CN103320358B - 一株用于燃料丁醇发酵的拜氏梭菌 u-57及其应用方法 - Google Patents
一株用于燃料丁醇发酵的拜氏梭菌 u-57及其应用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一株用于燃料丁醇发酵的拜氏梭菌U-57及其应用方法，保藏号为CCTCC NO：M2013208，该菌株由拜氏梭菌Clostridium beijerinckii ATCC55025经多次紫外诱变、反复筛选获得。该菌株能对葡萄糖、木质纤维原料蒸汽爆破酶解液进行发酵产丁醇；利用该菌株以木质纤维为原料发酵生产燃料丁醇，具有成本低、产量高、市场前景好等优点，同时附产丙酮、乙醇、木质素和蛋白饲料等高附加值产品。
Description
技术领域
本发明属于应用微生物领域，涉及一株用于燃料丁醇发酵的拜氏梭菌Clostridiumbeijerinckii U-57及其应用方法。
背景技术
能源是人类生产活动的物质基础，人类社会的发展依赖于优质能源的出现以及先进能源技术的使用，然而随着化石燃料等不可再生能源的大量消耗，人类将面临能源的枯竭，并且化石燃料燃烧产物对生态环境造成了巨大破坏，因此可再生清洁能源成了人们的追求，而通过生物发酵产的丁醇，正好与此相符。木质纤维储量大，资源丰富，经水解后可用来发酵产丁醇。因此实现木质纤维原料对传统粮食原料的替代，可以在一定程度上避免粮食危机的出现，并且有利于丁醇生产成本的降低和市场竞争力的提高。优良菌株是高效发酵结果的前提，因此在生产过程中需要不断的强化菌种性能，现代丁醇发酵工业主要是以纯种菌种的培养物为基础，采用各种筛选手段进行菌种选育，筛选出高产、符合生产条件的纯种。本发明采用了拜氏梭菌Clostridium beijerinckii，通过紫外诱变筛选实验，得到了一个稳定、高产的产丁醇菌株，分别对葡萄糖、蒸汽爆破材料酶解液进行了发酵产丁醇应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一株能够高产丁醇的拜氏梭菌Clostridium beijerinckii U-57，并提供该菌种对葡萄糖或蒸汽爆破材料酶解液进行发酵产丁醇的应用方法。
一株用于燃料丁醇发酵的拜氏梭菌U-57，所述的拜氏梭菌Clostridium beijerinckii U-57的保藏号为CCTCC NO：M2013208。
所述的拜氏梭菌Clostridium beijerinckii U-57的应用方法，所述的拜氏梭菌Clostridiumbeijerinckii U-57对葡萄糖进行发酵产丁醇；或者对蒸汽爆破材料酶解液进行发酵产丁醇。
具体是将所述的拜氏梭菌Clostridium beijerinckii U-57纯种接入活化液体培养基中37℃厌氧培养48h；然后将活化好的菌接种于种子培养基于37℃厌氧培养24h，得到的种子液用于对葡萄糖或者蒸汽爆破材料酶解液进行发酵产丁醇。
所述的活化液体培养基成分为：胰蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0、酵母浸粉3.0g、葡萄糖5.0g、氯化钠5.0g、可溶性淀粉1.0g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、乙酸钠3.0g、蒸馏水定容至1.0L；调pH到6.8，灭菌；所述的种子培养基成分为：葡萄糖20g、酵母浸粉2g、醋酸铵3g、KH2PO40.5g、MgSO40.1g、FeSO4·7H2O0.01g、MnSO40.01g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，蒸馏水定容至1L，调pH到6.8，灭菌。
上述方法中对葡萄糖进行发酵时将种子液转接到葡萄糖发酵培养基，接种量为葡萄糖发酵培养基体积的6％，发酵容器装液量80%，37℃厌氧发酵72h。
所述的葡萄糖发酵培养基成分：葡萄糖53.66g/L、酵母浸粉1.5g/L、醋酸铵3.82g/L、KH2PO40.75g/L、MgSO40.2g/L、FeSO4·7H2O20mg/L、MnSO410mg/L、CaCO32.60g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，pH为6.5，水定容至1L，灭菌，再通过无菌滤膜加入对氨基苯甲酸3mg/L、硫胺2mg/L。
上述方法中对蒸汽爆破材料酶解液进行发酵时采用以下两种方式中的任一种：
1）分步糖化发酵：取50g杨木蒸汽爆破渣，加入1L水，纤维素酶的载入量为20FPIU/g，温度为50℃，初始pH为5.5，酶解45h，过滤后以酶解液为碳源，配制发酵培养基；将种子液转接到发酵培养基，接种量为发酵培养基体积的6％，发酵容器装液量85%，37℃厌氧发酵72h；
2）同步糖化发酵：取50g杨木蒸汽爆破渣，加入1L水，配制发酵培养基，灭菌后加纤维素酶，载入量为20FPIU/g，同时将种子液转接到发酵培养基，接种量为发酵培养基体积的4％，发酵容器装液量85%，40℃厌氧发酵72h。
分步糖化发酵培养基成分：杨木酶解液200mL/L，酵母浸粉1.5g/L、醋酸铵3.82g/L、KH2PO40.75g/L、MgSO40.2g/L、FeSO4·7H2O20mg/L、MnSO410mg/L、CaCO32.60g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，充分溶解，调pH到6.5，蒸馏水定容至1L，灭菌后通过无菌滤膜加入对氨基苯甲酸3mg/L、硫胺2mg/L；
同步糖化发酵培养基成分：杨木蒸汽爆破渣50g/L、酵母浸粉1.5g/L、醋酸铵3.82g/L、KH2PO40.75g/L、MgSO40.2g/L、FeSO4·7H2O20mg/L、MnSO410mg/L、CaCO32.60g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L；调pH到5.9，蒸馏水定容至1L，灭菌后通过无菌滤膜加入对氨基苯甲酸3mg/L、硫胺2mg/L。
所述的杨木爆蒸汽破渣的制备：将杨木切片，粉碎至20目，填装入蒸汽爆破装置的爆破反应器中；开启蒸汽发生器，蒸汽到达预设温度210℃，通入爆破反应器；在预设蒸汽压力3MPa下维压20min，瞬间释放压力，爆破完成，然后将爆破液烘干至无水收集备用。
发明的有益效果和特点
由于拜氏梭菌Clostridium beijerinckii U-57保藏号：CCTCC M2013208，为拜氏梭菌Clostridium beijerinckii ATCC55025紫外诱变筛选所得，并对其进行了遗传稳定性分析，稳定性好，能够适应发酵环境，本发明利用拜氏梭菌分别对葡萄糖、蒸汽爆破材料酶解液进行发酵产丁醇，足以证明拜氏梭菌Clostridium beijerinckii U-57是一个稳定、高产的产丁醇菌株。
拜氏梭菌Clostridium beijerinckii U-57
保藏日期：2013年05月15日
保藏单位名称：中国典型培养物保藏中心
保藏单位简称：CCTCC
保藏号：CCTCC NO：M2013208
具体实施方式
以下实例旨在进一步说明本发明，而不是限制本发明。
实施例1
拜氏梭菌Clostridium beijerinckii U-57的筛选
1、菌种来源
经Clostridium beijerinckii ATCC55025（从美国典型培养物资源库ATCC购买）紫外诱变获得。
2、培养基及筛选原理、方法
菌种的代谢过程中能合成一些特定的产物，其产量的高低是由其遗传物质中某一个或者多个基因共同决定的，遗传物质的结构决定某一特定功能，如果通过一些手段改变其遗传物质结构，将会在一定程度上影响到其这一特定功能，通过紫外诱变选育，可以改变菌种的遗传物质中某一部分的结构，然后通过选择性筛选，从大量的突变体中筛选出产量高、性状优良的突变株。将ATCC55025菌悬液在距20W紫外灯下20-25cm照射90-110s，涂布YEM平板，37℃厌氧避光培养48h，转接到BCP平板，37℃厌氧避光培养36h，黄色透明圈为正常菌落，紫色为产酸较低的突变株。按照上述方法对初步筛选的74株进行实验，用5％的葡萄糖液体培养基发酵实验，筛选出13株正向突变株，再对正突变株进行5％的葡萄糖液体培养基发酵实验，筛选出2株产丁醇较高的菌株进行遗传稳定性分析，筛出一株编号为U-57的菌株。该菌株发酵能力、稳定性和对丁醇的耐受性均好（表1、表2、表3），故将其选为发酵所需优良突菌株。
表1初筛正突变结果
Table1The results of positive mutant strain in spreliminary screening
| 菌株 | 丙酮(g/L) | 乙醇(g/L) | 丁醇(g/L) | 总溶剂(g/L) |
| 原始菌株 | 2.84±0.03 | 1.03±0.04 | 6.01±0.06 | 9.88±0.13 |
| U-3 | 2.92±0.02 | 1.07±0.03 | 6.14±0.03 | 10.13±0.08 |
| U-14 | 2.99±0.03 | 1.00±0.03 | 6.23±0.02 | 10.22±0.08 |
| U-17 | 2.94±0.02 | 1.03±0.02 | 6.17±0.04 | 10.14±0.08 |
| U-19 | 2.89±0.04 | 0.93±0.01 | 6.08±0.05 | 9.90±0.10 |
| U-24 | 3.09±0.02 | 1.09±0.03 | 6.27±0.03 | 10.45±0.08 |
| U-37 | 3.01±0.03 | 1.13±0.04 | 6.36±0.02 | 10.58±0.09 |
| U-41 | 2.80±0.03 | 1.19±0.03 | 6.33±0.07 | 10.32±0.13 |
| U-42 | 2.76±0.01 | 1.16±0.02 | 6.31±0.04 | 10.23±0.07 |
| U-53 | 2.91±0.02 | 1.22±0.02 | 6.47±0.03 | 10.60±0.07 |
| U-57 | 3.04±0.03 | 1.13±0.03 | 6.42±0.03 | 10.59±0.09 |
| U-60 | 2.95±0.03 | 1.07±0.02 | 6.19±0.02 | 10.21±0.07 |
| U-63 | 2.93±0.04 | 1.20±0.03 | 6.39±0.04 | 10.52±0.11 |
| U-67 | 2.97±0.02 | 1.15±0.03 | 6.25±0.06 | 10.37±0.11 |
表2突变株U-57遗传稳定性
Table2Genetic stability of mutated strain U-57
| 代数 | 丙酮(g/L) | 乙醇(g/L) | 丁醇(g/L) | 总溶剂(g/L) |
| F1 | 3.01±0.02 | 1.13±0.01 | 6.45±0.02 | 10.59±0.05 |
| F2 | 2.99±0.02 | 1.14±0.02 | 6.44±0.03 | 10.57±0.07 |
| F3 | 3.02±0.03 | 1.10±0.01 | 6.47±0.03 | 10.59±0.07 |
| F4 | 2.97±0.02 | 1.13±0.01 | 6.42±0.02 | 10.52±0.05 |
| F5 | 3.00±0.02 | 1.09±0.03 | 6.44±0.04 | 10.53±0.09 |
| F6 | 3.03±0.01 | 1.12±0.02 | 6.43±0.02 | 10.58±0.05 |
| F7 | 3.00±0.03 | 1.14±0.02 | 6.45±0.02 | 10.59±0.07 |
表3丁醇对菌株生长的影响
Table3.6Effect of butanol on the growth of strain
| 丁醇浓度(g/L) | 0 | 5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 |
| 原始菌株 | ++++ | ++++ | +++ | ++ | + | + | - |
| 突变株U-57 | ++++ | ++++ | ++++ | +++ | ++ | + | - |
注：“++++”表示菌落200-300；“+++”表示菌落100-200；“++”表示菌落50-100；“+”表示菌落0-50；“-”表示不生长。
所述的YEM培养基成分为：葡萄糖40g、酵母浸粉2g、牛肉膏2g、K2HPO40.5g、MgSO40.2g、FeSO4·7H2O0.01g、醋酸铵3g、琼脂15g、蒸馏水1.0L。充分溶解，调pH到6.8，115℃高压蒸汽灭菌20min。
所述的BCP培养基成分为：葡萄糖10g、酵母浸粉8g、水解干酪素2.2g、MnSO40.01g、FeSO4·7H2O0.01g、天冬酰胺4g、溴甲酚紫0.4g、琼脂15g、蒸馏水1.0L。充分溶解，调pH到7.0，115℃高压蒸汽灭菌20min。
本发明筛选到的拜氏梭菌Clostridium beijerinckii U-57形态学特征如下：菌落较小，呈白色，圆形，表面光滑、有光泽、湿润、隆起，边缘整齐，菌落相互融合；细菌呈梭状，(0.6～0.9)×(2.4～4.7)微米，分散或成短链排列。
所述拜氏梭菌Clostridium beijerinckii U-57的生理生化特征如下：能在葡萄糖培养基和木质纤维水解液为碳源的培养基中均可分解牛肉膏、蛋白胨；在葡萄糖培养基中能够发酵葡萄糖，在木质纤维水解液为碳源的培养基中能发酵水解液中的戊糖和己糖。
实施例2
拜氏梭菌Clostridium beijerinckii U-57发酵实验
1、发酵方法
A：纯种接入活化液体培养基中37℃厌氧培养48h；(活化培养基成分为：胰蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0、酵母浸粉3.0g、葡萄糖5.0g、氯化钠5.0g、可溶性淀粉1.0g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、乙酸钠3.0g、蒸馏水1.0L。充分溶解，调pH到6.8，121℃高压蒸汽灭菌，20min。)
B：将活化好的菌接种于种子培养基于37℃厌氧培养24h；(种子培养基成分为：葡萄糖20g、酵母浸粉2g、醋酸铵3g、KH2PO40.5g、MgSO40.1g、FeSO4·7H2O0.01g、MnSO40.01g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，蒸馏水1L。充分溶解，调PH到6.8，115℃高压蒸汽灭菌20min。)
C：根据以下葡萄糖、爆破材料发酵；
1）葡萄糖发酵实验
将菌株由种子培养基转接到葡萄糖发酵培养基，接种量为6％，葡萄糖发酵培养基装液量80%；37℃厌氧发酵，72h后气相色谱测丁醇和总溶剂（包括丙酮、丁醇和乙醇）的含量。U-57菌株发酵液中丁醇和溶剂的含量分别为7.85、12.28g/L，高于其他菌株，而未诱变的原始菌株其丁醇和总溶剂的含量为6.01、9.88g/L，丁醇与总溶剂的含量分别提高30.6%、24.3%。
葡萄糖发酵培养基成分：葡萄糖53.66g/L、酵母浸粉1.5g/L、醋酸铵3.82g/L、KH2PO40.75g/L、MgSO40.2g/L、FeSO4·7H2O20mg/L、MnSO410mg/L、CaCO32.60g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L、对氨基苯甲酸3mg/L、硫胺2mg/L，pH为6.5。
2）爆破材料发酵实验
a.杨木爆蒸汽破渣的制备：将杨木切片，粉碎至20目，填装入蒸汽爆破装置的爆破反应器中；开启蒸汽发生器，蒸汽到达预设温度210℃，通入爆破反应器；在预设蒸汽压力3MPa下维压20min，瞬间释放压力，爆破完成，然后将爆破液烘干至无水收集备用。
b.爆破材料分步糖化发酵实验
取50g杨木蒸汽爆破渣(烘干)，加入1L水，纤维素酶的载入量为20FPIU/g，充分酶解温度为50℃，初始pH为5.5，酶解45h，过滤后以酶解液为碳源，配制发酵培养基。将菌株由种子培养基转接到发酵培养基，接种量为6％，发酵培养基装液量为85%；37℃厌氧发酵，72h后气相色谱测丁醇和总溶剂的含量。发酵液中丁醇和溶剂的含量分别为2.19、3.57g/L。而未诱变的原始菌株其丁醇和总溶剂的含量为1.41、2.48g/L，丁醇与总溶剂的含量分别提高55.3%、45.0%。
分步糖化发酵培养基成分：杨木酶解液，酵母浸粉1.5g/L、醋酸铵3.82g/L、KH2PO40.75g/L、MgSO40.2g/L、FeSO4·7H2O20mg/L、MnSO410mg/L、CaCO32.60g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，充分溶解，调pH到6.5，115℃高压蒸汽灭菌20min。通过无菌滤膜加入对氨基苯甲酸3mg/L、硫胺2mg/L。
c.爆破材料同步糖化发酵实验
取50g杨木蒸汽爆破渣(烘干)，加入1L水，配制发酵培养基，灭菌后加纤维素酶，载入量为20FPIU/g，同时将菌株由种子培养基转接到发酵培养基，接种量为4％，发酵培养基装液量为85%；40℃厌氧发酵，72h后气相色谱测丁醇和总溶剂的含量。发酵液中丁醇和溶剂的含量分别为2.16、3.44g/L。而未诱变的原始菌株其丁醇和总溶剂的含量为1.35、2.33g/L，丁醇与总溶剂的含量分别提高60.0%、47.6%。
同步糖化发酵培养基成分：杨木爆破渣50g/L(烘干)、酵母浸粉1.5g/L、醋酸铵3.82g/L、KH2PO40.75g/L、MgSO40.2g/L、FeSO4·7H2O20mg/L、MnSO410mg/L、CaCO32.60g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L调pH到5.9，115℃高压蒸汽灭菌20min。通过无菌滤膜加入对氨基苯甲酸3mg/L、硫胺2mg/L。
2、测定方法
A：还原糖的测定方法采用DNS法
准确称取于103±2℃下烘干至恒重的无水葡萄糖1g，精确至0.1mg，用水溶解并定容至100mL，分别吸取0.00、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.5mL于10mL容量瓶中，用超纯水定容到10mL，并对其进行编号(0-6)，每个浓度取0.5mL，加入缓冲液1.5mL，DNS试剂2mL，每组三个平行，沸水浴10min。用超纯水定容到25mL，摇匀，540nm处测吸光度，根据结果绘制标准曲线。根据标准曲线，测出还原糖浓度。
B：丁醇的质量浓度及含量的测定采用气相色谱法
气相色谱仪：GC-14C；色谱柱：安捷伦HP-INNOWAX，30m×0.25mm；检测器：FID；N2为载气，流速为35mL/min，H2流速为35mL/min，空气流速为350mL/min；初始柱温45℃，保留1min，然后以5℃/min升至150℃，保留2min；进样口温度为180℃；检测器温度为200℃；进样量为1μL，分流比为1∶60，外标法定量。样品的制备：发酵液10000r/min离心10分钟，取上清液，再次以10000r/min离心10分钟，取上清液。
Claims (2)
1.一株用于燃料丁醇发酵的拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)U-57，其特征在于，所述的拜氏梭菌的保藏号为CCTCC NO：M 2013208。
2.权利要求1所述的拜氏梭菌的应用方法，其特征在于，将所述的拜氏梭菌纯种接入活化液体培养基中37℃厌氧培养48h；然后将活化好的菌接种于种子培养基于37℃厌氧培养24h，得到的种子液用于对蒸汽爆破材料酶解液进行发酵产丁醇；
所述的活化液体培养基成分为：胰蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母浸粉3.0g、葡萄糖5.0g、氯化钠5.0g、可溶性淀粉1.0g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、乙酸钠3.0g、蒸馏水定容至1.0L；调pH到6.8，灭菌；所述的种子培养基成分为：葡萄糖20g、酵母浸粉2g、醋酸铵3g、KH2PO40.5g、MgSO40.1g、FeSO4·7H2O 0.01g、MnSO40.01g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g，蒸馏水定容至1L，调pH到6.8，灭菌；
对蒸汽爆破材料酶解液进行发酵时采用以下两种方式中的任一种：
1)分步糖化发酵：取50g杨木蒸汽爆破渣，加入1L水，纤维素酶的载入量为20FPIU/g，温度为50℃，初始pH为5.5，酶解45h，过滤后以酶解液为碳源，配制发酵培养基；将种子液转接到发酵培养基，接种量为发酵培养基体积的6％，发酵容器装液量85％，37℃厌氧发酵72h；
2)同步糖化发酵：取50g杨木蒸汽爆破渣，加入1L水，配制发酵培养基，灭菌后加纤维素酶，载入量为20FPIU/g，同时将种子液转接到发酵培养基，接种量为发酵培养基体积的4％，发酵容器装液量85％，40℃厌氧发酵72h；
分步糖化发酵培养基成分：杨木酶解液200mL/L，酵母浸粉1.5g/L、醋酸铵3.82g/L、KH2PO40.75g/L、MgSO40.2g/L、FeSO4·7H2O 20mg/L、MnSO410mg/L、CaCO32.60g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，充分溶解，调pH到6.5，蒸馏水定容至1L，灭菌后通过无菌滤膜加入对氨基苯甲酸3mg/L、硫胺2mg/L；
同步糖化发酵培养基成分：杨木蒸汽爆破渣50g/L、酵母浸粉1.5g/L、醋酸铵3.82g/L、KH2PO40.75g/L、MgSO40.2g/L、FeSO4·7H2O 20mg/L、MnSO410mg/L、CaCO32.60g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L；调pH到5.9，蒸馏水定容至1L，灭菌后通过无菌滤膜加入对氨基苯甲酸3mg/L、硫胺2mg/L；
所述的杨木蒸汽爆破渣的制备：将杨木切片，粉碎至20目，填装入蒸汽爆破装置的爆破反应器中；开启蒸汽发生器，蒸汽到达预设温度210℃，通入爆破反应器；在预设蒸汽压力3MPa下维压20min，瞬间释放压力，爆破完成，然后将爆破液烘干至无水收集备用。
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