CN104293746B - 一种高活性复合纤维素酶及其制备和应用方法 - Google Patents

一种高活性复合纤维素酶及其制备和应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高活性复合纤维素酶及其制备和应用方法。其步骤如下：利用黑曲霉C112进行液体发酵生产β‑葡萄糖苷酶，在一定培养条件下，所得β‑葡萄糖苷酶酶活力可达15.496IU/ml。将黑曲霉C112生产的β‑葡萄糖苷酶与里氏木霉RUT C30生产的纤维素酶进行酶系复合，制备出高活性复合纤维素酶，当β‑葡萄糖苷酶/滤纸酶比值为1.536时，酶解糖化稀磷酸与蒸汽爆破预处理杨木，获得最高还原糖61.858g/L，还原糖得率为81.63％。

Description

一种高活性复合纤维素酶及其制备和应用方法
技术领域
本发明属于酶工程技术领域，具体涉及一种利用生物技术手段制备高活性复合纤维素酶，并涉及该复合纤维素酶在酶解糖化木质纤维素中的应用。
背景技术
木质纤维素是自然界中蕴藏量最丰富、最廉价的可再生资源，占地球总生物量的40％左右。通过生物转化技术将天然纤维素降解为可以利用的糖，对于缓解地球能源危机和环境污染具有重大意义。纤维素酶是指能降解纤维素的一类多组分复合酶系的总称，主要包括三个酶组分：内切型-β-葡聚糖酶(exdo-1，4-β-D-glucanase，EG)、外切型-β-葡聚糖酶(exo-1，4-β-D-glucanase，CHB)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，BG)。纤维素酶的作用机理是EG先降解纤维素分子内部的非结晶区形成新的游离末端；然后由CHB作用于纤维素线状分子非还原性末端水解β-1，4-糖苷键形成纤维二糖；最后由BG水解纤维二糖为2个葡萄糖。
在纤维素的酶解糖化过程中，若BG型酶不能有效的酶解纤维二糖，将会对EG酶和CHB酶产生很强的反馈抑制作用，最终限制纤维素的酶解糖化率。为提高纤维素酶的酶解糖化率，十分有必要通过人工措施制备具有高活性EG、CHB和BG型纤维素酶的复合纤维素酶。目前公认的能产生高活性EG和CHB型纤维素酶的菌种为里氏木霉，而该菌种所产的BG型纤维素酶活性较低。目前能产生高活性BG型纤维素酶的菌种为黑曲霉。将黑曲霉生产的β-葡聚糖苷酶与里氏木霉生产的纤维素酶复合制备出高活性复合纤维素酶，优化酶系配比，提高木质纤维素的酶解得率，具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种高活性复合纤维素酶及其制备方法和其在酶解糖化木质纤维素中的应用，本发明能够显著提高酶解糖化木质纤维素的效率，尤其能够提高对于蒸汽爆破杨木的酶解效率。
一种高活性复合纤维素酶的制备方法，分别将保藏编号为CCTCC NO：M 2012129的黑 曲霉C112生产的β-葡萄糖苷酶与保藏编号为ATCC 56765的里氏木霉RUT C30生产的纤维素酶浓缩提纯，并将浓缩后的酶液混合使得β-葡萄糖苷酶活/滤纸酶活比值为1.048～2.685；黑曲霉C112通过产β-葡萄糖苷酶的培养基得到高活力的β-葡萄糖苷酶，培养基配方为：玉米芯25～30g/L，稻草粉20～30g/L，蛋白胨5～6g/L，(NH4)2SO410～13g/L，KH2PO46～8g/L，CaCl2·2H2O 0.5～1.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5～1.0g/L，吐温-801～2ml/L，Mandels微量元素浓缩液0.5～1ml/L，1mol/L柠檬酸缓冲液100～150ml/L，加水配制成1L。
上述方法优选将浓缩后的酶液混合使得β-葡萄糖苷酶活/滤纸酶活比值为1.536；黑曲霉C112通过产β-葡萄糖苷酶的培养基得到高活力的β-葡萄糖苷酶，培养基配方为：玉米芯25g/L，稻草粉30g/L，蛋白胨5g/L，(NH4)2SO410g/L，KH2PO46g/L，CaCl2·2H2O 0.9g/L，MgSO4·7H2O 0.9g/L，吐温-801ml/L，Mandels微量元素浓缩液1ml/L，1mol/L柠檬酸缓冲液100ml/L，加水配制成1L。
上述方法中黑曲霉C112的产β-葡萄糖苷酶的培养过程如下：将黑曲霉菌C112的种子培养液，以体积百分比5-8％的接种量接种于装有40-60ml产酶培养基的250ml摇瓶中，26-28℃，180-220r/min条件下培养4-6天，离心，取上清液得到粗酶液。
黑曲霉C112的种子培养：从保存的黑曲霉C112土豆固体平板培养基中挑取孢子，接种于装有40-60ml种子培养基的250ml摇瓶中，26-28℃，180-220r/min条件下培养2～3天作为接种物；黑曲霉C112种子培养基：马铃薯250～300g/L，葡萄糖15～25g/L，pH值6.5～7.0。
上述方法黑曲霉C112生产的纤维素酶β-葡萄糖苷酶活为13.368～15.496U/mL，滤纸酶活为0.183～0.215IU/mL，经超滤浓缩仪浓缩后，β-葡萄糖苷酶活为18.793～24.741U/mL，滤纸酶活为0.785～0.932IU/mL；里氏木霉RUT C30生产的纤维素酶β-葡萄糖苷酶活为1.205～1.652U/mL，滤纸酶活为5.931～6.212IU/mL；经超滤浓缩仪浓缩后，β-葡萄糖苷酶活为9.379～12.662U/mL，滤纸酶活为43.335～48.912IU/mL。
Mandels微量元素浓缩液配方为：FeSO4·7H2O 5g/L，MnSO4·H2O 1.6g/L，ZnSO4·7H2O 1.4g/L，CoCl2·6H2O 3.7g/L，加水配制成1L；
1mol/L柠檬酸缓冲液的配方为：柠檬酸(C6H8O7·H2O)210g，H2O 750ml，加NaOH78g，冷却后测pH为4.2，加水至1000ml，pH 4.5。
一种高活性复合纤维素酶，是由所述的制备方法制备而成的。
所述的高活性复合纤维素酶的应用方法，将所述的高活性复合纤维素酶用于酶解糖化木质纤维素。
具体是将粉碎后的杨木屑与质量浓度0.05-5.0％的稀磷酸按固液比1:1-1:10预浸渍1-24h 后进行蒸汽爆破，蒸汽爆破条件：蒸汽爆破压强为0.5-3Mpa，保压时间为60-240s；将所得蒸汽爆破产物，加入0.05-0.1mol/L，pH4.8的柠檬酸缓冲液，再用0.5～1mol/L的氨水调节pH至4.5-6.0，同时调整底物体积浓度为5％～20％，以滤纸酶活FPU为15～30IU/g底物加入复合酶，β-葡萄糖苷酶/滤纸酶的值为1.048～2.685时，酶解温度为45-55℃，pH为4.6-5.0，酶解8～64h。
上述应用方法优选将粉碎后的杨木屑与质量浓度0.05-2.0％的稀磷酸按固液比1:1-1:10预浸渍1-12h后进行蒸汽爆破，蒸汽爆破条件：蒸汽爆破压强为0.5-2.5Mpa，保压时间为90-220s；将所得蒸汽爆破产物，加入0.05mol/L，pH4.8的柠檬酸缓冲液，再用1mol/L的氨水调节pH至4.5-6.0，同时调整底物体积浓度为10％，以滤纸酶活FPU为15IU/g底物加入复合酶，β-葡萄糖苷酶/滤纸酶的值为1.536时，酶解温度为50℃，pH为4.8，酶解64h。
本发明的黑曲霉C112 Aspergillus niger C112，2012年4月23日保藏于《中国典型培养物保藏中心》，地址为：中国.武汉.武汉大学，其保藏号为CCTCC NO:M 2012129。
本发明所用里氏木霉RUT C30(Trichoderma reesei RUT C30)，购自美国模式菌种收集中心(ATCC)，编号：ATCC 56765，其产纤维素酶生产方法，见参考文献3。
本发明通过大量探索试验获得利用黑曲霉产高活性β-葡聚糖苷酶的培养基，将黑曲霉生产的β-葡聚糖苷酶与里氏木霉生产的纤维素酶复合制备出高活性复合纤维素酶，优化酶系配比，大大提高木质纤维素的酶解得率，具有重要的现实意义。本发明的应用可开辟新的纤维素酶制备技术，为高效、低成本酶解木质纤维素提供技术保障。
附图说明
图1为本发明单一碳源对黑曲霉C112产β-葡萄糖苷酶的影响；
图2为本发明单一氮源对黑曲霉C112产β-葡萄糖苷酶的影响；
图3为本发明黑曲霉C112摇瓶产β-葡萄糖苷酶活随时间的变化曲线；
图4为本发明β-葡萄糖苷酶/滤纸酶比值对还原糖的影响；
图5为本发明复合纤维素酶酶解糖化蒸汽爆破杨木得到还原糖量随时间的变化曲线。
具体实施方式
以下结合实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
实施例1：本发明提供了单因素和正交试验对黑曲霉C112产β-葡萄糖苷酶工艺的优化过程，具体如下。
黑曲霉C112的种子培养：从实验室保存的黑曲霉C112土豆固体平板培养基中挑取两环 孢子，接种于装有50ml土豆培养基的250ml摇瓶中，28℃，200r/min条件下培养2～2.5天作为接种物。黑曲霉C112种子培养基：马铃薯300g/L，葡萄糖20g/L，pH值6.80。
黑曲霉C112的产酶培养：将活化好的黑曲霉菌液，以6％(v/v)接种量接种于装有50ml产酶培养基的250ml摇瓶中，28℃，200r/min条件下培养5天。所有摇瓶实验均为3个平行。4000r/min下离心10min，取上清液(粗酶液)测定其β-葡萄糖苷酶活力。
用于筛选培养基的最优单因素的黑曲霉C112产酶基本培养基：玉米芯30.7g/L，麸皮10g/L，酵母粉5g/L，(NH4)2SO47g/L，KH2PO46g/L，CaCl2·2H2O 0.9g/L，MgSO4·7H2O 0.9g/L，吐温-801ml/L，Mandels微量元素浓缩液1ml/L，1mol/L柠檬酸缓冲液100ml/L。
其中，Mandels微量元素浓缩液：FeSO4·7H2O 5g/L，MnSO4·H2O 1.6g/L，ZnSO4·7H2O 1.4g/L，CoCl2·6H2O 3.7g/L；加水至1000ml。
1mol/L柠檬酸缓冲液：柠檬酸(C6H8O7·H2O)210g，H2O 750ml，加NaOH 78g，冷却后测pH约为4.2，加水至1000ml，pH约为4.5。
本发明所采用β-葡萄糖苷酶活力的p-NPG测定法，见参考文献1。
产酶培养基单因素试验：保持产酶液体培养基中其他成分不变，分别改变碳源、复合碳源、氮源、复合氮源这四个因素，筛选出黑曲霉C112产酶培养基的最优单因素。
保持产酶培养基中其他成分不变，分别加入1.0％、1.5％、2.0％的麸皮、玉米芯、稻草粉、微晶纤维素、麦芽浸粉和乳糖作为碳源，比较不同浓度的单一碳源对黑曲霉C112产β-葡萄糖苷酶的影响(图1)。结果表明，玉米芯和稻草粉的产酶效果较好，其中在浓度为2.0％时，玉米芯和稻草粉的β-葡萄糖苷酶活力分别达到3.577U/mL和3.320U/mL。表明玉米芯和稻草粉对黑曲霉的诱导产酶能力较强。
选取单一碳源中效果较好的玉米芯与稻草粉，研究不同浓度的复合碳源对黑曲霉C112产β-葡萄糖苷酶的影响(表1)。当玉米芯为2％，稻草粉为3％时，β-葡萄糖苷酶活力最高达到8.768U/mL。
表1 复合碳源对黑曲霉C112产β-葡萄糖苷酶的影响
以2％的玉米芯和3％的稻草粉作为碳源，保持产酶培养基中其他成分不变，分别向培养基中加入0.5％，1.0％，1.5％的酵母粉，蛋白胨，硫酸铵，玉米浆和硝酸钠，研究不同单一氮源对黑曲霉C112产β-葡萄糖苷酶的影响(图2)。结果表明，浓度为1.5％的蛋白胨产酶效果最高，β-葡萄糖苷酶活力为6.369U/mL。其次为浓度为1.5％的硫酸铵和玉米浆，β-葡萄糖苷酶活力分别达到5.598U/mL和5.204U/mL。表明氮源的种类和浓度对黑曲霉的生长和代谢产物的分泌具有重要影响。
选取单一氮源中效果较好的蛋白胨、硫酸铵及玉米浆，研究不同浓度的复合氮源对黑曲霉C112产β-葡萄糖苷酶的影响(表2)。当硫酸铵为0.75％，蛋白胨为1％时，β-葡萄糖苷酶活力最高达到11.724U/mL。
表2 复合氮源对黑曲霉C112产β-葡萄糖苷酶的影响
产酶培养基正交试验：为了获得最优液体产酶培养基，在单因素的基础上，选取玉米芯、 稻草粉、硫酸铵和蛋白胨为研究对象，按L9(34)正交表(表3，表4)进行试验研究其综合影响，试验结果及分析见表4。各因素对产酶影响大小顺序依次为玉米芯>硫酸铵>稻草粉>蛋白胨，从而得到最优产酶组合为A3B2C1D3。
表3 产酶培养基正交试验设计
表4 产酶培养基正交试验设计结果
表5 经优化后的黑曲霉C112与其他菌株产β-葡萄糖苷酶的比较
按照上述培养条件和优化得到的培养基配方培养10d，每隔1d取样一次。由图3可知，前6天β-葡萄糖苷酶活力增长幅度较大，在第6d时β-葡萄糖苷酶活力达到15.124U/mL。从第6d开始，酶活变化幅度较小，β-葡萄糖苷酶活力最高达到15.496U/mL。
与现有技术相比，本发明的优点在于：通过优化黑曲霉C112产β-葡萄糖苷酶生产条件，可以制得活性高、成本低的β-葡萄糖苷酶。
实施例2
本发明所用里氏木霉RUT C30(Trichoderma reesei RUT C30)，购自美国模式菌种收集中心(ATCC)，编号：ATCC 56765，其产纤维素酶生产方法，见参考文献3。
本发明的高活性复合纤维素酶的制备，具体如下：分别利用诱变选育的黑曲霉C112和购自美国ATCC的里氏木霉Ru-C30(ATCC 56765)生产纤维素酶。黑曲霉C112生产的纤维素酶β-葡萄糖苷酶活为15.496U/mL，滤纸酶活为0.215IU/mL，经超滤浓缩仪UOF 48(天津膜天膜科技股份有限公司)浓缩后，β-葡萄糖苷酶活为20.491U/mL，滤纸酶活为0.93IU/mL。里氏木霉RUT C30生产的纤维素酶β-葡萄糖苷酶活为1.352U/mL，滤纸酶活为6.212IU/mL。经超滤浓缩仪UOF 48(天津膜天膜科技股份有限公司)浓缩后，β-葡萄糖苷酶活为10.662U/mL，滤纸酶活为46.912IU/mL。将两株菌株生产的纤维素酶浓缩后，按照β-葡萄糖苷酶/滤纸酶的值分别为1.048，1.296，1.536，2，2.685时研究不同的酶系配比对木质纤维素酶解糖化率的影响。由见图4可知，β-葡萄糖苷酶/滤纸酶比值为1.536时效果最好。
实施例3
本发明采用稀磷酸结合汽爆破预处理杨木，具体如下：将粉碎后的杨木屑(直径1-2mm,长2-15mm)与稀磷酸(0.05％-2.0％)按固液比1:1-1:10预浸渍(1h-12h)后进行蒸汽爆破(蒸汽爆破机QBS-80，鹤壁市正道重型机械厂研发)，蒸汽爆破条件：蒸汽爆破压强为0.5-2.5Mpa，保压时间为90-220s。将所得蒸汽爆破产物，加入适量0.05mol/L，pH4.8的柠檬酸缓冲液，再用1mol/L氨水调节pH至4.5-6.0进行脱毒，待酶解糖化。
本发明利用复合纤维素酶酶解糖化蒸汽爆破杨木优选具体如下：风干杨木屑，木屑直径为1-2mm,长度为2mm-15mm，1％磷酸按固液比1:2.5预浸渍1h，在蒸汽爆破压强为2MPa，保压时间180s条件下进行爆破。测得含水率为82％，按绝干重的爆破物占锥形瓶装载量体积的10％装入250ml锥形瓶中(总装量为100ml，除开加入的爆破物，柠檬酸缓冲液和氨水，酶等外，余量为水)，往瓶中加入30ml，0.05mol/L的柠檬酸缓冲液，再用1mol/L氨水中和脱毒调节pH值至5.0±0.5，最后以滤纸酶活FPU为20IU/g加入实施例2制备的混合酶液(β-葡萄糖苷酶酶活/滤纸酶活＝1.536)，50℃下酶解64h。过程中监测其还原糖量。由图5可知，初始还原糖为27.31g/L，随着时间的延长，还原糖含量逐渐升高。在酶解8h时，还原糖含量为49.766g/L。8h后还原糖含量增加缓慢，最终在酶解64h时，还原糖最高达到61.858g/L，还原糖得率为81.63％。
参考文献：
[1]陈介南,张林,王义强,陈石兰,石彩蕊,先天敏,石旺.一株产β-葡萄糖苷酶的黑曲霉菌株及其应用.中国,2012105393718[P].(2012.12.13).
[2]王璀璨.混合纤维素酶水解杨木及多菌种共发酵制备燃料乙醇[D].中南林业科技大学,2010.
[3]王璀璨,王义强李辉,陈介南,石彩蕊.混合纤维素酶对杨木酶解的研究[J].可再生能源.2010,28(6):57-62。

Claims (3)

1.一种高活性复合纤维素酶的应用方法，其特征在于，将所述的高活性复合纤维素酶用于酶解糖化木质纤维素，具体包括以下步骤：
风干杨木屑，木屑直径为1-2mm,长度为2mm-15mm，1％磷酸按固液比1:2.5预浸渍1h，在蒸汽爆破压强为2MPa，保压时间180s条件下进行爆破，按绝干重的爆破物占锥形瓶装载量体积的10％装入250ml锥形瓶中，总装量为100ml，除开加入的爆破物，柠檬酸缓冲液和氨水，酶外，余量为水，往瓶中加入30ml，pH4.8的0.05mol/L的柠檬酸缓冲液，再用1mol/L氨水中和脱毒调节pH值至5.0±0.5，最后以滤纸酶活FPU为20IU/g加入混合酶液，β-葡萄糖苷酶酶活/滤纸酶活＝1.536，50℃下酶解64h；
所述的高活性复合纤维素酶的制备方法，分别将保藏编号为CCTCC NO：M 2012129的黑曲霉C112生产的β-葡萄糖苷酶与保藏编号为ATCC 56765的里氏木霉RUT C30生产的纤维素酶浓缩提纯，并将浓缩后的酶液混合使得β-葡萄糖苷酶活/滤纸酶活比值为1.536；黑曲霉C112通过产β-葡萄糖苷酶的培养基得到高活力的β-葡萄糖苷酶，培养基配方为：玉米芯25g/L，稻草粉30g/L，蛋白胨5g/L，(NH4)2SO4 10g/L，KH2PO4 6g/L，CaCl2·2H2O 0.9g/L，MgSO4·7H2O 0.9g/L，吐温-80 1ml/L，Mandels微量元素浓缩液1ml/L，1mol/L柠檬酸缓冲液100ml/L，加水配制成1L；
黑曲霉C112的产β-葡萄糖苷酶的培养过程如下：将黑曲霉菌C112的种子培养液，以体积百分比5-8％的接种量接种于装有40-60ml产酶培养基的250ml摇瓶中，26-28℃，180-220r/min条件下培养4-6天，离心，取上清液得到粗酶液；
黑曲霉C112生产的纤维素酶β-葡萄糖苷酶活为13.368～15.496U/mL，滤纸酶活为0.183～0.215IU/mL，经超滤浓缩仪浓缩后，β-葡萄糖苷酶活为18.793～24.741U/mL，滤纸酶活为0.785～0.932IU/mL；里氏木霉RUT C30生产的纤维素酶β-葡萄糖苷酶活为1.205～1.652U/mL，滤纸酶活为5.931～6.212IU/mL；经超滤浓缩仪浓缩后，β-葡萄糖苷酶活为9.379～12.662U/mL，滤纸酶活为43.335～48.912IU/mL。
2.根据权利要求1所述的高活性复合纤维素酶的应用方法，其特征在于，
黑曲霉C112的种子培养：从保存的黑曲霉C112土豆固体平板培养基中挑取孢子，接种于装有40-60ml种子培养基的250ml摇瓶中，26-28℃，180-220r/min条件下培养2～3天作为接种物；黑曲霉C112种子培养基：马铃薯250～300g/L，葡萄糖15～25g/L，pH值6.5～7.0。
3.根据权利要求1所述的高活性复合纤维素酶的应用方法，其特征在于，Mandels微量元素浓缩液配方为：FeSO4·7H2O 5g/L，MnSO4·H2O 1.6g/L，ZnSO4·7H2O 1.4g/L，CoCl2·6H2O 3.7g/L，加水配制成1L；
1mol/L柠檬酸缓冲液的配方为：柠檬酸(C6H8O7·H2O)210g，H2O 750ml，加NaOH 78g，冷却后测pH为4.2，加水至1000ml，pH 4.5。
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