CN107164400A - 产茶叶碱和咖啡碱的重组基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，公开了一种新的产茶叶碱和咖啡碱的重组基因工程菌及其构建方法和应用，本发明主要利用以黄嘌呤为甲基受体的咖啡碱合成代谢途径，将茶树咖啡碱合成酶基因TCS1和酵母鸟嘌呤脱氨酶基因GUD1共同导入大肠杆菌中，构建获得一种能在体外发酵生产茶叶碱和咖啡碱的重组大肠杆菌工程菌。该工程菌能在不添加任何底物的条件下，同时高产茶叶碱和咖啡碱，产量分别达到4.17mg/L和20.3mg/L，且产物在发酵液中，易分离纯化，具有良好的工业应用前景。

Description

产茶叶碱和咖啡碱的重组基因工程菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体地说，涉及一种产茶叶碱和咖啡碱的重组基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

甲基黄嘌呤属于嘌呤生物碱类，是黄嘌呤甲基化后的衍生物，根据其甲基化位置及数量的不同，可分为1-甲基黄嘌呤、3-甲基黄嘌呤、7-甲基黄嘌呤、3，7-二甲基黄嘌呤(可可碱)、1，3-二甲基黄嘌呤(茶叶碱)、1，7-二甲基黄嘌呤和1，3，7-三甲基黄嘌呤(咖啡碱)。自然界中大约有13个目100多种植物中均含有甲基黄嘌呤类化合物。其中咖啡碱是存在于植物中的天然生物碱，也是茶叶中嘌呤碱的主体成份，对人体具有多种生理作用。适量摄入咖啡碱可以帮助人体适当地升高血压，增加血液中的儿茶酚胺的含量，增强血液中高血压蛋白原酶的活力，提高血清中游离脂肪酸的水平，利尿和增加胃酸的分泌等。茶叶碱作为茶叶中的特征性嘌呤生物碱，具有与咖啡碱相似的利尿、兴奋神经等生理功能。此外，茶叶碱具有极强的舒张支气管平滑肌的作用，有很好的平喘作用，可被用于支气管喘息和抗灸的治疗。

咖啡碱和茶叶碱作为重要的食品添加剂和药用原料，其主要来源于化学合成，存在附产物多且污染环境的弊端。而来源于茶叶或咖啡中天然提取的咖啡碱，则存在原料和加工成本高，易产生有害物残留等弊端。因此，利用基因重组技术，构建重组工程菌，通过微生物发酵生产咖啡碱的方法具有良好的工业应用前景。

目前国内外尚未发现有利用重组大肠杆菌发酵法无底物生产咖啡碱的相关报道。

发明内容

本发明的目的是针对目前市场上合成制备咖啡碱和茶叶碱存在成本高、污染环境、提取率低等缺点，提供一种利用大肠杆菌实现无底物发酵生产咖啡碱和茶叶碱的新方法。

本发明构思如下：利用以黄嘌呤为甲基受体的咖啡碱合成代谢途径来生产咖啡碱，通过将茶树咖啡碱合成酶基因在大肠杆菌中过量表达。同时，为了进一步提高咖啡碱和茶叶碱的产量，高表达了酵母鸟嘌呤脱氨酶基因，以提高前体物质黄嘌呤的供应量。利用构建的产茶叶碱和咖啡碱的重组基因工程菌，可以在不添加任何底物和碳源的LB培养基中，直接发酵生产咖啡碱和茶叶碱。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种重组表达载体，其含有至少1个茶树咖啡碱合成酶基因TCS1表达盒以及至少1个酵母鸟嘌呤脱氨酶基因GUD1表达盒。其中，所述表达盒中的启动子选自Tac、Trp、Tac、IPL或T7启动子，所述重组表达载体选自pET系列、pGEX系列、pMAL系列或pRSF系列。

优选地，所述重组表达载体的出发载体为pRSF-Duet-1。

本发明还提供一种产茶叶碱和咖啡碱的重组基因工程菌，其是将茶树咖啡碱合成酶基因TCS1和酵母鸟嘌呤脱氨酶基因GUD1共同导入工程菌中表达而成的重组基因工程菌。其中，所述工程菌为大肠杆菌工程菌，可选择的表达菌株包括Rosetta(DE3)、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS等，优选BL21(DE3)。

所述的重组基因工程菌是将上述重组表达载体导入工程菌中表达而成。

所述的重组基因工程菌可按照如下方法构建获得，将茶树咖啡碱合成酶基因TCS1和酵母鸟嘌呤脱氨酶基因GUD1分别构建到不同表达载体上，然后将含有基因TCS1的表达载体以及含有基因GUD1的表达载体共同导入工程菌中表达而成；或者，将上述重组表达载体导入工程菌中表达而成。

本发明还提供所述重组基因工程菌在发酵生产茶叶碱和咖啡碱中的应用。所构建的重组工程菌中咖啡碱的生物合成途径见图1。

本发明进一步提供一种利用产茶叶碱和咖啡碱的重组大肠杆菌工程菌发酵生产茶叶碱和咖啡碱的方法，包括以下步骤：

S1、重组大肠杆菌工程菌BL21/pRSF-GUD1-TCS1的构建：将茶树咖啡碱合成酶基因TCS1和酵母鸟嘌呤脱氨酶基因GUD1串联构建到同一个表达载体pRSF-Duet-1上，其中基因TCS1和基因GUD1分别受两个独立的T7启动子控制，得到重组表达载体pRSF-GUD1-TCS1，然后将该重组表达载体导入大肠杆菌BL21(DE3)中构建而成；

S2、菌株BL21/pRSF-GUD1-TCS1依次经初步培养、扩大培养和诱导表达，最终得到含有茶叶碱和咖啡碱的发酵产物。

其中，步骤S2具体如下：

S21、初步培养：挑取菌株BL21/pRSF-GUD1-TCS1单菌落于3mL液体LB培养基中，37℃、200rpm条件下振荡培养过夜，得到种子液；

S22、扩大培养：将上述种子液以2％的接种量转入新鲜的LB液体培养基中进行扩大培养，装液量为40mL/150mL，继续在37℃、200rpm条件下振荡培养2-3h，至菌液OD₆₀₀为0.6-0.8；

S23、诱导表达：向步骤S22所得菌液中加入终浓度为1mM的IPTG，在16℃、110rpm条件下振荡培养20h诱导目的蛋白的表达；

S24、发酵生产咖啡碱和茶叶碱：继续将步骤S23所得菌液在30℃、200rpm条件下振荡培养120h，发酵结束后，收集菌液或离心收集上清，检测其中咖啡碱和茶叶碱的含量。

本发明中，基因TCS1来源于茶树(Camellia sinensis)，基因GUD1来源于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。它们的核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1和2所示。

本发明通过分子生物学手段，将一种新的咖啡碱生物合成代谢途径构建到大肠杆菌中，使大肠杆菌具备无底物生产咖啡碱和茶叶碱的能力，成本低，且产物能够大量分泌到胞外，分离纯化步骤少，咖啡碱和茶叶碱得率高，摇瓶发酵结果显示，咖啡碱和茶叶碱的产量分别达到4.17mg/U和20.3mg/L，表明该重组工程菌具有良好的工业应用前景。

附图说明

图1为本发明中构建的重组工程菌中咖啡碱的生物合成途径。

图2为本发明实施例1中重组表达载体pRSF-GUD1-TCS1的构建示意图。

图3为本发明实施例2中重组大肠杆菌工程菌的发酵液HPLC检测结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning：a Laboratory Manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

以下实施例中所用的限制性内切酶、PCR试剂等均购自TaKaRa生物公司，II One Step Cloning Kit购自南京诺唯赞生物科技有限公司，质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒均购自Axygen公司，大肠杆菌感受态细胞trans T1、BL21(DE3)、DNAmarker均购自北京全式金生物科技有限公司。所用引物由通用生物公司合成。

LB培养基(1L)：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g。

为了筛选重组目的菌株，向培养基中加入终浓度为50μg/mL的卡那霉素。

实施例1重组工程菌BL21/pRSF-TCS1-GUD1的构建

1、目的基因的克隆

本实施例中茶树咖啡碱合成酶基因TCS1和酵母鸟嘌呤脱氨酶基因GUD1的全序列分别见GenBank登录号AB031280和NC_00136。分别根据两个目的基因的ORF序列设计一对特异性引物，并以茶树cDNA和酵母基因组DNA为模板，通过PCR扩增得到TCS1基因和GUD1基因。引物序列(5′-3′)如下：

TCS1-F：TAAGAAGGAGATATACATATGATGGAGCTAGCTACTGCGGGG

TCS1-R：CCAATTGAGATCTGCCATATGCTATCCATCAATCTTGGAAAGCAC

GUD1-F：TCATCACCACAGCCAGGATCCATGACAAAAAGTGATTTATTATTTGATAAATT

GUD1-R：GCCGAGCTCGAATTCGGATCCCTAAATCTGGTAGACTTGCTGGCC

其中，为了将TCS1基因和GUD1基因定向插入表达载体中，分别在TCS1上、下游引物的两端引入了NdeI酶切位点，GUD1上、下游引物的两端引入了BamHI酶切位点。扩增后的产物经1.2％琼脂凝胶电泳后，切胶回收，贮存于-20℃待用。

2、重组质粒pRSF-GUD1的构建

先将表达载体pRSF-Duet-1经BamHI进行单酶切反应，并将酶切反应后的产物进行纯化。然后纯化后的线性化载体与目的基因GUD1利用ClonExpress II One Step CloningKit试剂盒进行同源重组连接，并转入大肠杆菌感受态细胞transT1中，于37℃培养箱中静置培养12h左右至长出单菌落，并通过菌落PCR进行初步筛选。最后将筛选出的阳性单菌落送去公司测序，进一步验证目的基因的正确性，获得重组质粒pRSF-GUD1。

3、重组载体pRSF-GUD1-TCS1的构建

利用试剂盒提取上述获得的经测序验证目的基因序列正确的重组质粒pRSF-GUD1，并利用NdeI进一步对重组质粒进行单酶切反应。然后纯化后的线性化载体pRSF-GUD1与目的基因TCS1进行同源重组连接，并转入大肠杆菌感受态细胞，最终获得重组表达载体pRSF-GUD1-TCS1(重组表达载体构建示意图见图2)。

4、重组菌株BL21/pRSF-GUD1-TCS1的构建

将上述构建的重组表达载体pRSF-GUD1-TCS1转入大肠杆菌BL21(DE3)中，并通过菌落PCR筛选阳性单菌落，最终获得重组工程菌BL21/pRSF-GUD1-TCSl。

实施例2重组工程菌发酵生产咖啡碱和茶叶碱

1、初步培养：挑取重组工程菌BL21/pRSF-GUD1-TCSl单菌落于3mL液体LB培养基中，37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。同时，为了排除出发菌株BL21(DE3)和表达质粒pRSF-Duet-1的干扰，分别将出发菌株和转入了未插入任何目的基因的表达载体的菌株进行培养，作为空白对照组。

2、扩大培养：将上述过夜培养的种子液以2％的接种量转入新鲜的LB液体培养基中进行扩大培养，装液量为40mL/150mL，继续于37℃、200rpm条件下振荡培养2-3h(至OD₆₀₀为0.6-0.8)。

3、诱导蛋白表达：分别向步骤(2)的菌液中加入终浓度为1mM的IPTG，于16℃、110rpm条件下振荡培养20h诱导融合蛋白的表达。

4、发酵生产咖啡碱和茶叶碱：继续将步骤(3)的菌液于30℃、200rpm条件下振荡培养120h。

5、发酵产物的检测：发酵结束后，收集菌液于4℃、12,000g条件下离心10min。离心后上清用无菌水稀释10倍，通过0.22μm微孔滤膜过滤后，用于HPLC检测。

6、HPLC检测方法：

仪器：waters液相色谱仪；

色谱柱：watersC18 5μm4.6×250mm Column；

流动相：A：0.2％乙酸水；B：纯乙腈；

梯度洗脱条件：0-3min，A：95％-95％；3-8min，A：95％-90％；8-11min；

A：90％-85％；11min-13min，A：85％-70％；13min-15min，A：70％-60％；

15min-20min，A：60％-60％；20min-22min，A：60％-95％；22min-28min，A：95％-95％。

色谱条件：流速，1mL/min；柱温，30℃；进样量，5μL；紫外检测波长，274nm。

重组大肠杆菌工程菌的发酵液HPLC检测结果见图3。其中，标准品是指鸟嘌呤、黄嘌呤、3-甲基黄嘌呤、茶叶碱和咖啡碱五中标准品的检测结果；样品组是指重组大肠杆菌工程菌发酵液的HPLC检测结果；对照组1是指出发菌株BL21(DE3)的发酵液检测结果；对照组2是含有空载体pRSF-Duet-1的出发菌株发酵液HPLC检测结果。

摇瓶发酵结果显示，重组工程菌中咖啡碱和茶叶碱的产量分别达到4.17mg/L和20.3mg/L，而两个对照组菌株在整个发酵过程中均检测不到咖啡碱的积累。本发明的重组大肠杆菌工程菌能在无底物的条件下，同时高产咖啡碱和茶叶碱，为通过微生物发酵生产甲基黄嘌呤类生物碱提供了新途径，具有良好的工业化应用前景。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 安徽农业大学

<120> 产茶叶碱和咖啡碱的重组基因工程菌及其构建方法和应用

<130> PI201710417

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1110

<212> DNA

<213> 茶树

<400> 1

atggagctag ctactgcggg gaaggtgaac gaagtgttgt tcatgaacag aggagaagga 60

gaaagtagtt atgcacaaaa ctcttctttc acgcaacaag tggcctcaat ggcacagcca 120

gcgctagaaa atgcagttga aactctcttc tccagagatt tccaccttca agctcttaac 180

gcagcggact tgggttgtgc agcgggtcca aacacattcg cagtgatttc tacgatcaag 240

agaatgatgg aaaagaaatg cagggaattg aattgccaaa cactggaact tcaggtttac 300

ttgaatgatc tttttggaaa tgatttcaat accctcttca aaggcctgtc gtctgaggtt 360

attggtaaca aatgtgagga agttccgtgt tatgtgatgg gagtaccggg gtctttccat 420

ggccggcttt ttcctcgtaa cagcttacat ttagttcatt cctcttacag tgttcattgg 480

cttactcagg caccaaaagg actcacaagc agagaaggct tggcattaaa caaggggaag 540

atttacatat caaagacaag ccctcctgtt gtaagagaag cctacttatc tcaatttcat 600

gaagatttca caatgtttct caatgctaga tcccaagagg tggttccaaa tggttgtatg 660

gtgttgatac ttcgtggtag gcaatgttct gatccttcag acatgcagag ctgctttact 720

tgggaactat tagctatggc cattgctgaa ttggtttcac agggattgat agatgaagat 780

aaattagaca ccttcaatat acccagctat tttgcatcac ttgaggaagt gaaagatata 840

gtggagaggg acggatcatt cacaattgat catatagagg ggtttgatct tgatagcgta 900

gaaatgcagg agaatgataa atgggttaga ggggaaaagt ttaccaaggt tgtcagggcc 960

ttcacagagc ctataatttc aaaccagttt ggacctgaaa tcatggacaa actatatgac 1020

aaattcactc acattgtagt ttcagatttg gaagcaaagc taccgaagac cacaagtatc 1080

atcctagtgc tttccaagat tgatggatag 1110

<210> 2

<211> 1470

<212> DNA

<213> 酿酒酵母

<400> 2

atgacaaaaa gtgatttatt atttgataaa ttcaacgaca aacatggaaa gtttctagtt 60

ttttttggta cctttgtaga tacccctaaa ttaggagagc tgagaatcag agagaaaaca 120

tctgttggag ttctcaacgg aatcatcagg tttgtgaaca gaaattcact cgatcctgtc 180

aaagattgtt tagatcacga tagtagctta tcaccagagg atgtcacggt ggttgacata 240

attggaaaag acaagactcg aaataacagc ttttattttc caggttttgt tgacacgcat 300

aaccatgtct cgcaatatcc aaatgtcggc gtatttggga attctaccct gctggattgg 360

ctagagaagt ataccttccc catagaagcc gcactagcaa acgaaaatat tgcgagagaa 420

gtttacaata aggtaataag taagacgctt tctcacggta caacgactgt ggcttactat 480

aataccattg atctcaagtc cactaagctc ttggctcaac taagctcctt attggggcag 540

cgtgttcttg ttggaaaagt gtgcatggat accaatggtc ccgagtatta tattgaagat 600

actaaaactt cctttgaaag cactgtgaaa gttgttaagt acatacggga aaccatttgt 660

gatcccctcg taaatcctat agtgacacca aggttcgcgc cctcttgttc tagagaacta 720

atgcaacagt tgtccaagct agtcaaggat gaaaacatac acgttcaaac ccacttgtcg 780

gaaaataagg aggagataca gtgggttcaa gatttatttc ccgaatgtga gagctatact 840

gatgtatacg acaaatatgg gctgctcaca gaaaaaacag tattggcaca ttgtattcat 900

ctaacagatg ccgaagcgcg tgtgattaaa cagcgtcgct gtggtatatc tcattgtccc 960

atttccaact cctctctgac ttctggagag tgtagggttc gatggttgct ggaccagggc 1020

ataaaggttg gtctaggcac cgacgtttca gccggtcatt cttgtagcat actcaccacc 1080

ggaaggcagg cctttgcagt ttcaaggcat ttggcaatga gagaaactga tcatgcaaaa 1140

ctttcagtct ccgagtgcct atttcttgct acaatgggcg gagcacaagt cttgcgtatg 1200

gatgagacct tggggacttt tgacgtcggt aagcagtttg acgctcaaat gatcgatacc 1260

aatgctcccg gctcaaacgt ggatatgttt cattggcagc taaaggagaa ggatcaaatg 1320

caagagcaag agcaagagca agggcaagac ccttataaga acccaccgct gcttactaat 1380

gaagacataa tcgcaaaatg gttctttaac ggtgatgatc gcaacaccac taaagtttgg 1440

gtagccggcc agcaagtcta ccagatttag 1470

Claims (10)

1.重组表达载体，其特征在于，含有至少1个茶树咖啡碱合成酶基因TCS1表达盒以及至少1个酵母鸟嘌呤脱氨酶基因GUD1表达盒。

2.根据权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达盒中的启动子选自Tac、Trp、Tac、IPL或T7启动子，优选T7启动子。

3.根据权利要求1或2所述的重组表达载体，其特征在于，出发载体选自pET系列、pGEX系列、pMAL系列或pRSF系列，优选pRSF-Duet-1。

4.产茶叶碱和咖啡碱的重组基因工程菌，其特征在于，其是将茶树咖啡碱合成酶基因TCS1和酵母鸟嘌呤脱氨酶基因GUD1共同导入工程菌中表达而成的重组基因工程菌。

5.根据权利要求4所述的重组基因工程菌，其特征在于，所述工程菌为大肠杆菌工程菌，包括Rosetta(DE3)、BL21(DE3)、BL21(DE3)pLysS，优选BL21(DE3)。

6.根据权利要求4或5所述的重组基因工程菌，其特征在于，其是将权利要求1-3任一项所述重组表达载体导入工程菌中表达而成。

7.权利要求4-6任一项所述重组基因工程菌的构建方法，其特征在于，将权利要求1-3任一项所述重组表达载体导入工程菌中表达而成；或者

将茶树咖啡碱合成酶基因TCS1和酵母鸟嘌呤脱氨酶基因GUD1分别构建到不同表达载体上，然后将含有基因TCS1的表达载体以及含有基因GUD1的表达载体共同导入工程菌中表达而成。

8.权利要求4-6任一项所述重组基因工程菌在发酵生产茶叶碱和咖啡碱中的应用。

9.利用产茶叶碱和咖啡碱的重组大肠杆菌工程菌发酵生产茶叶碱和咖啡碱的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、重组大肠杆菌工程菌BL21/pRSF-GUD1-TCS1的构建：将茶树咖啡碱合成酶基因TCS1和酵母鸟嘌呤脱氨酶基因GUD1串联构建到同一个表达载体pRSF-Duet-1上，其中基因TCS1和基因GUD1分别受两个独立的T7启动子控制，得到重组表达载体pRSF-GUD1-TCS1，然后将该重组表达载体导入大肠杆菌BL21(DE3)中构建而成；

S2、菌株BL21/pRSF-GUD1-TCS1依次经初步培养、扩大培养和诱导表达，最终得到含有茶叶碱和咖啡碱的发酵产物。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤S2具体如下：

S21、初步培养：挑取菌株BL21/pRSF-GUD1-TCS1单菌落于3mL液体LB培养基中，37℃、200rpm条件下振荡培养过夜，得到种子液；

S22、扩大培养：将上述种子液以2％的接种量转入新鲜的LB液体培养基中进行扩大培养，装液量为40mL/150mL，继续在37℃、200rpm条件下振荡培养2-3h，至菌液OD₆₀₀为0.6-0.8；

S23、诱导表达：向步骤S22所得菌液中加入终浓度为1mM的IPTG，在16℃、110rpm条件下振荡培养20h诱导目的蛋白的表达；

S24、发酵生产咖啡碱和茶叶碱：继续将步骤S23所得菌液在30℃、200rpm条件下振荡培养120h，发酵结束后，收集菌液或离心收集上清，检测其中咖啡碱和茶叶碱的含量。