장억제를 주는 농도로 부탄올 생성이 증가하여, 세포내 pH의 항상성 유지가 어려워지고, 세포내 에너지원인 ATP 수준이 낮아지며, 주 탄소원인 포도당 흡수속도가 낮아져서 미생물이 더 이상 성장하지 못하게 한다고 보고되어 있다(Bowles LK & Ellefson WL, Appl . Environ . Microbiol . 50(5):1165-1170, 1985). 하지만 이러한 부탄올의 클로스트리디움속 미생물의 세포막이나 생리적인 영향에 대한 다양한 연구에도 불구하고, 이러한 생리적인 특성을 개선하여 신규 균주개발에 적용하여 성공한 사례는 아직까지 보고되고 있지 않다.

상기 연구개발 동향에서 살펴본 바와 같이 균주개발의 다양한 접근전략을 통 해서도 여전히 부탄올의 농도는 20 g/L 수준에 머물러 있다. 또한, 부탄올의 경우 대체에너지로서의 효용성에 비해 부탄올 자체의 독성에 의해 고농도 발효가 어려운 상황이다. 이를 극복하기 위해 가스추출법 또는 막을 이용한 투과증발 등 공정측면에서 다양한 연구가 진행되고 있으나, 상업화 적용까지는 많은 어려움이 예상되므로, 부탄올에 대한 내성이 증진된 고농도 발효가 가능한 생산균주를 개발하는 것이 부탄올의 상업적 생산을 위한 가장 효율적인 방법이라 할 수 있다.

이에 본 발명자들은 기존의 ABE 발효로 잘 알려진 클로스트리디움속 미생물의 부탄올 내성을 증진하기 위해, 상기 미생물에 화학적 돌연변이를 수행한 후, 세포막 대사를 억제하는 화학물질인 페니실린 및 하이드록실아민에 대한 내성을 갖으며, 고농도로 부탄올을 생산할 수 있는 균주를 스크리닝하였고, 상기 균주의 부탄올 생산을 위한 배양 과정을 최적화하여 고농도의 부탄올을 생산할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 수 개의 시료내 부탄올 함량을 동시에 측정할 수 있는 측정 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 부탄올 내성 및 부탄올 고생산 균주의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법으로 제조된 부탄올 내성 및 부탄올 고생산 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법으로 제조된 부탄올 내성 및 부탄올 고생산 균주를 이용한 부탄올 대량 생산방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) 0 내지 1 g/ℓ의 복수의 농도의 부탄올 표준 용액, 부탄올에 기질특이성을 갖는 알콜 디하이드로게나제(alcohol dehydrogenase), 반응완충용액 및 조효소 NAD+를 혼합한 반응액을 반응시키는 단계;

2) 단계 1)의 반응액의 흡광도를 340 ㎚에서 측정하여 표준 곡선을 그리는 단계;

3) 부탄올을 포함할 것으로 예상되는 시료를 이용하여 단계 1)의 반응을 수행하는 단계;

4) 단계 3)의 반응액의 흡광도를 340 ㎚에서 측정하는 단계;

5) 단계 4)의 측정값을 단계 2)의 표준 곡선과 비교하여, 부탄올 함량을 계산하는 단계를 포함하는 시료내 부탄올 함량 측정 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 클로스트리디움 베이저링키(Clostridium beijerinckii) NCIMB 8052 야생형 균주를 돌연변이 시키는 단계;

2) 단계 1)에서 생존한 변이 균주들을 세포막 합성저해 화학물질이 포함된 고체배지에서 배양하는 단계;

3) 단계 2)에서 생존한 상기 화학물질에 내성을 갖는 변이 균주들을 액체 배지로 옮겨 혐기성 조건에서 배양하여 부탄올을 생산하는 단계; 및,

4) 단계 3)의 배양 상등액을 수득하여 생성된 부탄올 생산량을 상기 부탄올 함량 측정방법으로 측정하고, 부탄올 생산량이 높은 변이 균주를 선별하는 단계를 포함하는 부탄올 내성 및 부탄올 고생산 균주의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조하여 기탁번호 KCTC 11731 BP로 기탁 된 부탄올 내성 및 부탄올 고생산 균주를 제공한다.

아울러, 본 발명은 1) 상기 방법으로 제조된 부탄올 내성 및 부탄올 고생산 균주를 종배양하는 단계;

2) 단계 1)의 종배양액의 600 ㎚에서의 흡광도가 1.5 내지 5에 도달하면 pH 6.0 내지 7.0의 본배양 배지에, 종배양액을 10 내지 17%(v/v)로 접종하는 단계;

3) 단계 2)의 접종액을 혐기성 조건에서 15 내지 20시간 동안 본배양하는 단계; 및,

4) 단계 3)의 본배양액의 pH를 4.8 내지 5.2로 조정한 후, 혐기성 조건에서 26 내지 38시간 동안 배양하는 단계를 포함하는 부탄올 대량 생산방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은

1) 0 내지 1 g/ℓ의 복수의 농도의 부탄올 표준 용액, 부탄올에 기질특이성을 갖는 알콜 디하이드로게나제(alcohol dehydrogenase), 반응완충용액 및 조효소 NAD+를 혼합한 반응액을 반응시키는 단계;

2) 단계 1)의 반응액의 흡광도를 340 ㎚에서 측정하여 표준 곡선을 그리는 단계;

3) 부탄올을 포함할 것으로 예상되는 시료를 이용하여 단계 1)의 반응을 수행하는 단계;

4) 단계 3)의 반응액의 흡광도를 340 ㎚에서 측정하는 단계;

5) 단계 4)의 측정값을 단계 2)의 표준 곡선과 비교하여, 부탄올 함량을 계산하는 단계를 포함하는 시료내 부탄올 함량 측정 방법을 제공한다.

상기 단계 1)의 반응완충용액은 50 mM Tris-HCL(pH 8.0)이며, 단계 4)의 흡광도 측정값이 0.8 이상인 경우, 시료의 흡광도가 0.8 이하가 될 때까지 희석하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 효모 유래 알콜 디하이드로게나제를 사용하였으나, 이에 한정되는 것은 아니며 부탄올에 기질특이성을 갖는 알콜 디하이드로게나제는 모두 사용할 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 0 내지 1 g/ℓ의 복수의 농도의 부탄올 표준용액 20 ㎕를 10 ㎕의 효모 유래 알콜 디하이드로게나제[1 ㎎/㎖(Tris-HCl pH 8.0)], 50 ㎕의 반응 완충용액[50 mM Tis-HCl(pH 8.0)] 및 20 ㎕의 조효소 NAD+과 혼합한 후, 멸균 증류수를 이용하여 반응액을 200 ㎕로 조정하고, 상기 반응액을 37℃에서 10분간 반응시킨 후, 340 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, 알콜 디하이드로게나제가 부탄올에 대해서 기질선택성을 가지는 것을 확인하였고, R²이 0.9972인 부탄올 농도와 우수한 상관성을 갖는 표준곡선을 작성하였다(표 3 및 도 2 참조). 이에, 본 발명의 알콜 디하이드로게나제를 이용한 방법은 시료내 부탄올 함량 측정에 유용하게 이용될 수 있다.

부탄올 농도 분석에 일반적으로 사용되는 가스크로마토그래피법은 시료 1개당 약 20분이 소요되어, 96웰 플레이트를 이용하여 배양한 변이 균주 라이브러리의 부탄올 생산성을 측정하기 위해서는 플레이트당 약 32시간이 소요된다. 따라서 단기적으로 우수 균주를 선별해 내기 위해서는 선택적인 고속 스크리닝 방법(HTS, High Throughput Screening)이 디자인되어야 하지만, 이전까지 부탄올 생산을 확인 할 수 있는 고속 스크리닝 방법은 개발된 바 없다.

상기 알콜 디하이드로게나제는 에탄올에 대한 기질선택성이 높은 효소로, 본 발명의 실시예를 통해, 부탄올에 대한 기질 선택성을 확인하였다. 본 발명의 알콜 디하이드로게나제는 부탄올을 기질로하여 NAD+ 조효소을 환원시킴으로써 NADH을 생성하게 된다. 상기 NADH의 양을 340 ㎚에서 측정함으로써 총 96개의 시료를 15분 이내에 분석할 수 있었다.

본 발명의 방법은 부탄올과 함께 생성될 수 있는 에탄올에도 반응할 수 있으나, 본 발명의 구체적인 실시예에서 에탄올 생산이 비교적 균일한 것(도 3 참조)과 에탄올 존재하에서도 알콜 디하이드로게나제가 부탄올에 대해서 기질특이성을 가지는 것을 확인하였다(표 4 참조). 이에, 본 발명의 방법을 이용하여 유의성 있게 부탄올 고생산 균주를 선별할 수 있는 것으로 확인되었다.

또한, 본 발명은

1) 클로스트리디움 베이저링키(Clostridium beijerinckii) NCIMB 8052 야생형 균주를 돌연변이 시키는 단계;

2) 단계 1)에서 생존한 변이 균주들을 세포막 합성저해 화학물질이 포함된 고체배지에서 배양하는 단계;

3) 단계 2)에서 생존한 상기 화학물질에 내성을 갖는 변이 균주들을 액체 배지로 옮겨 혐기성 조건에서 배양하여 부탄올을 생산하는 단계; 및,

4) 단계 3)의 배양 상등액을 수득하여 생성된 부탄올 생산량을 상기 부탄올 함량 측정방법으로 측정하고, 부탄올 생산량이 높은 변이 균주를 선별하는 단계를 포함하는 부탄올 내성 및 부탄올 고생산 균주의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 클로스트리디움 베이저링키(Clostridium beijerinckii) NCIMB 8052 세포에 돌연변이 유발을 위한 알킬레이팅 화학물질인 NTG(N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidine)를 처리 후, 생존한 미생물로 구성된 돌연변이 균주 라이브러리를 제조한 후, 상기 라이브러리로부터 세포막 생성억제 화학물질인 페니실린 G와 하이드록실아민에 내성을 갖는 균주 820개를 선별하였다. 상기 내성 변이 균주 820개를 콜로니 피킹장치로 거품 방지제를 함유하는 배지를 포함하는 96웰 플레이트에 접종하여 혐기적 조건에서 배양한 후, 상기 알콜 디하이드로게나제를 이용한 본 발명의 부탄올 측정 방법을 이용하여 기존 모균주 대비 45% 이상 부탄올 생산량이 개선된 최우수 균주를 선별하였다(표 5 참조). 상기 균주는 한국생물공학연구원 생물자원센터에 2008년 7월 28일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC 11371 BP를 부여받았다. 이에 본 발명의 방법은 부탄올 내성 및 부탄올 고생산 균주의 제조에 유용하게 이용될 수 있다.

상기 단계 1)의 돌연변이는 돌연변이 유발물질 처리에 의한 화학적 돌연변이법, UV 처리에 의한 물리적 변이법 및 유전공학 조작에 의한 돌연변이 등에 의해 수행될 수 있고, 상기 돌연변이 유발물질에는 NTG(N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidine), EMS(ethyl methane sulfonate) 및 트리에틸렌 멜라 민(triethylene melamine) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 단계 2)의 세포막 합성저해 화학물질은 페니실린 또는 하이드록실아민 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

아울러, 부탄올 발효의 경우 초기 유기산 생성단계에서 다량의 거품이 발생할 수 있으므로, 상기 단계 3)의 액체 배지는 추가로 거품 방지제를 포함함으로써, 우수 균주에 의해 거품이 다량발생하여 넘치는 상황을 대비할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조하여 기탁번호 KCTC 11731 BP로 기탁 된 부탄올 내성 및 부탄올 고생산 균주를 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 방법으로 기존 모균주 대비 45% 이상 부탄올 생산량이 개선된 최우수 균주인 CBP-381 균주를 선별하였으며(표 5 참조), 이를 한국생물공학연구원 생물자원센터에 2008년 7월 28일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC 11371 BP를 부여받았다.

본 발명의 부탄올 내성 및 부탄올 고생산 균주는 세포막 생성억제 화학물질인 페니실린과 하이드록실아민에 내성을 갖고, 부탄올을 고농도로 생산할 수 있으므로, 부탄올 대량 생산에 유용하게 이용될 수 있다.

아울러, 본 발명은

1) 상기 방법으로 제조된 부탄올 내성 및 부탄올 고생산 균주를 종배양하는 단계;

2) 단계 1)의 종배양액의 600 ㎚에서의 흡광도가 1.5 내지 5에 도달하면 pH 6.0 내지 7.0의 본배양 배지에, 종배양액을 10 내지 17%(v/v)로 접종하는 단계;

3) 단계 2)의 접종액을 혐기성 조건에서 15 내지 20시간 동안 본배양하는 단계; 및,

4) 단계 3)의 본배양액의 pH를 4.8 내지 5.2로 조정한 후, 혐기성 조건에서 26 내지 38시간 동안 배양하는 단계를 포함하는 부탄올 대량 생산방법을 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 부탄올 내성 및 부탄올 고생산 KCTC 11371 BP 기탁균주를 이용하여 부탄올을 대량생산할 수 있는 최적 배양 조건을 확립하고자, 종배양된 상기 기탁균주를 본배양 배지에 접종할 시기 및 본배양 배지에 대한 종배양액의 최적 부피비를 확인한 결과, 대수성장기 초기인 흡광도가 2일 때 본배양 배지에 대한 종배양액의 부피비가 15%가 되도록 접종하는 것이, 본 발명의 내성 변이 균주의 부탄올 발효에 가장 효과적임을 확인하였다(표 6 및 7 참조).

또한, 부탄올과 같이 세포막에 많은 영향을 주는 대사물질의 생산에 있어 삼투압 보호제를 사용하는 경우 발효성적의 향상에 도움을 받을 수 있다. 이에 본 배양 배지에 프롤린, 콜린 및 베테인 등의 삼투압 보호제를 함유할 경우 상기 부탄올 생산이 향상될 수 있음을 확인하였는데, 특히 프롤린의 경우, 1.0 g/ℓ; 콜린의 경우, 1.0 g/ℓ; 및, 베테인의 경우, 1.0 g/ℓ의 농도로 포함하는 것이 가장 효과적이었다(표 8 참조).

또한, 상기 본 배양 배지의 pH는 6.5로 조절되는 것이 최적으로 확인되었다 (표 9 참조). 부탄올 발효시 배양액의 초기 pH 조절은 매우 중요한 공정변수이다. 일반적으로 클로스트리디움속 미생물의 경우 포도당을 이용하여 발효를 진행하는 경우 중성 pH 수준에서는 유기산 축적이 주된 대사특성을 이루고, 배양이 진행되면서 배지 내의 산성도가 높아지면 부탄올을 비롯한 유기용매를 생산하는 단계로 전환되는 특성을 보인다(Papoutsakis et al., Bioenergy Chapter 25:323-334, 2008, ASM Press). 따라서 부탄올 생산 균주의 경우 발효과정에서 부탄올의 전구체인 부틸산의 최대생산과 부탄올으로의 효율적인 전환을 위해서는 발효과정에서의 배양 배지의 초기 pH 조절 및 본배양중의 pH 조절이 필요하다. 이에, 상기 본배양중의 본배양액의 pH 조정 시점 및 적정 pH를 확인한 결과, 본배양 17시간 후 pH를 5.0으로 조정할 경우, 본 발명의 내성 변이 균주의 부탄올 발효에 가장 효과적임을 확인하였다(표 11 및 표 10 참조).

상기 KCTC 11371 BP 기탁균주를 상기 최적화한 배양조건에서 배양한 후, 모균주인 클로스트리디움 베이저링키 NCIMB 8052를 최적화한 배양조건에서 배양한 결과와 비교하면, 모균주는 약 10.7 g/ℓ의 부탄올을 생산하였고, 상기 KCTC 11371 BP 기탁균주는 14.8 g/ℓ의 부탄올을 생산하였다. 즉, 약 38.3% 이상 생산성이 향상한 것을 확인하였다.

이에 본 발명의 방법은 상기 KCTC 11371 BP 기탁균주를 이용한 부탄올의 대량생산에 유용하게 이용될 수 있다.

상기 단계 1)의 부탄올 내성 및 부탄올 고생산 균주는 기탁번호 KCTC 11731 BP로 기탁된 것이 바람직하다. 단계 2)의 흡광도는 1.5 내지 5이며, 바람직하게는 2이다. 또한, 단계 2)의 본배양 배지는 추가로 삼투압 보호제를 포함할 수 있으며, 상기 삼투압 보호제에는 프롤린, 콜린 및 베테인 등이 있을 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 프롤린은 0.8 내지 1.7 g/ℓ의 농도로 포함되는 것이 바람직하며, 1.0 g/ℓ의 농도로 포함되는 것이 더욱 바람직하다. 상기 콜린은 0.3 내지 1.7 g/ℓ의 농도로 포함되는 것이 바람직하며, 1.0 g/ℓ의 농도로 포함되는 것이 더욱 바람직하다. 상기 베테인은 0.8 내지 1.5 g/ℓ의 농도로 포함되는 것이 바람직하며, 1.0 g/ℓ의 농도로 포함되는 것이 더욱 바람직하다.

상기 단계 2)의 부피비는 10 내지 17%(v/v)로 접종하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 15%(v/v)이다. 또한, 단계 2)의 배양시간은 15 내지 20시간이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 17시간이다. 단계 4)의 본배양액을 pH 4.8 내지 5.2로 조정하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 pH 5.0이다.

본 발명의 방법에 의해 제조된 부탄올 내성 및 부탄올 고생산 균주는 바이오 부탄올 상업화 기술에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 화학적 돌연변이에 의한 변이 균주 라이브러리 제조

<1-1> 종배양

4℃에서 포자상태로 보관중인 모균주인 클로스트리디움 베이저링키(Clostridium beijerinckii) NCIMB 8052 세포를 80℃에서 10분간 열처리한 후, 5 ㎖ RCM 배지(DIFCO, USA)에 접종하여 혐기성 조건에서 16시간 동안 1차 종배양하였다. 이후, 상기 배양액 1 ㎖을 다시 100 ㎖ RCM 배지에 접종한 후, 600 ㎚에서 흡광도가 약 2 정도인 대수성장기가 될 때까지 4시간 정도 2차 종배양하였다.

<1-2> 본배양

pH 6.0의 포도당 60 g/ℓ 및 효모 추출물 2 g/ℓ가 함유된 변형된 P2 배지(Annous A & Blaschek HP, Appl . Environ . Microbiol . 56:2559-2561, 1990) 1ℓ를 넣어주고, 질소가스를 0.5 vvm 수준으로 공급함으로써 혐기성 조건으로 조정된 발효조에, 상기 종배양액을 접종한 후, 37℃, 200 rpm의 조건으로 본배양하였다.

<1-3> 돌연변이 유발 화학물질의 농도 결정

4 내지 5 시간 정도 본배양하여 대수성장기 초기에 이르면, 약 10 ㎖의 본배양액을 원심분리하여 세포를 회수한 후 이를 1 ㎖의 TYA 배지로 재현탁 하였다. 상기 1 ㎖에 0, 10, 25, 50, 75, 100 및 200 ㎎/ℓ의 농도로 돌연변이 유발을 위한 알킬레이팅 화학물질인 NTG(N-Methyl-N'-Nitro-N-Nitrosoguanidine; TCI, Japan)를 각각 처리한 후, 혐기성 조건하에서 37℃, 200 rpm의 조건으로 30분간 돌연변이를 유도하였다. 이후, 1 ㎖의 PT 완충용액(Annous A & Blaschek HP, Appl. Environ. Microbiol. 56:2559-2561, 1990)으로 3회 세척한 후, 1 ㎖의 TYA 배지에 현탁하여, 혐기성 조건하에서 37℃, 200 rpm의 조건으로 약 7시간 배양하였다. 상기 배양액을 멸균수로 1,000배 희석한 후 RCM 고체배지에 도말하여 생존하는 세포의 수를 조사한 후, 각 처리농도당 사멸율을 하기의 수학식 1을 이용하여 계산하였다.

NTG 처리 농도(㎎/ℓ)	세포수(콜로니수)	사멸율(%)
0(대조군)	~ 10,000	0
10	~2,000	80
25	415	95.85
50	120	98.8
75	7	99.93
100	0	100
200	0	100

그 결과, 표 1에서 나타난 바와 같이, 사멸율이 약 99%가 되는 최적의 NTG 처리 농도를 50 ㎎/ℓ로 결정하였다. 또한, 상기 50 ㎎/ℓ로 NTG 처리시 생존한 세포를 변이균주 라이브러리로 사용하였다.

< 실시예 2> 세포막 생성억제 화학물질에 대한 내성 변이 균주 선별

<2-1> 세포막 생성억제 화학물질의 최소억제농도 결정

실시예 1-1의 방법으로 종배양한 모균주 배양액을 멸균수로 1000배 희석한 후, 0, 10, 25, 50, 75, 100 및 200 ㎎/ℓ의 농도로 페니실린 G(Sigma, USA) 및 하이드록실아민(Sigma, USA)을 각각 포함하는 RCM 고체배지에 도말하여, 각 처리농도당 생존하는 세포의 수를 조사하였다.

그 결과, 표 2에서 나타난 바와 같이 페니실린의 경우 100 ㎎/ℓ, 하이드록실아민의 경우 1 ㎎/ℓ 수준을 최소억제농도로 결정하였다.

페니실린 G(㎎/ℓ)	세포수	하이드록실아민(㎎/ℓ)	세포수
0	134	0	118
25	68	0.5	28
50	32	1	0
75	8	1.5	0
100	0	2	0
200	0	4	0

<2-2> 세포막 생성억제 화학물질에 대한 내성 변이 균주 선별

실시예 1-3의 방법으로 선별한 변이 균주를, 100 ㎎/ℓ의 페니실린 및 1 ㎎/ℓ의 하이드록실아민이 각각 포함된 RCM 고체배지에 각각 30개씩 도말한 후, 혐기성 조건하에서 37℃, 200 rpm의 조건으로 약 4일간 배양하였다.

그 결과, 페니실린 G 내성 변이 균주 340개, 하이드록실아민 내성 변이 균주 480개로 총 820개의 내성 변이 균주를 확보하였으며, 이들을 각각 CBP-001~CBP340(페니실린 내성주) 및 CBH-001~CBH-480(하이드록실아민 내성주)으로 명명하였다.

< 실시예 3> 부탄올 고생산 균주 선별

<3-1> 내성 변이 균주의 배양

실시예 2에서 선정된 총 820개의 내성 변이 균주를 대상으로 단기간에 부탄올 고생산 균주를 선별하기 위해, 상기 내성 변이 균주를 9개의 96웰 마이크로플레이트(용적: 2.5 ㎖/웰) 동시에 배양하였다.

구체적으로, 각 웰당 1% 거품방지제(Antifoam A; Sigma, USA)를 포함하는 P2 배지 1 ㎖을 포함하는 96웰 플레이트에, 실시예 2에서 선정된 총 820개의 내성 변이 균주를 콜로니 피킹장치 QPIX2(GENETIX사, USA)를 이용하여 접종한 후, 혐기성 조건하에서 37℃에서 3일간 정치 배양하였다.

<3-2> 부탄올 정량

<3-2-1> 부탄올에 대한 알콜 디하이드로게나제 기질선택성 확인

0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 및 1 g/ℓ 농도의 부탄올 표준용액 20 ㎕를 10 ㎕의 효모 유래 알콜 디하이드로게나제[1 ㎎/㎖(50 mM Tris-HCl pH 8.0); Sigma, USA], 50 ㎕의 반응 완충용액[50 mM Tis-HCl(pH 8.0)] 및 20 ㎕의 조효소 NAD+과 혼합한 후, 멸균 증류수를 이용하여 반응액을 200 ㎕로 조정하였다. 상기 반응액을 37℃에서 10분간 반응시킨 후, 340 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 표 3 및 도 2에서 나타난 바와 같이, 알콜 디하이드로게나제가 부탄올에 대해서 기질선택성을 가지는 것을 확인하였고, R²이 0.9972인 부탄올 농도와 우수한 상관성을 갖는 표준곡선을 작성하였다.

부탄올 농도 (g/ℓ)	OD 340 ㎚
0	0.025
0.2	0.124
0.4	0.240
0.6	0.359
0.8	0.481
1.0	0.608

<3-2-2> 에탄올 존재하의 알콜 디하이드로게나제 기질특이성 확인

본 균주의 배양 시 부탄올과 에탄올이 동시에 생성되므로, 반응액에 에탄올이 존재할 경우, 부탄올 농도에 대한 알콜 디하이드로게나제의 기질특이성을 확인해 보았다.

0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 및 1 g/ℓ 농도의 부탄올 표준용액 20 ㎕를 10 ㎕의 효모 유래 알콜 디하이드로게나제[1 ㎎/㎖(50 mM Tris-HCl pH 8.0)], 50 ㎕의 반응 완충용액[50 mM Tis-HCl(pH 8.0)], 0.1 g/ℓ 농도의 에탄올 표준용액 10 ㎕ 및 20 ㎕의 조효소 NAD+과 혼합한 후, 멸균 증류수를 이용하여 반응액을 200 ㎕로 조정하였다. 상기 반응액을 37℃에서 10분간 반응시킨 후, 340 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 표 4에서 나타난 바와 같이, 에탄올 존재하에서도 알콜 디하이드로게나제가 부탄올에 대해서 기질특이성을 가지는 것을 확인하였다.

부탄올 농도 (g/ℓ)	OD 340 ㎚
0	0.047
0.2	0.140
0.4	0.251
0.6	0.367
0.8	0.488
1.0	0.621

<3-2-3> 부탄올 정량

실시예 3-1의 96웰 플레이트를 전용 원심분리기(Hanil, Korea)로 3000 rpm, 10분간 원심분리하여 세포와 발효액을 분리하였다. 상기 820개의 발효액을 자동 액체분주기(Liquid Handler; Xiril, Swiss)를 이용하여 새 96웰 플레이트로 회수하였다. 상기 발효액을 10배 희석하여 실시예 3-2-1의 방법으로 반응시킨 후, 반응이 완료된 지 1분 이내에 마이크로플레이트 인식기(BIOTEK, USA)를 이용하여 340 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 표 5에서 나타난 바와 같이 최우수 균주가 포함된 96웰 플레이트에서 기존 모균주 대비 45% 이상 부탄올 생산량이 개선된 최우수 균주인 CBP-381 균주를 선별하였으며, 이를 한국생물공학연구원 생물자원센터에 2008년 7월 28일자로 기탁하여 기탁번호 KCTC 11371 BP를 부여받았다.

	A	B	C	D	E	F	G	H	I	J	K	L
1	0.361	0.403	0.444	0.272	0.21	0.108	0.338	0.341	0.219	0.398	0.278	0.402
2	0.373	0.354	0.321	0.344	0.311	0.378	0.363	0.247	0.502	0.314	0.333	0.315
3	0.385	0.268	0.084	0.369	0.449	0.333	0.285	0.269	0.312	0.336	0.299	0.368
4	0.248	0.374	0.368	0.375	0.398	0.287	0.368	0.409	0.333	0.358	0.341	0.4
5	0.295	0.482	0.395	0.312	0.287	0.312	0.247	0.422	0.228	0.342	0.399	0.288
6	0.334	0.362	0.265	0.222	0.236	0.341	0.468	0.36	0.369	0.054	0.29	0.324
7	0.398	0.333	0.311	0.296	0.334	0.369	0.31	0.347	0.408	0.396	0.014	0.354
8	0.289	0.406	0.358	0.349	0.345	0.298	0.323	0.345	0.358	0.333	0.348	0.36

* 돌연변이 균주 90개(CBP-361~CBP-450) 및 모균주 6개(밑줄)의 발효결과

< 실시예 4> 부탄올 생산 발효공정 최적화

<4-1> 본배양 접종 시기

상기 KCTC 11371 BP 기탁균주를 실시예 1-1의 방법으로 종배양한 후, 상기 종배양액의 600 ㎚에서의 흡광도가 2, 5, 8 및 10일 때, 100 ㎖의 종배양액을 실시예 1-2의 본배양 배지 1 ℓ에 각각 접종하여 동일한 방법으로 본배양하였다. 상기 본배양이 완료된 후, 본배양액의 부탄올 생성량을 실시예 3-2-3과 동일한 방법으로 측정하였다.

그 결과, 표 6에 나타난 바와 같이 대수성장기 초기인 흡광도가 2일 때 본배양 배지에 접종하는 것이, 본 발명의 내성 변이 균주의 부탄올 발효에 가장 효과적임을 확인하였다.

종배양 OD(600 ㎚)	최고 부탄올 농도(g/ℓ)
2	14.1
5	13.6
8	10.5
10	9.7

<4-2> 본배양 접종 시, 종배양 부피비

상기 KCTC 11371 BP 기탁균주를 실시예 1-1의 방법으로 종배양한 후, 50, 100, 150 및 200 ㎖의 종배양액을 실시예 1-2의 본배양 배지 1 ℓ에 각각 접종하여 동일한 방법으로 본배양하였다. 상기 본배양이 완료된 후, 본배양액의 부탄올 생성량을 실시예 3-2-3과 동일한 방법으로 측정하였다.

그 결과, 표 7에서 나타난 바와 같이 본배양 배지에 대한 종배양액의 부피비가 15%가 되도록 접종하는 것이, 본 발명의 내성 변이 균주의 부탄올 발효에 가장 효과적임을 확인하였다.

종배양 규모(부피비, %)	최고 부탄올 농도(g/ℓ)
5	12.5
10	13.6
15	14.7
20	10.4

<4-3> 삼투압 보호제의 효과

상기 KCTC 11371 BP 기탁균주를 실시예 1-1의 방법으로 종배양한 후, 100 ㎖의 종배양액을 실시예 1-2의 본배양 배지 1 ℓ에 추가로 0, 0.5, 1.0 및 1.5 g/ℓ의 프롤린, 콜린 및 베테인(Sigma, USA)을 각각 포함하는 본배양 배지에 접종하여 동일한 방법으로 본배양하였다. 상기 본배양이 완료된 후, 본배양액의 부탄올 생성량을 실시예 3-2-3과 동일한 방법으로 측정하였다.

그 결과, 표 8에서 나타난 바와 같이 삼투압 보호제를 추가시, 프롤린>콜린>베테인의 순으로 본 발명의 내성 변이 균주의 부탄올 발효에 가장 효과적임을 확인하였다. 구체적으로, 프롤린의 경우, 1.0 g/ℓ; 콜린의 경우, 1.0 g/ℓ; 및, 베테인의 경우, 1.0 g/ℓ의 농도로 포함하는 것이 가장 효과적이었다.

삼투압 보호제(첨가량, g/ℓ)	최고 부탄올 농도(g/ℓ)
컨트롤	7.4
프롤린(0.5)	7.3
프롤린(1.0)	8.9
프롤린(1.5)	7.7
콜린(0.5)	7.5
콜린(1.0)	7.9
콜린(1.5)	7.8
베테인(0.5)	7.1
베테인(1.0)	7.5
베테인(1.5)	7.4

<4-4> 본배양 배지의 pH 조절

상기 KCTC 11371 BP 기탁균주를 실시예 1-1의 방법으로 종배양한 후, 100 ㎖의 종배양액을 실시예 1-2의 본배양 배지의 pH가 5.5, 6.0, 6.5 및 7.0으로 각각 조정된 본배양 배지 1 ℓ에 접종하여 동일한 방법으로 부틸산 생성이 최고로 도달되는 시점까지 본배양하였다. 초기 pH에 따라 최고 부틸산 생산에 도달하는 시간이 차이가 있을 수 있으므로, 부틸산의 농도를 측정하면서 발효양상을 분석하였다. 부틸산 및 부탄올의 농도는 가스크로마토그래피를 이용하여 측정하였다(Ezeji et al., Biotechnol . Bioeng . 97:1460-1469, 2007).

그 결과, 표 9에서 나타난 바와 같이 본배양 배지의 초기 pH가 6.5일 경우, 본 발명의 내성 변이 균주의 부틸산 생산에 가장 효과적임을 확인하였다. 참고로, 최고 농도 도달시간이 지나면서는 부틸산이 부탄올로의 전환에 따른 부틸산 농도의 감소가 현저하게 나타났다.

초기 pH	부틸산 최고농도(g/ℓ)	도달 시간(hr)
5.5	1.8	24
6.0	3.4	20
6.5	5.4	17
7.0	4.8	16

<4-5> 본배양액의 pH 조정

상기 KCTC 11371 BP 기탁균주를 실시예 1-1의 방법으로 종배양한 후, 100 ㎖의 종배양액을 실시예 1-2의 본배양 배지의 pH가 6.5로 조정된 본배양 배지 1 ℓ에 접종하여 동일한 방법으로 본배양하였다. 17시간 후, 상기 본배양액의 pH를 4.5, 5.0, 5.5 및 6.0으로 조정하였다. 조정된 pH에 따라 최고 부탄올 생산에 도달하는 시간이 차이가 있을 수 있으므로, 실시예 3-2-3과 동일한 방법으로 부탄올의 농도를 측정하면서 발효양상을 분석하였다.

그 결과, 표 10에서 나타난 바와 같이 본배양액의 pH를 5.0으로 조정할 경우, 본 발명의 내성 변이 균주의 부탄올 발효에 가장 효과적임을 확인하였다.

조정 pH	부탄올 최고농도(g/ℓ)	도달 시간(hr)
4.5	10.4	42
5.0	14.5	32
5.5	12.2	30
6.0	7.8	27

<4-6> 본배양액의 pH 조정 시점

상기 KCTC 11371 BP 기탁균주를 실시예 1-1의 방법으로 종배양한 후, 100 ㎖의 종배양액을 실시예 1-2의 본배양 배지의 pH가 6.5로 조정된 본배양 배지 1 ℓ에 접종하여 동일한 방법으로 본배양하였다. 12, 15, 17 및 20시간 배양한 후, 상기 본배양액의 pH를 5.0으로 조정하였다. pH 조정 시점에 따라 최고 부탄올 생산에 도달하는 시간이 차이가 있을 수 있으므로, 실시예 3-2-3과 동일한 방법으로 부탄올의 농도를 측정하면서 발효양상을 분석하였다.

그 결과, 표 11에서 나타난 바와 같이 본배양액의 pH를 5.0으로 조정할 경우, 본배양 17시간 후 수행하는 것이, 본 발명의 내성 변이 균주의 부탄올 발효에 가장 효과적임을 확인하였다.

조정시간(hr)	부탄올 최고농도(g/ℓ)	도달 시간(hr)
12	12.5	37
15	13.8	34
17	14.7	32
20	13.2	28

< 실시예 5> 배양조건 최적화 검증

상기 KCTC 11371 BP 기탁균주를 실시예 4에서 최적화한 배양조건(접종시기는 OD 600 ㎚가 2; 접종 시 종배양 부피비는 15%; 프롤린 1.0 g/ℓ; 본배양 배지의 초기 pH는 6.5; 본배양액의 pH 조절 시점 및 pH: 본배양 17시간 후, 5.0으로 조정; 본배양에서 pH 조정후, 배양시간은 32시간)에서 배양한 후, 모균주인 클로스트리디움 베이저링키 NCIMB 8052를 상기 최적화 배양조건에서 배양한 결과와 비교하였다.

그 결과, 도 3에서 나타난 바와 같이 모균주는 약 10.7 g/ℓ의 부탄올을 생산하였고, 상기 KCTC 11371 BP 기탁균주는 14.8 g/ℓ의 부탄올을 생산하였다. 즉, 약 38.3% 이상 생산성이 향상한 것을 확인하였다. 참고로, 에탄올 생산은 비교적 균일하게 유지되었다.

도 1은 본 발명의 세포막 생성 억제물질 내성 변이 균주 및 부탄올 제조공정의 모식도이다.

도 2는 본 발명의 알콜 디하이드로게나제를 이용한 부탄올 측정을 위한 검정곡선이다.

도 3은 본 발명의 최적화된 부탄올 제조공정을 이용하여 모균주와 KCTC 11371 BP 기탁균주의 부탄올 발효양상을 나타낸 그래프이다:

a: 모균주; 및,

b: KCTC 11371 BP 기탁균주.

Claims (23)

1) 0 내지 1 g/ℓ의 복수의 농도의 부탄올 표준 용액, 효모 유래 알콜 디하이드로게나제(alcohol dehydrogenase), 반응완충용액 및 조효소 NAD+를 혼합한 반응액을 반응시키는 단계;

2) 단계 1)의 반응액의 흡광도를 340 ㎚에서 측정하여 표준 곡선을 그리는 단계;

3) 부탄올을 포함할 것으로 예상되는 시료를 이용하여 단계 1)의 반응을 수행하는 단계;

4) 단계 3)의 반응액의 흡광도를 340 ㎚에서 측정하는 단계; 및

5) 단계 4)의 측정값을 단계 2)의 표준 곡선과 비교하여, 부탄올 함량을 계산하는 단계를 포함하는 시료내 부탄올 함량 측정 방법.

제 1항에 있어서, 단계 1)의 반응완충용액은 50 mM Tris-HCL(pH 8.0)인 것을 특징으로 하는 측정 방법.

제 1항에 있어서, 단계 4)의 흡광도 측정값이 0.8 이상인 경우, 시료의 흡광도가 0.8 이하가 될 때까지 희석하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 측정 방법.

1) 클로스트리디움 베이저링키(Clostridium beijerinckii) NCIMB 8052 야생형 균주를 돌연변이 시키는 단계;

2) 단계 1)에서 생존한 변이 균주들을 세포막 합성저해 화학물질인 페니실린 또는 하이드록실아민이 포함된 고체배지에서 배양하는 단계;

3) 단계 2)에서 생존한 상기 화학물질에 내성을 갖는 변이 균주들을 액체 배지로 옮겨 혐기성 조건에서 배양하여 부탄올을 생산하는 단계; 및,

4) 단계 3)의 배양 상등액을 수득하여 생성된 부탄올 생산량을 상기 제 1항의 부탄올 함량 측정방법으로 측정하고, 부탄올 생산량이 높은 변이 균주를 선별하는 단계를 포함하는 부탄올 내성 및 부탄올 고생산 균주의 제조방법.

제 4항에 있어서, 단계 1)의 돌연변이는 돌연변이 유발물질 처리에 따른 화학적 돌연변이법에 의한 돌연변이, UV 처리에 따른 물리적 변이법에 의한 돌연변이 및 유전공학 조작에 의한 돌연변이인 것을 특징으로 하는 제조방법.

제 5항에 있어서, 돌연변이 유발물질은 NTG(N-Methyl-N'-Nitro-N- Nitrosoguanidine), EMS(ethyl methane sulfonate) 및 트리에틸렌 멜라민(triethylene melamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제조방법.

삭제

삭제

제 4항의 방법으로 제조하여 기탁번호 KCTC 11731 BP로 기탁 된 부탄올 내성 및 부탄올 고생산 균주.

1) 제 4항의 방법으로 제조된 부탄올 내성 및 부탄올 고생산 균주를 종배양하는 단계;

2) 단계 1)의 종배양액의 600 ㎚에서의 흡광도가 1.5 내지 5에 도달하면 pH 6.0 내지 7.0의 본배양 배지에, 종배양액을 10 내지 17%(v/v)로 접종하는 단계;

3) 단계 2)의 접종액을 혐기성 조건에서 15 내지 20시간 동안 본배양하는 단계; 및,

4) 단계 3)의 본배양액의 pH를 4.8 내지 5.2로 조정한 후, 혐기성 조건에서 26 내지 38시간 동안 배양하는 단계를 포함하는 부탄올 대량 생산방법.

제 10항에 있어서, 단계 1)의 부탄올 내성 및 부탄올 고생산 균주는 기탁번호 KCTC 11731 BP로 기탁 된 것을 특징으로 하는 대량 생산방법.

제 10항에 있어서, 단계 2)의 흡광도가 2인 것을 특징으로 하는 대량 생산방법.

제 10항에 있어서, 단계 2)의 본배양 배지에 추가로 삼투압 보호제를 포함하는 것을 특징으로 하는 대량 생산방법.

제 13항에 있어서, 삼투압 보호제는 프롤린, 콜린 및 베테인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 대량 생산방법.

제 14항에 있어서, 프롤린은 0.8 내지 1.7 g/ℓ의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 대량 생산방법.

제 15항에 있어서, 프롤린은 1.0 g/ℓ의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 대량 생산방법.

제 14항에 있어서, 콜린은 0.3 내지 1.7 g/ℓ의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 대량 생산방법.

제 17항에 있어서, 콜린은 1.0 g/ℓ의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 대량 생산방법.

제 14항에 있어서, 베테인은 0.8 내지 1.5 g/ℓ의 농도로 포함되는 것을 특 징으로 하는 대량 생산방법.

제 19항에 있어서, 베테인은 1.0 g/ℓ의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 대량 생산방법.

제 10항에 있어서, 단계 2)의 부피비가 15%(v/v)인 것을 특징으로 하는 대량 생산방법.

제 10항에 있어서, 단계 3)의 배양시간은 17시간인 것을 특징으로 하는 대량 생산방법.

제 10항에 있어서, 단계 4)의 본배양액의 pH를 5.0으로 조정하는 것을 특징으로 하는 대량 생산방법.

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